Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение генетически кодируемых FRET-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение генетически кодируемых FRET-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP"

На правах рукописи

Арсланбаева Ляйсан Равиловна

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ ШЕТ-СЕНСОРОВ КАСПАЗЫ-З НА ОСНОВЕ ТЕРБИЙ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ПЕПТИДА И КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ ПвЛесИ И Та§ЯГР

Специальность 03.01.04 - «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

4843489

Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Учреждения Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «10» февраля 2011 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха по адресу: 199071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 199071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан «¿£» декабря 2010 года.

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор

А.П. Савицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

К.А. Лукьянов,

доктор биологических наук,

профессор

Н.В. Карапетян

Ведущая организация:

Кафедра биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Апоптоз является одним из вариантов программированной гибели клеток. Он участвует в гистогенезе и поддержании гомеостаза организма. Нарушения процесса апоптоза приводят к развитию нейродегенеративных, опухолевых, аутоиммунных заболеваний. За запуск протеолитического каскада каспаза-зависимого апоптоза отвечают инициаторные и эффекторные каспазы. Среди них каспаза-3 является центральным ферментом апоптоза, так как на ней сходятся рецепторный и митохондриальный пути активации протеолитического каскада. В активном состоянии она инициирует активацию других эффекторных каспаз и гидролизует различные клеточные субстраты. Фермент представляет интерес как терапевтическая мишень при воздействии на клетку различных лекарственных препаратов, индуцирующих апоптоз. Уровень активности каспазы-3 является важным прогностическим маркером для оценки агрессивности патологических процессов и эффективности действия лекарственных средств.

Для изучения ферментативной активности в живых клетках в последнее время активно разрабатываются FRET-биосенсоры, в основе действия которых лежит метод индуктивно-резонансного переноса энергии. По изменению параметров FRET можно проводить прямой мониторинг ферментативной активности.

В настоящее время активно ведется разработка FRET-биосенсоров, где в качестве доноров и акцепторов используются флуоресцентные белки. Объединение нуклеотидной последовательности флуоресцентных белков и субстрата каспазы-3 в единой рамке считывания является основой разработки генетически кодируемых сенсоров каспазной активности. Индуктивно-резонансный перенос энергии в данных сенсорах проявляется как динамический тип тушения флуоресценции донора и, соответственно, характеризуется снижением времени жизни донора в возбужденном состоянии. Гидролиз линкера, содержащего аминокислотную последовательность DEXD, специфически распознаваемой каспазой-3, приводит к физическому разделению донора и акцептора, в результате чего условия переноса

Принятые сокращения: Трп-СП - триптофан в составе тербий-связывающего пептида, ТЬ3+ - ион тербия, ТЬ3+-СП - тербий-связывающий пептид, DsRed2 -красный флуоресцентный белок (Discosoma Red fluorescent protein), TagRFP -красный флуоресцентный белок (Red Fluorescent Protein), Tb3+-CIl-DEVD-DsRed2 -гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида, линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка DsRed2, ТЬ3+-СП-DEVD-TagRFP - гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида, линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка TagRFP, FRET - флуоресцентный резонансный перенос энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer).

энергии нарушаются и, соответственно, снимается тушение. Данные сенсоры обладают преимуществами по сравнению с синтетическими флуорогенными субстратами. Это связано с тем, что генетически кодируемые сенсоры экспрессируются самой клеткой и не требуют внешней инъекции, кроме того они являются высоко стандартизованными метками со строго определенными точками присоединения белков друг к другу.

Для решения проблемы фонового сигнала клеток, связанной с автофлуоресценцией биомолекул и светорассеянием, разрабатывают сенсоры на основе белков со спектром флуоресценции в красной и дальнекрасной области. Другим подходом является использование в качестве доноров во БИЕТ-паре флуоресцирующих комплексов лантанидов с микро- и миллисекундным временем жизни в возбужденном состоянии. При переносе энергии от донора-лантанида время жизни возбужденного состояния акцептора увеличивается на порядки по сравнению с естественным временем жизни флуоресценции. Перекрывание спектра флуоресценции тербия и возбуждения красных флуоресцентных белков создает условия для эффективного переноса энергии и последующего испускания микросекундной флуоресценции красным флуоресцентным белком. Использование спектроскопии с временной задержкой позволит избежать регистрации короткоживущего фонового сигнала клеток, что важно в условиях низкой интенсивности сигнала ШЕТ-пары.

Цели и задачи работы

Целью данной работы являлась разработка генетически кодируемых сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков Оз11ес12 и TagRFP.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение генно-инженерных конструкций, содержащих участки ДНК, кодирующие тербий-связывающий пептид, линкер с сайтом распознавания каспазы-3 и один из красных флуоресцентных белков 05Яес12 или ТадИРР;

2. Оптимизация условий синтеза, выделения и очистки гибридных белков до гомогенного состояния;

3. Изучение условий, при которых перенос энергии происходит максимально эффективно;

4. Изучение гидролиза полученных РЯЕТ-сенсоров каспазой-3.

Научная новизна

Впервые получены генетически кодируемых И1ЕТ-пары ТЬ3+-СП-БЕУВ-БзЯесй и на основе тербий-связывающего пептида и

красных флуоресцентных белков ОзЯесй и TagRFP, внутри которых происходят два индуктивно-резонансных переноса энергии: от тербий-связывающего пептида к иону ТЬ3+, и от иона ТЬ3+ к красному флуоресцентному белку. На основании изменений времени жизни ТЬ3+ была рассчитана эффективность переноса энергии от

ТЬ3+ к хромофору белка. Для белка ТЬ3+-СП-ПЕУВ-ПзКес12 она составила 28%,

для белка Tb3+-CIl-DEVD-TagRFP - 35%. Показано, что повышение ионной силы в растворе приводит к снижению времени жизни ТЬ3+ в возбужденном состоянии в обеих FRET-napax. Белок Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2, который по данным динамического светорассеяния является тетрамером, не гидролизуется каспазой-3, в отличие от димерного белка Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP, который эффективно расщепляется каспазой-3 за исследуемые промежутки времени. Полученный FRET-сенсор может быть использован для изучения

ферментативной активности каспазы-3 в живых клетках.

Практическая значимость работы

Полученный FRET-сенсор Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP может быть использован для определения активности каспазы-3 in vitro.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были доложены на международной научной конференции International Symposium «Topical Problems of Biophotonics -2007» (Нижний Новгород-Москва-Нижний Новгород, 2007), на всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008), на V съезде Российского фотобиологического общества (Московская обл., г. Пущино, 2008), на международной научной конференции II International Symposium «Topical Problems of Biophotonics - 2009» (Нижний Новгород-Самара-Нижний Новгород, 2009).

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 ссылок. Диссертация содержит 35 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследования

Конструирование рекомбинантньгх плазмид. В качестве вектора для клонирования использовали трансляционный вектор pET22b («Novagen», США). Фрагмент ДНК, содержащий слитые в единой рамке считывания последовательности, кодирующие ТЬ3+-СП (YIDTNNDGWYEGDELLA) и белок DsRed2, клонировали в векторе рЕТ22Ь по сайтам Ndel и EcoRI. Между последовательностью ТЬ3+-СП и геном DsRed2 по сайту Sali вводили линкер, кодирующий пептид с сайтом распознавания каспазы-3 (VDGGSGGDEVDGWGGSGLD). В результате была получена плазмида pET22b/Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2.

Плазмида pET22b/Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP,

содержащая слитые в единои рамке считывания последовательности, кодирующие ТЬ3+-СП, линкер с сайтом распознавания каспазы-3 и белок TagRFP, получена путем замещения Sall-EcoRI-

фрагмента, содержащего ген DsRed2, в плазмиде pET22b/Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 на SalI-EcoRI-фрагмент, содержащий ген TagRFP.

Получение высокоочищенных фракций гибридных белков ТЬ3+-СП-РЕУР-DsRed2 и Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP. Для изучения процессов переноса энергии с участием ионов ТЬ3+ нельзя было использовать методику получения и очистки белка с использованием полигистидиновой аффинной последовательности, поскольку полигистидиновая аффинная метка будет связывать ионы ТЬ3+. Поэтому первоначально была выбрана методика получения и очистки рекомбинантных белков путем интеин-опосредованной хроматографии, которая предполагает получение высокоочищенных фракций белков, не содержащих каких-либо аффинных меток. Однако оказалось, что получение функционально активных белков этим методом характеризуется низким выходом целевых белков при их выделении. В связи с этим был выбран классический многостадийный способ очистки с использованием дробного осаждения белков сульфатом аммония, анионообменной хроматографии на носителе MonoQ («Pharmacia LKB Biotechnology», Швеция) и гель-фильтрации с использованием колонки Superdex 200 10/300 («GE Healthcare», Швеция). В подобранных условиях достигалась высокая степень очистки гибридных белков и нарабатывалось количество белка, достаточное для проведения экспериментов.

Определение агрегатного состояния гибридных белков. Определение агрегатного состояния белков Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 и Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP проводили методом динамического светорассеяния с использованием прибора DynaPro Titan («Wyatt Technology», США). Расчет гидродинамических радиусов проводили в приближении сферической модели белков с помощью программы Dynamics 6.7.7.9 («Wyatt Technology», США).

Фотообесцвечивание гибридных белков. Фотообесцвечивание белков ТЬ3+-Cn-DEVD-DsRed2 и Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP проводили в 10 мМ HEPES буфере, рН 7.0 в объеме 100 мкл. В экспериментах использовали пикосекундный Nd:YAG-лазер с длиной волны 532 нм импульсной накачкой, диодной линейкой и с электрооптическим управлением генерацией. Мощность облучения составила 20 мВт, частота генерации импульса - 300 Гц.

Результаты и их обсуждение

Конструирование FRET-сенсоров каспазы-3 заключается в присоединении молекул донора и акцептора на N- и С-концы линкера, содержащего сайт распознавания DEXD. Активация фермента ведет к гидролизу специфической последовательности, что приводит к физическому разделению донора и акцептора. В результате перенос энергии прекращается и, соответственно, снимается тушение. Таким образом, по изменению параметров FRET можно напрямую определять активность фермента.

Схема полученных в данной работе РЯЕТ-биосенсоров каспазы-3 представлена на рис. 1.

(а) сайт расщепления кэспазы-3

ТЬЭ:СП

TagRFP

сайт расщепления каспазы-3

\ЯХЗвЗООЕУ0<31ЛЛЗС5е1.О

ть'-сп

05р?ес12

Рис. 1. Схематическое представление сенсоров каспазы-3 на основе ТЬ3+-СП и красных флуоресцентных белков TagRFP и ВзН.ес12.

Данные биосенсоры каспазы-3 ТЬ3+-СП-ВЕУВ-0$11ес12 и рЕТ22Ь/ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Та§РЕР сконструированы на основе тербий-связывающего пептида YIDTNNDGWYEGDELLA, линкера У0008000ЕУ00\У0080Ь0 с сайтом узнавания каспазы 3 (ОЕ\Ш) и флуоресцентных белков Вз11ес12 и TagRFP.

Определение агрегатного состояния гибридных белков.

