Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека"

На правах рукописи

Купцов Василий Николаевич

□03050662

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ПРОИЗВОДСТВА ОТЕЧЕСТВЕННОГО ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

03 00 23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007 г

003058662

Работа выполнена на Федеральном государственном унитарном предприятии «22 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Минобороны России»

Научный руководитель

доктор медицинских наук,

профессор Степанов Алексей Вячеславович

Официальные оппоненты.

доктор биологических наук, Машко Сергей Владимирович

доктор биологических наук, Лахтин Владимир Михайлович

Ведущая организация. Федеральное государственное учреждение науки «Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства, Московская область, г Серпухов

специализированного совета Д 208 046 01 в ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212 Москва ул Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им Г Н Габричевского» Роспотребнадзора

Автореферат разослан 2007г

Защита диссертации состоится « 2007 г в /О часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Комбарова С Ю

Список сокращений

ВЭЖХ - обращеннофазная высокоэффективная жидкостная хроматография,

ГБ - гибридный белок,

ГИИЧ - генно-инженерный инсулин человека,

ДАИ - диаргинининсулин,

ДТИ - В30- дезтреонининсулин,

МАИ - моноаргинининсулин,

СД - сахарный диабет,

ТФУ - трифторуксусная кислота,

HINS11 - ренатурированный гибридный белок, полученный при культивировании штамма-продуцента Escherichia coli JM109 с рекомбинантной плазмидной ДНК pHINSll, PINS07 - ренатурированный гибридный белок, полученный при культивировании штамма-продуцента Escherichia coli JM109 с рекомбинантной плазмидной ДНК pPINS07

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Инсулин - гормон белковой природы, вырабатываемый Р-клетками поджелудочной железы для поддержания гомеостаза глюкозы в крови Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или наследуемых факторов приводит к заболеванию сахарным диабетом (СД) ( Овчинников Ю А , 1987, Марри Р , Греннер Д , Мейес П , Родуэлл В , 1993) Это системное заболевание, неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а без лечения - к смерти (Доклад комитета экспертов ВОЗ по сахарному диабету, 1987, Roman S Н , Harris М 1, 1997, Tuomilehto J , Cacciotollo J , Vassallo A et all, 1988) Ежегодно умирает 5,5% больных СД, уровень смертности среди них в 2-4 раза выше, а продолжительность жизни на 7-10 лет меньше, чем среди лиц без нарушений углеводного обмена ( Gu К , Cowie С С , Harris М , 1998, Roman S Н , Harris М1, 1997, Кудрякова С В , Сунцов Ю И 2001) В Российской Федерации зарегистрировано около 2 млн больных сахарным диабетом, из которых более 300 тыс человек нуждаются в ежедневном приеме препаратов инсулина Однако истинная заболевае-

мость сахарным диабетом значительно выше и, вероятно, составляет 6-8 млн человек (Балаболкин М И , Клебанова Е М , Креминская В М , 1999) Специалисты прогнозируют удвоение количества больных СД каждые 12-15 лет (Дедов И И , 1998, Amos А , McCarty D , Zimmet Р , 1997) Отсутствие современного, конкурентоспособного отечественного производства инсулина ставит нашу страну в зависимость от зарубежных производителей В результате производство препаратов на основе инсулина становится важной государственной задачей

Впервые инсулин был выделен в чистом виде и применен для лечения в 1921 г С 1923 г инсулин промышленно получали, выделяя его из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней Только в конце 50-х, начале 60-х годов XX века были выяснены отличия структуры человеческого инсулина от инсулинов животного происхождения, которые вызывали аллергические реакции (Sanger F, Tuppy Н , 1951, Brown Н , Sanger F, Kitai R , 1955) Результаты данных исследований легли в основу разработок промышленного получения инсулина человека В настоящее время основными способами получения инсулина, идентичного человеческому, являются полусинтетический и генно-инженерный (Дедов И И , 1998)

Наиболее прогрессивным методом является биотехнологический, при котором потребляются только энергоресурсы и используются высокопродуктивные генетически измененные микроорганизмы, вырабатывающие инсулин в виде неактивного предшественника (Коледопа*! А 2001) Получение генно-инженерного инсулина является сложным многостадийным процессом, основанным на нескольких этапах трансформации и препаративной очистке промежуточных продуктов и инсулина (Баирамашвили Д И, 2005) Поэтому основными направлениями по оптимизации технологии производства являются поиск легко вписываемых в существующую технологию, дающих заметный выигрыш по времени, уменьшающих себестоимость и легко масштабируемых решений на основе существующего оборудования Цель исследования

Усовершенствование технологии получения генно-инженерного инсулина человека с целью снижения себестоимости и увеличения выхода конечного продукта

Задачи исследования: 1) разработать методы оценки пригодности ферментативных препаратов протеаз для нужд биотехнологического производства,

2) найти более экономически выгодные и доступные отечественные препараты трипсина, для применения в процессе производства инсулина,

3) разработать оптимальную технологию хроматографической очистки инсулина и его предшественников на 8Р-8ерЬагс«е ГТ с использованием буферных растворов с меньшим содержанием мочевины, при сохранении объемов расходуемых буферных систем,

4) разработать технологическую схему совместного гидролиза гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой В в инсулин,

5) разработать технологию получения инсулина человека, основанную на использовании нового, более экономически выгодного штамма-продуцента

Научная новнзна-

1) изучено влияние температуры, рН и кот и честна ферментов на результаты трип-тического и совместного гидролизов РДО807,

2) определено, что динамика накопления продуктов гидролиза при триптическом гидролизе ренатурированного гибридного белка, постоянна при условии, что гибридный белок состоит из лидерной последовательности, пептидного линкера ИуЗегН^-бИуЗегА^ и проинсулина человека,

3) показано, что при очистке инсулина и его производных на сорбентах с сильными катионообменными свойствами (например ЗР-ЗерЬагоге БР) можно использовать буферные системы на основе ацетата аммония с низким содержанием мочевины (до 2 М и менее) без увеличения временных затрат при получении полупродукта той же чистоты, как и при использовании буферных систем с высоким содержанием (6 М и более) мочевины Данных результатов можно добиться путем увеличения ионной силы гидролизата и увеличения концентрации аммоний ацетата в используемых буферных растворах,

4) предложен универсальный метод получения инсулина при использовании штаммов-продуцентов ГБ, имеющих различные лидерные последовательности,

5) разработан новый метод одновременного (совместного) гидролиза ГБ карбоксипептидазой В и трипсином в соотношении (1,25-10) 1, в котором для уменьшения количества трудноотделимых примесей используется трипсин, инкубированный 24 часа при 4 °С в 0,01 Н НС1

Практическая значимость работы

Предложен метод ферментолиза и последующей хроматографической очистки, позволяющий повысить выход инсулина с единицы гибридного белка и значительно снизить себестоимость продукта за счет применения 2-х М мочевины и замены импортных ферментов на отечественные

Разработанная технология получения инсулина применяется при производстве генно-инженерного инсулина (ГИИЧ) на ОАО «Национальные биотехнологии» (изменения к регламенту на производство субстанции генно-инженерного инсулина человеческого № ПР-50159728-01-02) Получена приоритетная заявка на патент РФ № 2006137635 от 25 10 2006 на способ получения ГИИЧ Использование результатов работы в производстве привело к увеличению производства ГИИЧ в 2 раза и снижению себестоимости продукта на 63%

Новые способы гидролиза и очистки позволили получать конечный продукт, соответствующий требованиям международных фармакопей на субстанцию инсулина Разработанный алгоритм позволил статистически достоверно определять пригодность различных ферментных препаратов для нужд биотехнологического производства с наименьшими временными и денежными затратами Использование нового метода очистки инсулина и его предшественников на SP-Sepharose FF с использованием буферных растворов на основе 2 молярной мочевины привел к снижению потребления мочевины в три раза не снижая чистоты получаемого полупродукта Разработанные технологические приемы легли в основу новой технологии получения генно-инженерного инсулина на основе нового штамма-продуцента Е coli JM109/pHINSl 1 Положения, выноснмые на защиту

1 Разработан алгоритм позволяющий определить пригодность ферментативных препаратов протеаз для нужд биотехнологического производства генно-инженерных препаратов

2 Показана возможность использования буферной системы на основе 2М мочевины при хроматографической очистке инсулина и его производных на SP-sepharose FF при том же расходе буферных растворов и с той же эффективностью, что и при использовании буферной системы на основе 6М мочевины Для этого необходимо увеличить ионную силу наносимого материала и увеличить содержание буферной соли в буферных растворах

3 Доказано, что проведение одновременного гидролиза гибридного белка ГИИЧ, состоящего из лидерной последовательности, пептидного линкера GlySerHis4_6GlySerArg и проинсулина человека, трипсином и карбоксипептидазой В необходимо проводить при t= 5±1 °С, рН=7,2±0,1, и при соотношении гибридный белок трипсин карбоксипептидаза В = 1000 1,25 1 Перед использованием необходимо раствор трипсина в 0,01Н HCl с концентрацией 10 мг/мл инкубировать в течении 24 часов при 4 °С

4 Разработана новая универсальная и масштабируемая технология получения ГИИЧ на основе штамма-продуцента Е coli JM109/pHINSl 1

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на заседания секции Ученого света «Медицинская биотехнология» ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского Роспотребнадзора РФ» (Москва, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе одна статья в издании, рекомендованном ВАК, и одна приоритетная заявка на патент

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах Текст содержит 18 таблиц и 37 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, пяти глав с изложением собственных результатов, обсуждения результатов и выводов Библиографический указатель содержит 31 отечественную и 96 иностранных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исходным материалом в работе был раствор в 0,1М TrisHCl ОДМ KCl (рН=5,5±0,05) ренатурированного гибридного белка, который получали при культивации рекомбинантных штаммов Е coli JM109/pPINS07 и JM109/pHINSll Чистота белка составляла 70±20%, концентрация 8±2 г/л Штаммы-продуценты хранятся в музее предприятия ОАО «Биопрепарат»

В работе были использованы следующие реактивы аммоний ацетат (ч), мочевина (ч), трифторуксусная кислота (ч), хлорид калия (ч), ацетонитрил (осч), трис(гидроксиметил) амииометан (хч), натрий сернокислый (осч)

Для реакций ферментативного гидролиза применяли трипсин Трек Treated фирм «Worthington» (США) с активностью 239 ед/мг и ГосНИИ «Генетика», карбок-сипептидазу В с активностью 200 ед/мг производства ГосНИИ «Генетика»

Очистку продуктов гидролиза проводили с использованием сорбента SP-Sepharose FF «Amersham Pharmacia Biotech»

В экспериментах по определению критериев пригодности ферментов, поиску оптимальной буферной системы для очистки диаргинининсулина на SP-Sepharose FF и при подборе оптимальных условий проведения совместного гидролиза использовали ренатурированный ГБ, полученный при культивировании штамма-продуцента Е coh JM109/pPINS07, имеет следующую первичную структуру

Лидерная последовательность

MetAlaAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGliillelleHisLe-uProAsnLeuAsnGluGluGlnArgAsnGluPhelleGlnSerLeuLysAspAspPro-SerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGliiAlaLysLysLeiiAsnAspAlaGlnAlaProLy-sAlaAspAsnLysGlySerHisHisHisHisHisHisGlySerArg В-цепь

Phe ValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeu ValGluAlaLeuTyrleuValCysGlyG ^ luA rgGlyPhePheTyrThrProLysThrA rgA rg С - пептид

GluAlciGluAspLeuGlnGlyGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySer LeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGlnLysArg A - цепь

GlylleValGluGlnCysCysThrSerlleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCy-sAsn

Данный ГБ (далее PINS07) состоит из 160 аминокислотных остатков из которых 74 приходится на лидерную последовательность, 35 - на соединительный С-пептид, а 51 - на инсулин Первичная последовательность С-пептида и инсулина идентичны человеческим Лидерная последовательность данного ГБ состоит из IgG-связывающего домена белка A Staphylococcus aureus и пептидного линкера GlySerHis6GlySerArg

При поиске экономически выгодных новых штаммов использовали ренатурированный ГБ, продуцентом которого является Escherichia coll JM109/pHINSl 1 Отличительной особенностью данного ГБ (далее HINS11) является лидерная последовательность, которая имеет следующую первичную структуру MetGlnAspProTyr

Проинсулин ► человека

ValLysGluAlaGluAsnLeuLysLysTyrPheAsnAlaGlyHisSerAsp-

ValAlaAspAsnGlyThrLeuPheLeuGlylleLeuLysAsnTrpLysGluGluSerA-

spHisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg

Лидерная последовательность данного ГБ содержит 53 аминокислотных остатков и состоит из N-концевого фрагмента гамма-интерферона человека и пептидного линкера GlySerHis4GlySerArg Остальная часть представляет собой последовательность человеческого проинсулина За счет укороченной лидерной последовательности молекула ГБ состоит из 139 аминокислотных остатков

Основным методом определения количества и чистоты получаемых продуктов является аналитическая обращеннофазная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Для этих целей используется система ВЭЖХ фирмы «Dionex», под управлением программного обеспечения «Chromeleon 6 4»

Подвижной фазой при анализах является смесь буферных растворов (фаз) А и Б на основе водного раствора 0,1 М Na2S04 и ацетонитрила Все анализы проводили при температуре колонки 40 °С Рабочий поток подвижной фазы составлял 1 мл/мин Все представленные в виде рисунков ВЭЖХ - хроматограммы основывались на регистрации поглощения волны с длиной 214 нм

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Отбор препаратов трипсина, удовлетворяющих требованиям производства генно-инженерного инсулина человека

В мировой биотехнологической практике для расщепления ГБ наиболее часто используется трипсин зарубежных фирм «Worthmgton» и «Мегск», которые отвечают всем предъявляемым требованиям по чистоте и специфичности Но при крупномасштабном производстве цена данных ферментов составляла более 2% себестоимости конечного продукта не рентабельна В связи с этим был проведен поиск отечественного фермента, отвечающего предъявляемым требованиям, но с лучшим соотношением цена/качество

В ГосНИИ «Генетика» были разработаны и представлены на испытания несколько препаратов трипсина, выделенных из поджелудочных желез крупного рогатого скота Данные препараты различались методами очистки, удельной активностью

и содержанием примесей В табл 1 представлены основные различия полученных препаратов трипсина

Таблица 1

Свойства препаратов трипсина, предоставленных ГосНИИ «Генетика»

в сравнении с трипсином i эирмы «Worthington»

№ п/п Способ очистки Уд активность/ мг

трипсин химотрипсин

1 трипсин производства ООО «Самсон» после аффинной хроматографии 2,03 0,0096

2 аффинная хроматография при комнатной температуре частично очищенного препарата 2,4 0,0044

3 после одной кристаллизации 1,73 0,043

4 аффинная хроматография при 10 °С частично очищенного препарата 1,29 0,00324

5 двойная кристаллизация 1,4 0,00633

«Worthington » не известен 2,03 0,00636

Для определения качества исследуемых препаратов трипсина проводили экспериментальные трипсинолизы ГБ В качестве контроля параллельно производился трипсинолиз референсным образцом трипсина (производства фирмы «Whortingthon») при тех же условиях

Во время эксперимента 2 одинаковые емкости, с равными объемами раствора ГБ, помещали на магнитные мешалки Раствором 1 М Tris рН доводили до 7,2±0,05 После этого в оба сосуда с ГБ добавляли одинаковое количество трипсина Количество трипсина рассчитывали по формуле [1]

= QrE ш

VTryps 5()0

где Qiryps - масса трипсина, г, Qre - масса ГБ, г, со - коэффициент учитывающий содержание примесей в растворе ГБ При проведении экспериментов о>=1,6 Сравнительный гидролиз проводили при t=8±2 °С

Основным методом контроля динамики процессов гидролиза являлось сравнение ВЭЖХ-хроматограмм продуктов гидролиза ГБ в исследуемом и стандартном образцах Окончание процесса трипсинолиза определяли по завершению роста или началу падения концентрации диаргинининсулина (ДАИ) - основного продукта при

трипсинолизе, после чего в реакционную смесь добавляли 20% трифторуксусную кислоту (ТФУ), с помощью которой рН понижали до 3,3±0,1 и гидролиз останавливался По завершении обоих процессов гидролиза результаты анализировали на одном аппарате ВЭЖХ для сравнения После чего делали вывод о соответствии качества трипсина требованиям производства

В результате трипсинолиза ГБ образуются три белка, являющимися основными продуктами реакции Ими являются ДАИ, моноаргинининсулин (МАИ) - побочный продукт и неидентифицированная примесь Данная примесь была трудноотделима от инсулина человека методами ВЭЖХ и ионообменной хроматографии Так как время выхода этой примеси при анализе методом ВЭЖХ было немного (0,5-1 мин) больше, чем у инсулина человека Результаты дополнительных исследований позволили однозначно идентифицировать данный белок как В30- дезтреонининсулин (ДТИ) В дальнейшем при анализе результатов внимание уделяли именно этим трем белкам (рис 1)

Рис 1 ВЭЖХ - хроматограмма результатов трипсинолиза ГБ, полученная при использовании изократической элюции Примечание 1 - ДАИ, 2 - МАИ, 3 - ДТИ

Для статистической достоверности полученных результатов с каждым из исследуемых ферментов было проведено 10 сравнительных трипсинолизов по выше проведенной методике

Во время поиска оптимальных для производства отечественных препаратов трипсина были найдены и статистически подтверждены

• оптимальные условия проведения трипсинолиза,

• критерии пригодности ферментов,

• метод тестирования препаратов трипсина

Рис 2 Алгоритм определения соответствия качества ферментативных препаратов требованиям биотехнологического производства

Таким образом, на основе полученных нами данных была разработана не имеющая аналогов методика и составлен алгоритм определения пригодности ферментов для нужд биотехнологического производства

По этому алгоритму (рис 2) было испытано пять препаратов трипсина В результате проведенных исследований для производственных целей был выбран отечественный фермент производства ГосНИИ «Генетика», отвечающий всем

критериям (табл 2), получаемый методом двойной кристаллизации

Таблица 2

Результаты тестирования образцов трипсина

Тип фермента Относительные различия концен фаций белков, полученных при использовании исследуемого и стандартного ферментов, % Чистота ДАИ, % Время гидролиза, мин Цена 1г, руб Решение

ДАИ МАИ ДТИ

1 фермент -21,0±0,1 30,8+0,1 4,5±0,1 42,4+0,2 510+25 5600 низкое содержание ДАИ

2 фермент -1,5±0,1 76,9±0,1 79,1±0,1 35,4+0,2 480+25 3800 большое содержание примесей

3 фермент -2,6±0Д -3,8±0,1 -2,4+0,1 54,0+0,2 500+25 4200 непостоянство качества

4 фермент 0,4±0,1 -1,9±0,1 1,5±0,1 55,1+0,2 500+20 8000 большая цена

5 фермент 1,1±0,1 -1,9+0,1 0,3+0,1 55,5+0,2 620+30 5000 принято

\Vorthmg-¡оп 0 0 0 55,3±0,2 500+20 7700

Оптимизация условии хроматографической очистки диаргинининсулпна.

