Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика генетически измененных ризобактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика генетически измененных ризобактерий"

РГ6 од

ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

о п ¡НАМ 'ГШДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ / U HWn Ivw^

на правам рукописи

БМШЮВ Длитряй Петрович

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМИШНЫХ РКЗОБАКГЕРИЯ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканнэ учэной ctbiipiot кандидата Сиологичесютс наук

МИНСК - 1993

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов Института генетики и цитологии АН Беларуси

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н.А.Троицкий

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Б. В. Симаров

доктор биологических наук, профессор О.П. Коваленко Ведущее учреждение: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ¿£>ммя 1993 года в 1400 часов на заседании специализированного совета К 006.02.01 по защите дисоертаций на соискиние ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - Генетика в Институте генетики и цитологии АН Беларуси по адресу: 220734, Минск, ул. Ф. Скорины, 27

С диссертацией поено ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа

Автореферат разослан " ¿с 1ддз года

Учений секретарь специализированного оовета / л

к.О.н. __. В. В. Лобанок

Институт генетики и цитологии АН Беларуси, 1993

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Одно из направлений разработки биологических технологий в земледелии - использование ризобактерий, то есть бактерий, колонизирующих корневую систему растения и, благодаря этому, осли нэ доминирующих, то составляющих значительную часть микробного ценоза зоны корня. Ряду природных штаммов ризобактерий присуще свойство благотворно влиять на рост сельскохозяйственных культур. Мэхшгоэ-мн такого воздействия могут быть самыми разнообразными (К1о-еррег et aL., 1989), хотя наибольшие оаидания в втой области исследования связаны со способностью ризобактерий фиксировать Ng и подавлять развитие корневых { гтопатогенов.

Попытки разработать коммерчески конкурентоспособные технологии на основе ряда природных птаымов ризобактерий - фиксаторов N^ и супрессоров фитопатогенов иироко предпршш-мапись с конца семидесятых годов, однако к началу девяностых в большинстве случаев привели к некоторому разочарованию. Главная причина низкой эффективности природных отшагав ризобактерий - слишком большая зависимость механизмов их воздействия на растения от различных факторов внешней среды. Поэтому актуальной становится проблема изменения генетической регуляции проявления хозяйственно полезных признаков ризобактерий, позволяющая увеличить их экспрессию и уменьшить влияние внешних факторов. Ее реаениэ неизбежно поднимает вопрос о возможности сохранения у генетически измененных ризобактерий способности колонизировать корневую систему растений.

Цель и пяаачи исслаповпкия- Целью настоящей работы было получение штаммов ризобактерий с генетически измененными хозяйственно полезными признаками и исследование влияния этих изменений на колонизацию корневой системы.

Соответственно поставленной целя в задачи исследования входило: 1. Дерепрессия фиксации азота ризобактериями о помощью конститутивного гена nliA К.pneumoniae. 2. Подбор векторов для транспозониндуцированного мутагенеза ризобактерий. 3. Получение и характеристика мутантов рйзобактерий по азотфиксации. 4. Получение и характеристика мутантов ризобактерий с измененным синтезом сидерофоров. 5. Лаборатория

- А -

оценка колонизации корнэй ячменя генетически измененными ризобактериями. 6. Оценка изменения плотности колонизации корневой системы ячменя исходными и генетически измененными ризоОактариями в течение вегетации.

.Научная нтзизна. Впервые продемонстрирована экспрессия гена ni*А К.pneumoniae в даазотрофных ризобактериях рода Pseudomonas И получен штамм дере премированный по фиксации азота. Получена уникальная коллекция 'ГпЬ-индуцироваиных мутантов ризобактерий Paeudoraonas ар.418 по фиксации азота, а такие мутант P.fluorescena 49 конститутивно синтезирующий сидерофор. Впервые показано, что снижение жизнеспособности, вызванное генетическими изменениями хозяйственно полезных признаков ризобактерий не влечет за собой уменьшения плотности колонизации корневой системы на ранних этапах роста рао-теиий, однако приводит к более быстрому уменьшению численности генетически измененных ризе актерий в ризоплане в течение вегетации. Впервые в модельных вкслериментах продемонстрировано, что нестабильность фенотипов Niíc и Flu0 не оказывает влияния на плотность колонизации ризолланы генетически измененными ризобактериями и ее динамику в течение вегетации, а способность фиксировать Hg является определяющей для установления высокой численности ризобактерий Pseudomonas вр.418 на поверхности корнэй в поздние фазы вегетации.

