Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование рекомбинатного белка из клеток E. coli - продуцента генно-инженерного инсулина человека

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование рекомбинатного белка из клеток E. coli - продуцента генно-инженерного инсулина человека"

АКЛДЕЛ1ИЯ НАУК КАЗАХСКОЙ ССР ИНСТИТУТ ММКРОПИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи

ХАРИТОНОВ Владимир Григорьевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ

РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ИЗ КЛЕТОК Е. COLI — ПРОДУЦЕНТА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

03.00.07 — Микробиология 03.00.23 — Биотехнология

/

Г

Д и i о р е ф е р я г

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата — 10!) 1

Crmnkvio^

Работа выполнена в Степиогорскои научной опытно-промышленной базе ПО «Прогресс».

Научные руководители •— доктор медицинских наук,

Г. Н. ЛЕПЕШКИН,

— кандидат медицинских наук, А. X. ГАЛИЕВ,

Официальные оппоненты — член-корреспондент АН КазССР,

доктор биологических паук, АХМАТУЛЛИНА Назира Бадретдиновна;

— доктор химических наук, профессор, ГИНАК Анатолий Иосифович.

Ведущая организация — ВНШ1Л, г. Москва.

« ¿V, ____т^

Зашита диссертации состоится «

в часов на заседании специализированного совета К. 008.01.01

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии АН КазССР (адрес: 480100, Алма-Ата, ул. Кирова 103).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии АН КазССР.

Автореферат разослан «

/I

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

У. С. МУХАМЕДИЕВА

Актуальность темы. Микроорганизмы находят все более широкое применение для получения антибиотиков, белковых, лекарственных препаратов, витаминов и ферментов. Созданы бактериальные штаммы-продуценты трех типов интерферонов (Институт биоорганической химии АН СССР, Институт ВНШгенетики), гормона роста человека и рада сельскохозяйственных животных (Институт молекулярной биологии АН СССР), проинсулина человека (ИБХ АН СССР), ин-терлейкина-2 (Институт органического синтеза АН Латв.ССР).

С появлением новых продуктов микробиологического синтеза возникают проблемы их выделения из культуральной среды и освобождения от примесей. Очень часто получаемые отечественные препараты уступают зарубежным по степени чистоты и уровню биологической активности, что имеет немаловажное значение для их практического применения.

Одной из актуальных проблем в настоящее время является получение высокоочищенного инсулина человека. Советские специалисты сконструировали бактериальные штаммы-продуценты предшественника инсулине, что создало предпосылку развертывания в нашей стране производстве генно-инженерного инсулина человека (ГИМЧ). Преимущество процесса получения ГИИЧ состоит в том, что он не зависит дт перебоев в поставках сырья мясокомбинатами и позволяет получить человеческий инсулин, который при длительном применении не вызывает аллергических осложнений в отличие от инсулина животных.

Выделение рекомбинантного.белка (ББ) ГИИЧ из биомассы продуцентов £. УмгоУ ум/а в настоящее время осуществляется хроматографическими методами с .использованием импортных сорбентов, реактивов и оборудования, что влечет за собой высокие финансовые затраты. Наличие нескольких этапов очистки белка обусловливает дробность процесса, довольно значительную его продолжительность и необходимость предварительной фильтрации раствора.

Актуальность разрабатываемой проблемы связана с необходимостью проведения исследований", направленных на совершенствование технологии получения генно-ивдек )рного инсулина человека путем разработки новых методов выдсоения его полупродуктов ч использованием ¡«етод^в, альтернативных хроматогрзфи-ческим, и заменой /мпартнсго оборудования и сырья нч отечест-

венные.

Целью работы было изучение зависимости степени раствори-, мости РБ, получаемого из штамма-продуцента Е.ыб' , от температурного фактора, ионной силы раствора и присутствия органических растворителей для дальнейшего использования полученных результатов в процессе выделения и очистки полупродуктов ГИИЧ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку штаммов £. ¿МЛо! и Зм.юз по способности продуцировать рекомбинантный белок генно-инженерного инсулина человека-,

2. Разработать технологию очистки и выделения РБ с использованием отечественных сырья, реактивов и оборудования;

3. Оптимизировать процесс производства ГШЧ по времени и количеству стадий;

4. Осуществить контроль качества и специфичности ввделен-ного ББ физико-химическими и иммунологическими методами.

Научная новизна работы. Впервые проведены работы по изучению структурной и репликативной стабильности рекомбинантных плазмид штеммов В. 7М /о^ и дл юз _ продуцентов рекомбинантных белков на стадиях культивирования и в процессе хранения посевного материала. Осуществлена оценка этих штаммов по продуктивности РБ. Для экспериментальных работ по очистке и выделению белка отобран продуцент ¿м. Опробованы

методы всаливания, ультрафильтрами и осаждения белков органическими растворителями для удаления примесных компонентов ;;з раствора РЪ, продуцируемого штаммом £. ео& ¿ММ. На основе подученных данных о зависимости степени растворимости реком-бинантного белка от температуры, ионной силы раствора и наличия органических растворителей, усовершенствован процесс выделения и очистки целевого продукта. Осуществлена разработка новых методик контроля качества и специфичности РБ на стадиях его производства.

