Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина"

На правах рукописи

ПАВЛОВ КОНСТАНТИН АЛЕКСАНДРОВИЧ

Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003474288

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Государственный научный центр судебной и социальной психиатрии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, ФГУ «ГНЦССП Росздрава»

Владимир Павлович Чехонин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ»

Вадим Анатольевич Меркулов

Доктор биологических наук, профессор НИИ «ФХМ ФМБА России»

Вадим Маркович Говорун

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится «17» июня 2009г. в _ часов на заседании

Диссертационного Совета Д208.057.01 при НИИ «ФХМ ФМБА России» по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ «ФХМ ФМБА России» по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

Автореферат разослан «15» мая 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, Г

^уке^^ М.А. Мурина

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественный анализ глиофибриллярного кислого протеина (GFAP) в биологических жидкостях человека является критерием выбора в оценке тяжести нарушения резистентности гематоэнцефалического барьера больных нервными и психическими заболеваниями [Aurell А. 1991; Blennow M. 1995; 1996; Dotevall L. 1996; Eng L. 2000, Hermann M. 2000; Чехонин В.П. 2001; Van Geel W. J. 2002 ; Herrmann 2003; Jauch E. 2000; Kristjansdottir R. 2001; Sporer B. 2004; Petzold A. 2004]. Практически любой патологический процесс в нервной ткани характеризуется, в той или иной степени, активацией ее астрог-лиального компонента, и последующим реактивным астрог-лиозом [Eddieston M. 1993; McGraw J. 2001]. Наиболее ярким проявлением реактивного астроглиоза на субклеточном уровне является резкое увеличение экспрессии GFAP в активированных астроцитах [Blomstrand С. 1995; Hill M. 2000; Fitch М.Т. 2008]. Дальнейшее развитие патологического процесса, как правило, приводит к гибели реактивных астроцитов, нарушению резистентности цитоплазматической мембраны и элиминации GFAP - белка промежуточных филаментов астроцитов в межклеточную жидкость, а затем диффузии его в лик-вор и кровоток пациента [Eng L. 2000;Чехонин В.П. 2001; Guffard R.G. 2005; Pekny M. 2004, 2007; Wang W. 2007]. Подобная диффузия GFAP наблюдается при некоторых патологических состояниях из-за нарушение структуры и барьерных функций гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [Rosenfeld R. G. 1987; Cornford Е.М. 2005].

Таким образом, количество GFAP в биологических жидкостях напрямую зависит от количества погибших или поврежденных астроцитов, что в свою очередь отражает степень выраженности нейродегенеративных процессов [Lamers K.J. 2003; Petzold А. 2004]. Используя метод количественного им-муноферментного анализа для определения концентрации GFAP в крови и ликворе в динамике развития патогенетиче-

ского процесса, можно получить достоверную информацию о темпах развития заболевания и оценить эффективность применяемой терапии.

Цель исследования: Получить и охарактеризовать реком-бинантный йРАР человека, иммунохимически идентичный нативному антигену и разработать иммуноферментный анализ для количественного определения вРАР в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного вРАР и антител полученных при иммунизации данным белком.

Задачи исследования:

1. Клонировать кДНК ЬвРАР в вектор рЕТ28-а, и получить штамм-продуцент, обладающий способностью к биосинтезу рекомбинантного белка с высоким уровнем эффективности.

2. Разработать метод очистки рекомбинантного белка из первичного биоматериала с высоким уровнем гомогенности и максимальным выходом.

3. Провести сравнительный иммунохимический анализ нативного и рекомбинантного препарата вРАР с использованием коммерческих препаратов антисывороток.

4. Получить поликлональные и моноклональные анти-ОРАР антитела и иммунохимически охарактеризовать их.

5. Разработать метод количественного иммуноферментно-го анализа йРАР на основе рекомбинантного препарата и соответствующих поли- и моноклональных антител в биологических жидкостях и протоколы для иммуногистохимического анализа вРАР на гистологических срезах и в культуре клеток.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что рекомбинантный вРАР обладает идентичными нативному белку иммунохимическими и им-муногенными свойствами, а препараты моноклональных и по-ликлональных антител полученных в результате иммунизации рекомбинантным ОРАР идентичны антителам, традиционно получаемым иммунизацией нативным белком.

2. Впервые создан и стандартизован сэндвич вариант твердофазного ИФА для определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантно-го препарата GFAP и полученных к нему антител.

Практическая значимость: Разработанная иммунофер-ментная тест-система анализа GFAP характеризуется высоким уровнем технологичности. Все антительные компоненты системы получены при иммунизации животных рекомбинантным GFAP, что позволяет их стандартизовать и накапливать в необходимых количествах. Данная тест-система позволяет воспроизводимо, специфично и надежно осуществлять количественный мониторинг функциональной и структурной целостности ГЭБ при нервных и психических заболеваниях, а также других поражениях ЦНС (болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, различные формы менингитов и энцефалитов), опухолях и травмах головного мозга. Анализ результатов количественного скрининга и мониторинга GFAP в сыворотке крови больных дает возможность рекомендовать его для дополнительной диагностики, прогноза течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клонирование кДНК hGFAP в вектор рЕТ28а и последующая экспрессия в штамме Е. coli (DE3 BL21) позволяет выделять рекомбинантный GFAP иммунохимически идентичный нативному антигену.

2. Поликлональные и моноклональные антитела, полученные к рекомбинантному GFAP идентичны антителам, получаемым к нативному антигену.

3. На основе рекомбинантного GFAP и антител полученных к нему может быть разработан твердофазный сэндвич вариант ИФА для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека.

Внедрение результатов исследования: Разработанный иммуноферментный анализ активно применяется в лаборатории иммунохимии отдела фундаментальной и прикладной

нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава» для изучения им-мунохимических аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.

Полученные антитела активно применяются для иммуноги-стохимических исследований мозга экспериментальных животных с целью оценки степени выраженности нейродегенера-тивных процессов при моделировании различных патологических состояний, а также для разработки липосомальных контейнеров векторного типа, способных транспортировать диагностические и терапевтические препараты в заинтересованную область ЦНС.

Апробация материалов диссертационного исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на заседании проблемного совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 4 - в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, 1 - глава в монографии .

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 схемами, 21 рисунком, 1 таблицей. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (160 источников из них 4 отечественных и 156 зарубежных авторов). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клонирование кДНК hGFAP в вектор рЕТ28а и экспрессия рекомбинантного белка в Е. coli (штамм DE3-BL21).

Выделение полиА+ мРНК было выполнено с помощью магнитных олиго-дТ частиц из первичной культуры астроци-тов. Первичная культура астроцитов была выделена путем механической и ферментативной диссоциации из биоптата мозга пациента, полученного в процессе нейрохирургической операции. Для выделения мРНК использовали около 2 млн. клеток. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью обратной транскриптазы M-MLV и 18-мерного олиго-дТ прай-мера. Проверку получившегося кДНК проводили посредством ПЦР-амплификации убиквитарно экспрессируемого гена гли-церальдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Фрагмент кДНК GFAP, содержащий белок-кодирующую область соответствующей мРНК был амплифицирован с применением ген-специфичных праймеров комплиментраных последовательности в начале рамки считывания и последовательности в области терминирующего трансляцию кодона.

Последовательность праймеров была определена с помощью программы Vector NTI Suite 9. Предполагаемая нуклео-тидная последовательность кДНК GFAP человека была загружена из GenBank'a. Ампликон GFAP был очищен от примесей методом препаративного электрофореза в агарозном геле и выделен из геля с использованием силика-спин микроколонок. Очищенный препарат использовался в качестве матрицы в следующем раунде ПЦР. С целью последующего клонирования продукт реакции был реамплифицирован с использованием гнездных праймеров содержащих синтетические сайты распознавания для эндонуклеаз рестрикции Ndel и EcoRI. Амплификацию осуществляли в режиме горячего старта. Ампликон был выделен методом препаративного электрофореза, дважды экстрагирован смесью фенол:хлороформ:изоамиловый

спирт 25:24:1, осажден, дважды промыт этанолом и высушен. Ампликон, как и вектор были обработаны эндонуклеазами рестрикции Ndel и EcoRI и дефосфорилированы щелочной фос-фатазой. Продукты с интересующей массой были выделены препаративным электрофорезом и очищены на силика-спин колонках.

Лигирование осуществляли при помощи ДНК-лигазы бактериофага Т4. После инкубации препарат использовали при электропорации суспензии компетентных клеток Е. coli (штамм XL-lBlue). После часовой инкубации в среде SOC клетки были пересеяны на чашки с плотной средой LB, содержащих 50 мкг/мл канамицина. Отбор и анализ рекомби-нантов на присутствие и правильную ориентацию вставки осуществляли методом ПЦР при помощи пары праймеров, комплиментарных последовательности кодирующей области GFAP и последовательности транскрипционного терминатора Т7 вектора рЕТ-28а. Колонии, давшие продукт ожидаемой молекулярной массы при электрофорезе были использованы для выделения плазмид.

