Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител к инсулину, обладающих протективной биологической активностью

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител к инсулину, обладающих протективной биологической активностью"

На правах рукописи

|

1 БАТРАК ЕЛЕНА ЕВГЕНЬЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИНСУЛИНУ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕКТИВНОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.00.23 - биотехнология

тореферат на соискание ученой степени биологических иаун

А в

диссертации кандидата

Москва - 1996

Работа выполнена в Государственном институте кровезаменителей и медицинских препаратов Министерства эдравохранения и медицинской промышленности РФ.

Научный руководитель:

член-корр. АТН РФ, доктор медицинских наук, профессор А.С.Новохат кий.

' Научный консультант: кандидат биол. наук Т.Г. Мнхеева

Официальные оппоненты: доктор биод.наук, профессор

Дьяконов Л.П. доктор биод.наук, профессор Ддюмкин В.Н.

Ведушая организация:

■Государственный научный центр - Институт иымунрлогии Российской Федерации

Зишита состоится " " сгл/ыУЯ- 1996 г. в Л61 ¿гОч. на заседании Диссертационного совета К 0^0. ¿28.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экс -периментальцой ветеринарии иы. И.Р.Коваленко по адресу: 10947^, Москва, Кузьминки, ВИЭБ.

С диссертацией ыовно ознакомиться в библиотеке ВМЭВ. Автореф< рат разостлан 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, киндндит ветеринарных ааук -*7у //Е.Г.Терешкоа

г. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гибридомная технология является одним ив важнейших и наиболее широко разработанных направлений современной иммунобиотехнологии. Метод получения лимфоцитарных гибридом, продуцирующих моноююнальные антитела (МКА) веданной специфичности, был предложен в 1975-76 гг. Kohler а , Mustern С. ив настоящее время применяется во всем мире для получения высокоспецифичных антител к самым разным антигенам, в том числе к гормонам. Высокая специфичность, чувствительность и активность МКА, а также возможность использования для первичной иммунизации животных слабо очищенного антигенного материала делают их удобным инструментом при работе с гормонами, так как позволяют решить проблемы, возникающие при получении анти-гормональных поликлональных сывороток. Поскольку получение поликлональных сывороток к гормонам связано, прежде всего, с затратами больших количеств дорогостоящих высокоочишенных препаратов. Кроме того, очистдса иммуноглобулинов поликлональных сывороток также крайне сложна и трудоемка (Михеева Т. Г., Новохатский А. 0., и др. ,91). Особый интерес вызывает новое направление в использованиям МКА - их возможное применение в качестве терапевтических препаратов с целью воздействия на биологическую активность гормонов. Терапевтическое применение анти-гормоналъных поликлональных антисывороток затруднено из-за сложностей с их очисткой, недостаточно высокой специфичностью и наличия выраженных аллергических реакций.

В литературе отсутствуют какие-либо данные о влиянии мо-ноклональных антител на биологическую активность инсулина в организме животных и человека. В то же время получение антител к инсулину, обладающих протегсгивным биологическим действием, позволило бы использовать их в качестве антидота при инсулиновой гипогликемической коме и широко применять в научно-исследовательских работах для изучения механизма действия инсулина, выявления структурно-функционс хьных взаимосвязей в молекулу инсулина, а также для, создания на .их основе диагностических

тест-систем.

Первые сообщения о получении гибридом, продуцирующих ЫКА к инсулинам разной видовой специфичности, появляются в 1981 г. Schroer J. ,81, первая доложила о получении МВД к инсулину, с помощью которых она показала наличие эпитошв на молекула инсулина. В дальнейшем ряд исследователей (Schroer J. ,83,85,Rathjen D., 1986, Shibier 0. ,1988, Roth R. , 1982,85,88,92) такие получили MKA к инсулину, которые использовали для изучения антигенной структуры инсулина, для разработки диагностических тест-сис тем (Holzapfel О., Wuttke W./89), и для создания иммунных сорбентов для очистки биологически активных веществ (Howang Y. Y., Healey М.С. ,88,). С'90 гг в печати появляются работы по использованию антиинсулиновых МКА для исследования биологической активности инсулина на различных клеточных моделях (Horejsl л V., Hildert I., Kristofova Н., Satayalai 0. ,89, Nataa V., Monier S. ,92, Redmon В., Pyzdrowski K. L., 92). Однако, в доступной нам литературе не встречались работы,в которых исследовалось бы влияние МКА на биологическую активность инсулина in vivo. В 1960 гг опубликованы работы в этом-направлении с использованием поликлональной сыворотки к инсулину(Мэ1опеу Р. J., Coval М., 55, Armir J., Grant R.T., Wrlght Р.Н., 60, Robinson D. Y. D., Wrlght Р. H. ,61). Так, было показано, что введение по-ликлональных антител к инсулину нейтрализует его биологическую активность, но механизм, при помоши которого поликлональные антитела нейтрализовали биологическую активность инсулина, до сих пор неизвестен. Также было непонятно, как наблюдаекце различия в биологической активности поликлональных антшшсулино- . вых антител зависели от концентрации и аффинности этих антител.

