Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности

Битуева, Анна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности"

На правах рукописи

Битуева Анна Викторовна

ПОЛУЧЕНИЕ БИОРЕГУЛЯТОРА ИЗ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ХАРАКТЕРИСТИКА ЕГО ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ-2003

Работа выполнена в Проблемной научно-исследовательской лаборатории Восточно-Сибирского государственного технологического \ нппсрсшсм

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Аниупова Татьяна Петровна

доктор биологических наук Ажунова Татьяна Александровна

Ведущая организация: Бурятский государственный университет

Защита диссертации состоится "4" декабря 2003 г. в 14 часов на заседании Регионального диссертационного совета ДМ 212.039.02 в ВосточноСибирском государственном технологическом университете по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан "30 " октября 2003 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор технических наук асН^вб'ъ^- Н.И. Хамнаева

2оо£-/[ (7 J go

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лк iMiocib юмы В насгоятсе время прооюма шкешжж.к'ння иммунологических нарушений с помощью иммунокоррширующи.ч средств несомненна. Это обусловлено снижением иммунологической реактивности организма современного человека в целом и, как следствие повышением острой и хронической заболеваемости, связанной с условно-патогенными микроорганизмами (P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1999; В.В. Чиркин, 1999).

Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы -создание иммуностимуляторов на основе эндогенных биологически активных веществ. Из всей совокупности биологически активных веществ большое внимание привлекают регуляторные пептиды, содержащиеся в различных тканях организма и принимающие участие в межклеточном взаимодействии (Г.М. Яковлев и др., 1992; О.А Гомазков., 1999; В.Т. Иванов, 2000). К настоящему времени подобные по природе, но отличающиеся по функциональной активности пептиды выделены практически из всех органов и тканей: они нетоксичны, применяются в небольших дозах и обладают высокой биологической и лечебной активностью.

Важную роль в качестве продуцентов биологически активных пептидов играют органы иммунной системы. На сегодняшний день достаточно хорошо изучены пептидные препараты из тимуса (В.Я. Арион, 1981; В.Г Морозов, В.Х Хавинсон, 1999, 2000), костного мозга (Р.В. Петров, А.А Михайлова и соавт., 1999. 2000), селезенки (А.П. Горбунов, В.В Масанская, 1991.; А.Б. Цыпин, и др. 1993) лимфатических узлов (Г.Р. Жгенти и др., 1995, 1996; В.И. Новиков др., 1990, 1992), применяемые как препараты медицинского назначения. С развитием нового научно-прикладного направления - фармаконутрициологии возникла необходимость разработки новых технологий биологически активных регуляторов, по внешнему виду относящихся к фармпрепаратам, а по содержанию и возможности массового применения - к пище (В.А. Тутельян и др., 1999, С.К. Панюшин, Г.А. Угадчиков, 2002).

Исходя из вышесказанного, представлялось важным выделение биологически активных веществ с совокупными свойствами эндогенных биостимуляторов из органов иммунной системы животных (в частности, из лимфатических узлов).

Исследования, представленные в диссертационной работе, выполнены в соответствии с заданием «Разработать способы получения и использования вторичных источников местного сырья животного и растительного происхождения в качестве иммунопротекторов» на период с 1996 по 2000 гг. по программе «Бурятия. Няуь-а и трунмга ?nnn»

(РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

» Оэ" vSjjifäfe

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Государственная поддержка интеграции высшего обраювания и фчи.мченгл и,нои начни» 01 22.07 200> I №3»(К)? 1600

Цели и щачи исследований. Целью насюящих исследований явилась разработка биологически активного средства на основе регуляторных пептидов из лимфатических узлов крупного рогатого скота и выявление возможности его использования для коррекции иммунодефицитных состояний.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие

задачи:

1. Выделить пептидные фракции из лимфатических узлов крупного рогатого скота и исследовать их биологическую активность.

2. Изучить влияние нового биорегулятора на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа экспериментальных животных на модели иммунодепрессивного состояния.

3. Оценить нейротропную активность полученного биологически активного средства.

4. Оценить качество и безопасность биорегулятора по микробиологическим и токсикологическим показателям.

5. Разработать технологическую схему получения биорегулятора.

Научная новизна работы.

Впервые на основе биологически активных факторов лимфатических узлов крупного рогатого скота получен новый биорегулятор (АФЛ-2).

Впервые были оценены иммуномодулирующие свойства биологически активного средства «АФЛ-2». Изучено органотропное действие цитомединов, входящих в состав «АФЛ-2», при оценке морфофункционального состояния лимфатических узлов экспериментальных животных. Установлена нейротропная активность «АФЛ-2» на лабораторных животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии.

Создана технология получения сублимированного порошка биологически активного средства «АФЛ-2».

Новизна исследования подтверждена приоритетной справкой на заявку № 2003114957 от 21 мая 2003 г. о выдаче патента РФ «Способ получения иммуномодулятора».

Практическое значение.

Полученные данные позволяют рекомендовать иммуномодулятор «АФЛ-2» в качестве биологически активной добавки к пище и для создания новых продуктов лечебно-профилактического назначения. Результаты работы включены в материалы учебных занятий по биологической химии и

■ЧИР»'- -

иммунологии на медицинском факультете Бурятского государственного университета.

Основные по.юлсния. ныноснмыс н<| ¡¡нщпу

1. Выделены пептидные фракции из лимфатических узлов крупного рогатого скота.

2. АФЛ-2 восстанавливает показатели клеточно-опосредованных реакций иммунной системы, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета, функции нервной системы при экспериментальной азатиоприновой иммуносупрессии.

3. Исследована токсичность, безопасность и биологическая активность биорегулятора в зависимости от условий и сроков хранения в соответствии с нормативными требованиями.

4. Разработана технология получения сублимированной формы биорегулятора АФЛ-2.

Апробация работы: основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

• ежегодных научно-практических конференциях Восточно-

Сибирского государственного технологического университета по секции "Химия биологически активных веществ" (Улан-Удэ, 2000, 2001, 2003); научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ 2001; 2003); Международной конференции молодых ученых "От фундаментальной науки к новым технологиям" (Москва-Тверь, 2001); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах», (Улан-Удэ, 2002); 2-й Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, 2002); 1-м Международном Конгрессе «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); на 1 съезде лимфологов России (Москва, 2003); Международной научной конференции "Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных", поев. 90-летию профессора В.Р. Филиппова (Улан-Удэ, 2003); Международной научной конференции «Медицинские, социальные и экономические проблемы сохранения здоровья населения» (Турция, г. Анталия, 2003); Международной научной конференции «Актуальные проблемы морфологии» (Красноярск, 2003).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных

исследований. и\ обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 15 таблицами. Список ниер.тры включаем 205 истчникон ои-чссжсннои и иное iранной л итераторы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводились на двух видах лабораторных животных: 1) половозрелых мышах (самцах) линии СВА и гибридах F, (СВАхС57В!/6) массой 20-22 г; 2) морских свинках (самцах) массой 150-200 г.

В работе были использованы: биологически активная фракция лимфатических узлов крупного рогатого скота (АФЛ-2); азатиоприн в концентрациях 50 мг/кг в реакциях in vivo и 500 мкг/мл - in vitro.

За основу выделения биологически активных пептидов лимфоузлов была принята модифицированная в Проблемной научно-исследовательской лаборатории методика В.Я. Ариона (1982). Содержание белка в полученной фракции определяли по методу Лоури (1951). Нами были исследованы дозы АФЛ-2 - 10, 100, 1000 мкг/кг массы животного. Фракцию вводили перорально ежедневно в течение 7 дней.

Экспериментальное изучение клеточного звена иммунитета проводили в реакциях: "трансплантат против хозяина" (РТПХ) по В.Н. Тессеневу (1979), гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ (Р.В. Петров и др., 1987). Исследование активности антигенспецифических Т-супрессоров антителообразования проводили в соответствии с Методическими рекомендациями ... (1989). Гуморальный иммунный ответ оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых с использованием модифицированного (A.J. Cunningham, 1965) метода, предложенного N. Jerne, A. Nordin (1963). Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей в отношении Staphylococcus aureus исследовали по методике, описанной И.С. Фрейдлин (1976). Исследование антигенпрезентирующей функции макрофагов проводили согласно методическим рекомендациям (Э. А. Имельбаева, 1996).

Для гистоморфологических исследований лимфатические узлы мышей фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине с последующей стандартной спиртовой проводкой и заливали в парафин (Г.А. Меркулов, 1961). Из парафиновых блоков приготовляли срезы толщиной 4-6 мкм, которые окрашивали гематоксилином-эозином и азуром-И-эозином. Подсчет клеток проводили при помощи микроскопа Биолам при увеличении объектива х90 под масляной иммерсией по методу Стефанова С.Б. (1974) с использованием 25 узловой морфометрической сетки (с шагом 10 мкм).

вмонтированной в окуляр (,\9) микроскопа. Плотность расположения клеток определяли по методу С.Б. Стефанова (1974).

Мейрофопнхю лкшкносн' itcc.ie.ioiui.ni н iecie <ммкрьмое но.ю» (Я Буреш и др.. 1991).

Оценку микробиологических показателей проводили в соответствии с гигиеническим регламентом качества и безопасности, предъявляемым к биологически активным добавкам животного происхождения [ГОСТ 2726287], контроль осуществляли по следующим стандартам: ГОСТ 10444.15 -94; ГОСТ 10444.2 - 93; ГОСТ Р50480-93; ГОСТ Р50474-93; ГОСТ 10444.1288., ГОСТ 10444.8 -88.

Для фракционирования АФЛ-2 методом гель-фильтрации использовали колонку с Sephadex G-25 Superfine (Pharmacia Fine Chemicals) (2,5 x 30 см), уравновешенную в 0,1 M СН3СООН, скорость потока 60 мл/ч. Детекцию осуществляли детектором 2158 Uvicord SD (LKB, Швеция) по УФ-поглощению при 226 нм.

Иоонообменную хроматографию раствора низкомолекулярной фракции экстракта проводили, используя колонку с SP Sephadex С-25 (LKB, Швеция) (1,6 х 14 см), уравновешенную в 10 мМ СН^СООН. Колонку промывали 10 мМ СН3СООН в течение 30 мин со скоростью потока 1,5 мл/мин, с последующей элюцией сорбировавшихся компонентов фракции линейным градиентом концентрации NaCI в 10 мМ СН3СООН. Пики веществ детектировали по УФ-поглощению при 226 нм. ВЭЖХ проводили, используя хроматографическую систему System Gold (Beckman, USA), на колонке Luna CI8(2) (Phenomenex, USA) (2x250 мм), уравновешенную в 2%-ном растворе ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Элюцию веществ с колонки проводили линейным градиентом ацетонитрил-содержащего 0,08% ТФУ, от указанных начальных условий до 42% за 80 мин со скоростью 0,2 мл/мин. Детекцию осуществляли с помощью детектора на диодной матрице System Gold 168 (Beckman, USA) при длине волны 210 и 280 нм. Молекулярную массу пептидов оценивали методом масс-спектрометрии. Данный фрагмент работы выполнен совместно с ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва.