Выделенные плазмиды подвергли рестрикционному анализу с применением эндонуклеаз рестрикции FaunDI и EcoRI. Образцы, содержащие вставки ожидаемого размера были отобраны для определения нуклеотидной последовательности с вектор-специфичными праймерами T7prom и T7term. Определение нуклеотидной последовательности осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI3100 Genetic Analyzer.

Для экспрессии рекомбинантного GFAP штамм Е. coli (DE3 BL21) был трансформирован отобранной плазмидой «кальциевым» методом. Для анализа эффективности экспрессии трансформированный штамм культивировали на шейкере в селективной среде до достижения оптической плотности 0,4 при 600 нм. Затем культуру индуцировали добавлением ИПТГ и продолжали инкубацию, отбирая каждый час 1 мл суспензии. Бактерии осаждали центрифугированием и хранили на -20*С. Анализ эффективности экспрессии осуществляли мето-

дом аналитического диск-электрофореза. Об эффективности судили по увеличению размеров бэнда с ожидаемой молекулярной массой.

Препаративное выделение рекомбинантного СРАР. С этой целью штамм-продуцент наращивали в объеме 300,0 мл до оптической плотности 0,4-0,6 при 600 нм. После индукции ИПТГ продолжали культивирование еще 4 часа, затем бактерии осаждали центрифугированием (4000§), и замораживали при -20*С. После разморозки на льду осадок лизировали на шейкере денатурирующим буфером, содержащим хаотропный агент, в течении 30-45 минут при комнатной температуре. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием, лизат ре-суспендировали с уравновешенным денатурирующим буфером носителем №->1ТА агарозой. Лизат с агарозой инкубировали на роторном шейкере 30-45 минут, вносили в колонку и собирали не связавшуюся фракцию. Носитель промывали денатурирующим буфером, проводили элюцию этим же буфером, закисленным до 4,5, после чего элюат защелачивали до рН=8.0 и проводили ступенчатый диализ с кратным уменьшением хоатропного агента. Выпавший в осадок белок собирали центрифугированием и использовали для иммунизации животных. Белок, оставшийся в растворе лиофилизировали, и использовали в качестве стандарт антигена при постановке ИФА.

Иммуноблот-анализ. Иммуноблот анализ проводили в соответствии со стандартными протоколами [Н.ТохуЫп и соавт. 1979 г.], разработанными либо для пероксидазного, либо хе-молюминесцентного способа проявления с применением коммерческих препаратов анти-ОРАР антител.

Иммунодиффузионный сравнительный анализ рекомбинантного и нативного препаратов СРАР. Иммунодиффузионный анализ проводили по методу Оухтерлони в модификации Храмковой и Абелева с коммерческим препаратом по-ликлональных антител к вРАР. Визуализацию полос преципитации осуществляли после окраски гелей кумасси 11250.

Иммунизацию животных, получение гибридом и очистку антител проводили по стандартным методикам [Чехонин В.П. и др., 2000].

Твердофазный иммуноферментный анализ проводили по методу [А. Voller et al. 1976], в некоторой нашей модификации [Павлов К.А. и др., 2008].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клонирование и экспрессия GFAP в вектор pet28a и экспрессия в штамме DE3-BL21.

После выделения м-РНК из культуры астроцитов и постановки реакции ОТ-ПЦР полученная кДНК библиотека использовалась в качестве матрицы для постановки 2-х последовательных ПЦР: первая с ген-специфическими праймерами, вторая с праймерами, содержащими сайты узнавания для эндо-нуклеаз рестрикции Ndel и EcoRI. На рисунке 1 А и Б представлены фотографии агарозных гелей.

После лигирования очищенного ампликона GFAP в вектор pet28a, высева на селективную среду и появления колоний было отобрано 20 случайных колоний трансформантов, которые были проверены на наличие вставки при помощи пары прай-меров gfap350-s и T7term. Все тестируемые колонии дали при амплификации продукт ожидаемой молекулярной массы (350 п.н.). Среди них случайным образом были отобраны 6 клонов для выделения плазмидной ДНК с целью последующего рест-рикционного анализа и определения нуклеотидной последовательности вставок.

Для определения размера вставок плазмиды были подвергнуты расщеплению эндонуклеазами рестрикции FauNDI и EcoRI. Данные рестрикционного анализа приведены на рисунке 1-В.

Образцы, содержавшие вставки ожидаемого размера 1295bp (клоны pT7rGFAP-l и pT7rGFAP-4), были отобраны для определения нуклеотидной последовательности с вектор-

специфичными праймерами Т7ргош (5'-

ТААТАСОАСТСАСТАТАООО-З') и Т71егш (см выше).

В результате анализа полученных нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей было обнаружено, что оба клона содержали некоторое количество мутаций. В частности, клон 4 содержал нонсенс-мутацию, приводящую к преждевременной терминации трансляции в положении К257 (нумерация от ГЯ-конца нативного вРАР), что не позволило использовать данный клон в дальнейшем. В то же время клон 1 содержал миссенс-мутацию, приводящую к замене Н—>У в положении 219. Однако стереохимическое сходство этих аминокислот и отсутствие других мутаций позволило использовать данный белок для дальнейшей работы.

А Б В Г

Рисунок 1. А-В: Электрофорез в агарозном 1% геле. Г - СДС-ПААГ электрофорез 7,5% гель. Дорожка Х- ХЛПпсШ! - 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 пн. А - Амплификация фрагмента кДНК ОРАР. Визуализируется ампликон СРАР с молекулярной массой 1334 п.м. Б - Второй раунд ПЦР с использованием «гнсздных» праймеров. Нужный ПЦР продукт обозначен стрелочкой. В - Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид. Дорожки 2-7 плаз-мидные ДНК из рекомбинантных клонов. Стрелками отмечены вставки с ожидаемой молекулярной массой. Г - Электрофорстический анализ тотального белка из клона-продуцента СРАР после индукции 1РТС. Дорожка 1 - маркеры молекулярных масс; дорожка 2 -неиндуцировапная культура; дорожки З-б культура после 0.5, 1, 2 и 3 часов индукции соответственно.

При анализе эффективности экспрессии методом СДС-ПААГ электрофореза был выявлен факт активного накопления продукта в первые 4 часа после индукции. Дальнейшее инкубирование не приводило к увеличению выхода рекомбинант-ного СРАР (Рисунок 1-Г).

Сравнительный анализ рекомбинантного и нативного GFAP. Для подтверждения идентичности полученного рекомбинантного белка нативному антигену было проведено изучение некоторых физико-химических свойств белка, а именно определение молекулярной массы, изоэлектрической точки и определение критической концентрации агрегации. В таблице №1 представлены данные сравнительного анализа рекомбинантного и нативного антигенов (по результатам анализа тематических публикаций), а также результаты компьютерного прогнозирования, полученные с помощью программы Vector NTI v. 9.0. В таблице приведены данные кажущейся электрофоретической подвижности.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что рекомбинантный препарат GFAP обладает свойствами практически идентичными нативному белку.

Таблица №1. Физико-химические свойства рекомбинантного и нативного препаратов GFAP, а также данные Vector NTI.

Характеристика для сравнения Vector NTI Натив-ный GFAP Рекомбинантный GFAP

Молекулярная масса, кДа 49,504 47-51 49

Значение изоэлектрической точки 5,85 5,7-5,9 5,8

Критическая концентрация для спонтанной агрегации, мкг/мл 40 40

Анализ чистоты рекомбинантного вРАР проводили методом диск-электрофореза с последующей денсиметрией поли-акриламидных гелей, окрашенных кумасси 11-250.

Рисунок 2.

А - Результат ECL иммуноблотинга (дорожка 1) и аналитического СДС-ПААГ электрофореза (дорожка

2 - rechGFAP (49kDa, GelAnalysis, v. 1.0; СДС-ПААГ, 7,5% AA) рекомбинантного GFAP, дорожка

3 - белковые препараты с калиброванной молекулярной массой, кДа.

Б - Сравнительный иммунодиффузионный анализ препаратов нативного и recGFAP, в системе коммерческих и полученных нами анти-GFAP антисывороток. 1 -рекомбинантный препарат GFAP, 2 -нативный препарат GFAP, 3 - коммерческая антисыворотка анти-GFAP (Signet), 4 - сыворотка кролика, иммунизированного рекомбинантным GFAP.

Результаты диск-электрофоретического анализа представлены на рисунке 2-А.

Иммунохимическую идентичность рекомбинантного и нативного GFAP подтверждали методом иммунодиффузионного анализа по Оухтерлони в модификации Храмковой Н.И. и Абелева Г.И. (рис. 2-Б). Непрерывная линия преципитации (отсутствие «шпор» и «перекрестов») свидетельствует о полной иммунохимической идентичности этих препаратов.

Получение моноклональных и поликлональных антител к рекомбинантному GFAP.

При иммунизации кроликов (порода Шиншилла) и мышей (BALB/C) препаратом рекомбинантного GFAP по классической схеме [Чехонин В.П. и соавт. 2001] были получены высокие титры анти GFAP антител как у кроликов, так и у мышей. Антитела принадлежали классу IgG. На рисунке 2-Б представлены результаты сравнительной иммунодиффузии полученных при иммунизации recGFAP поликлональных антител и коммерческих кроличьих поликлональных антител к GFAP. Непрерывная линия преципитации (отсутствие «шпор» и «перекрестов») свидетельствует о полной иммунохимической идентичности сравниваемых антител.