Цель к задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась получение моноклональных антител к инсулину, обладающих протективной биологической активностью.

Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:

- получить клоны гибридом, продуцирующие МКА к инсулинам свиньи, крупного рогатого скота и человека;

-'получить клоны гибридом, продуцирующих МКА к С-пептидной части молекулы проинсулина;

- провести иммуноферментяое тестирование специфической активности МКА;

- определить видовую специфичность полученных МКА;

- получить стабильные клоны и массовые культуры гибридом;

- наработать асциткые препараты моноклональных антител;

- методом ВЖХ получить очищенные препараты МКА и проанализировать их специфическую активность ;

- отработать методы анализа антиинсулиновой активности МКА irv •vivo;

- изучить способность полученных клонов МКА воздействовать на гипогликемическую активность инсулина in vivo..

Научная новизна. Разработана эффективная схема массового получения и отбора клонов гибридных клеток, продуцирующих МКА к инсулинам, а также селекции гибридом, секретирующих МКА заданной специфичности к инсулинам и проинсулинам крупного рогатого скота и свиньи. Отработаны методы препаративного получения и очистки с помощью ВЖХ моноклональных иммуноглобулинов к инсулину, пригодных для изготовления диагностикумов и биологически активных препаратов.

Экспериментально обоснована концепция получения монокло-йальных иммуноглобулинов, проявляющих антигипогликемическую активность в отношении инсулинов человека, свиньи и крупного рогатого скота.

Впервые получены моноклональные антитела к инсулину, инги-бирующие биологическую активность инсулина in vivo. Выявлены 4 гибридомы (ИН-2, ИН-3, МИК-1, МИН-7), продуцирующие МКА, которые обладают протективной антигипогликемической активностью in vivo, зависящей от дозы и времени введения МКА.

Разработаны методы анализа влияния МКА на биологическую

активность инсулина in vivo. Обоснована возможность применения МКА, подавляющих биологическую активность инсулина в качестве терапевтического агента при гипогликемической коме.

Получены ЫКА, избирательно взаимодействующие с С-пептидной частью молекулы проинсулина крупного рогатого скота и не имеющие перекрестной специфичности к инсулину.

Практическая ценность работы. Получены 5 гибридом серии ИН, 7 гибридом серии МИК, 6 гибридом серии ПИК и 5 гибридом серии ПИ, которые секретируюг МКА, обладающие специфической активностью в отношении инсулина свиньи, крупного рогатого скота и человека. Получена 1 гибридома ПИК-3, МКА которой специфг 1ески взаимодействовали с проинсулином крупного рогатого скота и не взаимодействовали с инсулинами свиньи, крупного рогатого скота и человека.

Стабильные и высокоактивные штЬммы-продуценты моноклональ-ных антител к инсулину ШК-1(К-1) (депонент N ВЗКК/П/545Д от 21.03.91r) и МИК -4(К-4) (депонент ti ВСКК/П/546 от 21.03. 91 г), а также к проинсулину крупного рогатого скота ПИК-3 (депонент N ВСКК/1И531 от 16. 01.91г) депонированы во Всероссийской коллекции клеточных культур в Институте цитологии РАН, г. Санкт-Петербург.

Препараты МКА, взаимодействовавшие с инсулинами крупного рогатого скота, свиньи и человека серии МИК и ПИК, испольвовали в научно-исследовательских разработках и Институте иммунологии РАМН и в ГИКиМП. Кл*н ПИК-3, продуцирующий моноклональные антитела к проинсулину крупного рогатого скота успешно прошел испытания в НПО "Фермент", г. Вильнюс, Литва.

Отработана быстрая и требующая малых доа антигена методика иммунизации мышей инсулином и проинсудином с целью получения высокопродуктивных клонов гибридом.

Отработаны методики тестирования специфичности и активности МКА к кнсулину методом иммуноферментного анализа с -использованием культуральной жидкости и самир клеток-продуцентов. •

Отработана методика очистки МКА из культурал!лой жидкости гибридом методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии, позволявшая полностью сохранить специфическую активность МКА.

Данная работа выполнена при участии с. н. с., к. б. н. Т. Г. Ми-

хеевой, с.п. с. (Институт иммунологии РАМН), к.б. н. Г. О. Гудимой (Институт иммунологии РАМН), н.с., к.х.н. O.A. Юриным (Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов Мин-здравмедпрома РФ).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

- Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация, спид" в июне 19S1 г. в г. Санкт-Петербурге;

- Международной конференции Updating Course on Pancreatlo Diseases" в апреле 1992 г. в г.Генуя;

- Конференции "Культуры клеток в биотехнологии и ветеринарии" во Всеросийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеренарии им. Я. Р. Коваленко в те 1993 г. в г. Иоскве;

- Четвертом Путинском Совещании "Культивирование клеток животных и человека" в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН в апреле 1994 г. в г. Пущино.

- Ученом Совете ГИКиМП 28.09.89 г.