Скрининговые исследования биологической активности пептидов включали в себя изучение экспрессии рецепторов «трипсинизированных» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика в «реакции активного розеткообразования» (согласно фармакопейной статье ВС 42-1571-85).

При статистической обработке экспериментальных данных вычислялась средняя арифметическая (М), ошибка средней арифметической (±т), критерий Стьюдента (t) и достоверность различий (Р). Различия считали достоверным при вероятности 95% (Р<0,05) (M.JI. Беленький, 1963).

Схема экспериментальных исследований приведена на рисунке 1.

Рис. 1. Схема экспериментальных исследований

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вы имение пспш >ны\ фракции лимфатических \ 1.юв.

Неншдные фракции лимфатических у5лоп выделены методом поэтапного удаления высокомолекулярных белков из гомогената, включающего последовательные этапы гомогенизации, экстракции, автолиза, осаждения ацетоном, сульфатом аммония, растворения и ультрафильтрации. В результате были получены 4 фракции: АФЛ-2; АФЛ-3; АФЛ-4; АФЛ-5. Количественное содержание выделенных фракций лимфатических узлов представлено в таблице 1, из которой видно, что наибольший выход биологически активных веществ во фракции АФЛ-2.

Таблица 1

Выход биологически активных веществ лимфатических узлов

Фракции лимфатических узлов Выход фракции в мг из 1 кг лимфатических узлов

АФЛ-2 25160±1258

. АФЛ-3 6393±320

АФЛ-4 2546+153

АФЛ-5 280+19

Сравнительная оценка биологической активности фракций в тесте фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов в отношении Staph, aureus на фоне азатиоприновой иммуносупрессии in vitro' представлена на рисунке 2.

Как видно из рисунка 2, наибольшей активностью обладали фракции - АФЛ-2 и АФЛ-5. Процесс выделения второй фракции менее трудоемок, исключает воздействие агрессивных химических реагентов, позволяет получать больший выход биологически активных веществ, что целесообразно при создании биологически активной добавки.

Аминокислотный анализ фракции показал, что в составе АФЛ-2 присутствует весь спектр аминокислот, в гом-числе - п незаменимые аминокислоты: LEU (6,63%), THR (5,12%), РНЕ (3,31%), VAL (3,12%), ILE (2,08%), LYS (1,87%), MET (1,73%). позволяющие судить о её биологической ценности.

Для выяснения того, какими пептидами представлена фракция АФЛ-2, было проведено фракционирование полученного нами суммарного пептидного экстракта.

I(J

S 60 В 50

Я 40 £ 30 | 20 E 10

* л

< о

ъ®

J?1

ни -ЭЕ- т phi -if-

т -ш-

• I1

—г-1 —1— -1—

161

l4l 12g ю-©-

о о

s о X 1> (X

О активность фагоцитоза,% □ интенсивность фагоцитоза,%

Рис. 2. Влияние пептидных фракций на функциональную активность перитонеальных макрофагов мышей in vitro на фоне азатиоприновой

иммуносупрессии Первым этапом фракционирования экстракта АФЛ-2 явилось его гель-фильграционное разделение. При этом в составе АФЛ-2 зарегистрировано 4 пика. Для оценки условной молекулярной массы (ММ) экстракта брыжеечных лимфатических узлов проводилось гель-фильтрационное разделение маркерных соединений: альбумина 67 кДа, тирозина 181,2 Да. Смесь маркеров в объеме 2 мл наносили на колонку с сефадексом G-50 sf, уравновешенной 0,1М СН3СООН, со скоростью 60 мл/час. По результатам исследования составлен калибровочный график для определения молекулярной массы фракций гель-фильтрацией и, ориентировочно оценена ММ компонентов экстракта, с диапазоном до 37 кДа: фракция Л1 (ММ>17,5 кДа), Л2 (ММ=5-17,5 кДа), ЛЗ (ММ=1,5-5 кДа), Л4 (ММ<1,5 кДа). При скрининг-тестировании путем оценки влияния на экспрессию рецепторов «трипсинизированных» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика установлено, что активные фракции элюировались в низкомолекулярной области до 5 кДа.

Следующим этапом выделения пептидов лимфатических узлов стало разделение наиболее активной фракции Л4 методом ионообменной хроматографии с последующим изучением их биологической активности. В составе Л-4 выявлено 4 пика: Л4-1, Л4-2, Л4-3, Л4-4 (рис. 3).

Анализ данных, полученных при оценке иммуностимулирующей активности фракций, выявил максимальную активность у фракции Л4-4. В результате тестирования было показано, что фракция Л4-4 восстанавливает

Рис. 3. Ионообменная хроматография фракции Л4-4 на колонке БР БерЬаёех С-25(1,6 х-14 см), уравновешенная в 10 мМ СН3СООН со скоростью потока 1,5 мл/мин, с последующей элюцией сорбировавшихся компонентов фракции линейным градиентом концентрации КаС1 (0-1 М) в 10 мМ СН3СООН. Пики веществ детектировали по УФ-поглощению при 226 нм

2.0-i

-i 50

s 1.0 -

00 - ==A¿=

—■— 15

—1— 30

1-1—

—I— 60

О мин

Рис. 4. Обращенно-фазовая ВЭЖХ фракции Л4-4 на колонке Luna С 18(2) (Phenomenex, USA) (2x250 мм), уравновешенная в 2%-ном растворе ацетонитрила в 0,1% ТФУ, в градиенте концентрации ацетонитрила 042% за 80 мин. Скорость элкшии 0,2 мл/мин; детекция по поглощению при 210 нм

жспрессию мембранных рецепторов «трипсинизированных» тимоцитов, увеличивая содержание Еа РОК до уровня контроля

Лкпшная фракция .'14-4 оьма noinepi н\ r:i фракционированию препаративной обращенно-фаювой В')ЖХ (рис. 4).

Анализ второй производной спектра поглощения основного пика в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм выявил в нем характерные для триптофана максимумы. Кроме того, спектр поглощения в указанном диапазоне длин волн позволяет идентифицировать в пиках такие аминокислоты, как фенилаланин и тирозин.

Методом масс-спектрометрии была определена молекулярная масса данного пика, составляющая 1141.7 Да.

Параллельно с определением биологической активности узких фракций проводилось сравнительное тестирование и суммарного экстракта - АФЛ-2, иммуностимулирующая активность АФЛ-2 сопоставима с активностью фракции Л4-4.

Учитывая более доступный способ выделения АФЛ-2, экономически целесообразно использование второй фракции для получения пищевого иммуномодулятора. Присутствие в суммарном экстракте низкомолекулярных пептидных фракций свидетельствует об активном действующем начале АФЛ-2 и подтверждает необходимость изучения его иммуномодулирующей активности.

Исследование иммунобиологической активности АФЛ-2

Функциональную активность перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей изучали по фагоцитозу St. aureus in vivo. Введение мышам перорально АФЛ-2 в дозе 100 мкг/кг на фоне азатиоприна восстанавливало функциональную активность ПМ до уровня показателей фагоцитоза у животных контрольной фуппы. В дозах 10 мкг/кг и 1000 мкг/кг наблюдалось повышение активности фагоцитоза на 56,5% и 80,9%, а интенсивности фагоцитоза St. aureus на 60% и 21,8%, соответственно указанным дозам, по сравнению с уровнем супрессии.

Участие макрофагов в адекватном функционировании иммунной системы связано, в первую очередь, и с тем, что при попадании в организм антигенов фагоцитирующие клетки воспринимают антигенные структуры и являются посредниками между последними и лимфоидными клетками. Реакция определения числа антителообразующих клеток интактных животных после переноса им «примированных антигеном» сингенных макрофагов позволила оценить нам антигенпрезентирующую активность макрофагов. Результаты исследования представлены на рис.5.

300000 -Г 250000 -200000 - -150000 -100000 -50000 --

Контроль Азатиоприн АФЛ-2 Аз.+АФЛ-2

Г~~~1 Количество АОК на селезенку —♦— Количество АОК на 1&спленоцитов

Рис. 5. Влияние АФЛ -2 на антигенпрезентирующую функцию макрофагов мышей на фоне азатиоприновой иммуносупрессии

Трансплантация интактным мышам клеток перитонеального экссудата от иммунизированных ЭБ мышей-доноров, получавших азатиоприн, сопровождалась угнетением гуморального иммунного ответа, что выражалось в уменьшении количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов на 65% и 70%, соответственно, по сравнению с контролем.

При введении иммунизированным мышам-донорам, подвергнутым воздействию азатиоприна, АФЛ-2 и трансплантацией от последних перитонеальных макрофагов сингенным мышам-реципиентам происходило повышение выраженности гуморального иммунного ответа, что выражалось в увеличении абсолютного и относительного числа АОК на 62,7% и 76,4%, соответственно, по сравнению с данными в группе животных, получавших азатиоприн. Изучение влияния АФЛ-2 в дозе 100 мкг/кг свидетельствует о стимуляции антигенпрезентирукпцей активности макрофагов, выражающейся в увеличении как абсолютного (на 10,6%), так и относительного (на 32,4%) количества АОК относительно контроля. Таким образом, полученные данные позволяют считать, что в реализации иммуномодулирующих свойств пептидной фракции существенное значение имеет стимуляция иммунорегуляторной функции макрофагов.

Влияние АФЛ-2 на процессы аитителообразования представлены в таблице 2. Полученные экспериментальные данные показали, что введение АФЛ-2 в разных дозах лабораторным мышам с индуцированной иммунологической недостаточностью обеспечивает статистически достоверную стимуляцию антителообразующей функции В-лимфоцитов.

Как следует и! таблицы 2. азатиоприн уменьшал количество антителопродуцентов в 2.5 раза (в пересчете на селезенку) ив 1.6 раза (в пересчет ни Ю'Ч-м и-нокигов) по сравнению с конфолеч.

I аблица 2

Изменение количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки

Группы животных Доза, мкг/кг Абсолютное число АОК Число АОК на 106 спленоцитов

Контроль 263161±19135 1688±101

Азатиоприн (Аз.) 50 10401117625*1 1046±74*'

АФЛ-2 100 332485+16935 2704±105

Аз.+АФЛ-2 10 201136±16734#2 1447±125*2

Аз.+АФЛ-2 100 265999±21445*2 1668±107*2

АЗ.+АФЛ-2 1000 173012+13496*2 1031159

сравнению с контролем, - по сравнению с введением азатиоприна.