Для получения моноклональных антител было проведено слияние миеломных клеток линии SP2/0-Agl4 с клетками селезенки иммунизированных мышей по стандартному протоколу с использованием «PEG/DMSO Hybri-Мах», («Sigma»,

USA). После культивирования на селективной среде, гибридные клетки переводили на ростовую среду (RPMI, 10FBS). Видимые клоны образовывались через 3-4 недели после слияния. Анализ специфичности и эффективности секреции антител к GFAP проводили методом прямого твердофазного им-муноферментного анализа. Более 90% полученных в результате слияния клонов гибридом обладали способностью к синтезу анти-GFAP антител. Для получения конечного клона-продуцента было отобрано 5 наиболее активно синтезирующих клонов. Один из них был взят в работу для получения асцитов, содержащих моноклональные антитела.

Рисунок 3.

Иммуноцитохимический анализ GFAP в первичной культуре астроцитов(А, Б) и на срезах мозга крысы (В, Г) с помощью антител, полученных в результате иммунизации рекомбинантным GFAP. А - Первичные антитела - поликлональные антитела, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab -ВА2000 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML. Б -Первичные антитела - моноклональные антитела, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab - Ab - R6393 (Invitrogen), Rhodamine BA2000 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML. В -Первичные антитела - моноклональные антитела, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab - ВА2000 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML. Г -Первичные антитела - поликлональные антитела кролика, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab - ВА2005 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML

В целях проверки специфичности и аффинности полученных поликлональных и моноклональных антител были проведены эксперименты по иммунохимическому проявлению GFAP на срезах ткани головного мозга крысы и в препаратах фиксированных первичных культур астроцитов человека.

Шк -V " С{ 1 ■■' мЙЕ А i • \ ! / f . у 1 \ \ Б

М ¿L' w*- / в X •} } ■1K I / Г ' N

На рисунке 3 представлены микрофотографии иммунопе-роксидазного и иммунофлуоресцентного проявления GFAP-позитивных внутриклеточных структур соответствующими препаратами анти анти-GFAP антител. Полученные антитела высокоспецифично связываются с GFAP, визуализируя промежуточные филаменты астроцитов, при этом уровень их афинности позволяет использовать повышенную концентрацию детергента при отмывке, тем самым значительно снижая интенсивность неспецифического связывания антител и улучшить качество иммунопроявления.

Разработка сэндвич-варианта иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного GFAP и полученных к нему антител.

Для разработки ИФА было получено соответственно 5 и 10 мг препаратов поли- и моноклональных антител. В качестве препарата стандарт-титра для построения калибровочной кривой использовали лиофилизированный неденатурированный препарат рекомбинантного GFAP в концентрации 10 мг\л.

Препараты моноклональных и поликлональных анти-GFAP антител разводили бикарбонатным буфером (0.1М NaHCCh, рН 9.2) до конечной концентрации 10 мг/л и использовали сразу после разведения.

В лунки 96-луночного планшета (Sarsdedt, 82.1581) вносили препарат моноклональных анти-GFAP антител в концентрации 10 мг/л (0.1М NaHCCh, рН 9.2) по 50 мкл в лунку и инкубировали во влажной камере не менее 12 часов при 4°С. Далее лунки трижды промывали промывочным буфером (ЮОмМ PBS, 150мМ NaCl, 0.2% БСА, 0.05% Твин 20) на автоматическом вошере ELX50 (Bio-Tek). С целью блокирования свободных сайтов связывания в лунки вносили по 100 мкл блокирующего буфера (ЮОмМ PBS, рН 7.2, 1% БСА, 0.5% Твин 20, 0.02% тимерозал) и инкубировали в течение 30 минут при 20°С. Затем лунки трижды промывали промывочным буфером, в случае необходимости жидкость аспирировали и хранили плашки при -80°С.

К 100 нг лиофилизированного GFAP добавляли 1 мл буфера для антигена (ЮОмМ PBS, 150мМ NaCl) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. На следующем этапе, с использованием буфера для антигена, готовили серию разведений препарата GFAP от 100 до 0,75 нг/мл, вносили раствор GFAP по 150 мкл в лунку и инкубировали в течение 60 минут, при слабом покачивании, при 20°С. В 2 лунки вносили буфер без белка (контроль). В оставшиеся лунки вносили исследуемые образцы (плазма, ликвор) по 150 мкл в разведении 1:2 в буфере для антигена. После окончания инкубации лунки трижды промывали промывочным буфером.

На следующем этапе во все лунки планшета вносили по 100 мкл препарата поликлональных анти-GFAP антител кролика (10 мкг/мл) и инкубировали 30 минут при слабом покачивании, при 4°С. После окончания инкубации лунки трижды промывали промывочным буфером. Следующие стадии осуществляли в соответствие с протоколом производителя ABC Vector Labs Kit. Пероксидазную активность проявляли в течение 15 минут субстратным раствором, содержащим 0,3% Н2О2 в субстратном буфере (0,04М C6H807,0,27М NaHP04x2H20, рН 4,5) и 0,04% ОФД. Детекцию пероксидазной активности в лунках планшета осуществляли на фотометре ELx-800 Reader (Bio-Tek) при длине волны 450 нм.

Для определения точности и воспроизводимости калибровочной кривой иммунофер-ментного определения GFAP калибровали стандартный антиген, измеряя оптическую плотность при каждом варианте концентрации

Рисунок 4. Стандартная калибровочная кривая раз- g раз. АнаЛИЗ ДОВерИ-работанной тест-системы для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека. ТеЛЬНОГО Интервала И

стандартного отклонения осуществляли в Excel (Microsoft). Для проведения калибровки по стандарту («тест возврата») использовали пробы сыворотки с заранее определенной концентрацией GFAP. Далее к двум пробам прибавляли заведомо известное количество GFAP в концентрации 1 нг/мл. Результат оценивали в виде отношения ожидаемого и полученного результата. Для теста на определение линейности прямых для разного разведения пробы, выполняли титровку пробы 0,3% Н202 в субстратном буфере (0,04М С6Н807, 0,27М NaHP04x2H20, рН 4,5) от 1:1 до 1:8. Результат оценивали в виде отношения ожидаемых и полученных значений.

Результаты, характеризующие разработанную тест-систему, представлены в таблице №2. Точность и воспроизводимость калибровочной кривой подтверждается результатами анализа доверительного интервала и коэффициента вариации, значение которого лишь при концентрации 32 нг/мл оказывается более 5%.

Результаты определения теста-возврата демонстрируют значимое (более 20%) отклонение от ожидаемого результата лишь в случае 3-х кратного увеличения концентрации GFAP. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении в случае 3-х кратного увеличения концентрации GFAP. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении.

Полученные результаты позволяют характеризовать разработанную тест-систему как высокоспецифичную, воспроизводимую и стандартизованную.

На рисунке 4 приведена типичная калибровочная кривая, построенная с применением стандартного препарата рекомби-нантного GFAP. Величина достоверности аппроксимации составляет 0,99, что позволяет адекватно оценивать концентрацию GFAP в заданном диапазоне.

Таблица №2:

А) Точность и воспроизводимость калибровочной кривой иммунофсрмснтного определения СРАР.

Концентрация Число Среднее Доверительный Стандартное Коэффициент

GFAP опре- значение интервал отклонение вариации

нг/мл деле- Е425 %

ний

1,0 6 0,095 0,091-0,099 0,0014 4,78

2,0 6 0,103 0,100-0,106 0,0232 3,83

4,0 6 0,133 0,129-0,138 0,0130 3,90

8,0 6 0,157 0,151-0,163 0,0440 4,80

16,0 6 0,213 0,207-0,220 0,0548 3,88

32,0 6 0,289 0,275 - 0,304 0,0632 6,29

Б) Калибровка по стандарту («тест возврата») в иммунофермептном определении СКАР

Проба JV«1 - 2.7нг/мл Проба №2 - 0 иг/мл

Кол-во добавленного в мл пробы GFAP Ожидаемое \получснпос значение нг/мл Отношение в % Кол-во добавленного в мл пробы с;глр Ожидаемое \получе1шос значение нг/мл Отношение в %

2 нг 4,7 \ 5,0 107% 2 нг 2\ 1,74 87%

4 нг 6,7 \ 7,7 115% 4 нг 4 \ 3,72 93%

6 нг 8,7 \ 10,7 123% 6 нг 6\ 5,82 97%

В) Тест на определение параллельности калиб

ювочиых прямых при разведении антигена.

Проба №1 -5,80нг/мл

Проба №2-17,80 иг/мл

Разведение

Ожидаемое \получсшюс значение нг/мл

Отношение в%

Разведение

Ожидаемое \получси"ое значение нг/мл

Отношение в%

5,80

17,80

1:2

2,90 \2,48

85%

1:2

8,90 \ 10,10

113%

1:4

1,95 \ 1,84

94%

1:4

4,45 \ 5,17

116%

1:8

0,98 \ 1,10

91%

2,23 \ 2,86

128%

Результаты определения теста-возврата демонстрируют значимое (более 20%) отклонение от ожидаемого результата лишь в случае 3-х кратного увеличения концентрации СРАР. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении в случае 3-х кратного увеличения концентрации СРАР. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении.

