Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение генетически маркированных растений в семействе Solanaceae и их использование в соматической гибридизации.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение генетически маркированных растений в семействе Solanaceae и их использование в соматической гибридизации."

2 А ['-.Н? ^'Й^ЦІОІІАЛЬІІА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукопису УДК 575.224.46.044 + 577.21 + 575.127

РУДАС Володимир Аіщрійовпч

ОТРИМАННЯ ГЕНЕТИЧНО МАРКОВАНИХ РОСЛИН В РОДИШ БОЬ^АСЕАЕ'ІК ЇХ ВИКОРИСТАННЯ В СОМАТИЧНІЙ ГІБРИДИЗАЦІЇ

03.00.15 - Генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1997

Робота виконана у лабораторії цитотехнологій відділу клітинної селекції Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України.

Науковий керівник - академік НАН України, професор

ГЛЕБА Юрій Юрійович

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор

КУНАХ Віктор Анатолійович

кандидат біологічних наук КОСТЕНЮК Ігор Олексійович

Провідна організація - Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, Київ

Захист відбудеться " 7- " квітня 1997 р. о год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.19.01. в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 252143, м. Київ, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Автореферат розіслано " ” березня 1997 р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради І /

кандидат біологічних наук _/\ Л. В. Малишева

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність проблеми. Культурний томат Lycopersicon

esculentum Mill. і баклажан Solanum melongena L. є важливими сільськогосподарськими овочевими культурами. З кожним роком в світі збільшується їх виробництво і зростають вимоги до сортів та гібридів. Але часто ці вимоги неможливо задовільнити в зв'язку з відсутністю необхідних генів в геномі культурного томата і

баклажана, а також їх близьких родичів, з якими можливе схрещування. Природні бар'єри несумісності успішно долаються за допомогою методів культури клітин in vitro, зокрема за допомогою соматичної гібридизації. Велика кількість робіт по соматичній гібридизації (більше 400), виконаних головним чином на видах родів Nicotiana, Brassica, Solanum і Lycopersicon свідчать про можливість створення нових форм рослин, які є цінним вихідним матеріалом для селекційно-генетичної роботи. Разом з тим, в паш час роботи по соматичній гібридизації за участю томата і баклажана обмежуються отриманням гібридних форм лише з кількома дикими родичами. Це пояснюється в першу чергу нестачею спеціальних генетично

маркованих ліній у культурного томата і баклажана, і, практично

повною їх відсутністю у диких видів Lycopersicon і Solanum.

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було одержати шляхом експериментального мутагенезу та генетичної трансформації генетично марковані рослини в родині Solanaceae і створити на їх основі соматичні гібриди культурного томата і баклажана з використанням простих, зручних та ефективних схем селекції.

Згідно із поставленою метою в завдання експериментальної роботи входило:

1. Отримати хлорофілдефектні мутанти культурного томата і баклажана та довести їх цитоплазматичну природу.

2. Шляхом культивування листкових дисків з Agrobacterium tumefaciens одержати стійкі до канаміцину і гігроміцину рослини деяких диких видів родини Solanaceae та довести їх трансгеину природу.

3. Отримати соматичні гібриди культурного томата і баклажана з використанням генетично маркованих рослин.

4. Оцінити генетичну конституцію соматичних гібридів.

Наукова новизна.

Отримані пластомні хлорофілдефектні мутанти 6 видів родини Solanaceae, в тому числі культурного томата і баклажана.

Створена колекція трансгешіих стійких до канаміцину і/або гігроміцину рослин диких видів родини Solanaceae.

Отримані канаміцин- або гігроміцин стійкі пластомні хлорофіл-дефектпі мутанти А видів родини Solanaceae, які є універсальними партнерами для соматичної гібридизації.

Розроблені ефективні схеми селекції асиметричних соматичних гібридів, які базуються на використанні як реципієнтів пластомних хлорофілдефектних мутантів культурного томата і баклажана, а як донорів - трансгешшх форм диких видів Lycopersicon, Solanum і Lycium, інактивованих летальними дозами -/-опромінення.

Розроблена схема селекції асиметричних соматичних гібридів, яка дозволяє здійснювати перенос від донора до реципієнта тільки ядерного геному і уникати переносу лдастому.

Продемонстрована можливість використання трансгенних рослин з двома селективними генами як донорів при асиметричній соматичній гібридизації.

Отримані соматичні гібриди L. esculentum + L. peruvianum var. humifusum, S. melongena + S. rickii і L. peruvianum var. dentatum + L. hirsutum var. glabratum.

Практична цінність.

1. Отримані хлорофілдефектні мутанти культурного томата та баклажана є цінним матеріалом для подальших клітинно-інженерних експериментів.

2. Отримані трансгеїші рослини диких видів родини Solanaceae, які можна використати як донори при асиметричній соматичній гібридизації з культурним томатом і баклажаном.

3. Разроблені схеми селекції дозволяють ефективно отримувати соматичні гібриди різноманітної генетичної конституції.

Основні положення, шо вшгосяться на захист:

- методи хімічного мутагенезу та генетичної трансформації дозволяють ефективно створювати вихідний генетично маркований матеріал для соматичної гібридизації;

- запропоновані ефективні схеми селекції соматичних гібридів культурного томата і баклажана, які базуються на використанні, з одного боку, мезофільних протопластів пластомних хлорофіл-дефектних мутантів L. esculentum і S. melongena, а з іншого,

з

мезофільних протопласті п трансгешшх рослин родини Solanaceae, інактивованих детальними дозами у-опромінешш;

- запропонована схема селекції асиметричних соматичних гамма-гібридів, яка дозволяє уникнути переносу пластому від донора до реципієнта;

- з застосуванням розроблених схем селекції отримані:

а) асиметричні соматичні гібриди: L. esculentum + L. peruvianum var. dentatum, L. esculentum + L. peruvianum var. humifusum, L. esculentum + L. pennellii, L. esculentum + S. rickii, L. esculentum + S. nigrum, L. peruvianum var. dentatum + L. hirsutum var. glabratum;

б) симетричні гібриди: L. esculentum + S. nigrum, S. melongena + S. nigrum і S. melongena + S. rickii.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на II Всесоюзному з’їзді товариства фізіологів рослин (Мінськ, СРСР, 1990), VIII Міжнародному симпозіумі по протопластам (Упсала, Швеція, 1991), конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослии і генетики" (Київ, Україна, 1992), II з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, Україна, 1993), XV Міжнародному ботанічному конгресі (Йокогама, Японія, 1993), VIII Міжнародному конгресі по тканинам та культурі клітнп рослин (Флоренція, Італія, 1994), а також на наукових семінарах відділів клітинної селекції та цитофі.чіології і клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАІі України. .