Практическая значимость. Практическая значимость работы заключается в разработке новой нетрадиционной технологии получения РБ из В. ^мш, отличающейся от существующих простотой, большей экспресеностыэ и дешевизной, обусловленных применением отечественного сырья и оборудования, сокращением стадий очистки белка. Полученные экспериментальные данные по-

зволяют заменить 2 стадии хроматографической очистки FB на селективное фракционирование раствора белков этанолом. Простота выполнения операций, использование нехроматографических процессов очистки белка, результаты оценки качества РБ, выделенного по разработанной технологии, являются основанием для того, чтобы рекомендовать данную работу к внедрению в производство.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выбор штамма-продуцента рекомбинантного белка генно-инженерного инсулина человека.

2. Разработка альтернативной технологии очистки рекомбинантного белка, получаемого из клеток £. - продуцента генно-инженерного инсулина человека.

3. Оптимизация технологического процесса получения генно-инженерного инсулина человека.

4. Разработка методов контроля качества рекомбинантного белка на стадиях его получения.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на научно-практической конференции ПО"Прогресс" (Степногорск, 1991), на III Всесоюзном семинаре "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степногорск,1991), а также на совместном заседании секций Ученого Совета "Физиология роста, генетика и селекция микроорганизмов" и "Вирусология" (Алма-Ата,. 13.II.91) .

Публикации. Результаты проведенной работы вошли в опытно-промышленный регламент на производство рекомбинантного инсулина человека (ОПР 12315-01-9Г/64-Г20-01-91, ИБХ АН СССР, CHü:L П0"Прогресс"). Разработаны три производственные методики (Архив СНОПЕ П0"Прогресс", Инв.№ 2628, 1990), оформлен ьнио-тационный отчет по этапу темы СБ 04/91 (Архив СНОПБ il0"i]po»-pi ос',' инв.№ 2712/1990). По теме диссертации опубликозано 9 неучши трудов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяте, зделов: введения, аналитического, обюра, экспериментальных ис следований, заключенья и выводов. Список литературы включая 1' 123 наимонопачкя ра^от отечественных и зарубекних авторов, "е-тер'.-.али дпссортапиг доложены на 1.30 листах ыпиинописногс т-ао-т», содержат Г." таблиц и '? рису.чкэв'.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД

Штаммы-продуценты рекомбинантного белка М(>,< ¿Л /Ол' и Е. го-е,- /оз.

Штамм В. ео€'/мнЧполучен из ШИ11А (г.Москва) несет дериват плазмиды рКК 223-3, устойчив к ампициллину в концентрации 50 мкг'см-3 и синтезирует рекомбинангяый белок, состоящий из аминокислотной последовательности проинсулина и активного домена белка А. Морфологические свойства: грам-отрицателькая палочка длиной 2 чкм и шириной около 0,8 мкм. На плотной питательной среде при температуре (37±1)°С через 18-24 ч образует бесцветные слизистые колонии диаметром 1-3 мм.

Штамм получен из ВНИИ ПЭ (г.Вильнюс), несет

плазмиду рРСЯ, детерминирующую устойчивость к ампициллину в концентрации 50 мкг-см"^ Штамм синтезирует рекомбинантный белок, в состав которого входит аминокислотная последовательность про-инсулинэ и фрагмента^б-Д-тиогалактозидазы. Морфологически штамм представлен грам-отрицательными палочками длиной около 2 мкм и шириной 0,8 мкм. При инкубировании на плотной питательной среде в течение 18-24 ч при температуре (37±1)°С образует бесцветные колонии диаметром 1-3 мм.

Питательные среды и наработка биомассы. Для выращивания посевных и натквньгх культур £ <(>£<■ ¿¿но? и использовали

жидкие питательные среды на основе сернокислотного гидролиза-та казеина с добавлением дрожжевого экстракта. Массовая доля для бминного азота составляла мг$, величина рН -

(б,8±0,1).

Выбор штамма-продуцента Рб проведен по результатам изучения структурной и репликатквной стабильности рекомбииантных плазмид методом рестрикционного анализа на стадиях культивирования £, е^.-'&'/еУ и улоз и в процессе хранения посевного материала.

Выделение гибридных плазмид, содержащих гон рекомбинантного белка, осуществляли методом щелочного лизиса биомассы с помощью экстракции водного раствора пляэмвдной ДНК фенолом и хлороформом.