Полученные результаты позволяют характеризовать разработанную тест-систему как высокоспецифичную, воспроизводимую и стандартизованную.

На рисунке 4 приведена типичная калибровочная кривая, построенная с применением стандартного препарата рекомби-нантного ОРАР. Величина достоверности аппроксимации составляет 0,99, что позволяет адекватно оценивать концентрацию йРАР в заданном диапазоне.

ОБСУЖДЕНИЕ

Открытие технологии рекомбинантных ДНК ознаменовало наступление новой эпохи, как для биохимии, так и для биологической науки в целом. Методы молекулярной биотехнологии практически упразднили громоздкие методики традиционной препаративной белковой химии. Благодаря динамично развивающимся системам для трансгенной экспрессии белков сегодня у исследователя есть целый арсенал инструментов для быстрого клонирования, экспрессии, выделения и очистки интересующего белка.

Основной целью данной работы являлось изучение адекватности применения рекомбинантных белков на примере вРАР для создания высокостандартизованных твердофазных иммуноферментных систем количественного анализа белков в биологических жидкостях, что широко распространено в современной клинической диагностике, а также в фундаментальных исследованиях.

Весьма важен вопрос выбора клеточных систем экспрессии того или иного белка, и в каждом случае он должен решаться индивидуально. Теоретически для разработки тест-систем с применением рекомбинантных антигенов целесообразно использование эукариотических систем экспрессии, так как посттрансляционная модификация приводит к образованию специфичных и высокоиммуногенных антигенных эпито-пов. Рекомбинантный белок при эукариотической экспрессии имеет возможность для нативного образования вторичной и последующих структур и не агрегирует, образуя малорастворимые формы, что позволяет проводить выделение в нативных условиях.

Что же касается ОБАР, то проведенные нами исследования не подтверждают факт существования в его структуре вы-сокоиммуногенных антигенных детерминант, возникающих в процессе посттрансляционной модификации. Поэтому прока-риотическая система белковой экспрессии является вполне адекватной, в целях получения рекомбинантного СБ АР, для разработки иммуноферментной тест-системы.

Рекомбинантный препарат был охарактеризован физико-химическими и иммунохимическими методами. В качестве препарата сравнения был использован вРАР, выделенный из постмортального мозга человека, описанным ранее [Чехонин В.П. и соав. 1999] способом. Методами иммунодиффузии, ПААГ электрофореза и иммуноблотинга была продемостри-рована полная иммунохимическая идентичность рекомбинантного и нативного препаратов.

Кроме самостоятельной задачи - клонирования и выделения очищенного СРАР, в работе был изучена возможность применения рекомбинантного белка для получения высокоспецифичных препаратов поликлональных и моноклональных антител.

Результаты проведенных экспериментов позволяют утверждать, что иммунизация животных (кроликов и мышей) рекомбинантным СБ АР человека приводит к возникновению адекватного иммунного ответа. При иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител более 90% клонов-гибридом оказались продуцентами анти-ОРАР антител.

При изучении полученных поли- и моноклональных антител не было обнаружено перекрестной иммунореактивно-сти, что зачастую случается при иммунизации нативным белком (вероятно, даже высокоочищенный белковый препарат содержит иммуногенно значимые количества примесных белков). В случае рекомбинантного ОБАР высокоспецифичный способ металлохелатной хроматографии исключает возможность контаминации очищенного белка.

В экспериментах по сравнению антител, полученных при иммунизации рекомбинантным и нативным препаратами, не было найдено различий ни в специфичности, ни в аффинности сравниваемых иммуноглобулинов. При анализе соотношения классов иммуноглобулинов в данных антисыворотках принципиальных отличий также найдено не было.

При иммуноцитохимическом исследовании гистологических срезов и фиксированных культур клеток, поликлональ-ные и моноклональные антитела позволяли высокоспецифично визуализировать активированные астроциты. При этом, неспецифический фон практически отсутствовал. Препарат по-ликлональных анти-ОРАР антител в концентрации 1 мг/мл для иммуноцитохимических исследований применялся в разведении 1:10000, что является хорошим показателем, характеризующим их высокую аффиность и специфичность. Рекомендуемое разведение моноклональных анти-СРАР антител, для иммунохимического проявления составило 1:5000. Для имму-ноблот анализа нативного и рекомбинантного ОРАР максимальное разведение, при условии хемилюминесцентного проявления, составляет 1:50000 и 1:30000 соответственно.

Следующим шагом после проведенного изучения всех полученных компонентов системы было создание твердофазного количественного ИФА ОРАР в биологических жидкостях человека. Одним из основных компонентов такой тест-системы является стандартный препарат антигена, различные разведения которого используются при построении калибровочной кривой.

Разработанный твердофазный сэндвич-вариант иммуно-ферментного анализа позволяет достоверно, точно и надежно определять концентрацию ОРАР в сыворотке и ликворе человека. Рабочий диапазон для оптимального определения локализуется в интервале концентраций антигена от 1 до 32 нг/мл. Проверка тест-системы на параллелизм, проведенная с помощью кратных разведений рекомбинантного препарата ОРАР,

позволила получить кривые, практически параллельные стандартной.

В лабораторной практике существуют ИФА тест-системы для количественного определения GFAP [Blennow М. 1995; 1996; Чехонин В.П. 2001; Rosengreen L. 1990-2007, Pet-zold А. 2004]. Однако все они разработаны на основе нативных антигенов, выделяемых из разнообразных биологических материалов: мозга быка, свиньи, человека. При этом методики выделения отличаются друг от друга, как и конечный продукт. К примеру, в одной тест-системе молекулярная масса стандарт-титра антигена, используемого для построения калибровочной прямой, равняется 45кДа, а в другой 58кДа. Несмотря на высокую межвидовую гомологию GFAP, было бы наивным полагать, что 1 нг GFAP человека, массой 45кДа, будет обладать такой же связывающей способностью, что и GFAP быка, массой 58кДа. Вот почему существующие тест-системы являются стандартизованными лишь в рамках одной партии, созданной по одной методике. Это осложняет процедуру экстраполяции результатов, полученных на разных тест-системах, и не позволяет проводить анализ накопленных данных, полученных разными исследователями.

Принципиальным отличием ИФА тест-системы, созданной на основе рекомбинантного препарата GFAP человека, является возможность стандартизовать все компоненты системы. Будучи единожды трансформирован, штамм-продуцент Е. Coli синтезирует один и тот же белок, обладающий одинаковыми физико- и иммунохимическими характеристиками, что позволяет производить стандартные тест-системы неограниченно долго и, практически, в любых количествах.

Внедрение данной тест-системы в практическое здравоохранение позволит значительно расширить арсенал клинико-лабораторных методов диагностики, скрининга и мониторинга течения и эффективности проводимой терапии больных с заболеваниями нервной системы. С другой стороны, применение данных систем анализа резистентности ГЭБ открывает новые

перспективы в изучении аутоиммунных аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Клонирование ОТ-ПЦР-продукта, полученного на матрице полиаденилированной мРНК из культуры нормальных астроцитов, в вектор рЕТ-28а позволило получить штамм Е. coli, обладающий способностью к эффективной экспрессии рекомбинантного GFAP. Введение гексагистидинового мотива в состав рекомбинантного белка-слияния значительно упрощает выделение химически чистого GFAP, иммунохимически идентичного нативному белку.

2. Иммунизация рекомбинантным GFAP дает возможность получать моноклональные и поликлональные антитела с иммунохимическими свойствами идентичными антителам, получаемым иммунизацией нативным GFAP.

3. Полученные путем иммунизации рекомбинантным препаратом поликлональные и моноклональные антитела способны высокоспецифично распознавать и связываться с нативным GFAP в таких видах иммунохимического анализа как иммуноблот анализ, иммуноцито- и гистохимический анализ, твердофазный иммуноферментный анализ.

4. Разработанная тест-система твердофазного иммуно-ферментного анализа с использованием рекомбинантного антигена и антител, полученных при иммунизации антигеном, для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека является высокоспецифичной, легко воспроизводимой, стандартизованной системой и характеризуется порогом чувствительности 0,5нг/мл.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.П. Чехонин, К.А. Павлов, А.Н. Шкопоров, Б.А. Ефимов, О.И. Турина, Т.Б. Дмитриева Клонирование и экспрессия кДНК GFAP в Е. Coli // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, №1, стр. 74 - 77

2. В.П. Чехонин, В.П. Баклаушев, Г.М. Юсубалиева, К.А. Павлов, О.В. Ухова, О.И. Турина Моделирование и иммуногистохими-ческий анализ глиомы С6 // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007. - 2. - С.65-73

3. В.П. Чехонин, О.И. Турина, Т.Б. Дмитриева, В.П. Баклаушев, Г.М. Юсубалиева, В.В. Белопасов, Ю.С. Скоблов, К.А. Павлов, О.В. Ухова, А.В. Семенова в монографии: Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам // Москва — Издательство «Медицина» 2007

4. V.P. Chekhonin, GM Yusubalieva V.P. Baklaushev, К.А. Pavlov, O.I. Gurina Immunohistochemical analysis of a model rat c6 glioma // Mat. of conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversaiy of M. I. Vavilov, Kiev, 2007

5. K. Pavlov, O. Gurina, V. Chekhonin. Recombinant GFAP for antibody production. //Glial cells in health and disease. London. 4-8 September 2007.