- Неллабораторном сове(сании сотрудников ГИКиМП Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 3 работах. Подучено 3 свидетельства о депонировании.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных доследований, обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована 9 таблица л и 14 рисунками. Список литературы включает 205 источников из них 27 отечественных и 178 зарубежных авторов.

(

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

• 2.1. Материалы и методы

Миеломные клеточные линии. В работе ж .юльзовали мышиные миеломные линии клеток; X-63/Ag8. 653 (клон Раевского), NS-0 и FS дефектные по гену ГГФРТ, не продуцирующие собственных иммуноглобулинов, чувствительные к селективной среде ГАТ» содержащей гипоксантин, аминолтерин и тимидин, устойчивые к 20 мкг/мл 8-азагуанина.

йивотные. В работе использовали мышей линии BALB/c весом 14-16 г как источник иммунных В-лимфоцитор и для индукции гиб-ридомных,асцитных опухолей, а также новорожденных крысят, весом 40-100 г для оценки специфической активности методом непрямого иммунофлюоресцентного анализа. Исследование биологической активности МКА in vivo проводили на мышах линии BALB/c весом 16-18 г и кроликах породы шиншилла весом 3,0- 3,5 кг.

Получение гибридом. Гибридомы получали методом соматической'гибридизации, разработанным Kohler G. и Mi Istein С. , 19751976 в некоторой модификации. Иммунные лимфоциты, полученные из лимфоузлов или селезенки, сливали с клетками мышиной мнело-мы Х63-Ag8.653 или HS-0, или F6. В качестве сливающего агента • использовали 50% раствор полиэтиленгликоля (М. м. 4000). Все полученные' гибридные клоны были клонированы методом предельных разведений на слое клеток-кормилок, которыми служили макрофаги неиммунных мышей BALB/c.

Индукция гибридомных асцитных опухолей. Предобработан-ным пристаном или полным адыовантом Фрейнда мышам BALB/c вну-

6 т „

трибрюшинно вводили по 10 - 10 гибридных клеток.В случае.раз- ■ вития у животных асцитной опухоли их умерщвляли и производили забор асцита, который затем центрифугировали для удаления . клеток и хранили при -10 С, а осаженные гибридные клерки вводили сле^тощей партии мышей.

Определение специфической активности культуральных и асцитных препаратов МКА. Специфическую активность культуральных и асцитных препаратов моноклональных антител определяли методами ИФА, Р':1А : методом КФА на octdobkobux клетках поджелудочной железы крыс.

Определенна биологической активности инсулина в опытах на кроликах и мытах. Для анализа.влияния МКА на гипогликемическую активность инсулина ln vivo использовали модифицированные варианты фармакопейпого метода определения биологической активности препаратов инсулина по вызываемому ими гшюгликемическому эффек- " ту на кроликах и мышах.

Определение количественного содержания глюкозы в крови.

Измерение содержания глюкозы в крови проводили с использованием анализатора "Экзана-Г", принцип действия которого основан па электрохимическом определении продуктов ферментативной реакции окисления глюкозы, катализируемой ферментом глюкозоок-сидазой с последующи преобразованием в постоянное напряжение и фиксацией аналогоцифровым преобразователем.

Получение высокочистых препаратов МКА методом ВЖХ. Для • очистки мышиных МКА класса G был выбран метод анионнообменной хроматографии.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Излучение гибридом, продуцирующих МКА к инсулину и проинсулину

Несмотря на то, что инсулин - один ив наиболее хорошо охарактеризованных полипептидов - был первым человеческим гормоном, выявляемым с помощью РИА (Yalow Р. а и Berson S. А. , 1958), имеется относительно небольшое количество работ, описывающих получение и использование МКА специфических к инсулину. Исследования этз биологической активности инсулина in vivo проводились только с использованием поликлональных антисывороток к инсулину.

Целью нашего исследования было получение МКА к биологически активному сайту на молекуле инсулина и отработка методик тестирования биологической активности ЫКА. Поскольку до сих пор остаются неясными вопросы, как изменяется структура инсулина при связывании гормона с рецептором, один или несколько сайтов участвуют в связывании горюна с рецептором, мы ¿или заинтересованы в получении большого набора высоксаффинных МКА, взаимодействую-

щи к избирательно как с одним видом инсулина, так и с различными видами инсулинов.

Известно CMirza l. Н. , Wilkin Т. J. ,1987), что инсулин является одним из тех антигенов,которые вызывают иммунный ответ преимущественно в лимфоузлах, а не в селезенке, в связи с чем более высокая частота образования специфических клоиев, продуцирующих МКА с более высокой связующей способностью, наблюдается в результате слияния миеломных клеток с В-клетками лимфоузлов. Наш были опробованы равные схемы иммунизации мышей, которые в св^ю очередь определяли источник иммунных В-лимфоцитов: - либо однократная иммунизация в подушечки задних лапок, - либо 2 -3 кратная внутрибрю-шинная иммунизация с внутривенным введением бустерной дозы лти-гена и забором селезенки.

2.2.2. Характеристика гибридом методом ИФА.

В результате 5 независимых слияний наш было получены 24 доии гибридом, продуцирующие ША к инс.лнну и 1 гибридома, продуцирующая МКА к С-пептиду крупного рогатого скота (табл.1).

Специфическая активность полученных МКА серий ИН, ЫИК.ГО1 и ПИК в ША варьировала в широких пределах. Так, титры культураль-ных препаратов МКА клонов ИН-4, ЬШК-5, 1ЛЩ-6 были минимальны (is 40), а клонов Шг2, ИН-5, ШК-1, МИК-4, МИК-7, ПИ-6, ПИ-8, ПИ-12, ПИ-13, ПИК-3 достигали максимальных значений (1:1280). Специфическая активность МКА в асцитных препаратах,' также была неодинакова и значения титров колебались от минимальных 5x1 (f до максимальных 10^ табл. 1). Максимальной активностью обладали асцитнда препараты клона ЫИК-7, которые взаимодействовали с инсулином в разведении 1: 10. Несмотря на короткую схему иммунизации большне-тво ША относились к иммуноглобулинам класса 6. 8 клонов секре-тировали имшуноглобулины класса G1 3 клона секретировали иммуноглобулины G2a 4 клона секретировачи IgG2b-и только 3 клона секретировали IgM (табл.1).

2.2.3. Видовая специфичность МКА к инсулину.

По степени специфического взаимодействия-МКА с инсулинами

Таблица 1

Характеристика культуральных и асцитных препаратов моноклональных антител к инсулину и проинсулину.

Клон Класс ТИТ1 5 МКА

продуцируемых в : 1ФА

иммуноглобулинов к. ж*. | А. Е **

ИН-1 1801 160 10000

ЙН-2 1801 1280 10000

ИН-З- 1де1 160 5000

ИН-4 н. 0. 40

ИН-5. 1801 160 5000

. МИК-1 1&02Ь 1280 100000

МИК-2 40 5000

ыик-з 1В01 640 -

ШК-4 1802а 1280 10000

ЫИК-5 1801 1280 10000

№-6 1802а 40

ШК-7 1801 640 1000000

ПИ-4 н. о.' 5000 4.

■ПИ-6 даь 5000 500000

ПИ-8 Н. 0. 2000 100000

ПИ-12 1В0М 1000 1000000

ПИ-13 1802а 1000 1000000

ПИК-1 н. 0. 1000 -

ПИК-2 н. 0. 1000 -

ПИК-3 1й02Ь 1000 1000000

ПИК-4 180М 1000 1000000

ПИК-6 н. 0. 40 - •

ПИК-7 н. 0. 40 -

ПИК-8 180М 40 —

* К. Ж. - культуральная жидкость ** А. Я. * асцитная жидкость

> 10 -

человека, свиньи и крупного рогатого скота полученные гибридомы южно разделить на 3 группа 5 клонов (ИН-4, . ИН-5.-.МИК-1, МИК -2, МИК-б) .обладали одинаковой или близкой активностью в отношении всех трех видов инсулина. 6- клонов ( ИН-1, ИН-2, ИН -3,'.МИК -3, МИК-4, МИН-7),.взаимодействовали преимущественно с инсулином свиньи и крупного рогатого скота, тогда как степень их свя"-зывания с человеческим инсулином была различна. Так,' МКА' клонов МИК-4 и МИК-7 связывались С человеческим инсулином в 2 раза слабее, чем с другими инсулинами, а МКА клока ИН -1 и МИК -3 практически не взаимодействовали.с инсулином человека. К третьей группе можно отнести МКА клона МИК-5; реагировавшие преимущественно с инсулином крупного рогатого скота

Из 24 протестированных гибридом одна гибридома ПИК-З продуцировала МКА, специфически взаимодействовавшие с проинсулином и, С-пептидом крупного рогатого скота, что позволяет сделать вывод о специфичности МКА клона ПИК-З в отношении 0-пептидной части молекулы проинсулина крупного рогатого скота Причем, степень специфического. взаимодействия МКА ПИК-З с проинсулинсм крупного рогатого скота была на 2 порядка выше, чем с С-пептидом.

2.2. 4. Эпитопная специфичность МКА.

Одной из важнейших областей применения антиинсулиноЕых МКА является картирование эпитопов на молекуле антигена. Методом ИФА мы попытались определить уча-тие в образовании эпитопов А- и В-цепей инсулина. Результаты этого тестирования показали, что по специфическому взаимодействию ША разделились на 3 группы: 1) клоны: МИК-1, МИК-3 и МИК-4 сильнее взаимодействовали с А-цепью инсулина, чем с В-цепью, 2) клоны: МИК-2, ШЬ5, МИК-7 в равной степени взаимодействовали с• обеими цепями, 3) клоны: ИН-2, ИН-3,МИК-5 активнее взаимодействовали с В-цепью инсулина. Ни один из протестированные клонов не проявлял*избирательной специфичности в отношении какой-либо одной цепи. В то же время каждый клон сильнее взаимодействовал с' целой молекулой инсулина.' По всей вероятности, в состав.эпитопов, к которым были направлены подученные нами МКА, входят ашнокислотные остатки как А-, так и В-цепей.

• - И -

■ 2.2.5. Оценка специфичности МКА методом непрямого флюоресцентного анализа.

Специфичность МКА ЫИК-7 исследовали методом НФА, который позволяет определить направленность исследуемых МКА к функционально активным участкам молекулы инсулина. МКА МИК-7 в разведении 1:1000 при добавлениии к островковым клеткам поджелудочной железы вызывали интенсивное флюоресцентное свечение.

Специфичность. МКА МИК-7 к функционально активным участкам молекулы инсулина предполагает возможность их использования для выявления секреции инсулина при создании лабораторных моделей ■ подлелудочной' железы.

2.2.6. Специфическое взаимодействие гибридомных клеток с инсулином.

Известно, что специфическое связывание с антигеном МКА, находящихся на поверхности продуцирующих их гибридомных клеток, позволяет судить со аффинности антител. Для более полной характеристики полученных МКА мы тестировали гибридные клетки и куль-туральную жидкость этих гибридом. Ш обнаружили различия в скорости секреции МКА разными клонами гибридом. Так, при скрининге культуральной жидкости наибольшей активностью обладали МКА клона МЯК-7, а не МИК-4, МКА которого при тестировании гибридных клеток были -более активными. 4 клона из 5 обладали более высокой специфической активностью при анализе клеточных препартов и только МКА МИК-2 проявляли более высокую активность при тестировании культуральной жидкости. По-видимому, это связано с более высокой скоростью секреции МКА гибридомными клетками МИК-2 Сравнение результатов ИФА с испох^зованием в качестве препарата 'тестируемых антител, наряду с культуральной жидкостью гибридом самих гибридных • клеток, позволяет более полно охарактеризовать испытываемые МКА и не только выявить аффинность моноклональных иммуноглобулинов, но и особенности секреторной активности клеток.

Z. 2.7. Сравнительная иммунохимическая характеристика препаратов инсулина производства фирмы'"Novo", Дания и ГИКиЫП, Россия с использованием специфических МКА.

• Для оценки препаратов инсулина используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ), • который, позволяет выявить наличие минимальных количеств примесей, но не дает возможности судить об иммунных свойствах субстанции, ч:о в случае инсулина, используемого в качестве "'лекарственного препарата, служит одной из важнейших характеристик. Для определения имму-нохимических характеристик препатов инсулина, мы провели сравнительное тестирование инсулинов производства ГИКиМП, Россия и фирмы Novo,Дания.

Тестирование показало, что при взаимодействии МКА с инсу-линаыи импортного производства результаты ИФА были более од-. нородны,.а титры МКА были значительно выше, чем при взаимодействии с использованными нами инсулинами отечественного производства. Особенно значительные различия отмечались при анализе инсулинов крупного рогатого скота. Так, при разведении куль-туральной жидкости МКА МИК-1 в 20 раз, оптическая плотность образцов была в'2,5 раза выше при тестировании импортного инсулина, чем при тестировании инсулина отечественного -производства, 'а при разведении культуральной :едкости в 40 раз оптическая плотность была в 1,6 раза выше при взаимодействии МКА с импортны!.! инсулином крупного рогатого скота.

Можно предположить, что различия во взаимодействии МКА с инсулинами отечественного и импортного производства связаны С конформационными или с физико-химическими особенностями молекул инсулинов, не выявляемыми методом ШХ, которые тем не менее, могут иметь большое значение при терапевтическом применении препаратов инсулина Больший разброс значений, получаемых при сорбции на пластик отечественного инсулина, можно объяснить наличием в этих препаратах примесей липйдов, которые мешают равномерной сорбции антигена.

- 13 -

Основной целью нашей работы было получение МКА, направленных 1С биологически активному сайту на молекуле инсулина, что позволило бы модифицировать биологическую активность гормона. Для достижения этой цели мы отобрали наиболее стабильные и вы-■ сокоактивныэ клоны гибридом и, используя фармакопейные методы тестирования биологической активности инсулина, в некоторой модификации, проверили биологическую активность полученных нами МКА. Исследования проводили на кроликах и мышах.

2.2.8. Влияние ЫКА на гипогликемическую активность инсулина в опытах на кроликах.

Результаты экспериментов показали,' что моносуинсулин в дозе 0,5 Ед на 1 кг веса кроликов вызывал снижение, содержания сахара в крови через 1,5 часа после иньекции почти на 40%, тогда как моносуинсулин, обработанный МКА клона ИН-2, вызывал лишь 10-13% снюгание сахара в крови кроликов (табл.2). Таким образом, активность препарата моносуинсулина.которая исходно составляла 40 ЕД/мл после обработки МКА клона ИН-2 снижалась до 12,6 ЕД/мл. статистическая обработка результатов этих опытов показывает, что МКА клона ИН-2 вызывали достоверное снижение гипогликемической активности инсулина.

Несмотря на то, что' существует мнение о невозможности взаимодействия гомологичных сывороток с собственным инсулином, четыре, из полученных нами мышиных МКА, обладали протективным действием в отношении биологический активности собственного инсулина При этом ингибирующий эффект МКА зависел от дозы и времени их введения.

2.2. в. Определение протективной активности МКА, вводимых в смеси с инсулином.

Для подтверждения того, что МКА связываются с биологически активным сайтом на молекуле инсулина и для оценки прочности комплекса МКА + инсулин мы вводили МКА ИН-3 мышам, предварительно проинкубировав с инсулином.

Результаты судорожного мышиного, теста представлены на (рис.1). В течение первых 50 мин после инъекции инсулина процент гибели мышей в группе положительного контроля, был аначи-

Таблица 2.'.

Изучение протективной биологической.активности МКА ИН-2 по анализу содержания сахара в крови кроликов.

Вводимый препарат Исходный уровень сахара в крови (мг % ) 1 опыт | 2 опыт Концентрация сахара в крови через 1,5 ч после введения препарата (мгХ) 1 опыт 2 опыт ^снижения сахара в крови 1 опыт 2 опыт

М + т

Моносу-инсулин 90,3+2,5 89,0±3,1 56,7*3,5 54,4±3,9 37,5+2,8 38,4±3,9

Ыоносу-инсулин с МКА 88,4±1,3 91,б±3,2 76,3±2,8 81,4+2,9 13,7+2,4 10,8+2,5

той отмечено возрастание гибели мышей в группе отрицательного контроля, тогда как в двух опытных грушах продолжительность жизни животных по сравнению с группой отрицательного контроля, увеличивалась до 100 мин во второй группе и до 95 мин в третьей группе. Шесте с тем, количество живых мышей в опытных группах на протяжении всего опыта оставалось на 10-20 Z ниже, чем в группе, получавшей инсулин с глюкозой. Таким образом, предварительно проинкубированные МКА с инсулином оказывали протективное действие на биологическую активность инсулина по сравнению с отрицательным контролем, но более слабое по сравнению с аналогичным действием глюкозы. Возможность МКА оказывать протективное действие на биологическую активность инсулина свидетельствует в польэу того, что они действительно связываются с биологически активным сайтом на иолекуле инсулина .

2.2.10. Определение протективной активности МКА, вводимых до иньекции инсулина.

Для проверки возможности МКА непосредственно взаимодействовать с биологически активным сайтом инсулина in vivo были отобраны 10 наиболее высокоактивных клонов МКА, из которых МКА 4 клонов Ш-2, ИН-З, МИК-1, МИК-7 обладали выраженной протективной антигипогликемической активностью in vivo. ^

Ингибирувдий эффект МКА клона ИН-З (титр в ИФА 5:10) наблюдался при введении МКА ИН-З в разведении 1:100 ва 30-60 мин до иньекции инсулина. В этом случае, СПЯ животных (67 мин) увеличивалась на 47% по сравнению со СПЖ животных в группе отрицательного контроля (46 мин). ¿

При введении мышам МКА клона Ш1-2 (титр в ИФА 5:10 ) ияги-бируюший эффект наблюдался при введении асцитных препаратов в разведении 1:10 за 1 ч до иньекции инсулина При проведении эксперимента в этих условиях СПЖ мышей в опытной группе возрастала на 37%, по сравнению с СПЖ в группе отрицательного контроля.

При проверке более высокоактивного клона МИК-1 анти-инсу-

100

'«вело эпхвых мышей отволешт х перяонлчалшону хошгаестф)

25 30 85 40 46 СО бб 60 65 ТО время наблюдения (иив.)

75 ® 45 ВО 05 1

........ ККУЛКК ___ИНСУЛИН С ГЛюКОЗОЙ

_,_КНА В РАЗ ВЕДЕНИИ 1:100 _ МИЛ В РАЗВВДЕШШ 1:1000

РИС- 1

ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ИНСУЛИНА. ПРОИНКУбИРОВАННОГО С МКА КЛОНА ИН-3.

липовый эффект наблюдался при.введении препаратов асцитной жидкости в разведении 1:1000 за 3 часа до ведения инсулина. В этом случае СПИ увеличивалась на 34 Z, по сравнению с СШ в группе отрицательного контроля.

Интересно, что наиболее высокоактивные МКА клона МИК-7(титр в ИФА 1:1000000) ингибировали биологическую активность инсулина при введении препаратов асцитной жидкости в разведении 1:10 и 1:100 за 2 часа до введения инсулина СПЖ мышей в опытной группе увеличивалась на 43Х, по сравнению с СПЖ мышей в группе отрицательного контроля.

Проведенные эксперименты показали, что МКА ИН-3, ИН-2, МИК -1 и НИК-1? вызывали снижение гипогликемической активности инсулина. -Эффект зависел от дозы МКА и достигал максимума при введении мышем внутрибрюшинно 0,'2 мл асцитной жидкости, разведенной в • 10 или 100 раз. Оптимум разведения коррелировал с активностью МКА в ИФА, Время введения МКА ■ также существенно влияло на вызываемый ими антигипогликемический эффект, причем для разных клонов оптимальное время колебалось от 0.5- 1 ч (МКА серии ИН) до 2 - 3 ч ( Ш серии МИК).

"2.2.11. Изучение воздействия специфических моно-и поликлональных антител на биологическую активность эндогенного инсулина

С целью выявления оптимальных условий, при которых проявляется протективное действие МКА в отношении биологической активности эндогенного инсулина, методом глюкозооксидазного анализа определяли содержание сахара в крови мышей при введении асцитных препаратов МКА.

Введение МКА вызывало увеличение концентрации глюкозы в крови. Причем увеличение концентрации гюкозы вызывали разные клоны по-разному (рис. ')■. Так, при ведении МКА ИН-3 уровень глюкозы в щюви повидался уже в первые 10 мин и затем быстро.снижался (в течение 5-10 мин). А при введении МКА ИН-2 уровень глюкозы в крови мышей не изменялся в течении 2-х часов. При введении же ЫКА МИК-7 уровень глюкозы'в крови повышался постепенно и достигал максимума через 2 ч. ■

Таблица 3.

Воздействие ЫКА на биологическую активность эндогенного инсулина.

Время забора Содержаний глюкозы (мг%) в крови мышей

крови при введении ЫКА

(мин.) , ИБ-2 ин-з МИК-7

0 89,86*3,37 89,45*2,87 23,58*1,80

10 87,93±8,89 100,45*3,14 28,80*2,88

15 82,79*2.37 83,41*2,66 31,68*3,78

20 33,48±3,24

30 84.23tl.18 79,21*2,64 34,20*2", 88

60 70,55*1,18 74,28*2,64 38,70±4,8б

90 85,52*5,92 74,29*1,81 30,72*6,12

120 85.09tl.15 57,01*1.01 61,2012,52

-19 -

Таким образом,, .полученные, .нами данные свидетельствуют о том, что мышиные МКА связывают в крови эндогенный мышиный инсулин. В i ai сом случае встает вопрос: о том,. в .какой мере iíKA отличаются от поликлональных антисывороток по своему биологическому анти-инсулиновому действию,

2. 2. 12. Определение антиинсулиновой активности МКА

по изменению содержания сахара в крови мышей.

С целью выявления способности специфических поликлональных антисывороток влиять на биологическую активность эндогенного инсулина мышам вводили 'поликлональные сыворотки к проинсулину мыши и к инсулгну морстой ..свишси, а таете неспецифические поликлональные сыворотки морской свинки и мыши.

Получзшше результаты показывают, что при введении специфических и неспецифических мышиных сьтороток мышам до введения инсулина содержание глюкозы в крови шшей понижается в пределах нормы (такое же снижение концентрации глюкозы в крови некормленных мышей через 2 ч),а при введении неспецифическия и специфических сывороток морской свинки.- 'повышается (рис.2). Через 10 мин после введения инсулина концентрация глюкозы падает во всех группах, причем, при введении•специфических сывороток мыши и морской сви::ки наблюдается более медленное снижение концентрации глюкозы на 3,8% и 5.2%, соответственно,'По сравнению со снижением концентрации глюкозы у мышей, которым вводили неспецифические сыворотки. Через 60 мин после введения инсулина наблюдается значительное снижение сахара в крови мышей, которым вводили 'сыворотку морс ico й с вишен к ¡шеулшгу (97%), причем, в тоже время, снижение концентрации глюкозы в крови мышей, которым вводили неспецифическую сыворотку морской свинки минимальное 44%) по сравнению с концентрацией глюкозы в крови,мышей,которым вводили неспецифическую и специфическую сыворотку мыши (75% и 60%, соответственно) ii 20% раствор глюкозы (50%).

Возможность МКА серий ИН и МИК связывать эндогенный и экзогенный инсулин в опытах in vivo, в зависимости от дозы и времени введения свидетельствует в пользу того, что полученные нами МКА специфически связ^аются с биологически .' активным эпитопом не молекуле инсулина, что доказывает возможность взаимодействия аутоантител с собственным инсулином. Следует отметить, что подобным эффектом не обладали мышиные поликлональные сыворотки к инсулину. В то же время поликлональные сыворотки

КОНЛ*ИТ<р01уН) глркош

альнсму уроЬно)

(/по отнесению к р^рЬоно1 2" 0

/

/

200 -

150 -

100

ПК А импактноо ПКЛ «,инсули. шшинм* ПКА ькфсчоо еЬинки 'мсрсксо сЬи>^

ПКА ютпампноа к прешшрмжу

■х

50 -

"1—■—I—■—г Вр»мр эабора креби

1-0о смЬйраг.ас 3—ч«ре> 2Л и поел« сыЬсрогг.ок

2-ч«р«» 10 мин после ЬС>«0ет* инсулина «0 мин гюсл« инсулине

РИС. 14

СраЬнительное исследование протектибного деОстЬия ПКА но биологическую октиЬность "не ,ина

морской свинки к инсулину значительно активнее связывали эндогенный инсулин мышей, чем МКА, хотя их ингибирующий эффект не отличали а по длительности от аналогичного эффекта МКА.

вывода

1. Получены 20 линий гибридом, продуцирующие МКА к антиген-riM детерминантам молекулы инсулина, с которыми связана видовая специфичность и биологическая активность гормона

2. Для получения высокоспецифичных МКА к инсулину предпочтительнее однократная иммунизация мышей в подушечки задних лап.

3. Получены МКА, избирательно взаимодействующие с С-пептид-. ной частью молекулы проинсулина крупного рогатого скота

4. МКА к инсулину, проинсулину и С-'пептиду могут быть использованы для создания тест-систем. Очистка МКА методом ВЖХ не снижает их специфической активности.

5. Показано, что параллельное тестирование культуральной жидкости и самих клеток-продуцентов позволяет более полно охарактеризовать испытываемые МКА, выявить особенности секреторной активности клеток и, аффинность моноклональных иммуноглобулинов.

6. Выявлены 4 штамма гибридом (ИН-2, ИН-З, МИК-1, МИК-7), продуцирукще МКА, которые обладают протективной антигипоглике-мической активностью ln vivo, зависящей от дозы и времени введения МКА.

7.Разработаны методы анализа влияния МКА на биологичес-кур активность инсулина ln vivo.

8. Специфичность взаимодействия с.А-, В-цепями и с целой молекулой инсулина позволяет предположить наличие гетерогенных эпи-топов на молекуле или, способность МКА изменять конформацию молекулы таким образом, что во взаимодействие со специфическим эпито-пом, в результате стерических помех, вовлекаются аминокислотные остатки другой цепи.

9. Получение МКА, нейтрализующих биологическую активность инсулина, указывает на возможность аутоантител взаимодействовать с собственным инсулином.

- 22 -ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

- Получены 24 линии гибридом, которые оекретируот МКА, обладающие специфической активностью в отношении инсулина свиньи, крупного рогатого скота и человека,

- Получена 1 гибридома ПИК-З, МКА которой специфически взаимодействовали с проинсулином крупного рогатого скота

Препараты МКА, взаимодействовавшие с инсулинами крупного рогатого скота, свиньи и человека серии МИК и ПИК, использовали в научно-исследовательских разработках в Институте иммунологии РАМН и в ГИКиМП. Клон ПИК-З, продуцирующий моноклональные антитела к проинсулину крупного рогатого скота успешно прошел испытания в НПО "Фермент", г.Вильнюс, Литва

- Отработана быстрая и требующая малых доз антигена методика иммунизации мышей инсулином и проинсулином с целью получения высокопродуктивных клонов гибридом.

- Отработаны методики тестирования специфичности и активности МКА к инсулину методом иммуноферментного анализа с использованием культуральной жидкости и амих клеток-продуцентов.

- Отработана методика очистки МКА из культуральной жидкости гибридом методом высоко-эффективной жидкостной.хроматографии, позволяющая полностью сохранить специфическую активность МКА.

- 23 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Михеева Е.Г.. Новохатский A.C., Хпябич Г.Е , Калинин Г.а , Ивасько Е. П. , ' Батрак Е. Е., Кочетова Е. а Моноклональные ан-йтела к инсулину, влияющие на его биологическую активность// Проблемы эндокринологии. - 1991.' - Т. 37, N2. - С. 59-61.

2. Сидорович И.Г., Михеева Т.Г., Батрак Е.Б., Новохатский А.С. Application of monoclonal antibodies against human and animal pancreatic hormones // Updating Course on Pancreatic Diseases, Генуя - 22-25. 04.1992. ' - 233.

3. Михеева Т. Г., Батрак Е. Е., Ювохатский А. С. Биологически активные моноклоналъные антитела к инсулину //"Медицинская биотехнология, иммунизация,' спид". - Санкт-Петербург. - 12-18.06.1991.

4. Михеева Е. Г., Новохатский ' А. С., Хдябич Г. Е , Батрак Е. Е. ,С. 1. Кочетова Е. а Штаммы' гибридных.культивируемых кл :ок мышей В-В, используемые для получения моноклональных антител к инсулину// Свидетельства о депонировании - N 'ВСКК/П/545Д от

21.03.91 г. ;

Б. Михеева Е. Г., Новохатский А. С., Хлябич Г. Е , Батрак Е. Е., КЬчетоваЕ. а Штаммы.'гибридных'.культивируемых клеток мышей В-В, используемые для получения моноклональных антител к инсулину// Свидетельства о депонировании - N ВСКК/1У546Д от 21.03.91 г.;

6. ' Михеева Е. Г., Новохатский А. С., Хлябич Г. Е .Кочетова Е. а , Батрак Е. Е. Штаммы гибридных культивируемых клеток мышей В-В, используемые для получения'моноклональных антител к ин-0улину // Свидетельства о депонировании - N ВСКК/П/531Д от 16.01.91т.;