Выррщивание нативной культуры осуществляла в

япперате вместимостью 20 м3 при температуре (37-1)°С, объем-

_ б -

ном расходе воздуха на аэрацию (460±20)м3 'ч давлении (0,3^0,1)кгс-см и величине рН культуральной среды (6,65^0,15). Биомассу продуцента дезинтегрировали и растворяли в буферном растворе. Рекомбинэнтный белок выделяли из раствора, полученного после экстракции РБ из дезинтегрированной биомассы. В ря-боте использовали профильтрованный через мембрану с размером пор 0,45 мкм раствор ГБ с содержанием основного вещества 27-39% и концентрацией общего белка 4,8-12,0мг'см-3, а также нефильтрованный раствор с содержанием основного вещества 28-37% и концентрацией общего белка 1ь-20мг•см~3.

Осаждение примесных белков. Для осаждения применых белков из раствора применяли ацетон (ТУ 6-09-3513-86) и 96% этанол (ТУ 98.005-004-87).

Оценку качества выделенного РВ проводили методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (Щ ПААГ) и реакции диффузной преципитации в геле (РДГТ).

Предварительную обработку экспериментальных данных осуществляли на ЗШ типа используя для этого разработанную бейсик-программу. В качестве выборочных характеристик использовали эмпирическое среднее и его дисперсию, о также значение коэффициента вариации, язлякщееса мерой относительной изменчивости наблюдений случайной величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ И (ЕСУЭДЕНИЛ

I. Выбор штамма-продуцента рекомбинантного белка

Стабильность рекомбинянтннх плазмид в бактериальных популяциях зависит от цело.го ряда факторов: условий культивирования, генетических характеристик клеток хозяев, свойств самих плазмид. Изучение стабильности плазмид проводили в образцах продуцентов, выращенных но косяках из глицериновых закладок, хранившихся в течение различного времени (от 5 мес до 12 лес) при температуре -20°С и -70оС, а также в образцах биомассы, 'полученной в процессе периодического культивирования. Оценка результатов рестрикционного анализа плазмид, вьщеленных из посевных материалов, показала полнуп идентичность олектро^орегрямм посевного мм'ерийл« с рестрикиионными картами рекомбинантных плазмид втгммов £ /Су у .

Анализ электролсреграж плязр-д, выделенных из бисмоссы £ полученной е процессе периодического кулъгив/ро-

вания в ферментерах вместимостью 1м3 и 20 м3, установил полное соответствие их с рестрикционными картами штамма. В то же время электрофореграммы фрагментов ДНК, полученных из биомассы

выращенной в ферментерах вместимостью 100 дм3 и I м3, не соответствовали рестрикционным картам указанного штамма.

Таким образом, методом рестрикционного анализа выявлено, что плазмида, выделенная из биомассы шт. £. '/ЛЮЗ, сохраняет свою структурную и репликативную стабильность при различных условиях хранения и в процессе периодического культивирования. Плазмида, выделекнвя из шт. £. /и//сз , не сохраняет репликативную стабильность в процессе культивирования, хотя и структурно стабильна при хранении.

Анализ результатов по изучению выработки РБ штаммами-продуцентами Е.сл&Хя/оз у, ум юз показал, что содержание исследуемого белка в пробах из биомассы шт. С. со&'/л/оу находилось в пределах от 20 до 45% по отношению ко всем белкам, находящимся в пробе (или же от 180 до 400 мг на I дм3 культуральной жидкости); содержание ЕВ в пробах из биомассы шт. £ <и>& /оз составляло от 3 до 9$ (или же от 5 до 15 мг на 1дмэ культураяь-ной жидкости).

Таким образом, в связи с высокой структурной и реплика- • тивной стабильностью плазмиды, а также с более высокой продуктивностью штамма по РБ для дальнейших работ по разработке технологии выделения и очистки целевого белка был выбран продуцент /А*7 . .

2. Разработка методов контроля качества и специфичности РБ

Креме применяемых методов контроля качества и специфичности выделенного РБ (РДП и ВЭ ПААГ) в процессе эксперимйаль- . ных неследований были разработаны применительно к выделяемому белку методы иммуноэлектрофореза (КЭФ), иммуноферментного анализа (ИФА) и высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭ).

В методах ШФ и ИФА в качестве специфических к РБ антител использовали полученную гипериммуннуто кроличью сыворотку и выделенные из нее .

Учет результатов ИЭФ осуществляли визуально по наличию линий преципитата, их количеству, положению и форме у стандар-

тного и исследуемого РБ.

Для определения концентрации Из методом ИФА вариант "сьн-двич" применяли специфические , конъюгированные с перокси-дазой хрена. Уиет проб проводили на однолучевом спектрофотометре Mirtiс еаЛс г , величину экстинции в каждой лунке записывали на ленте регистрирующего прибора.