Пряктичрпкяя цацнпсть. Показана возможность использования конститутивного гена nlíA ((.pneumoniae для дерепресоии азотфиксации в ризобактериях рода Pseudomonas. Результаты модельных вкспериментов позволяют прогнозировать сохранение колонизирующей способности ризобактерий при изменении хозяйственно полезных признаков.

Дпрппиция работн. Результаты работы были доложены и обсуждались на VI съезде БелОГиО (Горки, 1992) и VIII Восточно-Европейском симпозиуме по биологической фиксации азота 'Nitrogenfix 92' (Саратов, 1992).

Публикации*. По материалам диссертации опубликовано Б работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "материалы и методы", четырех глаь содержащих результаты исследования. Материал диссертации

изложен на 137 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 194 названия, из них Í8I на английском языке.

МАТЕРИМЫ И МЕТОД!

В.качестве объектов исследования Сыли взяты изолированные нами диазотрофные ризобактерии Pseudomonas sp.403, Pseudomonas sp.414 и Pseudomonas sp.418 (Баканов и др., 1991), а та'-te нэазотфиксируюций штамм Pseudomonas fluorescena 49, отличающийся высокой плотностью колонизации корней ячменя. В большинстве экспериментов использовались Rlfr мутанты этих штаммов. Для дерепрессш азотфиксацки использовали плазмиду рСК1 (получена от В.В.Зинченко), нэсущу-i конститутишый ген nlfA К. pneumoniae (Kennedy, íiobson, 1983). Be мобилизации осуществляли с помощью плазмид рЕК2013 либо pRK212.1 (Plgur-skl, Helinskl, 1979). Для получения транспозонных мутантов риэобактерий изучали возможность использования следующих векторов: pfiK2013(Tn903), рВЕЕЮ(ТпЮ) (Ely,1 1985), pJB4JI Citó) (Berlnger, 19Y9) - получены от Б.В. Симарова; pSUP1021 Citó). pSUP2021(Tn5), pSUP102Gm::Tn5-B20, pSUP102Gm::Tn5-B30 (Simon et al., 1986, 1989) - предоставлены Р.Симоном; pJPP 350(0megon-Km) (Feilay et al., 1989) - получена от Я.Фрзя; pEJl>4ü8(Omegon-Km), pEJL435(0megon-Kra-cat), pEJL449.( Oraegon-Km-lacZ) (Joeeph-Llauzun et al., 1989) - предоставлены U. Чандлором.

Скрещивания проводили на поверхности твердых агаризовшшх сред, придерживаясь отработанных нами методик (Ваганова и др., 1991; Баяанов, Троицкий, 1992).

Пи" мутанты выявляли на среде Юдага Б, Fluc - на агаре L с добавлением 4 мг/л семиводного сульфата железа (II).

Выявление мутантов риэобактерий по азотфиксации проводили в два этапа - отбор транспозантов с нарушением роста в полужидкой среде со стартовыми количествами связанного азота и послодупдая оценка восстановления ацетилена (ВА).

ВЛ оценивали по нашей методике (Баранова и др., 1991)

Идентификацию плазмидной ДНК осуществляли по методу Экхарта (Eckhardt, 1978) в модификации Скотта для горизонтального геля (Бергквист и др., 1989).

Лабораторную оценку плотности колонизации корней ячменя

- Ь -

(сорт Зазврский 6) проводили по отработанной нами (Баженов и др., 1991) модификации метода Scher et al. (1984). Предварительно оценивали сохранив колонизирующей способности о помощью репликации корней. Реизолирование риэобактерий про,водили по маркеру Rlir, сохранение фенотипа мутачтов контролировали реплицированием по соответствующему маркеру, а в случае Uli' и Nifc штаммов - по активности ВА.

Для оценки изменения плотности колонизации ризобактериями корней ячменя в течение вегетации бил заложен микрополевой експеримент на опытной станции ИГиЦ АНБ. Схема . опыта включала 7 вариантов, повторность трехкратная.

Статистическую обработку данннх проводили на компьютере по программе дисперсионного анализа или жэ по t-кригерию.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

целью характеристики активности ЗА было проведено исследование кинетики накопления этилена культурами. Активность ВА определялась как достоверный прирост количества образованного втилена' за единицу времени. Максимальная активность ВА (А^ при 28 С варьировала от 10,3 (Pseudomonas ер.403) до 30,G (Pseudomonas sp.418) нмоль С0Н4 на флакон в час, в то время как не обнаруживалось образование ¡этилена неазотфиксирующим штаммом Р.iluorescens 49.

Штаммы Pseudomonas sp.414 и Pseudomonas sp.418 восстанавливали ацетилен при температуре инкубации 13°С, при этом А^ составляла соответственно 4,8% и 22,2% от к^ этих штаммов при 28° 0. Они характеризовались и большей плотностью колонизации корневой системы ячменя (lgKOK порядка 5,6 для обоих штаммов) по сравнению с Pseudomonas sp.403 (lgKOE около 4,6), хотя при этом и уступали ризобактериям P.fluorescens 49 (lgKOK около 6,3).

Ыш__

ризаоакщзшх- Д"я введения гена пИА^ плазмиду рСК1 Мобилизовали в клетки ризоОактерий. ^пользование в качестве переносчиков плазмид рЯК2013 И рЖ212.1 Онло одинаково аффективным и позволяло получать Бтг трансконъюгангы с г, ^ зр. 414 и на клетку

рРК212.1 происходил

частотой Ilf ■ на клетку Pseudomonas Pseudomonas sp.418. Копэречос

соответственно в 87Ж и 93% случаев. Электрофоретический анализ подтвердил присутствие автономно реплицирующихся ллаэмид рСК1 и pRK212.1 в трансконъюгантах обоих реципиентов Плязмида pRK2013 при этом не обнаруживалась.

Автономная репликация рСК1 в ризобактериях подтверждалась такие спонтанной ее элиминацией, частота которой при трехкратном пассировании у трансконгюгентов штамма Pseudomonas sp '-14 достигала 15,9л, а штамма Pseudomonas ер.418 - 36,93.

Оценка ВА (проверялось по 25 - 60 колоний) показала, что все трансконъюганты штамма Pseudomonas эр.418, воспринявшие рСК1, приобретали свойство конститутивной фиксации азота. В противоположность этому, ни один из тра..сконъюгантов штамма 414 не обнаруживал дврепрессии ВА, хотя последующая мобилизация из них плазмида рС!К1 в Pseudomonas зр.418 подтвердила сохранение функциональной активности гена nifAKc).

Однако, если в среде содержащей избыток NH^Cl трансконъв-ганты востанавливали ацетилен, то при росте в безазотшй присутствие рСК1 в клетках вело к снижению накопления этилена культурами (Э) и ^ до уровня соответственно 59,4% и 49,YS от показателей бактерий дикого типа (таОл.1). Это било следствием замедления роста трансконыогантов, обусловленного скорее всего повышенной чувствительностью к поскольку их зона роста в безазотном полужидком агаре локализовалась глубже и никогда не достигала поверхности, хотя последнев было характерно для реципиента.

Таблица I

Экспрессия гена nifA Кр в ризобактериях Pseudomonas вр.418

Конц. Время э, V Нм> я

nh4ci. Штамм генерации, нмоль на нмоль на нмоль на 10°

г/л ч флакон флакон в ч клеток в ч

0 418 56,8 ± 5,1 3339 ± 538 33,6 £ 5,8 8,5 £ 2,0

418-1 137,0 ± 15,8 1983 i 281 16,7 i г, 4 14,9 ± 2,2

0,5 418 3,4 £ 0,7 0

418-1 3,6 £ 0,9 188 £ 42 4,3 £ 0,7 1,7 £ 0,3

Для корректной оценки экспрессии гена niiAK_ в Pseudomo nas sp.418 öiui произведен пересчет активности БА на еденицу биомассы. Он показал, что активность нитрогеназы (Н) трансконыоганта во время экспоненциального роста достоверно вшие, чем реципиента, а сравнение максимальных значений (Н,^) дает j ровень 175J на безазотной среде и 20% на среде с NH4CJL (таОл.1).

Нами била исследована возможность использования ряда векторов для индуцирования транспозонных мутаций в ризобакте-риях P.iluorescens 49 и Pseudomonas sp.418. Предварительно изучался перенос плазмиды RP4, поскольку большинство векторов было сконструировано с использованием ее tra генов.

Штамм P.iluorescens 49 воспринимал плазмиду RP4 с частотой 10~5 на клетку реципиента, что было на четыре порядка ншю чем при переносе в Pseudomonas sp.418, однако строой обусловленности этим частоты передачи маркеров транспозонов исследованными векторами не обнаруживалось. 100% коперенос в оба реципиента дополнительного маркера pJB4JI, позволил предположить достаточно аффективную автономную репликацию этой плазмиды в исследованных ризобактериях. Частота переноса паркеров транспозонов всеми другими векторами, за исключением p£JL435 и pEGL449, варьировала от 10~9 до Ю-6 и давала возможность получения трансловантов в количествах необходимых для обнаружения ауксотрофов .

Однако, только в случае использования векторов pSUP удалось выявить ауксорофныв мутанты P.iluorescens 49. После анализа 1500 транспозантов, полученных с помощью pSUP1021, было обнаружено 7 ауксотрофов. Таким образом, частота их выявления составила 0,5% , а характеристика показала, что сравнительно легко удалось получить довольно широкий спектр мутаций (табл.2), что подтверадает низкую специфичность встраивания ТпЬ в случае P.fluorescena 49.

Наряду с ауксотрофами были получены в независимых скрещиваниях два мутанта утративших способность синтеза флуоресцирующего пигмента - сидерофора (Flu- фенотип) и один мутант синтезирующий его конститутивно (Fluc фенотип) нз 'среде с избытком доступного железа, когда образование

сидерофора у штамма дикого типа полноотыэ подавлено .

Известно, что фенотип Fluc нонет быть вызван регуляторной мутацией (O'Sulllvan, O'Gara, 1990). В опубликованных работах нам не встречались сведения о получении таких мутантов путем их непосредственного отбора по фенотипу среди транспозантов.

Частота реверсии 'Гп5-индуцировантх мутантов P.fluoresce з 49 не превышала 10~6 (за исключением Fluc мутанта 49430), при этом ревертанты как правило утрачивали маркер Кга1" (табл.2). Это указывает на то, что реверсия обычно вызывалась вксцизией ТпБ, который как правило представлен одной копией на геном Р.Пиогезсепз 49.

Большинство TnS-нндуцированшх мутантов Р.Пиогезсепз 49 не отличались от штамма дикого типа по скороотк роста в полноценной среде. Исключение составили мутанты 49-430 (Pluc) и 49-627 (Руг-), время удвоения которых при росте в бульоне L увелилось почти в 1,6 раза.

Таблица 2

Характеристика ГпЬ-индуцированных мутантов P. fluorescens

Штамм Фенотип Частота реверсии Кш3 Km1, ревертанты/ ревертанты Время удвоения, мин.

49Kiír Дикий тип 65,1 í 3,2

49-463 Лтд" to"7 76/4 61,7 í 3,3

49-627 Руг" <10~Э 93,8 i 8,4

49-639 Ser- <10~Э 70,5 £ 6,1

49-694 Met" <10~9' 62,6 t 2,8

49-1111 Pan" 10~6 108/0 69,5 fc 4,3

49-1217 Тгр- 10"7 59/0 НО

49-1219 Met" 10~8 34/0 НО

49-430 Pluc 10"2 0 / 500 87,6 ± 6,4

49-966 Flu" но НО

49-1222 Plu" но 64,3 ± 4,4

НО - не определяли.

Для получения мутантов Pseudотэпаз вр.418 по азотфиксации использовали вектор pSUP2021. После проверки 5000 транспо-вантов было отобрано I26 штаммов с ослабленным ростом в полужидком безазотном агаре с добавлением 0,02 г/л глутдминовой кислоты. Сценка (ВА) показала его отсутствие только у четырех из них (Nlf~ фенотип), а еще у шестнадцати активность ВА была снижена (Nifd фенотип (decreased). Исследование кинетики ВА позволило выявить Б полученных в , независимых скреащваниях мутантов, имеющих пониженную й^ и не отличающихся достоверно по скорости роста в жидкой среде о добавлением ЫН401 от бактерий дикого типа (табл.З).

Все исследованные Ulf" мутанты ревертировали с частотой от 10~6 до Ю-8 (табл.З). Все проверенные ревертвнты сохраняли маркер Km17. Скорее всего, его может быть связано о наличием нескольких копий Тп5 на геном Pseudomonas sp.418, так как супрессия nif~ мутаций nj вставляется маловероятной. ,,

При переносе плазмиды рСК1 в один из мутантов, а именно в ггамм 418-271, наблюдалась частичная комплементация Nli~ фенотипа, сопровождающаяся дереиреооивй ВА в среде о NH^Cl.

Таблица Э

Характеристика Тп5-индуцированных мутантов Pseudomonas sp.418

Штамм Фенотип Частота Km® / Km r Время удвое- А^, нмоль/

реверсии ревертанты ния, мин флакон ч

418 Дикий тип 188,8 ± 24,5 37,1

418-6 Mir 10"6 0/50 НО 0

41Ö-142 иг to-8 0/50 НО 0

418-247 Nif" 10"0 0/50 НО 0

418-271 Nif" ю-0 0 / 50 НО 0

418-15 Nlid HO 179,5 ± 28,8 20,3.

418-41 Nlfd но 203,8 ± 31,2 26,5

4)8-218 Hifd HD 220,4 ± 47,0 6,2

418-242 Ulf11 HO 184,9 ± 36,1 14,5

418-327 Hiid HO 186,2 ± 34,7 20,0

ДОР (Р<0,05) для Ац составила 2,6. НО - не определяли.

Ни один из полученных в этой работе Uli- мутантов не нуждался в добавлении глутамина для нормального роста на минимальной среде и не утратил способности использовать аргинин, гистидин и пролин в качестве вдинстрэного источника азота. Таким образом, мутация в штамме 418-271 не затрагивает ntr-подобнш reim и скорее всего обусловлена нарушением синтеза продукта резидентного niiA гена.

вации корневой системы ячменя генетически измененными ризо-Оактериями проводились лабораторные вксперименты. Предварительною оценку проводили методом репликации корней. Удовлетворительные отпечатки были получены для всех генетически измененных ризобакторий, однако наиболее наглядными результаты были при репликации Fluc мутанта 49-430. На сео.-жтивном к аре с избытком ie(II) отпечатки корней растений, выросших из семян инокулированшх бактериями этого штамма, флуоресцировали при ультрафиолетовом Освещении, чего никогда'не наблюдалось при инокуляции штаммом о нормальным синтезом пигмента (рис. 1).

На правом втапе для оценки колони-

Рис.1. Отпечатки корней девятидневных растения ячменя на селективном агар» о добавлением сульфата железа. Семена циркулировала бактериями Р. Ипогезсепз 49 (слева) и его Р1ис мутантом 49^430 (справа).

Ксличественная оценка обнаружила у ряда мутантов тенденции к снижению численности формируемо* на корнях популяции по сгзвнен'-т со штаммом дикого типа (табл.4) .

- <2 -

Синтез сидерофора моаег оказывать влияние на плотность формируемой , ннтродуцмрупмцм штампом популяции через взаиыодейотвие о другими сартериями (ВаКкег, 1989), однако полное сохранение колонизн! ующей опособнооти Plu" мутантами ( таОя.4} укааива^г, что sio взаимодействие ло-видимому m имеет Сольного значения «а ранних этапах колонизации.

Что касаэтся муг&нтов азотфиксируюадх риэоОактерий, то Nif фенотип сем ко -себе ыэ оказывал какого-либо влияния на

Таблица 4

Колонизация корней яшэня Тп5-Ш1дуцировашими мутантами и сохранение феноадта

■Штамм Фенотип LgM Сохранение фенотипа *

i 49 ДИКИЙ ИИ 6,43

49-463 ЛИВ" 5,15 108 / 108

49-627 5,12 108 / 108

49-639 5ег~ 1 5,05 108 / 108

49-694 ' Met" ' 5,28 108 / 108

49-1111 i Pan- 1 5,77 108 / 108

49-1217 ' Ггр~ ■6« 46 108 / 108

49-1219 ' Ket~ : •6.41 I 108 / 108

49-430 . -PIUc ; <6,01 ! 552 / 545

.49-966 j Plu" ! '6,34 ; 1775 / 1775

49-1222 I Им" .. ! •6,56 ! 965 / 965

418 ! Дикий тип j •5,55 j

.18-6 ! tf~ I 4,40 j 15 / 15

418-142 j Nii~ ■; 5,65 ' j 15 / 15

418-247 i iNli" j 5,25 ! 15 / 15'

418-271 I " Wli" I '5,17 i да

4I8-1 , Nii* ! 1 5., 40 ¡ 25 / 25 »«

N - титр клеток на 1 г сырых корней, ИСР <Р < 0,05) для 1йМ составила 0,43. НО - не определяли. » Числитель - всего проверено колоний, энаменитель - количество колоний с ооотвототвушим фенотипом. »* Исследовались Бгаг колонии.

плотность колонизации корней. Из четырех не фикснрукщих азот мутантов лишь у одного (418-6) этот показатель Сил приблизительно на порядок ниже, чем у штамма дикого типа. Не било обнаружено достоверных разлтий по плотности колонизации между исходным безллазмидным штаммом и несущим р(ЗК1 трансконъюгантом Pseudomonas ар. 418—1.

Как и ожидалось, ревертанты среди реизолированннх из ри-золланы бактерий выявлялись лишь у штамма 49-430, что может бнть объяснено их наличием в суспензии для инокуляции из-за очень высокой частоты реверсии Flu0 мутанта к дикому типу. В случае Pseudomonas sp.418-1 маркер Snf ллазмиды рСК1 сохраняла 9456 реизолированннх бактерий, при отом все Stif рэизолянтн обнаруживали дерепрессию В4 (табл.4).

Для выяснения закономерностей поведения генетически измененных ризобактерий в естественных условиях нами был ,грово-де1 микрополевой опыт. Исследовались штаммы P.f1иогезсепз 49-430 (Fluc), 49-1222 (Plu"), Pseudomonas sp.418-1 (Nlfc), 418-142 (Nif"), а тшске соответствующие исходыю • штаммы дикого типа.

Первое определение численности бактерий Р. Пиогезсепз 49, 49-430 и 49-1222 бнло произведено на пятый день после появления всходов. Как и при лабораторной сценке мутанты по плотности колонизации риэопланн не отличались достоверно от штамма дикого типа (рис.2), однако численность бактерий Fluc (lgKOK = 6,48) была достоверно ниже численности Plu" бактерий ( lgKOE = 6,85). Численность же резидентных бактерий находилась на уровне lgKOE = 7,37, так что внесенные штаммы составляли несколько больше 10Ж общей популяции. Как випсни-Л01о в дальнейшем, ето значение оказалось для P.iluorescens 49 и его мутантов самым высоким за весь период вегетации.