6. Г.М. Юсубалиева, В.П. Баклаушев, К.А. Павлов, В.П. Чехонин Направленный транспорт моноклональных антител к GFAP и AMVB1 на экспериментальной модели глиомы С6 крысы // Материалы конференции с международным участием Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга, Санкт - Петербург, 2008

7. К.А. Павлов, О.И. Турина, Т.Б. Дмитриева, А.В. Макаров, В.П. Чехонин Разработка иммуноферментного анализа GFAP на основе рекомбинантного антигена. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008, №11, стр. 535-539

8. V.P. Baklaushev, К.А. Pavlov, V.P. Chekhonin; Monoclonal Antibodies in Diagnostics of High-Grade Gliomas // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2009, Vol. 3. No. 2, pp. 105-115

Подписано в печать 15.05.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д.42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлов, Константин Александрович

Оглавление.

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. ОБ АР - глиофибриллярный кислый протеин.

1.2 Иммуноферментые системы для количественного определения антигена в биологических жидкостях.

1.3 Диагнстическая ценность количественного определения ОБ АР в биологических жидкостях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина"

Актуальность исследования. Возрастающий интерес к проблеме получения рекомбинантных нейроспецифических белков обусловливается, прежде всего, их высокой диагностической значимостью как критериев оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера при заболеваниях ЦНС [Aurell А. 1991; Blennow М. 1995,1996; Dotevall L. 1996; Hermann М. 2000; Чехонин В.П. 2001; Van Geel W. J. 2002, Herrmann 2003; Jauch E. 2000; Kristjansdottir R. 2001; Sporer B. 2004; Vissers J.L. 2006, Wunderlich M.T. 2006, Foerch C. 2006, Roseng-ren L. 2007, Heckl S. 2007, Notturno F.2008, Mullett S.J. 2008]. Практически любой патологический процесс в ЦНС приводит к реактивному астроглиозу - выраженной активации астроглиального компонента нервной ткани [Fitch M.T. 2008]. Наиболее ярким проявлением реактивного астроглиоза на молекулярно-биологическом уровне является резкое увеличение экспрессии GFAP в активированных астроцитах [Blomstrand С. 1995, Hill М. 2000, Brahmachari S. 2006]. Дальнейшее развитие патологического процесса приводит к гибели реактивных астроцитов, вследствие чего нарушается резистентность клеточной мембраны и GFAP (белок промежуточных филаментов астроцитов) оказывается в межклеточной жидкости, откуда элиминируется в кровоток и ликвор пациента, несмотря на его внутриклеточную локализацию. Подобный «прорыв» GFAP в биологические жидкости организма возможен лишь при заболеваниях, сопровождающихся нарушением резистентности гемато-энцефалического барьера [Blennow М. 1995,1996, Чехонин В.П. 2001, Chekhonin V. 2002, Rosengren L. 2007, Rosenfeld R. G. 1987]. Таким образом, количество GFAP в биологических жидкостях может напрямую зависеть от количества погибших или поврежденных астроцитов, что, в свою очередь, отражает степень выраженности нейроде-генераторного процесса [Lamers К. J. 2003; Petzold А. 2004, Notturno F.2008, Mullett S.J. 2008]. Используя метод количественного иммуноферментного анализа для определения GFAP в крови и ликворе, в динамике развития патологического процесса, представляется возможным создать систему получения достоверной объективной информации не только о наличии процесса как такового, но и о динамических особенностях течения заболевания и что особенно важно и перспективно оценить эффективность применяемой терапии. В связи с этим, биотехнологические аспекты получения необходимых количеств высоко-очищенного и абсолютно идентичного препарата белка, несомненно, являются определяющими при разработке способов количественного скриннингового определения его диагностически значимых количеств в биологических жидкостях пациентов (Чехонин В.П. 2001,2007, Jung CS 2007., Sarthy V.2007, Foerch C.2006). Всем этим требованиям полностью удовлетворяет рекомбинантный препарат GFAP, позволяющий разработать высокоточную, воспроизводимую и, что особенно важно, биотехнологически стандартизованную систему его имму-ноферментного определения для практического здравоохранения.

Цель исследования: Получить и охарактеризовать рекомбинантный GFAP человека, иммунохимически идентичный нативному антигену и разработать иммуноферментный анализ для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного GFAP и антител полученных при иммунизации данным белком.

Задачи исследования:

1. Клонировать кДНК hGFAP в вектор рЕТ28-а, и получить штамм-продуцент, обладающий способностью к биосинтезу рекомбинантного белка с высоким уровнем эффективности.

2. Разработать метод очистки рекомбинантного белка из первичного биоматериала с высоким уровнем гомогенности и максимальным выходом. \

3. Провести сравнительный иммунохимический анализ нативного и рекомбинантного препарата GFAP с использованием коммерческих препаратов антисывороток.

4. Получить поликлональные и моноклональные анти-GFAP антитела и иммунохимически охарактеризовать их.

5. Разработать метод количественного иммуноферментного анализа ОБ АР на основе рекомбинантного препарата и соответствующих поли- и мо-ноклональных антител в биологических жидкостях и протоколы для иммуноги-стохимического анализа ОБ АР на гистологических срезах и в культуре клеток.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что рекомбинантный ОБ АР обладает идентичными нативному белку иммунохимическими и иммуногенными свойствами, а препараты моноклональных и поликлональных антител полученных в результате иммунизации рекомбинантным ОБ АР идентичны антителам, традиционно получаемым иммунизацией нативным белком.

2. Впервые создан и стандартизован сэндвич вариант твердофазного ИФА для определения концентрации ОБ АР в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного препарата ОБ АР и полученных к нему антител.

Практическая значимость: Разработанная иммуноферментная тест-система анализа ОБ АР характеризуется высоким уровнем технологичности. Все антительные компоненты системы получены при иммунизации животных рекомбинантным ОБ АР, что позволяет их стандартизовать и накапливать в необходимых количествах. Данная тест-система позволяет воспроизводимо, специфично и надежно осуществлять количественный мониторинг функциональной и структурной целостности ГЭБ при нервных и психических заболеваниях, а также других поражениях ЦНС (болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, различные формы менингитов и энцефалитов), опухолях и травмах головного мозга. Анализ результатов количественного скрининга и мониторинга ОБ АР в сыворотке крови больных дает возможность рекомендовать его для дополнительной диагностики, прогноза течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клонирование кДНК hGFAP в вектор рЕТ28а и последующая экспрессия в штамме Е. coli (DE3 BL21) позволяет выделять рекомбинантный GFAP иммунохимически идентичный нативному антигену.

2. Поликлональные и моноклональные антитела, полученные к реком-бинантному GFAP идентичны антителам, получаемым к нативному антигену.

3. На основе рекомбинантного GFAP и антител полученных к нему может быть разработан твердофазный сэндвич вариант ИФА для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека.

Внедрение результатов исследования: Разработанный иммунофермент-ный анализ активно применяется в лаборатории иммунохимии отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава» для изучения иммунохимических аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.

Полученные антитела активно применяются для иммуногистохимических исследований мозга экспериментальных животных с целью оценки степени выраженности нейродегенеративных процессов при моделировании различных патологических состояний, а также для разработки липосомальных контейнеров векторного типа, способных транспортировать диагностические и терапевтические препараты в заинтересованную область ЦНС.

Апробация материалов диссертационного исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на заседании проблемного совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 4 - в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, 1 - глава в монографии .

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 схемами, 21 рисунком, 1 таблицей. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (160 источников из них 4 отечественных и 156 зарубежных авторов). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлов, Константин Александрович, Москва

1. Bignami A., Eng L. F., Dahl D., Uyeda С. T. Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by iMMunofluorescence // Brain Res. — 1972. — Vol. 43.—P. 429-435.

2. Eng L. F., Ghirnikar R. S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). // Neurochem. Res. — 2000. — Vol. 25. — P. 14391451.

3. Bignami A., Dalil D. Isolation of GFA protein from normal brain — a coMMent // J. Histochem. Cytochem. — 1979. — Vol. 27. — P. 693.

4. Dahl D., Bignami A. iMMunogenic properties of the glial fibrillary acidic protein. // Brain Res. — 1976. — Vol. 116. — P. 150.

5. Lewis SA, Balcarek JM, Krek V, Shelanski M, Cowan NJ, Sequence of a cDNA clone encoding mouse glial fibrillary acidic protein: structural conservation of intermediate filaments. ProcNatl Acad Sci USA. 1984 May;81(9):2743-6.

6. Miura M, Tamura T, Mikoshiba K., Cell-specific expression of the mouse glial fibrillary acidic protein gene: identification of the cis- and trans-acting promoter elements for astrocyte-specific expression. J Neurochem. 1990 Oct; 55(4):11808.