При введении АФЛ-2 в дозах 10 и 100 мкг/кг на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов; при этом первый показатель превышал уровень азатиоприновой супрессии в 1,9 и 2,5 раза, соответственно, а второй показатель - в 1,4 и 1,6 раза. АФЛ-2 в дозе 1000 мкг/кг проявлял меньшую активность, достоверно повышая в 1,6 раза только абсолютное содержание АОК в селезенке.

Действие активной фракции лимфатических узлов на клеточное звено иммунного ответа изучали в реакциях «гиперчувствительность замедленного типа» (ГЗТ) и «трансплантат против хозяина» (РТПХ) (таблица 3)

Таблица 3

Влияние АФЛ-2 на показатели клеточного иммунитета, оцениваемого в реакциях ГЗТ и РТПХ/М±т), п=10

Группы животных Доза, мкг/кг Индекс реакции ГЗТ, % Коэффициент стимуляции ГЗТ Индекс увеличения лимфоузлов, РТПХ

Контроль 46,7±3,4 1,0 2,7±0,2

Азатиоприн (Аз) 50 32,2±1,4*' 0,69 1,67±0,04*'

АФЛ-2 100 48,5±2,8 0,98 2,84±0,16

Аз + АФЛ-2 10 46,4±2,9*2 0,99 2,04±0,07*2

Аз + АФЛ-2 100 44,7±2,7*2 0,95 2,62±0,12*2

Аз АФЛ-2 1000 37,3±1,5 0,79 1,84±0,05*2

Иj таблицы 3 следует, что азатиоприн в до?е 50 мг/кг подавлял пока5атель клеточного иммунитета организма в реакции ГЗТ в 1.4 ра$а (\ i не реннс па 31"«) и н po.iMiiin Р 111\ к 1.6 рн !а (> i неюние ня 38 %)

При испольюваиии АФЛ-2 в л о sa\ 10 и 100 чкг ki на фоне описанной выше супрессии отмечалось увеличение индекса реакции ГЗТ в 1,4 и 1,38 раза, соответственно, по отношению к результатам опыта с введением азатиоприна. Увеличение дозы АФЛ-2 (1000 мкг/кг) не приводило к выраженному и достоверному приросту индекса реакции. Введение АФЛ-2 f в дозе 100 мкг/кг также не изменяло показатели, характеризующие

изучаемый клеточный феномен.

При оценке результатов РТПХ наблюдали достоверное повышение 41 индекса увеличения лимфоузлов (ИУЛ) на 57% (в 1,6 раза) при введении

АФЛ-2 в дозе 100 мкг/кг на фоне азатиоприновой иммуносупрессии. Менее выраженный эффект наблюдался при введении АФЛ-2 в дозе 10 мкг/кг - на 22% (в 1,2 раза). В эксперименте установлено, что АФЛ-2 в дозе 100 мкг/кг оказывал незначительное стимулирующее влияние на клеточный иммунитет животных контрольной группы.

Важная роль в регуляции иммунного ответа отводится Т-супрессорам, выступающим в роли основного отрицательного регулирующего звена иммунного ответа (L.D. Loose, 1982; D.A. Clark et.al., 1981) (табл.4).

Таблица 4

Влияние АФЛ-2 на активность антигенспецифических Т-супрессоров антителообразования(1У1 ¿ m), п = 10_

Группы животных Доза, мкг/кг Абсолютное число АОК Число АОК на 106 спленоцитов

Контроль - 125000 ±6060 766 ± 69

Контроль супрессии - 79666+4826*' 498 ±48*'

АФЛ-2 100 120259±4714*2 872 ± 52*2

Результаты опытов свидетельствуют о том, что в селезёнках мышей, иммунизированных внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 4x109 клеток на мышь, накапливались Т-лимфоциты с супрессорной активностью. О действии указанной субпопуляции судили по угнетению антителогенеза у мышей-реципиентов после адаптивного переноса суспензии селезеночных клеток гипериммунизированных сингенных животных, что выражалось в уменьшении абсолютного и относительного числа АОК на 37% и 35%, соответственно, по отношению к контролю.

Как следует из таблицы 4, под влиянием АФЛ-2 наблюдалось полное снижение индекса супрессии, что проявилось в увеличении как абсолютного количества АОК на селезенку, так и при расчете на 106 спленоцитов на 51% и 75%, соответственно.

На примере реактивности периферических органов иммунной системы нами было изучено действие биологически активной фракции на морфофчHktmoHii.ihHoc состояние ма\овы\ .шмфашческнч умов мышеи после агапюприновой иммуносупрессии. Установлено, что. наряду с морфологическими изменениями органа, введение азатиоприна приводит к выраженным сдвигам в кооперации лимфоидных клеток - исчезают бласты, уменьшается число больших лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов. Важным фактором повреждения лимфоидной ткани в паховых лимфатических узлах цитостатиком азатиоприном является высокий уровень деструкции клеток, появление зон фиброза, исчезновение центров размножения в лимфоидных узелках. Введение АФЛ-2 восстанавливало центры размножения в лимфоидных узелках и равновесие в популяции лимфоидных клеток до уровня контрольных значений или приближало к ним. Действие биорегулятора сопровождалось уменьшением числа деструктивно изменённых и разрушенных клеток в 1,3 - 2,2 раза в разных структурных компонентах лимфатического узла. Важным показателем действия АФЛ-2 являлась макрофагальная реакция, повышение числа молодых форм клеток, плазматических клеток. Полученные данные свидетельствуют о наличии иммунокорригирующих свойств у изучаемого биорегулятора, что является, по-видимому, результатом действия цитомединов, входящих в его состав и подтверждающих постулированную органотропность цитомединов, объясняемую большим содержанием регуляторных пептидов (Б.И. Кузник и др. 1991, В.Х. Хавинсон, В.Г. Морозов, 1998).

Нейротропная активность АФЛ-2 на фоне иммунодефицитного состояния, вызванного азатиоприном

В настоящей работе изучена суммарная двигательная активность и ориентировочно-исследовательское поведение мышей в тесте "открыто©' поле" при введении АФЛ-2 в дозе 100 мкг/кг. Исследование проводилось на фоне иммунодепрессивного состояния, вызванного азатиоприном.

Установлено^ что животные^ в" состоянии иммунодепрессии характеризовались низкой суммарной двигательной активностью и уровнем исследовательского поведения по сравнению с контролем.

По полученным данным двигательная активность мышей имела следующее распределение (в баллах): контрольная группа (232) > АФЛ-2 (225) > аз.+АФЛ-2 (223) > азатиоприн (175).

Исходя из данных по общей исследовательской активности, распределение нейромодулирующей активности исследуемых средств установилось в следующей последовательности (в баллах): контрольная группа (284) > АФЛ-2 (279) > аз+АФЛ-2(250) > азатиоприн (211). Введение

АФЛ-2 не оказывало заметного эффекта на поведенческие реакции жспериментальных животных.

В роллы,не нровепенныч исс.челоклннй чекшовлено. чю \ мышей наблюдалась прямая зависимое 1ь межд\ выраженностью покаютелей основных звеньев иммунного ответа, уровнем исследовательского поведения и суммарной двигательной активностью. Данный факт проявлялся в восстановлении показателей нейротропной активности и иммунологических параметров на фоне азатиоприновой иммуносупрессии. Исходя из вышеизложенных результатов экспериментальных исследований, можно прогнозировать успешный результат иммунокорригирующего действия АФЛ-2 в качестве биологически активной добавки с адаптогенным действием при иммунодефицитном состоянии.

Определение качества и безопасности биорегулятора АФЛ-2

Нами было проведено сублимационное высушивание при атмосферном давлении биорегулятора АФЛ-2.

Сублимационное высушивание АФЛ-2 при I —18°С требовало значительных энергозатрат и длилось 92 часа, при I —12°С - 72 часа, при I =-10°С - 31 час. Выбор температуры сублимирования АФЛ-2 определило время, требующее минимальных энергозатрат.. На рис.. 6 показана зависимость влагосодержания биорегулятора от времени сушки, показывающая вымораживание влаги до 11% в течение 31 часа.

Длительность,час

Рис.6. Изменение влажности биорегулятора АФЛ-2 в процессе сублимации

Математическая обработка данных, приведенных на рис. 6, позволила установить изменение параметров влажности от времени высушивания согласно уравнению: у = -19,637х +121,51

Тепловую досушку материала проводили в ИК-сушке. Уровень влажности продукта, достигаемый к окончанию процесса досушивания,

определялся условиями, сроками последующего хранения. Оптимальный пока¡атсль содержания влаги, равный 3.1%. был достигнут при температуре 28' С в точение 20 мин\ I.

Исследуемый биорегулятор представлял собой порошок серою цвета с желтоватым оттенком, аморфный, растворимый в дистиллированной воде и 0,85%-ном растворе хлорида №. Сравнительный анализ стандартных показателей порошкообразных средств с характеристиками порошка АФЛ-2 свидетельствовал о его соответствии технологическим параметрам, предполагающим таблетирование средства (табл.5).

Таблица 5

Определение технологических характеристик сухой формы __биорегулятора__

Сыпучесть, г/сек Насыпная масса, г/мл Угол естественного откоса, С0

2,9 0,52 43

Скрининговое тестирование экстракта и сухой формы АФЛ-2 в реакции «активного» розеткообразования показало, что восстановление рецепторов тимоцитов, обработанных трипсином, происходит как при действии экстракта, так и порошка АФЛ-2 (рис. 7).

.о 60 о4

Я 50 О

а. 40

Р 30

£ 20

1 Ю

¿1 Г1!

гЯВИ s-l

.. Л."'*'-

ш г -4 ш i Л

Норма Контроль 50 100 300

Концентрация азотистых веществ, мкг/кг □ Количество РОК до АСС, % ■ Количество РОК после АСС,%

Рис. 7. Изменение иммунобиологической активности АФЛ-2 в процессе сублимации при атмосферном давлении

Как следует из рис.7, изменение биологической активности АФЛ-2 в процессе сублимации зависит от вводимых доз. При введении АФЛ-2 в дозе 50 и 100 мг/мл наблюдается снижение иммунобиологической активности на 13,7% и 12,5%, соответственно. Полное восстановление мембранных

рецепторов гимоцитов морской свинки регистрируется под влиянием АФЛ-2 в концентрации 300 мг'мл.

Ьжсмчиосп, АФЛ-2 оценена но ре ¡\jiuaia\i »ксирссс-мею м с испольюванием тесч-культуры Те^асЫтепа РупГопгт [1 ОСТ 13496 -97]. Исследуемое биологически активное средство токсичностью не обладало.

Оценка микробиологических показателей проведена в соответствии с гигиеническим регламентом безопасности и качества, предъявляемым к пищевым биологически активным добавкам на основе переработки животного сырья в соответствии с СанПин 2.3.2.560 - 966.10.22.

