Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороз у человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороз у человека"

[УНИВЕК

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

:' /

щ

На правах рукописи

005002718

Москаленко Михаил Викторович

ПОЛИМОРФИЗМ РЯДА ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ ТКАНИ И ОСТЕОПОРОЗ У ЧЕЛОВЕКА

специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук ^ у НОЯ 2011

Санкт-Петербург 2011

005002718

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отт; СЗО РАМН в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезне! человека

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, зав. лаб.

Владислав Сергеевич Баранов, НИИАГ им. Д.О. Отга СЗО РАМН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Виктория Николаевна Горбунова, ГОУ ВПО СПбГПМА

доктор медицинских наук, профессор

Имянитов Евгений Наумович, НИИ онкологии им. H.H. Петрова

Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательски} институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Л * 201.,.^

Защита состоится « » ^ _ 2011 г. в АУ часов на заседании Диссертационного совет'

Д 212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора биологически наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Санкг-Петербургскогс государственного университета

Автореферат разослан « » — 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

JI.A. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ктуалыюсть проблемы. Наступивший XXI век, по мнению многих ученых, это - век генетики, рямым и важнейшим достижением генетики стала расшифровка (прочтение) генома человека. Международная программа "Геном человека" определила бурное развитие и активное внедрение в едицинскую практику молекулярной медицины и представления о существовании "генов редрасположенности" - генов, мутантные аллели которых совместимы с рождением и жизнью в остнатальном периоде, но при определенных неблагоприятных условиях могут способствовать азвитию того или иного заболевания (Баранов и др. 2000, 2009). По образному высказыванию Фрэнка оллинса - директора Международной Программы "Геном человека": "Каждый из нас генетически есовершенен. По мере разработки все новых генетических тестов у каждого человека можно бнаружить мутацию, предрасполагающую к тому или иному заболеванию". (Collins, 1999). В геноме еловека насчитывается около 22 тысяч генов. Мутации некоторых из них, приводят к одному из шогочисленных наследственных заболеваний. Методы молекулярной диагностики позволяют выявить е только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному очетанному (мультифакторному) заболеванию (МФЗ). Среди болезней, вызванных наличием мутаций генах предрасположенности, различают заболевания "с поздним началом" и мультифакториальные полигенные) болезни (Баранов и др., 2000). Генетическая предрасположенность к заболеваниям с 'поздней манифестацией" (рак молочной железы, хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера и др.) меет, как правило, моногенную природу и может быть обнаружена уже при рождении ребенка, однако имптомы болезни развиваются в более позднем возрасте. Предрасположенность к ультифакториальным (сочетанным или комплексным) болезням (сахарный диабет, атеросклероз, шемическая болезнь сердца, бронхиальная астма, остеопороз, эндометриоз, некоторые психические и нкологические заболевания) также может быть определена сразу после рождения, но их анифестация в значительной мере зависит от провоцирующего действия неблагоприятных факторов нешней среды, специфичных для конкретного заболевания.

Данная работа посвящена изучению особенности аллельного полиморфизма генов метаболизма остной ткани у лиц с высоким риском развития остеопороза - одного из частых МФЗ. Остеопороз, по анным Всемирной Организации Здравоохранения, вышел по значимости на четвёртое место среди еинфекционных заболеваний после сердечнососудистой и онкологической патологии, а так же щабета. Интерес к остеопорозу как важной медицинской и социальной проблеме очень высок. Это вязано, прежде всего, с тем, что в развитых странах всё большее внимание уделяется людям пожилого озраста, продолжительность жизни которых увеличивается, а активная созидательная деятельность охраняется достаточно долго. Широкая распространенность, тяжесть исходов, особенно при ереломах шейки бедра, и потеря способности к самообслуживанию определяют высокую социальную начимость данного заболевания. Рассчитано, что в среднем 40% женщин постменопаузального ериода переносят, по крайней мере, один перелом вследствие остеопороза (Audi et al., 1999). Более 10 иллионов американцев страдают остсопорозом, из них около миллиона ежегодно переносят ереломы вследствие этого заболевания (Melton, 1997). На лечение и профилактику остеопороза в ША тратится более 10 млрд. долларов ежегодно (Melton, 1997). Учитывая вышеприведенные факты, пределение молекулярно-генетических причин остеопороза является достаточно актуальной задачей, уществует несколько подходов для оценки вклада того или иного гена-кандидата в патогенез стеопороза. Один из них состоит в определении степени корреляции между аллельным олиморфизмом гена-кандидата и факторами, провоцирующими развитие болезни. С этой целью роводится сравнение частот аллелей предполагаемых генов-кандидатов у больных остеопорозом с аковыми у лиц, не имеющих данного заболевания и, соответственно, сохраняющих нормальную инеральную плотность костной ткани.

Подтверждение наличия ассоциации между аллелями генов костного ремоделирования и стеопорозом у больных в популяции Северо-западного региона России позволит использовать анный алгоритм для тестирования индивидуумов на выявление предрасположенности к заболеванию, езультаты такого исследования важны для более рациональной организации системы профилактики и ечения этого заболевания еще на ранних досимптоматических стадиях его развития.

Работа была поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№ 06-04-08319-офи, № 08-04-12225-офи) и CRDF (ST-012-0).

Цель и задачи исследования. Изучить особенность частот аллелей генов-регуляторов метаболизм костной ткани у больных остеопорозом различной этиологии и в популяции Северо-западного регион России.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить частоты аллелей генов метаболизма костной ткани (COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP) женщин Северо-западного региона России, у больных с тяжёлым остеопорозом, у женщи постменопаузального периода и у пациентов с глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом.

2. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COL1AI, VDR и CALCR с риском развит заболевания у больных тяжёлым остеопорозом.

3. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COLIAI, VDR, BGLAP и CALCR с скоростью потери МПК и уровнем экскреции маркера остеорезорбции дезоксиперидинолина (ДПИД) женщин в постменопаузе.

4. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COLI AI и VDR с риском развит: глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у пациентов при лечении астмы.

5. Разработать и апробировать лабораторный макет «остео-чипа» для одновременного анализ полиморфизма некоторых генов метаболизма костной ткани (VDR, COLIAI, CALCR, BGLAP, GSTM1 GR, MTHFR и ER).

Научная новизна работы. Впервые проведен сравнительный анализ частот аллелей генов COLIAI VDR, BGLAP и CALCR у женщин постменопаузального периода, у пациентов с остеопорозом и популяции Северо-Западного региона России, проанализирована корреляция полиморфных варианто изученных генов с тяжестью заболевания. Впервые показана неслучайная ассоциация между развитиен глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом и полиморфизмом генов VDR, CALCR, BGLAP, MTHFR и GSTM1 у больных бронхиальной астмой. Впервые проведен проспективный анализ уровне МПК в зависимости от паттерна аллелей и генотипов по генам COLIAI, VDR, BGLAP и CALCR. Впервые показано, что гомозиготность по аллелю t гена VDR, аллелю s гена COL1A1 и аллелю Т ген CALCR увеличивает риск высокой потери МПК у женщин Северо-Западного региона России постменопаузе. Впервые показан синергический (аддитивный) эффект сочетаний изученны «функционально неполноценных» генотипов по генам VDR и COL1A1 при развитии прогрессировании остеопороза. Впервые создан лабораторный макет «остео-чипа», предназначенног для одновременного анализа полиморфизма нескольких генов костного метаболизма. Практическая значимость. Анализ генетического полиморфизма генов VDR и COLI AI можн рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска быстрой потери МПК и развита тяжёлого остеопороза у женщин в постменопаузе. Анализ генетического полиморфизма генов VDR CALCR, BGLAP, MTHFR и GSTM1 можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценк риска развития вторичного остеопороза при лечении астмы глюкокортикоидами. Материаль диссертационной работы вошли в методические рекомендации для врачей эндокринологов гинекологов «ОСТЕОПОРОЗ. Генетическая предрасположенность. Современная диагностика профилактика» (67 стр. 2003). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аллели и генотипы по генам COLIAI, VDR и CALCR ассоциированы с развитием остеопороза.

2. Наличие определенных аллелей и генотипов по генам COLIAI, VDR и CALCR, а также сочетанны генотипов по генам VDR и COLI AI ассоциировано с различной скоростью потери МПК у женщин постменопаузе.

3. Наличие определённых аллелей и генотипов по генам COLIAI, VDR и CALCR ассоциировано различным уровнем секреции маркера остеорезорбции дезоксиперидинолина (ДПИД) у женщин постменопаузе.

4. Носительство генотипа tt по гену VDR, генотипа CT по гену CALCR, генотипа CT по гену BGLAP генотипа CT по гену MTHFR и делеции в гене GSTM1 ассоциировано с низкими значениями Z-scor и абсолютными значениями МПК поясничного отдела позвоночника у пациентов с глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом.

Апробация работы. Результаты работы представлены на 2-ом съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000), на 2-ом Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000), П-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), Международном конгрессе по предиктивной медицине (Виши, Франция, 2001), на Европейских конгрессах по генетике человека

Бирмингем, Великобритания, 2003), (Мюнхен, Германия, 2004), (Прага, Чехия, 2005), на еждународном конгрессе по генетике человека (Вена, Австрия, 2001). Диссертация апробирована на аучных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней еловека ГУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга РАМН, афедры генетики и селекции СПбГУ.

убликации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ, из них 8 - в изданиях, екомендованных ВАК.

бьем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 171 странице машинописного екста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и результаты), их бсуждения, выводов и списка литературы, включающего 240 ссылок. Диссертация иллюстрирована 20 аблицами и 42 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

арактеристика исследуемых групп. Приём, клиническое обследование, измерение МПК и уровня ПИД у 555 пациентов проводилось при непосредственном участии врачей научно-сследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга СЗО РАМН (Зазерская И.Е., узнецова JI.B., г. Санкт-Петербург), Санкт-Петербургской академии профилактической медицины Котова С.М., г. Санкт-Петербург), ЦМСЧ №122 (г. Санкт-Петербург), ГОУ ВПО Российского осударственного Медицинского университета Росздрава (Баранова И.А., г. Москва) и НИИ ульмонологии (Путилин A.M., г. Москва).

В научно-исследовательской работе использовались образцы ДНК, выделенной из ядер имфоцитов крови 70 больных тяжёлым остеопорозом (женщины в возрасте 50-65 лет, в менопаузе, с Т-итерием менее -2,5 SD), пациентов Санкт-Петербургской академии профилактической медицины. В сследовании были использованы образцы ДНК 179 здоровых неродственных представительниц Северо-ападного региона России в качестве популяционного контроля. В данную группу включены здоровые енщины в возрасте от 20 до 44 лет (средний возраст 33,8+0,4 лет), родившиеся в Санкт-Петербурге и в ближайших районах. В структуре группы выделены подгруппы: 20-24 года - 34 чел., 25-29 лет -5 чел., 30-34 года - 40 чел., 35-39 лет - 30 чел., 40-44 года - 40 чел. Все были обследованы в оликлинике ЦМСЧ №122 с 2001 по 2003 г. В группу исследования включены только женщины, у соторых на основании клинико-лабораторного обследования не выявлено причин вторичного стеопороза, в том числе признаков хронических заболеваний, не работающие на вредных роизводствах и регулярно (1 раз в 12 месяцев) наблюдавшиеся врачами поликлиники или стационара V1C4 № 122. Основная часть исследованных образцов ДНК была выделена из ядерных клеток крови 69 женщин с эстрогендефицитным состоянием, вступивших в менопаузу естественным путем (87 ациенток - группа ЕМ) и после хирургического вмешательства (82 пациентки - группа ХМ). В ЕМ , уппе обследовано 87 женщин в постменопаузе в возрасте от 44 до 54 лет (средний возраст: 52,5±0,4 ier), родившихся и проживающих в Санкт-Петербурге. На базе "Центра здоровья женщины" и инекологического отделения ЦМСЧ-№122, поликлинического отделения ГУ НИИ АиГ РАМН им .О. Отта с 1998 по 2005г. выполнялись прием пациенток, анкетирование, подписание нформированного согласия, клиническое обследование, определение уровня ДПИД, стеоденситометрия. В исследование включены только те женщины, у которых на основании сбора амнеза и клинико-лабораторного обследования установлено: длительность естественной остменопаузы от 3 до 5 лет (в среднем 4,2±0,8 года), отсутствие симптомов предшествующей едостаточной функции яичников, отсутствие тяжелых соматических заболеваний, которые могли бы вляться причиной вторичного остеопороза. В ХМ группу включены 82 женщины после илатеральной эвариоэктомии в возрасте от 38 до 52 лет (средний возраст 46,2±2,3 лет), родившиеся и роживающие в Санкт-Петербурге. В исследование включены только те послеоперационные ициентки, у которых длительность эстрогендефицитного состояния составила от 3 до 5 лет (в среднем ,3±0,6 лет). Причиной хирургического вмешательства явились доброкачественные заболевания ичников, до операции имел место регулярный менструальный цикл, и отсутствовали симптомы недостаточной функции яичников; не приобретены тяжелые соматические заболевания, которые могли бы явиться причиной вторичного остеопороза. Все пациентки достаточно регулярно наблюдались врачами до операции, не работали на вредных производствах и не применяли препаратов, влияющих на минеральный обмен. Оперативные вмешательства обследованным выполнялись с 1993 по 2000 год на

базе гинекологического или хирургических отделений ЦМСЧ №122, СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, ИАГ РАМН им. Д.О.Отта, ЦНИРРИ, городских больниц г. Пушкина № 3 и железнодорожной.

Также в исследование включены образцы ДНК 137 пациентов в возрасте от 20 до 45 лет обоих полов (женщины в пременопаузе), страдающих БА и принимавших СГК не менее 6 месяцев. Образцы крови пациентов предоставлены ГОУ ВПО Российским Государственным Московским университетом. Данные пациенты ранее не получали терапии антиостеопоретическими препаратами. Критериями исключения явились наличие у пациентов патологии органов дыхания, отличной от БА, наличие заболеваний и состояний, вызывающих развитие вторичного остеопороза другой этиологии, наличие пациенток беременности или лактации во время обследования, отсутствие согласия на участие в исследовании. Анкетирование проводилось для отбора больных и оценки факторов, влияющих на МГ и риск развития переломов. В перечень вопросов вошли следующие пункты: возраст, наличие сопутствующих заболеваний и состояний, гинекологический статус женщины, курение и злоупотребление алкоголем, степень физической активности, возраст начала БА и ее длительность, возраст начала приема СГК и его длительность, суточная и кумулятивная доза СГК, переломы на фон приема СГК. Был измерен рост и вес пациентов, оценен индекс массы тела. Суточное потребление кальция с продуктами питания рассчитывалось по дневнику пациента в соответствии с диетическими таблицами.

Минеральную плотность кости у пациентов и пациенток определяли методом двухэнергетической рентгеновской денситометрии (DEXA) на аппарате QDR 4500С фирмы Hologi (США) на базе МСЧ № 122 и для пациентов с ГИ-остеопорозом и БА на базе ГУ НИИ ревматологии (г. Москва). Диагностику остеопороза осуществляли согласно рекомендациям ВОЗ (1994 г.) по T-score, т.е. в стандартных отклонениях (SD) от нормативных показателей пиковой костной массы (ПКМ) здоровых женщин и по Z-score в SD от поло-возрастного норматива. Величина SD до 1 расценивалас как норма, от 1 до 2,5 SD - как остепения, ниже 2,5 SD - как остеопороз. Для статистических расчетов также использовали абсолютные значения МПК в г/см2. Определение содержания ДПИД (Beta-CrossLaps) в сыворотке крови проводилось на электрохемилюминесцентном анализаторе Elesys 101 наборами фирмы Roche (Фракция) на базе лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологи имени Д.О. Отта.

Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккалыгаг эпителия. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпители проводили в соответствии с методикой, приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989), некоторыми модификациями.

Проведение полимеразной цепной реакции. Нуклеотидные последовательности искомых фрагменто генов выбирали из интернет-базы "Nucleotide" ("NCBI", США). Праймеры, необходимые дл проведения ПЦР этих фрагментов, подбирали с использованием программы "Oligo 6" (США). Специфичность праймеров проверяли в программе "Nucleotide-nucleotide BLAST" ("NCBI", США).

Во всех группах изучен полиморфизм генов: COL1A1 (rsl800012), VDR (rs731236), BGLA (rsl800247) и CALCR (rsl801197). Дополнительно, в группе пациентов с бронхиальной астмой изучен полиморфизм генов: COL1A1 (rsl 107946), VDR (rsl 1568820), GSTM1 (делеция), MTHFR (rsl801133), GR (rs6195) и ER1 (rs2234693). Характеристика изученных генов представлена в таблице 1.

Таблица I. Характеристика исследованных генов и их полиморфных вариантов.

Ген, локализация Название белкового продукта гена Полиморфизм

COL1A1 (17q21.3 - q22) а1 цепь коллагена 1 типа rsll07946 -1997G/T

rsl800012 +1245G/T (S/s)

VDR (12pl2-ql4) Рецептор к витамину О rsl1568820 -3731A/G

rs731236 +61968OT (T/t)

BGL4P(17q21.3-q22) Остеокальцин rsl800247 -198C/T (H/l.)

GR (5q31) Рецептор к глюкокортикоиду rs6195 N363S A/G

CALCR (7q21.3) Рецептор к кальцитонину rsl801197 +1340C/T (СУГ)

CSTMI (lpl3) Глютатион-Б-транеферазы М1 del делеция (-/+)

ER1 (6q25.1) Рецептор к Эстрогену а rs2234693 +1943OT

MTHFR (lp36.3) Мешлентетрогидрофолатредуктаза rsl801133 +677C/T

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (БаЗо, 1989) при помощи программируемого термоциклера МС-2 «Терцик» с использованием термофильной ДНК-

полимеразы и специфических олигопраймеров. Во всех группах пациентов и в популяции определение полиморфных вариантов генов СОИА1 (Ы 800012 и ге1107946), УйК (ге731236), ВСЫР (ге 1800247) и САЬСИ (гв1801197) проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Определение в группе пациентов астматиков полиморфизма генов КДЙ (гв731236 и ге11568820), йЗТМ1 (делеция), ТЯКй (ге 1801133), ЕЯ (ге2234693) и ОД (ге6195) проводили методом гибридизации на лигонуклеотидном биочипе.

Статистическая обработка данных. При сравнении результатов использовали точный критерий ишера (Животовский, 1991), пакеты программ "ОгарЬРа<11п51аГ' (США) и БТАПЭПСА 6.0 (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам УЛЛ, СОЫА1, САЬСЯ и ВОЬАР у ольных тяжёлым остеопорозом, женщин постменопаузалыюго периода и в популяции Северо-ападного региона России

На первом этапе исследований проанализировано распределение частот аллелей и генотипов енов СОЫА1, УОЯ, С Л 1С К и ВаЛР у женщин постменопаузального периода (группа I), у больных яжёлым остеопорозом (группа И) и в популяции Северо-западного региона России (популяциопная ыборка - только женщины). Полученные результаты представлены в таблице 2. Результат анализа астот генотипов по генам СОЫА1, КОД, САЬСК и ВйЬАР показал, что распределение анализируемых енотипов в популяции Северо-западного региона России соответствуют распределению Харди-айнберга (Г=1,42 СОЫА1, "¿4), 1013 КОД; х2=1.01 СЛЬСЯ, -/>0,02 ВЫАР, ёГ=1; р>0,05).

Таблица 2. Распределение генотипов и частот аллелей генов СОЫА1, УЛ11 и САЬСК в популяции, в группе женщин

Группы и количество индивидуумов (п) Частоты аллелей, % Сравнение с популяцией: Частоты генотипов, % Сравнение с популяцией:

COLI AI S S SS Ss SS

Популяциопная выборка (п-179) 81,6±2,3 18,4±4,8 - 64,8 33,5 1,7 -

Группа I (п=168) 79,8±2,5 20,2±4,9 0,25 р=0,6136 68,5 22,6 8,9 12,61 р=0,0018

Группа II (п~70) 50,0±5,9 50,0±5,9 48,93 D<0,0001 32,9 34,3 32,9 56,06 D<0,0001

VDR т t TT Tl tt

Популяционная выборка (п-179) 63,7±3,2 36,3±4,2 - 41,3 44,7 14,0 -

Группа I (п=169) 64,5±3,2 35,5±4,4 0,02 р=0,8859 39,1 50,9 10,1 1,91 р-0,3844

Группа II (п=70) 48,6±6,1 51,4±5,9 8,92 р=0,0028 18,6 60,0 21,4 11,62 р-0,0030

CALCR т с TT тс сс

Популяционная выборка (п-179) 74,9±2,6 25,1±4,2 — 58,1 33,5 8,4 -

Группа I (п=149) 78,2±2,7 21,8±5,1 0,82 р=0,364б 58,4 39,6 2,0 3,24 р-0,1980

Группа II (п=32) 84,4±4,9 15,6±7,4 2,86 р=0,0907 68,8 31,3 0,0 6,84 р-0,0328

Как следует из полученных данных (таб. 2), частота аллеля s гена COLI AI в группе II почти в три раза выше (50,0%±5,9) таковой в популяции (18,4%±4,8) (р<0,0001). В группе I отмечено екоторое повышение частоты аллеля s (20,2%±4,9), но оно оказалось статистически недостоверным о сравнению с популяционной (р=0,6136). По нашим данным, частоты генотипов SS, Ss и ss в группе составляют 68,5%, 22,6% и 8,9% соответственно, что достоверно отличается от таковых в популяции еверо-западного региона России (64,8%, 33,5% и 1,7%; р=0,0018). Интересно отметить увеличение более чем в четыре раза частоты генотипа ss в группе I, по сравнению с таковой в популяции, несмотря на недостоверность отличия по частоте аллеля s (20,2%±4,9 и 18,4%±4,9, соответственно). Наиболее интересные результаты получены при анализе распределения генотипов в группе II. Так у пациентов с тяжёлым остеопорозом частота генотипа ss достигала 32,9%, по сравнению с 1,7% в популяции. Причем частота генотипа SS более чем в 2 раза меньше, чем в популяции, тогда как частота генотипа ss в 19 с лишним раз превысила популяционный уровень (р<0,0001).

Интересные данные получены и при изучении частоты аллеля t гена VDR, частота которого оказалась достоверно выше в группе II (51,4%±5,9), по сравнению с популяционной (36,3%±4,2) (р=0,0028). Частота этого же аллеля в группе I (35,5%±4,4) практически не отличалась от

популяционной (р=0,8859). Частоты генотипов ТТ, Т1 и и в группе II равнялись 18,6%, 60,0% и 21,4% соответственно и достоверно отличались от таковых в популяции Северо-западного региона России (41,3%, 44,7% и 14,0%; р<0,003) (таб. 2). Важно отметить двукратное снижение частоты генотипа ТТ и существенное возрастание частоты генотипа И по сравнению с популяционной. Распределение генотипов в группе I практически не отличалось от популяционного (р=0,3844). Интересно отметить, что частота характерного для популяции генотипа Т1 (44,7%) в группе I заметно увеличивается и достигает 50,9%, в то время как частоты генотипов ТТ (39,1%) и (10,1%) уменьшаются по сравнению с таковыми в популяции (41,3% и 14,00, соответственно).

При изучении полиморфизма гена САЬСЯ определено, что частота аллеля Т достоверно не отличалась от таковой в популяции (74,9%±2,6) как в группе I (78,2%±2,7) (р=0,3646), так и в группе П (84,4%±4,9) (р=0,0907). Для группы I распределение генотипов достоверно не отличалось от популяционного (ТТ-68,8%, ТС-31,3% и СС-0,0%; р=0,1980). Интересно отметить, что хотя нами не выявлено отличий в частотах аллелей для группы II, частоты генотипов ТТ, ТС и СС достоверно отличались от таковых в популяции (58,4%, 39,6%, 2,0% и 58,1%, 33,5%, 8,4% соответственно; р=0,0328). В группе II не было идентифицировано ни одного пациента с генотипом С С, и резко увеличилась частота генотипа ТТ.

Исследование полиморфизма гена ВвЬАР проведено на сравнительно небольшой групп больных тяжёлым остеопорозом. Согласно нашим данным частоты аллелей и генотипов в группе I и II не отличались от таковых в популяции Северо-западного региона России. Частота генотипов НН, НЬ и ЬЬ по гену ВОЛР в популяции составила 3,6%, 32,5% и 63,9% соответственно.

Таким образом, проведённый анализ частот генотипов и аллелей генов УйН, СОЫА1, САЬСЯ и ВЫАР в группе I (женщины постменопаузального периода) не выявил достоверных отличий о таковых в популяционной выборке. В целом, полученные результаты свидетельствуют гетерогенности исследуемой группы женщин и её сходстве с популяционной выборкой. При анализ группы II (пациентки с тяжёлым остеопорозом) установлено достоверное отличие частот аллелей генотипов по генам 1Т)Я, СОЫА1 и САЬСЯ от таковых в популяционной выборке. Важно отметит резкое увеличение числа гомозигот $$ и М, причём для гена СОЫА1 частота гомозигот была равн частоте гомозигот вв. Полученные результаты доказывают наличие ассоциации генотипов по гена рецептора витамина О и коллагена с развитием тяжёлого остеопороза. Важно отметить, что, отсутстви ярких отличий в анализируемых группах между частотами аллельных вариантов гена САЬСЯ н должно снижать интерес к изучению данного полиморфизма. Можно педполагать, что дальнейши молекулярно-генетические исследования гена САЬСЯ и увеличение выборки позволят получить боле объективную информацию о природе и механизмах действия рецептора кальцитонина, как одного и° важных регуляторов кальциевого метаболизма.

2. Сравнительный анализ частоты аллелей и генотипов по генам СОЫА1, УйЯ, САЬСЯ и БСЬЛ у пациенток с различной скоростью потери МПК

В зависимости от причины наступления менопаузы, выделено две группы женщин. Перв состояла из пациенток, у которых менопауза наступила в результате хирургического вмешательства. Вторая включала женщин с естественной менопаузой. Анализ частот генотипов и аллелей генов СОЫА1, УОЯ, САЬСЯ и ВвЬАР у женщин с менопаузой разного генеза не выявил достоверны отличий в частотах генотипов и аллелей, что позволило нам объединить их в дальнейшем в од группу, независимо от причины наступления менопаузы. Для данной группы пациенток общим неблагоприятным фактором было наличие эстрогендефицитного состояния. Данной группе пациенто была проведена остеоденситометрия поясничного отдела позвоночника в начале и через 12 месяцев о начала обследования. В зависимости от динамики изменения МПК за 12 месяцев при одинаковой продолжительности постменопаузы (независимо от ее причины), все пациентки были разделены на две группы. Первую (медленная потеря - МП) составили 53 пациентки с минимальной скоростью потери МПК (до 3% в зоне поясничного отдела 1,1-1.4 за 12 месяцев), вторую (быстрая потеря - БП) -116 женщин с высокой скоростью потери МПК (более 8%). У пациенток МП потери МПК составили в зоне и на 2,8±0,4%, Ь на 1,9±0,7%, Ь3 на 2,1±0,3 % и Ц на 2,6±0,4% (общее значение -2,35±0,47%). Пациентки БП в среднем снизили МПК в зоне Ь, на 7,9±0,93%, Ь2 на 7,6±0,66%, 1_3 на 8,0±0,96% и Ь4 на 8,2±0,72% (в целом - на 8,1б±0,76%). Результаты анализа частот аллельных вариантов и генотипов по генам СОЫА1, УОЯ, САЬСЯ и ВСЬАР представлены в таблице 3.

Частота аллеля s гена COLI А1 у женщин с быстрой потерей МПК составила 26,3±6,2% и была остоверно выше популяционной (18,4±4,8%) (р=0,0303), она более чем в 4 раза превысила таковую в уппе с медленной потерей МПК (6,7±9,4%) (р<0,0001). Интересно, что частота аллели s в популяции ыла ближе к таковой в группе с БП, чем к частоте в группе МП. Результат анализа частот генотипов ю гену COL1A1 показал достоверное отличие частот в группе женщин с быстрой потерей МПК от аковых в популяции (р=0,0009). Частота гомозигот ss по гену COLI AI в группе с быстрой потерей ПК составила 12,1%. Вместе с тем, женщины с медленной потерей МПК оказались преимущественно омозиготами по аллелю S. В этой группе его частота превысила 88%. Женщины в группе МП с енотипом ss, как и в популяции, встречались лишь в единичных случаях (1,9% и 1,7%, оответственно), но за счёт высокой частоты пациенток с генотипом Ss мы наблюдали достоверные азличия с популяционным контролем (р=0,0033). Частота гомозигот SS среди женщин с быстрой отерей МПК составила 59,5%, и была достоверно ниже популяционной (64,8%). Сходный характер аспределения частот наблюдался и в отношении гетерозигот Ss. Особенно редко генотип Ss стречался в группе женщин с медленной потерей МПК, где его частота составила всего 9,6%.

Таблица 3. Распределение генотипов и частот аллелей гена COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP в популяции и у женщин

Группы и число обследуемых пациентов (п) Частоты аллелей, % Сравнение с популяцией и между собой x!;df=i Частоты генотипов, % Сравнение с популяцией и между собой

COLI Л1 S 9 SS Ss SS

Группа МП (п-52) 93,3±2,5 6,7±9,4 7,44 р=0,0064 15,83 р<0,0001 88,5 9,6 1,9 11,41 р-0,0033 14,17 D=0.0008

Популяционная выборка (п=179) 81,6±2,3 18,4±4,8 — 64,8 33,5 1,7 -

Группа БП (п=116) 73,7±4,8 26,3±6,2 4,69 1>-0,0303 59,5 28,4 12,1 14,09 р=0,0009

VDR т t ТТ TI tt

Группа МП (п=53) 82,1 ±4,1 17,9±8,8 11,86 р-0,0006 19,74 р<0,0001 67,9 28,3 3,8 12,43 [>-«,002» 27,25 D<0.0001

Популяциоиная выборка (ч=179) 63,7±3,2 36,3±4,2 - 41,3 44,7 14,0 -

Группа БП (п=116) 56,5±5,9 43,5±5,7 2,79 р-0,0951 25,9 61,2 12,9 8,59 р=0,0136

CALCR т С ТТ тс СС

Группа МП (п=43) 65,1±6,4 34,9±8,7 2,86 р=0,0907 11,06 р=0,0009 34,9 60,5 4,7 10,61 р=0,0050 14,46 D=0.0007

Популяционная выборка (п-179) 74,9±2,6 25,1 ±4,2 — 58,1 33,5 8,4

Группа БП (п=106) 83,5±3,9 16,5±7,9 5,30 р-0,0213 67,9 31,1 1,0 7,72 р-0,0211

Аналогичная зависимость прослеживалась и в отношении частот аллелей и генотипов по гену УОИ (таб. 3). В группе с быстрой потерей МПК частота аллеля I (43,5±5,7%) достоверно не отличалась т таковой в популяции (36,3±4,2%) (р=0,0951), но была более чем в два раза выше частоты этого леля в группе с медленной потерей МПК (17,9±8,8%) (р=0,0006). Число женщин с медленной отерей МПК, гомозиготных по аллелю 1, составило 3,8 % и было более чем в 3 раза меньше таковых в опуляции (14,0%) (р=0,0020). В то же время частота генотипа и среди женщин с быстрой потерей ПК достигала 12,9% и бьиа практически равна популяционной, но, как и для гена C0L1A1, высокая азница в частотах других генотипов делала эти две группы статистически отличными (р=0,0136). Частота гетерозигот (генотип 14) среди женщин с быстрой потерей МПК составила 61,2% и была остоверно выше таковой в популяции (44,7%) и у женщин с медленной потерей МПК (28,3%). Частота ТТ гомозигот в этой группе составила всего 25,9% по сравнению с 41,3% в популяции и 67,9% гомозигот среди женщин с медленной потерей МПК.

Для гена CALCR достоверные отличия в частотах аллелей были получены при сравнении группы пациенток с БП с популяционной выборкой и группой с МП. Частота аллеля Т в группе женщин с быстрой потерей МПК достигала 83,5±3,9%, в популяции она составила 74,9±2,6% (р=0,0907), а в группе с медленной потерей - 65,1±6,4% (р=0,0213). Интересно отметить, что хотя нами не выявлено достоверных отличий в частотах аллелей гена CALCR для женщин с медленной потерей МПК, распределение генотипов ТТ, ТС и СС в этой группе достоверно отличалось от популяционного (34,9%, 60,5%, 4,7% и 58,1%, 33,5%, 8,4% соответственно; р=0,0050). У женщин с медленной потерей определено двукратное увеличение частоты гетерозигот ТС и уменьшение гомозигот ТТ (60,5% и

34,9% соответственно) по сравнению с популяционной (33,5% и 58,1%) и женщинами с быстрой потерей МПК (31,1% и 67,9%).

Результат анализа частот аллелей H и h, а также генотипов НН, Hh и hh по гену BGLAF показал, что их распределение в исследуемых группах пациенток очень сходное. Частота аллеля Н| имела тенденцию к увеличению в группе БП (20,8+4,8%) по сравнению с таковой в МП (13,5±9,5%) и в популяции (19,9±6,9%).

В дальнейшем, в ходе анализа частот генотипов у всех пациенток в постменопаузе с помощы критерия ANOVA Краскела-Уоллиса и рассчитанных между генотипами точных значений р по U-критерию Манна-Уитни нами получены прямые доказательства ассоциации аллельных вариантов-полиморфизма генов VDR, СОЫА1 и CALCR с уровенем потери МПК (в г/см2) поясничного отдела позвоночника. Чтобы доказать достоверность отличий в частотах генотипов изучаемых генов в группах женщин с различной скоростью потери МПК, нами был проведён анализ количественных изменений МПК за 12 месяцев в зависимости от различных генотипов. Для полиморфизма rsl80001 , (S/s) гена COL1A1 после выполнения повторных измерений МПК и расчёта значений МПК (рис. 1) были получены достоверные отличия как по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (х2=9,53; df=2; р=0,0085), так и по U-критерию Манна-Уитни (рис. I).

0.036 0.036 0.034 0.032 0.030 0028 0.026 0.024 0.022 0.020 0.018 0.016 0.014 0.012

р = 0,105«

р = 0,2163 р = 0,

S А

р = 0,0081*

Ss

Collai

I I ±SE _ ±SD

Рисунок 1. Показатели количественных изменений МПК в течение 12 месяцев в зависимости от генотипа по гену COLI AI. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U критерию Манна-Уитни, *достоверное отличие

0.050 0.045 0.040

0.020 0.015 0.010

р <0,0001* 1>

р =0,01 оз*

р <0,0001*

0.005

TT

Tt

QiSE ±SD

Рисунок 2. Показатели количественных изменений МПК в течение 12 месяцев в зависимости от генотипа по гену

VI)И. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по и критерию Манна-Уитии, *достоверное отличие

Особенно впечатляющие результаты получены при анализе полиморфизма rs731236 (T/t) гена VDR. После выполнения повторных измерений МПК и расчёта разницы в значениях МПК были

:олучены достоверные отличия как по критерию АЫОУА Краскела-Уоллиса (х*= 17,50; сК==2; р=0,0002), ак и и-критерию Манна-Уитни (рис. 2).

Для полиморфизма 801197 (С/Т) гена САЬСЯ после повторных измерений МПК и расчёта 1азницы в значениях МПК были получены достоверные отличия по критерию АЬЮУА Краскела-Уоллиса (х2=7,04; (11=2; р=0,0296), а и-критерий Манна-Уитни показал достоверные отличия между осителями генотипов ТТ и СС (рис. 3).

р =0,1380

"Л"

=0,0643

р =0,0363*

тс

CALCR

□ isT

1SD

исунок 3. Показатели количественных изменений МПК в течение 12 месяцев в зависимости от генотипа по гену AIXR. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U критерию Манна-Уитни, *достоверное отличие

Таким образом, полученные результаты указывают на наличие чёткой ассоциации аллельных ариантов генов VDR, COLI AI и CALCR не только с развитием тяжёлого остеопороза, но и со коростью потери МПК. Доказана ассоциация полиморфизма изученных генов с развитием стеопороза у женщин в постменопаузе, независимо от её происхождения. Распределение аллелей у i енщин с различной скоростью потери МПК позволило рассчитать коэффициент соотношения шансов OR), показывающий, во сколько раз выше вероятность иметь повышенную скорость потери МПК при ^аличии неблагоприятного генотипа (таб. 4). У женщин с генотипом tt по гену VDR более чем в 3,5 аза увеличен коэффициент соотношения шансов потери МПК в постменапаузе и, соответственно, азвития остеопороза [CI 95%: ORmi„=2,02 OR,mx=6,18]. При наличии генотипа TT по гену CALCR оэффициент соотношения шансов возрастает в 2,7 раза [CI 95%: ORmi„=l,53 +■ ORmax=4,81], а для юсителей генотипа ss по гену COLI AI - в 4,9 раз [С1 95%: (ЖШш=2,18 ^ OR™x=l 1,24]. Особый интерес щя генетического тестирования наследственной предрасположенности к остеопорозу могли бы [редставить женщины с генотипом ss по гену COLI AI и tt по гену VDR.

Таблица 4. Коэффициенты соотношения шансов для генов СОИ AI, VDR и CALCR при сравнении

Группы COLI AI VDR CALCR

OR [ORmin-max] при сравнении с ПВ OR [ORmin-max] при сравнении с МП OR [ORmin-max) при сравнении с ПВ OR [ORmin-max] при сравнении с МП OR [ORmin-max] при сравнении с ПВ OR [ORmin-max] при сравнении с МП

Женщины с быстрой потерей МПК 1,58 [1.06-2,351 4,94 [2,18-11,24] 1,35 [0,97-1,891 3,53 [2,02-6.181 1.70 [1,10-2,621 2,71 [1,53-4,811

Женщины с медленной потерей МПК 0,32 [0,14-0,72] - 0,38 [0,22-0.66] - 0,63 [0,38-1,041 -

Важно подчеркнуть, что на основании уже полученных данных определение аллельных зариантов полиморфизма генов COL1A1 и VDR перспективно с целью раннего, досимтоматического выявления женщин, принадлежащих к группе высокого риска по развитию остеопороза в тостменопаузе вследствие высокой скорости потери МПК. Максимальная частота носителей хотя бы 'эдного из генотипов ss или tt по генам COLI AI и VDR наблюдается у больных тяжёлым остеопорозом. Их минимальная частота зарегистрирована у женщин с медленной потерей МПК. Важно отметить практически равную частоту гетерозигот по двум этим генам. Эти данные свидетельствуют о независимом воздействии аллелей генов COLI AI и VDR на состояние МПК у женщин в постменопаузе

(рис. 4). Полученные данные свидетельствуют о важности анализа полиморфизма rs731236 (T/t) ген VDR, rsl800012 (S/s) гена COLI Al и возможно rsl801197 (Т/С) гена CALCR.

100

МП ПВ БП ТО МП ПВ БП ТО МП ПВ БП ТО SS- или -tt SsTt другие

Рисунок 4. Частоты генотипов генов COL1A1 и VDR у женщин Северо-западного региона России (ПВ), в групп женщин с медленной потерей МПК (МП), с быстрой потерей МПК (БП) и у больных тяжёлым остеопорозом (ТО)

Таким образом, несмотря на большое количество работ, посвященных ассоциации гено COL1A1 и VDR с переломами и с риском развития остеопороза, имеющиеся данные еще не позволяю сделать окончательный вывод о роли этих генов в поддержании МПК у женщин в постменопауз? Действительно, проведенный анализ аллельных частот этих генов у женщин постменопаузапьног периода (без учёта динамики МПК) и в популяционной выборке не позволил выявить ассоциаци соответствующих аллелей или их генотипов. Вместе с тем, наши данные хорошо согласуются результатами исследований, которые показали ассоциацию аллельных вариантов генов COL1A1 и VDk с потерей МПК в ранней постменапаузе (Gong et al., 1999; Efstathiadou et al., 2001). Причем 3Tj ассоциация не зависела от значения МПК в пике костной массы, но коррелировала с уровнем её потер| (MacDonaid et al., 2001). Характер такого воздействия может варьировать в зависимости от наличи других неблагоприятных факторов. Показано, что ЗГТ (заместительная гормональная терапия) j женщин в постменопаузе, а также высокое потребление витамина D и кальция - значительно снижаю! негативное влияние полиморфных аллелей генов COL1A1 и VDR. На фоне такого лечения у женщин и, происходит резкого снижения МПК (Harris et al., 2000; Recker R, Deng H-W., 2002).

3. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам VDR, COL1A1 и CALCR у женщш в постменопаузе с различным уровнем экскреции маркера остеорезорбции

Сделана попытка оценить влияние аллельных вариантов генов COL1A1 и VDR не только Hi поддержание МПК, но и на интенсивность резорбции костной ткани у женщин постменопаузального периода. Интенсивность резорбции оценивалась по уровню дезоксипиридинолина (ДПИД), которьЦ является высокоспецифичным биохимическим маркером костной резорбции. К биохимически^ маркерам резорбции кости относят, прежде всего, фрагменты коллагена I типа, попадающие в кровото! из зоны резорбции костного матрикса. Среди продуктов деградации коллагена I типа особого внимани заслуживают те фрагменты, в состав которых входят молекулы зрелого коллагена, имеющие поперечные сшивки. Оценка уровня экскреции ДПИД характеризует количество продуктов деградацш зрелого коллагена. Мы оценивали уровень ДПИД в моче, который зависит не только от уровня МПК| но и от генотипа пациентки.

При анализе частот аллельных вариантов гена COL1A1, в зависимости от уровня ДПИД, были получены достоверные отличия (X =28,27; df=2; р<0,0001). Выявлено всего 2 пациентки (7,4%) j генотипом ss при нормальном уровне ДПИД. В то же время при высоком уровне ДПИД генотип Si встречался у 68,5% обследованных. Частота гетерозигот (генотип Ss) среди женщин с высокими значениями ДПИД равнялась 24,1%, а гомозигот по аллелю S - 7,4%. Частота гетерозигот Ss среди женщин с нормальными значениями ДПИД более чем в два раза выше таковой при повышенном ДПИД (55,6%), а гомозигот по аллелю S - более чем в пять раз - 37,0% (рис. 5).

I

13

скорость костной резорбции в предела! нормальных значений

ДПИД < 7,4 нмоль ДПИД /нмоль креатинииа, п-27

нысокаи скорость костной резорбции

ДПИД > 7,4 нмоль ДПИД /нмоль крезткнкка, п=54

скорость костной резорбции в пределах нормальных значений

ДПИД' 7,4 нмоль ДПИД /нмоль креатнккна, п=27

высокая скорость костной резорбннн

дгащ >7,4 нмоль ДПИД /нмоль креатнннна, п^54

рсунок 5. Распределение генотипов по генам COLI AI и VDR у женщин в постменопаузе в зависимости от скорости сорбции костной ткани.

I

Среди двух групп пациенток с нормальным и превышающим норму показателем ДПИД были лучены достоверные отличия в распределении генотипов по гену VDR (%'=21 ,\1\ df=2; р<0,0001). У кциенток с уровнем ДПИД, не превышающим норму, гомозигот по аллелю t не было выявлено (рис. ). В то же время, генотип tt обнаружен у 32,7% женщин с высокой уровнем ДПИД в моче. Частота ртерозигот (генотип Tt) среди женщин с высокими значениями ДПИД составила 67,3%, а с эрмальными значениями ДПИД - 66,7%. Гомозиготы по аллелю Т при нормальной скорости костной ззорбции встретились в 33,3% случаев, а в группе с высокими показателями ДПИД данный генотип не Цявлен.

При анализе распределения генотипов по гену CALCR достоверных отличий получено не было ¿2=3,62; df=2; р=0,1634). Частота генотипа ТС у пациенток с нормальным показателем ДПИД почти в !еа раза меньше таковой у женщин с уровнем ДПИД, превышающим норму. Из пятидесяти пациенток высокой скоростью резорбции генотип СС был обнаружен только у одной (2,0%), в то время как веди 26 женщин с нормальным уровнем ДПИД такой генотип зарегистрирован лишь у двух пациенток f,7%).

Таким образом, результаты проведённых исследований подтверждают представление о 1олигенности патогенеза остеопороза. Костная ткань является результатом согласованной работы ;ногих генов. Уже идентифицировано более 300 генов, принимающих непосредственное участие в 'роцессах формирования костной ткани и её функционирования. В исследованных выборках здоровых иц, достигших половой зрелости, генетическое разнообразие в подавляющем большинстве случаев не 1ыходит за рамки "нормального" фенотипа. Инактивирующая мутация одного из главных генов стеогенеза способна разрушить согласованную работу системы полигенов, что неизбежно ведёт к ^явлению «аномального» фенотипа в сравнительно раннем возрасте. По-видимому, некоторые .елективно нейтральные (полиморфные) аллели в системе полигенов, детерминирующих процессы 'остного обмена, в изменившихся условиях внутренней среды (дефицит эстрогенов при менопаузе) шгут приводить к нарушению костного гомеостаза и процессов ремоделирования кости и, как [ледствие, к значительной потере МПК и увеличению уровня ДПИД. Например, аллель s юлиморфного локуса (нуклеотид Т) изменяет последовательность 1 интрона гена COL1A1, вследствие его данная область имеет почти в два раза большее сродство (аффинность) к транскрипционному Фактору Spl, по сравнению с S аллелем (нуклеотид G) (Hobson et al., 1998). Увеличение степени (ффинности приводит к двукратному усилению транскрипции с^ цепей проколлагена (белкового ipo дукта гена COLI AI) с последующим изменением соотношения ai и аз белковых цепей в молекуле коллагена и образованием гомотримера только из ai цепей (Mann et al., 2001). Биохимические анализы :бразцов кости гетерозигот Ss по гену COLI AI показали уменьшение прочности костной ткани по равнению с гомозиготами SS (Ralston S, 2002). Возможно, что наличие патологического гомотримерного коллагена 1 типа приводит к изменению его четвертичной структуры с последующим |гарушением минерализации костного матрикса.

Известно, что действие отбора не распространяется на гены, негативный эффект которых проявляется в пострепродуктивный период. Нельзя также исключить, что определённый вклад в ^атогенез остеопороза вносят накапливающиеся с возрастом соматические мутации. Для получения

более чёткого представления о причинах остеопороза и разработки на этой основе мер по ег| эффективной профилактике предстоит ещё большая работа. Прежде всего, она касаета идентификации всех генов, определяющих состояние кости, а также выявления взаимодейств^ между самими генами и их продуктами с оценкой влияния на эти процессы факторов внутренней внешней среды.

Тем не менее, уже сейчас генетическое тестирование женщин репродуктивного возраста и| генам COL1A1, VDR и CALCR в сочетании с обязательным денситометрическим анализом определением уровня дезоксипиридинолина (ДПИД) позволят начать разработку комплексно программы профилактики остеопороза.

4. Создание лабораторного макета "остео-чипа"

С целью одновременного анализа полиморфизма сразу нескольких генов, участвующих I метаболизме костной ткани, нами была предприянта попытка создания лабораторного варианта "ocTetj чипа". Разработанная нами тест-система полностью отвечает всем тенденциям и направления! мировой практики. В чипе использован анализ небольшого числа генов-кандидатов для проведен^ оптимальной диагностики и профилактики заболеваний костной ткани. Даный биочип, позволял б' одновременно анализировать полиморфизм следующих генов: VDR (rs731236, rsl 1568820), COL1Ä (rs 1800012, rsl 107946), BGLAP (rsl800247), GSTM1 (делеция), CALCR (rsl801197), MTHFR (rsl801133j GR (rs6195) и ERI (rs2234693). Помимо традиционных генов-кандидатов остеопороза, нами быЛ| включены гены GSTMI и MTHFR. Согласно результатам наших предыдущих пилотных исследовани (данные ещё не опубликованы), аллельные варианты этих генов коррелируют с МПК пациент'1 астматиков.

Все этапы разработки, изготовления и апробации лабораторного макета "остео-чипа, выполнялись в разное время совместно с Глотовым A.C. и Гра O.A., а также с коллегами из ОО «ИМБ-Биочип» и сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РА (г. Москва). I

Основным критерием при размещении на биочипе олигонуклеотидов, было группирована генов по блокам на основе сходства их функции, где в первый блок вошли гены, белковые продукт: которых составляют матрикс костной ткани, во второй - гены кальциотропных гормонов, факторов их рецепторов, а в третий - ген, ответственный за метаболизм гомоцистеина. Согласно выбранные критериям, олигонуклеотидные пробы в составе биочипа были сгруппированы в 3 блока (рис. 6' Олигонуклеотидные пробы, нанесенные в ячейки микрочипа, представляют собой фрагменты гено! метаболизма костной ткани. Для исключения ошибок и повышения точности каждая проба и микрочипе продублирована. 1

COLI AI -I997G COL1A1 I245G BGLAP -298C CALCR I340C VDR -3731А VDR 61968C ER 3341C GSTMI +/+ GR N363S/A MTHFR 677C

COL1A1 -I997G COL1A1 1245G BGLAP -298C CALCR 1340C VDR -3731А VDR 61968C ER 3341С GSTMI +/+ GR N363S/A MTHFR 677C

COLIA1 -I997T COL1AI I245T BGLAP -298T CALCR 1340T VDR -373 IG VDR 61968T ER 3341T GSTMI +/+ GR N363S/G MTHFR 677T

COL1A1 -1997T COL1A1 1245T BGLAP -298T CALCR 1340T VDR -373 IG VDR 61968T ER 3341T GSTMI +/+ GR N363S/G MTHFR 677T

1 блок

гйкй

3 блок

Рисунок 6. Схема первого варианта лабораторного макета «остео-чипа» н картина гибридизации продукте^ мультиплексного ПЦР на «остео-чипе».

Олигонуклеотиды в двух верхних наборах ячеек соответствуют ДНК-фрагментам «дикого» тип.' в двух нижних - «мутантным» ДНК-последовательностям. Подобное расположение облегчай интерпретацию результатов гибридизации. Выявление флюоресцентного сигнала в ячейках дв}| верхних строк биочипа для каждого из генов, означает, что анализируемый образец содержит аллел'_ дикого типа. Появление сигнала в нижних строках свидетельствует о наличии аллелей «мутантноге типа. Детекция сигнала в ячейках одного из столбцов означает гетерозиготное носительство аллеле| для каждого из генов. Созданный "остео-чип" позволяет анализировать 10 полиморфных локусов восьми различных генах. На рисунке 6 приведен пример гибридизационной картины, включающей вс блоки биочипа для образца со следующим генотипом: COL1A1 G/G - Т/Т, BGLAP С/Т, CALCR Cl VDR А/А - С/С, ER Т/Т, GSTM1 +/+, GR А/А и MTHFR С/Т.

Нами были отработаны оптимальные режимы мультиплексной ПЦР с целью повышения фективности амплификации в каждом блоке. В блоки 1, 2 и 3 входят следующие гены: COL1A1 олиморфизм rsll07946), COL1A1 (полиморфизм rsl800012, известный как S/s), BGLAP олиморфизм rsl800247, известный как H/h); CALCR (полиморфизм rsl801197, известный как СЯ), R (полиморфизм rsll568820), VDR (полиморфизм rs731236, известный как T/t), ER (полиморфизм 2234693), GSTM1 (del полиморфизм +/-), GR (полиморфизм rs6195) и MTHFR (полиморфизм 1801133). Для проверки эффективности дискриминации аллелей анализируемых генов проведена льтиплексная гибридизация продуктов второго этапа амплификации с зондами биочипа (37 циклов) с пользованием меченых нуклеотидов (dUTP), согласно ранее описанной методике (Глотов и др., 05). Гибридизационные картины были получены при анализе двух различных образцов (более 20 пытаний), генотипы которых были установлены ранее методом ПДРФ. Было показано совпадение зультатов генотипирования с помощью биочипа и метода ПДРФ.

Таким образом, применение данного чипа открывает возможности для массового скрининга с лью выявления лиц группы высокого риска развития остеопроза.

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам VDR, CALCR, BGLAP, GSTM1 и THFR у пациентов, больных тяжелой бронхиальной астмой, длительно принимающих юкокортикоиды (ГК)

Глюкокортикоиды (ГК) включены в арсенал обязательных средств современной терапии личных заболеваний, в том числе бронхиальной астмы. За более чем полувековой период накоплен юмный опыт, касающийся показаний, противопоказаний, лечебного и побочных эффектов ГК. аимосвязь остеопороза с терапией глюкокортикоидами (ГК) была установлена практически сразу еле начала использования этих препаратов и впервые описана у больных бронхиальной астмой, дивидуальная чувствительность к ГК на данный момент хорошо известна, но механизмы ее до сих р нуждаются в уточнении. Глюкокортикоид-индуцированный остеопороз (ГИ-остеопороз) считается иболее частым и тяжелым осложнением терапии ГК. Терапия глюкокортикоидами препятствует рмальному остеогенезу. При этом значительную роль играет нарушение абсорбции кальция в шечнике, обусловленное как снижением образования в печени, так и замедленным превращением его кальцитриол вследствие торможения активности 1а-гидроксилазы почек (Bowman, 1997). юкокортикоиды нарушают функционирование рецепторов к витамину D, препятствуя их связыванию кальцитриолом. При ГИ-остеопорозе нивелируется значение многих известных факторов риска. Он вивается у людей любого возраста и пола. Попытка определить минимальную (т.н. «пороговую») зу ГК, при превышении которой возрастает риск развития переломов, и требуются неотложные агностические и лечебные мероприятия, не увенчалась успехом. В последние годы появились данные о том, что применение ингаляционных глюкокортикоидов также сопровождается снижением МПК nstitute for clinical systems improvement, 2004., London: Royal College of Physicians, 2002). У пациентов жилого и старческого возраста отмечено увеличение относительного риска развития теопоротических переломов (Hubbard et al., 2002; Suissa et al., 2004).

Отсутствие четких рекомендаций для оценки риска развития ГИ-остеопороза заставляет искать вые маркеры его проспективной диагностики. Анализ ассоциации кандидатных генов метаболизма стной ткани с показателями МПК, риском переломов и с развитием остеопороза в условиях лечения К был нами проведен с помощью метода биочипов.

Исследование включало 137 больных бронхиальной астмой (БА) - как мужчин, так и женщин, и шо проведено со строгим ограничением возрастных рамок (женщины до 50 лет). Кроме онхиальной астмы, пациенты не имели иных заболеваний и состояний, которые могли бы привести к азвитию вторичного остеопороза. Было проведено генотипирование образцов ДНК по 9-ти днонуклеотидным заменам и 1 делеции в семи генах, участвующих в метаболизме костной ткани (см. аздел 4). С помощью разработанного нами лабораторного варианта "остео-чипа" удавалось чётко пределять генотипы пациентов по генам VDR, ER, GSTM1, GR и MTHFR, тогда как анализ олиморфизма генов COL1A1, BGLAP и CALCR проводился с помощью метода ПДРФ. При анализе астот генотипов и аллелей генов COLI Al, VDR (только rsl 1568820), ER и GR у больных БА с азличными показателями МПК (в абсолютных значениях г/см2, T-score и Z-score), длительно ринимающих ГК, достоверных различий выявлено не было. Вместе с тем, при сравнении абсолютных начений МПК выявлены статистически значимые различия для полиморфизма гена VDR rs731236 (T/t)

по критерию ANOVA Краекела-Уоллиеа (%2=6,28; df=2; р=0,043). Попарный сравнительный анал между генотипами по U-критерию Манна-Уитни показал, что пациенты с генотипом tt по гену VD характеризовались более низкими значениями МПК, по сравнению с носителями генотипов Tt и Т Для полиморфизма гена CALCR rsl801197 (С/Т) при сравнении абсолютных значений МПК так-были получены статистически значимые различия по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (у.2=6,8 df=2; р=0,032). Сравнительный анализ по U-критерию Манна-Уитни также показал статистичес значимые различия: носители генотипов С/Т и Т/Т по гену CALCR характеризуются более низки значениями МПК, по сравнению с носителями генотипа С/С. Для однонуклеотидной замены в ге BGLAP rsl800247 (H/h) при сравнении абсолютных значений МПК бьии получены статистичес значимые различия по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (х2=8,88; df=2; р=0,012). Сравнительнь анализ по U-критерию Манна-Уитни показал, что носители генотипа hh по гену BGLAP име достоверно более высокие значения МПК по сравнению с носителями генотипов НН и Hh.

Таким образом, изученные гены непосредственно вовлечены в процессы остеогенеза, хо биомеханизмы их действия различны. Рецепторы к кальцитонину и витамину D влияют на урове! гормональной регуляции остеогенеза, тогда как остеокальцин является важной составной часть костного матрикса.

При этом в отношении генов GSTMT и MTHFR методами непараметрической статиста удалось обнаружить ассоциацию аллельных вариантов данных генов с показателями Z-score. П сравнении показателей МПК проксимального отдела бедренной кости в целом по Z-score ) полиморфизма гена MTHFR rsl801133 (677С>Т) выявлены статистически значимые отличия (ANOV

Bo*ptotby Group Variante-Z-score

GST*W*MWFR+ GSTUQH UTMFROC

CSTMdel UTHfKT/-

0.0 -0.5 | .,.0 -1.5 •J.O -2.5 -3,0

p=0,6S9433

, p-0.0043«

p=0,0003ST

6STM+/*. MTHFR-/- GSTMaet MTHFRC/C GSTMdtí. MTHFRT/-

I<

Рисунок 7. Корреляция мезкау полиморфизмом генов CSTM1 и MTHFR и значениями МПК и Z-score у пациенте больных БА. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U-критерию Манна-Уитни, *достоверное отличи

Пациенты с СС и ТТ генотипами имели более низкую МПК по сравнению с носителям генотипа СТ (U-критерий Манна-Уитни, р = 0,0004 и р = 0,0666, соответственно). Для полиморфизм гена GSTM1 были получены статистически значимые различия по U-критерию Манна-Уитни (р=0,01 (рис. 7).

При одновременном анализе полиморфизма генов GSTM1 и MTHFR и показателей МП обнаружено, что пациенты с наличием делеции в гене GSTM1 и генотипом СС по гену MTHFR имел достоверно более низкие значения МПК (ANOVA Краскела-Уоллиса р=0,0414) по сравнению таковыми у пациентов других генотипов (рис. 7). Важно отметить, что наибольшие значения Mi были зарегистрированы у пациентов с делецией в гене GSTM1 и, по крайней мере, с одним алеллем гена MTHFR. Более выраженные отличия были получены при сравнении полиморфизма двух генов показателями Z-score (ANOVA Краскела-Уоллиса р=0,0012), где особенно высокие значения Z-scor были у пациентов, которые имели хотя бы один функциональный аллель гена GSTM1. Посколь белковые продукты «генов-кандидатов» остеопороза GSTM1 и MTHFR играют важную роль в защит организма от оксидативного стресса, который является независимым фактором риска развита

теопороза, можно предполагать, что изменение активности соответствующих ферментов определяет фективность компенсаторной реакции организма на оксидативный стресс. При действии сидативного стресса происходит индукция развития остеокластов и ингибирование фференцировки остеобластов свободными радикалами, вследствие чего усиливается костная зорбция и снижается МПК (Bjelakovic et al., 2007).

Наша работа является первой и пока еднственной, в которой изучалось развитие вторичного -остеопороза в зависимости от обмена фолиевой кислоты (метилентетрагидрофолатредуктаза FHFR) - обеспечивает превращение фолиевой кислоты в её метаболически активную форму -трагидрофолиевую кислоту). Нами показано, что у больных БА, получавших длительную терапию К, аллель 677С отрицательно коррелирует с уровнем МПК по Z-score, то есть наличие жционального полноценного фермента MTHFR в сочетании с приемом ГК предрасполагает к зрежению костной ткани и развитию вторичного ГИ-остеопороза. Возможно, такой парадоксальный фект обусловлен тем, что длительная терапия ГК приводит к увеличению выработки цитокина F-a (фактора некроза опухолей), который является важным регулятором активности остеокластов, ветственных за снижение МПК (Lane N.E. and Yao W., 2009).

Таким образом, аллельные варианты в генах GSTM1 и MTHFR у больных с тяжёлой формой онхиальной астмы (БА), получавших длительную терапию ГК, ассоциированы с нарушением рмирования пика костной массы и, следовательно, с повышенным риском развития остеопороза. и результаты позволяют приблизиться к пониманию патогенеза остеопороза, возникающего на фоне чения тяжелой формы БА, а также сформировать группу высокого риска развития ГИ-остеопороза еди больных, принимающих ГК. Предполагается, что дальнейшее изучение генетических факторов едрасположенности к ГИ-остеопорозу, в том числе анализ полиморфизма в генах цитокинов и цепторов стероидных гормонов, позволит выявить все прогностически значимые генетические кторы риска развития осложнений, возникающих вследствие длительной гормональной терапии БА, таким образом, оптимизировать стратегию применения глюкокортикоидов при лечении БА.

ВЫВОДЫ

Установлено отличие частот аллелей и генотипов по генам COLI Al, VDR и CALCR у больных жёлым остеопорозом от таковых в популяции Северо-западного региона России.

Показано отличие частот генотипов и аллелей генов COL1A1, VDR и CALCR у женщин с быстрой терей МПК от таковых у женщин с медленной потерей МПК.

Генотипы ss по гену COL1A1, It по гену VDR и TT по гену CALCR ассоциированы с высоким овнем секреции маркера остеорезорбции -дезоксиперидинолина (ДПИД) у женщин в постменопаузе.

Выявлена ассоциация абсолютных значений МПК, T-score и Z-score поясничного отдела звоночника с генотипами по генам VDR, CALCR, BGLAP, GSTM1 и MTHFR у пациентов с юкокортикоид-идуцированным остеопорозом.

Разработан и апробирован лабораторный макет «остео-чипа» для одновременного анализа диморфизма некоторых генов метаболизма костной ткани ( VDR, COLIA1, CALCR, BGLAP, GSTM1, R, MTHFR и ER).

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ в журналах рекомендованных ВАК

Москаленко М.В., Асеев М.В., Зазерская И.Е., Котова С.М., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Анализ социации аллелей гена COLI Al с развитием остеопороза // Генетика, 2002, Т38, №12, с1699-1703. Зазерская И.Е., Асеев М.В., Кузнецова JI.B., Москаленко М.В., Айламазян Э.К., Баранов B.C. ализ ассоциации генов VDR3 и Coli Al с постменопаузальным остеопорозом // Остеопороз и еопатии, 2002, №2, с2-6

Москаленко М.В., Асеев М.В., Котова С.М., Баранов B.C. Анализ ассоциации аллелей генов Collai, R и CALCR с развитием остеопороза // Экологическая генетика, 2004, Т2, №1, с38-43 Зазерская И.Е., Асеев М.В., Кузнецова Л.В., Москаленко М.В., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. лияние аллельных вариантов гена VDR3 на скорость потери минеральной плотности костной ткани у енщин в ранней постменопаузе // Журнал акушерства и женских болезней, 2005, Т54, №2, с23-30.

5. Москаленко М.В., Асеев М.В., Федотова А.А., Зазерская И.Е., Баранов B.C. Анализ распределен аллелей гена эстрогенового рецептора у женщин с постмеиопаузальным остеопорозом // Медицинск генетика, 2005, Т4, №5, с232а-232

6. Путилин A.M., Москаленко М.В., Баранова И.А., Асеев М.В., Дёмин Н.В., Баранов B.C., Чучал

A.Г. Исследование полиморфизма гена рецептора витамина D при глюкокортикоид-индуцированн остеопорозе у больных тяжёлой бронхиальной астмой // Пульмонология, 2006, с68-75

7. Чучалин А.Г., Баранова И.А., Москаленко М.В., Путилин A.M., Асеев М.В., Дёмин Н.В., Иващен Т.Э., Гораб Д.Н. Изучение генетической предрасположенности к глюкокортикоид-индуцированно остеопорозу у больных тяжёлой бронхиальной астмой // Вестник Российского Медицинско Университета, 2006, №4 (51), с39-43

8. B.C. Оганов, О.Л. Виноградова, Н.С. Дудов, B.C. Баранов, А.С. Миненков, А.В. Бакунин, В. Новиков, О.Е. Кабицкая, М.В. Москаленко, А.С. Глотов, О.С. Глотов, Д.В. Попов Анализ ассоциац костной массы у спортсменов с биохимическими и молекупярно-генетическими маркёра ремоделирования костной ткани // Физиология человека, 2008, Т34, №2, с56-65.

9. О. А. Гра, М. В. Москаленко, Н. А. Филимонова, И. А. Баранова, А. С. Глотов, С. А. Суржиков,

B. Королева, И. В. Голденкова-Павлова, Т. В. Наседкина Ассоциация полиморфных вариантов ген MTHFR и GSTM1 с развитием глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у больных бронхиальн астмой // Молекулярная Биология, Т45, №5,2011 (в печати).

в иностранных журналах и материалах международных конференций

10. M.Aseev, M.Moskalenko, V.Baranov. Bone mineral density in relation to Taq I polymorphism at the VD gene. // Progress in prevention of genetic diseases, Prague, Czech Republic, June 3-5, 1999.

11. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Zazerskaya I.E., Baranov V.S. The association alleles of COL1A1, VD CALCR genes and sever osteoporosis in women from Russia. // Eur J Hum Genetics, 2001, V9, P272

12. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Baranov V.S. Non-association alleles of ERa gene and postmenopau osteoporosis in women from Russia. // International Congress in Predictive Medicine, P14, Vichy, France, June - 1 July 2001.

13. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Zazerskaya I.E., Baranov V.S. Allelic association of COL1A1 and VD genes with one-year rates of bone mineral loss in postmenopausal women // Eur J Hum Genetics, 2002, VI P177

14. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Zazerskaya I.E., Baranov V.S. VDR, Collal and BGLAP gen polymorphism in development of postmenopausal osteoporosis // Eur J Hum Genetics, 2003, VI1, P234

15. M. V. Moskalenko, M. V. Aseev, I. E. Zazerskaya, V. S. Baranov The analysis of association betwe polymorphism of BGLAP gene and gynecologic diseases at osteoporosis in postmenopausal women // Eur Hum Genetics, 2004, V12, P298

16. Moskalenko M.V., Putilin A.M., Baranova I.A., Aseev M.V., Dentin GS., Ghorab D., Demin N. Chuchalin A.G, Baranov V.S. Analysis of polymorphisms of the Collal and VDR genes in severe astl patients treated with oral glucocorticoids // Calcif Tissue Int, 2006, V78, S113

17. D. Ghorab, G Demin, A. Glotov, M. V. Moskalenko MICROARRAY TECHNOLOGY IN MEDIC" ANALYSIS AND RESEARCH OF BONE METABOLISM GENES // 35th European Symposium on Calcifi Tissues, Barcelona, 24-28 May 2008.

18. Gra O.A., Moskalenko M.V., Goldenkova-Pavlova I.V., Nasedkina T.V. Biotransformation ge polymorphisms and the risk of glucocorticoid-induced osteoporosis // European Human Genetics Conferenc Gothenburg, Sweden, June 12-15, 2010. European Journal of Human Genetics

другие основные публикации

19. И.Е. Зазерская, М.В. Асеев, JI.B. Кузнецова, М.В. Москаленко, Д.А. Ниаури, B.C. Баран ОСТЕОПОРОЗ. Генетическая предрасположенность. Современная диагностика, профилактика методическое пособие, под ред. акад. РАМН, з.д.н., проф. Э.К. Айламазяна, ООО "МГК", 2003,32 стр.

20. Москаленко М.В., Асеев М.В., Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., Баранов B.C. Изучен генетической предрасположенности к остеопорозу // в сб. Молекулярно-биологические технологии медицинской практике, выпуск 4, ООО "Альфа Виста", Новосибирск, 2003, с120-133

. Асеев М.В., Москаленко М.В., Баранов B.C. Болезни и гены предрасположенности. ТЕОПОРОЗ // в книге Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины, д редакцией B.C. Баранова. СПб, издательство «Н_Л», 2009, clôl-191

. Москаленко М.В. Асеев М.В. Баранов B.C. Модификация методики определения G->T диморфизма гена CollAl и использование её для диагностики риска развития остеопороза. // Тезисы кладов II съезда ВОГиС, т 2, с277, С-Петербург, 1-5 февраля, 2000.

. Асеев М.В., Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., Москаленко М.В., Иващенко Т.Э., Айламазян Э.К., ранов B.C. Анализ ассоциации аллелей генов VDR3 и COL1A1 с постменопаузальным остеопорозом Научно-практический симпозиум «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении», , Москва, 20-21 июня, 2002.

. Путилин A.M., Москаленко М.В., Асеев М.В., Демин Н.В., Федотова A.A., Баранова И.А. Анализ диморфизма гена VDR при глюкокортикоид-индуцированном остеопорозе у больных бронхиальной 1М0Й // II съезд по остеопорозу, с44, Ярославль, 29 сентября - 1 октября, 2005 Гораб Д.Н., Москаленко М.В., Путилин A.M., Асеев М.В., Баранова И.А. Анализ полиморфизма ob VDR и Collai у больных бронхиальной астмой при глюкокортикоид-индуцированном iConopo3c. // Научная школа молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при ждународной конференции "Генетика в России и мире, посвященной 40-летию Института общей етики им. Н. И. Вавилова РАН" Москва, 28 июня - 2 июля 2006.

. Гораб Д.Н., Москаленко М.В., Глотов A.C., Вашукова Е.С. , Полушкина Л.Б., Иващенко Т.Э. , ¡нелис В.Г. , Баранов B.C. Анализ генов костного метаболизма у гормонозависимых пациентов, адающих бронхиальной астмой, с использованием БиоЧип технологии.// Международная Школа лодых Ученых по Молекулярной генетике «Геномика и Биотехнология», Звенигород, 4-8 декабря 06.

дписано в печать 01.11.11 Формат 60x84'/i6 Цифровая Печ. л. 1.0

.-изд. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 08/10 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Москаленко, Михаил Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.!.

1.1 Эпидемиология остеопороза.

1.2 Денситометрия костнойткани.

1.3 Факторы риска? остеопороза.

1.4 Генетические факторы риска« остеопороза.

1.5 Гены предрасположенности к остеопорозу.

1.6 Структура гена рецептора витамина D (VDR).

1.7 Структура и роль белкового продукта гена рецептора витамина D.

1.8 Полиморфизм гена рецептора витамина D.

1.9 Структура генов коллагена 1 типа (COL1A1 и COL1A2).

1.10 Структура и,биосинтез белкового продукта, генов коллагена Г типа {COLIAI и COL1A2).

1.11 Полиморфизм гена коллагена 1 альфа 1.

1.12'Кальцитониновый рецептор (CALCR).

1.13 Роль кальцитонина:В метаболизме костной ткани.

1.14 Полиморфизм гена рецептора кальцитонина.

1.15 Остеокальцин (BGLAP).

1.16 Роль остеокальцина в метаболизме костной ткани.

1.17 Полиморфизм гена остеокальцина.

1.18 Полногеномные исследования ассоциаций (GWAS).

1.19 Перспективы клинического использования диагностики полиморфизма в «генах-кандидатах».

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Контингент обследованных лиц.

2.2 Реактивы и список растворов.

2.3 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови.

2.4 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

2.4.1 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.4.2 Ферментативный гидролиз и электрофорез в ПААГ.

2.5 Использование лабораторного макета «остео-чипа» для идентификации; аллелей генов УТ)К, СоНа, САЬСЯ, ВСЬАРЕЩ <7/?, вБТМ! и МТНРЯ.

2.5.1 Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов.

2.5.2 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе.

2.5.3 Гибридизация меченого продукта на микрочипе и регистрация изображения.

2.6 Математические методы анализа.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Частота аллелей, и генотипов по генам СОЫА1, К/)/?, САЬСЯ и ВСВАР у больных тяжёлым остеопорозом;, у женщин постменопаузального периода; и? в популяции Северо-западного региона Россию.:.

3:1.1 В$еI полиморфизм гена СОЫА1.

3X2 Тацк полиморфизм гена Р7Ж.83 '

3.1.3 Л/гЛ полиморфизм гена САЬСК.

3.1.4 НтсйИполиморфизм гена ВОАР.

3.2 Частоты аллелей; и генотипов по генам СОЫАЬ, САЬСК и ВСЬАР у женщин в ностменопаузе (группа II).

3.3 Частоты аллелей и генотипов по генам» СОШАГ, УОЛ, САЬСЯ и ВСЬАР у пациенток с различной скоростью потершМПК.

3.3.1 ВяеI полиморфизм гена СОЫА1.

3.3.2 полиморфизм генаУШ.!.

3.3.3 АкЛ полиморфизм гена САЬСЯ.

3.3.4 ШпсПИ полиморфизм тепа ВСЬАР.

3.4: Частота аллелей и генотипов по генам СОЫА1, УИЯ и САЬСЯ у женщин в постменопаузе с различным уровнем экскреции маркера. остеорезорбции.

3.4.1 ВяеI полиморфизм гена СОЫА1.

3.4.2 Taq\ полиморфизм гена УИЯ.

3.4.3 А1и\ полиморфизм гена САЬСЯ.

3.5 Частота аллелей и генотипов по генам СОЫА1 и УОК у пациентов больных тяжелой бронхиальной астмой, длительно принимающих глюкокортикоиды (ГК).

3.5.1 Тад1 полиморфизм гена УВЯ.

3.5.2 Значения МПК у пациентов с различными генотипами по гену УИЯ.

3.5.3 Bsell полиморфизм гена COL1A1.

3.6 Создание лабораторного макета остео-чипа.

3.6.1 Результаты оптимизации мультиплексной ПЦР Блока № 1.

3.6.2 Оптимизация мультиплексной ПЦР Блока № 2 (кроме гена CALCR).

3.6.3 Оптимизация мультиплексной ПЦР Блока № 3 (гены CALCR и MTHFR).

3.6.4 Проверка моноплексной и мультиплексной гибридизации ПЦР продуктов генов с биочипом.

3.7 Частота аллелей и генотипов по генам COLI AI, VDR; CALCR, BGLAP,

GR, GSTM1 и MTHFR у пациентов больных тяжелой! бронхиальной астмой, длительно принимающих глюкокортикоиды (FK).

Глава 4: ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1s Сравнительный« анализ частот аллелей и генотипов по генам. VDR, COLI AI, CALCR и BGLAP у женщин постменопаузального периода и у больных тяжёлым остеопорозом.

412 Сравнение частот, генотипов и аллелей генов VDR, COL1A1 и CALCR в популяциях Европы, Северо-западного и Волго-Уральского регионов России».

4.2.1 Bsel полиморфизм гена COL1A1.

4.2.2 TaqI полиморфизм гена VDR.

4.2.3 Alul полиморфизм гена CALCR.

4:3 Функциональная значимость аллельных» вариантов генов COLI AI,

VDR и CALCR.£.

4.4 Сравнительный анализ частот генотипов по генам VDR, COL1A1 и

CALCR у женщин-постменопаузального периода.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороз у человека"

Наступивший XXI век, по мнению многих ученых мирового сообщества, это - век генетики. Прямым и важнейшим достижением генетики стала расшифровка (прочтение) генома человека. Международная программа Геном человека определила бурное развитие и активное внедрение в медицинскую практику молекулярной медицины и представления о существовании "генов предрасположенности" — генов, мутантные аллели которых совместимы с рождением и жизнью в постнатальном периоде, но при определенных неблагоприятных условиях могут способствовать развитию того или иного заболевания (Баранов и др. 2000, 2009). По образному высказыванию Фрэнка Коллинса - директора Международной Программы "Геном человека" "Каждый из нас генетически несовершенен. По мере разработки все новых генетических тестов у каждого человека можно обнаружить мутацию, предрасполагающую к тому или иному заболеванию". (Collins, 1999;). В' геноме человека насчитывается около 22 тысяч генов. Мутации, возникающие в некоторых из них, приводят к одному из многочисленных наследственных заболеваний. Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не' только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному сочетанному (мультифакторному) заболеванию. Среди болезней, вызванных наличием мутаций в генах предрасположенности, различают заболевания "с поздним началом" и мультифакториальные (полигенные) болезни (Баранов и др., 2000). Генетическая предрасположенность к заболеваниям с "поздней манифестацией" (рак молочной железы, семейный полипозный рак толстой кишки, хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера, ряд нейродегенеративных заболеваний) имеет, как правило, моногенную природу и может быть обнаружена уже при рождении ребенка, однако симптомы болезни развиваются в более позднем возрасте. Предрасположенность к мультифакториальным (сочетанны или комплексным) болезнням (сахарный диабет, атеросклероз, ишемическя болезнь сердца, бронхиальная астма, остеопороз, эндометриоз, некоторые психические и онкологические заболевания) также может быть определена сразу после рождения, но их манифестация в значительной мере зависит от провоцирующего действия неблагоприятных факторов внешней среды, специфичных для конкретного заболевания.

Данная работа посвящена изучению особенности аллельного полиморфизма генов метаболизма костной ткани у лиц с высоким риском развития остеопороза — одного из частых МФЗ. Остеопроз по данным Всемирной Организации Здравоохранения вышел по значимости на четвёртое место среди неинфекционных заболеваний после сердечнососудистой и онкологической патологии, а так же диабета. В интерес к остеопорозу как важеной» медицинской и социальной проблеме очень высок. Это связано, прежде всего, с тем, что в развитых странах всё большее внимание уделяется людям пожилого возраста, продолжительность жизни которых увеличивается, а активная созидательная деятельность сохраняется достаточно долго. Широкая распространенность, тяжесть исходов особенно при переломах шейки бедра и потеря способности к самообслуживанию определяют высокую социальную значимость данного заболевания. Рассчитано, что в среднем 40% женщин постменопаузального периода переносят, по крайней мере, один перелом вследствие остеопороза (Audi et al., 1999). Более 10' миллионов американцев страдают остеопорозом, из них около миллиона ежегодно переносят переломы как следствие этого заболевания (Melton, 1997). На лечение и профилактику остеопороза в США тратится более 10 млрд. долларов ежегодно (Melton, 1997). Учитывая вышеприведенные факты, определение молекулярно-генетических причин остеопороза является достаточно актуальной задачей. Существует несколько подходов для оценки вклада того или иного гена-кандидата в патогенез остеопороза. Один из них состоит в определении степени корреляции между аллельным полиморфизмом гена-кандидата и факторами, провоцирующими развитие болезни. С этой целью проводится сравнение частот аллелй предполагаемых генов-кандидатов у больных остеопорозом с таковыми у лиц, не имеющих данного заболевания и, соответственно, сохраняющих нормальную минеральную плотность костной ткани.

Подтверждение наличия ассоциации' между аллелями генов костного ремоделирования и остеопорозом у больных в популяции Северо-западного региона России позволит использовать данный алгоритм для тестирования индивидуумов на выявление предрасположенности к заболеванию. Результаты» такого исследования важны для более рациональной организации системы профилактики и лечения этого заболевания еще на ранних* досимптоматических стадиях его развития:

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучить особенность частот аллелей, генов-регуляторов метаболизма костной ткани у больных остеопорозом различной этиологии и в популяции Северо-западного региона России.

Для до стиже н и я цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценть частоты аллелей генов метаболизма костной ткани {COLIAI, VDR, CALCR и BGLAP) у женщин Северо-западного региона России, у больных с тяжёлым остеопорозом, у женщин постменопаузального периода и у пациентов с глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом.

2. Определить ассоциацию аллелей и- генотипов по генам COL1A1, VDR и CALCR с риском развития заболевания у больных тяжёлым остеопорозом.

3. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COLI AI, VDR, BGLAP и CALCR со скоростью потери МПК и уровнем экскреции маркера остеорезорбции дезоксиперидинолина (ДПИД), у женщин в постменопаузе.

4. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COL1A1 и VDR с риском развития глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у пациентов при лечении астмы.

5. Разработать - и апробировать лабораторный макет «остео-чипа» для одновременного анализа полиморфизма некоторых генов метаболизма костной ткани (VDR, COLI AI, CALCR, BGLAP, GSTM1, GR, MTHFR и ER).

Научная новизна работы

Впервые проведен сравнительный анализ частот аллелей генов COLI AI, VDR, BGLAP и CALCR у женщин постменопаузального периода, у пациентов с остеопорозом и в популяции Северо-Западного региона России, проанализирована корреляция, полиморфных вариантов изученных генов, с тяжестью заболевания. Впервые показана неслучайная, ассоциация между развитием глюкокортикоид-идуцированным остеопорозом и полиморфизмом генов VDR, CALCR, BGLAP, MTHFR и GSTM1 у больных бронхиальной астмой. Впервые проведен проспективный анализ уровней МПК в зависимости от паттерна аллелей и генотипов по генам COLI AI, VDR", BGLAP и CALCR. Впервые показано, что гомозиготность по аллелю Ггена VDR, аллелю. s гена COL1A1 и аллелю Т гена CALCR увеличивает риск высокой потери МПК у женщин Северо-Западного региона России в постменопаузе. Впервые показан синергический (аддитивный) эффект сочетаний изученных «функционально неполноценных» генотипов по генам, VDR и COLI AI при развитии и прогрессировании. остеопороза. Впервые создан лабораторный макет «остео-чипа», предназначенного для одновременного анализа полиморфизма нескольких генов костного метаболизма.

Практическая значимость

Анализ генетического полиморфизма генов* VDR и COL1A1 можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска быстрой потери МПК и развития тяжёлого остеопороза у женщин в постменопаузе. Анализ генетического полиморфизма генов VDR, CALCR, BGLAP, MTHFR и GSTM1 можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска развития вторичного остеопороза при лечении астмы глюкокортикоидами. Материалы диссертационной работы вошли в методические рекомендации «ОСТЕОПОРОЗ. Генетическая предрасположенность. Современная диагностика, профилактика» для врачей эндокринологов и гинекологов. 2007 г., 67 стр. (2003).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аллели и генотипы по генам COLI AI, VDR и CALCR ассоциированы с развитием остеопороза.

2. Наличие определенных аллелей и генотипов по генам COLI AI, VDR и CALCR, а также сочетанных генотипов по генам VDR и COLI AI ассоциировано с различной скоростью потери МПК у женщин в постменопаузе.

3. Наличие определённых аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR и CALCR ассоциировано с различным уровнем секреции маркера остеорезорбции дезоксиперидинолина (ДПИД) у женщин в постменопаузе.

4. Носительство генотипа tt по гену VDR, генотипа CT по гену CALCR, генотипа CT по гену BGLAP и генотипа CT по гену MTHFR и делеции в гене GSTM1 ассоциировано с низкими значениями Z-score и абсолютных значений МПК поясничного отдела позвоночника у пациентов с глюкокортикоид-идуцированным остеопорозом.

Апробация работы

Результаты работы представлены* на 2-ом съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000), на 2-ом Российском, съезде медицинских генетиков» (Курск, 2000), 11>ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), Международном конгрессе по предиктивной медицине (Франция, 2001), на Европейских конгрессах по генетике человека в 2003г. (Бирмингем, Великобритания), в 2004г. (Мюнхен, Германия), в 2005г I

Прага, Чехия), на Международном конгрессе по геному человека HGM2002 (Китай, 2002). Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории пренатальной, диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ Научно-исследовательский, институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ, из них 8 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 171 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и результаты), их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 240 ссылок. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 42 рисунками. Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врождённых заболеваний человека Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Москаленко, Михаил Викторович, Санкт-Петербург

1. Баранов B.C. Баранова Е.В. Иващенко Т.Э. Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности» (Введение в предиктивную медицину) // СПб. Издательство "Интермедика". 2000

2. Баранов B.C. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предиктивной медицины // СПб, H-JL, 2009, 528С

3. Беневоленская Л.И. Остеопороз — актуальная* проблема медицины^ // Остеопороз и остеопатии. 1998. №1.С4-7

4. Беневоленская Л! И. Генетические аспекты остеопороза // В книге: Руководство по остеопорозу, М5., Бином, 2005, 105-130:

5. Быков В.Л. Цитология и общая гистология // СПб. Издательство "Сотис". 1999. СЗ58-370

6. Вандер А. Физиология почек // СПб. Издательство'"Питер". 2000. С256

7. Гра O.A., Глотов* A.C., Кожекбаева Ж.М., Макарова О.В., Наседкина Т.В. Генетический полиморфизм GST, NAT2 и MTRR и предрасположенность к развитию острого лейкоза у детей // Молекуляр. Биология, 2008, 42, 214-225.

8. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты // М., Реафарм, 2004

9. Михайлов Е.Е., Беневоленская Л.И., Аникин С.Г. и др. Частота основных переломов основных локализаций среди городского населения России // Научно п практическая ревматология, 2001, № 3, 75.

10. Михайлов Е.Е., Беневоленская Л.И., Аникин СГ. // Остеопороз и остеопатии, 1999; № 3: 2-6.

11. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA // М.: МедиаСфера.- 2003. 312 с.

12. Селезнева ЛИ, Хусаинова РИ, Нурлыгаянов РЗ Анализ, ассоциаций полиморфизмов и гаплотипов 5' региона гена COL1A1 с риском развития остеопоретических переломов у женщин Волго-Уральского региона России // Генетика.-2008 -№2 С 219-225

13. Селезнева ЛИ, Хусаинова РИ; Хуснутдинова ЭК Генетические аспекты остеопороза // Медицинская генетика -2006 №12 - С 3-12

14. Смирнов А. В. Рентгенологическая» диагностика остеопороза при* ревматических заболеваниях // Consilium Medicum журнал доказательной медицины для практикующих врачей, 2004, Т06, N 8

15. Aerssens J. Dequeker J: Peeters J., Breemans S. Broos P. Boones S Polymorphisms of the VDR. ER and COL1A1 genes and osteoporotic hip fractures in elderly postmenopausal women // Osteoporos Int. 2000. VI1. P583-91

16. Ames SK, Ellis KJ, Gunn SK, Copeland KC, Abrams SA. Vitamin D receptor gene Fokl polymorphism predicts calcium absorption and bone mineral density in children // J Bone Miner Res. 1999 May;14(5):740-6.

17. Andrew R. Baker R. Yong S. Timont G Cloning and' expression of full-legth cDNA. encoding Human vitamin D receptor // Proc Nat Acad Sci USA. 1988. V85. P3294-8

18. Arai H. Miyamoto KI. Taketani Y. Yamamoto H. Iemori Y. A vitamin D receptor gene polymorphism in the translation initiation codon: Effect on protein activity and relation^to BMD in Japanese women. // J Bone Miner Res. 1997. V12. P915-21

19. Arden- NK. Baker J. Hogg C. Baan K. Spector TD. The heritability of bone mineral density, ultrasound of the calcaneus and hip axis length: A study of postmenopausal twins // J. Bone Miner Res.1996. V4(4). P530-534

20. Audi IL Garcia-Ramirez M. Carrascosa A. Genetic determinants of bone mass // Horm Res. 1999. V51(3). P105-23

21. Barthe N. Basse-Cathalinat B Measurement of Bone mineral* density in mather-daughter pairs for evaluating» the family influence on bone mass acquisition: A GRIO survey // Osteoporos Int. 1998. V8(4). P 379-84

22. Beamer WG, Donahue LR, Rosen CJ, Baylink DJ. Genetic variability in adult bone density among inbred strains of mice. Bone. 1996;18:397-403

23. Beavan S. Prentice A. Yan L. Dibba, B. Ralston SH Differences in vitamin D receptor genotype and geographical variation in osteoporosis // The Lancet. 1996. V348. P136-7

24. Beavan S. Prentice A. Bakary D. Yan L. Cooper C. Ralston»SH Polymorphism of the collagen type loci gene and ethnic differences in hip-fractures rates // NEngl J Med. 1998; V339. P 351-52

25. Bjelakovic G., Beninati S., Pavlovic D.v, Kocic G., Jevtovic T., Kamenov B., Saranac L.J., Bjelakovic B., Stojanovic I., Basic J. 2007. Glucocorticoids and oxidative stress // J!. Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 18,115-127.

26. Bord S, Ireland DC, Moffatt P, Thomas GP, Compston JE. Characterization of Osteocrin Expression in Human Bone. J Histochem Cytochem. 2005

27. Bower AL, Lang DH, Vogler GP, Vandenbergh DJ, Blizard DA, Stout JT, McClearn GE, Sharkey NA. QTL analysis of trabecular bone in BXD F2 and RI mice. J Bone Miner Res. 2006;21:1267-75

28. Bowman A.R., Epstein S. Drug and hormone effects on vitamin D metabolism. In: Vitamin D. Fieldman D., Glorieux F.H., Pike J.W. // (eds). San Diego: Academic Press; 1997: P797-829.

29. Bradney M, Karlsson MK, Duan Y, Stuckey S, Bass S, Seeman E. Heterogeneity in the growth-of the axial and appendicular skeleton in boys: implications for the pathogenesis of bone fragility in men. J Bone Miner Res. 2000;15:1871-8

30. Braga V. Mottes M. Mirandola S. Lisi V. Malerba G. Sartori L. Bianchi G. Gatti D. Rossini M. Bianchini D. Adami S Association of CTR and1 COL1A1 alleles with¡BMD values in Peri- and Postmenopausal women // Calcif Tissue Int. 2000: V67. P361-366

31. Brodt MD, Ellis CB, Silva, MJ. Growing C57B1/6 mice increase whole bone mechanical properties by increasing, geometric and material1 properties. J Bone Miner Res. 1999;14:2159-66

32. Brown M. Eisman-J The genetics of osteoporosis: Future diagnostic Possibilities // Clin Lab Med. 2000. V20(3). P527-47

33. Celeste AJ, Rosen V, Buecker JL, Kriz R, Wang EA, Wozney JM. Isolation of the human gene for bone gla protein utilizing mouse and rat cDNA clones // EMBO J. 1986 Aug;5(8): 1885-90.

34. Chatteijee S, Das N, Chatterjee P. The estimation of the heritability of anthropometric measurements. Appl Human Sci. 1999;18:1-7

35. Cheverud JM, Ehrich TH, Vaughn TT, Koreishi SF, Linsey RB, Pletscher LS. Pleiotropic effects on mandibular morphology II: differential epistasis and genetic variation in morphological integration: J Exp Zoolog B Mol Dev Evol. 2004;302:424-35

36. Colin D.S., Pauline M.E., Sarah J.L., George D.S., Tobias J.H. 2009. Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) C677T Polymorphism Is Associated With Spinal BMD in 9-Year-Old Children // J. Bone Miner. Res. 24, 117-124.

37. Collins FS. Shattuck lecture — medical and societal consequences of the Human Genome Project // N Engl J Med. 1999. V341(l). P28-37

38. Copper GS. Umbach DM Are vitamin D receptor Polymorphisms associated with bone mineral density? A meta-analysis // J. Bone Miner Res.1996. Vll. P1841-9

39. Crofts LA, Hancock MS, Morrison NA, EismanJA. Multiple promoters direct the tissue-specific expression of novel N-terminal variant human vitamin D receptor gene transcripts // Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Sep 1;95(18):10529-34.

40. Cummings CW, Weymuller EA Jr, Woodson G. Pregnant woman with a neck mass // Head Neck. 1995 Jan-Feb;17(l):56-8.

41. Deng HW, Shen H, Xu FH, Deng HY, Conway T, Zhang HT, Recker RR Tests of linkage and/or association of gene for vitamin D receptor, osteocalcin, andparathyroid hormone with bone mineral density // J Bone Miner Res 2002, 17:678-686

42. Dennison EM. Arden NK. Keen RW. Syddall H. Day IN. Spector TD. Cooper C. Birthweight. vitamin D receptor-genotype and the programming of osteoporosis // Paediatr Perinat Epidemiol. 2001. V15(3). P211-9

43. Donaldson C. Hulley S. Vogel J. Effect of prolonged bed rest on bone mineral. // Metabolism. 1970. V19. P1071

44. Duan Y. De Luca V. Seeman E. Parathyroid hormone deficiency and excess: similar effects on trabecular bone but differing effects on cortical bone. // J Clin Endocrinol Metab. 1999. V84(2). P718-22

45. Ducy P, Karsenty G Skeletal Gla proteins: gene structure, regulation of expression, and function. In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA (eds) Principles of Bone Biology. Academic // New York, 1996., pp 321-338

46. Efstathiadou Z. Tsatsoulis A. Ioannidis JP. Association of collagen Ialpha 1 Spl polymorphism with the risk of prevalent fractures: a meta-analysis // J Bone Miner Res. 2001. VI6(9). P1586-92

47. Eisman JA genetics of osteoporosis. In: Osteoporosis 1996. Proceed, of the 1996 World Congr. On Osteoporosis. Ed. By S.E. Papapoulos et al. Elsevier. 1996. P131-35

48. Eisman JA- Vitamin D polymorphisms, and calcium homeostasis: A new concept of normal gene variants and physiologic variation // Nutr Rev 1998 56:s22-s29.

49. Eisman JA. Genetics of osteoporosis // Endocr Rev. 1999. V20(6). P788-804

50. Esterle L, Jehan F, Sabatier JP, Garabedian M. Higher milk requirements for bone mineral accrual in adolescent girls bearing specific Caucasian genotypes in the VDRpromoter // J Bone Miner Res. 2009lAug;24(8):1389-97.

51. Faraco J£H: Morrison N.A. Baker A. S hine J: Frossard P.M: Apal dimorphosm at human vitamin D receptor gene locus // Nucleic Acids Res.1989. V17. P2150

52. Fernandez E. Fibla J. Betriu A. Piulats JM. Almirall J1. Montoliu J. Association' between vitamin D receptor gene polymorphism and relative hypoparathyroidism in patients with chronic renal failure // JiAmSoc Nephrol. 1997. V8(10). P1546-52

53. Fotin AV, Drobyshev AL, Proudnikov DY, Perov AN, Mirzabekov AD. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips // Nucleic Acids Res. 1998 Mar 15;26(6):1515-21.

54. Fountas L. Moutsatsou P. Kastanias I. Tamouridis N. Tzanela M. Anapliotou M. Sekeris CE. The contribution of vitamin D receptor gene polymorphisms in osteoporosis and familial osteoporosis // Osteoporos Int. 1999. V10(5). P392-8

55. Friso S., Choi S.W. 2002. Gene-nutrient interactions and DNA methylation // J. Nutr. 132, 2382S-2387S.

56. Furuya Y. Akakura K. Masai M. Ito Hi Vitamin D receptor gene polymorphism in Japanese patients with prostate cancer // Endocr J. 1999.V46(3). P467-70153

57. García-Giralt N, Enjuanes A, Bustamante M, Mellibovsky L, Nogués X, Carreras R, Diez-Pérez A, Grinberg D, Balcells S. In vitro functional assay of alleles and haplotypes of two COL1A1-promoter SNPs // Bone. 2005 May;36(5):902-8. Epub 2005 Apr 7.

58. Garnero P. Arden NK. Griffiths G. Delmas PD. Spector TD: Genetic influence on bone tumover:in postmenopausalitwins;// J?Glin Endocrino^ Metab. 1996. V81(l).- P140-6 " ' ;

59. Garnero P, Delmas PD. Bone markers // Baillieres Clin Rheumatol: 1997 Aug; 1T(3):517-37. .

60. Carnero P. Borel O. Grant SF. Ralston SH. Delmas PD. Collagen Ialphal Spl polymorphism: bone mass. and? bone turnover in healthy Frcnch premenopausal women: the OFELY study // J Bone Miner Res. 1998. V13(5). P813-7

61. Gennari C. Agnusdet D; Camporeale A. Long-term treatment with, calcitonin in osteoporosis // Horm.Met.Res. 1993. V 25. P 484

62. Genriari L. Becherini L et al Fok I polymorphism at translation initiation sitc of the vitamin D receptor gene predicts bone mineral density and osteoporotic fracture in early postmenopausal women // Bone. 1998. V23(5). Suppl. S 373

63. Gennari E, Becherini L, Falchetti A, Masi L, Massart F, Brandi ML. Genetics of osteoporosis: role of steroid hormone receptor gene polymorphisms // J Steroid Biochem Mol Biol. 2002 May;81(l):l-24.

64. Glucocorticoid-induced osteoporosis: guidelines for prevention, and treatment. London: Royal College of Physicians 2002.