7. Sarkar S, Cowan NJ. Intragenic sequences affect the expression of the gene encoding glial fibrillary acidic protein.J Neurochem. 1991 Aug;57(2):675-84.РМШ: 2072110

8. Sarkar S, Cowan NJ. Regulation of expression of glial filament acidic protein.J Cell Sci Suppl. 1991;15:97-102.PMTO: 1824112

9. Kaneko R, Sueoka N. Tissue-specific versus cell type-specific expression of the glial fibrillary acidic protein.Proc Natl Acad Sei USA. 1993 May 15;90(10):4698-702.PMLD: 8506321

10. Brenner M, Lampel K, Nakatani Y, Mill J, Banner C, Mearow K, Dohadwa-la M, Lipsky R, Freese E.Characterization of human cDNA and genomic clones for glial fibrillary acidic protein.Brain Res Mol Brain Res. 1990 May;7(4):277-86.РМЮ: 2163003

11. Reeves SA, Helman LJ, Allison A, Israel MA.Molecular cloning and primary structure of human glial fibrillary acidic protein.Proc Natl Acad Sei USA. 1989 Jul;86(13):5178-82.PMID: 2740350 PubMed indexed for MEDLINE.

12. Sarthy PV, Fu M, Huang J.Subcellular localization of an intermediate filament protein and its mRNA in glial cells.Mol Cell Biol. 1989 0ct;9(10):4556-9.РМГО: 2586519 PubMed indexed for MEDLINE.

13. Quinlan RA, Brenner M, Goldman JE, Messing A.GFAP and its role in Alexander disease .Exp Cell Res. 2007 Jun 10;313(10):2077-87. Epub 2007 Apr 6. Review.PMID: 17498694 PubMed indexed for MEDLINE.

14. Laping NJ, Teter B, Nichols NR, Rozovsky I, Finch CE.Glial fibrillary acidic protein: regulation by hormones, cytokines, and growth factors.Brain Pathol. 1994 Jul;4(3):259-75. Review.PMID: 7952267

15. Калашников В.В. Раково-эмбриональные белки человека: Дис. . д-ра. мед. наук. —М., 1986.

16. Köhler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature -1975 V. 256 - P. 495-497.

17. Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Е. и др. Моноклональные ан-ти-GFAP антитела: получение характеристика и иммуноферментный анализ.БЭБМ 2001- № 8 - с.188-191

18. Weir D. Handbook of experimental iMMunology. — Oxford, 1978

19. Чехонин В. П., Дмитриева Т. Б., Жирков Ю. А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. -М. Медицина, 1999

20. Albrechtsen М., Massaro A., Bock Е. Enzyme-linked iMMunosorbent assay for human glial fibrillary acidic protein using a mouse monoclonal antibody. // J. Neurochem. — 1985. — Vol. 44. — P. 560-565.

21. Albrechtsen M., Sorensen P. S., Gjerris F., Bock E. High cerebrospinal fluid concentration of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in patients with normal pressure hydrocephalus. // J. Neurol. Sci. — 1985. — Vol. 70. — P. 269-274.

22. Arochena M., Anadón R., Diaz-Regueira S. M. Development of vimentin and glial fibrillary acidic protein iMMunoreactivities in the brain of gray mullet (Chelon labrosus), an advanced teleost. // .J Сотр. Neurol. — 2004. — Vol. 469. — P. 413-436.

23. Aurell A., Rosengren L. E., Karlsson B. et al. Determination of S100 and glial fibrillary acidic protein concentrations in cerebrospinal fluid after brain infarction. // Stroke. — 1991. — Vol. 22. — P. 1254-1258.

24. Beach T. G., Walker R., McGeer E. G. Patterns of gliosis in Alzheimer's disease and aging cerebrum. // Glia. — 1989. — Vol. 2. — P. 420-436.

25. Berry M. Regeneration in the central nervous system. — In: Smith W. Т., Canavagh J. B. (Eds.). Recent advances in neuropathology. — Edinburgh: Churchill Livingstone, 1979. — Vol. 1. — P. 67-111.

26. Bertelli E., Regoli M., Gambelli F. et al. GFAP is expressed as a major soluble pool associated with glucagon secretory granules in A-cells of mouse pancreas. // J. Histochem. Cytochem. — 2000. — Vol. 48. — P. 1233-1242.

27. Bigner D. D., Bigner S. H., Ponten J., et al. Heterogeneity of genotypic and phenotypic characteristics of fifteen permanent cell lines derived from human gliomas // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1981. — Vol. 40. — P. 201-229.

28. Bjorklund H., Dahl D., Seiger A. Neurofilament and glial fibrillary acid protein-related iMMunoreactivity in rodent enteric nervous system // Neuroscience. — 1984. — Vol. 12. — P. 277-287.

29. Blennow M., Hagberg H., Rosengren L. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid: a possible indicator of prognosis in full-term asphyxiated newborn infants? // Pediatr. Res. — 1995. — Vol. 37. — P. 260-264.

30. Blennow M., Rosengren L., Jonsson S., Forssberg H., et al. Glial fibrillary acidic protein is increased in the cerebrospinal fluid of preterm infants with abnormal neurological findings // Acta Paediatr. — 1996 — Vol. 85. — P. 485-489.

31. Blennow M., Savman K., lives P. et al. Brain-specific proteins in the cerebrospinal fluid of severely asphyxiated newborn infants. // Acta Paediatr. — 2001Vol. 90 —P. 1171-1175.

32. Blomstrand C., Johansson B., Rosengren B. Blood-brain barrier lesions in acute hypertension in rabbits after unilateral X-ray exposure of the brain // Acta Neurol. Scand. — 1995. — Vol. 31. — P. 97-102.

33. Bush T .G., Puvanachandra N., Horner C. H. et al. Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice. // Neuron. — 1996. — Vol. 23. — P. 297308.

34. Calne D. B. — In: W. B. Saunders (Ed.) Neurodegenerative Diseases — Philadelphia, 1994.

35. Campbell I. L. Transgenic mice and cytokine actions in the brain: bridging the gap between structural and functional neuropathology. // Brain Res. Brain Res. Rev. — 1998. — Vol. 26. — P. 327-336.

36. Carrasco J., Hernandez J., Gonzalez B. et al. Localization of metallothione-in-I and -III expression in the CNS of transgenic mice with astrocyte-targeted expression of interleukin 6. // Exp. Neurol. — 1998. — Vol. 153. — P. 184 -194.

37. Carpenter M. K., Winkler C., Fricker R. et al. Generation and transplantation of EGF responsive neural stem cells. // Exp. Neurol. — 1997. — Vol. 148. — P. 187-204.

38. Chen W. J., Liem R. K. Reexpression of glial fibrillary acidic protein rescues the ability of astrocytoma cells to form processes in response to neurons. // J. Cell Biol. — 1994. — Vol. 127. — P. 813-823.

39. Choi B. H., Kim R. C. Expression of glial fibrillary acidic protein by iMMature oligodendroglia and its implications. // J. NeuroiMMunol. — 1985. — Vol. 8,—P. 215-235.

40. Dadi H. K. et al. — In: Reid E., Cook G. M. W., Moore D. J. (Eds.) Investigation of membrane located receptors. — Plenum, 1984. — 548 p.

41. Dahl D., Rueger D. C., Bignami A., et al. Vimentin, the 57,000 molecular weight protein of fibroblast filaments, is the major cytoskeletal component of iMMature glia. // Eur. J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 24. — P. 191-196.

42. Dahl D., Chi N. H., Miles L. E., et al. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in Schwann cells // J. Histochem. Cytochem. — 1982. — Vol. 30. — P. 912-918.

43. Delaney C. L., Brenner M., Messing A. Conditional ablation of cerebellar astrocytes in postnatal transgenic mice. //J. Neurosci. — 1996. — Vol. 16. — P. 6908-6918.

44. Dotevall L., Rosengren L. E., Hagberg L. Increased cerebrospinal fluid levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in Lyme neuroborreliosis. // Infection. — 1996. — Vol. 24. — P. 125-129.

45. Duffy P. E., Rapoport M., Graf L. Glial fibrillary acidic protein and Alzheimer-type senile dementia. //Neurol. — 1980. — Vol. 30. — P. 778-782.

46. Eddleston M., Mucke L. Molecular profile of reactive astrocytes; implications for their role in neurologic diseases. // Neurosci. — 1993. — Vol. 54. — P. 15-36.

47. Ehlers S., Kyllerman M., Rosengren L. Analysis of glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of children investigated for encephalopathy. // Neuropediatrics. — 1994. — Vol. 25. — P. 129 133.

48. Eng L. F., Ghirnikar R. S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). //Neurochem. Res. — 2000. — Vol. 25. — P. 14391451.

49. Galbreath E., Kim S. J., Park K., Brenner M. et al. Overexpression of TGF-beta 1 in the central nervous system of transgenic mice results in hydrocephalus. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1995. — Vol. 54. — P. 339-349.

50. Gard A. L., White F. P., Dutton G. R. Extra-neural glial fibrillary acidic protein (GFAP) iMMunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver. // J. NeuroiiviMunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 359-375.