Данные бактериологического анализа биорегулятора АФЛ-2 свидетельствовали о том, что рост числа микроорганизмов не превышал нормативный показатель 5*10 КОЕ/г в течение 1-го, 3-х, 6-ти и 12-ти месяцев со дня изготовления при 1=5±2°С и 1=18+6° С.

Изменение иммунобиологической эффективности в процессе хранения биорегулятора при разных условиях оценивали по аналогичному тесту. Данные представлены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние температуры хранения на показатели качества _сублимированной формы АФЛ-2__

Группы Срок Средняя Средняя Активность

хранения, температура хранения, °С влажность после

мес сухого средства, % хранения (количество РОК,%)

Норма 50,1 ±4,2

Контроль 18,2±1,9*'

АФЛ-2 6 5±2 3,2±0,2 48,4±3,9*2

АФЛ-2 6 18±6 3,3±0,2 43,3±3,5*?

АФЛ-2 12 5±2 3,8±0,3 45,2±4,Г2

АФЛ-2 12 18+6 3,8±0,3 42,1±3,5*2

Как следует из таблицы 6, на изменение активности биорегулятора температура хранения не оказывала существенного влияния.

Разработка технологической схемы получения биорегулятора

АФЛ-2

В соответствии с выше проведенными исследованиями нами разработана технологическая схема получения биорегулятора АФЛ-2. Схема приведена на рис. 8.

2(1

Отбор сырья, соответствующего I ребованиям ГОС Г 212(>2-75

Рис.8. Технологическая схема получения биорегулятора АФЛ-2

Технология получения биологически активных добавок из органов иммунной системы, в том числе и лимфатических узлов, позволяет, с одной стороны, максимально использовать природные сырьевые ресурсы, с другой стороны, - рационально реализовать биологические свойства нативного материала, обуславливающие иммунобиологическую активность средства.

Таким образом, полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что биорегулятор АФЛ-2 обладает иммуномодулирующим действием и оказывает положительное влияние на все звенья иммунитета. Исследования морфофункционального состояния соматических лимфатических узлов экспериментальных животных полностью подтверждают выявленные закономерности позитивного эффекта исследуемого средства на иммунологические показатели при

азатиопри новой иммуносупрессии. Наряду с указанными свойствами у АФЛ-2 была обнаружена нейромодулирующая активность.

Иммчномо tvinp\H)iuiiH >ффем оноршч im юра швпсш oí лош: максимальный огмечен при введении дозы 100 mki м в исследованиях in vivo и в концентрации 0,1 мг/мл - in vitro.

В целом изученные характеристики иммуномодулятора АФЛ-2 позволяют рекомендовать его для перорального способа коррекции вторичных иммунодефицитных состояний как в качестве самостоятельной биологически активной добавки, так и биологически активного компонента продуктов лечебно-профилактического назначения.

Полученные в результате фракционирования экстракта низкомолекулярные фракции, обладающие иммуностимулирующей активностью, могут быть рекомендованы к изучению для препаративного получения лекарственных средств.

ВЫВОДЫ

1.-Выделены 4 пептидные фракции из брыжеечных лимфатических узлов крупного рогатого скота, обладающие иммуномодулирующим эффектом. Наибольшая активность отмечена у одной из фракций - «АФЛ-2» (активная фракция лимфатических узлов).

2. «АФЛ-2» восстанавливает показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа экспериментальных животных на модели иммунодепрессивного состояния. Вероятным механизмом иммуномодулирующего действия биорегулятора «АФЛ-2» следует считать его способность угнетать активность супрессорных клеток, а также усиливать функциональную активность макрофагов, в частности, антигенпрезентирующую способность.

3. Биорегулятор «АФЛ-2» обладает нейромодулирующим действием, выражающимся в возрастании доли ориентировочно-исследовательского поведения и суммарной двигательной активности лабораторных животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, что указывает на усиление общей адаптационной активности организма.

4. Разработана технологическая схема получения сублимированной формы биорегулятора «АФЛ-2», позволяющая сохранить иммунобиологическую активность средства в течение 12 месяцев.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Выделение пептидных фракций лимфатических узлов и оценка их активности // От фундаментальной науки к новым технологиям: Тез. докл. Международной конференции молодых учёных. 25-28 сентября 2001.-Москва - Тверь, 2001,- С. 19-20.

2. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Влияние пептидной фракции лимфатических узлов на показатели клеточного иммунитета /' Кполотчески .жшвные юбавки и перепек швы м\ применения н здравоохранении: Тез. докл. научно-практической конференции. 13 декабря 2001 г.- Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2001.- С 66-67.

3. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Влияние фракции лимфатических узлов на фагоцитарную активность макрофагов // Сборник научных трудов ВСГТУ. Серия: Химия и биологически активные вещества. - Вып.7. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2002. - С.96-99.

4. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Органы иммунной системы убойных животных как перспективные источники БАД // Биотехнология - состояние и перспективы развития: Тез. докл. 1-го Международного Конгресса. 14-18 октября 2002 г.- Москва, 2002.-С.374-375.

5. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Исследование биологических свойств фракций лимфатических узлов // Сборник материалов 11-й Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество», Краснообск, 10-11 июня 2002. -Новосибирск, 2002.-С.234-235.

6. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Оценка токсичности и относительной биологической ценности фракции лимфатических узлов // Тез. докл. Всероссийской конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах», 10-12 октября 2002. -Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2002.-С.101-103.

7. Битуева A.B., Григоренко Д.Е., Жамсаранова С. Д. Микроструктура паховых лимфатических узлов при действии цитостатика азатиоприна // Вестник новых медицинских технологий, 2002. -№3. - Т. 9.-С.106-108.

8. Тармакова О.С., Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Сублимационная сушка биологически активных фракций при атмосферном давлении // 7-я Путинская школа-конференция молодых

' ученых, 14-18 апреля 2003 г.- Пущино, 2003.-С.133.

9. Битуева A.B., Жамсаранова С.Д., Григоренко Д.Е. Морфология паховых лимфатических узлов мышей при воздействии эндогенных пептидов // Материалы Международной научной конф. "Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных", поев. 90-летию профессора В.Р. Филиппова, 25-27 июня 2003. - Улан-Удэ: БГСХА, 2003. - С.23-24.

10. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Коррекция иммунодефицитного состояния биорегулятором природного происхождения //Успехи современного естествознания. -2003. - № 6. Москва «Академия естествознания», 2003. - С. 38-39.

11. Битуева A.B., Хобракова В.Б.. Григоренко Д.Е.. Ерофеева J1.M. Морфофункциональное состояние тимуса и лимфатических узлов под влиянием ишосгатка ашноприна Ью.мегень ПЦССХ им А Н. Бакулева РАМН.-2003.- №5. - Г.4. - С.28.

12. Битуева A.B., Григоренко Д.Е., Сапин М.Р., Жамсаранова С. Д. Воздействие активной фракции лимфатических узлов на структурную организацию паховых лимфатических узлов // Вестник новых медицинских технологий, 2003.- №4. - С. 100-103.

13. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Морфологическая характеристика лимфатических узлов при экспериментальном иммунодефицитном состоянии и его коррекции пептидным биорегулятором //' Сборник научных трудов «Актуальные проблемы морфологии». - Красноярск, 2003.-С. 16-18.

14. Битуева A.B., Бубеева Н.Б., Жамсаранова С.Д. Влияние фракции лимфатических узлов на антителогенез // Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине: Материалы научно-практической конференции. 18-19 сентября 2003. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2003. - С 84-85.

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории функциональной анатомии НИИ МЧ РАМН (г. Москва) вед.н.с, к.б.н. Д.Е григоренко..и д.б.н. U.M. Ерофеевой, оказавшим консультативную помощь при выполнении гистоморфологических исследований, а также старшему научному сотруднику лаборатории химии пептидов ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва) к.х.н Р.Х. Зиганшину за консультацию и помощь в проведении работы.

2оо?-/4

\7Т&о ^ 17 3 8 0

Редактор Т. А. Стороженко Отпечатано в типографии ВСГТУ. Усл.п-л. 1,39. Тираж 100 - 2003 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Битуева, Анна Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунодефицитные состояния. Иммунотропные лекарственные средства, их классификация.

1.2. Современные представления о пептидных биорегуляторах. Химико-биологические характеристики, свойства, получение и применение

1.2.1. Химический состав пептидных биорегуляторов

1.2.2. Биологические свойства пептидных биорегуляторов

1.2.3. Механизмы действия пептидных биорегуляторов

1.2.4. Способы получения и применения пептидных биорегуляторов

1.3. Биологически активные факторы лимфатических узлов (АФЛ) и 35 лечебные препараты на их основе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Предварительная оценка качества сырья

3.2. Выделение пептидных фракций лимфатических узлов и 54 определение их биологической активности

3.2.1. Фракционирование экстракта брыжеечных лимфатических узлов

3.3. Оценка иммунобиологической активности активной фракции лимфатических узлов на модели азатиоприновой иммуносупрессии 66 3.3.1. Изучение влияния АФЛ-2 на показатели макрофагального звена иммунного ответа относительно иммуносупрессии, вызванной 66 азатиоприном

3.3.2 Влияние АФЛ-2 на функциональное состояние гуморального иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии

3.3.3. Исследование функциональной активности клеточного звена иммунного ответа при введении АФЛ

3.3.4. Влияние АФЛ-2 на активность антигенспецифических Т-супрессоров антителообразования

3.3.5. Влияние АФЛ-2 на морфофункциональное состояние соматических лимфатических узлов мышей в условиях 75 иммунодепрессии.

3.4. Нейротропная активность АФЛ-2 на фоне иммунодефицитного состояния, вызванного азатиоприном.

3.5. Определение качества и безопасности АФЛ

3.5.1. Сублимационное высушивание при атмосферном давлении биорегулятора, полученного из лимфатических узлов.

3.5.2. Анализ физико-химических свойств и состава биорегулятора

3.5.3. Оценка микробиологических и токсикологических показателей 101 биорегулятора

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности"

Актуальность темы. В настоящее время актуальность проблемы восстановления иммунологических нарушений с помощью иммунокорригирующих средств несомненна, так как почти любое заболевание, как правило, сопровождается развитием иммунодефицитных состояний. Имеющиеся нарушения в организме человека возникают в результате воздействия различных факторов, в том числе воздействие микробных агентов, применение фармакологических препаратов, таких как антибиотики, кортикостероиды, цитостатики, используемые при лечении воспалительных, онкологических и других заболеваний. Это обусловлено снижением иммунологической реактивности организма современного человека в целом и, как следствие, повышением острой и хронической заболеваемости, связанной с условно-патогенными микроорганизмами [139, 144].

Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы - создание иммуностимуляторов на основе эндогенных биологически активных веществ. Из всей совокупности биологически активных веществ в настоящее время большое внимание привлекают регуляторные пептиды, содержащиеся в различных тканях организма и принимающие участие в межклеточном взаимодействии [26, 65, 149]. К настоящему времени подобные по природе, но отличающиеся по функциональной активности пептиды выделены практически из всех органов и тканей: они нетоксичны, применяются в небольших дозах и обладают высокой биологической и лечебной активностью.

Важную роль в качестве продуцентов биологически активных пептидов играют органы иммунной системы, которые, следует отметить, относят к отходам основного производства. Тимус, селезенка и лимфатические узлы убойных животных на сегодняшний день являются одними из перспективных и дешевых источников биологически активных веществ.

На сегодняшний день достаточно хорошо изучены пептидные препараты из тимуса, костного мозга, селезенки, применяемые как препараты медицинского назначения [9, 37, 78, 81, 87, 95, 96, 142]. Представляет интерес изучение пептидных препаратов, выделенных и из лимфоузлов, так как лимфатические узлы, которые условно относят к периферическим органам иммунной системы, играют не менее важную роль в развитии иммунологических реакций, чем центральные органы этой системы. В них происходит не только пассивный процесс фильтрации антигена, но и имеет место активное метаболическое действие, приводящее к запуску и реализации всех последующих этапов иммуногенеза.

С развитием нового научно-прикладного направления — фармаконутрициологии возникла необходимость разработки новых технологий биологически активных регуляторов, по внешнему виду относящихся к фармпрепаратам, а по содержанию и возможности массового применения - к пище [91, 123].

Цели и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилась разработка биологически активного средства на основе регуляторных пептидов из лимфатических узлов крупного рогатого скота и выявление возможности его использования для коррекции иммунодефицитных состояний.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

3. Оценить нейротропную активность полученного биологически активного средства.

4. Оценить качество и безопасность биорегулятора по микробиологическим и токсикологическим показателям.

5. Разработать технологическую схему получения биорегулятора.

Научная новизна работы.

Создана технология получения сублимированного порошка биологически активного средства «АФЛ-2».

Практическое значение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделены пептидные фракции из лимфатических узлов крупного рогатого скота.

4. Разработана технология получения сублимированной формы биорегулятора АФЛ-2.

Апробация работы: основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

• ежегодных научно-практических конференциях ВосточноСибирского государственного технологического университета по секции "Химия биологически активных веществ" (Улан-Удэ, 2000,2001, 2003);

• научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ 2001; 2003);

• Международной конференции молодых ученых "От фундаментальной науки к новым технологиям" (Москва-Тверь, 2001);

• Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах», (Улан-Удэ, 2002);

• 2-й Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, 2002);

• 1-м Международном Конгрессе «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва, 2002);

• 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003);

• на 1 съезде лимфологов России (Москва, 2003);

• Международной научной конференции "Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных", посвященной 90-летию профессора В.Р. Филиппова (Улан-Удэ, 2003);

• Международной научной конференции «Медицинские, социальные и экономические проблемы сохранения здоровья населения» (Турция, г. Анталия, 2003);

• Международной научной конференции «Актуальные проблемы ч морфологии» (Красноярск, 2003).

V, I к

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Битуева, Анна Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Выделены 4 пептидные фракции из брыжеечных лимфатических узлов крупного рогатого скота, обладающие иммуномодулирующим эффектом. Наибольшая активность отмечена у одной из фракций — «АФЛ-2» (активная фракция лимфатических узлов).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что введение азатиоприна вызывает нарушения морфофункционального состояния иммунной системы, характеризующиеся резким изменением микроанатомии соматических лимфатических узлов интактных животных и сопровождается угнетением реакций, опосредующих различные звенья иммунной системы.

Исследование иммунокорригирующей активности биорегулятора АФЛ-2 при экспериментальной азатиоприновой иммуносупрессии выявило его эффективность по отношению к реакциям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также стимулирующее влияние на фагоцитарную активность макрофагов.

Изученный биорегулятор способен отменять супрессивное действие азатиоприна на клеточноопосредованные иммунные реакции, антителогенез и фагоцитоз макрофагов, что выражается в восстановлении изученных иммунных реакций организма до уровня таковых у контрольных животных.

Иммуномодулирующий эффект пептидной фракции зависит от дозы. Максимальная активность отмечена при введении дозы 100 мкг/кг в исследованиях in vivo и в концентрации 0,1 мг/мл - in vitro.

Исследуемое средство АФЛ-2 не изменяет показатели реакций клеточного, гуморального иммунного ответов и фагоцитоза макрофагов интактных мышей. Это свойство изучаемого биорегулятора очень важно, поскольку оно присуще лишь истинным иммуномодуляторам, обладающим активностью только в условиях повреждения иммунитета.

Проведенные исследования микроанатомии соматических лимфатических узлов экспериментальных животных полностью соответствуют выявленным закономерностям позитивного эффекта исследуемого биорегулятора на иммунологические показатели при экспериментальной азатиоприновой иммуносупрессии и подтверждают постулированную органотропность цитомединов.

Установлена важная роль регуляторных иммунокомпетентных клеток в механизме иммуномодулирующего действия биорегулятора АФЛ-2. Введение мышам исследуемого средства вызывает усиление антигенпрезентирующей функции макрофагов и угнетение активности субпопуляции Т-лимфоцитов супрессоров.

Биорегулятор АФЛ-2 обладает нейромодулирующей активностью, выражающейся в усилении поведенческих реакций экспериментальных животных на фоне азатиоприновой иммуносупрессии.

Выделенные в результате фракционирования низкомолекулярные пептидные фракции Л4-3 и Л4-4 свидетельствуют об активном действующем начале суммарной фракции АФЛ-2.

Разработанная технологическая схема получения сублимированного порошка АФЛ-2 позволяет сохранить биологическую ценность бирегулятора в течение длительного времени.

Полученные данные позволяют заключить, что биорегулятор АФЛ-2 является эффективным иммунокорригирующим средством, что позволяет рекомендовать его в качестве биологически активной добавки к пище и для создания продуктов лечебно-профилактического назначения.

120

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Битуева, Анна Викторовна, Улан-Удэ

1. Абрамов В.В. Интеграция иммунной и нервной систем // Иммунология. — 1999. -№3.- С. 62- 64.

2. Абрамов В.В., Абрамова Т.Я., Кожевников B.C. и др. Взаимосвязь параметров иммунитета и высшей нервной деятельности у человека // Докл. Рос. АН. 2000. -Т. 371. - № 3. - С. 410- 412.

3. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М., 1990. - 384 с.

4. Алехин Е.К., Лазарева Д.Н. Проблемы фармакологической стимуляции иммунитета // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1994. - №4. -С. 3-6.

5. Алехин Е.К., Лазарева Д.Н., Сибиряк С.В. Иммунотропные свойства лекарственных средств. Уфа, 1993. - 208 с.

6. Антонов С.Ф., Сигаев Г.И., Никонов Б.А., Кобатов А.И. Особенности сублимационной сушки лекарственных и диагностических препаратов в ампулах // Биотехнология 1998. - №5. - С.48-69.

7. Арион В.Я. Иммунологически активные факторы тимуса // Итоги науки и техники. Сер. Иммунология / ВИНИТИ. 1981. - Т. 9. - С. 10- 50.

8. Арион В.Я. Выделение, физико-химические свойства и биологическая активность Т-активина // Итоги науки и техники. Сер. Иммунология / ВИНИТИ.-1982.-Т. 10.-С. 45- 53.

9. Арион В.Я., Зимина И.В., Лопухин Ю.М. Современные взгляды на природу и клиническое использование тимических препаратов // Иммунология. 1997.-№3-4.-С. 157-166.

10. Антоненко В.П. Лимфопептиды как регуляторы резистентности организма к действию иммуногенных и неиммуногенных факторов // I Всес. иммун. съезд, Сочи, 15-17 ноября, 1989.-М., 1989. -с.268-269.

11. И. Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды, происхождение и иерархия // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1982.- №1. — С. 3-10

12. Анфалова Т.В., Лупан Н.И., Галактионов В.Г. Взаимодействие макрофагов с тимоцитами при генерации Т клеток, вступающих в реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ) // Докл. АН СССР. 1983. - Т. 268. - № 5. -С. 1274-1276.

13. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче. -М.: ВИНИТИ, 1988. 177с.

14. Баглаев Т.Н., Жамсаранова С.Д. и др. Практикум по иммунологическим методам исследования. Улан-Удэ, 1987.

15. Бауэр Г., Энгельгард., Хеншен А. и др. // Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988 - 205 с.

16. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. - С. 81-107.

17. Белокрылов Г. А., Софронов Б.Н., Сравнительное действие низкомолекулярных фракций из полипептидов тимуса и коры головного мозга на иммунный ответ у мышей // Бюл. Эксперим. Биологии и медицины. 1980. №8. С. 184-186.

18. Бадмаева Э.Э., Малежик Л.П. Влияние щелочных полипептидов сердца на некоторые показатели иммунитета и гемостаза // Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники. — Чита, 1995. — С.284.

19. Будажабон Н.Г. Влияние полипептида из плаценты на некоторые показатели иммуногенеза и гомеостаза // Цитомедины: Сб. научн. трудов / Под ред. Б.И. Кузника. Чита. - 1998. - С. 22-23.

20. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М., 1991. - Гл. 2: Врожденное и мотивированное поведение. - С. 119 - 123.

21. Вальтер М.В., Тютенков О.Л., Филипин Н.А. Постадийный контроль в производстве таблеток. М.: Медицина, 1982г.

22. Вогралик М.В., Ковальчук Л.В. Вторичные иммунодефицита. Горький, 1986.- 123 с.

23. Галактионов В.Г. Графические модели в иммунологии. М., 1986. - 236 с.

24. Галанкин В.Н., Токманов A.M., Боуманов К.В. О структурных основах снижения антибактериальной резистентности организма, связанной с функционированием системы нейтрофильных фагоцитов // Архив патологии. -1989. вып. 3.-С. 49-54.

25. Гладкова Н.Е. Исследование иммунодепрессивных свойств азатиоприна, метотрексата и хлорамфеникола. Автореф. дис. канд. мед. наук. -М., 1973.

26. Гомазков О.А. Современные тенденции в исследовании физиологически активных пептидов // Успехи соврем, биологии. 1996. - Т. 116, вып. 1. - С. 6068.

27. Горбунов А.П., Масанская В.В. Способ получения биостимулятора "Спленивита" из селезенки животных. А.с. 1695869 // Бюл. Изобрет. и открытий.- 1991.-№45.

28. Гордиенко А.И. Влияние низкомолекулярных лимфопептидов на морфофункциональные показатели иммунокомпетентных клеток: Автореф. дисс. канд. биол. наук.- Киев, 1992.-20 с.