Второе определение (возраст растений - 19 дней) показало некоторый рост численности в ризоплане бактерий Plu- и дикого типа. В то ко самое время плотность популяции Fluc мутанта значительно снизилась, в результате его численность в ризоплане била почти на порядок нияэ чем бактерий дикого типа и Plu" мутанта. Достигнутые в этот период абсолютные значения плотности колонизации риэопланн ячменя ризобактериями Р. Пиогезсепз 49 и Plu" мутчнтом 49-1222 были максимальны-

Рис.2. Изменение численности ризобактерий в ризоплане ячменя в течение вегетации. Штаммы:—о— P. fluorescein 49 (дикий тип)г—О— 49-430 (Flu0), —В— 49-1222 (Plu-); —О— резидентные бактерии.

ми за всю вегетацию и при дальнейших высевах обнаруживалось постепенное их уменьшение, хотя плотность резидентной популяции стабилизировалась на уровне lgKOË порядка 8,0 (рис.2).

Уменьшение популяции ризобактерий Fluc (мутант 49-430) происходило гораздо более интенсивно, чем бактерий дикого типа или же Plu" мутанта. В результате этого на протяжении почти всей вегетации растений численность Fluc бактерий в ризоплане на порядок, а в отдельные периода - почти на два порядка, была меньше численности бактерий дикого типа (рис. 2). При последнем высеве (75 дней после появления всходов) она лишь ненамного превышала порог определения.

Реверсия Flu0 бактерий к дикому типу не являлась основной причиной их вытеснения из ризопланн. Выявляемые ревартанты составляли не более от численности интродуцированного штямма, при втом не обнаруживалось четкой тенденции к уполичонип втого показателя в течение вегетации.

Кик и при исследовании флуоресцирующих ризобактерий, пер-шй Hiioen иг плримнтон, обрпбо'гшших риробактнриями Pseudo-

ис.О. Изменение численности ризобактерий в ризоплане ячменя в течение вегетации. Штаммы: —О— Pseudomonas вр.418 (дикий тип),—О— 418-142 (N11"), —□— 418-1 (Wlic);—Ö— резидентные бактерики.

топаз эр.41В, 418-1 (Nif0) или 418-142 (Nif) показал отсутствие достоверных отличий в плотности колонизации этими штаммами корней растений ячменя, достигших возраста 11 дней после появления всходов (рис.3). Следует отметить, что абсолютные ее значения в поле были почти на порядок выше наблюдавшихся при лабораторной оценке и составляли, немногим более 10% от численности резидентных аэробных бактерий.

При втором высеве в возрасте 25 дней обнаружилось уменьшение плотности популяции всех трех штаммов в ризопланэ, несмотря на наблюдавшийся в это время рост численности резидентных микроорганизмов (рис.3). Уменьшение популяции ганетически изменениях Опктвр55й происходило Снстрээ, чем штамма дикого типе, что привело к раянице по плотности '."олонивдции почти на порядок.

Начиная с 39-го дня рпгэгяшя наблюдалось увеличение числен, эсти, а внеев в возрасте 53 дая дал наиСольяее абсолютное эначетю плотности популяции, форм!груемой ризобакте-риями Pseudomonas зр.4П (lgKOB порядка 6,8). Дальнейшие

определения в возрасте 67 м 81 дней обнаружили постепенное снижение их численности в гизоплана.

В отличив от Nif+ бактерий, численность популяции мутанта 418-142 в период о" 25 до 67 дней после появления всходов стабилизировалась «а уровне lgKOE 5,6 - 5,8, а численность штамма 418-1 (Nlfc) продолжала уменьшаться. L тот момент, когда плотность популяции Paeudomonaa sp.418 достигла наивысших абсолютных значений и находилась на уровне 10% от. численности резидентных бактерий, количество клеток штамма 418-142 составляло около 1Ж, а штамма 418-1 -менее 0,1Я резидентной бактериальной популяции.

Как и в случав Fluc мутанта 49-430, реверсия Nlfc бактерий Pseudomonas ар.418-1 к дикому типу за счет элиминации плазмиды рСК1 ш оказывала заметного влияния на численность лолуль_ли, формируемой втим штаммом в ризопланв. В течение всего периода вегетации сохранялось практически постоянное (приблизительно 10:1) соотношение между бактериями несущими плазмиду рСК1 и утратившими ее.

вывода

1. Конотитутивный ген nlfA К.pneumoniae дерепрессирует фиксацию азота ризооактериями Faeudoraonaa ер.418 при избытке в среда связанного азота.

2. Получены Тп5-иидуцировашше мутанты диазотрофных ризобактерий Pseudomonas ар.418, дефектные по фиксации азота - утратившие способность расти в среде Оез азота и восстанавливать ацетилен (Nif~), либо со сниженной активностью восстановления ацетилена (Nifd). Частичная комплементация Nlf~ фенотипа мутанта Pseudomonas ар.418-271 конститутивным геном niiA К.pneumoniae позволяет связать мутацию в втом итамме с нарушением позитивной регуляции транскрипции nlf опэронов.

3. Получены Тп5-индуцированше мутанты риэобактерий P. iluoreacena ,49 по синтезу оидерофора - утратившие способность его образования JPlu" мутанты и синтезирующий сидефор конститутивно Fluc мутант.

4. Генетические изменения потенциально полезных е практичиеком отношении признаков (фиксация азота и синтез сидерофора) нэ Приводят к уменьшению плотности колонизация

- 17 -.

риэобактериями корневой сиотемн ячменя на ранних стадиях роста растений, даже если эти изменения сопровождаются снижением жизнеспособности ризоОактерий. Вызванное генетическими изменениями снижение яздэнеспособности ризоОактерий проявляется на поздних отадиях вегетации растения, приводя к более быстрому, по сравнению с бактериями дажого типа, уменьшению численнооти генетически измэнненных ризобактерий в ризоллане.

5. Нестабильность генетически измененных ризоОактерий (реверсия Flu0 мутанта P.fluorescena 49-430 к дикому типу и элиминация плазмиды рСК1 из Pseudomoras ар.418-1) не является преилтствием для колонизации корневой система ячменя и не оказывает заметного влияния нэ динамику численности генетически изменненных ризоОактерий в течение вегетащш.

6. Способность фиксировать азот является определяющий для формирования высокой численности популяции дназотрсфтх ризобактерий Paeudomonas ар.418 в ризоллане ячменя и фаза вчхода в трубку - молочной спелости, to эсть в период наибольшей активности ассоциативных аоогфнкойрущих бактеркЯ.

По материалам диссертации опубликована следующие работы:

1. Бананом А. Л., Бшзанов Д. П,, Троицкий Н. Л. Перенос и экспрессия nifA гена Klebsiella pneumoniae в гибридном штамме Azotobacter chroococcum ЯХТ41// ДокЛ.АН БССР.- 1991.-Т.35, йй.- С.176-178.

2. Баканов Д.П., Рудова В.В., ТройцКйй Н.А. Ввделетга и характеристика аэробных азотфййсйрумцих бактерий то риэопланц дикорастущих и кульТурйИх оДИоДояывп растений// Изв.АН БССР.- Сер.Сиол.наук.- 1991»- >».- 0.8-12. .

Вйяанов Д.II., Рудова 15.В. > Троицкий Н.А. Исследование генетической детерминации колон'Лэйр'/Щэй способности ризобактерий// VI съезд БелОГИС. Тез. Докл.- Горки, 1992.- С.99.

4. Бяжанов Д.П., Троицкий Н.А. экспрессия гена nifA Klebsiella pneumoniae в дйёзотофМй ризобактериях// Генетика.- 1992.- Т.28, ЛЮ.- С.40-4?.

5. Bazhanov D.P., Rudova E.V., 'ttoitekl Н. Derepression of nlt.Tgen fixation in rhizobattli-la Paeudomonas ep. strain 418// VIIIth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen

Fixation 'Nitrogenfix 9?*. Abstracts.- Saratov, 1992.- P.36.

-й