С помощью метода динамического светорассеяния были получены данные по эффективным диффузионным радиусам и соответствующим им молекулярным массам. Для белка ТЬ3+-СП-ОЕУО-ОзКес12 величина радиуса в приближении сферической модели составила 5 нм, что соответствует молекулярной массе 143 кДа, для белка ТЬ3+-СП-ОЕУВ^11ЕР - 3.5 нм, что соответствует 64 кДа. Вычисленная молекулярная масса мономера составляет

29.4 кДа, а мономера ТЬ3+-СП-ВЕ\Ф-Та§КЕР - 30.5 кДа. Исходя из этого, можно заключить, что белок ТЬ3+-СП-ОЕУО-Вз11ес12, наиболее вероятно, находится в данных условиях в тетрамерном состоянии, а белок ТЬ3+-СП-ВЕУО-Та§КЕР в димерном.

Изучение переноса энергии

В полученных конструкциях присутствуют две донорно-акцепторные пары, между которыми происходит перенос энергии. Первый перенос энергии происходит от Трп-СП к ТЬ3+. Второй перенос энергии происходит от сенсибилизированного ТЬ3+ к флуоресцентному белку (Оз11ес12 или Та§КРР). Результатом этих двух процессов является долгоживущая флуоресценция ТЬ3+ и белков ОзЯесЕ и Та£11РР, которая регистрируется с микросекундной временной задержкой.

Сенсибилизация флуоресценции ТЬ3+ происходит через индольное кольцо триптофана, находящемся в 7 положении. Наличие триптофана приводит к реализации эффекта «антенны», состоящей в передаче энергии электронного возбуждения с триплетного уровня Трп-СП (донора) на резонансный излучательный уровень иона ТЬ3+ (акцептора), испускающего характерную для него долгоживущую флуоресценцию.

Для подтверждения этого процесса в полученных РЯЕТ-парах проводили облучение эквимолярных растворов ТЬ3+ и гибридных белков на длине волны возбуждения триптофана (280 нм) при регистрации флуоресценции ТЬ3+ на длине волны 545 нм. Полученные спектры возбуждения, регистрируемые с задержкой 100 мкс, показали возбуждение ТЬ3+ в обеих РЯЕТ-парах: ТЬ3+-СП-ВЕ\Ш-Б5Кес12 и ТЬ3+-СП-ВЕУО-Та§КРР (рис. 2).

Рис. 2. Спектры возбуждения микросекундной флуоресценции белков ТЬ3+-СП-DEVD-DsRed2 (а) и Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP (б), нормированные на оптическую плотность по 277 нм в отсутствие (1) и в присутствии 150 мМ NaCl (3), и обесцвеченная форма этого же белка в отсутствие (2) и в присутствии 150 мМ NaCl {4).

Рис. 3. Спектры микросекундной флуоресценции Tb3+-Cri-DEVD-DsRed2 (а) и Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP (б), нормированные на оптическую плотность по 277 нм в отсутствие (I) и в присутствии 150 мМ NaCl (3), и обесцвеченная форма этого же белка в отсутствие (2) и в присутствии 150 мМ NaCl (4).

Дополнительным подтверждением возбуждения сенсибилизированных ионов ТЬ3+ явились спектры микросекундной флуоресценции гибридных белков (рис. 3), в которых присутствуют пики флуоресценции ТЬ3+ (490 и 545 нм). Отсюда следует, что сенсибилизированное возбуждение и флуоресценция ТЬ3+ в обеих FRET-napax обусловлено переносом энергии от Трп-СП к иону ТЬ3+.

Второй индуктивно-резонансный перенос энергии происходит от возбужденного ТЬ3+ к хромофорам красных флуоресцентных белков. Сенсибилизированную микросекундную флуоресценцию белков-акцепторов определяли по интенсивностям их максимумов при 586 нм и 584 нм для белков DsRed2 и TagRFP, соответственно. Регистрация спектров микросекундной флуоресценции FRET-nap с временной задержкой 100 мкс показала, что, помимо флуоресценции ТЬ3+, наблюдаются максимумы, соответствующие микросекундной флуоресценции хромофоров флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP (рис. 3). Как видно на рис. 3 в результате второго переноса энергии происходит увеличение времени жизни белков DsRed2 и TagRFP в возбужденном состоянии по сравнению с их естественными временами. Известно, что собственное время жизни белка DsRed2 составляет 3.6 не, белка TagRFP - 2.2-2.3 не. Так как регистрация спектров микросекундной флуоресценции велась с временной задержкой, то присутствие характеристических пиков DsRed2 и TagRFP указывает на увеличение их времени жизни флуоресценции до значений, превышающих 100 мкс.

Оценка эффективности переноса энергии от ТЬ3+ к красному флуоресцентному белку, не может быть выполнена на основе изменения интенсивности флуоресценции донора (которая на рисунке нормирована на поглощение по 277 нм). Это связано с тем, что вклад флуоресцентного белка в

значение оптической плотности на 277 нм не может быть точно определен. Поэтому спектры микросекундной флуоресценции гибридных белков, нормированные на оптическую плотность по 277 нм, могут представлять ошибочные данные об относительных интенсивностях микросекундной флуоресценции гибридных белков.

В данной работе определение эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии, происходящего от ТЬ3+ к хромофорам красных флуоресцентных белков, производилось на основе изменений времени жизни донора (ТЬ3+), так как известно, что вследствие переноса энергии время жизни донора в возбужденном состоянии сокращается. Для измерения времени жизни донора (ТЬ3+) в отсутствие акцептора было проведено фотообесцвечивание хромофоров красных флуоресцентных белков, которое дает возможность получить донор, у которого время жизни флуоресценции не снижается за счет безызлучательной дезактивации акцептором. Фотообесцвечивание хромофоров белков ОзЯес12 и TagRFP, подвергавшихся облучению в течение 1-2 часов, контролировали по уменьшению полос их собственного поглощения в видимой области (рис. 4).

Рис. 4. Спектры поглощения белков Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 (а) и Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP (б), нормированные на оптическую плотность при 277 нм в отсутствие (7) и в присутствии 150 мМ NaCl (2), и обесцвеченная форма этого же белка в отсутствие (3) и в присутствии 150 мМ NaCl (4).

Времена жизни ТЬ3+ в обеих FRET-napax и их обесцвеченных формах, т.е. в присутствии и в отсутствие хромофоров красных флуоресцентных белков, рассчитывали в приближении одноэкспоненциальной модели затухания. Время жизни ТЬ3+ во FRET-паре Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 составило 0.37 мс, а в его обесцвеченной форме — 0.52 мс. Время жизни Tb + в белке Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP составило 0.28 мс, в его обесцвеченной форме - 0.44 мс (табл. 1).

Из данных табл. 1 следует, что в результате переноса энергии времена жизни ТЬ3+ снизились. Эффективность переноса энергии от ТЬ3+ к акцепторам DsRed2 и TagRFP рассчитывали по формуле:

250 350 450 550 Е50 Длина волны,нм

250 350 450 550 650 Длина волны,нм

Е = 1 - tda/Td,

где Е - эффективность переноса энергии, т0А - время жизни донора в присутствии акцептора, тц - время жизни донора в отсутствие акцептора.

Таблица 1. Время жизни ТЬ3+ и эффективность переноса энергии во FRET парах в присутствии и в отсутствие NaCl.

Гибридный белок Буфер 1, время жизни ТЬ3+ в возбужденном состоянии, мс Эффективность переноса энергии от ТЬ3+ к флуоресцентному белку (DsRed2/TagRFP), %

ТЪ'+-СП-ВЕУВ-ОзКеа2 10 мМ HEPES буфер, рН 7.0 0.37 28

Обесцвеченная форма ТЬ3+-С1И)Е\Т)-05Кей2 0.52

TbJ+-CП-DEVD-DsRed2 10 мМ HEPES буфер, рН 7.0, 150 мМ NaCl 0.35 17

Обесцвеченная форма ТЬ3+-СП-ОЕУВ-Б5Кеа2 0.42

ТЬ^-СП-ОЕУОЛ^КЕР 10 мМ HEPES буфер, рН 7.0 0.28 35

Обесцвеченная форма ТЬ3+-СП-ОЕУВЛ^ЯЕР 0.44

ТЬ'+-СП-ОЕУО-ТавКЕР 10 мМ HEPES буфер, рН 7.0, 150 мМ NaCl 0.18 44

Обесцвеченная форма ТЬ3+-СП-ОЕУВ-Та§КБР 0.33

Для белка Tb3+-CII-DEVD-DsRed2 эффективность переноса энергии от ТЬ3+ к хромофору DsRed2 составила 28%,"для белка Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP - 35% (табл. 1), т.е. эффективность переноса энергии от ТЬ3+ к акцептору выше во FRET- паре Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP.

Изучение влияния NaCl на микросекундную флуоресценцию обеих FRET-пар показало, что добавление соли NaCl в раствор приводило к снижению интенсивности возбуждения ТЬ3+ и, как следствие, снижению микросекундной флуоресценции обеих FRET-nap (рис. 3). Кроме того, снизились времена жизни ТЬ3+: для белка Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 оно составило 0.35 мс, для его обесцвеченной формы - 0.42 мс, для белка ТЬ -СП-DEVD-TagRFP - 0.18 мс, его обесцвеченной формы - 0.33 мс. Эффективность переноса энергии при добавлении 150 мМ NaCl упала для белка Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 с 28% до 17% и, напротив, возросла для белка Tb3+-CIl-DEVD-TagRFP с 35% до 44% (табл. 1). Данный эффект предположительно связан с динамическим тушением флуоресеценции тербия ионами СГ.

Таким образом, продемонстрировано наличие двух процессов индуктивно-резонансного переноса энергии в обеих И1ЕТ-парах: от Трп-СП к иону ТЬ3+, от иона ТЬ к хромофорам белков-акцепторов. Изучение влияния ионной силы на флуоресценцию показало, что добавление №С1 к раствору белков приводит к дезактивации возбужденного состояния ТЬ3+, и, как следствие, к снижению интенсивности флуоресценции и времени жизни ТЬ3+ в обоих гибридных белках.

Анализ результатов гидролиза субстратов каспазы-3.

Гидролиз субстратов каспазой-3 изучали по увеличению времени жизни флуоресценции ТЬ3+ в течение исследуемого промежутка времени в режиме измерения фосфоресценции. На рис. 5 представлена зависимость времени жизни ТЬ3+ при инкубации субстратов с каспазой-3. Для белка ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Та§ИРР наблюдается увеличение времени жизни ТЬ3+ в течение инкубации с каспазой-3 по сравнению с контрольным образцом, не содержащим фермент. Данные свидетельствует, что разрезание линкера каспазой-3 приводит к снятию тушения флуоресценции ТЬ3+, которое вызвано безызлучательной дезактивацией акцептора. Для белка ТЬ3+-СП-0ЕУ0-05Лес12 значения времени жизни ТЬ в контрольном образце и в присутствии каспазы-3 не изменяются.

Рис. 5. Зависимость времени жизни флуоресценции ТЬ3+,

сенсибилизированного в субстратах ТЬ3+-СП-ОЕУО-Та§кБР (1 - в присутствии каспазы-3, 2 — контрольный образец в отсутствие каспазы-3) и ТЬ3+-СП-ОЕУО-ВвИесЕ (3 - в присутствии каспазы-3, 4 - контрольный образец в отсутствие каспазы-3) от времени инкубации с каспазой-3.

Время инкубации, ч'

Данные результаты показывают, что расщепление каспазой-3 линкера между донором и акцептором происходит только в случае что

приводит к прекращению переноса энергии и увеличению времени жизни донора.

Для определения кинетических параметров ферментативного расщепления субстрата ТЬ3+-СП-ВЕУО-Та§КРР использовали методы интегральной кинетики. Полученную кинетическую кривую линеаризовали, используя следующую формулу:

£ 1/5(5 — 5 \ Кп

1п(50 - 5)

_ _ ^о-* \

-б) ~ КЧп (5п/5)/

+ "

где, Г - время инкубации субстрата с каспазой-3, я0 - начальная концентрация субстрата, 5 - текущая концентрация субстрата, V - скорость реакции, Кт -константа Михаэлиса-Ментен. При этом текущую концентрацию субстрата рассчитывали, исходя из того предположения, что последняя точка на кинетической кривой соответствует полному израсходованию субстрата. Линеаризация полученной кинетической кривой представлена на рис. 6.

.3.8

Рис. 6. Линеаризация зависимости времени жизни флуоресценции ТЬ3+ при инкубации субстрата ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Та£М-Т с каспазой-3.

2.5

3.5

(5„-5)/1п(5„/з)

4.0 4,5

Из параметров

0.21 ± 0.06, Кт/Утт = 3.15 ± 0.21, были

аппроксимирующей прямой 1 /Ут вычислены кинетические параметры субстрата ТЬ3+-СП-ВЕУО-Та§НРР: Ктах = £са, Е0, Е0 = 1.2 нМ, соответственно Кгаах = 5 ± 1.5 мкМ/мин, ксм = 4.2-103 ± 1.2-103 мин"1, £га = 17 ± 6 мкМ.

Для независимого подтверждения параллельно с измерениями отбирали аликвоты растворов субстрата и фермента для анализа с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Как видно на рис. 7, при инкубации субстрата ТЬ3+-СП-БЕУТ)-Та§11ЕР с каспазой-3 происходит постепенное исчезновение полосы 33.2 кДа, которая соответствует цельному субстрату, и появление полосы 27.7 кДа, которая соответствует одному из продуктов гидролиза (табл. 2). Низкомолекулярный пептид, второй продукт гидролиза, не задерживается в геле. Полоса 29.9 кДа скорее всего является частично расщепленным белком ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Та£КРР, так как интенсивность этой полосы также падает по мере нарастания времени инкубации с каспазой-3. На электрофореграмме с белком ТЬ3+-СП-ОЕУВ-Вз11ес12 исчезновение полосы субстрата не наблюдается.

Таким образом, полученные электрофоретические профили подтверждают данные спектральных измерений, указывающих на специфичный гидролиз субстрата Tb3+-Cri-DEVD-TagRFP каспазой-3 и отсутствие расщепления субстрата Tb +-CE[-DEVD-DsRed2 в условиях in vitro.

В табл. 3 представлено сравнение кинетических параметров полученного нами субстрата ТЬ -СП-DEVD-TagRFP и природных субстратов каспазы-3.

ТГ-СП-DEVD-TagRFP

Ttf*-Cn-DEVD-DsRgd2

-33.2 -29,9 -27.7

•32.6 -29.4

1 2 3 4 5 S 7 S 0

Рис. 7. Электрофоретический анализ реакционных смесей при различном времени инкубации с каспазой-3 и соответствующих контролей: 1 - субстрат в отсутствие каспазы-3, 2 - образец белка непосредственно после добавления каспазы-3, 3-9 -через 1. 2, 3, 4, 5, 6 ,7 ч после инкубации с каспазой-3.

Таблица 2. Таблица молекулярных масс гибридных белков Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP и Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2.

Гибридные белки Расчетная молекулярная масса, кДа Наблюдаемая молекулярная масса по электрофорезу, кДа Динамическое светорассеяние

субстрат продукт гидролиза субстрат продукт гидролиза радиус, нм соответств ующая молекуляр ная масса, кДа

TbJ+-cn-DEVD-TagRFP 30.5 27.2 33.2 27.7 3.5 64.0

ТЬ3+-СП-DEVD-DsRed2 29.4 26.2 29.4 — 5 143.0

Таблица 3. Кинетические параметры субстратов каспазы-3.

Субстрат M, кДа Агрегатное состояние Fraax, мкМ/с Km, MKM &cat, С &cat /^гтъ MKM-'C"1

PARP 226.4 димер - - - 5

[Casciola- [Mendoza-

Rosen, 1996] Alvarez, 1993]

DNA-PKcs 450 мономер - - - 7.7

[Casciola- [Casciola-

Rosen, 1996] Rosen, 1996]

ТЬ3+-СП- 61 димер 0.08 ± 0.03 17 ± 6 70 ±20 4.1

DEVD-TagRFP

Субстрат Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP, представляющий собой димер, по своим кинетическим свойствам близок к природным субстратам, что следует из сравнения значении кса/Кт. Субстрат Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2, находящийся в тетрамерном состоянии, за исследуемые промежутки времени не гидролизуется. Наиболее вероятной причиной отсутствия ферментативного расщепления белка Tb3+-Cn-DEVD-DsRed2 может быть влияние олигомерного состояния флуоресцентного белка DsRed2, которое в совокупности с другими факторами, возможно, длиной линкера, нежелательными взаимодействиями каспазы-3 и флуоресцентного белка приводит к отсутствию доступа каспазы-3 к субстрату. При этом стерические затруднения не обусловлены различной молекулярной массой субстратов, так как субстрат DNA-PKcs, представляющий собой каталитическую субъединицу, гидролизуется эффективнее, чем димерный субстрат PARP (поли(АДФ-рибозо)полимераза), несмотря на то, что последний имеет практически вдвое меньшую молекулярную массу.

В заключение следует отметить, что наиболее подходящим биосенсором для in vivo определения активности каспазы-3 является субстрат Tb3+-Cn-DEVD-TagRFP. Данная FRET-napa впервые получена на основе ТЬ3+ в комплексе с тербий-связывающим пептидом и красного флуоресцентного белка TagRFP и является полностью генетически кодируемой. Это важно при использовании сенсора в живых и постоянно делящихся клетках, в связи с отсутствием необходимости внешней инъекции. С помощью данного FRET-сенсора можно эффективно снизить короткоживущий фоновый сигнал в живых клетках, что важно в условиях регистрации низкой интенсивности сигнала.

выводы

1. Впервые получены генетически кодируемые РЯЕТ-пары на основе флуоресцентных белков ВзКес12 и TagRFP, субстрата каспазы-3 и тербий-связывающего пептида: ТЬ3+-СП-ОЕУВ-В81Ы2 и ТЬ3+-СП-БЕУ0^11РР.

2. Продемонстрировано наличие двух процессов индуктивно-резонансного переноса энергии в обеих И1ЕТ-парах: от тербий-связывающего пептида к иону ТЬ3+, от иона ТЬ3+ к хромофорам флуоресцентных белков.

3. Определена эффективность переноса энергии от иона ТЬ3+ к хромофорам флуоресцентных белков, для белка ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Б8К.ес12, она составила 28%, для белка Tb3+-CП-DEVD-TagRFP - 35%.

4. Показано, что добавление ЫаС1 в раствор с гибридными белками приводит к дезактивации возбужденного состояния ТЬ3+, и, как следствие, к снижению интенсивности флуоресценции и времени жизни ТЬ3+ в обеих РЯЕТ-парах. Данный эффект предположительно связан с динамическим тушением флуоресеценции тербия ионами СГ.

5. Показано, что димерный субстрат ТЬ3+-СП-ВЕУП-Та§ЯРР подвергается гидролизу каспазой-3, что подтверждено методами фосфоресцентной спектроскопии и электрофореза.

6. В случае тетрамерного белка ТЬ3+-СП-ВЕУБ-В5Яеё2 наблюдается отсутствие гидролиза каспазой-3 за исследуемый промежуток времени, что предположительно объясняется влиянием стерических факторов на доступ каспазы-3 к субстрату.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Turchin I.V., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Orlova A.G, Kleshnin M.S., Fiks I.I., Shirmanova M.V., Meerovich I.G., Arslanbaeva L.R., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals // Journal of Biomedical Optics. 2008. V.13. № 4.

2. Арсланбаева JI.P., Жердева B.B., Ивашина T.B., Винокуров Л.М., Русанов А.Л., Савицкий А.П. Генетически кодируемая FRET-napa на основе тербий-связывающего пептида и красного флуоресцентного белка // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 2. с. 166-171.

Тезисы докладов на конференциях:

1. Arslanbaeva L.R., Meerovich I.G., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. The Estblishment of stable high-level red fluorescent protein (TurboRFP)-Expressing melanoma cell line MelKor // International Symposium «Topical Problems of Biophotonics - 2007». Россия, Нижний Новгород-Москва-Нижний Новгород, 4-11 августа 2007 г. С. 156-157.

2. Арсланбаева Л.Р., Меерович И.Г, Жердева В.В., Савицкий А.П. Получение флуоресцирующих опухолей человеческой линии melKor, экспрессирующей красный флуоресцирующий белок TurboRFP, в мышах линии Nu/Nu // Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 17-19 марта 2008 г. С. 11.

3. Арсланбаева Л.Р., Меерович И.Г., Савицкий А.П. Получение опухолевой клеточной меланомы линии melKor, стабильно экспрессирующей красный флуоресцентный белок TurboRFP в условиях in vitro и in vivo // V съезд Российского фотобиологического общества. Московская обл., г. Пущино, 8-13 июля 2008 г. С. 198.

4. Arslanbaeva L.R., Ivashina T.V., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. Novel FRET-based genetically encoded sensor for caspase-3 activity detection // II International Symposium «Topical Problems of Biophotonics - 2009». Россия, Нижний Новгород-Самара-Нижний Новгород, 19-24 июля 2009 г. С. 27-28.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, 2-ой Автозаводский пр-д, д. ЗА Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Арсланбаева, Ляйсан Равиловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Изучение ферментативной активности каспазы-3 с помощью FRET-биосенсоров.

1.2. Проблема фоновой флуоресценции.

1.3. Флуоресцентные свойства лантанидов. Сенсибилизация флуоресценции. Лантанид-связывающие пептиды.

1.4. Многофотонное возбуждение лантанидов.

1.5. Основные тенденции изучения индуктивно-резонансного переноса энергии.

1.6. Комплексные соединения лантанидов в качестве доноров во FRET-парах при изучении биологических процессов и проведении биоаналитических реакций.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Оборудование.

2.2. Реактивы.

2.3. Методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика экспрессии флуоресцентных белков в условиях in vitro и in vivo.

3.2. Получение генетически кодируемых конструкций, кодирующих гибридные белки.г.;.

3.3. Получение высокоочищенных фракций гибридных белков и определение их агрегатного состояния.:.

3.4. Изучение переноса энергии

3.5. Определение активности каспазы-З.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение генетически кодируемых FRET-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP"

Апоптоз является одним из вариантов программированной гибели клеток. Он участвует в гистогенезе и поддержании гомеостаза организма. Нарушения апоптоза приводят к развитию нейродегенеративных, опухолевых, аутоиммунных заболеваний. За запуск протеолитического каскада апоптоза отвечают инициаторные и эффекторные каспазы. Среди них каспаза-3 является центральным ферментом апоптоза, так как на ней сходятся рецепторный и митохондриальный пути активации протеолитического каскада [1]. В активном состоянии она инициирует активацию других эффекторных каспаз и гидролизует различные клеточные субстраты [2]. Фермент представляет интерес как терапевтическая мишень при воздействии на клетку различных лекарственных препаратов, индуцирующих апоптоз. Уровень активности каспазы-3 является важным прогностическим маркером для оценки агрессивности патологических процессов и эффективности действия лекарственных средств.

Для изучения ферментативной активности в живых клетках в последнее время активно разрабатываются FRET-биосенсоры, в основе действия которых лежит метод индуктивно-резонансного переноса энергии [3]. В данных сенсорах FRET проявляется как динамический тип тушения флуоресценции донора и, соответственно, характеризуется снижением времени жизни донора в возбужденном состоянии [4]. По изменению параметров FRET можно проводить прямой мониторинг ферментативной активности, белок-белковых взаимодействий, изменения конформации белков и др. [5].

В настоящее время активно ведется разработка FRET-биосенсоров, где в качестве доноров и акцепторов используются флуоресцентные белки [б]. Экспрессия нуклеотидной последовательности флуоресцентных белков и субстрата каспазы-3 в единой рамке считывания является основой разработки генетически кодируемых сенсоров каспазной активности. Индуктивно-резонансный перенос энергии в данных сенсорах проявляется как динамический тип тушения флуоресценции донора и, соответственно, характеризуется снижением времени жизни донора в возбужденном состоянии. Гидролиз линкера, содержащего аминокислотную последовательность DEXD, специфически распознаваемой каспазой-3, приводит к физическому разделению донора и акцептора, в результате чего условия переноса энергии нарушаются и, соответственно, снимается тушение [7]. Данные сенсоры обладают преимуществами по сравнению с синтетическими флуорогенными субстратами. Это связано с тем, что генетически кодируемые сенсоры экспрессируются ' самой клеткой и не требуют внешней инъекции, кроме того они являются высокостандартизованными метками со строго определенными точками присоединения.

Тем не менее, проблема фонового сигнала клеток, связанная с автофлуоресценцией биомолекул и светорассеянием остается открытой. Для решения этой проблемы разрабатывают сенсоры на основе белков со спектром флуоресценции в красной и дальнекрасной области [8, 9, 10]. Другим подходом является использование в качестве доноров во БИЕТ-паре флуоресцирующих комплексов лантанидов с микро- и миллисекундным временем жизни в возбужденном состоянии [11]. При переносе энергии от донора-лантанида время жизни возбужденного состояния акцептора увеличивается на порядки по сравнению с естественным временем жизни флуоресценции [12].

РЯЕТ-пары на основе тербия в комплексе с генетически кодируемым тербий-связывающим пептидом и красным флуоресцентным белком имеют большое перекрывание спектра флуоресценции тербия и возбуждения красных флуоресцентных белков, что создает условия для эффективного переноса энергии. Использование спектроскопии с временной задержкой позволит избежать регистрации короткоживущего фонового сигнала клеток, что важно в условиях низкой интенсивности сигнала РЫЕТ-пары.

Цель работы: получение генетически кодируемых РКЕТ-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков БзКес12 и Та§КРР.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Арсланбаева, Ляйсан Равиловна

выводы

1. Впервые получены генетически кодируемые РКЕТ-пары на основе флуоресцентных белков ВэКес12 и Та§КРР, субстрата каспазы-3 и тербий-связывающего пептида: ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Оз11ес12 и Tb3+-CП-DEVD-TagRFP.

2. Продемонстрировано наличие двух процессов индуктивно-резонансного переноса энергии в обеих РЫЕТ-парах: от тербий-связывающего пептида к иону ТЬ3+, от иона ТЬ3+ к хромофорам флуоресцентных белков.

3. Определена эффективность переноса энергии от иона ТЬ3+ к хромофорам флуоресцентных белков, для белка ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Вз11ес12, она составила 28%, для белка ТЬ3+-СП-ОЕУБ-Та§Б^Р - 35%.

4. Показано, что добавление ЫаС1 в раствор с гибридными белками приводит к дезактивации возбужденного состояния ТЬ3+, и, как следствие, к снижению интенсивности флуоресценции и времени жизни ТЬ3+ в обеих ШЕТ-парах. Данный эффект предположительно связан с динамическим тушением флуоресеценции тербия ионами СГ.

5. Показано, что димерный субстрат ТЬ3+-СП-БЕУБ-Та§КРР подвергается гидролизу каспазой-3, что подтверждено методами фосфоресцентной спектроскопии и электрофореза.

6. В случае тетрамерного белка ТЬ3+-СП-ВЕУВ-Б511ес12 наблюдается отсутствие гидролиза каспазой-3 за исследуемый промежуток времени, что предположительно объясняется влиянием стерических факторов на доступ каспазы-3 к субстрату.

Заключение

Наиболее подходящим субстратом для in vivo определения активности каспазы-3 i i является субстрат ТЬ -СП-DE VD-TagRFP. Данная FRET-napa впервые получена на основе тербия в комплексе с тербий-связываюгцим пептидом и красного флуоресцентного белка TagRFP и является полностью генетически кодируемой. Это важно при использовании сенсора в живых и постоянно делящихся клетках, в связи с отсутствием необходимости внешней инъекции. С помощью данного FRET-сенсора можно эффективно снизить короткоживущий фоновый сигнал в живых клетках, что важно в условиях регистрации низкой интенсивности сигнала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арсланбаева, Ляйсан Равиловна, Москва

1. Mazumder S., Plesca D., Almasan A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis. Methods Mol. Biol., 2008, v. 414, pp. 13-21.

2. Meier P., Finch A., Evan G. Apoptosis in development. Nature, 2000, v. 407, pp. 796-801.

3. Forster Th. Delocalized Excitation and Excitation Transfer. -Modern Quantum Chemistry, ed. by Sinanoglu O. N.Y.: Academic Press, 1965, pp. 93-138.

4. Vogel S.S., Thaler C., Koushik S.V. Fanciful FRET. Sei. STKE, 2006,1. 331, re2.

5. Li I.T., Pham E., Truong K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol .Lett., 2006, v. 28, pp. 1971-1982.

6. Piston D.W., Kremers G.-J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. -Trends Biochem. Sei., 2007, v. 32, № 9, pp. 407-414.

7. Karasawa S., Araki T., Nagai T., Mizuno H., Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/ acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. -Biochem. J., 2004, v. 381, pp. 307-312.

8. Wu X., Simone J., Hewgill D., Siegel R., Lipsky P.E., He L. Measurement of Two Caspase Activities Simultaneously in Living Cells by a Novel Dual FRET Fluorescent Indicator Probe. -Cytometry Part A, 2006, v. 69A, pp. 477-486.

9. Shcherbo D., Souslova E.A, Goedhart J., Chepurnykh T.V, Gaintzeva A., Shemiakina I.l, Gadella T.WJ, Lukyanov S., Chudakov D.M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology, 2009, v. 9, i. 24, pp. 1-6.

10. Hemmil'a I., Laitala V. Progress in Lanthanides as Luminescent Probes. J. Fluoresc., 2005, v. 15, №4, pp. 529-542.

11. Horton R.A., Strachan E.A., Vogel K.W., Riddle S.M. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Anal. Biochem., 2007, v. 360, i. 1, pp. 138-143.

12. Thornberry N.A., Rano T.A., Peterson E.P., Rasperi D.M., Timkey T., Garcia-Calvo M.,

13. Houtzageri V.M., Nordstromi P.A., Royi S., Vaillancourti J.P., Chapman K.T., Nicholsoni D.W.

14. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme100

15. B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, i. 29, pp. 17907-17911.

16. Hoeppner D.J., Hengartner M.O., Schnabel R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature, 2001, v. 412, pp. 202-206.

17. Nicholson D.W, ICE/CED3-like proteases as therapeutic targets for the control of inappropriate apoptosis. Nat. Biotechnol., 1996, v. 14, pp. 297-301.

18. Blankenberg F.G. Monitoring of treatment-induced apoptosis in oncology with PET and SPECT. Curr. Pharm. Des., 2008, v. 14, pp. 2974-2982.

19. Tyas L., Brophy V.A., Pope A., Rivett A.J., Tavare J.M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO, 2000, v. 1, pp. 266270.

20. Morgan M.J., Thorburn A. Measurement of caspase activity in individual cells reveals differences in the kinetics of caspase activation between cells. Cell Death Differ., 2001, v. 8, pp. 38-43.

21. Chiang J.J, Truong K. Using co-cultures expressing fluorescence resonance energy transfer based protein biosensors to simultaneously image caspase-3 and Ca2+ signaling. Biotechnol. Lett., 2005, v. 27, № 16, pp. 1219-1227.

22. Luo K.Q., Yu V.C., Pu Y., Chang D.C. Measuring dynamics of caspase-8 activation in a single living HeLa cell during TNFalpha-induced apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, v. 304, № 2, pp. 217-222.

23. Tyas L., Brophy V.A., Pope A., Rivett A.J. and Tavare M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonanse energy transfer. EMBO Reports, 2000, v. 1, i. 3, pp. 266-270.

24. Lin J., Zhang Z., Yang J., Zeng S., Liu B.F., Luo Q. Real-time detection of caspase-2 activation in a single living HeLa cell during cisplatin-induced apoptosis. J. Biomed. Opt., 2006, v. 11, i. 2, 024011.

25. Mahajan N.P., Harrison-Shostak D.C., Michaux J., Herman B. Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal the activation of specific caspases during apoptosis. Chem. Biol., 1999, v. 6, i. 6, pp. 401-409.

26. Xu X., Gerard A.L.V., Huang Betty C.B., Anderson D.C., Payan D.G., Luo Y. Detection of programmed cell death using fluorescence energy transfer. Nucl. Acids Res., 1998, v. 26, № 8, pp. 2034-2035

27. Angres B., Steuer H., Weber P., Wagner M., Schneckenburger H. A Membrane-Bound FRET-Based Caspase Sensor for Detection of Apoptosis Using Fluorescence Lifetime and Total Internal Reflection Microscopy. Cytometry Part A, 2009, v. 75A, pp. 420-427.

28. Takemoto K., Nagai T., Miyawaki A., Miura M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. — J. Cell Biol., 2003, v. 160. i. 2, pp. 235-243.

29. Nagai T., Miyawaki A. A high-throughput method for development of FRET based indicators for proteolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, v. 319, pp. 72-77.

30. Xu X., Gerard A.L V., Huang B.C.B., Anderson D.C., Payan D.G., Luo Y. Detection of programmed cell death using fluorescence energy transfer. Nucl. Acids Res., 1998, v. 26, pp. 2034-2035.