51. Ghirnikar R .S., Yu A. C., Eng L. F. Astrogliosis in culture: III. Effect of recombinant retrovirus expressing antisense glial fibrillary acidic protein RNA. // J. Neurosci. Res. — 1994. — Vol. 38. — P. 376-385.

52. Goldman R. D., Zackroff R. V., Steinert P. M. Intermediate filaments: overview. — In: Goldman R. D., Steinert P. M. (Eds.) Cellular and molecular biology of intermediate filaments. — N. Y.: Plenum, 1990. — P. 3-20.

53. Gomes F. C., Garcia-Abreu J., Galou M. et al. Neurons induce GFAP gene promoter of cultured astrocytes from transgenic mice. // Glia. — 1999. — Vol. 26. — P. 97-108.

54. Gomi H., Yokoyama T., Fujimoto K., et al. Mice devoid of the glial fibrillary acidic protein develop normally and are susceptible to scrapie prions. //Neuron. — 1995. —Vol. 14.—P. 29-41.

55. Goodison K. L., Parhad I. M., White C. L. et al. Neuronal and glial gene expression in neocortex of Down's syndrome and Alzheimer's disease. // J. Neuropa-thol. Exp. Neurol. — 1993, — Vol. 52.—P. 192-198.

56. Hatfield J. S., Skoff R .P., et al. The lens epithelium contains glial fibrillary acidic protein. // J. NeuroiMMunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 347 — 357.

57. Herrmann M., Ehrenreich H. Brain derived proteins as markers of acute stroke: their relation to pathophysiology, outcome prediction and neuroprotective drug monitoring. //Restor. Neurol. Neurosci. — 2003. — Vol. 21. — P. 177-190.

58. Herrmann M., Vos P., Wunderlich M. T. et al. Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke: A comparative analysis of serum concentrations of protein S100B and glial fibrillary acidic protein. // Stroke. — 2000 — Vol. 31—P. 2670-2677.

59. Higley H. R., McNulty J. A., Rowden G. Glial fibrillary acidic protein and SI00 protein in pineal supportive cells: an electron microscopic study. //Brain Res. — 1984, —Vol. 304 —P. 117-120.

60. Hill M. D., Jackowski G., Bayer N. et al. Biochemical markers in acute ischemic stroke // CMAJ. — 2000. — V. 18. — P. 162-168.

61. Hofler H., Walter G. F., Denk H. iMMunohistochemistry of folliculo-stellate cells in normal human adenoliypophyses and in pituitary adenomas. // Acta Neuro-pathol. — 1984. — Vol. 65. — P. 35-40.

62. Holland E. C., Varmus H. E. Basic fibroblast growth factor induces cell migration. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1998. — Vol. 95. — P. 1218-1223.

63. Iida K., Takashima S. et al. iMMunohistochemical study of myelination and oligodendrocytes in infants with periventricular leukomalacia. // Pediatr. Neurol. Nov. — 1995. — Vol. 13. — P. 296-304.

64. Jauch E. C. Diagnosis of stroke: the use of serum markers. // Stroke. — 2000. —Vol. 31,—P. 39-45.

65. Kalman M., Pritz M. B. Glial fibrillary acidic protein-iMMunopositive structures in the brain of a Crocodilian, Caiman crocodilus, and its bearing on the evolution of astroglia. // J. Comp. Neurol. — 2001. — Vol. 431. — P. 460-480.

66. Kordower J. H., Chen E. Y., Winkler C. et al. Grafts of EGF-responsive neural stem cells derived from GFAP-hNGF. // J. Comp. Neurol. — 1997. — Vol. 387,—P. 96-113.

67. Kragh J., Bolwig T. G., Woldbye D. P. et al. Electroconvulsive shock and li-docaine-induced seizures in the rat activate astrocytes as measured by glial fibrillary acidic protein. //Biol. Psychiatry. — 1993. — Vol. 33. — P. 794-800.

68. Kristjansdottir R., Uvebrant P., Rosengren L. Glial fibrillary acidic protein and neurofilament in children with cerebral white matter abnormalities. // Neuro-pediatrics. — 2001. — Vol. 32. —P. 307-312.

69. Landry C. F., Ivy G. O., Brown I. R. Developmental expression of glial fibrillary acidic protein mRNA in the rat brain analyzed by in situ hybridization // J. Neurosci. — 1990. — Vol. 25. — P. 194-203.

70. Liedtke W., Edelmann W., Biery P. L., et al. GFAP is necessary for the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination. //Neuron. — 1996. — Vol. 17. — P. 607-615.

71. Lundkvist J., Sundgren-Andersson A. K., Tingsborg S. et al. Acute-phase responses in transgenic mice with CNS overexpression of IL-1 receptor antagonist. // Am. J. Physiol. — 1999. — Vol. 276. — P. R644-651

72. Magerkurth O. Nachweis von saurem glialen Faserprotein (GFAP) in humanem Serum und erste klinische Ergebnisse. // Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin. —München, 2003.

73. Mann D. M. A. The pathological association between Down's syndrome and Alzheimer's disease. // Mech. Aging Dev. — 1988. — Vol. 43. — P. 99-136.

74. McCall M. A., Gregg R. G., Behringer R. R. et al. Targeted deletion in astrocyte intermediate filament (Gfap) alters neuronal physiology. //Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. — 1996. — Vol. 93. — P. 6361-6366.

75. McKie E. A., Graham D. I., Brown S. M. Selective astrocytic transgene expression in vitro and in vivo. // Gene Therapy. — 1998. — Vol. 5. — P. 440 -450.

76. Michetti F., Larocca L. M., Rinelli A. et al. iMMuriocytochemical distribution of SI00 protein in patients with Down's syndrome. // Acta Neuropathol. — 1990. — Vol. 80. — P. 475-478.

77. Miller D. B., Blackman C. F., O'Callaghan J. P. An increase in glial fibrillary acidic protein follows brain hyperthermia in rats. //Brain Res. — 1987. — Vol. 415,—P. 371-374.

78. Missler U., Wiesmami M., Wittmann G. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein in human blood: Analytical method and preliminary clinical results. // Clin. Chem. — 1999. — Vol. 45. — P. 138-141.

79. Mito T., Becker L. E. Developmental changes of S100 protein and glial fibrillary acidic protein in the brain in Down syndrome. // Exp. Neurol. — 1993. — Vol. 120.—P. 170-176.

80. Mori T., Morimoto K., Hayakawa T., et al. RadioiMMunoassay of astro-protein (an astrocyte specific cerebroprotein) in cerebrospinal fluid and its clinical significance //Neurol. Med.-Chir. — 1978. — Vol. 18. — P. 25-31.

81. Mucke L., Rockenstein E. M. Prolonged delivery of transgene products to specific brain regions by migratory astrocyte grafts. // Transgenics. — 1993. — Vol. 1.—P. 3-9.

82. Murphy G. M., Eng L. F., Ellis W. G. et al. Antigenic profile of plaques and neurofibrillary tangles in the amygdala in Down's syndrome: a comparison with Alzheimer's disease. // Brain Res. — 1990. — Vol. 537. — P. 102-108.

83. Nakazato Y., Ishizeki J., et al. Localization of SI00 and glial fibrillary acidic protein-related antigen in pleomorphic adenoma of salivary glands. // Lab. Invest. — 1982. — Vol. 46. — P. 621-626.

84. Niebroj-Dobosz I., Rafalowska J., Lukasiuk M., et al. iMMunochemical analysis of some proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with ischemic strokes // Folia Neuropathol. — 1994. — Vol. 34. — P. 182-186.

85. O'Callaghan J. P., Lavin K. L., Chess G., Clouet D. H. A method for dissection of discrete regions of rat brain following microwave irradiation. // Brain Res. Bull. — 1983. — Vol. 11. — P. 31-42.

86. Onteniente B., Kimura H., Maeda T. Comparative study of the glial fibrillary acidic protein in vertebrates by PAP iMMunohistochemistry // J. Comp. Neurol. — 1983. — Vol. 215 — P. 427-436.

87. Papasozomenos S., Shapiro S. Pineal astrocytoma — report of a case, confined to the epiphysis, with iMMunocytochemical and electron microscopic studies // Cancer. — 1981. — Vol. 47. — P. 99-103.

88. Pekny M., Leveen P., Pekna M. et al. Mice lacking GFAP display astrocytes devoid of intermediate filaments but develop and reproduce normally. // EMBO J. — 1995 — Vol. 14 — P. 1590-1598.

89. Pekny M., Johansson C. B., Eliasson C. et al. Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillary acidic protein and vimentin. // J. Cell Biol. — 1999. — Vol. 145. — P. 503-514.

90. Petito C. K., Halaby I. A. Relationship between ischemia and ischemic neuronal necrosis to astrocyte expression of glial fibrillary acidic protein // Int. J. Dev. Neurosci. — 1993. — Vol. 11. — P. 239-247.

91. Petzold A., Keir G., Green A. J. et al. An ELISA for glial fibrillary acidic protein. // J. iMMunol. Methods. — 2004. — Vol. 287. — P. 169-177.

92. Quintana J. G., Lopez-Colberg I., Cunningham, L. A. Use of GFAP-lacZ transgenic mice to determine astrocyte fate in grafts of embryonic ventral midbrain. //Brain Res. Dev. Brain Res. — 1998. — Vol. 105. — P. 147-151.

93. Ramer M. S., Kawaja M. D., Henderson J. T. et al. Glial overexpression of NGF enhances neuropathic pain and adrenergic sprouting into DRG followingchronic sciatic constriction in mice. //Neurosci. Lett. — 1998. — Vol. 251. — P. 53-56.

94. Ribotta M. G., Menet V., Privat A. Glial scar and axonal regeneration in the CNS: lessons from GFAP and vimentin transgenic mice. // Acta Neurochir. Suppl. — 2004. — Vol. 89. — P. 87-92.

95. Rosengren L. E., Ahlsen G., Belfrage M. et al. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: application in CSF of children. // J. Neurosci. Methods. — 1992. — Vol. 44. — P. 113-119.

96. Rosengren L. E., Lycke J., Andersen O. Glial fibrillary acidic protein in CSF of multiple sclerosis patients: relation to neurological deficit. // J. Neurol. Sci. — 1995.— Vol. 133, —P. 61-65.

97. Rosengren L. E., Wikkelso C., Hagberg L. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: Application in CSF of adults // J. Neurosci. Methods. — 1994. —Vol. 51.—P. 197-204.

98. Rozemuller J. M., Eikelenboom P., Stam F. C. et al. A4 protein in Alzheimer's disease: Primary and secondary cellular events in extracellular amyloid deposition. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1989. — Vol. 48. — P. 674 -691.

99. Rutka J. T., Murakami M., Dirks P. B., et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review // J. Neurosurg. — 1997. — Vol. 87. — P. 420-430.

100. Rutka J. T., Smith S. L. Transfection of human astrocytoma cells with glial fibrillary acidic protein complementary DNA: analysis of expression, proliferation, and tumorigenecity// Cancer Res. — 1993. — Vol. 53. — P. 3624-3641.

101. Ruutiainen J., Newcombe J., Salmi A. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and anti-GFAP antibodies by solid-phase radioiMMunoassays. // Acta Neurol. Scand. — 1981. — Vol. 63. — P. 297-305.

102. Salm A. K., Hatton G. I., Nilaver G. iMMunoreactive glial fibrillary acidic protein in pituicytes of the neurohypophysis // Brain Res. — 1982. — Vol. 236. — p. 471-476.

103. Schaumburg H. H., Powers J. M., Raine C. S. et al. Adrenoleukodystrophy. A clinical and pathological study of 17 cases. // Arch. Neurol. — 1975. — Vol. 33. — P. 577-591.

104. Schnitzer J., Franke W. W., Schachner M. iMMunocytochemical demonstration of vimentin in astrocytes and ependymal cells of developing and adult mouse nervous system // J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 90. — P. 435-447.

105. Segovia J., Vergara P., Brenner M. Astrocyte-specific expression of tyrosine hydroxylase after intracerebral gene transfer induces behavioral recovery in experimental Parkinsonism. // Gene Therapy. — 1995. — Vol. 5. — P. 1650-1655.

106. Shibuki K., Gomi H., Chen L. et al. Deficient cerebellar long-term depression, impaired eye blink conditioning, and normal motor coordination in GFAP mutant mice. // Neuron. — 1996. — Vol. 16. — P. 587-599.

107. Smith J. D., Sikes J., Levin A. J. Human apolipoprotein E allele-specific brain expressing transgenic mice. //Neurobiol. Aging. — 1998. — Vol. 19. — P. 407-413.

108. Sporer B., Missler U., Magerkurth O. et al. Evaluation of CSF glial fibrillary acidic protein (GFAP) as a putative marker for HIV-associated dementia. // Infection. — 2004. — Vol. 32. — P. 20-23.

109. Suenaga T., Hirano A., Llena J. F. et al. Modified iMMunocytochemical studies in cerebellar plaques in Alzheimer's disease. // J. Neuropathol. Exp. Neurol.1990.— Vol. 49.—P. 31-40.

110. Sun Y., Wu S., Bu G. et al. Glial fibrillary acidic protein-apolipoprotein E (apoE) transgenic. // J. Neurosci. — 1998. — Vol. 18. — P. 3261-3272.

111. Tardy M., Fages C., Riol H., et al. Developmental expression of the glial fibrillary acidic protein mRNA in the central nervous system and in cultured astrocytes // J. Neurochem. — 1989. — Vol. 52. — P. 162-167.

112. Trejo F., Vergara P., Brenner M. et al. Gene therapy in a rodent model of Parkinson's disease using differentiated C6 cells expressing a GFAP-tyrosine hydroxylase transgene. // Life Sci. — 1999. — Vol. 65. — P. 483-491.

113. Tsukita S. Ishikawa H., Karokawa M. Isolation of 10 nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. // J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 88. — P. 245250.

114. Van Geel W. J., de Reus H. P., Nijzing H. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein in blood: An analytical method. // Clin. Cliim. Acta. — 2002. — Vol. 326,—P. 151-154.

115. Vijayan V., Geddes J. W., Anderson K. J. et al. Astrocyte hypertrophy in the Alzheimer's disease hippocampal formation. // Exp. Neurol. — 1991. — Vol. 112.P. 72-78.

116. Wallin A., Blennow K., Rosengren L. E. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of patients with dementia. // Dementia. — 1996. — Vol. 7. — P. 267-272.

117. Yu A. C., Lee Y. L., Eng L. F. Inhibition of GFAP synthesis by antisense RNA in astrocytes. // J. Nenrosci. Res. — 1991. — Vol. 30. — P. 72-79.

118. Bernier, L.; Colman, D. R.; D'Eustachio, P. Chromosomal locations of genes encoding 2-prime,3-prime cyclic nucleotide 3-prime-phosphodiesterase and glial fibrillary acidic protein in the mouse. J. Neurosci. Res. 20: 497-504, 1988. PubMed ID :2903254

119. Yu A. C., Lee Y. L., Eng L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. // J. Neurosci. Res. — 1993. — Vol. 34. — P. 295-303.

120. Hallpike J. F., Adams C. W. M., Tourtellotte W. W. Multiple Sclerosis. Pathology, diagnosis and management. — Baltimore: Williams & Wilkins, 1983.

121. De Strooper, B. Aph-1, Pen-2, and nicastrin with presenilin generate an active gaMMa-secretase complex. Neuron 38: 9-12, 2003. PubMed ID : 12691659

122. Li, Y.-M.; Xu, M.; Lai, M.-T.; Huang, Q.; Castro, J. L.; DiMuzio-Mower, J.; Harrison, T.; Lellis, C.; Nadin, A.; Neduvelil, J. G.; Register, R. B.; Sardana, M. K.; Shearman, M. S.; Smith, A. L.; Shi, X.-P.; Yin, K.-C.; Shafer, J. A.; Gardell, S. J. :

123. Photoactivated gaMMa-secretase inhibitors directed to the active site cova-lently label presenilin 1. Nature 405: 689-694, 2000. PubMed ID : 10864326

124. Page, K.; Hollister, R.; Tanzi, R. E.; Hyman, B. T. In situ hybridization analysis of presenilin 1 mRNA in Alzheimer disease and in lesioned rat brain. Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 14020-14024,1996. PubMedID : 8943053

125. Bernier, L.; Colman, D. R.; DEustachio, P. Chromosomal locations of genes encoding 2-prime,3-prime cyclic nucleotide 3-prime-phosphodiesterase and glial fibrillary acidic protein in the mouse. J. Neurosci. Res. 20: 497-504, 1988. PubMed ID :2903254

126. Brownell, E.; Lee, A. S.; Pekar, S. K.; Pravtcheva, D.; Ruddle, F. H.; Bay-ney, R. M. : Glial fibrillary acid protein, an astrocytic-specific marker, maps to human chromosome 17. Genomics 10: 1087-1089, 1991. PubMedID : 1655631

127. Brenner, M.; Johnson, A. B.; Boespflug-Tanguy, O.; Rodriguez, D.; Goldman, J. E.; Messing, A. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nature Genet. 27: 117-120, 2001.

128. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. и соавт. Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы Сб. // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2007 — №2 — С. 65 — 73.

129. Erlich et al., Recent advances in the PCR. Science, 1991

130. Di Donato et al. A method for synthesizing denes and cDNAs by the PCR. Anal. Biochem. -1993

131. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1964. — Vol. 121. — P. 321-349.

132. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1979. — Vol. 76. — P. 4350-4354.

133. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.Nature. 1975 Dec 18;258(5536):598-9. No abstract available. РМЮ: 1678 PubMed indexed for MEDLINE.

134. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантаев Б.Б., Гаврилова E.M., Теория и практика иммуноферметного анализа. 1991

135. Albrechtsen М, Bock, Quantification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in human body fluids by means of ELISA employing a monoclonal anti-body.E.J NeuroiMMunol. 1985 Jun;8(4-6):301-9.

136. Petzold A, Keir G, Green AJ, Giovannoni G, Thompson EJ.J An ELISA for glial fibrillary acidic protein.lMMunol Methods. 2004 Apr;287(l-2): 169-77.

137. Weller Т.Н. и Coons A.H. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1954, V. 86, p. 787794).