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, список яких наведено в кінці автореферату.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліжень та їх обговорення, заключної частини, висновків та списку літератури, іцо містить 393 бібліографічних посилапь. Робота викладена на 241 сторінці машинопису і містить 23 таблиці та 48 рисунків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ.

Рослинний матеріал.

1. Культурний томат Lycopersicon esculentum Mill. ліній No 13, 37, 604, 1051, 1286 та сортів Богданівський і Український тепличний.

2. Хлорофілдефектні мутанти L. esculentum Mill.: пластомнин

Pl-alb 1 та ядерний "gilva".

3. Баклажан Solanum melongena L. сортів Скороспілий, Боиіка і Дністровець.

4. Дикі види S. mammosum L., S. rickii Corr., S. lycopersicoid.es Dun., S. gilo Raddti, S. sisymbr і folium Lam. і 5. aculeatissimum Jacg.

5. Дикі види томатів L. peruvianum var dentatum Dun. (лінії 3767 і 3772A L. peruvianum humifusum C.H.Mull., L. peruvianum Mill., L. pennellii Corr. i L. hirsutum var. glabratum Humb. et Bonpl.

6. Повій звичайний Lycium barbarum L. та трансгєнні рослини цього виду, стійкі до гігроміцину.

7. Паслін чорний Solanum nigrum L.

Штамп Agrob&ctermm tumefaeiens.

t. CR58CIRif, які несуть плазміди pG21 або pGll (Дейнеко и др., 1991) з генами неоміцинфосфогрансферази (npt-II) і ß-інтерферону людини.

2. pGS 1166, що несе нлазміду pGV2260 з геном гігроміцин-фосфотрансферази QipÚ.

3. pGV 3850:/рАР 2034.35S.tl несе нлазміду pGV 3850 з npt-ll і геном 6-еіїдотоксину Bacillus thuringensis (Евстратова, 1992).

4. pCV 631 mp90, який створений на основі вектору pCV 002 (Koncz & Schell, 1986) і містить плазміди pGV 631 з hpt та рМР90 (похідна від pGV 2201) з гл'г-районом.

Для індукції хлорофілдефектиих мутантів насіння обробляли різними концентраціями М-нітрозо-ЬГ-метилсеадвшш (НМС) протягом 16 год. при кімнатній температурі, промивали і стерилізували. Хлорофілдефектні мутанти отримували живцюванням строкатих рослин або шляхом регенерації з хлорофілдефектиих ділянок листків.

Граисгешіі рослини отримували за методикою Horsch et al. (1985), модифікованою стосовно умов експериментів.

Аналіз активності неоміцинфосфогрансферази (NPT-II) проводили згідно з Schreier et al. (1985) та з використанням комерційного NPTII ELISA КІТ (5-Prime-3-Prime Inc., США).

Для виявлення 72pí-II методом ПЛР використовували праймери NPTII-F (5'-ТGGAGAGGCTATTCGGCTATGАС-3’) і NPTII-R (5-AACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3') (International Biotechnologies Inc., США).

Експресію гена ß-інтерферону людини виявляли методом вестерн-блоттингу.

Протопласти виділяли із асептично вирощуваних рослин згідно

з методиками Сидорова и др. (1985). Опромінення протопластів донора проводили на установці "Дослідник" (60Со, 9 рад/сек). Злиття протопластів проводили згідно з Menczel et al., (1981). Культивування протопластів та регенерацію рослин проводили згідно

з Shahin (1985) і Sihachakr ct al. (1988). Відбір гібридних колоній проводили по здатності рости на середовищі з антибіотиками та по зеленому забарвленню.

Рестриктний аналіз хлоропластної ДНК, аналіз множинних молекулярних форм ферментів (ММФФ) та патогенетичним аналіз проводили згідно з методиками, які застосовуються в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії. (Биохимический анализ в клеточной биологии растений. - 1988. - Препринт/ АН УССР, Институт ботаники; 88.1). Для RAPD-аналізу соматичних гібридів використовували праймер ОРА-09 (-GGG-TAA-CGC-C) (Operon, США).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

1. Отримання та аналіз хлорофілдефектшех мутантів.

Насіння L. esculcntum обробляли різними концетраціями НМС (5, 10, 20 і ЗО мМ). Більші концентрації не застосовували, тому що при ЗО мМ НМС спостерігали різке зниження схожості насіння - 36 ± 3,4%. Найбільший вихід хлорофілдефектних мутантів (8,08 ± 1,26%) спостерігали після обробки насіння L. esculentum розчином 20 мМ НМС (Рис. 1; Табл. і). При концентрації НМС 5 і 10 мМ вихід мутантів був незначним, а гри ЗО мМ спостерігалось зменшення мутацій по відношенню до загальної кількості обробленого насіння (6,56 ± 1,76%), хоча по відношенню до насіння, яке зійшло, кількість мутацій продовжувала збільшуватися (18,50 + 4,63%) (Рис. *>. .

Рослини з строкатим стеблом розхимерювали живцюванням. Всього було відібрано і розмножено по одному мутанту типу альбіна на лініях 1051, 1286, 604, 37 і сорті Богданівський, та по дна - на лінії 13 і сорті Україський тепличний (Рис. 2 А).

