Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полисахариды некоторых видов дрожжей рода Sporobolomyces Kluyver, van Niel, 1925

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Полисахариды некоторых видов дрожжей рода Sporobolomyces Kluyver, van Niel, 1925"

и n t) я i

flu — ¿ "

ЮПЕСТЕРСТЕО ЗД>АЕООХРАНЕШ PCÎCP ХШКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИНСТИТУТ

Ка правах рукописи УДК 579. 61. 66: 547. 917

СМИРНОВА Надежда Викторовна

ПОЛИСАХАРИДУ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ДРОЖЖЕЙ РОДА Sporcbolomycës Kluyver.van Niel,1925

03. 00. 07-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учебной степени кандидата биологических наук

Самят-Пйгервург

1/992.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Хкмико-фармадев-тического института (г.Санкт-Петербург).

Научный руководитель - доктор биологических наук Г.А.Ватовская,

Научный консультант - кандидат биологических наук Е.П.Ананьева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ■ Е.П.Яковлева, .

кандидат биологических наук Т.В.Меледина

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова

За1дита состоится у. в Л часов

на заседании специализированного'совета К 084.63.01. Химико-фармацевтического института по адресу: 197376 г.Санкт-Петербург, ул.Проф.Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета • кандидат биологических

наук Н.В.Кириллова

/ *

. ' I Полисахариды некоторых видов дротетей рода

¿нТациЗрогсЬо1ояусез К1иууег,уа1 n161,1925.

Актуальность теш. Исследованиями последних десятилетия впал е но значение дрожкевых организмов как продуцентов биологически ктлвных полисахаридов. Показана перспективность использования омо- и гетерогликанов дрожяей еядов Ктсс^опЛа , Сгур1о-юссиэ и др. в качестве лекарственных средств, детоксикато-ов, основ для косметических кремов. Некоторые из них в настоящее рег.'л внедряются в практику здравоохранения и другие области.

К моменту начала работы, сведения об углеводных полимерах аллистоспороЕЫх дротлей, в частности спороболомицетов, были весь-а ограниченными и относились к отдельны!.! штаммам. Между тем донне о продукции и особенностях биосинтеза ими полисахаридов, их остава и свойствах, такхе как и о полисахаридах клеточной стенки, пособствуют расширению знаний о биологии дробей рода ЗрогоЬо-отусе£ , имеют таксономическую и практическую ценность.

Работа выполнена в соответствия с Координационным планом на-чных исследований по комплексной программе ":.!:: кроб/ология" (пробега !Ь 2.20.9) и программой ГКНТ 0.74.05 18112, входит в тематику абот института (Государственный регистрационный № I 01 88 0 053943).

Цель я задачи исследования. Цзлыэ настоящей работы было нзуче-не не исследованных ранее в качестве продуцентов полисахаридов редстазителей дротаевых и диморфных пгаммов ЗрогсЬо1отусе.з

В связи с поставленной целью потребовалось решить следуйте адачи:

- изучить способность ряда зтзммов 5рогоЬо!отус<?з проду::-ии внеклеточных полисахаридов;

-выявить ооо^'лшэст! их образования, ссстога и строения;

- получить полисахарида клеток я пряности я:с анализ.

Научная новизна. Установлена способность изученных дрожжевых к диморфных штаммов спороболомицетов синтезировать в определенных условиях зкзополисахариды - машина. Показано, что на процесс их образования существенное влияние оказывает рН. Канианы продуцируются только при кислых значениях рН. На црпмере S. holsatícus установлено, что при нейтралышх значениях рП, в зависимости от состава среды, вместо манна на синтезируется либо гетерополисаха-риц, либс^но происходит образования экзогликана. S. salrnor.icolor 3KÍ Y -G79, йрОдуцируювдй в отличие от других штаммов два полимера (гетерополисахарид и маннан), способен повышать продукцию последнего после предварительного пассирования культуры в условиях, типичных для образования маннанов.'Таким образом, рН может выступать регулирующим фактором при биосинтезе экзогликанов дрокжей рода Sporobolomyces.

Установлено строение внеклеточны.. манна нов л сходство их с маннанами дроккей родов Rhodotorula,Bullera tsugae.

Показана сложность состава полимеров плеточной стенки и уча тие растворимого глюкоманнэна клеточной стенки S. holsaticus биосинтезе внеклеточного маннана.

Практическая ценность. Результата работы имеют значение для выявления филогенетических связей i ж среди баллистоспоровых дрс ней, так и среди не относятся к ним родоЕ. Благодаря специфиче кпм физико-химическим характеристикам, таким как вязкость и др., внеклеточные полисахариды спороболомицетоБ могут быть использош для различных практических целей. Показпо, что S. holsaticui синтезирует с хорошим выходом маннан, пригодкЫГдш: приготовлен! пленок шдиципскоги назначения. Этот полимер оказывает та тле а к Еируюц&с действие на клетки коконуклсарных фагоцитов.

Апробация работа. Материалы исследования были доложены на

едашга Ленинградского научного общества микробиологов и элкдемио-огов /1988/, на копферешзп: молодых ученых "Творчество молодых -аучно-техническому прогрессу /Ленинград, 19В8/, на конференции Биоконверснп - 88 "Теоретичесгае основа ткробной конверсии" Рига-Юрмала, 19ВЗ/, на конференции "проблемы и перспективы био-ехпологии" /Братислава, ЧСС?, 1989/, Всесоюзной конференции "Рефляция микробного метаболизма" /Ц/дано, 1989/.

Пуйшзши. По материалам.исследования имеется 6 публикаций.

Структура работы. Диссертация сосопт из введения, обзора птературы (3 раздела), описания'материалов п методов исследования, зложения полученных результатов я их обсуждения (4 раздела), заточения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена а страницах машинописного текста, содержит рисунков, У таблиц. Еиолиографпя включает наименований, из них

д иностранных языках.

'.'атер^алы и методы исследования

3 качестве объектов исследования использовали пять щтаммов ютсеИ рода' ЗрогоЬо1огГ|усез из коллекции микроорганизмов ЛССС1 Всесоюзной коллекции микроорганизмов: 3.1ю1£;а^сиз ' ЛХ&!, говеиз ЗК,"У-681, ВН.! У-5В4, ВКМ У -686, Э. за1тсгцсо1ог С,1 У -579.

Морфолого-физнологическпе и биохимические особенности дрог-лей |учали по известной методике /Бабьева, Голубев, 1902/.

Для получения экзопол:юахаридов двухсуточные культуры, лырз-!ниые на сусло-агаре, засевал:; в модифицированную среду Харпвд, :браннуа после ряда предварительных экспериментов. Сна имолч сло-идап состав: (г/л дистиллирован;!^ вода) :гл:о;:оз.1 - 50, "4)г504 - 2.5. К!Г2Р04 - 1,0, - 0,«5, Кч.. - 0,5,

О - 0,1, дрзгчевоЛ азтолизат - :.гл. {'Л •;)

и ферментацию (I2U ч) проводили на лабораторгах качалках при '¿20 об/шн ¡1 температуре 24-25 °С в колбах объемом 750 мл, соц< каваих соответственно 50 и 150 мл среда.

В составе среди в ряде экспериментов глюкозу заменяли на i хорозу, а сульфат аммония на мочевину или пептон в эквклюлярно; по азоту количество (0 33 г/л); варьировали такте содержание д Г.!Х КОМПОКСНТОВ.

В прочесов роста и развитая культур определяли биомассу к ток пефелометричесгаш способом, измеряя оптическую плотность р Еоров при А -590 на фотоколориметре марки ФЭК - 5G ПМ с после цим расчетом по калибровочной кривой. Экзополисахарпды осаждал освобожденной от клеток ферментационной массы этанолом. Выход лисахарида определяли весовым методом, содержание углеводов пс тоду Пека, Греси /I960/; рН измеряли потенциометрически, содех аммонийного азота методом КоноЕалова( 1361).

На различных стадиях развития культуры проводили микроскс ческое исследование с использованием светового микроскопа к 3J ронного трансмиссионного микроскопа Тесла-613 (ЧССР). Ультрот< срезы окрашивали методом серебрения /Громов и др., 19^3/.

Для получения гликанов из клеток дродоки вырагивалл но cyi агаре в течение 4 суток, затем разругали в дезинтеграторе г;:с: го типа (А.С.СССР № 440 153). Растворимые полисахариды осажда. этанолом из супернатантов после отделения нерастворимых осадк клеточных стенок и фракционировали цетавлоном (Методы химии у водов, 1967). Из осадков последовательной обработкой различны агентами выделяли структурные полисахариды ¡меточных стенок.

Внеклеточные поисах^иды фррчшонпровали с использован:: реактива Фел^нга или цетавлона (Методы химии углеводов, 1967) Образцы анализировали по следую:-™« показателям: относительной кости 0,1% раствора - с помощью вискозиметра Оствальда (0 0,1

ельному вращению - га поляриметре мэр*л: "Изрган-Элмер" модель I, гомогенности - методом гель-хроматограф:: л ка колонке ,8 х 28 с;.:) с сефярозой 43, содержало бсл:са - методом Лоури Lowry et al , 1957/, зольности - яееоилд методом.

Для определения качественного состава полисахариды гидролн-пали 2 при 100 °С в течение 4 ч и исследовали хро-

гографией на бумаге Фяльтрак F" -II е системе растворителей: Зутанол:этанол:зода:аммиак - (40:10:49:1) с последующа? проявлен кислым фталаноч анилина.

Соотношение моносахаридов устанавливали методом ГЗХ ацетатов толов. Анализ проводили на хроматографе Ивет-162 ка колонке Ю,0 х 0,4 см), наполненной хроматоном N-AV-DMCS с 3% -225, при 190' .

Соотношение гликозидных сачзей в образцах полисахаридов опре-1яля методом перйодатного окисления с последую'чпм боргндриднхдд ¡становлением /Захаров?, Носенко, I9G2/.

Метилирование углеводных образцов осуществлял:! методами горса и Хакоморп. Анализировали смеси метилпроизводных в виде патов частичнометилированных метилгликозл.тов ГГ^ при програм--огонии температуры (120-220 °С).

Спектры 13С ЖР снимали на приборе А,'.:—300 Бруке? (ОРТ). спектры получены на приборе LR -20.

Статистическую обработку данных проводили в соответствии с Т 11.004-74.

Результаты исследования и их о5су::г,?ино

I. Мо"^ологс-/';:гзнолэг,.:чо"г|,.ал :: бног/улчес'^я уч:п-?|*р-"'т:г'г цту?. С"1юш;ьг."1 ппизгагезми пвнчз^темности лстгог?Ч:г.':: .'го :*.*■' з"/ rLovoCoiл^^отсл налично пм:г-".чг-з т • тлстоспор. C.ü:"iKO, rp o г.е с о i- nCiy. то*: ::ог."> »згльТивярсммиЯ

(

гие кз них утрачивают способность к баллистоспорообразовэпию. Дл изучения биосинтеза полисахаридов исследуемыми штаммами необходи мо бало- уточнить их таксономическое положение. 3 связи с этим tía ЛИ изучены иорфолого-физиологические к биохимические особенности культур. При этом было отмечено вегетативное размножение почковг кием, образование в определенных условиях баллистоспор у всех атакмов. Кроме того, otra не сбразхивали сахара, обладали уреозно; протсолитичоской активностью, а культуры S. salmonicolor,S.

roseus -684 такие и j¡ -глхжозидазной. Штамм S. roseus отсутствием пигмента и типом колоний несколько отличался от описанных хул вида S. roseus , Однако, по своим ассимиляции ным характеристикам (ключевые из которых приведены в табл.1) bi изученные штаммы соответствовали типовым культурам, описанным д видов, к которым они отнесены по определителю прошей Kreger Rij /1904/. При этом штаммы S. hol_aticus, S. salmonicolor существовали только в дрожжевой форме, штаммы о.roseus были диморфными.

2. Изучение процесса биосинтеза экзополпеа'харидов. Поело в варительных экспериментов в качестве основной была Еыбрана сред Харада. На этой среде изученные штаммы спороболомицетов гак дрс яевые, так и диморфные, сиптезирс-алй внеклеточные полисахарида Из всех полимеров за исключением S. salmonicolor с помощ>ю ре тива Фелинга были выделены маннаны.

Основные закономерности процесса биосинтеза изучены на щи ре наиболее продуктивного диморфного ш—змма S. holsat leus . I скольку наряду с глюкозой наиболее интенсивно потребляемым ист< ником углерода яв._ллась сахароза, то з ряде эксперименто ее в; дили в среду Харада вместо глюкозы. При этом не отмечено каких, либо существенных отклонений основных параметров процесса *ерм •mivii (рис.1). В обоих случая" полисахарид осзждйлся гз кэтазк

o V.

ci r:

H c i :-o ■ > r~cy

p,« l.i o

r- n

in < >

H

i r>

c; n

O •

X-J O

I. '!

q o t i c-

r* I <-.

E-i

+ 111 +

+ 111 +

I + I

O

+ + I

P? + I

O

I I

lili I

+ +

+ +

« ^

n I

o

rt r 'o oí

M

ti

HH o

ce

? f f c o r 1

>• o,

o í.

T5

r-

n

-tYI

L-'XI

c;

0 o

1

+1

XJ tí

n.

n

+

+■ +

+

+

+

I n

s

тора после 54 ч культивирования. Однако, в конце ферг/сптп-(120 ч) па срог,о с сахарозой огкэч lia проввзокас биокзссы ток на 11% и выхода полисахарида ил Т0£ по сравнении с кснт-ем (среда Хзродя с глюкозоГ;). Бзтее супествекное влияние ока-ал источник азотного питания. Так, на среде с пептоном сбра-зкия-полисахарида не отмечено, па среде с г.:оч'ов::но" огэ вк-минимзлсн (табл.2). Наиболее благопрпятн:.::.! для синтеза ока-ось использования сульфата .агония, потрсОло1ие которого со-во.-далось резким снихенлем рН (до 2,0) уже па первое сутки, i:e наблюдалось в двух первых случаях. Для оценки глиялгля центрацпл водородных ионов на образование полисахарида Lsaticus ' предприняли попытку стг.Зилизаши рН. При внесе-з среду фе-фатнои буферной систем рН 6,G, буферная емкость залась недостаточной для обеспечения необходимой величины рН. кое снижение до величины, близкой к контролю, наблюдали уже 24 ч. Однако, выход полисахарида в этих условиях снижался из , что очевидно объяснялось избытком в среде фоггат-ионов. подтвердилось при использовании среды Харада с увеличенной одной концентрацией ионов без изменения остальных цем-

ентов. При близких к контролю основных порамотроз процесса в их экспериментах происходило сни.че.чпе выхода экзэглнканз в «раза (табл.2). При это;.', отмечали морфологические изменения ьтуры - вместо вытянутых и овальных клеток увеличивалось го-сство круглых; мицелий сгоношился неровным, приобретал ; происходив частичная потеря пигмента.

В другой серии экспериментов стабилизации рН провод;:.':-! сенне:.; в сроду :.:ола (,0,5 г/iCO г.п ерзпы). 1:рн этом ог.-.о'г.-ь значительное увеличение б;<с;.:асси глеток (на ко

внелжз с контроле:.;). л:личи:п рН л ход» ¡rpoi.eccs яг. ¡:.?/

Таблица 2

Влияние услозий культивирования на биосинтез экзогликана (то! за* 1сиз.

Среда Харада, содержащая рН на 120 ч Выход, г/л Удельная Эффективность процесса Экономический коэффициент роста

биомасса полимер продуктивность

Сахарову 1,9 * 0,2 7,0 £ 0,2 5,2 £ 0,4 0,74 0,12 0,16

Мочевину 3,6 ±. 0,7 6,5 £ 0,2 1,0 £ 0,2 0,18 0,03 0,15

Пептон 3,8 £ 0,1 4,8 £ 0,4 - - - 0,14

Буфер 2,0 ± 0,4 7,1 £ 0,3 1,0 £ 0,2 0,18 0,03 0,15

Юу<>4 2,1 ± 0,2 6,4 £ 0,4 1,1 - 0,2 - - 0,15

Мел 5,5 ± 0,2 8,0 £ 0,2 2,2 £ 0,2 0,3 0,05 0,16

Контроль 1,9 ± 0,3 6,2 £ 0,3 4,3 £ 0,2 0,69 0,11 0,16

Примечапя: 1. Эффективность процесса рассчитывали гак отношение конечного продукта к количеству потребленного углеродного субстрата.

2. Экономический коэффициент роста продуцента - отношение биомассы клеток к количеству потребленного субстрата.

не опускалась ниже 6,5. Глякан осаждался из нгтквного раствора после 120 ч ферментация с выходом 2,'¿ г/л (табл.2). 1) отличие от контрольной среди, на которой синтоэнрозался манкан, в отнх условиях происходило образование гетерсполисахармга. Однако, при помещении отмытых клеток 3. holiaticus после 54 ч ¡культивирования на среде, содержащей мел, з контрольную среду Харада происходило образование маннана в соответствии с закономерностями, приведенной; на рис.1. Таким образом, снижение рН яакется необходимым условием синтеза маннана.

По данным электронно-микроскопического исследования образование маннана при снижении рК сопровождалось изменением состояния клеточной поверхности. К моменту максимального синтеза полимера, в отличие от стенки исходно!; клетки, меточная стенка ¡гредзтавлл-ла собой многослойную структуру с черецущкгдюя зонами различно:; электронной плотности. Специфическим окрашиванием в не:} выявлено несколько углеводных слоев в виде концентрических окружностей, разделенных веществом неуглеводно;-; природа. Тол.цина стенки составляла^^ км, тогда как в контроле на твердо;; среде сна колебалась в пределах им. Наблюдалось разрыхление отделах внешних, участков клеточкой стенки (рис.2).

В отлична от других исследованных .у ль тур S. sa1.. ..;исо'юг образовывал два полимера - какнозосодер.^ады гетерополпеахарид а шннан. Образование мэ-чшна увеличивалось более чем ь 2 ра.гз посла предварительного IC-кратнзго пассирования ¿;ультуры ¡и г^га— р::зозаш;ой среде Харада. Суммарни:": выход полисахаридов составил '¿,й г/л. Следует отметить, что обцуя удвльь::л пли-

ток, naccapOE'.ic-Oix на среде ларада, была ¡ц'С'/г.лькз üív.o :o;;ï-рольноп, а продуктивность пэ спнтазу гiui;:ri:: : ..зор jçr.-j [i-.z.z.àj.

п

У.'/' ... ,

а.-'.'

X ь.'"''' • -'Л'- -лм

2а

УЗ'.^йЙР.,«*!»-^ ' -

* :г ^

V- 7\Т

•4*.

.: I

т-

¿5

тгч

'Г 'У-

■

рис.^ Электронно- микроскопическое

исследование клеток Э. holsaticuз. Увеличение 1: 45000.

4 -клетки после 96ч роста на

сусло-агаре 2 -клетки е процессе синтеза маннана( 96ч) до (2а) и после специфического окрашивания на углевод(25), . '

Таблица 3

' Соотношение полисахаридов 3. за1ггагпсо1ог

Условия В^ход,г/л Удельная про- Соотношение

предварительно го опока с- полисаха- дуктивность по синтезу Фракцн и

выраздвания са риды полисахаридов ¡/а;:на-ка глапнан готеро- полп- сахарид

Сусло-агар 4,8±0,3 2,6^0,5 0,54 0,13 I 1,5

Среда „ Харада" 7,0^0,2 2,8^0,3 - 0,40 0,30 2 1.5

* - 10-кратное пассирование.

Выделение маннанов при снижении рН до 2,0, вероятно, можно рассматривать как защитную реакцию дро.чжей на неблагоприятные условия культивирования.

3. Характеристика экзополисахаридов. Полученные внеклеточ-ше полисахариды представляли собой порошки белого или серсзато-белого цвета, без вкуса и запаха, хорошо растворимые в воде после предварительного'набухания в концентрациях до 2%. Основным компонентом полимеров, образуемых и дрожжевыми, и диморфными штаммами ЗрогоЬо1отусез на среде'Харада, латалась машгоза. Кроме того, ош! содержали галактозу, фукозу и глюкозу в различных количественных соотношениях. Количество белковых принесен не превышало 1,1%, а зольность варьировала от 3,1 до 6,2£. Ьо всех случаях, кроме образца 3. Ьо1Баисиз , полученного со среды с мелом, были выделены паннаны в количестве от 25^ до 70£ от исходных полисахаридов (табл.4).

Полисахарид Б. Ьо1заисиз , полученный со среды о мелем, значительно отличался по количественному соотношению моносахаридов представлял собой гетерополисахарид, содержавший шнногу, .

Таблиц 4

Состав исходных полисахаридов спороболомицотов.

Продуцент Среда Харада с МоносахаридныЗ состав55 % Белок Зольность Содержание маннаиа %

'Мал (За1 Э1с Гис %

3.1ю1за.Исиз КМ ЛХЙ1 /7-14 Глюкозой Сахарозой Мелом■ 78.0 73.1 39,7 8,1 10,6 32,4 9,7 10,6 15,9 4,2 5,7 12,5 1,9 7,1 4,4 3,1 4,5 5,4 70 70 ~ **

3. гозеиз ВКГЛ V -681 Глюкозой 35,6 32,5 - 30,9 4,5 4,6 50

5. ГОЗёЧЗ Ы-С.1 У -684 Глюкозой 44,2 19,1 - 36,7 4,7 6,2 50

5. за1ггоп1со1ог М.1 V -679 Глюкозой 29,0 33,2 £4,2 19,6 1,6 4,2 25

Примечание: * - в пересчете на углеводную часть; ** - отсутствует.

галактозу, фукозу.

Маннаны обладали величиной оптического вращения от —18° до -8У°, содержали от 0,6 до 1% белка, относительная еязкость колебалась в интервале 1,0-1,5. Гетерополисахарид S.salmorucolor был сходен по составу с гетерополимером S. holsaticus , выделенным со среди с мелом, имел оптическое вращение -14°, и образовывал растворы, вдвое превышающие по вязкости раствори маннанов той же концентрации (табл.5).

При периодатном окислении маннанов, которое заканчивалось после.48 ч поглощалось 0,71-0,79 моль NaJO^ и выделялось 0,012-0,12 моль KCÜÜH на моль сахарного остатка. Полученные результаты ц данные боргидридного восстановления окисленных полимеров свидетельствовали о неравном соотношении I—3, I—*-4 свя: эй.

Величины химических сдвигов ЯМР-спек.ров маннанов приведены в табл.6. Все спектры были идентичными, содержали 12 сигналов, что соответствовало дисахаридному фрагменту. Сравнение полученных данных с имеюэдмися в литературе показало, что сигналы соответствуют структуре маннана, повторяющееся звено которого представлено на рис.З.

ч Таким образом, все иоследованные штаммы дрожжей рода Sporo-boloinyces как дрожжевые, так и диморфные, были способны к образованию маннанов, сходных по строению с маннэнзми видов Rho-dotorula "I некоторых видов Bullera

Специфические физико-химические характеристики маннанов делают перспективным их дальнейшее изучение о целью практического использования. Так, показано, что полимер S. holsaticus монет использоваться для получения п.'енок медицинского назначения. Соответствующий акт испытаний приложен к диссертации. Кро:, а того, он оказывает активирующее влияние на клетки системы мононуклеар-ных фагоштоь.

Таблица 5

Характеристика очицзнкых полисахаридов

Полисахарид Содержание моносахаридов, % * • Белок Зольность Ш20

Van Gal Glc Fue % СО, 1; Нг0

5. boisâticus КМ ЛК>Л Л -14 с сахарозы с глюкозы 100 100 - - 1,0 1,0 1,0 1,0 -90° -78° 1,24 1,53

5. rose us BiC.l Y -681 94,0 - 6,0 - . 1,0 2,0 -89° 1,30

5. roseus HI« V -M 100 — - - 0,8 1,4 -06° I.II

S. sal pícnico lor }Ш Y-679 маннан 100 0,6 8,2 -48° 1,0

гетерополисаха-рид 30,4 26,3 7,1 36,2 0,6 4,0 -14,5° 2,16

* - в пересчете на углеводнуэ часть.

Таблица S

TQ

Ззлпч'.иш хиглнчоскнх сдвигов С ЯМР-спектров внеклеточных маннаноз

C-I C-2 C-3 • C-l C-5 C-6 C-l' C-2' C-3' C-l* C-5' C-5'

1 ¡ ............ j А-14 ya.460 71.979 73.347 78.670 76 . 746 62.317 101.867 69.229 80.605 66.816 77.877 62.779 '

i •"• 1 Y - 681 98.380 71.897 79.243 78.565 76.656 62.218 100.909 G9.164 80.556 66.755 77.783 62.685

1 J-11 Y - ÖW 97.516 71.032 72.393 77.708 75.792 61.369 101.771 38.293 79.681 65.899 76.913 61.829

S. •-'Ol or 98.465 7I.S9I 73.341 78.663 76.743 62,311 101.839 69.245 80.621 63.050 77.813 62.780

1t

V' o V

, 1 ¡- I

Vi»4'

95 90 85 80 75 70 65 60

I3c ÍMP-c:n:i:r¡

o ¡:: цспчпго окпогликйч!- 3.holsnticua.

4. Полисахариды клеток спороболомнцетов. Выделение полисахаридов из клеток проводили по приведенной схеме (рис.4). Мз осадка супернатанта всех штаммов выделен глюкан (фр. 3 ), структура которого, гак показано 13С ШР-спектроскопиой, идентична структуре гликогена. Растворимые полисахариды клеточной стенки представляли собой протеогликаны, углеводная часть которых состояла из манчозы, галактозы, фукозы, глюкозы (фр.4). Аналогичный качественный состав имели и осп щи клеточных стенок (фр. Я). После их последовательно!! обработки различными агентами получены нерастворимые компоненты клеточных стенок (фр.2£) и водорастворхлая фракция (фр.2г). Нерастворимые компоненты для всех изученных штаммов являлись про-теогликанами, углеводная часть которых представлена маннозой и глвкозой(1:1,4-2,5). Белок составлял до По данным перйодат-ного окисления и метилирования остатки маннопиранозы в них были соединена 1—3 и 1-М гликозидными связями, ИК-спектры всех образцов были идентичными и свидетельствовали о р -конфигурации связей. Вторым ломпонентом нерастворимых углеводов клеточных стенок был хитин, содержание которого было большим у диморфных штаммов. Водорастворимая фракция (одна из частей растворимых полисахаридов клеточной стенки (фр,2а)) представляла собой глюко-каннан, содержавший белка и имевший оптическое вращение -4и°. Его 13С йМР-спектр содержал сигналы, указывающие на наличие ди-сахаридного фрагмента, идентичного повторяющемуся звену маннана. Сигналы, относящиеся к глюкоплранозе, -были менее интенсивными и свидетельствовали об ее присоединении в положении I—6 к остатку маннопиранозы. Тагам образом, существенная часть фракций полисахаридов клеточной стенки всех изученных видов являлась гюкоманна-нами.

Так как. было обнаружено определенное сходство в-строении вне-

■S/Xtte ¡'.Лет ки ---------------А

дез илтагриро-анис, 2С-26 мкн.,50 CCû об/кин\

\

супсрнотонт - cbcî зоримые нсг./сахаркды клточпои суонки ¡i цитоп л- зматичзсгсиз

/ цзтпглон + бура,

Y

I pH 9,0

cynennovah? I ? оОьеда ¿ о г.';нола

гликоген

3

структурио-

кетаооличзскин

полисахарид

осадок - нерастворимые ко.чг.оненги кп'лкн, клеточной CïUiKH

■:_?кХ.,;А f.

ь.:стра;л:ип SZNaOH 1 час, i ати

цо.'ЮЧ'.ыешстЕОРКмип с?адок 3-крат на л нрокиькс ьодо у,, ацетонов, 3CCÛ об/um, 15

о огдо'к

/

экстрахция '¿o¿o¡i,\

LCiP, 2 часа \ ОСПД01:_- J;OJlOpO_nTJ:OpVIl!4ÍÍ

рчактив телинга

¿-кратная про-.мырка ведог:, ацетоне«,15 мин. ЗССО oû/УЛ'.Н

отру ктурннп полисахарид

КГП-ТЯ 26 моннозосодержаний полисахарид

*

Рио.4 >хема к.чделеиии по/исахаридзв клеток споройолокице'1~в.

клеточногоманнана и полимеров клеточной стенки,для выявления возможной взаимосвязи их синтеза была определена динамика накопления маннозосодержащих полимеров в клетках при биосинтезе ман-нана. Для этого клетки 3. Ьо1яа1юиз с различным сроком культивирования Фракционировали в соответствии со схемой (рис. 4.). При этом во фракции ? содержание глюкозы и галактозы оставалось практически неизменным (7,7-10,6% и 24,5-23,7% соответственно). Содержание фукозы возрастало от 6,62 до 19,6%. Содержание маннозы после 54 часов снижалось от 61% до 46,4%. Получен"ые из него нерастворимые полисахариды яелялись глюкоманнанами с весьма близким соотнесением компонентов (табл.7.).

таблица 7

Содержание моносахаридов в нерастворимом полисахариде клеточной стенки Б. Гю^аЫсиэ ка различных этапах биосинтеза маннана.

Время ферментации, час Мап

10 59,3 40,07

24 63,5 36,5

54 65,3 34,7

96 66,0 34,0

Моносахаридный состав растворимой Фракции клеточной станки был представлен маннозой , глюкозой,галактозой и Фукозой,содержание которых значительно изменялось в процессе культивирования. Так.фукога отсутствовала в составе гидролизатов на 56 ч,а содержание маннозы увеличивалось в 3 раза после 96 ч по сравнению с уровнем .отмеченным на 10ч(табл. 3.). И липь при увеличении содержания маннозы в растворимом полисахариде клеточной стенки до определенного уровня маннан обнаруживался в культуралькой гад-кости. Выделанные фракции не взаимодействовали с реактивом Фединга, что свидетельствует .вероятно,о том .что маннач приобретает окончательную структуру при переходе через клеточную стенку.

выводы

1.Bce изученные дрожжевые и диморфные штаммы спороболо-мицетов способны образовывать внеклеточные полисахариды,состоящие из маннозы, глюкозы, галактозы и фукозы. Преобладающим компонентом э.их гликаноЕ является маннан,содержание которого достигает 70

2. Маннаны представляют собой полимеры D-маннопиранозы, соединенной последовательно чередующимися 1—3 и^-1—4 гликозидными связями,сходными по строению с маннанама видов Rhodotorula и некоторых видов Bullera.

3. В процессе биосинтеза эзополисахаридов спороболомице-тов рН среды выступает регулирующим фактором:

3.1. быстрое снижение рН до 2.0 и поддержание его на этом уровне в течении ферментации является необходимым условием для образования маннанов; это определяется наличием в среде сульфата аммония в качестве источника азотного питания.

3.2. Использованиё источников азота, не обеспечивающих снижения рН в процессе Ориентации, приводит и..дибированию синтеза маннанов.

3.3. при поддержании рН на близком к нейт; льному уровню введением в среду мела происходит изменение метаболических процессов, приводящее к образованию гетерополисахарида, состоящего из маннозы, галактозы и фукозы.

3. 4. при биосинтез^кзополисахаридов S. salmonícolor, синтезирующем в отличие от других штаммов 2 полимера( гетерополи-Сс.харид, состоящий из маннозы, галактозы и фукозы, и маннан

" : 1,5 : 1), выход маннона увеличивается оолее чем е 2 раза в результате предварительного 10-кратного пассирования культуры на агазированной среде, специфичной для образования этого полисахарида.

4. В с:став нерастворимых полисахаридов клеточке.i стенки спороболомицетов входит хитин (0,7 - 7%), содержание которого зависит от морфологического состгяния культуры и протеогликан, углеводная часть которого является глюкоманнаном с соотношением глюкозы и маннозы, равным 1:1,4 - 2,5. Растворимые полисахариды клето1—ой стенки представлены сложным углеводным комплек-

сом. Соотношение углеводных компонентов в клеточной стенке варьируют в зависимости от итамма и условий культивирования.

5. На примере S. holsatlcus показано, что при биосинтезе маннана наблюдается постоянство содержания маннозы в нерастворимых полисахаридах клеточной стенки, постоянное увеличение ее содержания в растворимом компоненте и корреляция этого процесса с накоплением маннана в культуралькой дадкости.,,,,

0. По данным электронной микроскапиикШннана при низких значениях рН среды сопровождается разрыхлением отдельных внешних учасков клеточной поверхности, утолщением клеточной стенки примерно в 10 раз, накоплением в ней углеводосодержадего материала и формированием с его участием слоистой структуры.

7. Маннан S. holsaticus способен образовывать эластичные пленки, перспективные для использования в медицине и оказывает активирующее влияние на клетки системы мононуклиарных фагоцитов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Смирнова К В. Биосинтез и выделение полисахаридов, образуемых некоторыми видами дрожжей рода Sporobolomicus. Тезисы докладов конференции "Творчество молодых — научно-техническому прогрессу", Ленинград, 1988, с. 15.

2. Витовск"я Г. А. , Ананьева Е. П., Смирнова R В. , Головкина В. Влияние некоторых условий культивирования на биосинтез дрожжевых полисахаридов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Еиокон-версия-88. Теоретические основы микробной конверсии",Рига-Юрмала, 1988, с. 33.

3. Ананьева Е. П. ,Витковская Г. А. .Смирнова Н. В. .Синицкая И. А. Клеточная оболочка некоторых дрожжевых организмов при биосинтезе экзополисахаридов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма", Пущино, 1988, с. 8.

4. Смиронова Н. В., Витовская Г. А., Ананьева Е. П., Полисахариды некоторых еидов дрожжей рода Sporóbolomicus. Тезисы докладов Международной конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии ", Братислава, ЧССР, 1989,с. 100.

5. Ананьева Е. П. .Смирнова Н. В. .ЕиткоЕская Г. А. Образование экзополисахаридов и некоторые морфолого-физиологические особенности баллистоспоровых дрожжей. ¡Микология и фитопатология,т. 23,

в 6,1385,с. 536-534.

С-П .Т/Л 3.Í8.T.I00 20.01.92 г. Уч.изд.лист-1.0 Бесплатно.