Метод ВЭКЗ для оценки качества РБ, получаемого на стадиях производстве ГИИЧ, разработал на основе общих методических подходов для анализа органических веществ. В основу метода ЕЭКЭ положено разделение белков электроосмотическим потоком, благодаря которому компоненты анализируемого образца разделяются в соответствии с электрофоретической подвижностью. 3 работе использоаоли прибор для ВЭКЗ модель Р/АСЕ 2000 (, QUA) с длиной капилляра 5? см и диаметром 0,0075 см. Длина волны детекции составляла 214 нм, термостатирование капилляра -?.5°С. Обработку данных проводили с помощью програмного обеспечения "¿¡'¡ггг* С-оМ " ("ВесА/ялп "). Чистота РБ выражалась в процентах по отношению ко всем белкам, находящимся в образце. Наличие РБ в исследуемой пробе определяли сравнением времени миграции анализируемого вещества и стандарта РБ.

Разработанные методы оценки качества РЬ отличались высокой чувствительностью, специфичностью (ВЗКЭ, Шк и ИЭФ) и экс-прессноетью (ВЭ1СЭ). Общее время анализа одной пробы методом ВЭКЭ не превышало 40 мин.

3, Разработка методов очистки РБ, продуцируемого

/f. c <V/ Jjc /i'9

Разработка альтернативной технологии выделения РБ явилась следствием проведения комплексных работ по изыскании способа его нехроматогрпфическогэ выделения. Для этого были опробованы методы всмпвания, ультрэфильтрации, осуждения белков ацетоном и отгнолом. Наилучшие результаты были получены при выделении РЬ отиловым спиртом. На первом этапе работ необходимо было определить объемные пропорции раствора РБ и этанола, пои которых происходило бы осаждение только примесных белков. Этя-Ьол добавляли к раствору РБ (рН 7,5),,тцетельно перемеаиеаии, и iнк.убировг-ли смесь при температуре (4^2)°С п течение 10-20', Белки, выпавшие в осадок, удаляли центрифугированием растйоро^ при. частоте вращения роторь ЗбООмин-^ в течение 15 ш-л. Пр:би

осадков и супернатанта анализировали на содержание основного вещества методом ВЭ ПААГ.

Необходимо отметить, что при добавлении этанола к раствору РБ в соотношениях 0,2:1; 0,3:1; 0,4:1 - образования белкового осадка не отмечалось, а при объемных пропорциях 0,5:1 и 0,6:1 наблюдалось только легкое помутнение смеси, но получить осадок также не удалось, поэтому результаты этой части работы не приводятся. Результаты работ по определеняю оптимальных объемных пропорцж этанола и раствора ИЗ для осаждения примесных белков представлены в тебя Л;

Таблица I

Влияние соотношения объемов раствора РБ и этанола на чис.-готу РБ

Пропорции объемов раст-!Содержание основного ве-!Средние поте-вора РБ и Етанола !щества (FE), % !ри РБ, %

! осадок !супернатант!

I 2 3 ! 4

I 0,7 20,6 ± 3,6 43,6 ± 4,3 16,7

I 0,8 12,4 ± 5,6 64,8 ± 6,9 22,3

1 0,9 10,0 t 5,8 84,6 ± 6,1 22,5

I I 10,0 t 3,9 93,0 £ .3,8 23,6

I 1,1 12,0 t 2,8 85,0 £ 7,7 26,3

1,2 . 16,8 ± 4,1 71,4 ± 12,8 43,4

I 1,3 24,0 ± 5,4 40,8 £ 4,6 64,5

Из приведенных в табл.1 результатов следует, что при объемных пропорциях раствора РБ и этанола 1:0,5; 1:1 и 1:1,1 происходило выпадение в осадок преимущественно примесных белков, в РБ оставался в растворе. Содержание основного'вещества (ЕБ) з сулернатпнте при этом составляло 84,6; 93,0 и 85,0% соответственно, а процентное содержание РБ в осрдке не превьшело 10,012,0%. Средние потери РБ в осадке при объемных пропорциях от 1:0,7 до 1:1,1 имели сравнимые .значения и находились в пределах 16,7-26,3%, в затем при увеличении объема добавляемого этанола

резко возросли до 43,4 и 64,5%. Следовательно, оптимальной объемной пропорцией этанола и раствора РБ для денатурации при^ месных белков является соотношение I : I.

С целы8^зШ5Й1Й1 температуры и продолжительности инкубирования смеси, а также предварительной микрофильтрации раствора РБ на качество фракционирования белков, работы по очистке РБ проводились при их варьировании. Этанол в объемной пропорции 1:1 добавляли параллельно к фильтрованному (Ф) через мембрану с диаметром пор 0,45 у,км раствору РБ и нефильтрованному (НФ). Инкубирование смеси проводили при температурах 4; 20 и 35°С в течение 2 и 20 часов. Пробы анализировали на содержание основного вещества методом ВЭ ЛААГ.