29. Горяйнов И.И. Иммуномодулирующее действие физиотерапевтических факторов в норме и при патологии, характеризующейся развитием вторичных иммунодефицитов // Автореф. дисс . д.м.н. М., 1999. - 42 с.

30. Гречко А.Т. Нейротропная активность пептидных иммуномодуляторов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1998. — Т.61. - № 4. - С. 1416.

31. Григоренко Д.Е. Цитоархитектоника трахеобронхиальных лимфатических узлов крыс после воздействия сероуглерода // Архив АГЭ. — 1988. Т. 44. - № 3. - С. 60-65.

32. Григоренко Д.Е. Отдаленный эффект воздействия сероуглерода на лимфатические узлы крыс // Архив АГЭ. 1991. - Т. 101. - № 7,8. - С. 9-13.

33. Гриневич Ю.А., Чеботарев В.Ф., Никольский И.С. и др. Иммунобиология гормонов тимуса. К.: Здоровье, 1989. - 160 с.

34. Дранник Г.М. и др. Иммунотропные препараты. К.: Здоровье, 1994. — 288 с.

35. Ерошенко Т.М., Титов С.А., Лукьянова Л.Л. Каскадные эффекты регуляторных пептидов // М. ВИНИТИ, 1991. 204 с.

36. Жгенти Г.Р., Резников Ю.П., Колдаев Р.А. Хроматографичекий анализ пептидов лимфатической системы // Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники. Чита, 1995. — С.95.

37. Жгенти Г.Р., Ложкина А.Н. Влияние полипетидов лимфы и лимфатических узлов на коагуляционный гемостаз // Цитомедины. Чита, 1996. -С.15-16.

38. Жгенти Ц.Р., Жгенти Г.Р., Ложкина А.Н. Антикоагулянтное и антифибринолитическое действие полипептидов лимфатической системы // Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч. тр. /Под ред. Б .И. Кузника. Чита, 2002. - С. 5-6.

39. Жебраускас П., Рочка В., Тилиндис Б. Влияние азатиоприна, преднизолона и дегранола на некоторые иммунологические показатели у мышей // Труды научн. конф. медиц. фак-та. Вильнюс, 1970. - С. 61-65

40. Забродский П.Ф. Влияние тимогена на постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, вызванное острым отравлением ацетонитрилом // Экспер. и клиническая фармакология. — 1999. — Т.62. №3. — С.48-49.

41. Замятнин А.А. Общие функциональные особенности эндогенных регуляторных пептидов // Физиол. журнал. — 1992. — Т. 78. №9. - С. 39-51.

42. Захарова Л.А. Миелопептиды: природа и функциональная активность: Автореф. дис. д-ра мед. наук. М., 1987.- 33 с.

43. Земсков В.М. Принципы дифференцированной иммунокоррекции // Иммунология. 1996. - №3. - С.4-6.

44. Иванова Н.И., Тальков В.В. Коррекция тимозином функциональной активности иммунной системы у животных после максимальной физической нагрузки // Регуляция иммунного гомеостаза. Мат. докладов III всесоюз. симпозиума, JL. 1982. С.53-54.

45. Имельбаева Э.А. Иммунологические, цитохимические и биохимические методы исследования фагоцитирующих клеток / Методические рекомендации. -Уфа, 1996.-С. 18-19.

46. Иммунодеффицитные состояния / под ред. B.C. Смирнова и И.С. Фрейдлин СПб: "Фолиант", 2000 - 568 с.

47. Исмаилова Л.И., Керхер И.О., Ли Ю.С. Современные данные о структуре и функции лимфатических узлов человека и животных // Здравоохр. Таджикистана. 1991. - №6. - С.7-11.

48. Казанцева С.Т. Сравнительное изучение физико-химических свойств цитомединов // Роль пептидных бирегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза: Тез. докл. науч. конф. / Воен. мед. акад. им. С.М.Кирова. - Л., 1987. - С. 45.

49. Калинина И.И., Хлыстова З.С., Хавинсон В.Х. и др. Содержание тимического фактора тималина в эпителии кожи человека и мыши и изменение его в процессе онтогенеза // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1996.-№11.-С. 574-577.

50. Камовников Б.П., Антипов А.В., Семенов Г.В., Бабаев И.А. Атмосферная сублимационная сушка пищевых продуктов. — М.: Колос, 1994. — 255 с.

51. Киселева Е.П., Огурцов Р.П., Попова О .Я. и др. Сравнительная характеристика двух пептидных иммуномодуляторов // Иммунология. 1999. № 2. С.23-26.

52. Кирпичева О.В., Левченко Е.В. Влияние азатиоприна и холестерола на морфологию ядер перитонеальных макрофагов золотистых хомяков in vitro //

53. Мат-лы конф., посвящ. актуальн. вопр. теор. и практ. мед. "Медико-биологические аспекты нейро-гуморальной регуляции". Томск, 1992. - вып.2. -С. 75-76.

54. Кичигина E.JL, Ракова Е.Б., Будникова З.И. и др. Растения Восточной Сибири перспективные иммуномодуляторы // Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке. - Томск, 1991. - Ч. 1. - С. 66-67.

55. Кожемякин A.JL, Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Использование препаратов тимуса в медицине // Биохимия. 1984. Т.49. - Вып. 4. - С.658.

56. Козлов В.А., Кудаева О.Т., Наумова Е.Е. Методическое руководство по применению метода локального гемолиза и статистическому оцениванию результатов. Новосибирск, 1988. - 16 с.

57. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. JI.: Наука, 1988: Гл. 1: Проблема нейрогуморальной модуляции функции иммунной системы. С. 5-35.

58. Короткое A.M., Дейгин В.И., Титов М.И. Физико-химические исследования иммуноактивных препаратов // Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза: Тез. Докл. Науч. конф. / Воен. мед. акад. Им. С.М. Кирова. Л., 1987. С. 53.

59. Корочкин Л.И. Взаимодействие генов в развитии. М.: Наука, 1977. 280 с.

60. Кульберг А.Я. Регуляция иммунного ответа. М., 1985. - 223 с.

61. Кузник Б.И. Механизмы действия цитомединов // Цитомедины. Чита, 1988.-С.4-8.

62. Кузник Б.И., Хавинсон В.Х., Витковский Ю.А. и др. Применение пептидных биорегуляторов в хирургии и онкологии. Чита: Степанов М.А., 2001.-352 с.

63. Кузник Б.И., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Цитомедины. Спб.: Наука, 1998.-305 с.

64. Ломакин М.С., Арцимович Н.Г. Гормоны и другие биологически активные вещества тимуса: структуры и функции // Иммунология. 1992. - N.1. -С. 10-15

65. Малежик Л.П., Малинин В.В., Демина и др. Роль органоидных полипептидов в межклеточных и внутриклеточных взаимодействиях // Цитомедины. Чита, 1988. С.8-11.

66. Малежик Л.П., Хасанова Н.В., Корешкова Г.Н. Влияние ливагена на иммунитет и гемостаз // Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч. тр. /Под ред. Б.И. Кузника. Чита, 2002. - С. 14-15.

67. Малинин В.В. Коррекция пептидными препаратами тимуса и костного мозга вторичных иммунодефицитных состояний: Автореф. дис. . канд. мед. наук. СПб., 1992. 22 с.

68. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспективы // Иммунология. — 2002. Т.23. - №3. - С. 132-137.

69. Маркова Е.В., Громыхина Н.Ю., Абрамов В.В., Козлов В.А. Иммунологические параметры у мышей с различным поведением в тесте "открытого поля" // Иммунология. — 2000. № 3. — С. 15- 18.

70. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1994. - Т. 2. - С. 192-203

71. Меркулов Г.А. Курс патологической техники. Медицина: Лен. отд., 1961.-153 с.

72. Методические рекомендации по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств фармакологических средств. М., 1992. - 39 с.

73. Механизмы биорегуляции. / Яковлев Г.М., Новиков B.C., Смирнов B.C. и др. // С-Пб.: Наука, 1992. 40 с.

74. Михайлова А.А. Индивидуальные миелопептиды; лекарства нового поколения, используемые для иммунореабилитации. Int. J. Immunoreabilit. 1996, 2, с. 27-31.

75. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение и очистка и идентификация иммуномодулирующего полипептида, содержащегося в тимусе телят и человека. Биохимия, 1981.- Т.46. - № 9. - С. 1652-1659.

76. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение и изучение свойств регуляторных пептидов иммунной системы // Тез. докл. 1 Всесоюз. Иммунол. Съезда. М., 1989. Т.1.С.72.

77. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем цитомедины // Успехи соврем, биологии. - 1983. -Т.96. - вып. 3(6). - С. 339-352.

78. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения). СПб., Наука. 1996. - С. 75.

79. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Достижения и перспективы в области биорегуляции и геронтологии // Материалы Международного симпозиума «Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма». СПб., Наука. 19966. С. 7-9.

80. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Кожемякин А.Л., Кожемякин Л.А. Влияние полипептидного фактора тимуса на систему циклических нуклеотидов иммунокомпетентных клеток // Вопр. Мед. химии. 1982. №4. С. 114-118.

81. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. СПб.: Наука, 2000. 157 с.

82. Низкомолекулярные лимфопетиды гуморальное звено в механизме иммуностимуляции / Антоненко В.Г., Гаевский А.А. и др. // Механизмы иммуностимуляции. - Киев. — 1985. — С.7-8.

83. Нестерова И.В., Сепиашвили Р.И. Иммунотропные препараты и современная иммунотерапия в клинической иммунологии и медицине // Аллергология и иммунология. 2000. - Т. 1. - №3,- С. 18-28.

84. Новиков В.И., Власов А.А., Ковальчук АЛ., Раевская М.В., Барсуков А.А., Шанин. Природа фактора, вырабатываемого клетками иммунных лимфатических узлов, и его влияние на систему мононуклеарных фагоцитов // Иммунология. 1990. - №1. - С. 31-34.

85. Новиков В.И., Власов А.А. Влияние фактора иммунных лимфатических узлов на формирование клеток иммунологической памяти при гуморальном иммунном ответе // 1 съезд иммунологов России, Новосибирск, 23-25 июня 1992.-Новосибирск, 1992.-С.336-337.

86. Новиков В.И., Сидорович И.Г. Коммуникативная и регуляторная функция клеток лимфатических узлов в иммуногенезе // Успехи совр. биол. — 1990. -Т.110, №2. С.219-230.

87. Новиков В.И., Петров Р. В., Сергеев Ю. О. Антигенспецифический гуморальный фактор лимфатических узлов, стимулирующий активность «молчащих» антителообразующих клеток // Микробиология, эпид. и иммунопатология. 1984. - №1. - С. 68-71.

88. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-432 с.