Для производства ГИИЧ важное значение имеет качество мочевины В России последнее время выпуск мочевины категорий х, чда, осч практически прекращен Используемая в технологической схеме мочевина фирм «Мегск» и «Рапгеас» соответствует предъявляемым требованиям, но очень дорога (65 руб /кг) Для производства 1 кг инсулина по существовавшей технологии необходимо было более 2 тонн мочевины, что не рентабельно Большой расход реагента был обусловлен использованием при хроматографической очистке ДАИ на SP-sephrose FF буферных растворов на основе 6М мочевины Также использование высококонцентрированных растворов мочевины приводит к быстрому выходу из строя дорогостоящего хроматографического оборудования

В связи с этим был проведен ряд исследований, позволивший значительно снизить концентрацию мочевины, и как следствие, ее расход

Для проведения хроматографического разделения предшественников инсулина в производстве используется хроматографический модуль «Quantasep 1000LXR», и колонки серии «Versaflo» фирмы «Sepragen» В производстве применяется 40 литровая колонка «Versaflo - 250 column» с 25 литрами сорбента Данная колонка имеет внутренний диаметр 250мм Высота слоя сорбента составляет около 50 см Рабочий поток равен 500 мл/мин

Для проведения экспериментов хроматографический модуль настраивали на работу с потоками от 8 до 100 мл/мин Экспериментальные хроматографии проводили в колонке НК 26 фирмы Pharmacia Диаметр колонки составляет 25 мм, те в 10 раз меньше, чем у препаративной колонки «Versaflo - 250 column» Для облегчения дальнейшего масштабирования результатов экспериментальных хроматографий на производственные условия высоту слоя сорбента в экспериментальной колонке оставили 50 см, что соответствует 250 мл сорбента, или в 100 раз меньше, чем в промышленной колонке Таким образом нагрузка должна быть в районе 10 г исходного ГБ В связи с ограничениями хроматографа удалось уменьшить поток только в 62,5 раза (8 мл/мин)

Исходя из результатов предварительных исследований и экономической целесообразности было решено, что необходимо использовать буферную систему на основе 2 М мочевины и ацетата аммония

Первой буферной системой на основе 2М мочевины была предложена система, представлена в табл 3

Таблица 3

Состав буферной системы на основе 2М мочевины с 50 мМ ацетата аммония

Компоненты Уравновешивающий буфер Элюирующий буфер

хаотроп 2 М мочевина 2 М мочевина

буферная соль 50 мМ NH4AC 50 мМ NH4Ac

элюирующий агент - IM KCl

pH 3,6±0,05 3,6+0,05

При проведении хроматографии было выяснено, что

1 элюирующей силы буферной смеси вполне достаточно для полной элюции всего материала,

2 основной примесью, мешающей очистке ДАИ при данной буферной системе является ДТИ, так как данный белок присутствовал практически во всех фракциях и сильно понизил выход чистого продукта,

3 концентрация ДАИ в целевых фракциях была 1,1+0,3 г/л, что достаточно для производственных условий,

4 последовательность элюции продуктов трипсинолиза сохраняется той же, что и при использовании 6 М мочевины

Таблица 4

Градиенты, использованные при препаративных и экспериментальных __очистках днаргннининсулина__

Название градиента Молярность мочевины, М/ молярность буферной соли, мМ/ Изменение процента ЭБ на участке градиента,% / продолжительность участка Продолжительность градиента, мин

1 участок 2 участок 3 участок

препаративная очистка, поток 500 мл/мин

градиент№1 6М 30 мМ ШдАс 30-40/250 40-55/150 55-65/440 840

градиент№2 2М 50 мМ ЫН4Ас 30-50/960 50-70/700 - 1660

экспериментальная очистка, поток 8 мл/мин

градиент№3 2М 50 мМ 1ЧН4Ас 30-55/600 55-75/460 - 1060

После серии экспериментов был подобран оптимальный для данной буферной системы градиент (градиент №3, табл 4), позволивший достичь заданного выхода (75+5%) продукта с чистотой более 90% Но из-за низкой растворимости белков время градиентной элюции пришлось увеличить почти в 2 раза по сравнению с 6 М буферной системой при тех же выходах

Масштабирование данного процесса в производственных условиях оказалось экономически невыгодным из-за большей (в 2 раза) продолжительности хроматогра-фической очистки (градиент №2, табл 4)

Расход буферных растворов на основе 6М мочевины на 1 хроматографию составлял около 450л Хроматографическая очистка ДАИ таким объемом буферных растворов на основе 2М мочевины и 50мМ аммоний ацетата позволила достичь выхода 52%, что не рентабельно

Следующим шагом по оптимизации условий хроматографии стало использование буферов на основе 2М мочевины и 100 мМ 1ЧН4Ас Повышенная концентрация аммоний ацетата привела к увеличению скорости элюции примесей и к уменьшению времени хроматографии Также, из-за большей ионной силы использовавшихся буферов повысилась элюирующая сила буферной системы, что позволило понизить содержание в элюирующем буфере КС1 до 0,5 М

Хотя данная система и позволила уменьшить расход буферных растворов до заданного, но выход составил только 69% Дальнейшее увеличение содержания в буферных растворах аммоний ацетата было не приемлемо, так как приводило к значи-

тельному повышенной коррозионной активности. Поэтому было решено оптимизировать другие важные процессы хроматографической очистки.

Ьыло решено увеличить ионную силу раствора трипсинолизата таким образом, чтобы часть примесей не задерживалась на сорбенте, а зоны сорбировавшихся бел кои были больше разнесены по колонке для их лучшего разделения при дальнейшей хроматографии.

Таблица 5.

Сравнение эффективности применение различных буферных систем на основе 2 М мочевины при очистке диаргинининсулииа из трипсинолизата

Се- Концен- Мо- Количе- Сум- Чис- Объем Кон- Количе- Выход

рия трация ляр! IOC ство до- марную тота соб- цен- ет во чистого

экспе NHIAL- В ть KCl бавлен- расход ДАИ, ранных трация ДАИ в ДАИ %

риме буфер- п элюи- ного буферов. % фрак- ДАИ, чистых

нтов, ных рас- рую- KCl в л ций, Л г/л фракци-

№ творах, щем трипеп- ях, г

мМ буфере. нолизат, «

М мМ

i 50 1 0 5,2 93,7 0,65 2,99 ¡,94 90

2 100 I 0 3,3 У 1,3 f ,08 1,26 1,36 63

3 100 0,5 0 3,6 02,9 1,16 1,28 1,49 69

4 100 0,5 20 3,8 93,8 1,36 1,24 1,68 78

5 100 0,5 40 3,2 90,1 1,13 1,30 1.47 68

6 100 0,5 40 3,5 92.8 Ш 1.16 1,88 89

Увеличения ионной силы трипсинолизата достигали добавлением KCl, который уже присутствовал в грипеннолизате,

Проведение нескольких серий экспериментов с добавлением различных количеств KCl, оптимальная концентрация которого оказалась 40м М. Во время экспериментов были скоррект ированы профили градиентов.

Результаты и исходные данные серий экспериментальных хроматографии представлены в табл. 5 (серым выделены эксперименты проведенные при использовании одного градиента).

Таким образом, путем увеличения элюирующей силы наносимого трипсинолизата и концентрации буферной соли в используемых буферных растворах поставленная задача была решена.

Оптимизация процесса трансформации гибридного белка при получении инсулина человека

Использование для получения инсулина человека метода раздельного гидролиза, включающего в себя трипсинолиз ГБ с получением ДАИ, его хроматографическая очистка на ЗР-БерЬагозе ИР, концентрирование с последующей трансформацией очищенного ДАИ карбоксипептидазой В до инсулина имеет как ряд преимуществ, так и свои недостатки Так ДАИ за счет двух остатков аргинина имеет больший положительный заряд, чем молекула инсулина и при ионообменной хроматографии ДАИ легко очищается от белков, трудноотделимых в дальнейшем (например, ДТИ) от ин-сулна Но большая продолжительность процесса (около 50 часов), большие потери инсулина, в виде МАИ, ДГИ и остатков ГБ, на стадии трипсинолиза (до 20%) и во время последующих манипуляций (до 25%), приводят к тому, что практический выход очень низок Более совершенным и экономически выгодным является метод совместного гидролиза, при котором ГБ одновременно обрабатывается трипсином и карбоксипептидазой В с получением инсулина в одну стадию Такая схема производства, в следствии полного гидролиза ГБ до инсулина, исключает потери в виде побочных продуктов реакции и неполного гидролиза ГБ Трансформация ГБ в инсулин за одну стадию кроме увеличения выхода позволяет значительно снизить временные затраты, тем самым повышая производительность производства и снижая себестоимость Основным недостатком данного метода является образование во время гидролиза примесей, трудноотделимых от инсулина (ВЗО-дезтреонининсулина и др) Таким образом при разработке метода совместного гидролиза ГБ главной задачей являлся поиск оптимальных физико-химических условий, при которых нарабатывается незначительные количества трудноотделимых примесей

Для рассмотрения возможности перехода на более технологичную схему был проведен ряд экспериментов по поиску оптимизации условий проведения совместного гидролиза

Совместный гидролиз ГБ протекает в две стадии трипсинолиза ГБ до промежуточных продуктов (диаргинининсулина и моноаргинининсулина) и их карбокси-пептидолиза до инсулина Таким образом, трипсинолиз является определяющей, а карбоксипептидолиз - зависимой стадией совместного гидролиза Следовательно все

продукты, образовывающиеся при трипсинолизе ГБ обязательно будут образовываться и во время реакции совместного гидролиза

В начале было использовано стандартное соотношение «фермент/субстрат» как и при раздельном гидролизе, а количество ферментов рассчитывалось по формулам [1] и [2]

ОспгЬ ~

_ йгБ-а

750

[2]

где (2гб - масса гибридного белка, г, а - содержание инсулина в Р1№07 оно равно 0,3, С2сал - масса карбоксипептидазы В, г

В результате проведения гидролиза при данном соотношении фермент субстрат и при рН=7,2±0,1, 1=8±1 °С был получен инсулин с примесью ДТИ более 20%, что недопустимо

Для определения оптимальной рН и температуры при совместном гидролизе были проведены серии экспериментов, в результате которых была замечена зависимость увеличения количества ДТИ при повышении температуры (рис 3)

1 С0МРАЯ1МУЕХР СЮИ0116 17040®»»лп 1чс1гТ=13

2 СОМРАЯГ-'УЕХР вГОЯМ. 16 17 04 03Б88т Ыс1гТ=24 Я ППМРАЯМУРХР П1Г)ЯЩ 1В 17 04 ПГК№п Ь|ПгТ=ГЯП

иУ_У13_1 IIV У1Я

15-ЗЯМ5

ф!п

26 00

27 00

31,00

Рис 3 Зависимость результата совместного гидролиза от температуры Примечание 1 - инсулин, 2 - ДТИ, 3 - хроматограмма гидролиза при 13 °С, 4 - хро-матограмма гидролиза при 24 °С, 5 - хроматограмма гидролиза при 30 °С

При определении оптимума рН была получена схожая картина увеличения количества ДТИ от увеличения рН

Полученные зависимости не линейны и при проведении экспериментов при низких температурах (1 - 6°С) и значениях рН в районе 7,1±0,1 было выяснено, что

результаты гидролиза практически ие изменяются, но содержание ДТИ все еще велико (5-10%)

Таким образом был найден оптимум проведения совместного гидролиза рН=7,1±0,1 и 1=5±1°С

В результате проведенных экспериментов было выяснено, что соотношение ГБ фермент влияет только на время гидролиза, но не на качество получаемого продукта Таким образом главным при поиске оптимальных концентраций ферментов было определение оптимального соотношения трипсин карбоксипептидаза В

При анализе динамики накопления продуктов во время трипсинолиза было замечено, что если во время не остановить реакцию, то концентрация ДАИ начнет падать, а ДТИ - расти При проведении совместного гидролиза накопление ДТИ происходило одновременно с ростом концентрации инсулина и по завершении гидролиза концентрации белков оставались неизменными В результате было выдвинуто предположение о том, что ДТИ - продукт побочного воздействия трипсина (или его примесей) на ДАИ, уменьшение времени нахождения которого в растворе приведет к снижению концентрации ДТИ Этого можно достичь увеличением содержания кар-боксипептидазы В Также было выдвинуто предположение, что инкубация перед гидролизом трипсина в неблагоприятных условиях, позволит снизить содержание примесей и, тем самым, приведет к снижению конечной концентрации ДТИ

В результате проведенных экспериментов выдвинутые предположения были подтверждены (рис 4) Доказано, что при массовом соотношении карбоксипептидаза В трипсин > 1,25 1 и при рН=7,1±0,1 и 1=5±1°С содержание в гидролизате ДТИ равно 2,5 ±0,5%

боксипептидаза В инкубированный трипсин = 1,25 1

Эксперименты по инкубированию трипсина в различных условиях показали, что количество ДТИ уменьшается Инкубация раствора трипсина с концентрацией 10 мг/мл в 0,01Н НС1 24 часа при 4 °С позволила значительно уменьшить содержание ДТИ и не привела к потере активности фермента

Уменьшение температуры и рН ниже 5°С и 7,0 соответственно, приводило к значительному увеличению времени гидролиза, что не компенсировалось небольшим (менее 0,2%) уменьшением содержания ДТИ Увеличение относительного содержания карбоксипептидазы В также не приводило к значительному уменьшению содержания ДТИ, но значительно увеличивало себестоимость продукта

В результате проведенной работы были определены оптимальные физико-химические условия проведения совместного гидролиза ГБ

1 Температура реакционной среды <6°С,

2 рН<7,1±0,1,

3 соотношение карбоксипептидаза В трипсин > 1,25 1,

4 использование подготовленного трипсина путем инкубации его раствора с концентрацией 10 мг/мл в 0,01Н НС1 24 часа при 4 °С

При масштабировании процесса на производственные мощности в целях снижения себестоимости и ограниченности технологического процесса по времени было найдено оптимальное соотношение ГБ карбоксипептидаза В трипсин = 1000 1,25 1 При таком соотношении гидролиз ГБ с концентрацией 8±2 г/л при рН=7,1±0,1 и 1=5±1°С продолжается 14±3 часа, степень гидролиза при этом не менее 95%

Инсулин, полученный по разработанной технологии, содержит ДТИ и чистоту около 65% (по данным ВЭЖХ), недостаточную для достижения приемлемого выхода на последующей стадии очистки методом препаративной ВЭЖХ Буферная система на основе 6М мочевины не подходила для очистки инсулина на сорбенте БР-БерИагозе И3 в следствии высокой себестоимости получаемого продукта Разработанная нами методика очистки ДАИ на БР-БерЬагозе НЕ7, включающая предварительное увеличение ионной силы гидролизата добавлением 40 мМ КС1 и использование буферной системы на основе 2М мочевины и ЮОмМ ацетата аммония, оказалась оптимальна и для очистки инсулина Это позволило использовать метод совместного гидролиза в промышленных условиях и получать инсулин с чистотой не менее 94% при выходе с хроматографии не менее 80±5% Таким образом, разработанный метод вписался в

технологическую схему производства ГИИЧ на ОАО «Национальные биотехнологии» не требуя использования нового оборудования и дополнительных стадий

В результате перехода на разработанную нами технологическую схему выход инсулина с чистотой более 94% можно поднять, при увеличении производства на предыдущих стадиях, в 3 раза до 4,7 кг/мес (табл 6)

Таблица 6

Сравнение экономической эффективности методов получения _генно-инженерного инсулина человека__

Метод про- Количест- Время Себе- Производст- Циклов за Объем

изводства во процес- 1 цикла, ч стоимость во инсулина месяц, шт продукции

сов в цикле 1гр, руб за цикл, гр гр /мес

раздельный гидролиз 4 94 738 216 7 1512

совместный гидролиз 2 36 274 238 20 4760

В результате проведенной нами работы производство ГИИЧ удалось увеличить в 2 раза, и оно достигло 3 кг/мес Себестоимость получаемого инсулина уменьшилась на 464 руб/г (63%) Экономическая выгода составила 16 7 млн руб в год, при производстве 36 кг/год

Разработка стадии гидролиза и хроматографической очистки генно-инженерного инсулина человека при использовании нового гибридного белка

Использование рекомбинантного белка PINS07 с низким (около 30%) содержанием инсулина не позволяет кардинально увеличить выход при существующих мощностях Применение нового штамма-продуцента, экспрессирующего белок с более высоким содержанием инсулина, при прочих равных условиях, позволяет значительно снизить себестоимость ГИИЧ и повысить выход конечного продукта С этой целью были проведены исследования по использованию более высокоэффективных штаммов-продуцентов инсулина, одним из которых является штамм Е coli JM109/pHINSl 1 - продуцент гибридного белка HINS 11

Данный ГБ отличался от использовавшегося ранее PINS07 более короткой ли-дерной последовательностью За счет этого относительное содержание инсулина в ГБ повысилось с 33% до 38% Сайты протеолитического расщепления ферментов были сохранены прежними за счет чего основные продукты гидролиза не должны были отличаться Но новые сайты протеолитического расщепления трипсина были внесены в

лидирующую последовательность, что могло сказаться на стадии хроматографиче-ской очистки

Экспериментальный трипсинолиз проводили при тех же условиях, что и трип-синолиз РШ507

Рис 5 Сравнение результатов трипсинолиза HINS11 и PINS07

Примечания 1 - результат трипсинолиза HINS11, 2 - результат трипсинолиза PINS07, 3 - ДАИ, 4 -МАИ, 5 -ДТИ

На рис 5 приведена сравнительная хроматограмма результата трипсинолиза

HINS 11 наложенная на результат трипсинолиза PINS07 с примерно равными концентрациями целевого ДАИ Хорошо видно, что кроме ДАИ в растворе присутствуют также основные белки, получаемые при трипсинолизе PINS07 МАИ и ДТИ

Рис 6 Результат хроматографической очистки ДАИ, из трипсинолизата HINS 11 Примечание 1- хроматограмма исходного трипсинолизата HINS 11,2- хроматограмма наиболее чистой фракции, полученной при хроматографической очистке ДАИ, 3 - трудноотделимая примесь, 4,5 - легко отделимые примеси, 6 — В30- дезтре-онининсулин

Сопоставляя данные о конечных концентрациях белков в растворе трипсиноли-зата было установлено, что динамика процесса гидролиза идентична у обоих ГБ Основное различие результатов гидролиза отмечено при рассмотрении левой части рис 5 Так при трипсинолизе HINS11, кроме приведенных выше белков, присутствует большое количество примесных белков При последующей попытке очистить полученный ДАИ на сорбенте SP-sepharose FF оказалось, что один из примесных белков со временем выхода на ВЭЖХ хроматограмме около 7,5 мин (№3 на рис 6), элюиру-ется в одно и тоже время, что и ДАИ, причем максимумы концентраций ДАИ и этого белка также совпадают (рис 6) Ввиду явного равенства pl у ДАИ и белка №3 (рис б) был сделан вывод о невозможности очистки ДАИ из трипсинолизата HINS 11 с при-емпемой чистотой и выходом Дальнейшие эксперименты в этом направлении были прекращены

Анализ полученных результатов позволил провести эксперимент по совместному гидролизу HINS11 Как уже было отмечено, при проведении трипсинолиза HINS11 образуются те же самые белки (ДАИ, МАИ и ДТИ) и с той же самой динамикой, что и при трипсинолизе PINS07 Так как при совместном гидролизе ведущей является реакция именно трипсинолиза, а ведомой - карбоксипептидолиз, то ожидали, что и при совместном гидролизе динамика процесса образования продуктов реакции останется прежней Поэтому для проведения совместного гидролиза HINS11 использовали те же условия, что и при гидролизе PINS07