Результаты проведенной работы представлены в табл.2.

Таблица 2

Влияние температуры и времени инкубации на чистоту РБ в растворе

Анализируемая проба!Продолжи-'Содержание основноги вещества

'тельность! (РБ)', %, в зависимости от темпе-!иккубиро-fpsтуры инкубирования

!си, ч 4°С 20°С 35°С

РастЕор РЕ,фильтрованный (Ф) Раствор РБ,нефильтрованный (НФ) Супернзтант (Ф) Супернатант (НФ) Супернатакт. (Ф) Супернатант ШФ) 2 2 ' 20 20 72,4±8,5 67,8±Г>,6 88,0±6,7 8I,6i5,9 32,0-6,1 29,0^5,6 86,4-7,I 83,4-7,7 38,0±7,а 33,4^5,2 85,0-5,9 01,6^4,5 8С,6±5,2 82,6±5,7

Из данных, представленных в табл.2, следует, что оптимальным температурным режимом для фракционирования белков является интервал температур от 25 до 35°С, при котором денатурация примесных белков происходила в течение дв^х часов. Качество очистки РБ этанолом не зависело от предварительной микрофильт-рацьк раствора через мембрану с диаметром пор 0,45 мкг. Содержание РГ> в нгдосадке для фильтрованного раствора через 2 ч ин~

кубирования составило 86,4%, а нефильтрованного - 83,4%. Инкубирование реакционной смеси при температуре 4°С приводило к за- ■ медлеиию скорости выпадения в осадок примесных белков. Содержание основного вещест-Еа в супернатанте через 2 ч составляло только 72,4%, а через 20 ч уие 88,0%. Показатель потерь ИЗ в осадке в зависимости от условий фракционирования приведен в табл.3.

Таблица 3

Средние значения потерь Из с осадком в зависимости от условий фракционирования смеси

Показатель.'Условия под-Условия проведения эксперимента

!готовки рас-! _

!твора РБ '"ЯнкуОирование смеси! Инкубирование ! ! 2 ч__[смеси 20 ч _

( 4°С ; 20°С ,! 35°С } 4°С ,!

Фильтрован- 18,9 20,1 24,1 21,4 37,2 42,7

Средние ный

потери РБ, % Нефильтро- 68,9 66,6 68,1 70,2 68,5 71,1

ванный

Из результатов, представленных в табл.3, следует, что при очистке фильтрованных рестворов РБ средние, потери через 2ч инкубирования увеличивались в зависимости от повышения температурного режима осаждения белков, хотя, разница была не очень существенной. Более яркое проявление »ышэуказанного аффекта отмечалось через 20 ч-инкубации, при этом потери РБ составляли 21,4; 37,2 и 42,7% для температур 4; 20 V 35°С соответственно.

Оценивая значения средних потерь № при использовании нефильтрованного раствора, можно сказать, что они. примерно были равны для всех режимов фракционирования и находились в пределах 66,6-71,1%. Высокий процент средних потерь РБ при отом обусловлен тем, что в исходном растворе находился РБ, связанный с внутриклеточными включениями и обломками клеточных стенок, которые образовывали осадок и вовлекали б него определенное количество РБ. Следует добавить, что это же количес-.тво связанного РБ задерживалось при фильтрации раствора через мембрану с раз-

мерами пор 0,45 мкм.

Таким образом, по результатам проведенной работы удалось определить наиболее оптимальный на данное этапе режим очистки РБ этанолом: добавление 96$ этанота к фильтрованному или нефильтрованному раствору РБ в объемной пропорции 1:1; перемешивание смеси и ее инкубирование при (20^2)°С в течение 2ч; отделение осадка центрифугированием смеси при частоте сращения ротора 3500 мин-* в течение 15 мин.

На следующем этапе работ была поставлена задаче найти еще более технологичный режим очистки раствора РБ. Выполнение этой' задачи предполагалось осуществить изменением величины рН раствора РБ до значений, при которых примесные белки будут находиться в состоянии, близком к изоэлектрической точке. Для этого в пробах раствора РЕ (с содержанием основного вещества 35%) значение р!1 доводили до 6,0; 5,5 и 5,0 раствором 0,5М соляной кислоты. После чего приливали к раствору РБ этанол в объемных пропорциях 1:1 и 1:0,5. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при температуре 20°С в течение 2ч. Осадок отделяли центрифугированием при частоте вращения ротора ЗОООмин"* в течение 15 мин. Пробы анализировали на содержание РБ методом ВЭ ПААГ. Результаты селективного фракционирования РБ этанолом при различных значениях рН растворов представлены в табл.4.