89. Панюшин С.К, Угодчиков Г.А. Биологически активные добавки к пище. Теоретические и прикладные аспекты. М.: «РТ-Пресс», 2002. - 192 с.

90. Петров Р.В., Атауллаханов Р.И. Биохимия мембран. Кн.9. Клеточные мембраны и иммунитет. М., 1991. - 144 с.

91. Петров Р.В., Захарова JT.A., Михайлова А.А. Костномозговые медиаторы, регулирующие иммунный ответ (миелопептиды) // Гематология и трасфузиология. 1984. Т.29, № 2. С. 43-45.

92. Петров Р.В., Михайлова А.А., Захарова JT.A. Регуляторные пептиды костного мозга миелопептиды // Вест. АМН СССР. 1985. №8. С. 58-62.

93. Петров Р.В., Михайлова А.А., Захарова JT.A. и др. Миелопептиды -регуляторные медиаторы, вырабатываемые клетками костного мозга // Докл. АН СССР. 1986. Т.287, №2. С. 489-492.

94. Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина JI.A., Степаненко Р.Н. Миелопептиды. М.: Наука, 2000. 181 с.

95. Петров Р.В., Хаитов P.M. и др. // Региональные проблемы здоровья России-М., 1993.- с.175-185.

96. Пинегин Б.В., Калинкович А.Г., Варданян И.К. и др. Влияние реформированных иммунных комплексов из JgG-антител и эритроцитов барана на формирование популяций иммунокомпетентных клеток // Иммунология. -1982. № 4. - С. 39-42.

97. Подколзин А.А., Донцов В.И. Факторы малой интенсивности в биоактивации и иммунокоррекции. М., 1995. С. 109-127.

98. Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике // Сб. науч. тр. / Под ред. Б.И. Кузника. — Чита, 2002. 112 с.

99. Прокопенко В.Д. Структура и функции иммунной системы человека. -М.: Изд-во ун-та дружбы народов, 2001. — 56 с.

100. Резников Ю.П., Степанов А.В. Влияние пептидов кишечника, селезенки и лимфатических узлов на гуморальный иммунитет // Поиск новых лекарственных средств и их применение в клинике. Чита, 1990. - ч. 1. С. 178179.

101. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир, 2000.-592 с.

102. Роль лимфопетидов в гуморальной регуляции функций лимфоидной системы / Антоненко В.Г., Лиссова З.И., Третьяк Н.н. и др. // XIV съезд Всес. физ. общ. им. И.П. Павлова.-Баку. 1983.-Т.2.-С. 143-150.

103. Сакаева Д.Д. Влияние некоторых антибиотиков на иммунологические свойства организма при иммуносупрессиях // Автореф. дисс. к. м. н. Уфа, 1996.-22 с.

104. Сапин М.Р. Иммунная система и иммунодефицит // Клинич. медицина. — 1999. Т. 77. - № 1.-С. 5-11.

105. Сапин М.Р., Аминова Г.Г., Русина А.К. и др. Состояние лимфатических узлов и тимуса в условиях внешних воздействий // Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии. М., 1981 б. — С. 64-65.

106. Сапин М.Р., Никитюк Д.Б. Иммунная система, стресс и иммунодефицит. -М.: АПП "Джангар", 2000. 184 с.

107. Сапин М.Р., Этинген Л.Е. Иммунная система человека. М., Медицина, 1996.-304 с.

108. Семенов Г.В., Касьянов Г.И. Сушка сырья: мясо, рыба, овощи, фрукты, молоко // Учебно-практическое пособие. Серия «Технологии пищевых производств». Ростов на Дону: «МарТ», 2002. — 112 с.

109. Семенова И.Б. Принципы коррекции вторичных иммунодефицитов двумя различными по своей природе иммуномодуляторами анатоксином стафилококковым очищенным и ликопидом // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1998. - № 1. - С. 100-104.

110. Семенова Л.Ю. Действие на систему комплемента пептидных регуляторов препаратов лимфы и брыжеечных лимфатических узлов: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Чита, 1999.

111. Серый С.В. Целенаправленная иммунокоррекция цитомединами лимфоидных органов // Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза: Тез. Докл. Науч. конф. / Воен.- мед. акад. Им. С.М. Кирова. Л., 1987. С. 90-91.

112. Серый СБ., Пасхина Т.Г., Пелевин М.А., Дейгин В.И., Короткое A.M. Влияние иммуноактивных пептидов тимуса на регенерацию рецепторов тимоцитов // Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов. Тез. докладов. Пущино, 1990. - С. 163.

113. Слепушкин В.Д., Павленко B.C., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Влияние полипептидов, выделенных из сердца, на течение экспериментального инфаркта миокарда // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1987.- № 1. - С. 26-27.

114. Смирнов B.C. Вторичные иммунодефицитные состояния и их коррекция при промышленных катастрофах и стихийных бедствиях: Автореф. Дис. .д-ра мед. наук. СПб, 1992. 38с.

115. Смирнов B.C., Фрейдлин И.С. Иммунодефицитные состояния. — СПб: "Фолиант", 2000.-568 с.

116. Степанов А.В. Некоторые свойства цитомединов из сумки Фабрициуса, костного мозга и кишечника // Механизмы патологических реакций. Новокузнецк, 1991. С. 126-128.

117. Степанов А.В., Резников Ю.П. Влияние пептидов из лимфоидной ткани на состояние гомеостаза у эмбрионально бурсэктомированных цыплят // Физиология и патология перекисного окисления липидов, гомеостаза и иммуногенеза. Полтава. 1991. С. 91-92.

118. Степанов М.А. Цитомедины как межклеточные регуляторы / Цитомедины. Чита. 1988. С. 60-63.

119. Стефанов С.Б. Морфометрическая сетка случайного шага как средство ускоренного измерения элементов. //Цитология, 1974, №6, с.89-93.

120. Тессенев В. Реакция «трансплантат против хозяина» на мышах гибридах первого поколения. В кн.: Иммунологические методы. Под ред. X. Фримеля. Мир. 1979.-с.182-186.

121. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Поздняковский В.М. Биологически активные добавки в питании человека. Томск: Изд-во НТЛ, 1999. -296 с.

122. Утешев Б.С., Сергеев А.С., Коростелев С.А. Анализ современных направлений в создании иммунотропных средств // Эксперим. и клинич. фармакология. 1995. - Т. 10. - № 3. - С. 3-6.

123. Ушакова Н.Д., Перелыгина Г.М. // Стресс и иммунитет: (Психонейроиммунология). Л., 1989. - С. 206-207.

124. Федосеева В.Н., Шарецкий А.Н. и др. Методические рекомендации по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств химических факторов окружающей среды. М., 1989. - 47 с.

125. Федяхина Р.Ф., Рыбакова Л.П., Тутова Л.Ю. Влияние экстракта лимфатических узлов на гемопоэтические и лимфоидные клетки в норме и при различных формах лейкозов // Онкология. 1992. -Т. 12. №4. - С.47-50.

126. Филев Л.В., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Регуляция функциональной активности стволовых клеток предшественников гранулоцитопоэза полипептидными факторами тимуса и костного мозга // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1982. - №4. - С. 94-95.

127. Фрейдлин И.С. Использование культуры мышиных перитонеальных макрофагов в качестве моделей для изучения клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы организма и их применение под влиянием биологически активных веществ // Метод, рекоменд. Л., 1976.

128. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб.: Наука, 2001,4 3-4.

129. Хавинсон В.Х., Жуков В.В., Дейгин В.И., Короткое A.M. Влияние тималина и синтетического пептида тимуса на активность ферментов метаболизма пуриновых нуклеотидов в тимоцитах // Тез. докл. Науч. конф. «Биохимия медицине». Л., 1988. С.198-199.

130. Хавинсон В.Х., Кузнецов С.В. Теоретичекие аспекты применения цитаминов // Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма. СПб.: Наука, 1996. С. 87-88.

131. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Серый С.В. и др. Разработка пищевых добавок (парафармацевтиков) на основе пептидных биорегуляторов // Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма. СПб: Наука, 1996.-С. 86- 87.

132. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г, Малинин В.В., Серый С.В. Средство, стимулирующее репаративные процессы, и способ его применения / Патент РФ №2139085. 1999.

133. Хавинсон В.Х., Серый С.В., Малинин В.В. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью / Патент РФ № 2080120. 1997.

134. Хаитов P.M. Современные представления о защите организма от инфекции // Иммунология. 2000. - № 1. - С. 61- 64.

135. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000. 432 с.

136. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотропных лекарственных средствах // Иммунология. 1996. - №6.- С. 4-9

137. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения // Иммунология. — 2000. №5. - С. 4-7.

138. Хмельницкий O.K., Гринцевич И.И., Григорьева З.Г. и др. Морфофункциональное состояние вилочковой железы морских свинок при воздействии препаратов тимуса и костного мозга // Бюл. Эксперим. Биологии и медицины. 1975. №7. С. 83-86.

139. Цыпин А.Б., Мануйлов Б.М., Макаров А.А., Витязев Г.А. Способ получения биологически активных веществ из ткани селезенки. А.с. 1805568 // Бюл. Изобрет. и открытий.- 1993. №12.

140. Чипенс Г.И., Веретенникова Н.И., Вегнер Р.Э. и др. Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторов. Рига: Зинатне, 1990. -326 с.

141. Чиркин В.В., Семенков В.Ф., Карандашов В.И. Вторичные иммунодефициты. М.: Медицина, 1999. - 248 с.

142. Шанурин С.Ю., Гурьянов С.А. Михайлова А.А. Индивидуальный миелопептид оказывает корригирующий эффект на антителопродукцию в модели иммунодефицита, вызванного адриамицином // Иммунология. 1993. №2. С. 17-19.

143. Шарова Е.Е. Микроанатомическая организация нижних трахеобронхиальных лимфатических узлов крыс в условиях воздействия паров диметилсульфата // Дисс. к. б. н. — М., 1989. — 237 с.

144. Юшков В.В., Юшкова В.А. Влияние биорегуляторов на поведение и нейромедиаторный гомеостаз // Симпозиум: Пептидные биорегуляторы-цитомедины / Воен.-мед. акад. им. С.М. Кирова. СПб., 1992. С.151

145. Яковлев Г.М., Новиков B.C., Хавинсон В.Х. Резистентность, стресс, регуляция. Л.: Наука, 1990. 238 с.

146. Яковлев Г.М., Новиков B.C., Смирнов B.C., Хавинсон В.Х. Биорегуляция в медицине катастроф. СПб.: Наука, 1992. — 42 с.

147. Яковлев Г.М., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. и др. Тимоген новый синтетический иммунорегулирующий пептид тимуса // Цитомедины: Сб. науч. трудов / Под ред. Б.И. Кузника; Читин. Гос. мед. ин-т. Чита. - 1988.- С. 66-68.