31. Wang F., Chen T.-S., Xing D., Wang J.-J., Wu Y.-X. Measuring Dynamics of Caspase-3 Activity in Living Cells Using FRET Technique During Apoptosis Induced by High Fluence Low-Power Laser Irradiation. Lasers in Surgery and Medicine, 2005, v. 36, pp. 2-7.

32. Billinton N., Knight A.W. Seeing the Wood through the Trees: A Review of Techniques for Distinguishing Green Fluorescent Protein from Endogenous Autofluorescence. Anal. Biochem., 2001, v. 291, pp. 175-197.

33. Monici M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. -Biotechnol. Annu. Rev., 2005, v. 11, pp. 227-256.

34. Pawley J.B. Handbook of Biological Confocal Microscopy, third edition. New York: Springer Science Business Media, 2006.

35. Yuan J., Wang G. Lanthanide Complex-Based Fluorescence Label for Time-Resolved Fluorescence Bioassay. J. Fluoresc., 2005, v. 15, № 4, pp. 559-568.

36. Corrodi H., Jonsson G. The Formaldehyde Fluorescence Method for the Histochemical Demonstration of Biogenic Monoamines. J. Histochem. Cytochem., 1967, v. 15, № 2, pp. 6578.

37. Levenson R.M., Mansfield J.R. Multispectral Imaging in Biology and Medicine. Cytometry A., 2006, v. 69, pp. 748-758.

38. Aubin J.E. Autofluorescence of Viable Cultured Mammalian Cells. J. Histochem. Cytochem., 1979, v. 27, № 1, pp. 36-43.

39. Nokubo M., Ohta M., Kitani K., Nagy I. Identification of protein-bound riboflavin in rat hepatocyte plasma membrane as a source of autofluorescence. Biochim. Biophys. Acta., 1989, v. 981, i. 2, pp. 303-308.

40. Benson R.C., Meyer R.A., Zaruba M.E., McKhann G.M. Cellular Autofluorescence Is It Due To Flavins? - J. Histochem. Cytochem., 1979, v. 27, № 1, pp. 44-48.

41. Sewell W.F., Mroz E.A. Flavin adenine dinucleotide is a major endogenous fluorophore in the inner ear. Hear Res., 1993, v. 70, i. 2, pp. 131-138.

42. Galeotti T., van Rossum G.D., Mayer D.H., Chance B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. — Eur. J. Biochem., 1970, v. 17, i. 3, pp. 485-496.

43. Schneckenburger H., Gessler P., Pavenstàdt-Grupp I. Measurements of Mitochondrial Deficiencies in Living Cells by Microspectrofluorometry. J. Histochem. Cytochem., 1992, v. 40, № 10, pp. 1573-1578.

44. Gao G., Ollinger K , Brunk U T. Influence of intracellular glutathione concentration of lipofuscin accumulation in cultured neonatal rat cardiac myocytes. Free Radie. Biol. Med., 1994, v. 16, i. 2, pp. 187-194.

45. Wolman M. Lipid pigments (chromolipids): their origin, nature, and significant J. Pathobiol., 1980, v. 10, pp. 253-267.

46. Dowson J.H. The evaluation of autofluorescence emission spectra derived from neuronal lipopigment. J. Microsc., 1982, v. 128, pp. 261-270.

47. Yin D., Yuan X., Brunk U.T. Test-tube simulated lipofuscinogenesis. Effect of oxidative stress on autophagocytotic degradation. Mech. Ageing. Dev., 1995, v. 81, i. 1, pp. 37-50.

48. Katz M.L., EIdred G.E., Robison W.G. Lipofuscin autofluorescence: evidence for vitamin A involvement in the retina. Mech. Ageing. Dev., 1987, v. 39, i. 1, pp. 81-90.

49. Abiko T., Abiko A., Ishiko S., Takeda M., Horiuchi S., Yoshida A. Relationship between auto fluorescence and advanced glycation end products in diabetic lenses. Exp. Eye Res., 1999, v. 68, i. 3, pp. 361-366.

50. Sady C., Khosrof S., Nagaraj R. Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, v. 214, i. 3, pp. 793-797.

51. Sell D.R., Lapolla A., Odetti P., Fogarty J., Monnier V.M. Pentosidine formation in skin correlates with severity of complications in individuals with long-standing IDDM. Diabetes, 1992, v. 41, i. 10, pp. 1286-1292.

52. Bissonnette R., Zeng H., McLcan D.I., Schreiber W.E., Roscoe D.L., Lui H. Psoriatic plaques exhibit red autofluorescence that is due to protoporphyrin IX. J. Invest. Dermatol., 1998, v. Ill, i. 4, pp. 586-591.

53. He X.Q., Li S.W., Hu Y.S., Lin J.X. Microspectrofluorometric analysis of autofluorescence in the cell walls of Phyllostachys pubescens culm. Acta Bot. Sin., 1999, v. 41, pp. 711-714.

54. Donaldson L.A., Singh A.P., Yoshinaga A., Can K.T. Lignin distribution in mild compression wood of Pinus radiate. J. Bot., 1999, v. 77, i. 1, pp. 41-50.

55. Gunning B.E.S., Schwartz O. Confocal microscopy of thylakoid autofluorescence in relation to origin of grana and phylogeny in the green algae. J. Plant Physiol., 1999, v. 26, pp. 695-708.

56. Shaner N., Steinbach P., Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods, 2005, v. 2, № 12, pp. 905-909.

57. Roda A., Guardigli M., Michelini E., Mirasoli M. Nanobioanalytical luminescence: Fôrster-type energy transfer methods. Anal. Bioanal. Chem., 2009, v. 393, pp. 109-123.

58. Van de Lest C.H., Versteeg E.M., Veerkamp J.H., Van Kuppevelt T.H. Elimination of Autofluorescence in Immunofluorescence Microscopy with Digital Image Processing. J. Histochem. Cytochem., 1995, v. 43, i. 7, pp. 727-730.

59. Terpetschnig E., Szmacinski H., Malak H., Lakowicz J.R. Metal-Ligand Complexes as a New Class of Long-Lived Fluorophores for Protein Hydrodynamics. Biophys. J., 1995, v. 68, pp. 342-350.

60. Piszczek G. Luminescent metal-ligand complexes as probes of macromolecular interactions and biopolymer dynamics. Arch. Biochem. Biophys., 2006, v. 453, № 1, pp. 54-62.

61. Thibon A., Pierre V.C. Principles of lanthanide-based luminescent probes for cellular imaging. Anal. Bioanal. Chem., 2009, v. 394, pp. 107-120.

62. Rajapakse H.E., Reddy D.R,. Mohandessi S., Butlin N.G., Miller L.W. Luminescent terbium protein labels for time-resolved microscopy and screening. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, v. 48, i. 27, pp. 4990-4992.

63. Lissemore J.L., Jankowski J.T., Thomas C.B., Mascotti D.P., deHaseth P.L. Green fluorescent protein as a quantitative reporter of relative promoter activity in E. coli. -Biotechniques., 2000, v. 28, i. 1, pp. 82-84.

64. Galland P., Senger H. New trends in photobiology the role of flavins as photoreceptors. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1988, v. 1, pp. 277-294.

65. Cowen T., Haven A.J., Burnstock G. Pontamine sky blue: a counterstain for background autofluorescence in fluorescence and immunofluorescence histochemistry. Histochem., 1985, v. 82, i. 3, pp. 205-208.

66. Neumann M., Gabel D. Simple Method for Reduction of Autofluorescence in Fluorescence Microscopy. J. Histochem. Cytochem., 2002, v. 50, i. 3, pp. 437-439.

67. Miiller-Taubenberger A., Anderson K.I. Recent advances using green and red fluorescent protein variants. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, v. 77, i. 1, pp. 1-12.

68. Binnemans K. Lanthanide-Based Luminescent Hybrid Materials. Chem. Rev., 2009, v. 109, pp. 4283-4374.

69. Reisfeld R. Rare earth comlpexes in sol-gel glasses. Materials Science, 2002, v. 20, № 2, pp. 5-18.

70. Motson G., Fleming J., Brooker S. Potential applications for the use of lanthanide complexes as luminescent biolabels. Advan. Inorg. Chem., 2004,. v. 55, pp. 361-431.

71. Brunet E., Juanes O., Rodriguez-Ubis J.C. Supramolecularly Organized Lanthanide Complexes for Efficient Metal Excitation and Luminescence as Sensors in Organic and Biological Applications. Curr. Chem. Biol., 2007, v. 1, pp. 11-39.

72. Biinzli J.C. Luminescent Lanthanide Probes as Diagnostic and Therapeutic Tools. Met. Ions Biol. Syst, 2004, v. 42, pp. 39-75.84.http://las.perkinelmer.com

73. Lobnik A., Majeen N., Niederkiter K., Uray G. Optical pH sensor based on the absorption of antenna generated europium luminescence by bromothymolblue in a sol-gel membrane. Sens. Actuators, 2001, v. 74, pp. 200-206.

74. Brunet E., Juanes O., Rodriguez-Ubis J.С. Supramolecularly Organized Lanthanide Complexes for Efficient Metal Excitation and Luminescence as Sensors in Organic and Biological Applications. Curr. Chem. Biol., 2007, v. 1, pp. 11-39.

75. Berlman I.B. Energy transfer parameters of aromatic compounds. N.Y.: Academic Press, 1973, pp. 70-80.

76. Mathis G. Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera. -Clin. Chem., 1993, v. 39, pp. 1953-1959.

77. Selvin P.R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annu. Rev. Biophys. Biomembr., 2002, v. 31, pp. 275-302.

78. Weissman S.I. Intramolecular Energy Transfer The Fluorescence of Complexes of Europium. J. Chem. Phys., 1942, v. 10, pp. 214-217.

79. Balzani V. Photochemistry and luminescence of coordination compounds. J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 1990, v. 51, p. 55-62.

80. Whan R.E., Crosby G.A. Luminescence studies of rare earth complexes: Benzoylacetonate and dibenzoylmethide chelates. J. Mol. Spectrosc., 1962, v. 8, ii. 1-6, pp. 315-327.

81. Crosby G.A., Whan R.E., Alire R.M. Intramolecular Energy Transfer in Rare Earth Chelates. Role of the Triplet State. J. Chem. Phys., 1961, v. 34, pp. 743-748.

82. Crosby G.A., Whan R.E., Freeman J.J. Spectroscopic studies of rare earth chelates. J. Phys. Chem., 1962, v. 66, pp. 2493-2499.

83. Misra V., Mishra H. Photoinduced proton transfer coupled with energy transfer: Mechanism of sensitized luminescence of terbium ion by salicylic acid doped in polymer. J. Chem. Phys., 2008, v. 128, i. 24, pp. 244701.

84. Breen P.J., Hild E.K., Horrocks W.D.Jr. Spectroscopic studies of metal ion binding to a tryptophan-containing parvalbumin. Biochem. J., 1985, v. 24, i. 19, pp. 4991-4997.

85. Supkowski R.M., Bolender J.P., Smith W.D., Renyolds L.E.L., Horrocks W.D.Jr. Lanthanide Ions as Redox Probes of Long-Range Electron Transfer in Proteins. Coord. Chem. Rev., 1999, v. 185, pp. 307-319.

86. Lazarides Т., Sykes D., Faulkner S., Barbieri A., Ward M.D. On the Mechanism of d-f Energy Transfer in RuII/Lnlll and OsII/Lnlll Dyads: Dexter-Type Energy Transfer Over a Distance of 20 A. Chem. Eur. J., 2008, v. 14, pp. 9389-9399.

87. Мешкова С.Б., Кирияк А.В., Топилова З.М., Левшов С.М. Способы повышения чувствительности люминесцентного определения лантанидов с использованием их комлпексных соединений. Вюник Харктвського нацюнального ушверситету, 2008, вип. 16, №39, с. 59-75.

88. Eliseeva S.V., Bunzli J.-C.G. Lanthanide luminescence for functional materials and biosciences. Chem. Soc. Rev., 2010, v. 39, pp. 189-227.

89. Mukkala V.M., Takalo H., Liitti P., Kankare J., Kuusela S., Lonnberg H. Lanthanide chelates as a tool in nucleic Acid chemistry. Met. Based. Drugs, 1994, v. 1, ii. 2-3, pp. 201211.

90. Pandya S., Yu J., Parker D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans., 2006, pp. 2757-2766.

91. Savitsky A.P., Chydinov A.V., Krilova, S. M. 1995. Novel Fluorescent Chelate for Eu. Presented at the Advances in Fluorescence Sensing Technology II, San Jose С A 1995

92. Р-Дикетонаты металлов. M.: Наука, 1980, 217 с.

93. Va'zquez-Ibar J.L., Weinglass A.B., Kaback H.R. Engineering a terbium-binding site into an integral membrane protein for luminescence energy transfer. PNAS USA, 2002, v. 99, № 6, pp. 3487-3492.

94. Cotton S. Lanthanides and Actinides. Oxford University Press., New York., 1991.111 vBunzli J-C.G. Benefiting from the unique properties of lanthanides ions. — Acc. Chem. Res., 2006, v. 39, i. l,pp. 53-61.

95. MacManus J.P., Hogue C.W., Marsden B.J., Sikorska M., Szabo A.G. Terbium luminescence in synthetic peptide loops from calcium-binding proteins with different energy donors. J. Biol. Chem., 1990, v. 265, № 18, pp. 10358-10366.

96. Franz K.J., Nitz M., Imperiali B. Lanthanide-binding tags as versatile protein coexpression probes. ChemBioChem., 2003, v. 4, pp. 265-271.

97. Nitz M., Franz K.J., Maglathlin R.L., Imperiali B. Powerful combinatorial screen to identify high-affinity terbium(III)-binding peptides. ChemBioChem., 2003, v. 4, pp. 272-276.

98. Martin L.J., Sculimbrene B.R., Nitz M., Imperiali B. Rapid Combinatorial Screening of Peptide Libraries for the Selection of Lanthanide-Binding Tags (LBTs). QSAR Comb. Sei., 2005, № 10, pp. 1149-1157.

99. Nitz, M.; Sherawat, M.; Franz, K.J.; Peisach, E; Allen, K.N.; Imperiali, B. Structural origin of the high affinity of a chemically evolved lanthanide-binding peptide. Angew. Chem. Int. Ed. 2004,43,3682-3685.

100. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Beifrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 1975, v. 258, pp. 598-599.

101. Sculimbrene B.R., Imperiali B. Lanthanide-Binding Tags as Luminescent Probes for Studying Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc., 2006, v. 128, i. 22, pp. 7346-7352.

102. Reynolds A.M., Sculimbrene B.R., Imperiali B. Lanthanide-Binding Tags with Unnatural Amino Acids: Sensitizing Tb3+ and Eu3+ Luminescence at Longer Wavelengths. Bioconjugate Chem., 2008, v. 19, pp. 588-591.

103. Martin L.J., Hähnke M.J., Nitz M., Wöhnert J., Silvaggi N.R., Allen K.N., Schwalbe H., Imperiali B. Double-lanthanide-binding tags: design, photophysical properties, and NMR applications. J. Am. Chem. Soc., 2007, v. 129, i. 22, pp. 7106-7113.

104. Tyrell R.M., Keyse S.M. The interaction of UVA radiation with cultured cells. J. Photochem. Photobiol., 1990, v. 4, pp. 349-361.

105. Kaiser W., Garrett C.G.B. Two-Photon Excitation in CaF2: Eu2. Phys. Rev. Lett., 1961, v. 7, i. 6, pp. 229-231.

106. Singh S., Bradley L.T. Three-Photon Absorption in Naphthalene Crystals by Laser Excitation. Phys. Rev. Lett., 1964, v. 12, pp. 612-614.

107. Lim E.C. Excitcd states. N.Y.: Academic Press, 1977, pp 1-56.

108. Kliger D. Ultrasensitive laser spectroscopy. -N.Y.: Academic Press, 1983, pp. 109-174.

109. Shreve A.P., Trautman J.K., Owens T.G., Albrecht A.C. Two-photon excitation spectroscopy of thylakoid membranes from Phaeodactylum tricornutum: Evidence for an in vivo two-photon allowed carotenoid state. Chem. Phys. Lett., 1990, v. 170, pp. 51-56.

110. Pantell R. H., Pradere F., Hanus J., Schott M., Puthoff H. Theoretical and Experimental Values for Two, Three and Four Photon Absorption. J. Chem. Phys., 1967, v. 46, pp. 35073511.

111. Shreve A.P., Albrecht A.C. A three-photon fluorescence excitation study of the SO(Alg) to Sl(B2u) transition in neat liquid benzene. J. Chem. Phys., 1991, v. 94, pp. 5772-5773.

112. Denk W., Strickler J.H., Webb W.W. Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science, 1990, v. 248, № 4951, pp. 73-76.

113. Diaspro A., Bianchini P., Vicidomini G., Faretta M., Ramoino P., Usai C. Multi-photon excitation microscopy. Biomed. Eng Online, 2006, v. 5:36.

114. Guild J.B., Xu C., Webb W.W. Measurement of group velocity dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Appl. Opt., 1997, v. 36, pp. 397-401.

115. Konig K., So P.T.C., Mantulin W.W., Gratton E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Opt. Lett., 1997, v. 22, pp. 135-136.

116. Konig K., So P.T.C., Mantulin W.W., Tromberg B.J., Gratton E. Two-photon excited lifetime imaging of autofluorescence in cells during UVA and NIR photostress. J. Micros., 1996, v. 183, pp. 197-204.

117. Dunn K.W., Young P.A. Principles of Multiphoton Microscopy. Nephron Exp. Nephrol., 2006, v. 103, № 2, pp. e33-40.

118. Koenig K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc., 2000, v. 200, i. 2, pp. 83104.

119. Tauer U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Exp Physiol., 2002, v. 87, № 6, pp. 709-714.

120. Oheim M., Beaurepaire E., Chaigneau E., Mertz J., Charpak S. Two-photon microscopy in brain tissue: parameters influencing the imaging depth. J. Neurosci. Methods, 2001, v. 111, pp. 29-37.

121. Zipfel W.R., Williams R.M., Webb W.W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat. Biotechnol., 2003, v. 21, pp. 1369-1377.

122. Kim H. M., Cho B. R. Two-Photon Probes for Intracellular Free Metal Ions, Acidic Vesicles, And Lipid Rafts in Live Tissues. Acc. Chem. Res., 2009, v. 42, pp. 863-872.

123. Masters B.R., So P.T.C. Antecedents of Two-Photon Excitation Laser Scanning Microscopy. Microscopy Research and Technique, 2004, v. 63, pp. 3-11.

124. Lakowicz J.R., Piszczek G., Maliwal B.P., Gryczynski I. Multiphoton excitation of lanthanides. ChemPhysChem., 2001, v. 2, pp. 247-252.

125. Piszczek G., Maliwal B.P., Gryczynski I., Dattelbaum J., Lakowicz J.R. Multiphoton Ligand-Enhanced Excitation of Lanthanides. J. Fluoresc., 2001, v. 11, № 2, pp. 101-107.

126. White G.F., Litvinenko K.L., Meech S.R., Andrew D.L., Thompson AJ. Multiphoton-excited luminescence of a lanthanide ion in a protein complex: Tb bound to transferring. -Photochem. Photobiol. Sci., 2004, v. 3, pp. 47-55.

127. Luo L„ Lai W.P.-W., Wong K.-L., Wong W.-T., Li K.-F., Cheah K.-W. Green upconversion fluorescence in terbium coordination complexes. Chem. Phys. Lett., 2004, v. 398, pp. 372-376.

128. Wong K.L., Law G.L., Kwok W.M., Wong W.T., Phillips D.L. Simultaneous observation of green multiphoton upconversion and red and blue NLO processes from polymeric terbium(III) complexes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2005, v. 44, i. 22, pp. 3436-3439.

129. Law G.L., Wong K.L., Yang Y.Y., Yang H.L., Wong W.T,. Lam M.H., Tam H.L., Cheah K.W. Molecular switching in the near infrared (NIR) to visible/NIR f-f emission with a functional-lanthanide complexes. J. Fluoresc., 2008, v. 18, ii. 3-4, pp. 749-752.

130. Law G.L., Kwok W.M., Wong W.T., Wong K.L., Tanner P.A. Terbium luminescence sensitized through three-photon excitation in a self-assembled unlinked antenna. J. Phys. Chem. B., 2007, v. lll,i. 37, pp. 10858-10861.

131. Palsson L.O., Pal R., Murray B.S., Parker D., Beeby A. Two-photon absorption and photoluminescence of europium based emissive probes for bioactive systems. Dalton Trans., 2007, v. 48, pp. 5726-5734.

132. D'Aleo A., Pompidor G., Elena B.5 Vicat J., Baldeck P.L., Toupet L., Kahn R., Andraud C., Maury O. Two-photon microscopy and spectroscopy of lanthanide bioprobes. Chemphyschem., 2007, v. 8, i. 14, pp. 2125-2132.

133. Law G.L, Wong K.L, Man C.W.Y, Wong W.T, Tsao S.W, Lam M.H.W, Lam P.K.S. Emissive terbium probe for multiphoton in vitro cell imaging. J. Am. Chem. Soc., 2008, v. 130, i. 12, pp. 3714-3715.

134. Selvin P.R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat. Struct. Biol., 2000, v. 7, № 9, pp. 730-734.

135. Selvin P.R. Fluorescence Resonance Energy Transfer. Methods Enzymol., 1995, v. 246, pp. 300-334.

136. Giordano L., Jovin T.M., Irie M., Jares-Erijman E.A. Diheteroarylethenes as Thermally Stable Photoswitchable Acceptors in Photochromic Fluorescence Resonance Energy Transfer (pcFRET). J. Am. Chem. Soc., 2002, v. 124, № 25, pp. 7481-7489.112

137. Yun С., You J., Kim J., Huh J., Kim E. Photochromic fluorescence switching from diarylethenes and its applications. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews, 2009, v. 10, i. 3, pp. 111-129.

138. Ефремов E.C., Филатова М.П., Реутова Т.О., Степанова JI.H., Рейссман 3., Иванов В.Т. Конформационные состояния брадикинина и его аналогов в растворах, II. спектры флуоресценции. Биоорганическая химия, 1977, т. 3, № 9, с. 1169-1180.

139. Kohen Е., Hirschberg J.G., Ploem J.S. FRET microscopy: Digital imaging of fluorescence resonance energy transfer. Application in cell biology. In: Cell Structure and Function by Micro spectra fluometry. London: Academic Press, 1989, pp. 99-117.

140. Madan R., Satyajit M. Use of Forster's resonance energy transfer microscopy to study lipid rafts. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, pp. 221-233.

141. Torres Т., Levitus M. Measuring conformational dynamics: A new FCS-FRET approach. -J. Phys. Chem., 2007, v. 111, № 25, pp. 7392-7400.

142. Olwin B.B., Keller C.H., Storm D.R. Interaction of a fluorescent N-dansylaziridine derivative of troponin I with calmodulin in the absence and presence of calcium. Biochemistry, 1982, v. 21, pp. 5669-5675.

143. Chapman, E.R., Alexander K., Vorherr Т., Carafoli E., Storm D.R. Fluorescence energy transfer analysis of calmodulin-peptide complexes. Biochemistry, 1992, v. 31, pp. 12819— 12825.

144. Shotten D.M. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens. J. Cell Sci., 1989, v. 94, pp. 175-206.

145. Gordon G.W., Berry G., Liang X. H., Levine В., Herman B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys. J., 1998, v. 74,pp. 2702-2713.

146. Giordano L., Vermeij R.J., Jares-Erijman E.A. Synthesis of indole-containing diheteroarylethenes. New probes for photochromic FRET (pcFRET). ARKIVOC, 2005, v. 12, pp. 268-281.

147. Song L., Jares-Erijman E.A., Jovin T.M. A photochromic acceptor as a reversible light-driven switch in fluorescence resonance energy transfer (FRET). J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 2002, v. 150, ii. 1-3, № 26, pp. 177-185.

148. Schiller P.W. Study of Adrenocorticotropic Hormone Conformation by Evaluation of Intramolecular Resonance Energy Transfer in N-Dansyllysine21- ACTH-(l-24)-Tetrakosipeptide. PNAS USA, 1972, v. 69, № 4, pp. 975-979.

149. Miller J.N. Fluorescence energy transfer methods in Bioanalysis Analyst, 2005, v. 130, pp. 265-270.

150. Berney C., Danuser G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical J., 2003, v. 84, pp. 3992-4010.

151. Van Munster E.B., Gadella T.W. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Adv. Biochem. Eng. Biotechnol, 2005, v. 95, pp. 143-175.

152. Wallrabe H., Periasamy A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. -Curr. Opin. Biotechnol., 2005, v. 16, pp. 19-27.

153. Remaut K., Lucas В., Braeckmans K., Sanders N.N., De Smedt S.C., Demeester J. FRET-FCS as a tool to evaluate the stability of oligonucleotide drugs after intracellular delivery. J. Control Release, 2005, v. 103, i. 1, pp. 259-271.

154. Wallace M.I., Ying L., Balasubramanian S., Klenerman D. FRET fluctuation spectroscopy: exploring the conformational dynamics of a DNA hairpin loop. J. Phys. Chem. B, 2000, v. 104, №48, pp. 11551-11555.

155. Eggeling C., Jager S., Winkler D., Kask P. Comparison of different fluorescence fluctuation methods for their use in FRET assays: monitoring a protease reaction. Curr. Pharm. Biotechnol., 2005, v. 6, i. 5, pp. 351-371.

156. Gratton E., Breusegem S., Barry N., Ruan Q., Eid J. Fluctuation Correlation Spectroscopy in Cells: Determination of molecular aggregation. Biophotonics, 2005, pp. 1-14.

157. Mann T.L., Krull U.J. Fluorescence polarization spectroscopy in protein analysis. -Analyst., 2003, v. 128, pp. 313-317.

158. Mattheyses A.L., Hoppey A.D., Axelrod D. Polarized Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy. Biophys. J., 2004, v. 87, pp. 2787-2797.

159. Levitt J.A., Matthews D.R., Ameer-Beg S.M., Suhling K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol., 2009, v. 20, № 1, pp. 2836.

160. Gautier I., Tramier M., Durieux C., Coppey J., Pansu R. В., Nicolas J. C., Kemnitz K., Coppey-Moisan M. Homo-FRET microscopy in living cells to measure monomer-dimer transition of GFP-tagged proteins. Biophys. J., 2001, v. 80, pp. 3000-3008.

161. Runnels L.W., Scarlata S.F. Theory and application of fluorescence homotransfer to melittin oligomerization. Biophys. J., 1995, v. 69, pp. 1569-1583.

162. Tramier M, Coppey-Moisan M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods Cell Biol., 2008, v. 85, pp. 395-414.

163. Rizzo M.A., Piston D.W. High-contrast imaging of fluorescent protein FRET by fluorescence polarization microscopy. Biophys. J., 2005, v. 88, pp. L14-L16.

164. Matsuya Т., Hoshino N., Okuyama T. Curr. Anal. Chem., 2006, 2, i. 4, pp. 397-410.

165. T. Nishioka, K. Fukui and K. Matsumoto, in Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths, ed. K. A. Gschneidner, Jr, J.-C. G. Bu. nzli and V. K. Pecharsky, Elsevier Science B.V., Amsterdam, 2007, vol. 37.

166. Spangler C.M., Spangler C., Schaerling M. Luminescent Lanthanide Complexes as Probes for the Determination of Enzyme Activities. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2008, v. 1130, pp. 138-148.

167. Bunzli J.-C.G. Lanthanide Luminescent Bioprobes (LLBs). Chem. Lett., 2009, v. 38, pp. 104-108.

168. Hovinen J., Guy P.M. Bioconjugation with Stable Luminescent Lanthanide(III) Chelates Comprising Pyridine Subunits. Bioconjug Chem., 2008, v. 20, i. 3, pp. 404-421.

169. Connally R.E., Piper J.A. Time-gated luminescence microscopy. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2008, v. 1130, pp. 106-116.

170. Vereb G., Jares-Erijman E., Selvin P.R., Jovin T.M. Temporally and spectrally resolved imaging microscopy of lanthanide chelates. Biophys. J., 1998, v. 74, i. 5, pp. 2210-2222.

171. Bunzli J.-C.G., Chauvin A.-S., Vandevyver C.D.B., Song В., Comby S. Lanthanide Bimetallic Helicates for in Vitro Imaging and Sensing. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2008, v. 1130, pp. 97-105.

172. Montgomery C.P., Murray B.S., New E.J., Pal R., Parker D. Cell-penetrating metal complex optical probes: targeted and responsive systems based on lanthanide luminescence. — Acc. Chem. Res., 2009, v. 42, i. 7, pp. 925-937.

173. Song В., Wang G., Tan M., Yuan J. A Europium(ln) Complex as an Efficient Singlet Oxygen Luminescence Probe. J. Am. Chem. Soc., 2006, v. 128, pp. 13442-14450.

174. Soini E., Hemmila I. Fluoroimmunoassay-present status and key problems. Clin. Chem., 1979, v. 25, i. 3, pp. 353-361.

175. Hemmila I., Mukkala V.M. Time-resolution in fluorometry technologies, labels, and applications in bioanalytical assays. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 2001, v. 38, i. 6, pp. 441-519.

176. Steinkamp Т., Karst U. Detection strategies for bioassays based on luminescent lanthanide complexes and signal amplification. Anal. Bioanal. Chem., 2004, v. 380, № 1, pp. 24-30.

177. Vazquez-Ibar J.L., Weinglass A.B., Kaback H.R. Engineering a terbium-binding site into an integral membrane protein for luminescence energy transfer. PNAS USA, 2002, v. 99, i. 6, pp. 3487-3492.

178. Rajapakse H.E., Reddy D.R., Mohandessi S., Butlin N.G., Miller L.W. Luminescent Terbium Protein Labels for Time-Resolved Microscopy and Screening. Angew. Chem. Int. Ed., 2009, v. 48, pp. 4990 -4992.

179. Савицкий А.П., Папковский Д.Б., Пономарев T.B., Березин И.В. Фосфоресцентный иммуноанализ. Металлопорфирины альтернатива редкоземельным флуоресцентным меткам. - Докл. АН СССС, 1989, т.304, № 4, с.1005-1008.

180. Савицкий А.П., Папковский Д.Б., Флуоресцентный иммуноанализ. Порфирины -новый тип меток для иммуноанализа. Докл. АН СССР, 1987, т. 293, вып. 3, с. 744-745.

181. Kronick M.N. The use of phycobiliproteins as fluorescent labelsin immunoassays. J. Immunol. Methods, 1986, v. 92, pp.1-13.

182. Miller J.N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis. Analyst, 2005, v. 130, pp. 265-270.

183. Yeh S.W., Ong L.J., Glazer A.N., Clark J.H. Fluorescence properties of allophycocyanin and a crosslinked allophycocyanin trimer. Cytometry, 1987, v. 8, pp. 91-95.

184. Degorce F., Card A., Soh S., Trinquet E., Knapik G.P., Xie B. HTRF: A Technology Tailored for Drug Discovery -A Review of Theoretical Aspects and Recent Applications. Curr. Chem. Genomics, 2009, v. 3, pp. 22-32.

185. Kupcho K.R., Stafslien D.K., DeRosier T., Hallis T.M., Ozers M.S., Vogel K.W. Simultaneous Monitoring of Discrete Binding Events Using Dual-Acceptor Terbium-Based LRET. J. Am. Chem. Soc., 2007, v. 129, i. 44, pp 13372-13373.

186. Kokko T., Kokko L., Soukka T. Terbium(III) Chelate as an Efficient Donor for Multiple-Wavelength Fluorescent Acceptors. J. Fluoresc., 2009, v. 19, pp. 159-164.

187. Zhong W. Nanomaterials in fluorescence-based biosensing. Anal. Bioanal. Chem., 2009, v. 394, pp. 47-59.

188. Sandtner W., Bezanilla F., Correa A.M. In Vivo Measurement of Intramolecular Distances Using Genetically Encoded Reporters. Biophys. J., 2007, v. 93, i. 9, pp. 45-47.

189. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol., 1962, v. 59, pp. 223-239.

190. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 1992, v. 111, pp. 229-233.

191. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. PNAS USA, 1994, v. 91, pp. 12501-12504.

192. Delagrade S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. Biotechnology, 1995, v. 13, pp. 151-154.

193. Ormy M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 1996, v. 273, pp. 1392-1395.

194. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem., 1998, v. 67, pp. 509-544.

195. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol., 1999, v. 17, pp. 969-973.

196. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., Lukyanov S.A. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence. FEBS Lett., 2000, v. 479, pp. 127-130.

197. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2002, v. 99, pp. 4256-4261.

198. Морозова E.C., Верхуша В.В., Перский Е.Э. Флуоресцентные белки красной спектральной области. Вюник Харшвського нащонального ушверситету iMem В.Н.Каразша, 2009, вип. 9, №856.

199. Зубова Н., Савицкий А.П. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. Успехи биологической химии, 2005, т. 45, с. 391454.

200. VanEngelenburg В., Palmer А.Е. Fluorescent biosensors of protein function. Curr. Opin. Chem. Biol., 2008, v. 12, pp. 1-6.

201. Tainaka K., Sakaguchi R., Hayashi H., Nakano S., Liew F.F., Morii T. Design Strategies of Fluorescent Biosensors Based on Biological Macromolecular Receptors. Sensors, 2010, v. 10, pp.1355-1376.

202. Morris M.C. Fluorescent Biosensors of Intracellular Targets from Genetically Encoded Reporters to Modular Polypeptide Probes. Cell Biochem. Biophys., 2010, v. 56, pp. 19-37.

203. Remington S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Curr. Opin. Struct. Biol., 2006, v. 16, i. 6, pp. 714-721.118

204. Morris M.C. Fluorescent Biosensors of Intracellular Targets from Genetically Encoded Reporters to Modular Polypeptide Probes. Cell Biochem. Biophys., 2010, v. 56, pp. 19-37.

205. Zimmer M. Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior. Chem. Rev., 2002, v. 102, i. 3, pp. 759-781.

206. Ormô M, Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea Victoria green fluorescent protein. Science, 1996, v. 273, pp. 1392-1395.

207. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N.Jr. The molecular structure of green fluorescent protein. -Nat. Biotechnol., 1996, v. 14, pp. 1246-1251.

208. Martin L-J. Development of LBTs as Powerfull and Versatile Peptides for use in Studies of Protein and Protein Interactions: doctoral thesis. Massachussets. 2008. 185 p.

209. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol., 1999, v. 17, pp. 969—973.

210. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. PNAS, 2000, v. 97, pp. 2211990-2211995.

211. Wang Y., Shyy J.Y.-J., Chien S. Fluorescence Proteins, Live-Cell Imaging, and Mechanobiology: Seeing Is Believing. Annu. Rev. Biomed. Eng., 2008, v. 10, pp. 1-38.

212. Miyawaki A. Green fluorescent protein-like proteins in reef Anthozoa animals. Cell Struct Funct. 2002, v. 5, pp. 343-347.245. http://www.pdb.org

213. Strack R.L., Strongin D.E., Bhattacharyya D., Tao W., Berman A., Broxmeyer H.E., Keenan R.J., Glick B.S. A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat. Methods, 2008, v. 5, i. 11, pp. 955-957.

214. Bevis B.J., Glick B.S. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat. Biotechnol., 2002, v. 20, pp. 83-87.

215. Strack R.L., Strongin D.E., Bhattacharyya D., Tao W., Berman A., Broxmeyer H.E., Keenan R.J., Glick B.S. A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat. Methods, 2008, v. 5, i. 11, pp. 955-957.

216. Kredel S., Oswald F., Nienhaus K., Deuschle K., Rocker C., Wolff M., Heilker R., Nienhaus G.U., Wiedenmann J. mRuby, a Bright Monomeric Red Fluorescent Protein for Labeling of Subcellular Structures. PLoS ONE, 2009, v. 4, i. 2, pp. 1-7.

217. Sato Y., Igarashi Y., Hakamata Y., Murakami T., Kaneko T., Takahashi M., Seo N., Kobayashi E. Establishment of Alb-DsRed2 transgenic rat for liver regeneration research. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, v. 311, pp. 478-481.

218. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. PNAS USA, 2001, v. 98, i. 2, pp. 462-467.

219. Robers M.B., Machleidt T., Carlson C.B., Bi K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay Drug. Dev. Technol.,2008, v. 6, i. 4, pp. 519-529.

220. Carlson C.B., Robers M.B., Vogel K.W., Machleidt T. Development of LanthaScreen cellular assays for key components within the PI3K/AKT/mTOR pathway. J. Biomol. Screen.,2009, v. 14, i. 2, pp. 121-132.

221. Carlson C.B., Mashock M.J., Bi K. BacMam-enabled LanthaScreen cellular assays for PI3K/Akt pathway compound profiling in disease-relevant cell backgrounds. J. Biomol. Screen., 2010, v. 15, i. 3, pp. 327-334.

222. Vuojola J., Lamminmaki U., Soukka T. Resonance energy transfer from lanthanide chelates to overlapping and nonoverlapping fluorescent protein acceptors. Anal. Chem., 2009, v. 81, i. 12, pp. 5033-5038.

223. Laitala V., Hemmilla I. Homogeneous Assay Based on Anti-Stokes' Shift Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy-Transfer Measurement. Anal. Chem., 2005, v. 77, i. 5, pp 1483-1487.

224. Kokko L., Sanberg K., Lovgren T., Soukka T. Europium(III) chelate -dyed nanoparticles as donors in a homogeneous proximity-based immunoassay for estradiol. Anal. Chim. Acta, 2004, v. 503, pp. 155-162.

225. Appelblom H., Nurmi J., Soukka T., Pasternack M., Penttila K.E., Lovgren T., Niemela P. Homogeneous TR-FRET High-Throughput Screening Assay for Calcium-Dependent Multimerization of Sorcin. J. Biomol. Screen., 2007, v. 12, № 6, pp. 842-848.

226. Wang G., Yuan J., Hai X., Matsumoto K. Homogenous Time-resolved Fluroimmunoassay of 3,5,3-triiodo-L-thyronine in Human Serum by Using Europium Fluorescence Energy Transfer. Talanta, 2006, v. 70, i. 1, pp. 133-138.

227. Heyduk T., Heyduk E. Luminescence Energy Transfer with Lanthanide Chelates: Interpretation of Sensitized Acceptor Decay Amplitudes. Anal. Biochem., 2001, v. 289, i. 1, pp. 60-67.

228. Chen Y., Lehrer S.S. Distances between Tropomyosin Sites Across the Muscle Thin Filament Using Luminescence Resonance Energy Transfer: Evidence for Tropomyosin Flexibility. Biochemistry, 2004, v. 43, № 36, pp. 11491-11499.

229. Sueda S., Yuan J., Matsumoto K. A homogeneous DNA hybridization system by using a new luminescence terbium chelate. Bioconjugate Chem., 2002, v. 13, pp. 200-205.

230. Nurmi J., Wikman T., Karp M., Lovgren T. High-Performance Real-Time Quantitative RT-PCR Using Lanthanide Probes and a Dual-Temperature Hybridization Assay. Anal. Chem., 2002, v. 74, pp. 3525-3532.

231. Mathis G. Probing molecular interactions with homogeneous techniques based on rare earth cryptates and fluorescence energy transfer. Clin. Chem., 1995, v. 41, pp. 1391-1397.

232. Laitala V., Ylikoski,A., Raussi H.M., Ollikka P., Hemmila I. Time-resolved detection probe for homogeneous nucleic acid analyses in one-step format. — Anal. Biochem., 2007, v. 361, pp. 126-131.

233. Guo W., Urizar E., Kralikova M., Mobarec J.C., Shi L., Filizola M., Javitch J.A. Dopamine D2 receptors form higher order oligomers at physiological expression levels. EMBO J., 2008, v. 27, № 17, pp. 2293-2304.

234. Wang J., Norcross M. Dimerization of chemokine receptors in living cells: key to receptor function and novel targets for therapy. Drug Discov. Today, 2008, v. 13, ii. 13-14, pp. 625-632.

235. Dodeller F., Gottar M., Huesken D., Iourgenko V., Cenni B. The lysosomal transmembrane protein 9B regulates the activity of inflammatory signaling pathways. J. Biol. Chem., 2008, v. 283, №31, pp. 21487-21494.

236. Goedken E.R., Gagnon A.I., Overmeyer G.T., Liu J., Petrillo R.A., Burchat A.F., Tomlinson M.J. HTRF-based assay for microsomal prostaglandin E2 synthase-1 activity. J. Biomol. Screen., 2008, v. 13 № 7, pp. 619-625.

237. Lopez-Crapez E., Bazin H., Andre E., Noletti J., Greinier J., Mathis G. A homogeneous europium cryptate-based assay for the diagnosis of mutations by time-resolved luminescence resonance energy transfer. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, p.1-10.

238. Sambrook J., Fritisch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. -N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

239. Yanisch-Perron C., Vieira ,J, Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 1985, v. 33, i. 1, pp. 103-119.

240. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature (London), 1970, v. 227, pp. 680-685.

241. Nitz M., Franz K.J., Maglathlin R.L., Imperial! B. A powerful combinatorial screen to identify high-affmity terbium(III)-binding peptides. Chembiochem., 2003, v. 4, pp. 272-276.

242. Karasawa S., Araki Т., Nagai Т., Mizuno H., Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem. J., 2004, v. 381, i. 1, pp. 307-312.290. www.neb.com

243. Subach F.V., Patterson G.H., Renz M., Lippincott-Schwartz J., Verkhusha V.V. Bright monomelic photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J. Am. Chem. Soc., 2010, v. 132, pp. 6481-6491.

244. Angres В., Steuer H., Weber P., Wagner M., Schneckenburger H. A Membrane-Bound FRET-Based Caspase Sensor for Detection of Apoptosis Using Fluorescence Lifetime and Total Internal Reflection Microscopy. Cytometry Part A, 2009, v. 75A, pp. 420-427.123

245. Parker D., Williams J.A.G. The lanthanides and their interrelations with biosystems. Metal ions in biological systems, 2003, v. 40, pp. 262-264.

246. Основы ферментативной кинетики. Корниш-Боуден Э. М: Мир, 1979.

247. Mendoza-Alvarez H., Alvarez-Gonzalez R. Poly(ADP-ribose) polymerase is a catalytic dimer and the automodification reaction is intermolecular. J. Biol. Chem., 1993, v. 268, pp. 22575-22580.

248. Lozanov, V., Ivanov, I.P., Benkova, В., and Mitev, V. (2009) Amino Acids, 36, 581-586.

249. Lien, S., Pastor, R., Sutherlin, D., and Lowman, H.B. (2004) Protein J., 23, 413-425.

250. Sun, J., Bottomley, S.P., Kumar, S., and Bird, P.I. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 238, 920-924.

251. Garcia-Calvo, M., Peterson, E.P., Rasper, D.M., Vaillancourt, J.P., Zamboni, R., Nicholson, D.W., and Thornberry, N.A. (1999) Cell Death Differ., 6, 362-369.

252. Chiang J.J.-H., Truong K. Computational Modeling of a New Fluorescent Biosensor for Caspase Proteolytic Activity Improves Dynamic Range. IEEE Trans. Nanobioscience, 2006, v. 5, № 1, pp. 41-45.

253. Tawa P., Tam J., Cassady R., Nicholson D.W., Xanthoudakis S. Quantitative analysis of fluorescent caspase substrate cleavage in intact cells and identification of novel inhibitors of apoptosis. Cell Death Differ., 2001, v. 8, pp. 30-37.

254. Lin J., Zhang Z., Yang J., Zeng S., Liu B.F., Luo Q. Real-time detection of caspase-2 activation in a single living HeLa cell during cisplatin-induced apoptosis. J. Biomed. Opt., 2006, v. 11, i. 2, 024011.