Після обробки насіння баклажана розчином 10 мМ НМС приблизно 2/3 проростків були строкатими. Шляхом живцювання отримані росліши-альбіноси всіх 3 сортів S. melongena, а також стійкої до канаміцину трансгенної рослини сорту Дністровсць (Рис. 2 Б). Також були отримані хлорофілдефеїстні мутанти 4 диких видів

родини пасльонових (Табл. 1).

Із результатів наших дослідів можна зробити висновок, що представники роду Solanum більш чутливі до дії НМС, ніж роду Lycopersicon. Так, після обробки насіння S-. тєіопдепа розчином 10 мМ НМС вихід хлорофілдефекгних мутантів становив 51,60 ± 6,32%, в той час як у L. csculentum - тільки 1,33 ± 0,59% (Табл. 1). Приблизно такі ж відміни існують і між дикими видами родів Solanum і Lycopersicon (Табл. 1). Найбільше вражає надзвичайно високий процент появи пігментдефектних мутантів S. nigrum 684,80 ± 4,69%). Результати наших дослідів свідчать на користь припущення Arntzcn and Duesing (1984) про існування у S. nigrum ядерного гена-мутагора пластид подібного до такого в Oenothera.

Поява строкатих рослин і характер дії застосованого мутагену свідчили про цитоплазматичну природу отриманих хрофілдефектних мутантів. Цей висновок підтвердив і тест на соматичне розщеплення. Експланти строкатих листків на регенераційному середовищі утворювали білі, зелені, і строкаті пагони, що є наслідком сегрегації нормальних і мутантних пластид при поділі клітин.

Оскільки отримані хлорофілдефектні мутанти не росли в грунті, то неможливо було провести класичний гібридологічний аналіз. Тому для їх аналізу був застосований комплементаційний аналіз, який базується на злитті протопластів (Sidorov & Maliga, 1982; Aviv & Galun, 1985; Сидоров и др., 1987). Протопласти деяких отриманих хлорофілдефектпих рослин зливали з протопластами хлорофіл-дефектних мутантів L. esculertum, природа яких була відома, а саме Pl-alb 1 (пластомна мутація) та "gilva" (ядерна мутація), опромінених у-променями (1000 Гр) (Табл. 2). Після злиття протопластів отриманих мутантів з протопластами мутанта Pl-alb 1 спостерігали на регенераційному середовищі появу лише білих колоній, що свідчило про відсутність комплементації. В той же час після злиття протопластів отриманих мутантів з протопластами мутанта "gilva" спостерігали появу зелених колоній, які могли виникнути внаслідок заміни дефектних пластид отриманих хлорофілдефектпих мутантів хлоропластами дикого типу ядерного хлорофілдефектного мутанта "gilva". Це свідчить про цитоплазматичну пророду отриманих мутантів.

Таким чином, в результаті дослідів створена колекція пластомних хлорофілдефектпих мутантів, які є ідеальними реципієнтами чужинної цитоплазми при соматичній "гамма-гібридизації".

Таблиця 1. Результати обробки насіння різних видів Боїопасеае М-нітрозо-М-мсгилсечовиною (НМС) протягом 16 годин.

Концепт Кількість

Вид рація НМС, мМ оброб- лених насі- нин насі- нин, що зійшли рослин із строкатим листям Вихід мутантів, %

Lycopcrsicon 5 350 311 2 0,57±О,8О

esculentum 10 1500 1276 20 1.33±0,59

20 1868 1317 150 8,08±1,26

30 792 281 52 6,56±1,76

Solarium melongena 10 250 166 129 51,60±6,32

L. peruvianum var. dentatum 20 100 47 5 5,00+4,37

L. hirsutum var. glabratum 20 ¡00 25 7 7,00±5,05

S. nigrum 5 230 206 195 84,80±4,69

Lycium barbarum 10 50 5 4 8,00±6,7 7

Таблиця 2. Результати комплементаційного аналізу хлорофілдефсктних мутантів.

Вид, мутант Pl-alb 1 "gilva"

Lycopcrsicon esculentum (604 аІЬіла-1)

L. esculentum (13 alb-6) - +

Solanum melongena (Дністровець alb-1) _ +

S. nigrum alb-1 - 4-

Lycium barbarum alb-1 - +

L. peruvianum var. dentatum (3767) alb-5 _ +

Примітка: - наявність комплементації, - відсутність

комплементації.

Концентрація НМС, мМ

Рис. 1. Частота появи хлорофілдефектних мутантів Ьусорепісоп escu.len.tum після обробки насіння розчином НМС: 1 - частота появи хлорофілдефектних мутантів по відношенню до кількості оброблених насіннн; 2 - частота появи хлорофілдефектних мутантів по відношенню до кількості насінин, що зійшли.

Рис. 2. Хлорофілдефектні мутанти albina 1 Lycopersicon esculentum лінії 604 (А) та albina 1 Solanum melongena сорту Дністровець (Б).

2. Отримання трансгеїпшх рослин Lycopersicon, Solanum і Lycium методом культивування листкових дисків з Agrobacterium tumefaciens.

Для багатьох видів був характерний надзвичайно високий коефіцієнт трансформації (відношення кількості експлантів, на яких утворювались стійкі калуси, до загального числа експлантатів, оброблених A. tumefaciens, помножене на 100). Для L. peruviamim var. dentatum (лінії 3767 і 3772), S. rickii, S. nigrum, S. lycopersicoides i S. aculeatissimum він складав 70-90%, а іноді навіть 100%. Для інших видів і форм коефіцієнт трансформації був набагато нижчий (1-10%). У S. sisymbrіfolium і і-, діїо отримано лише по одній траіісгешпії рослині. Для генетичної трансформації більшості видів використовували середовище, що містило солі MC (Murashige & Skoog, 1962), вітаміни В5 (Gamborg et al., 1968), 2,5 мг/л БАП, 0,2 мг/л ЮК, 20 г/л сахарози і 7 г/л агару. Оскільки не існувало протоколів регенерації рослин L. bartíarum і S. mammosum, були пронедені досліди з метою вивчення регенераційних потенціалів цих видів. Встановлено, що для отримання регенерантів із протопластів L. barbarum оптимальними е середовища Шахіпа (Shahin, 1985), а для регенерації рослин із листкових сегментів цього виду - MC з 1 мг/л БАП та 0,1 мг/л НОК. Для регенерації рослин із листкових сегментів S. mammosum оптимальним виявилося середовище MC з 3 мг/л БАП і 0,3 мг/л ЮК. Використання цих середовищ дозволило отримати канаміцинстійкі рослини L. barbarum та .S’, mammosum. Рослини, стійкі до двох антибіотиків, отримували шляхом повторної трансформації.

При вирощуванні в теплиці деякі рослини-трансформанти утворювали насіння. У канаміцинстінкої рослини клону № 1 L. peruvianum var. dentatum лінії 3767 було вивчене успадкування ознаки резистентності. Насіння, отримане після схрещування трансгенної лінії з вихідною дикого типу, висадили на середовище MC з 100 мг/л канаміцину. Із 132 насінин, що зійшли, 69 були чутливими і 63 - стійкими до канаміцину. Це відповідає розщепленню 1:1, оскільки відміни між фактичними (69:63) і теоретично очікуваними (66:66) результатами були несуттєві (х^факт^'/І^Ол)-Отримані результати вказують, що Т-ДНК у трансгенної лінії була

інтегрована в одній хромосомі і що ознака канаміцинстійкості успадковується як домінантна алель.

У канаміцинстійких рослин визначали активність NPT-II. Результати аналізів підтвердили наявність у тканинах всіх проаналізованих рослин білкового продукту npt-11 (Рис. 3).

Після ампліфікації ДНК in vitro методом ПЛР і електрофорезу в агарозному гелі в трансформованих рослинах L. peruvianum var. dentatum та L. pennellii був виявлений фрагмент біля 742 пар нуклеотидів, відповідний ампліфікації ДНК npt- II. Ця смуга відсутня в нетрансфориоваїшх рослинах. Трансгеині рослини L. peruvianum var. dentatum використовували для визначення білкового продукту npt-II методом ELISA. Трансгенні рослішії містили до 2524.4 гіг NPT-11/мг сумарного білка, в той час як у нетрансформованої рослнни реакції з антитілами не виявлено.

Більшість генетичних конструкцій, які були використані в даному дослідженні, крім селективних npt-ll і hpt генів, містили гени, іцо кодують цінні господарські ознаки. При соматичній "гамма-гібриднзації" ці гени можуть бути перенесені з геному донора в геном реципієнта. Штам pGV 3850:/рАР 2034.35S.tl, крім npt-ll, несе ген 6-ендотоксипу Bacillus thuringiensis. Цей ген здатний надавати трапегешшм рослинам стійкість до комах. Дослідження експресії гена 5-єндотоксішу у трансгенних рослинах не проводилося, так як автори конструкції повідомили, що експресія цього гена в отриманих ними рослинах тютюну була надзвичайно низькою і конструкція потребує вдосконалення (Евстратова, 1992). Штами pGlí і pG21, крім npt-ll, несуть гени ß-інтерферону людини. При експресії цих генів у транстеншіх рослин спостерігалось уповільнення розвитку вірусної інфекції (Ривкин и др., 1992). У трансгенних і нетрансгенних рослинах перуанського томата визначали експресію гена ß-інтерферону людини. В трансгених рослинах виявлена експресія hIFN-ß гена.

Таким чином, одержані трансгеині рослини у 10 диких видів Solanaceae, які є донорами цінних ознак для культурного томата і баклажана (Табл. 3). Для деяких видів отримані рослини, стійкі не лише до канаміцину, а й до гігроміцину чи до обох антибіотиків одночасно. Трансгенні рослини L. peruvianum var. dentatum, L. peruvianum var. humifsum, S. gilo, S. sisymbrifolium, S. aculeatatissimum і 5. mammosum отримані вперше.

Таблиця 3. Види і форми трансгенних рослин, стійких до антибіотиків.

№ Вид, форма Kmr Hmr Нші'+Ктг

1. Lycopersicon pennellii ♦

2. L peruvianum var. dentatum (3767) ♦ V + ♦

3. L peruvianum var. dentatum (3772) ♦ V V + ♦

4. L. peruvianum var. dentatum (3767) albina X

5 L. peruvianum Mill. *

6. L. peruvianum var. humifusum X

7. Solanum aculeatissimum X H v + x

8. S. gilo

9. S. mammosum X

10. S. melongena X;*

11. S. lycopersicoides 4 V V +- *

12. S. rickii ♦ V V +■ X

13. S. nigruvi ♦ V V 4- X

14. S. nigrum albina -♦ V v + x

15. S. sisymbrifolium X

16. Lycium barbarum *

17. L. barbarum albina *

Примітка: * - pGV 3850:/pAP2034.35S.tl; ♦ - pGll;

X - pG21; V - pGS 1166; H - pGV 631 mp 90.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 3. Визначення NPT-II активності у трансгенних рослин Lycopersicon: L. peruvianum var. humifusum - негагивиий контроль (1) і Kmr клони № 1 і № 2 (2 і 3, відповідно); L. peruvianum Ктг клон № 1 (4); L. реппеїііі - негативний контроль (5) і Ктг клони №

1, No 2, № 10 і № 3 (6, 7, 8 і 9, відповідно); бактеріальна культура Agrobacterium tumefaciens рМВ 90[HIN] - позитивний контроль (10).

3. Соматична гібридизація з використанням отриманих мутантних і трансгенних форм рослин.

3.1. Можливі схеми селекції соматичних гібридів.

В результаті експериментів по мутагенезу та генетичній трансформації створено унікальну колекцію генетично маркованих рослин, яку можна розділити на 3 групи: і) пластомні хлорофіл-дефектні мутанти (6 видів); 2) стійкі до канаміцину чи гігроміцину та до обох антибіотиків трансгеині рослини (10 видів); 3) хлорофілдефектні мутанти, стійкі до антибіотиків, або так звані "універсальні гібридизатори'' (4 види). З використанням цієї колекції теоретично можливо апробувати 10 схем селекції асиметричних соматичних гібридів культурного томата чи баклажана (Рис. 4 - 7). Найчастіше використовували схеми селекції N0 8 і 10. Вони дозволяють отримувати соматичні гібриди, що містять ядро культурного виду, пластом та частину ядерного матеріалу дикого виду. Згідно зі схемою селекції № 7 можна отримувати цибриди (Рис. 5). Схеми селекції № 4 - б дозволяють уникати переносу чужинного пластому від донора до реципієнта. Отриманий генетично маркований матеріал дозволяє також відбирати соматичні гібриди культурного томата чи баклажана без застосування у-опромінення (схеми № 10 - 12, Рис. 7). Селекцію гібридів баклажана можна також проводити згідно зі схемами № 14 -16 (Рис. 7).

Рис. 4. Можливі схемі! селекції соматичних "гамма-гібридів" після злиття протопластів культурного томата або баклажана (реципієнт, дикий тип) з у-онроміненими протопластами диких видів (донор, стійкість до антибіотиків і/або мутантний тип).

Реципієнт (дикий тип)

Донор

(у-опромінення)

Трансгеині рослини

Культурніш тона або баклажан

'СКпіг

■<Ншг

<Ктг + Ншг

(1)

(2)

(3)

Хлорофілдефектні трансгенні рослини <Кшг <Ншг

<Ктг + Ііщг

(4)

(5)

(6)

Рис. 5. Можливі схеми селекції соматичних "гамиа-гібридів" після злиття протопластів культурного томата або баклажана (реципієнт, мутантний тип) з у-опромінеішми протопластами диких видів (донор, діікий тип, стійкість до антибіотиків).

Реципієнт

(хлорофілдефектшш

мутант)

Культурной томат або баклажан

Донор

(у-опромінення)

Рослини дикого типу (7)

Трансгеппі рослгти Кшг (8)

Ншг (9)

Кшг+Нтг (10)

Рис. 6. Можливі схеми селекції соматичних гібридів культурного томата або баклажана без застосування у-опромінення.

Культурний томат або баклажан '■ (дикий тни)

Хлорофілдефектпні трансгеппі рослини :Кшг (11)

-<Птг (12)

:Ктг + Ншг (13)

Рис. 7. Можливі схеми селекції соматичних гібридів баклажана (5. тпеїопдепа ) без застосування у-опроміпешія.

Трапсгетп

рослини

'Ншг (14)

Баклажяіґ-

Кшг Хлорофілдефектпні

трансгеппі рослини =Ншг (15)

Баклажан>------------------<Рослини дикого (16)

(Кшг типу

хлорофілдефектшій мутант)

3.2. Соматична гібридизація Ь. сзсиїспіиіп з X. рспп-іапит.

Перуанський томат є практично ідеальним об'єктом для соматичної гібридизації з культурним томатом завдяки високій регенераційній здатності. Ця комбінація злиття була використана для конструювання соматичних гібридів різноманітної генетичної конституції. Спочатку були проведені досліди по отриманню соматичних гібридів, які 6, крім ядерного геному реципієнта, містили пластом і частину ядерного геному донора. Для цього були використані пластомні хлорофілдефектні мутанти Ь. свсиїспіит як реципієнти та трансгенні рослини перуанського томата як донори (Рис. 5, схема № 8). Ця схема селекції успішно застосована вперше в наших експериментах. Вона є досить ефективною і забезпечує отримання 102-103 гібридних колоній в 1 експерименті. Отримані 7 гібридів (клони А) мали кількість хромосом від 43 до 80, добре росли в умовах теплиці, але насіння не утворювали.

Ця схема селекції була модифікована за рахунок використання донорів, стійких відразу до канаміцшгу та гігроміцину (Схема № 10, Рис. 5). Донорів, маркованих двома клоновапими селективними генами в соматичній "гамма-гібридизації" ще не застосовувавали і в наших дослідженнях вперше експериментально продемонстрована можливість отримання соматичних гібридів з їх використанням. Отримані 4 гібриди (клони В) за своєю життєздатністю значно поступалися аналогічним гібридам, отриманим шляхом селекції на середовищі з одним антибіотиком (клони А). Вони мали аномальну морфологію, погано росли та вкорінювалися. Ймовірно, це зв'язано з високим рівнем плоїдності гібридів, а селекція "гамма-гібридів" по двох ядерних ознаках донора сприяла цьому.

Іншим напрямком досліджень було отримання асиметричних ядерних гібридів, які мають пластом реципієнта. Питання, чи можна цілеспрямовано створювати "гамма-гібриди", які б зберігали пластом реципієнта,, не обговорювалась в науковій літературі. В даному дослідженні вперше розроблена схема селекції, яка сприяє сегрегації хлоропластів донора і збереженню у асиметричного гібрида виключно пластому реципієнта. При використанні як реципієнта протопластів рослин дикого типу культурного томата, а як донора -інактивованих у-опроміненням протопластів канаміцинстійкого пластомного хлорофїлдефектного мутанта перуанського томата, (схема селекції № 4, Рис. 4), були отримані 4 асиметричні ядерні гібриди (клони С). Всі рослини клонів С мали хлоропласти

реципієнта L. esculentum, ідо було доведено рестрнктішм аналізом хлДНК (Hind III).

Для всіх дослідів по отриманню асиметричних гібридів культурного і перуанського томатів був характерний надзвичайно низький коефіцієнт регенерації соматичних гібридіп - 0,13 - 3%. Основними чинниками цього можуть бути: 1) низька регенераційна здатність культурного виду; 2) опромінення протопластів дикого виду; 3) схема селекції соматичних гібридів. Жорстке програмування генетичної конституції гібридної рослини (ядерний геном культурного виду + пластом і частина ядерного геному дикого виду), яке спонукає селекція по двох ознаках (стійкості до антибіотиків і здатності до відновлення фотосинтезу), робить сегрегацію ядерних та цитоплазматичних генів дуже обмеженою і, відповідно, може зменшувати ймовірність регенерації рослин з гібридних колоній.

3.3. Соматігпга гібридизація L. cscvlentum з S. rickii.

Протопласти L. esculentum сорту Богдані вський зливали з

інакгивованимн у-променями протопластами канаміцинстійкої лінії S. rickii. Із 537 гібридних колоній вдалося регенерувати три гібридні рослини. Вони, як і рослини культурного томата, мали де-термінантний тип росту. Фертильність пилку гібрида RB-1 становила 8,6 ± 3,0%. Пилок клонів RB-2 і RB-3 виявився стерильним. Гібриди зав'язували велику кількість плодів, але без насіння. Плоди гібрида RB-1 важили 10-12 г, гібридів RB-2 і RB-3 - близько 2-3 г, тоді як плоди L. esculentum сорту Богданівський досягали ваги 140 г.

При вивченні хромосомних чисел встановлено, що у клону RB-1 48 хромосом, клонів RB-2 і RB-3 - 39, в той час як батьківські форми L. esculentum і S. rickii мали набори хромосом 2п=2х=24.

У всіх гібридів були присутні шгдоспецифічні смуги естерази та пероксидази батьківських форм. Результати RAPD-аналізу показали наявність у всіх соматичних гібридів зон ампліфікованої ДНК, характерних як для RAPD-спсктра I. csculentum сорту Богданівський, так і канаміцинстійкої лінії S. rickii, що також підтверджує гібридність всіх клонів.

3.4. Соматична гібридизація L. esculcntuin з S. nigrum.

Метою досліджень було з'ясування причин труднощів отримання гібридів в даній комбінації. Тому були проведені експерименти по

отриманню гібридів як з у-опроміненням одного із партнерів, так і без нього.

Із 400 гібридних колоній, отриманих після злиття протопластів хлорофілдефектного мутанта albina 6 L. esculentum лінії 13 та пасльону чорного, стійкого до каїїаміцину та гігроміцину, був регенерований всього один "гамма-гібрид". Цей гібрид (N 239) за свою морфологією нагадував культурний томат, добре ріс в грунті, утворював невеликі плоди без насіння (близько 2 г). Пилок гібрида був стерильним. Як і в культурного томата, квітки і плоди гібрида N 239 мали відповідно, жовте і червоне забарвлення. В той же час листки і стебла цього гібрида були світло-зеленого кольору, а плоди мали яйцевидну форму, що невластиво жодній батьківській формі.

Батьківські форми L. esculentum мають кількість хромосом 2n=2x=24, S. nigrum - 2п=2х=72, а у гібрида N 239 їх було 42.

Дані аналізу ММФ естерази підтвердили гібридність клону N 239. В той же час ММФ пероксидази клону N 239 були такі, як у L. esculentum, що може свідчити про його асиметричну природу. Результати RAPD-аналізу геномної ДНК батьківських видів і клону N 239 показали сутєві зміни в RAPD-сгіектрах соматичного гібрида. Поруч з зонами ампліфікованої ДНК, які характерні для батьківських видів, з'являються 3 нові фрагменти ампліфікованої ДНК. В той же час у гібрида зникло чимало фрагментів батьківських видів. Це свідчить про складні процеси перебудови ядерної ДНК. Рестриктний аналіз хлДНК (Hind III) гібрида N 239 показав, що він має хлоропласти культурного томата. Це можна пояснити спонтанною зворотною мутацією в хлоропластах культурного томата або здатністю ядерних генів S. nigrum впливати на відновлення біосинтезу хлорофілу хлоропластами L. esculentum.

Для отримання симетричних гібридів культурного томата і пасльону протопласти канаміцинстійкого хлорофілдефектного мутанта S. nigrum зливали з протопластами L. esculentum (лінія 604). Із 100 гібридних колоній було регенеровано 42 рослини. Симетричні гібриди томата і пасльону чорного росли дуже повільно in vitro і в теплиці. їх хромосомний набір приблизно дорівнював сумі хромосомних наборів батьків.

Таким чином, в результаті експериментів по соматичній гібридизації між культурним томатом та пасльоном чорним встановлено:

1) застосування стандартної методики злиття протопластів дозволяє отримувати в даній комбінації значну кількість гібридних

колоній в одному експерименті (близько 102). Необхідною умовою для цього є застосування ефективних схем селекції соматичних гібридів з використанням хлорофілдсфектннх мутантів та трансген-них рослин;

2) коефіцієнт регенерації симетричних гібридів томата і пасльону чорного (42%) значно перевищує аналогічний показник для асиметричних гібридів (0,25%). Це свідчить про негативний вплив опромінення одного із партнерів на морфогенез соматичних гібридів;

3) симетричні гібриди L. esculenturn + S. nigrum характеризувалися низькою життєздатністю, тому, мабуть, подальші експерименти по їх отриманню є недоцільними;

4) у асиметричних гібридах культурного томата і пасльона чорного відбуваються складні процеси перебудови їх ядерої ДНК, що підтверджується появою нових зон ампліфікованої ДНК в RAPD-профілях соматичного гібрида N 239.

3.5. Соматична гібридизація L. esculenturn з Lycium barbarum.

Томат культурний (L. esculenturn) та повій звичайний (Lycium

barbarum) є найбільш філогенетично віддаленими видами з усіх , які ми використовували для злиття протопластів. Ці види належать до різних триб родини Solanaceae (Hunziker, 1979). Для отримання гібридів використовували опромінені дозою 200 Гр протопласти трансгенних гігроміцинстійких рослин L. barbarum. Всього було відібрано біля 800 гібридних колоній. Ці колонії вирощували протягом трьох років на регенераційному середовищі ТМ-4, але не вдалося отримати жодної рослшш-регенерапта.

3.6. Соматична гібридизація за участю S. melongena.

Для отримання симетричних соматичних гібридів баклажана використовували канаміцинстійкі рослини S. тєіопдепа сорту Дністровець і гігроміцинстійкі рослини S. rickii чи S. підгит (Рис. 7, схема № 14).

В комбінації злиття S. melongena + S. rickii вдалося регенерувати 5 гібридів. За морфологією всі гібриди були більше схожі на S. rickii. Три клони характеризувалися високою життєздатністю і цвітінням. Два інших клони росли дуже повільно і у них осипалися бутони. Пилок гібридів був частково фертильним, але тест на його життєздатність виявився негативним. Гібриди зав'язували плоди без насіння вагою 1-3 г. Обидва батьківські види

мають число хромосом 2п~2х=24. Гібриди мали близьке до тетра-плоїдиого рівня число хромосом. Гібридність всіх рослин-регенеран-тів підтверджена за допомогою аналізу ізозимів естерази і пероксид ази.

В комбінації S. melongená + S. nigrum отримано 8 гібридів і тільки 1 з них добре ріс (клон ДН-12). Він виявився химерним. При размноженнні цього клону живцюванням спонтанно отримані два субклоии з різною морфологією: ДН-12-1 (схожий на S. nigrum) та ДН-12-2 (схожий на S. melongená). В теплиці всі субклони добре росли і цвіли. Гібрид ДН-12-1 іноді утворював чорні плоди без насіння, які були схожі на ягоди S. nigrum. Фертильність пилку гібридів ДН-12 і ДН-12-1 складала 9,2 ± 3,7% і 26,8 ± 4,7%, відповідно, але тест на його життєздатність був негативним. Квітки гібрида ДН-12-2 взагалі не містили пилкових зерен. Гібридність ядерного геному всіх рослин встановлена за допомогою аналізу ММФФ естерази і пероксидази. Число хромосом у S. тпеїопдепа 2n=2x=24, а у S. nigrum 2п=2х=72. Гібриди ДН-12-1 та ДН-12 мали близько 140-145 хромосом, тоді як субклон ДН-12-2 - 24 хромосоми, що свідчить про масштабність процесів елімінації хромосом протягом 2-3 вегетативних циклів розвитку in vitro гібридної рослини клону ДН-12. Це один з небагатьох випадків, коли асиметричні гібриди баклажана можна отримати і без гамма-опромінення.

Для отримання асиметричних соматичних гібридів баклажана з застосуванням у-опромінеїшя використовували як реципієнт пластомний хлорофілдефектпий мутант albina 1 S. melongená сорту Дністровець і як донор і-, nigrum чи S. rickii, але із отриманих колоній регенерувати рослини не вдалось.

Підсумовуючи результати даної роботи можна сказати, що вона охоплює весь цикл клітинно-інженерних досліджень по соматичній гібридизації томата і баклажана з дикими видами родини Solanaceae від створення вихідних генетично маркованих форм для гібридизації (хлорофілдефектних мутантів і/або трансгешшх рослин, стійких до антибіотиків) до аналізу соматичних гібридів. Отримані мутанти і трапсгенні рослини можна ефективно використовувати в дослідах по соматичній гібридизації із застосуванням різноманітних схем селекції. Крім цього, отримані хлорофілдефектні мутанти можуть також знайти застосування в фізіологічних і молекулярно-біоло-гічпих дослідженнях для вивчення механізмів фотосинтезу, взаємодії ядерного геному і пластому та функціонування геному хлоропластів.

ВИСНОВКИ.

1. Методи хімічного мутагенезу дозволяють ефективно отримувати цитоплазматичні хлорофілдефектні мутанти Lycopersicon esculentum і Solanum melongena, а також диких видів родини Solanaceae.

2. Види роду Solanum більш чутливі до дії НМС, ніж Lycopersicon.

3. Метод генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens дозволяє ефективно і за короткий період отримувати стійкі до антибіотиків трансгенні рослини диких видів родини Solanaceae, які є цінним вихідним матеріалом для експериментів по соматичній гібридизації.

4. Запропоновані ефективні схеми селекції асиметричних соматичних гібридів культурного томата і баклажана з. дикими видами родини Solanaceae, які базуються на використанні, з одного боку, мезофільних протопластів пластомних хлорофілдефектних мутантів L. esculentum чи S. melongena, а з іншого, мезофільних протопластів стійких до антибіотиків трансгенних рослин диких видів родини Solanaceae, інактивованих летальними дозами у-опромінення.

5. Використання в соматичній гібридизації як донорів у-опромінених трансгенних хлорофілдефектних пластомних мутантів дозволяє відбирати асиметричні ядерні гібриди, які мають пластом реципієнта.

6. Для селекції соматичних асиметричних гібридів можливе використання як донорів трансгенних рослин, які містять в своєму геномі два селективних гени, що кодують стійкість до каиаміцішу та гігроміцину.

7. З застосуванням розроблених схем селекції отримані:

а) асиметричні гібриди: L. esculentum +• L. peruvianum var.

dentatum, L. esculentum + L. peruvianum var. humifusum, L. esculentum +• L. pennellii, L. esculentum +- S. rickii, L. esculentum +

S. nigrum і L. peruvianum var. dentatum +■ L. hirsutum var. glabratum\

б) симетричні гібриди: L. esculentum + S. nigrum, S. melongena + 5. nigrum і S.melongena +- 5. rickii.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації.

Статті,

1. Рудас В.А., Завгородняя А.В., Череп Н.Н., Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация методом листовых дисков диких видов родов Solanum и Lycopersicon. //Биополимеры и клетка.- 1993.- Т. 9, № 5, С. 73-77.

2. Рудас В.А. Получение пластомных хлорофиллдефектных мутантов у видов семейства пасленовых.// Цитология и генетика. -1994. - Т. 28 , No 2,- С. 42-48.

3. Рудас В.А., Пивень Н.М., Ривкин М.И., Вершинин А.В., Инфанте Д.Х. Генетическая трансформация Lycopersicon peruvianum var. dentatum с помощью Agrobacterium tumefaciens, несущей плазмиду с геном (5-интерферона человека.// Цитология и генетика.

- 1997. Т. 31, № 2. С. 24-29.

4. Ratushnyak Y.I., Pivcn N.M., Rudas V.A. Protoplast culture and plant regeneration in Lycium barbarum L.// Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1989. - V. 17. - P. 183-190.

5. Ratushnyak Y.I., Rudas V.A., Pivcn N.M. Regeneration of Lycium barbarum L. plants from leaf tissue, callus culture and callus protoplasts. Plant Cell Rep - 1990.- V. 9. - P. 84-87.

6. Ratushnyak Y.I., Rudas V.A., Piven N.M. Regeneration of plants from protoplasts of Lycium barbarum L. (Wolfberry). In: Bajaj Y.P.S. (ed) Biotechnology in Agriculture and Forestry. - 1993. - Vol. 22, Plant Protoplast and Genetic Engineering III, Springer, New York., P. 79-86.

Тези.

1. Ратушняк Я.И., Рудас В.А., Пивень Н.М. Селекция соматических гибридов томата с использованием пластомных хлорофиллдефектных мутантов.//Материалы второго съезда Всесоюзного общества физиологов растений. - Минск, 24-28 сентября 1990 г.

2. Рудас В.А. Получение хлорофиллдефектных и трансгенных растений в семействе Solanaceae.// Тезисы докладов конференции молодых ученых "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики". - Киев, 26-28 мая 1992, С. 139.

3. Рудас В.А., Завгородняя А.В., Череп Н.Н. Генетическая трансформация методом листовых дисков некоторых видов семейства Solanaceae. Тезисы II Росийского симпозиума "Новые методы

биотехнологии растений". - Пущішо,- 1993. - С. 46.

4. Кочевенко А.С., Рудас В.А., Ратушняк Я.І. Культура протопластів та регенерація рослин деяких представників роду Solarium. Тези II з'їзду Українського товариства фізіологів рослин. -Київ. - 1993. - Т. 1. - С. 111.

5. Piven N.M., Ratushnyak Y.I., Rudas V.A., Latypov S.A., Zavgorodnya G.V., Gleba Y.Y. Selection of somatic hybrids using chlorophyll-deficient mutants and gamma-irradiation.// Abstr. VIII th Intern! Protoplast Symposium. Uppsala.- 1991.

6. Piven N.M., Rudas V.A., Infante D., R.G. de Uzcategui, Rivkin M.I., Vershinin A.V. Testing of tomato mosaic virus resistance and susceptibility in transgenic plants of Lycopersicon. //Abstr. XV th Internl Congress of Botany.- Japan. - Yokohama, 1993.- Poster No 8197.

7. Rudas V.A., Zavgorodnyaya A.V., Cherep N.N., Ratushnyak Y.I. & Gleba Y.Y. Production of initial material for somatic hybridization with culti%'ated tomato.// .Abstr. VIII th Internl, Congress of Plant Tissue and Cell Culture, Italy, Firenze.- 1994,- P. 101.

8. Rudas V.A., Zavgorodnyaya A.V., Cherep N.N., & Gleba Y.Y. High-efficient technology of the tomato somatic "gamma-hybridization". Abstr. Internl. Symp. Plant Biotechnology and Genetic Engineering, the Ukraine, Kyiv.- 1994.- P. 68.

9. Rudas V.A., Zavgorodnyaya A.V., Pitel S.G., Gleba Y.Y. Selection of tomato somatic hybrids using chlorophyll-deficient mutants, transgenic plants and gamma-irradiation. In Proc. FAO/IAEA Internl. Symp. on the use of induced mutations and molecular techniques for crop improvement (19-23 June 1995, Austria, Vienna).

ANNOTATION.

Rudas Y.A. Production of genetically marked plants in Solanaceae family and their using in somatic hybridization.

Thesis for gaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of the Ukraine, Kyiv, 1997.

The results of 15 scientific publications are defended.

The thesis deals with the production of tomato and eggplant cytoplasmic chlorophyll-deficient mutants, kanamycin- and/or hygromycin-resistant plants of some wild Solanaceae specics and their using for somatic hybrids selection. The cytoplasmic nature of the chlorophyll-deficient mutants obtained has been confirmed by complementation analysis. The transgenic nature of the wild species plants has been confirmed by NPT-II assay, NPT-II ELISA, PCR analysis, Western blotting hybridization.

Following protoplasts fusion of tomato chlorophyll-deficient mutants and gamma-irradiated protoplasts of transgenic plants of wild spccies the asymmetric somatic hybrids of L. esculentum with L. peruvianum, L. pennellii, Solanum rickii, S. nigrum have been regenerated. Also the somatic hybrids of Solanum melongena with S. rickii and S. nigrum were obtained. Their hybrid nature was confirmed by isozyme analysis, RAPD analysis, restriction analysis of chloroplast DNA, chromosome numbers counting.

АННОТАЦИЯ.

Рудас В.А. Получение генетически маркированных растений в семействе Solanaceae и их использование в соматической гибридизации. Рукопись.

Защищается 15 научных работ по теме диссертации.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1997.

Диссертационная работа посвящена получению генетически маркированных растений: хлорофиллдефектных пластомных

мутантов культурного томата и баклажана, устойчивых к канамицину и/или гигромнцину трансгенных растений диких видов Solanaceae и

их дальнейшему использованию для получения соматических гибридов. Пластомная природа хлорофиллдефектных мутантов подтверждена с помощью комплемепгациопного анализа путем слияния протопластов. Трансгенная природа растений-трансформантов доказана с помощью анализа активности неомицинфосфо-трансферазы (NPT-II), NPTII ELISA, ПЦР, вестерн-блоттипга.

После слияния протопластов хлорофиллдефектных мутантов культурного томата с инактивированными у-лучам и протопластами трансгегшых растений диких видов регенерированы асимметричные соматические гибриды Lycopersicon esculentum с L. peruvianum, L. pennelli, Solanum rickii или S. nigrum. Также получены соматические гибриды melnngena с 5. rickii или S. nigrum. Их гибридная природа подтверждена анализом множественных молекулярных форм эстеразы, пероксидазы, RAPD-анализом, рестрикционным анализом хлДНК, подсчетом числа хромосом.

Ключові слова: Lycopersicon, Solanum, хлорофілдефектні

мутанти, трансгенні рослини, соматичні гібриди.