148. Яковлева В.В., Васильев Н.В. Влияние тимэктомии на динамику факторов естественного иммунитета // Тимус и его влияние на организм. Томск, 1982.-С. 221-225.

149. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа // Иммунология. 1999. - № 1. - С. 17- 24.

150. Ярилин А.А., Мирошниченко И.В., Михна М.Г. и др. Комплексное тестирование активности препаратов из тимуса in vitro // Иммунология. 1986. -№ 3. - С. 23-26.

151. Ambrosius A., Rudolph W. // Grungris der Immunobiologie. — Jene. 1990. -P. 375.

152. Arion V. Ya. Contemporary Views on the Nature and Clinical Application of thymus preparation // Russion Journal of Immunology. Vol. 2. - №3-4. - 1997. - P. 157-166.

153. Arion V. Ya., Zimina I.V., Lopuchin Yu. M. Contemporary Views on the Nature and use of thymus preparation // Journal Immunology. J. Allergol. Clinic. Immunol. 1994. - P. 4-17.

154. Bach J. F. // Jmmune regulations by characyerized polypeptides: UCLA sympos. mol. and cell. biol. New ser. -V. 41. N.Y.: A.R.Liss. - 1987. - P. 245.

155. Bach J.-F. Les hormones thymigues // Nouv. Presse med. 1979. - An.8. -№35. - P. 2797-2799.

156. Basch R. S., Goldstein G. Induction of T-cell differentiation in vitro by thymin, a purified polypeptide hormone of the thymus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. -Vol. 71.-P. 1474-1478.

157. Bernengo M.G., Appino A. Thymopoietin in sezary syndrome. J. Nat 1. Cancer Inst. 1992. - №17. - P. 1341-1346.

158. Besedovsky И.О., Rey A.E., Sorkin E. // J. Immunol. 1985. - Vol. 135. - №2.- P. 750-754.

159. Bienenstock J., Befus A.D. A review of mucosal immunology // Immunology.- 1980.-Vol.41.-P. 249-270.

160. Blute R.M., Parnet P., Dantzer R., Kelley K.W. Interleukin-1 receptor antagonist blocks effects of IL-1 and IL-1 on social behavior and body weight in mice. Neurosci. Res. Commun. 1991. - Vol. 9 (3). - P. 151-158.

161. Bret Dibat J.L., Bluthe R.M., Kent S., Kelley K.W., Dantzer R. Lypopolysaccharide and interleukin-1 depress food-motivated behavior in mice by a vagal-mediated mechanism. Brain Behav. Immun. 1995. - Vol. 9 (3). - P. 242-246.

162. Cardona Pera D. Administrachion of glutamine and its dipeptides in parenteral nutrition. Which patients are candidates ? // Nutr. Hosp. 1998. - Vol. 13. - №1.- P. 8-20.

163. Cordero O.J., Maurer H.R., Noguera M. Novel approaches to immunotherapy using thymic peptides. TIBS. 1997. - p. 10-13.

164. Crestani F., Seguy F., Dantzer R. Behavioral effects of peripherally injected interleukin-1. Role of prostaglandins. Brain Res. 1991.- Vol. 542 (2). - P. 330-335.

165. Dantzer R. How do cytokines say hello to the brain? Neural versus humoral mediation. Eur. Cytokine Netw. 1994. - Vol. 5 (3). - P. 271-273.

166. Dunn A J., Anton M., Chapman Y. Reduction of exploratory behaviour by intraperitoneal injection of IL-1 involves brain corticotropin-releasing factor. Brain Res. Bull. 1991. - Vol. 26 (4). - P. 539-542.

167. Ivanov V.T., Karelin A.A., Philippova M.M. et. al. Hemoglobin as a source of endogenous bioactive peptides: the concept of tissue-specific peptide pool // biopolymers. 1997.-Vol. 43. - №2. -P.171-188.

168. FAO/WHO energy and protein requirement: Report of a joint FAO/WHO at hot expect commitec on enerqy and protein reguirements. Geneva: WHO. — 1973.

169. Furst P., Pogan K., Stehle P. Glutamine dipeptides in clinical nutrition // Nutrition.- 1997.-Vol.17. -№2.-p. 100-106.

170. Gieldanowski J., Slopek S., Kowalczyk-Bronisz S.H. Immunobiolological and pharmacological properties of thymus factor X (TFX). Immunotropic activity // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1980. - Vol. 28. - № 6. - P. 853-857.

171. Goldstein A. L., Chirigos M. A. Lumphokines and thymic hormones, their potential utilization in cancer theraputics // Progress in cancer research and therapy. New-York: Raven Press. 1981. - Vol. 20. - P. 125-134.

172. Goldstein A.L., Low L. K., Thurman G. B. Et al. Current status of thymosin and other hormones of the thymus gland // Recent Progr. In Hormone Res. N.Y. etc. 1981.-Vol. 37.-P. 369-412.

173. Grey H.M., Sette A., Soren B.Structurel characteristic of peptides required for their interaction with IA/Molecular basis of the immune response: Ann N-Y. Acad. Sci. 1988. - Vol. 546. - P.72-79.

174. Goldstein G., Scheid P., Boyse E.A. et al. A syntetic pentapeptide with biological activity characteristic of the thymic hormone thymopoitin // Science. -1979.- Vol. 204.- №4399.- P. 1309-1310.

175. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody producing cells // Science. 1963. - Vol. 140. - № 2965. - P. 405-407.

176. Johnson H.M., Torres B.A., // J. Immunol. 1985. - Vol. 135. - №2. - P. 773775.

177. Karelin A.A., Blishchenco E.Yu., Ivanov V.T. A novel system of peptidergic regulation // FEBS Lett. 1998. Vol. 428. - № 1-2. - P. 7-12.

178. Klein J.J., Goldstein A. L., White A. Enhancement of in vivo incorporation of labeled precusors into DNA and total protein of mouse lymph nodes after administration of thymic extracts // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1965. - Vol.53. -№4.-P. 812-817.

179. Laye S., Bluthe R.M., Kent S., Combe Ch., Medina Ch., Parnet P., Kelley K., Dantzer R. Subdiaphragmatic vagotomy blocks induction of II-1 mRNA in mice brain in response to peripheral LPS // Am. J. Physiol. 1995. - Vol. 268. - P. 13271331.

180. Li J., King B.K., Janu P.G. et al. Glycyl-L-glutamine-enriched total parenteral nutrition maintains small intestine gud-associated lymphoid tissue and upper respiratory tract immunity // JPEN J. Parenter. Enteral Nutr. 1998. - Vol. 22. - №1. -P.31-36.

181. Lowry O., Rosebroungh N.J., Farr A.L. et. al. Protein measurement with Folin phenol reagent//J. Biol.Chem. 1951. - V. 193.-№ l.-P. 265-275.

182. Moller G. Do suppresor T cell exist ? // Scand. J. Immunol. 1988. - Vol. 27. -№ 3. - P. 247-250.

183. Mikhailova A.A., Shanurin S. Y., Petrov R. V. Immunoregulatory effects of two bone-marrow hexapeptides (myelopeptides) in experimental models of immunodeficiency // Immunol. Lett. 1995. - Vol. 47. - № 3. - P. 199-203.

184. Mutchnie M.G., Cummings G.D., Hoofnagle J.H. Thymosin an innovative approach to the treatment of chronic hepatitis В // Combination Therapies. - 1992. -P. 143-157.

185. Nishioka K., Amoscato A.A., Babcock G.F., Tuftsin A. Hormonelike tetrapeptide with antimicrobial and antitumer activities // Life Sg. 1988. - Vol.28. №10. -P.1081-1090.

186. Nishioka K., Constantopoulos A., Satoh P.S. et. Al. // Biochim. Biophys. Acta. 1973.-Vol. 311.-P. 217-229.

187. Penkov M. A., Zubarev S.F. Correction of immune disturbances by thymoptin, tactivin and decaris in patients with endogenous uveitis // Ophtalmologic. Journal. -1992.-P. 1-5.

188. Petrov R.V., Mikhailova A.A., Fonina L. A. Bone marrow immunoregulatory peptides (myelopeptides): isolation, structure, and functional activity // Biopolimers. -1997. Vol. 43. - №2. - P. 139-146.

189. Quik M., Collier В., Audhya Т., Goldstein G. // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1990.-Vol. 254.-P. 1113-1119.

190. Reibman J., Meixler S., Lee T.C. etal. Trasforming growth factor beta 1, a potent chemoattractant for human neurophils, bypasses classic signal-trasduction pathways // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - №15. - P.6805-6809.

191. Rinaldi Garaci E., Del Gobbo V. et al. Modulation of endogenous prostoglandins by thymosin oti in lymphocytes // Cell. Immunol. 1983. - Vol. 80. -№1. - P. 57-65.

192. Robert F., Geenen V., Schoenen E. et. al. // Brain Behav. Immunol. 1991. -Vol. 5-P. 102-115.

193. Sadee W., Drubbish V. Amidon G.L. Biology of membrane transport proteins//Pharm. Res. 1995. - Vol.12. - №12. - P.1823-1837

194. Safieh-Garabidian В., Kendall M.D. Thymulin and its role in immunomodulation // J. Autoimmun 1992. - №5. - P. 547-555.

195. Simonsen A.H., Audreassen T.T., Bendix K. The healing strength of corneal wounds in the human eye / Exp. Eyl. Pes. 1982. - Vol 25. - №3. - P. 287-292.

196. Sztein M.B., Serrate S.A., Goldstein A.L. Modulation of interleukin 2 receptor expression on normal human lymphocytes by thymic hormones // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. - № 16. - P. 6107-6111.

197. Watkins L.R., Maier S.F., Goehler L.E. Cytokine-to-brain communication. A review and analysis of alternative mechanisms / Life Sci. 1995. - 57 (11). - P. 1011-1026.

198. Whisler R.L., Stobo J.D. Heterogenity of murine regulatory T-cells 1. Subpopulations of amplifer and supressor T-cells // J. Med. 1976. - Vol. 144. - № 2. -P. 398-423.

199. Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto Т., et al. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice. Immunol. 1979. -№38. - P. 577-583.

200. Zamyatnin A.A. Structural classification of endogenous regulatory oligopeptides // Protein Seg. Data Anal. 1991. Vol. 4. - № 1. - P. 53-56.

201. Zatz M.M., Oliver J., Samuels C. et al. Thymosin increases production of T-cell growth factor by normal human peripheral blood lymphocytes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81. - P. 2882-2885.

202. Zhow A.W., Guo J., Du Y.C. NLPR, an agonist of AVP4-8, increases NGF gene expressin in memory-impaired rat brain // Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids. 1994-95. - Vol. 1. - №1. - P. 57-58.

Информация о работе

Битуева, Анна Викторовна
кандидата биологических наук
Улан-Удэ, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы