Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полисахариды некоторые видов дрожжей рода Sporobolomyces Kluyver, van Niel, 1925

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Полисахариды некоторые видов дрожжей рода Sporobolomyces Kluyver, van Niel, 1925"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РС2СР ХМ»5ЖО-ФАРМАЦЕЗТИЧЕСКИЯ ИНСТИТУТ

Ка правах рукописи УДК 579.61.66: 547. 917

СМИРНОВА 'Надежда Викторовна

ПОЛИСАХАРИДЫ НЕКОТОРЫХ ВЗДОВ ДРОЖЖЕЙ РОДА ЗрогсЬо1отусёз К1иууег,уап N ¿в!, 1925

03.00. 07-микробиология ' .

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание уч*ном: степени кандидата'биологических наук

Сдает-П«терЗкрг 1932.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Химико-фармацевтического института (г.Санкт-Петербург).

Научный руководитель - доктор биологических наук

Г.А.Ватовская,

Научный консультант - кандидат биологических наук Е.П.Ананьева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук • Е.П.ЯкоЕлева, .

кандидат биологических наук Т.Б.Мелевдна

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова

Зацита состоится Д199^г. в на заседании специализированного"совета К 084.63.01. • Химико-фармацевтического института по адресу: 19737Б г.Санкт-Петербург, ул.Проф.Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан

193^ г.

часов

Ученый секретарь специализированного совета • кандидат биологических

наук Н.В.Кириллова

Полисахариды некоторых видов дротгаеХ рода Sporobolomyces Kluyver,van Miel,1025.

Актуальность теш. Исследованиями последних десятилетий выявлено значение дрожжевых организмов как продуцентов биологически активных полисахаридов, Показана перспективность использования гомо- и гетероглкканов дрожжей видов Rhcdotorula , Cryptо-coccus и др. в качестве лекарственных средств, детоксикато-ров, основ эдл косметических кремов. Некоторые из них в настоящее вре;.'Д внедряются в практику здравоохранения и другие областл.

К моменту на тала работы сведения об углеводных полы.:ерах баллястоспоровых дрожяей, в частности епоробаломнцетов, были весьма ограниченными и относились к отдельным штаммам. Между тем данные о продукция и особенностях биосинтеза шля полисахаридов, их составе и свойствах, также как и о полисахаридах клеточной стекга, способствуют расширению знаний о биологии грогяей рода Sporobo-lomyces , имеют таксономическую я практическую ценность.

Работа выполнена в соответствия с Координационным планом научных исследований по комплексной программе крой/ология" (проблема № 2.28.9} и программой ГШ 0.74.05 18112, входит в тематику работ института (Государственный регистрационный % I 01 88 0 053S43).

Пель я задач;? исследования. Изльо настоящей работа было ::зучс~ нне не исследованных ранее в качестве продуцентов полисахаридов представителей црожжешг и диморфных птамт.гав Sporcbolo.iiyces

В связи с поставленной целью потребовалось решить еле дун я 5 задачи:

- изучить способность ряда штаммов - Sporobolomyces :; ггрэг;/:-.-ши внеклеточных полисахаридов;

- гаявлть оообадрстг :ix образоаапл, состлпа :г сгроеннд;

- получить полисахариды клето;с л пр:носта ;*:с аг;чл;;з.

г

Научная новизна. Установлена способность изученных црожяешх и диморфных штаммов сиороболомнцетов синтезировать в определенных условиях экзополисахарнды - ыапнакы. Показано, что на процесс их образования существенное влияние оказивает pli. Каннаны продуцируются только при кислых значениях рН. На примере S. holsaticus установлено, что при нейтралышх значениях рН, в зависимости от состаза среды, вместо маннана синтезируется либо гетерополисаха-рид, либо но происходит образов., ;щ экзогликана. S. salmóntcolor ЗКМ Y -679» вродуцяруювдй в отличие от других штаммов два полимера (гетерояолисахарид и манная), способен повышать продукцию последнего после предварительного пассирования культуры в условиях, типичных для образования канканов. Таким образом, рН может выступать регулирующим фактором при биосинтезе акзогликанов црохжей рода Sporobolorryces.

Установлено строение внеклеточни.. швнанов и сходство их с манна ною? дрожэй родов Rhodotorula, Bullera tsugae.

Показана сложность состава полимеров клеточной стенки и участие растворимого глюкоманнана клеточной стеюш S, holsaticus в биосинтезе внеклеточного маннана.

Практическая ценность. Результаты работы ииеат значение для выявления филогенетических связей i ш среди баллистоспоровых дрож-яей, так и среди не относящихся. к ним родов. Благодаря специфическим физико-химическим характеристикам, таким как вязкость и лр., внеклеточные полисахариды спороболомицетов могут быть использованы для различных практических целей. Показпо, что S. holsaticus. сянтезируег с хороиим выходом маннан, цригодний для приготовления

пленок шдигмаскогч, назначения. Этот полимер оказивает тагзе актк-

о

варувд&о действие на клетки «эионуклеарных фагоцитов.

Апробация работа. Материалы исследования бvjz: доловени на за-

седании Ленинградского научного общества микробиологов и эпидемиологов /19В6/, на конференции молодых ученых "Творчество молодых -научно-техническому прогрессу /Ленинград, 1988/, на конференции "БиоконЕерсия - 88 "Теоретические основа ми;<робноЙ конверсии" /Рига-ррмала, 1968/, на конференции 'ЧТроблекы и перспективы биотехнологии" /Братислава, ЧССР, 1989/, Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" /Цу::яно, 1289/.

Публикации. По материалам,исследования имеется S публикаций.

Структура работа. Дюсергация сосогт из введения, обзора литературы (3 раздела), описания-материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения (4 раздела), заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 442. страницах машинописного текста, содержит is> рисунков,

таблиц. Библиография включает наименований, из них

на иностраншх язаках.

!.'атер"ала и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали пять штаммов щюхг.е'Л рода' Sporobolonq/ces из коллекции микроорганизмов JîXttI и Всесоюзной коллекции микроорганизмов: 3. holsaticus ' JffiKÎ, S. roseus BKMV-6ÔI, НИМ V-6B4, Ш V -68S, S. salncmcoîor ВИЛ Y -579.

Морфолого-физнологические и биохимические особенности дролт.ой изучал;; по известной методике /Бабьевп, Голубев, 1982/.

Для получения экзополн^ахаридов двухсуточные культуры, выра-щенние на сусло-агаре, засезалн в модифицированнуа среду Харпда, выбранную после ряда предварительных экспериментов. Сна н::ола сле-дущлй состав: (г/л дистиллированной вод;;) :гли;:ос?а - 50, UJVzS04 - 2,5, KîloPO. - 1,0, ^-ТН о " °'5' ^ " °'5' Са'Л.;Т< О - 0,1, дро.тлевоЛ азголлзат - -, ;<V£ •;)

к ферментации (I2U ч) проводили ка лабораторных качалках при '¿20 об/шн и температура 24-25 °С в колбах объемом 750 мл, содержавших соответственно 50 и 150 мл среда.

В составе среда в ряде экспериментов глюкозу заменяли ка сахарозу, а сульфат аммония на мочевину пли пептон в зквкмолярном по азоту количества (0 33 г/л); варьировали тяккз содержание других компонентов.

В процессе роста и развитая культур определяли биомассу клеток нэфелометрдческш способов, измеряя оптическую плотность растворов при Я -590 на фотоколориметре мэрии ОЭК - 56 ИМ с последующи расчетом по калибровочной кривой. Экзополнсахарицы осаждали из освобожденной от клеток ферментационной кассы этанолом. Выход полисахарида определяли весовым методом, содернание углеводов по методу Пека, Гресл /i960/; рН измеряли потенциометрически, содержание аммонийного азота методом Коновалова( 1561).

На различных стадиях развития культуры проводили микроскопическое исследование с использованием светового микроскопа к электронного трансмиссионного микроскопа Тесла-613 (ЧССР). Ультротошзхе срезы окраиивали методом серебрения /Громов и пр., 19^5/.

Для получения гликвнов кз клеток дрожжи вырапивалл на сусло-агаре в течение 4 суток, затем разрушали в дезинтеграторе ihokoeo-го типа (A.C.CCCP~iê~44Q 153). Растворимые полисахариды осаждали этанолом из супернатантов после отделения нерастворимых осадков клеточных стенок и фракционировали цетавлоном (Методы химии углеводов, 1967). Из осадков последовательно:!; обработкой различными агентами шделяли структурнне полисахариды ¡неточных стенок.

Внеклеточные по«исахи^кды фррчшюнировалп с использованием реактива Фелт'нга или цетавлока (Методы химии углеводов, 1957). Образцы анализировали по следую:?®! показателям: относительной вяз-f.octîi 0,1% раствора - с помочь» вискозиметра Оствальда (0 0,73),

удельному вращения - из поляриметре wap:n: "Пэртгт-Элглер" модель 241, гомогенности - методом гель-хроматография ко колонке (0,8 х 28 см) о сефзрозой 43, содержание бсл:са - методом Лоурн / Lowry et al , 1957/, зольности - весовил методом.

Для определения качественного состава полисахариды гинроли-зовалн ¡ГЙ^О^ при 100 °С в течениз 4 ч и исследовали хро-

матографией на бумаге Фяльтрак FN -II в системе растворителей: н-Оутонол:отзкол:пода :а?.т,кзк = (40:10:49:1) с последувп^ проявлением кислым фталаноч анилина.

Соотношение моносахаридов устанавливали методом ГЗЗС ацетатов полколов. Анализ проводил:? на хроматографе Цвет—162 на колонке (150,0 х 0,4 см), наполненной хрокатоном N-AV-DMCS с 3$ 0V -225, при 190' .

Соотношение глнкозндних связей в образцах полисахаридов определяли методой перйоцатного окисления с послелуюптд боргидридньил восстановлением /Захарок», Носенко, 1982/.

Метилирование углеводных образцов осуществляли методами Хеуорса и Хэкомори. Анализировал;-! смеси кетилпроизводных в виде ацетатов частичнометшшровэнных метялгллкозядов Г£Х при програм-жгрован:нг температуры {120-220 °С).

Спектры ЖР снижали на приборе АМ-300 Брукер (ФРГ). ЛК-спектри получены на приборе U?. -20.

Статистическую обработку дзшшх проводили в соответствии о ГОСТ II.Ü04-74.

Результаты исследования и их обсуждение

I. МоуТо.того-^>:;зяолок?,1рс:ая :: y,->:.-r-rftr-7?t,-::r

культтр. Ссеговпьг.'н празпзкзгл! врпнздлечлост;! ¡>сп~рэгчшг.г>: ."с0"—*

к рзду lTL,;-:o;:oio;!.voos лг-яотсд !НЛН';.:е пнг'птэ :: r^^-.n-r г-:: боллнстоспор. Сдн-.ко, з грзке-езо лзбормог.ногл хульТивя^мчиа lv l

гие из них утрачивают способность к бзллистоспорообразоваикю. Для изучения биосинтеза полисахаридов исследуемыми штаммами необходимо било уточнить их таксономическое положение. 3 связи с отим бы-»11 изучены иорфолого-физиологическке и биохимические особенности культур, При этом било отмечено вегетативное размножение почкованием, образование в определенных условиях баллистоспор у всех атажов. Кроме того, они не сбрзвииала сахара, обладали уреазяой, протсолитичоской активностью, о культуры S. salmonicolor.S.,

roseus -684 такле и j¡ -глюкозидазной. Штамм S. roseus -684 отсутствием пигмента и типом колоний несколько отличался от описанных для вида S. roseus . Однако, по своим ассимиляционным характеристикам (мочевые из которых приведены в табл.1) вес изученное штамш соответствовали типовым культурам, описанным для видов, к которым они отнесены по определителю дрокней Kreger van Ril /1984/. При этом атакш S.FO&£US;éKM &8У1 существовали только в лрокхевой форме, п то ммы J iff finante Cat, S Á¡¿saf¡ была диморфными.

2. Изучение процесса биосинтеза экзополпео'харидов. После предварительных экспериментов в качестве основной была выбрана среда Харада. На этой среде изученные птаммы спорсболомицетов гак дродс-яевые, так и диморфные, синтезировали внеклеточные полисахариды. , 'Из вссх полимеров за исключением S. salrtorncolor с помощью реактива Фелинга были выделены маинаяы.

Основные закономерности процесса биосинтеза изучены на примере наиболее продуктивного диморфного ш-эмма S. holsattcus . Поскольку наряду с глюкозой наиболее интенсивно согг "бляеылл источником углерода яе..ялэсь сахароза, то ¿ ряде эксперименте ее вво-

»

дили в иреду Харада вместо тоокозы. При этом не отмечено каких-либо существенных отклонений основа« параметров процесса фермен-(ркс.1). 3 обоих случаях полисахарид оса адалея ::з катимого

ТаСл:пз I

Клззчевие хзрактер;тст;пи игслегусг-ых баллкстослорок.'х гр-.тлеГг

Культура "- 3 инозит Ланг-тоза Цолло-блозз Мальтоза I-грабило за лззз Нал-"-" го

Го. иок'аисиз

л?:! -ы + - - ■ + • + - +(м) + +

3. гогоиз

г' —оЬХ + - - + +(сл) - - -

с.гог^из

:>:сл у -68« + - - +(сл,м) + (ел) - + <М> - -

С, гогеил + +

Бг*1 V -'385 + - - - + — —

о. :-л1йС:.1С01£М' + + +(1.1)

Ъ"Л'\ V -<37:3 + + + +

С-ч-ши роста: + - ситеасаг и1.', пост, (и) - шз-лзшшЯ, (сл) - слаби2, - - очень _;лелгепшр и ^ * слабни.

раствора после 54 ч культивирования. Од:юко, в ко;що ферментации (120 ч) на среде с сахарозой отаоччлл прешяские биомассы меток на 11% и выхода полиса хари, да на 10$ по сравнению с контролем (среда Харада с глшоэоП). Более существенное влияние оказывал источник азотного питания. Так, на среде с пептоном образования полисахарида не отмечено, на среде с ыочевшо" его выход минимален (табл.2). Наиболее благоприятным гля синтеза оказалось использование сульфата .аммония, потребление которого со-провондалось резким снижением рН (до 2,0) уже на первые сутки, что не наблюдалось в двух перьих случаях. Для оценки влияния концентрации водородных ионов на образование полисахарида 3, ¡ю1заисиз ' предприняли попытку стерилизации рН. При внесении в среду фс-фатной буферной системы рН 6,С, буферная емкость оказалась недостаточной для обеспечения необходимой величины рН. Резкое снижение цо величины, близкой к контролю, наблюдали уже на 24 ч. Однако, выхог, полисахарида в этих условиях снижался на ,70%, что очевидно объяснялось избытком в среде фо^ят-иоиов. Это подтвердилось при использовании среды Харада с увеличенной исходной концентрацией ионов Н^РО^ без изменения остальных компонентов. 11ри блазках к контролю основных параметр«» ¡гооцесса в таких экспериментах происходило снижение выхода экзоглкканз в 2,4-раза (табл.2). При этом отмечали морфологические изменения культуры - вместо вытя!:утк>; и овальных клеток увеличивалось' ¡количество круглых; мицелий становился неровным, приобретал взятия; происходил частичная потеря яиг:«ента.

Н другой серии экспериментов стабилизацию рН'вровэдн.™ внесением в сроду мола (0,5 г/100 т.-л ерзды). При ото:Г отеочп-лось значительное увеличение биомассы кчото:; (из/,},.- :'> по сравнит) с контролем). йалич::.ча рН в. холе процесса им;

Таблица 2

Влияние условий культивирования на б:;осинтез экэогликана 5. Ьо1за*. гсиз.

Среда Харада, -содержащая рН на 120 ч Выход, г/л Удельная Эффективность процесса Экономический коэффициент роста

биомасса полимер продуктивность

Сахарой/ 1,9 ± 0,2 7,0 ± 0,2 5.2 £ 0,4 0,74 0,12 0,16

Мочевину 3,6 ± 0,7 6,5 ± 0,2 1,0 ± 0,2 0,18 0,03 0,15

Пептон 3,8 ± 0,1 4,8 ± 0,4 - - - 0,14

Буфер 2,0 £ 0,4 7,1 ± 0,3 1,0 ± 0,2 0,18 0,03 0,15

КН^Р04 2,1 4 0,2 6,4 * 0,4 1,1 ± 0,2 - - 0,15

Мед 5,5 ± 0,2 е,о ± 0,2 2,2 ± 0,2 0,3 0,05 0,16

Контроль 1,9 ^ 0,3 6,2 ± 0,3 4,3 ± 0,2 0,69 0,11 0,16

Цримечапя: I. Эффективность процесс« рассчитывали как отноаегае конечного продукта к , - количеству потребленного углеродного субстрата.

2. Экономический коэффициент роста продуцента - отношение биомассы клеток к количеству потребленного субстрата.

не опускалась ниже 6,5. Гликан осаждался из нгдивного раствора после 120 ч ферментации с шхоцом 2,2 г/л (табл.2). В отличие от контрольной среда, на которой синтезировался машин, в этих условиях происходило образование гетерсполисахарилп. Однако, при помещении отмытых клеток S. holsaticus после 54 ч цультивяро-ваная на среде, содержащей мел, в контрольную среду Харада происходило образование маннана в соответствии с закономерностями, приведенной! на рпс.1. Таким образом, снижение рН является необходимым условием синтеза маннана.

По данным электронно-микроскопического исследована образо- • вание маннана при снижении рН сопровождалось изменением состояния клеточно;! поверхности. К моменту максимального синтеза полимера, в отличие от стенда исходной клетки, клеточная стенка представляла собой многослойную структуру с чвредуида-зюя зонаг.з! различной электронной плотности. Специфическим окрааивашюм в ней выявлено несколько углеводных слоев в вице концентрических окруяностзл, разделенных веществом неуглеводно;! природа. Толдагз стенки составляла 20 О нм, тогда как в контроле на твердой среде она колебалась в пределах 1(^20' им. Наблюдалось разрыхление отдельных знелних участков клеточной стенки (рис.2).

3 отличив от других исследованных: ультуо S. sal. .^¡ucolor образошвал дза ггадаыора - маннозосодер.\;а^ил гатеродолпеахарид и маннан. Образование тг'нана увеличивалось .более чем ь разл после предварительного IG-кэаткого пассирован:«* ¡с-льтуры ня а«-р::зозанкой среде Харада. СугадаршХ заход полнеахапиез состри <¿,8 г/л. Следует отметать, что эбщ.ч удалы ля г uoc i г,

ток,' пассирошкшх на среда Х.-.'ра.';л, была яосяслы» !»v:c контрольной:, a продукт;»« эоть пэ ските sy ьзоркли ;-¿ ,

п

У'.-

шщъ

ч

■ Л Л

ж }л> с и

2а

•¿^■''ЭД');

г." • •

>• '■¿¿' А*.'" - ■■ -•< ■!'.<: П-Г ■

Ш Л

ш

25

а

шщ

I ■ ^ '-л'УХГ1 г»-; ч"

-

■ ' ¿"»'.'■У

¡».'■"•у а

рио.^ Электронно-микроскопическое

исследование клеток Б. Ьо^аисиэ. Увеличение 1: 45000.

1 -клетки после 9вч роста на

сусло-агаре

2 -клетки в процессе синтеза

маннана(9бч)до (2а) и после специфического окрашивания

на углевод^ 5),

Соотношение полисахаридов Э. за1ггюгпсо1ог

Условия Выход,г/л Удельная про- Соотношение

предварительного биомас- полисаха- дуктивность по синтезу фракций

выращивания са риды полисахаридов канкана манпан гетеро-полисахарид

Сусло-агар 4,8±0,3 2,6±0,5 0,54 0,13 I 1.5

Среда Харада" 7,0±0,2 2,8^0,3 --- 0,40 0,30 2 1,5

й - 10-кратное пассирование.

Выделение маннанов при снижении рН до 2,0, вероятно, можно рассматривать как защитную реакции дро.таей на неблагоприятные условия культивирования.

3. Характеристика экзопажюахаридов. Полученные внеклаточ-ше полисахариды представляли собой порошки белого или серовато-белого цвета, баз вкуса а запаха, хорошо растворимые в воде после предварительного'набухания в концентрациях до 2%. Основным компонентом полимерой, образуемых и дрожжевыми, и диморфными штатами 5рогоЬо1отусез на средс Харада, являлась магшоза. Кроме того, они содержали галактозу, фукозу и глюкозу в различных количественных соотношениях. Количество белковых примесей не превышало 7,1а зольность варыфозала от 3,1 до 6,2%. Во всех случаях, кроме образца 3. 1ю1заисиз' , полученного со среды с мелом, были выделены маннаны в количестве от 25% до 70^ от исходных полисахаридов (табл.4).

Полисахарид 1ю1заИсиз , полученный со среды с мелом» значительно отличался по количественному соотношении мо но сахара •• дов н представлял собой гетерополисахарид, содержавший маннозу, ,

Состав исходных полисахаридов спороболомицетов.

Продуцент Среда Харада с Моносахаридный состав* % Бзлок Золь-кость Содержание каннаиа, %

"Van Gal Glc Fuc %

S. holsaticus Глюкозой 78,0 8,1 9,7 4,2 1.9 3,1 70

• ЮЛ JLXaKI л-и Сахарозой 73,1 10,6 10,6 5,7 7,1 4,5 70

Мелом 39,7 32,4 15,9 12,6 4,4 5,4 _ **

О. roseus

Bffii Y -681 Глюкозой 35,6 32,5 - 30,9 4,5 4,6 50

S. roseus Глюкозой 44,2 19, X 36,7 4,7 6,2 50

bii.l Y -684

G.salrtorucolor Глюкозой • 29,0 33,2 24,2 19,6 1,6 4,2 25

JiC-I Y -679

Примечание: * - в пересчете на углеводную часть; ** - отсутствует.

галактозу, фукозу.

Маннаны обладали величиной оптического вращения от -48° до -8У°, содержали от 0,6 до 1% белка, относительная вязкость колебалась в интервале 1,0-1,5. Гетерополисахарид 5. salmonicolor был сходен по составу о гетерополимером S. holsaticus , выделенным со среды с мелом, имел оптическое вращение -14°, и образовывал растворы, вдвое превышающие по вязкости растворы маннанов той же концентрации (табл.5).

При периодатном окислении маннанов, которое заканчивалось после .48 ч поглощалось 0,71-0,79 моль NaJO^ . и выделялось 0,012-0,12 моль KCU0H на моль сахарного остатка. Полученные результаты и данные боргидридного восстановления окисленных полимеров свидетельствовали о неравном соотношении I—- 3, I—-4 свя:зй.

'Величины химических сдвигов ü'IP-спек ров ма ннанов приведены в табл.6. Все спектры были идентичными, содержали 12 сигналов, что соответствовало дисахаридному фрагменту. Сравнение полученных данных с имеющимися в литературе показало, что сигналы соответствуют структуре ыаннана, повторяющееся звено которого представлено на рис.3.

ьТаким образом, все исследованные штаммы дрожжей рода Sporo-bolomyces как дрожжевые, так и диморфные, были способны к образованию маннанов, сходных по строению с маннанами еидов Rho-dotorula i некоторых видов Bullera

Специфические физико-химические характеристики маннанов делают перспективным их дальнейшее изучение о кельи практического использования. Так, показано, что полимер S. hoisat leus монет использоваться для ппучения n-енок медицинского назначеыш. Со- ■ ответствую:?!^ акт испытаний приложен н диссертации. Кро:. а того, он оказывает активирующее влияние на клетки системы мононуклеар-ных фаговдтоь. • • '

Характеристика очищенных полисахаридов

: Полисахарид Содержание моносахаридов, % 34 Белок Зольность шго ^отн

Мал 6а1 51о Рис % СО, 1; Н20

5. Ъо^висиг КМ ДХФЛ Л -14 с сахарозы . с глюкозы 100 100 - - ■'' 1,0 1,0 1,0 1,0 -90° -78° 1,24 1,53

2. гозеиэ ВКМ У -681 94,0 — 6,0 — 1,0 2,0 1,30

5. гозеиэ ВКМ У -о84 100 _ _ 0,8 . 1,4 -96° 1.П

3. за1тошсо!ог ВКМ У -679 каннан 100 0,6 8,2 -48° 1,0

гетерополисаха-рлд 30,4 26,3 7,1 36,2 0,6 4,0 -14,5° 2,16

* - в пересчете на углеводную часть.

Таблица 6

Величины химических сдезгозз ^С ЛМР-спектров внеклеточных маннанов

; ЧЛ^ОЛУЭТЛД ! C-I 0-2 C-3 ■ C-4 C-5 C-6 C-l' C-2' C-3' C-4* C-5' C-5'

; .'.¿-„и А -14 98.460 71.979 73.347 78.670 76.746 62.317 101.857 69.229 80.606 66.&16 77.877 62.779 '

j .1/. 1 ио 1 'i - 681 98.380 71.897 79.243 78.565 76.655 62.218 100.909 69.164 80.556 66.755 77,788 62.685

; j.:; Y - sai col or 97.516 71.032 72.396 77.708 75.792 61.369 I0I.77I 38.293 79.681 65.899 76.913 61.829

98.465 71.991 73.341 78.663 76.743 62.311, 101.869 69.245 80.621 66.850 77.813 62.780

кн <3

í I

I

"WW

95 90 35 80 75 70 65 60

1

,iiok Л 13C ДМР-ск-ггр о ¡и цен»¡oго пклпглик&ш- S .holanticua.

4. Полисахарида клеток спороболомидетов. Выделеш.е полисахаридов из клеток проводили по приведенной схеме (рис.4). Из осадка супернатанта всех штаммов выделен гл>окан (фр.^), структура которого, как показано 13С ЯМР-спектросколиой, идентична структуре гликогена. Растворимые полисахариды клеточной стенки представляли собой протеогликаиы, углеводная часть которых состояла из манчозы, галактозы, фукозы, глюкозы (фр~£ ). Аналогичный качественный состав имели и осадки клеточных стенок (фр.2). После их последовательной обработки различными агентами получены нерастворимые компоненты клеточных стенок (фр.2Л) и водорастворимая фракция (фр.25". Нерастворимые компонента зля всех изученных штаммов являлись про-теоглпканами, угла-водная часть которых представлена маннозой и глшозо;!(1:1,4-2,5). Белок составлял до Ibfi. По данным шрйодат-ного окисления и метилирования остатки манношгранозы в ешх были соединен 1—3 и I—4 гликозидпыми связями, ЯК-спектра всех образцов были идентичными и свидетельствовали о р -конфигурации связей. Вторым ломпонеитом нерастворимых углеводов клеточных стенок был хитин, содержание которого было большим у диморфных штаммов. Вадораспзор.таая фрашш (одна из частей растворимых по-лисахарицов клеточной стенки (фр.]<£) представляла собой глоко-

маннан, содержавший 10$. белка и имевший оптическое вращение -48°.

13

Его 0 ЯМР-спектр содержал сигналы, указывающие на наличие ди-сахаридного фрагмента, идентичного повторяющемуся звену маннана. Сигналы, относящиеся к глюкопнранозе, -были менее интенсивными и свидетельствовали об ее присоединении в положении 1-*6 к остатку маннопиранозы. Тагам образом, существенная часть фракций полисахаридов клеточной стенки всех изученных видов являлась гюкоманна-нами.

Так как было обнаружено определенное сходство в 'строении вне—

¿¿хне

■метки

.г.егкнтвгрирохаиге, ' \ 20-26 м;:н., 50 ССС оо/кшД

с/г^рнгтаит - растворимое ол/сгхорилы клш'о чпо с.-лгсй и аятолл* зкатячзскиз

/ '¡гтог-юн

I Ф

супепнагаь^ I? ось?::а | ог.'.нсл-л

гликоген

оур.г

\

структурчо-

ует&ооличзсклй

полисахарид

осадок - нер-астгирихие

кокг.саоаги л.:етка, клеточной ои !-.:•:;*;:

:>::стр.:':--.1:ия СХМаОН

1 члс, ^ 'л1!

з л о чи е ип сц о о;: мм с ? п до к. | З-кроткпя п со ми ъ 1-Х полой. А ацетонои, ЗССО об/мин. ' 15

о Ссг.до ¡с

Г»

Г -О 1

осадок

¿-кратная про-.мквка голо Г;, • ацетоном,15 кип. ЗССО о о/мин

За • структурный полисахарид

а к с т рз кайл го до а,, 2 час;! \ ^одмастроримыН £олимеп_

■| реактив -г-елинга

¿РАХШ-М 26 мэннозосодержащий полисахарид

>хг.ма наделения полисахариду клеток спороСодомицет^в.

клеточногоманнана и полимеров клеточной стенки,для выявления возможной взаимосвязи их синтеза была определена динамика накопления маннозосодержащих полимеров в клетках при биосинтезе мзн-нана. Для этого клетки S. holsaticus с различным сроком культивирования фракционировали в соответствии со схемой (рис. 4.)-При этом но Фракции ? содержание глюкозы и галактозы оставалось практически неизменным (7,7-10,6% и "4,5-23,7^ соответственно).Содержание фукозы возрастало от 6,5X до 19,6%. Содержание макнозы после 54 часов снижалось от 61% до 45, АХ. Получен"ые из него нерастворимые полисахариды являлись глюкоманнанами с весьма близким соотношением компонентов (табл. 7.).

таблица 7

Содержание моносахаридов в нерастворимом полисахариде клеточной стенки S. holsaticus ка различных этапах биосинтеза маннана.

Время ферментации,чае Van Sic

10 £9,3 40, ,07

24 63,5 35, 5

54 65,3 34, г» , /

96 66,0 34, ,0

Мэносахаридньй состав растворимой Фракции клеточной стенки бил представлен маннозой , глюкозой, галактозой и йукозой,содержание которых значительно изменялось в процессе культивирования. Так.фукова отсутствовала в "остаье гидролизатов на 56 ч,а содержание манкозц увеличивалось в 3 раза после 96 ч по сравнению с уровнем ,отмеченным на 10ч ".. . .И лись при увеличении содержания маянозы в растворимом полисахариде клеточной стенки до определенного уровня маннан обнаруживался в культурадьной жидкости. Выделанные фракции не взаимодействовали с реактивом Фединга, что свидетельствует .вероятно,о том .что маннан приобретает окончательную структуру яри переходе через клеточную стенку.

выводы

1. Все изученные дрожжевые и диморфные штаммы спороболс шцетов способны образовывать внеклеточные полисахариды.состоящие из маннозы, глюкозы, галактозы и фукозы. Преобладающ компонентом з.их гликанов является маннан,содер;кание которого достигает 70%.

2. Маннаны представляют собой полимеры D-маннопиранозы, соединенной последовательно чередующимися 3 и_£-1—-4 гликозидными сеязями,сходными ш строению с маннанами видо* Rhodotorula и некоторых видов Bullera.

3. В процессе биосинтеза эзоподисахаридст спороболоми^ тов рН среды выступает регулирующим фактором:

3.1. быстрое снижение рН до 2.0 и поддержание его на э уровне в течении ферментации является необходимым условием для образования маннанов;это определяется наличием б среде сульфата аммония в качестве источника азотного питания.

3.2. Использование источников азота, не обеспечивающих

el

снижения рН в процессе ферментации, приводит иадкбированию синтеза маннанов.

3.3. при поддержании рН на близком к несильному уров введением в среду мела происходит изменение метаболических процессов, приводящее к образованию гетерополисахарида, состоящего из маннозы, галактозы и фукозы.

3.4. при бкосинтезе^кзополисахаридов S. salmonicolor, с. тезирующем в отличие от других штаммов 2 полимера(гетеропол са/арид, состоящий из маннозы, галактозы и фукозы, и маннан : . (1,5 : 1), выход маннвиа увеличивается оолее чем в 2 раза в результате предварительного 10-кратного пассиров; ния культуры на агазированной среде, специфичной для образования этого полисахарида.

4. В с ;став нерастворимых полисахаридов клеточнол стен! спороболомицетов входит хитин (0,7 - 7%), содержание которо] зависит от морфологического состояния культуры и протеоглик; углеводная часть которого является глккоманнаном с соотноше] ем глюкозы и маннозы, равным 1:1,4 - 2,". Растворимые полиса: Риды клето'-'ой стенки представлены сложным углеводным компл*

сом. Соотношение углеводных компонентов в клеточной стенке варьируют в зависимости от штамма и условий культивирования.

5. IIa примере S.holsaticus показано, что при биосинтезе маннана наблюдается постоянство содержания маннозы в нерастворимых полисахаридах клеточной стенки, постэпемре увеличение ее содержания в растворимом компоненте и корреляция этого процесса

с накоплением маннана в культуральной ¡гадкости.

e«/»<fJci?(T int е

6. По данным электронной микроскопий маннана при низких значениях pH среды сопровождается разрыхлением отдельных внешних учасков клеточной поверхности, утолщением клеточной стенки примерно в 10 раз, накоплением в ней углэводосодержащэго материала и формированием с его участием слоистой структуры.

7. Маннан S. holsaticus способен образовывать эластичные пленки, перспективные для использования в медицине и оказывает активирующее влияние на клетки системы мононуклиарных фагоцитов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Смирнова К В. Биосинтез и выделение полисахаридов, образуемых некоторыми гидами дрожжей рода Sporobolomjcüs. Тезисы докладов конференции "Творчество молодых — научно-техническому прогрессу", Ленинград, 1988, с. 15.

2. Еитовскг'Я Г. А., Ананьева Е. П., Смирнова Н. В. , ГоловкинЕ. В. Влияние некоторых услоеий культивирования на биосинтез дрожжевых полисахаридов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Еиокон-версия-88. Теоретические основы микробной конверсии",Рига-Юрмала. 1988, с. 33.

3". Ананьева Е. П. .Вит/.овская Г. А. .Смирнова R В. .Синицкая И. А. Клеточная оболочка некоторых дромевых организмов при биосинтезе экэололисахаридов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма", Пушино, 1988, с. 8.

4. Смир-гнова Н. В., Витовская Г. А., Ананьева Е. П. , Полисахариды некоторых еидов дротаей рода Sporöbolomy:es. Тезисы докладов Международной конференции "Проблемы и перспективы биотехно-логин ", Братислава, ЧССР, 1989,сЛ00.

5. Ананьева Е. П. .Смирнова Н.В. .Еитковская Г. А. Образование экзополисахаридов и некоторые морфолого-физиологические особенности баллистоспоровых дрожжей. Микология и фитопатология,т. 23, в 6,1385, с. 536-539.

С-П :Ii-rri з.18,т.IÜ3 20.01.92 г. Уч.кзд.лист-1.0 Бесплатно.