Рис 7 Результат совместного гидролиза HINS 11

Примечание 1 - хроматограмма результата совместного гидролиза P1NS07, 2 - хро-матограмма результата совместного гидролиза HINS11, 3 - примесный белок, 4 - белок, мешающий ионообменной хроматографической очистке ДАИ, 5 - А21-дезамидоинсулин

Результаты эксперимента приведены на рис 7, где сравнены результаты совместных гидролизов PINS07 и HINS11, имевших одинаковую концентрацию ГБ Видно, что при совместном гидролизе HINS 11 также образуется много примесей, которых нет при гидролизе PINS07, но выход значительно выше 45% и 32%, соответственно Основными примесями, полученными при совместном гидролизе были те же самые белки (пики 3 и 4 на рис 7), что и при трипсинолизе (пики 5 и 3 на рис 6), соответственно Данные белки, как уже говорилось, элюируются при разной ионной силе подвижной фазы и не загрязняют фракции с ДТИ, а, следовательно, не мешают при хроматографии инсулина

Проведенные эксперименты по гидролизу HINS11 и последующей хромато-графической очистке полученного ГИИЧ на сорбенте SP-sepharose FF статистически достоверно показали возможность применения данного ГБ для производства ГИИЧ методом совместного гидролиза, разработанным в ходе этой работы Так, при гидролизе HINS И образуется почти на 30% больше инсулина на единицу массы ГБ, чем при гидролизе PINS07 При последующей хроматографической очистке гидролизата выигрыш снижается, но, тем не менее, составляет боле 20% Расчетная экономическая выгода использования данного штамма-продуцента составила более 1,7 млн рублей в год при увеличении производства до 43,3 кг/год

ВЫВОДЫ

1 Усовершенствована технология производства инсулина человека, позволившая увеличить выход готового продукта в 2 раза при снижении его себестоимости более чем на 60%

2 Разработана новая схема очистки продуктов гидролиза в ГБ на сорбенте SP-sepharose FF с применением буферной системы на основе 2 М мочевины Добавление в гидролизат ГБ KCl до концентрации 140 мМ и использование буферной системы на основе 2М мочевины и ЮОмМ NH4Ac позволило, не уменьшая выход и степень очистки, оставить расход буферных растворов при хроматографической очистке на том же уровне, что и при использовании 6М мочевины

3 Создана оригинальная методика проведения совместного гидролиза ГБ трипсином и карбоксипептидазой В, в разработке которой использованы данные полученные при поиске оптимальных условий процесса трипсинолиза ГБ В результате были

определены и статистически достоверно доказаны промышленные условия совместного гидролиза ГБ t=5±l °С, рН=7,1+0,1, соотношение белок карбоксипептидаза В трипсин = 1000 1,25 1 Перед использованием необходимо инкубировать раствор трипсина с концентрацией 10 мг/мл в течении 24 часов в 0,01Н HCl при 4 °С

4 Впервые была разработана технологическая схема получения ГИИЧ, основанная на использовании нового штамма Е coli JM109/pHINSl 1, продуцента рекомби-нантного белка HINS 11

5 Технология получения инсулина, основанная на проведении совместного гидролиза ГБ и последующей хроматографической очистке инсулина человека на SP-Sepharose FF с применением буферных растворов на основе 2М мочевины, является универсальной для использования в биотехнологическом производстве ГИИЧ и масштабируемой в производственных условиях

6 Получен алгоритм определения пригодности различных препаратов протеоли-тических ферментов для нужд биотехнологического производства, основанный на выявленном наборе критериев

Практические рекомендации

1 Для определения пригодности нового препарата протеолитического фермента необходимо с ним и контрольным (например, используемом ранее) препаратом фермента провести серию параллельных экспериментов по гидролизу субстрата при оптимальных условиях Контроль процесса и сравнение результатов гидролиза необходимо осуществлять с использованием аналитических систем ОФ ВЭЖХ

2 Для получения ГИИЧ с минимальным количеством трудноотделимых примесей при проведении совместного гидролиза ренатурированного ГБ, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека, пептидный линкер His^GlySerArg и лидерный пептид, необходимо использовать смесь карбоксипепти-дазы В и трипсипа в массовом соотношении не менее 1,25 1 и поддерживать t=5±l °С, рН=7,2±0,1 Перед использованием необходимо инкубировать раствор трипсина с концентрации 10 мг/мл в течении 24 часов в 0,01 Н HCl при 4 °С

3 При снижении концентрации хаотропа (мочевины, гуанидинхлорида и т д) в буферных системах, используемых для очистки белков и пептидов на ионообменных

сорбентах типа SP-sepharose FF для сохранения прежних объемов расхода буферных растворов при равном выходе готовой продукции необходимо повышать концентрацию буферной соли и увеличивать ионную силу наносимого материала путем добавления солей щелочных металлов, например KCl

4 При производстве генно-инженерного инсулина человека перспективно использовать в качестве продуцента штамм Е coli JM109/pHINSl 1, который позволяет увеличить выход инсулина-сырца и снизить себестоимость препарата

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Купцов В Н , Горкун Т А , Борисов Н В , Борисова Т IO , Шматченко Н А , Бай-дусь А Н , Степанов А В Оценка влияния физикохимических факторов и состава буферных растворов на выход инсулина человека // Материалы Третьего московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г), с 110

2 Купцов В Н , Горкун Т А , Борисов Н В , Борисова Т Ю , Шматченко Н А , Степанов А В Оценка качества трипсина, используемого при производстве генноин-женерного инсулина человека // Материалы Третьего московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г),с 111

3 Купцов В Н , Горкун Т А , Борисова Т Ю , Шматченко Н А , Честухина Г Г , Степанов А В Разработка критериев оценки качества трипсина, используемого в биотехнологическом производстве // Материалы 2-ой Международной конференции «Наука-бизнес-образование» «Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда» (г Пущино, МО, май 2005 г) с 27-28

4 Купцов В Н , Горкун Т А , Шматченко Н А , Байдусь А Н , Степанов А В Оптимизация условий стадии хроматографической очистки диаргинининсулина при производстве генноинженерного инсулина человека // Материалы 2-ой Международной конференции «Наука-бизнес-образование» «Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда» (г Пущино, МО, май 2005 г) с 85-87

5 Купцов В Н , Байдусь А Н , Шматченко Н А , Борисов Н В , Горкуи Т А , Борисова Т Ю , Степанов А В Оптимизация условий ферментативного гидролиза при производстве генно-инженерного инсулина человека // Биотехнология № 4 2006г

6 Шматченко В В , Шматченко Н А , Байдусь А Н , Купцов В Н , Ноздрин В Н , Степанов AB Рекомбинантная плазмидная ДНК pHINSll, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека, клетка Escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной ДНК pHINSll, штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHINSl 1 - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека, и способ получения инсулина человека Заявка на патент РФ № 2006137635, 25 10 2006

Типография ордена «Знак Почета» издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 196 Тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Купцов, Василий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Сахарный диабет.

1.1 Классификация.

1.2 Клиника.

1.3 Лечение сахарного диабета.

1.4 Показания к применению инсулина человека.

Глава II. Открытие инсулина и его свойств.

2.1 История открытия инсулина.

2.2 Структура инсулина.

2.3 Биосинтез и секреция инсулина.

2.4 Аномальные инсулины человека.

2.5 Применение мутантных ГИИЧ в лечебных целях.

Глава III. Получение инсулина.

3.1 Химический синтез инсулина человека.

3.2 Получение полусинтетического инсулина.

3.3 Синтетико-ферментативный метод получения инсулина человека.

3.4 Получение генно-инженерного инсулина человека.

3.4.1 Использование эукариотов при производстве ГИИЧ.

3.4.2. Получение ГИИЧ при использовании рекомбинантных штаммов Е. coli

3.4.3. Ферменты, используемые при производстве ГИИЧ.

3.4.3.1. Трипсин.

3.4.3.2. Карбоксипептцдаза В.

3.4.4. Производство ГИИЧ в СССР и России.

3.4.5. Современное производство ГИИЧ в России.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава IV. Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.2 Исходный материал.

4.3 Оборудование.

4.4 Анализ экспериментальных материалов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава V. Разработка критериев оценки пригодности ферментов, используемых в производстве ГИИЧ при трансформации ГБ.

5.1 Ферменты, применяемые при производстве ГИИЧ.

5.2 Схема тестирования образцов трипсина.

5.3 Отбор препаратов трипсина, удовлетворяющих требованиям производства генно-инженерного инсулина человека.

5.4 Схема проверки новых партий карбоксипептидазы В.

Глава VI. Оптимизация процесса трансформации ГБ при получении инсулина.

6.1 Постадийный гидролиз ГБ с выделением промежуточных продуктов трипсинолиза

6.2 Постадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В без выделения промежуточных продуктов трипсинолиза.

6.3 Одностадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В.

6.3.1. Подбор оптимальной температуры для одностадийного гидролиза ГБ.

6.3.2 Подбор оптимального рН для одностадийного гидролиза ГБ.

6.3.3 Подбор оптимальных условий подготовки ферментов для одностадийного гидролиза ГБ.

6.3.4 Подбор оптимальных концентраций ферментов для одностадийного гидролиза ГБ.

Глава VII. Оптимизация условий хроматографической очистки диаргинининсулина.

7.1 Подбор оптимальной концентрации мочевины в буферных растворах.

7.2 Подбор оптимальной концентрации буферной соли в буферных растворах.

7.3 Масштабирование экспериментальных результатов на промышленный процесс.

Глава VIII. Использование результатов экспериментов в производстве ГИИЧ.

8.1 Проведение препаративного совместного гидролиза ГБ при получении ГИИЧ.

8.2 Проведение хроматографической очистки ГИИЧ на SP-Sepharose FF.

Глава IX. Получение ГИИЧ при использовании нового ГБ.

9.1 Проведение триптического гидролиза HINS11.

9.2 Разработка условий хроматографической очистки диаргинининсулина из трипсинолизата HINS11.

9.3 Разработка условий проведения совместного гидролиза HINS11.

9.4 Проведение экспериментальной хроматографии инсулина, полученного в результате совместного гидролиза HINS11.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека"

Актуальность. Инсулин - гормон белковой природы, вырабатываемый Р-клетками поджелудочной железы для поддержания гомеостаза глюкозы в крови [1,2]. Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или наследуемых факторов приводит к заболеванию сахарным диабетом (СД) [2, 3, 4]. Это системное заболевание, следствием которого является высокое содержание глюкозы в крови, вызывает поражение многих внутренних органов и систем организма, что неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а без лечения - к смерти. СД называют «болезнью цивилизации», т.к. первые его описания относятся к античным временам. Инсулин относится к жизненно важным лекарственным средствам, которые Всемирная организация Здравоохранения рекомендует самостоятельно производить тем странам, чье население превышает 50 млн. человек [5].

Впервые инсулин был выделен в чистом виде и применен для лечения в 1921 г., а уже в 1923 г. начато его массовое производство. В то время единственным доступным для промышленного использования источником инсулина являлись поджелудочные железы крупного рогатого скота и свиней, поступавшие с боен [1,6]. Этому способствовало отсутствие видовой специфичности в проявлении функций у инсулинов различного происхождения. Однако, по мере накопления данных о последствиях инсулинотерапии выяснилось, что у большого количества пациентов по мере применения животного инсулина развивается ряд серьезных осложнений: падает чувствительность к вводимому инсулину, что приводит к постоянной корректировке вводимой дозы; проявляются различные аллергические реакции, накапливаются антитела к инсулину и т.д. Данные проблемы связывали с развитием иммунной реакции, которая вызвана структурными отличиями инсулина человека от животных инсулинов [6]. Только в конце 50-х, начале 60-х годов XX века развитие молекулярной биологии позволило определить структуру инсулинов различного происхождения. Результаты данных исследований легли в основу разработок промышленного получения инсулина, идентачного человеческому, основными способами получения которого, в настоящее время, являются полусинтетический и биотехнологический. При использовании полусинтетического метода свиной инсулин подвергается химической модификации [1,6]. Биотехнологическим путем инсулин производят используя высокопродуктивные генетически измененные микроорганизмы. Полусинтетический метод полностью зависит от сырья, поступающего с боен. Биотехнологический метод лишен этого недостатка, так как потребляет только энергоресур-сы[7]. Также важным достоинством биотехнологического метода является простота масштабирования процесса. Поэтому, получение инсулина при помощи высокопродуктивных штаммов рекомбинантных микроорганизмов, обеспечивающих стабильный уровень экспрессии встроенного гена инсулина человека, становится актуальным. Однако в микроорганизмах инсулин синтезируется в виде неактивного биотехнологического предшественника, гибридного белка (ГБ), поэтому получение генно-инженерного инсулина человека (ГИИЧ) является сложным многостадийным процессом, основанным на нескольких этапах трансформации и препаративной очистке промежуточных продуктов и инсулина. Это отражается на выходе и стоимости генно-инженерного инсулина. В связи с этим значительно возрастает значение разработки оптимальной технологической схемы, обеспечивающей высокий выход, и чистоту конечного продукта. Основными направлениями по оптимизации технологии производства являются поиск легко вписываемых в существующую технологию, дающих заметный выигрыш по времени, уменьшающих себестоимость и легко масштабируемых решений на основе существующего оборудования.

Настоящая работа основана на исследованиях, проведенных по оптимизации стадии получения первичного инсулина (инсулина, имеющего чистоту 90-96% и являющегося сырьем для стадий финишной очистки инсулина методами высокоэффективной жидкостной, гидрофобной, гель-эксклюзивной хроматографий и др.) из ГБ. Работа проводилась в Федеральном государственном унитарном предприятии «22 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Минобороны России». Результаты диссертации проверяли на базе существующего производства генно-инженерного инсулина человека в ОАО «Национальные биотехнологии». Проектирование данного производства было начато в 1996г. на основе совместных разработок коллективов ГНЦ ПМ (п. Оболенск) и ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. В 2003г. в п. Оболенск была запущена производственная линия, основанная на получении ГИИЧ из гибридного белка, продуцентом которого являлся штамм E.coli JM109/pPINS07.

Целью исследования стало усовершенствование технологии получения генно-инженерного инсулина человека с целью снижения себестоимости и увеличения выхода конечного продукта.

Перед началом работы основными проблемами производства были:

• использование дорогих ферментов иностранного производства из-за отсутствия методик поиска более дешевых отечественных аналогов;

• применение буферных растворов с высоким содержанием мочевины при хромато-графической очистке диаргинининсулина (ДАИ) на промежуточной стадии получения ГИИЧ;

• применение технологической схемы трансформации ГБ в инсулин с большим количеством промежуточных стадий (т.н. схема «раздельного гидролиза»);

• низкое содержание инсулина в гибридном белке, продуцируемом штаммом E.coli JM109/pPINS07.

Таким образом, для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. разработать методы оценки пригодности ферментативных препаратов протеаз для нужд биотехнологического производства;

2. найти более экономически выгодные и доступные отечественные препараты трипсина, для применения в процессе производства инсулина;

3. разработать оптимальную технологию хроматографической очистки инсулина и его предшественников на SP-Sepharose FF с использованием буферных растворов с меньшим содержанием мочевины, при сохранении объемов расходуемых буферных систем;

4. разработать новую более совершенную технологическую схему трансформации гибридного белка в инсулин;

5. разработать технологию получения инсулина человека, основанную на использовании нового, более экономически выгодного штамма-продуцента.

Практическая значимость.

Предложен метод ферментолиза и хроматографической очистки, позволяющий повысить выход конечного продукта инсулина с единицы гибридного белка и значительно снизить себестоимость продукта за счет применения 2-х М мочевины и замены импортных ферментов на отечественные.

Разработанная технология получения инсулина применяется при производстве ГИИЧ на ОАО «Национальные биотехнологии» (изменения к регламенту на производство субстанции генно-инженерного инсулина человеческого № ПР-50159728-01 -02). Получена приоритетная заявку на патент РФ № 2006137635 от 25.10.2006 на способ получения ГИИЧ. Использование результатов работы в производстве привело к увеличению производство ГИИЧ более чем в 3 раза, понизить себестоимость продукта на 65%, при этом экономический эффект составил около 30 млн. руб. в год.

Новый способ гидролиза и очистки позволил получать конечный продукт с чистотой 98%, что соответствует требованиям международной фармакопеи и ФСП на субстанцию инсулина. Разработанный алгоритм позволил статистически достоверно определять пригодность различных ферментных препаратов для нужд биотехнологического производства с наименьшими временными и денежными затратами. Использование нового метода очистки инсулина и его предшественников на SP-Sepharose FF с использованием буферных растворов на основе 2 молярной мочевины привел к снижению потребления мочевины в три раза не снижая чистоты получаемого полупродукта. Технология получения первичного инсулина, основанная на результатах исследований процесса совместного гидролиза гибридного белка и новом методе очистки инсулина, позволила значительно увеличить выход готовой продукции и снизить издержки производства, используя существующее оборудование. Разработанные технологические приёмы легли в основу новой технологии получения генно-инженерного инсулина на основе нового штамма-продуцента Е. coli JM109/pHINSl 1. Научная новизна.

1. Изучено влияние температуры, рН и количества ферментов на результаты триптиче-ского и совместного гидролизов PINS07.

2. Определено, что динамика накопления продуктов гидролиза при триптическом гидролизе ренатурированного гибридного белка, постоянна при условии, что гибридный белок состоит из лидерной последовательности, пептидного линкера GlySerHis^GlySerArg и про-инсулина человека.

3. Показано, что при очистке инсулина и его производных на сорбентах с сильными ка-тионообменными свойствами (например SP-Sepharose FF) можно использовать буферные системы на основе ацетата аммония с низким содержанием мочевины (до 2 М и менее) без увеличения временных затрат при получении полупродукта той же чистоты, как и при использовании буферных систем с высоким содержанием (6 М и более) мочевины. Данных результатов можно добиться путем увеличения ионной силы гидролизата и увеличения концентрации аммоний ацетата в используемых буферных растворах.

4. Предложен универсальный метод получения первичного инсулина при использовании штаммов-продуцентов ГБ, имеющих различные лидерные последовательности.

5. Разработан новый метод одновременного (совместного) гидролиза ГБ карбоксипептидазой В и трипсином в соотношении (1,25-40): 1, в котором для уменьшения количества трудноотделимых примесей используется трипсин, инкубированный 24 часа при 4 °С в 0,01 ННС1.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан алгоритм позволяющий определить пригодность ферментативных препаратов для нужд биотехнологического производства генно-инженерных препаратов.

2. Показана возможность использования буферной системы на основе 2М мочевины при хроматографической очистке инсулина и его производных на SP-sepharose при том же расходе буферных растворов и с той же эффективностью, что и при использовании буферной системы на основе 6М. Для этого необходимо увеличить ионную силу наносимого материала и увеличить содержание буферной соли в буферных растворах.

3. Доказано, что проведение одновременного гидролиза гибридного белка ГИИЧ, состоящего из лидерной последовательности, пептидного линкера GlySerHis^GlySerArg и проинсулина человека, трипсином и карбоксипептидазой В необходимо проводить при t=5±l °С, рН=7,2±0,1, и при соотношении гибридный белок:трипсин:карбоксипешвдаза В = 1000:1,25:1. Перед использованием необходимо раствор трипсина в 0,01 Н НС1 с концентрацией 10 мг/мл инкубировать в течении 24 часов при 4 °С.

4. Разработана новая универсальная и масштабируемая технология получения ГИИЧ на основе штамма-продуцента Е. coli JM109/pHINSl 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В литературном обзоре обобщены данные о сахарном диабете, открытии инсулина, его структуре, свойствах и способах получения.