Таблица 4

Содержание РБ в пробах в зависимости от величины рН раствора

Анализируем,"я!Пропорции!Содержание основного веществе (РБ), %, пробр !объемов !в зазксимости от значения рН раствора

'пастворэ ' ! "1 !

!раств ! РЕ и

эта-! рЬ 7,5 > ноле !

рН 6,0

рН 5,5 ! рН 5,0

Осадок I : 0,5 20,0 ± 4 11,0*4,4 10,4^3,4 12,8-3,0

Супернатант I : 0,5 32,0±7,5 90,'4±4,4 89,017,5 90,4±4,0

Осадок I : I 15,0±6,4 14,0±4,5 14,8-4,1 17,0-5,2

Супернатант 1:1- 93,0±4,4 96,0^3,6 98,3±1,'4 98,2*1,0

Из приведенных- в табл.4 результатов следует, что величину рН исходного раствора имеет большое значение для процесса-

- и -

очистки РЕ ьтанолом. Высокое процентное'содержание РБ в пробах из недосадочного раствора отмечалось при величинах рН исходного раствора' 6,0; 5,5; 5,0 не только при добавлении этанола в объемной пропарции к раствору РБ 1:1, но и при соотношении 0,5:1. Чистота РБ в супернатанте при использовании первой пропорции и указанных величин рН раствора■равнялась 96,0; 98,3; 98,2$ соответственно, а при использовании второй пропорции этанола - 90,4; 09,0 и 90,4%. Качественная очистиа РБ (чистота 93,0$) при величине рН исходного раствора 7,5 наблюдалась только лишь при добавлении этанола к раствору РБ в соотношении 1:1. Применение объема этанола, равного половине объема раствора РБ (рН7,5), не призодило к осаждению всех примесных белков из раствора, содержание РБ в супернатанте в данном случае составляло в среднем 32,0$. Процентное содержание РБ в осадках при величинах рК 6,0; 5,5 и 5,0 было невысоким и находилось в пределах 10,4-12,8%.

Показатель потерь РБ при фракционировании раствора этанолом при различных величинах рН исходного раствора приведен в табл.5.

Таблица 5

Средние потери РБ при очистке раствора этанолом в зависимости от величины рН исходного раствора

Величина р!1 неходкого раствора

Показатель порции раствора РБ и этанола 7,5 6,0 5,5 5,0

Средние I : 0,5 23,9 16,1 15,1 21,7

потери

РБ, $ I : I 17,0 21,7 22,7 25,8

Из результатов, представленных в.табл.5, следует, что наименьшие средние потери РБ б процессе его очистки (15,1 и 16,0%) отмечались при использовании этанола и растзора РБ в объемной пропорции 0,5:1 и величинах рН 5,5 и 6,0, о также при величине рН раствора РБ 7,5 г объе.унон пропорции 1:1 (средние потери •РБ разнялись IV,ОД), При всех остальных рекгмах осаждения примесных белков эт.'нолсм средние потери РБ были больше вьшеука-

занных значений и находились в пределах 21,7-25,8$. Следовательно, наиболее оптимальным способом очистки РБ на данном этапе экспериментальных работ был следующий:

- доведение величины рН исходного раствора РЕ до значений 5,5—0,I раствором С,5М солглой кислоты;

- добавление этанола к раствору РБ в объемной пропорции 0,5:1 и перемешивание смеси;

- инкубирование смеси в течение 2ч при температуре (2С±2)°С;

- отделение осадка центрифугированием при частоте вращения ротора 3500мин~а в течение 15 мин.

Поскольку на дальнейших стадиях производства инсулина предусмотрено использование сухого рекомбинантного белка, то очистка его в растворе не являлась конечным этапом подготовки белка к лиофильноыу высушивании. Перед высушиванием РБ необходимо было осуществить концентрирование и обессоливание очищенного раствора РБ. Эти работы были выполнены двумя слособычи. Во-первых: концентрированием раствора РБ ультрэфнльтрацией и обессоливание его гельфильтрацией. Во-вторых: концентрирование и обессоливрние только методом ультрафильтреции. Второй способ оказался предпочтительней,чем первый. Подготовка раствора РБ к высушиванию осуществлялась более быстро и с меньшими потерями белка. Поэтому ультрафильтрация раствора белка использоьана на заключительной стадии комбинированного метода очистки■и выделения РБ. Разработанный комбинированный метод включает в себя следующие этапы:

- доведение величины рН исходного раствора сБ до 5,5 раствором 0,5М соляной кислоты;

- добавление этанола к раствору РБ в объемной пропорции 0,5:1 и перемешивание смеси;

- инкубирование смеси в течение (2,0-0,1)ч при температу-. ре (Р.0±2)°0;

- отделение образовавшегося осадка;

- концентрирование супер.чнтонта методом ультрафильтрации;

- диализ и вторичное концентрирование раствора методом ультрафильтрации.

С целью проведения сравнительной оценки использованных в работе методов выделения РБ (кроме метода всаливэкия) из исходного раствора, лучшие показатели для кавдого из них. по ка-

честву полученного белка приведены в табл.6.

Таблица 6

Показатели качества полученного РБ и процент его потерь при использовании различных методов выделения

!Ультра- !ичисткаи ¡фильтра-!раствора! ¡ционная !РБ с ис-1 .очистка ¡пользовав !РБ на уЫнием ацЫ

Методы выделения и очистки РБ ичистка!! даделе-!фракцио-! ичи!

еделе-ние РБ с использованием

и 'этан о-! ла - !

фракцио-!ичистка ^ыноыоини-нирова- !селектив- ¡рованный ние рас-!нам фрак- !метод твора РБ!ционирова-! этанолом!нием с по-!

! концент'ри-! !рованием ! ¡раствора ! !на системе! \"fkecttvn "и! !обессолива-! !нием на ! !хроматогра! ¡фйческой ! ¡колонке с ! !сефадекоом!

Примечание: В скобках приведены потери РБ (.%) по этапам очистки.

Яз приведенных в табл.б результатов следует, что при использовании указанных методов удалось добиться довольно высокой степени чистоты РБ во всех анализируемых пробах(78,2 -- 9С,4%), однако некменьший процент потерь белка отмечался при Фракционировании раствора № этанолом (15,1$),а также при очистке белка комбинированным методом (21,4$).

Таким образок, при проведения сравнительной оценки изученных методов выделения РБ по показателям чистоты и потерь белка,

можно заключить,что фракционирование раствора РБ этанолом при оптимальных параметрах проведения процесса более технологично, • чем все остальные методы, поскольку при высокой чистоте РБ в этом случае имеется минимальный процент потерь белка. Однако, при использовании только данного метода, РБ остается в не сконцентрированном и не обессоленном растворе, и эти операции еще необходимо будет выполнить при проведении технологического процесса .

Применение комбинированного метода выделения РБ предусматривает осуществление вышеуказанных операций, причем с минимальными дополнительными потерями белка при высокой степени чистоты РБ (82,4%). Поэтому неиболее перспективным, в плане дальнейшего использования в производстве, следует считать комбинированный метод выделения. Поскольку комбинированный метод включает в себя три самостоятельных технологических стадии ( денатурирование примесных белков этанолом, отделение осадка,концентрирование и обессоливание раствора РБ), выполнение "которых производилось на обособленном оборудовании, строго последовательно по времени и с соблюдением определенных параметров процесса, ю можно заключить, что данный подход при выделении РБ из раствора белков претендует на роль технологии, а не простого метода.

Для подтверждения этого положения были проведены экспериментальные работы с объемами раствора РБ.не только 0,2-0,3 дм3, но и с объемами 10 дм3. Отделение осадка осуществляли 'на цгчтри-фуге с вместимостью стакана 1,5 дм3, концентрирование раствора ультрафильтрацией проводнике только на системе ыпп ) но и на отечественных колонках с полыми волокнами. Во всех случаях результаты очистки РБ были сравнимы с данными, полученными при работах на лабораторном оборудовании.

Тяким обрезом, можно подвести итог, что в процессе исследований была разработана технология очистки и выделения РБ.

■/н ализ чистоты и специфичности РБ, выделенного' по предложенной технологии методами ВЭ ПААГ, ВЭКЭ, ИФА, ЮФ и РДП показал, что опытные образцы белка по содержанию основного вещества полностью соответствуют белку, очищенному хроматографи-ческим способом. Антигенная структура опытных - образцов РБ так-, же полностю соответствует антигенной структуре стандартного

белка (производство ИБХ АН СССР).

При оценке соответствия субстанции ГИИЧ, наработанной из РБ, выделенного по разработанной технологии, были получены результаты, подтверждающие полное соответствие субстанции инсулина требованиям В$С 42-. Предлагаемая технология позволяет использовать толико отечественное оборудование, сырье' и реактива на данных стадиях производства ГИИЧ, а также сократить технологический процесс на 2 стадии.

Еще одним аргументом в пользу данной технологии является то, что из фильтрата после этапа концентрирования раствора РБ можно извлекать методом возгонки этанол, использовать его повторно для фракционирования белкового раствора, в оставшийся после возгонки раствор - для экстракции РБ из дезинтегрированной биомассы. Процесс возгонки этанола из растворов технологически не сложен и применяется на многих производствах, в то время как выделение и очистка дорогостоящего триса из стоков со стадии хроматографии требует больших капитальных вложений для создания системы осаждения данного вещества;

Таким образом, разработанный метод очистки и выделения РБ показал свою перспективность, соответствие уровню, установленному в ряде опытно-промышленных регламентов на производство ГИИЧ.

ШВОДЫ

1. Плазмида шт. /-"/¿У, регулирующая синтез РБ, сохраняет свою структурную и репликативную стабильность в процессе хранения и культивирования. Плазмида т .Е.со?-' /м /сз не сохраняет репликативную стабильность в процессе культивирования.

2. На основании данных о стабильности плазмид штаммов

ул/0$ и /¿//с'З и их продуктивности по РБ проведен отбор

штамма-продуцента £. си£г для получения рекомбинантного белка генно-инженерного инсулина человека.

3. Осуществлена оценка возможности применения методов всаливания, ультрафильтрации и осаждения белков органическими растворителями для выделения полупродуктов ГККЧ.

4. Разработана технология очистки рекомбинантного белка, полученного из клеток £ см?-' гМ - продуцента генко-инженерг-ного инсулина человека, сснозанная не селективном фракционировании раствора белков этанолом с последующим концентрированием и обессолинаннем на ультрарильтрационноР мембране.

5. Покарана реальная возможность сокращения технологического процесс? производства ГИИЧ на продуцента £. /г/U'J на две стадии, что соответствует 13,3 ч (при переработке раствора, полученного после ферментации в ферментере вместимостью 20 м3).

6. Разработаны методы ШФ, ВЭКЭ, позволяющие контролировать качество рекомбинантного белка на стадиях его получения.

7. Рекомбинэнтннй белок ГМН, выделенный в соответствии с данной технологией, полностью соответствовал требованиям существующих опытно-промышленных регламентов.

СПИСОК ОПУЕЛГКОЗАШЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харитонов З.Г., Галдев А.Х., Петров П.П. Выделение ре- . комбинантного белка генно-инженерного инсулина человека денатурирующим способом/Материалы научно-практической конференции ПО"Прогресс" (январь 1991г.). - Степногорск, 1991г.,'Архив СНОПЕ, инв..'Р 2923, с.2.

2. Петров П.П., Галиев А.Х., Харитонов В.Г. Применение отечественных колонок с полыми волокнами для концентрирования и обессоливания полупродуктов генно-инженерного инсулина человека (ГМ!Ч) /Материалы научнедрвкт^ческой конференции П0"Г1рог-ресс" (январь 1991 г.). Степногорск, 1991г., Архив СНОПЕ, инв. )Ь 2923, с.З.

3. Опытно-промышленный регламент на производство инсулина человек? (субстанция генно-инженерного, рекомбннантного инсулина человека). СПР I23I5-OI-9I/64-I20-OI-9I./K5X Ail СССР, CHOilB ЛС'Прогресе". Ы., ШХ /Л СССР, 1991, 281с.

4. Опытно-промышленный регламент на производство субстен- • ции генно-инженерного инсулина человека. ОПР 64-120-079-90./ СНОПЕ ПО "Прогресс", кна.» 2731. - Степногорск, 1990-, 225с.

5. Разработка метода выделения рекомбинантного белка генно-инженерного инсулина человека из штамма-продуцента £.

jM/vi /З.Г.Харьтонов, А.X.Галиев, П.П.Петров, А.Н.Косинов/'Ма-териплы lu Всесоюзного семинара на тему:: Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения:.Целиноградская область, г.Степногорск (18-20 июня 1991г.). - Степногорск,1991.

- 19 -

6. Разработка опытно-промышленной технологии получения ГИИЧ с использованием отечественных оборудования, сырья и сорбентов ./А.Х.Галиев, Г.Н.Лепешкин, А.Н.Вульфсон и др/^Материалы Ш Всесоюзного семинара на тему: "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения". Целиноградская обл. г.Степногорск (18-20 июня 1991г.). - Степногорск, 1991.

7. Оценка качества рекомбинантного инсулина человека и его полупродуктов на различных стадиях производства./А.Н.Косинов, П.П.Петров, А.Л.Бай и др^(0Латериалы 111 Всесоюзного семинара

на тему: "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения". Целиноградская обл., г.Степногорск (18-20 июня 1991 г.). - Степногорск, 1991.

8. Петров П.П., Харитонов В.Г., Галиев А.Х. Получение гипериммунных сывороток и выделение специфических^? класса & к продуктам микробиологического синтеза^Материалы Ш Всесоюзного семинара на тему: "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения". Целиноградская обл., г.Степногорск (18-20 июня 1991г.). - Степногорск, 199I.

9. Оценка качества генно-инженерного инсулина человека методом высокоэффективного капиллярного электрофореза./А.Н.Косинов, В.Г.Харитонов, А.Х.Галиев, П.П.Петров^Материалы Ш Всесоюзного семинара на тему: "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения". Целиноградская обл.,г.Степногорск (18-20 июня 1991г.). - Степногорск, 1991.