Гпава I. Сахарный диабет

Сахарный диабет - эндокринное заболевание, обусловленное абсолютной и/или относительной инсулиновой недостаточностью. Под абсолютной инсулиновой недостаточностью подразумевается сниженная секреция инсулина, а относительная - характеризуется потерей, в той или иной степени, чувствительности инсулинзависимых тканей к биологическому действию инсулина.

СД является самым распространенным заболеванием в промышленно развитых странах мира. По данным ВОЗ во всем мире насчитывается от 120 до 140 миллионов больных СД, причем к 2025 году прогнозируется увеличение числа больных в два раза [2, 5, 8,9].

По определению Всемирной организации здравоохранения сахарный диабет охарактеризован как неинфекционная эпидемия и по распространенности занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [2,8,10].

1.1 Классификация

Существует два вида СД: тип I, инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), и тип П, инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНСД). Тип I характеризуется тем, что поджелудочная железа утрачивает свою способность вырабатывать жизненно необходимый инсулин. Этой формой чаще всего заболевают дети и подростки, однако наблюдается рост заболевания среди людей более зрелого возраста. Тип II обуславливается невосприимчивостью инсу-линовых рецепторов клеток [3,4,5].

1.2 Клиника

Симптомы неосложненного сахарного диабета обусловлены, главным образом, ин-сулиновой недостаточностью, что проявляется гипергликемическим синдромом. Поскольку инсулин обладает анаболическим действием, то при его дефиците больные худеют, несмотря на компенсаторно повышающийся аппетит, достигающий иногда степени булемии («волчий голод») [3,4,11].

Следует заметить, что не всегда удается однозначно определить по клиническим проявлениям и даже лабораторным признакам тип сахарного диабета, особенно, когда он развивается после 30 лет. Тогда тип диабета определяется клиницистом относительно произвольно, с учетом преобладания у больного признаков, характерных для одного из его типов^, 12].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Купцов, Василий Николаевич

выводы

1. Усовершенствована технология производства инсулина человека, позволившая увеличить выход готового продукта в 2 раза при снижении его себестоимости более чем на 60%.

2. Разработана новая схема очистки продуктов гидролиза ГБ на сорбенте SP-sepharose FF с применением буферной системы на основе 2 М мочевины. Добавление в гидролизат ГБ КС1 до концентрации 140 мМ и использование буферной системы на основе 2М мочевины и ЮОмМ NH4AC позволило, не уменьшая выход продукта и степень очистки, оставить расход буферных растворов при хроматографической очистке на том же уровне, что и при использовании буферной системы на основе 6М мочевины.

3. Создана оригинальная методика проведения совместного гидролиза ГБ трипсином и карбоксипептидазой В, в разработке которой использованы данные полученные при поиске оптимальных условий процесса трипсинолиза ГБ. В результате быж определены и статистически достоверно доказаны промышленные условия совместного гидролиза ГБ: t=5±l °С, рН=7,1±0,1, соотношение белок: карбоксипептидаза В: трипсин = 1000:1,25:1. Перед использованием необходимо инкубировать раствор трипсина с концентрацией 10 мг/мл в течении 24 часов в 0,01Н НС1 при 4 °С.

4. Впервые была разработана технологическая схема получения ГИИЧ, основанная на использовании нового штамма Е. coli JM109/pHINSll, продуцента рекомбинантного белка HINS11.

5. Технология получения инсулина, основанная на проведении совместного гидролиза ГБ и последующей хроматографической очистке инсулина человека на SP-Sepharose FF с применением буферных растворов на основе 2М мочевины, является универсальной для использования в биотехнологическом производстве ГИИЧ и масштабируемой в производственных условиях.

6. Получен алгоритм определения пригодности различных препаратов протеолитиче-ских ферментов для нужд биотехнологического производства, основанный на выявленном наборе критериев.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Купцов, Василий Николаевич, Москва

1. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987, с.247-249.

2. Zimmet P., Alberti K.G., Shaw J. Nature, 2001, v.414, p. 782-787.

3. Аметов A.C. Российский медицинский журнал, 1998, т.6, № 12, с. 1321-1324.

4. Чазова Т.Е. Российский медицинский журнал, 2003, т.11, № 27, с. 1507-1514.

5. Дедов И.И. Сахарный диабет в Российской Федерации: проблемы и пути решения. Сахарный диабет. 1998, №1, с. 212-285.

6. Старостина Е.Г. Инсулин и инсулинотерапия: «темный лес» или стройная система? В мире лекарств, 1998, №2, с. 32-39.

7. КоледоваЕ.А. Современные проблемы инсулинотерапии. Сахарный диабет. 2001, № 12, с. 66-69.

8. Klyushnichenko V., Bruch R., Bulychev A. e. a. Bioprocess International, 2004, v. 2, №8, p. 48-59.

9. Хигинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988, с. 325—338.

10. Amos A., McCarty D., Zimmet P. Diabetes Med. 1997. - №14. - P. 57-85.

11. Балаболкин М.И., Клебанова E.M., Креминская B.M. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете. Сахарный диабет. 1999, №1, с. 212-285.

12. Кудрякова С.В., Сунцов Ю.И. Смертность среди больных сахарным диабетом по данным территориального регистра. Сахарный диабет. 2001, №12, с. 12-20.

13. Kjeldsen Т., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2000, v. 54, p.277-286.

14. Sanger F., Tuppy H. The amino acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. Biochem. J., 1951, v.49, p.463-490.

15. Sanger F., Thompson E.O. The amino acid sequence in the glycyl chain of insulin. Biochem. J., 1963, v.53, p.353-374.

16. Ladish M.R., Kohlmarm K.L. Recombinant Human Insulin. Biotechnol. Prog., 1992., v. 8., p. 469-478.

17. Farias R.N., Lopez Vinals A.E., Posse E., Morero R.D. Relationship between isoelectric point of native and chemically modified insulin and liposomal fusion. Biochem J., 1989., v.264., p.285-287.

18. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Москва, Мир, 1994.

19. Brown Н., Sanger F., Kitai R. The structure of sheep and pig insulin. Biochem. J., 1955, v.60, p. 556-565.

20. Nicol S., Smith L.F. Amino-acid sequence of human insulin. Nature, 1960, v. 187, p.433.

21. Dolan-Heitlinger J. Recombinant DNA and Biosynthetic Human Insulin, A Source Book. Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN, 1982.

22. Derewenda U., Derewenda Z„ Dodson E.J. e. a. Nature, 1989, v. 338, p. 594 596.

23. Bentley G., Dodson E., Dodson G., Hodgkin D., Mercola D. Structure of Insulin in 4-zinc insulin. Nature. 1976, v.261,p. 166-168.

24. Mirmira R.J., Tager H.S. J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 6349-6354.

25. Olsen H.B., Ludvigsen S„ Kaarsholm N.C. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 8836-8845.

26. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М.: Мир, 1993, т. 2, с. 247-263.

27. Hales C.N. Actions of hormones in the regulation of glucose metabolism. Essays in Biochemistry, 1967, v. 3,p. 73-104.

28. Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. Москва, Высшая школа, 1996.

29. Steiner D.F., Oyer P.F. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1967, v. 57, p. 473-480.

30. Steiner D.F., Hallund 0., Rubenstein A. e. a. Diabetes, 1968,v. 17, p. 725-736.

31. Biden T. J. Signal transduction events in the regulation of insulin. Proc. Austral. Physiol, and Pharmacol. Soc., 1997,28, № 1, p. 84.

32. Zierath J.R., Handberg A., Tally M., Wallberg-Henriksson H. C-peptide stimulates glucose transport in isolated human skeletal muscle independent of insulin receptor and tyrosine kinase activation, Diabetologia, v.39, p.306-313.

33. Cheatham В., Kahn C.R. Insulin action and insulin signaling network. Endocrine Rev., 1995, №16, p.l 17-142.

34. Scrutton M.C., Utter M.F. The regulation of glycolysis and gluconeogenesis in animal tissues, Ann. Rev. Biochem., 1968, v. 37, p. 249-302.

35. Given B.D., Mako M.E., Tager H.S., Baldwin D., Markese J., Rubenstein A.N., Olef-sky J., et al. Diabetes due to secretion of an abnormal insulin. N. Engl. J. Med., 1980, v.302, p. 129-135.

36. Tager H.S., Given В., Baldwin D., Mako M., Markese J. et al. A structurally abnormal insulin causing human diabetes. Nature, 1979, v.281. p. 122-125.

37. Kwok S.C.M., Chan S.J., Rubenstein A.N., Poucher., Steiner D.F. Loss of restriction endonuclease cleavage site in the gene of a structurally abnormal insulin. Biochem. Bio-phys. Res. Commun., 1981, v. 98, p.844-849.

38. Shoelson S., Haneda M., Blix P., Nanjo K., Sanke Т., Inouye K., Steiner D. et al. Three mutant insulins in man. Nature, 1983, v.302, p.540-543.

39. Kwok S.C.M., Steiner D.F., Rubenstein A.N., Tager H.S.Identification of the mutation giving rise to insulin Chicago. Diabetes, 1983, v.32, p.872-875.

40. Quiocho F.A., Lipscomb W.N., Adv. Protein Chem., 25,1,1971.

41. Балаболкин М.И. 35-я ежегодная конференция Европейской Ассоциации по изучению диабета. Сахарный диабет. 2001, № 12, с. 35-40.

42. Hirsch I. Insulin analogues. N. Engl. J. Med., 2005, v.352, p. 174-183.

43. Gerich J. Insulin glargine: long-acting basal insulin analog for improved metabolic control. Curr. Med. Res. Opin., 2004, v. 20, p. 31-37.

44. Klein R, Klein ВЕК, Moss SE. Relation of glycemic control of diabetic microvascular complications of diabetes mellitus. Ann Int Med, 1996, v. 124, p. 90-96.

45. Owens D.R., et al. Pharmacokinetics of 1251-labeled insulin glargine in healthy men: comparison with NPH insulin and the influence of different subcutaneous injection sites. Diabetes Care, 2000, v. 23, p. 813-819.

46. Yki-Jarvinen H. Combination therapy with insulin and oral agents. Optimizing glycemic control in patient with type 2 diabetes mellitus. Diabetes Met Res Rev. 2002, v. 18(suppl.3), p. 77-87.

47. Yki-Jarvinen H. Insulin therapy in type 2 diabetes: role of the long acting insulin glargin analogue. Eur J Clin nvest 2004, v. 34, p. 410-416.

48. Fritsche V.M., et al. Glimepiride combined with morning insulin glargin, bedtime NPH insulin, or bedtime insulin glargine in patients with type 2 diabetes mellitus. A randomized control trial. Ann Intern Med. 2003, v. 138, p. 952-959.

49. US Patent №6444641,03.09.2002.

50. US Patent №5939387,17.08.1999.

51. Australian patent № 199965392,02.03.2000.

52. Dixon G. H., Wardlow A.C. Regeneration of insulin activity from the separated and inactive A and В chains. Nature, 1960, v. 186, p. 721.

53. Шредер Э., Любке К. Пептиды. М., 1969, Т. 2, с. 468.

54. Hirschmann R., Nutt R.F., Veber D.F., Vitali R.A., Varga S.L. at all. Studies on the total synthesis of an enzyme. The preparation of enzymatically active material. J. Am. Chem. Soc., 1969, v. 91, p.507-508.

55. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы, т.1. Генетическая и белковая инженерия. М.: Наука, 2004, с. 171-173.

56. Cereghino G.P.L., Cregg G.M. Curr. Opin. Biotechnol, 1999, v. 10, p. 422-427.

57. Watson J.D., Tooze J., Kurtz D.T. Recombinant DNA-A short course. Scientific American Books. W.H. Freeman Co., New York, 1983, p. 231-235.

58. Markussen J., Fill N., Ammerer G., Hansen M.N., Thim L., Norris K. Insulin precursors, process for their preparation and process for preparing human insulin from such Insulin precursors. European patent 0 163 529, Bulletin 65.

59. Thim L., Norris K., Hansen M.T. Insulin precursors, process for the preparation of human insulin. European patent 0 195 691, Bulletin 86/39,24.09.86.

60. Kjeldsen Т., Brandt J., Andersen A.S. e.a. Gene, 1996, v. 170, p. 107-112.

61. Thim L., Hansen M.T., Norris K. e.a. PNAS USA, 1986, v. 83, p. 6766-6770.

62. Kjeldsen Т., Petterson A.F., Hach M. J. Biotechnology, 1999, v.75, p. 195-208.66 US Patent №4,946,828.

63. Brange J. Galenics of Insulin. Berlin-Heidelberg, Springer-Verlag, 1987, p. 1-99.

64. Goeddel D.V., Kleid D.G., Bolivar F. e.a. PNAS USA, 1979, v.76, p.106-110.

65. CreaR., Kraszewski A., Hirose T. e.a. Ibid., 1978, v. 75, p. 5764-5769.

66. Miller W.L., Baxter J.D. Diabetologia, 1980, v. 18, p. 431-436.

67. Williams D.C., Frank R.M., Muth W.L., e.a. Science, 1982, v. 215, №5, p. 687-689.

68. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988, с. 325-338.

69. Burnett J.P. Experimental Manipulation of Gene Expression. N.Y.: Acad. Press, 1983, p. 261-271.

70. Nilsson J., Johansson P., Samuelson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. J. Biotechnology 1996, V. 48, p. 241-250.

71. Kroeff E.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Reversed-Phase High-Perfomance Liquid Chromatography. J. Chromatography, 1989, v. 461, p. 45-61.

72. Frank B.H., Chance R.E. Two routes for producing human insulin utilizing recombinant DNA technology. Munch Med Wochenschr. 1983, Suppl. 1:P, S14-20.

73. Johansson P., Nilsson J., Samuelson E., Moks Т., Stahl S., Uhlen M. Eur. J. Biochemistry, 1988, v. 236, p. 656-661.

74. Ленинжер А.Л. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. Пер. с английского Москва, Мир, 1974.

75. Бернхард С. Структура и функция ферментов. Пер. с английского Москва, Мир, 1971.

76. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Пер. с английского Москва, Мир, 1966.

77. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов . Пер. с английского Москва, Мир, 1980.

78. Blow D.M. Structure and mechanism of chymotrypsin. Acc. Chem. Res., v.9, p.142-152.

79. Matthews B.W., Singler P.B., Henderson R„ Blow D.M. Nature, Lond., 1967, v.214, p. 652.

80. Stroud R.M., Kay L.M., Dickerson R.E., J. molec. biol., 1974, v.83, p. 185.

81. Shotton D.M., Watson H.C., Nature., Lond. 225,811,1970.

82. Уэбб Л., Ингибиторы ферментов и метаболизма. Пер. с английского Москва, Мир, 1966.

83. Bier M., Nord F.F. On the mechanism of enzyme action. XLVI. The effect of certain ions on crystalline trypsin and reinvestigation of its isoelectric point. Arch. Biochem. Biophys., 33,320, 1951.

84. Buck F. F., Vithayathil A. J., Bier M., Nord F. F. On the mechanism of enzyme action. LXXIII. Studies on trypsins from beef, sheep and pig pancreas.— Arch. Biochem. Biophys., 97,417,1962.

85. Folk J. E. A new pancreatic carboxypeptidase. J. Amer. Chem. Soc., 78,3541,1956.

86. Weil L., Seibles T.S., Telka M. Studies on the specificity of protarminase. Arch. Biochem. Biophys., 79,44,1959.

87. Folk J. E., Gladner J. A. Carboxypeptidase В. I. Purification of the zymogen and the specificity of the enzyme.- J. Biol. Ghem., 231,379,1958.

88. Folk J. E., Gladner J. A. Carboxypeptidase В. II. Mode of action on protein substrates and its application to carboxyl terminal group analysis.—J. Biol. Ghem., 231,393,1958.

89. Jones D. D., .Miller W. G. Studies on the action of carhoxypeptidase В on polylysine.-Biochim. biophys. acta, 159,411,1968.

90. Wolff E. C., Schirmer E. W„ Folk J, E. The kinetics of carboxypeptidase В activity. I. Kinetic parameters.—J. Biol Chem., 237,3094,1962.

91. Shmid M.F., Herriot J.R., J. molec. Biol., 103,175 1976.

92. Folk J. E., Gladner J. A. Garboxypeptidase В. III. Specific esterase activity. • Bio-chim. biophys. acta, 33, 570, 1959.

93. Folk J. E., Piez K. A., Carroll W. R., Gladner J. A. Garboxypeptidase В. IV. Purification and characterization of the porcine enzyme. J. Biol. Chem., 235,2272, 1960.

94. Cox D. J., Wintersberger E.t Neurath H. Bovine pancreatic procarboxypeptidase B. П. Mechanism of activation,Biochemistry, 1,1078,1962.

95. Folk J. E., Gladner J. A. Influence of cobalt and cadmium on the peptidase and esterase activities of carboxypeptidase B. Biochim. biophys. acta, 48,139,1961.

96. Folk J. E., Wolff E. C., Schirmer E. W. The kinetics of carboxypeptidase В activity. II. Kinetic parameters of the cobalt and cadmium enzymes. J. Biol. Chem., 237, 3100, 1962.

97. Prahl J. W., Neurath H. Pancreatic enzymes of the spiny Pacific dogfish. II. Procarboxypeptidase В and carboxypeptidase B. Biochemistry, 5,4137,1966.

98. Wintersberger E., Cox D. J., Neurath H. 1962. Bovine pancreatic procarboxypeptidase B. I. Isolation, properties, and activation. Biochemistry, 1,1069,1962.

99. Инсулин человека ВФС 42-212892 от 19.06.1992, МЗ РФ.

100. The United States Pharmacopeia. Philsdelphia, USA. 2000. (USP24), Suppl. 3.

101. European Pharmacopeia 4th Edition. Strasbourg, France. 2002.4.02 Version.

102. Патент РФ RU 2208637 16.04.2002.

103. Баирамашвилн Д.И. Генноннженерный инсулин человека: успехи и перспективы. Российский химический журнал. М.: 2005, т. XLIX, №1.

104. Патент РФ RU2208637,16.04.2002.

105. US Patent №6,281,329,28.08.2001.

106. US Patent № 6,699,692,02.03.2004.

107. US Patent № 6,509,452,21.01.2003.

108. European Patent CY1830,01.12.1995.

109. US Patent US5457066,10.10.1995.

110. US Patent №6,068,993,30.05.2000.

111. Патент РФ RU 2144957,26.02.1999.

112. Патент РФ RU 2141531,26.05.1999.

113. Приоритетная заявка на патент РФ № 2006137635 от 25.10.2006.

114. ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP).

115. Markussen J. Proteolytic Degradation of proinsulin and of the intermediate forms: Application to Synthesis and Biosynthesis of insulin. Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide. Tokushima, 1978, p. 50-62.

116. Chance R.E., Ellis R.M., Bromer W.W. Porcine proinsulin: characterization and amino acid sequence. Science. 1968, v. 161, p. 165.

117. Сергеев H.B. Использование инструментальных микрометодов анализа для постадийного контроля процесса получения рекомбинантного инсулина человека. Диссертация к.х.н. ИБХ РАН. Москва. 2000 г. с. 92.

118. Welinder B.S., Linde S. High Perfomance Ion Exchange Chromatography of Insulin and Insulin Derivatives. In CRC Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins., 1981, v.2., p. 357- 362.

119. Уильяме Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. Пер. с английского Москва, Мир, 1978.

120. US Patent №1218888,24.04.1997.

121. US Patent №55089252,05.07.1980.

122. US Patent №4459226,07.09.1983.