65. Glowacki J; Rey C, Glimcher MJ, Cox KA, Lian J A\ role, for. osteocalcin^ in, osteoclast differentiation // J Cell Biochem 1991 45:292-302

66. Gong G. Stern HS. Cheng SC. Fong N. Mordeson J. Deng HW. Recker RR. The association of bone mineral density with vitamin D receptor gene polymorphisms // Osteoporos Int. 1999. V9(l). p55-64

67. Grainge MJ. Coupland CA. Cliffe SJ. Chilvers CE. Hosking DJ Association between a family history of fractures and bone mineral density in early postmenopausal women // Bone. 1999. V24(5). P507-12

68. Grant SF. Reid DM. Blake G. Herd R. Fogelman I. Ralston' SH. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Spl binding site in the collagen type I alpha, i gene // Nat Genet. 1996. V14(2). P203-5

69. Griffiths H.J1. Parantainen H. Olson P. Alcohol and bone disorders // Ale Health & Res World. 1993. V17(4). P.299-304

70. Guo Y-, Xiong D, Zhang L, Tian Q; Liu Y, Deng H. PTH and IL21R may underlie variation, of femoral neck bone mineral density as suggested by a genome-wide association study. J Bone Miner Res.2009;24 (Suppl 1).

71. Gustavsson A, Nordstrom P, Lorentzon R; Lerner UH, Lorentzon M Osteocalcin gene polymorphism is related to bone density in healthy adolescent females. Osteoporos // Int 2000.11:847-851

72. Hampson G. Evans C. Petitt RJ: Evans WD. Woodhead SJ. Peters JR. Ralston SH. Bone mineral density, collagen type 1 alpha 1 genotypes and bone turnover in premenopausal, women with diabetes mellitus // Diabetologia. 1998. V41(ll). P1314-20

73. Han KO. Moon IG. Hwang CS. Choi JT. Yoon HK. Min HK. Han IK. Lack of an intronic Spl binding-site polymorphism at the collagen type I' alphal gene in healthy Korean women // Bone. 1999. V24(2). P135-7

74. Harris SS. Patel MS. Cole DE. Dawson-Hughes B. Associations of the collagen type Ialphal Spl polymorphism with five-year rates of bone loss in older adults // Calcif Tissue Int. 2000. V66(4). P268-71

75. Health care Guideline: diagnosis and treatment of osteoporosis. Institute for clinical systems improvement, www.icsi.org; 2004.

76. Ho Y.V., Briganti E.M:, DuanY\ et al. Polymorphim of the vitamin D receptor gene and.corticosteroid-related osteoporosis // Osteoporos. Int. 1999; 9 (2): 134138.

77. Hoang QQ, Sicheri F, Howard AJ, Yang DS Bone recognition mechanism of porcine osteocalcin from crystal structure // Nature. 2003' Oct 30;425(6961):977-80!

78. Hobson E. Dean V. Grant SFA. Ralston SH. Functional effects of a polymorphism of collagen (I) alpha 1 gene (CollAl) in osteoporosis // J Med Genet. 1998. V35. Suppl. P32

79. Hong X., Hsu Y.H., Terwedow H., Tang G., Liu X., Jiang S., Xu X., Xu X. 2007. Association of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and fracture risk in Chinese postmenopausal women // Bone. 40, 737-742.

80. Houston LA. Grant SF. Reid DM. Ralston SH. Vitamin D receptor polymorphism, bone mineral density, and osteoporotic vertebral fracture: studies in a UK population// Bone. 1996. V18(3). P249-52

81. Hubbard R.B., Smith C.J.P., Smeeth L. et al. Inhaled corticosteroids and hip fracture // Resp.Crit. Care Med. 2002; 166:1563-1566

82. Hustmyer FG. Deluca HF. Peacock M. Apal.Bsml.EcoRV and Taql polymorphisms at human vitamin D receptor gene locus in Caucasians. Blacks and Asians // Hum Mol Genet. 1993. V2. P487

83. Hustmyer FG. Peacock M. Hui S. Johnston CC. Christian J. Bone mineral density in relation to polymorphism at the vitamin D receptor gene locus // J Clin Invest. 1994. V94(5). P2130-4

84. Hustmyer FG. Liu G. Johnston CC. Christian J. Peacock M. Polymorphism at an Spl binding site of COL1A1 and bone 'mineral density in premenopausal female twins and elderly fracture patients // Osteoporos Int. 1999. V9(4). P346-50

85. Ingles S.A., Haile R.W., Henderson B.E. et al., Strength of linkage disequilibrium between two Vitamin D receptor markers in five ethnic groups: implications for association studies // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 6 (1997) 93-98.

86. Jin H, van't Hof RJ, Albagha OM, Ralston SH. Promoter and intron 1 polymorphisms of COL1A1 interact to regulate transcription and susceptibility to osteoporosis Hum Mol Genet. 2009 Aug l;18(15):2729-38. Epub 2009 May 9.

87. Johansson C, Molander U, Milsom I, Ekelund P. Association between urinary incontinence and urinary tract infections, and fractures in postmenopausal women // Maturitas. 1996 Apr;23(3):265-71.

88. Jones G. Nguyen T. Sambrook P. Kelly PJ. Eisman JA. Progressive loss of bone in the femoral neck in elderly people: longitudinal findings from the Dubbo osteoporosis epidemiology study // BMJ. 1994. V309(6956). P691-5

89. Jouanny P.* Guillemin F. Kuntz C. Jeandel C. Pourel J. Environmental and genetic factors affecting bone mass. Similarity of bone density among members, of healthy families // Arthrit Rh. 1995. V38(l). P61-67

90. Kelly PJ. Hopper JI. Hiopopklus DK Genetic factors in bone turnover // J Clin Endocrinol Metab. 1991. V72. P808-13

91. Kim S, Kim S, Rhee Y, Li S, Jahng J & Lim S Lack of association of Cdx polymorphism with bone mineral- density in Korean postmenopausal women // Journal of Bone and Mineral Research 2002 17 (Suppl 1) S324.

92. Kobayashi S. Inoue S. Hosoi T. Ouchi Y. Shiraki M. Orimo H. Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene // J. Bone Miner. Res. 1996.- Vll. P306-311

93. Kolchinsky A, Mirzabekov A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based cliips // Hum Mutat. 2002 Apr;19(4):343-60.

94. Kotowicz MA. Pasco JA et al Vitamin D receptor start codon polymorphism is \ not associated with bone mineral density in australian women // Bone. 1998.V23(5). Suppl. S 372

95. Landi S, Gemignani F, Gioia-Patricola L, Chabrier A, Canzian F. Evaluation of a microarray for genotyping polymorphisms related to xenobiotic metabolism and1 DNA repair //Biotechniques. 2003 0ct;35(4):816-20, 822, 824-7.

96. Lane N.E., Yao W. 2009. Developments in the scientific understanding of osteoporosis // Arthritis Res. Ther. 11, 228.

97. Langdahl BL. Ralston SH. Grant' SF. Eriksen EF. An Spl binding site polymorphism in the COLIA1 gene predicts osteoporotic fractures in both men and women // J Bone Miner Res. 1998. V13(9). P1384-9.

98. Langdahl BL. Gravholt CH. Brixen K. Eriksen EF. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and bone mass, bone turnover and,osteoporotic fractures // Eur J Clin-Invest. 2000. V30(7). P608-17

99. Lau J. Ioannidis JP. Schmid CH. Quantitative synthesis in systematic reviews // Ann Intern Med. 1997. V127(9). P820-6

100. Le Blanc A. Schneider V. Krebs J. Spinal bone mineral after five weeks of bed rest // Calc Tiss Int. 1987. V41. P259

101. Lei SF, Jiang H, Deng FY, Deng HW. Searching for genes underlying susceptibility to osteoporotic fracture: current progress. and future prospect. Osteoporos Int. 2007 Sep;18(9):1157-75

102. Lei SF, Zhang YY, Deng FY, Liu MY, Liu XH; Zhou XG, Deng HW. Bone mineral density and five prominent candidate genes in Chinese men: associations, interaction effects and their implications // Maturitas. 2005 Jun 16;51(2):199-206

103. Lewis S.J., Ebrahim S., Davey Smith G. 2005. Meta-analysis of MTHFR 677G->T polymorphism and coronary heart disease: Does totality of evidence support causal role for homocysteine and preventive potential of folate? // B. M. J. 331,1053.

104. Li Y., Xu L., Shen L., Chen L. Relationship between glucocorticoid-induced osteoporosis and vitamin D receptor genotypes // JiHuazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2002; 22 (4): 317-323.

105. Liden M>. Wilen B. Ljunghall S. Melhus H. Polymorphism at the Sp l binding site in the collagen type I alpha. 1 gene does not predict bone mineral density in postmenopausal women in Sweden // Calcif Tissue Int. 1998. V63(4). P293-5

106. Lieber C.S. AlcohoL and nutrition. An overview // Ale Health & Res World. 1989. V13(3). P197205

107. Liljedahl U, Karlsson J, Melhus H, Kurland L, Lindersson M, Kahan T, Nystrom F, Lind L, Syvanen AC. A microarray minisequencing system for pharmacogenetic profiling of antihypertensive drug response // Pharmacogenetics. 2003 Jan;13(l):7-17.

108. Lim SK, Park YS, Park JM, Song YD, Lee EJ, Kim KR, Lee HC, Huh KB. Lack of association1 between vitamin D receptor genotypes and osteoporosis in Koreans // J Clin Endocrinol'Metab. 1995 Dec;80(12):3677-81.

109. Ling X, Cummings SR, Mingwei Q, Xihe Z, Xioashu C, Nevitt M, Stone K. Vertebral fractures in Beijing, China: the Beijing Osteoporosis Project // J Bone Miner Res. 2000 Qct;15(10):2019-25. , .

110. Long JR, Liu PY, Lu Y, Dvornyk V, Xiong DH, Zhao LJ, Deng HW. Tests of linkage and/or association of TGF-betal and COL1A1 genes with bone mass // Osteoporos Int. 2005 Jan;16(l):86-92. Epub 2004 May 26.

111. MacDonald, HM; McGuigan FA. New SA. Campbell MK. Golden MH. Ralston SH. Reid DM. COLI AI Spl polymorphism predicts perimenopausal and early postmenopausal spinal bone loss // J Bone Miner Res. 2001. V16(9). P1634-41

112. Mann V. Hobson« EE. Li B: Stewart TL. Grant SF. Robins SP: Aspden RM. Ralston SH. A COL1A1 Spl' binding site polymorphism predisposes to osteoporotic fracture by affecting „bone density and quality // J Clin Invest. 2001. V107(7). P899-907

113. Mann V. and Ralston S.H. Meta-analysis of COL1A1 Spl polymorphism in relation to bone mineral density and osteoporotic fracture // Bone 32 (2003) 711717

114. Marc J. Prezelj J. Komel R. Kocijancic A. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with bone mineral density in Slovenian postmenopausal women // Gynecol Endocrinol. 2000. V14(l). P60-4.

115. Matkovic V. Nutrition genetics and skeletal development // J Am Coll Nutr. 1996. V(156). P556-569

116. McGuigan FE. Reid DM; Ralston SH. Susceptibility to osteoporotic fracture is determined by allelic variation at the Spl site, rather than other polymorphic sites at the COL1A1 locus // Ostcoporos Int. 2000. VI 1(4). P338-43

117. Melton LJ. Epidemiology of spinal osteoporosis // Spine. 1997. V22(24). Suppl. 2S-11S

118. Melton LJ, Johnell O, Lau E, Mautalen CA, Seeman E. Osteoporosis and the global competition for health care resources // J Bone Miner Res. 2004 Jul;19(7):l055-8. Epub 2004 Mar 22.

119. Minamitani K. Takahashi Y. Minagawa Mi Exon 2 polymorphism in the human vitamin D receptor gene is a predictor of peak BMD // J Bone Miner Res. 1996. Vll. Suppl. S207

120. Miyamoto K. Kesterson R. A. Yamamoto H. Taketani Y. Nishiwaki E. Tatsumi S. Inoue Y. Morita K. Takeda E. Pike J. W. Structural organization of the human vitamin D receptor chromosomal gene and its promoter // Molec. Endocr. 1997. Vll. P1165-1179

121. Morrison NA. Qi JC. Tokita A. Kelly PJ. Prediction1 of bone density from vitamin D'receptor alleles // Nature. 1994. V367. P284-287

122. Nakajima T. Ota N. Shirai Y. Hata A. Yoshida H. Suzuki T. Hosoi T. Orimo H. Emi M. Ethnic difference in contribution of Spl site variation of COLIA1 gene in>genetic predisposition to osteoporosis // Calcif Tissue Int. 1999. V65(5). P352-3

123. Nakamura M! Hashimoto T. Nakajiama- T. Ichii. S. Furuyama J. Ishibara Y. Kakudo K A^ new type of human calcitonin receptor- isoform generated by alternative splicing // Biochem Biophys Res Commun. 1995. V209. P744-751.

124. Nakamura- Mi Zhang ZQ. Shan- L. Hisa T. Sasaki M. Tsukino R. Yokoi T. Kaname A. Kakudo K. Allelic variants of human calcitonin, receptor in the Japanese population // Hum Genet. 1997. V99(l). P38-41

125. Nakamura M. Morimoto S. Zhang Z. Utsunomiya H; Inagami T. Ogihara T. Kakudo K. Calcitonin, receptor gene polymorphism in japanese women: correlation with body mass and bone mineral density // Calcif Tissue Int. 2001. V68(4). P211-5

126. Nakashima.K., Zhou X., Kunkel G., Zhang Z., Deng J.M., Behringer R.R., de Crombrugghe B. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation // Cell 2002;108:17-29.

127. Nelson M.E. Fiatarone M.A. Effects of high-intensity strength training on multiple risk factors for osteoporotic fractures // JAMA. 1994. V272(24). P1909-1914

128. Niu T. Xu X. Candidate genes for osteoporosis. Therapeutic implications // Am J Pharmacogenomics. 2001. Vl(l). Pll-9

129. Nuytinck L. Sitki Sayli B. Wettinck K. De Paepe A. Prenatal diagnosis of osteogenesis imperfecta type 1 by COL1A1 null-allele testing // Prenat Diagn. 1999. V19. P873-75

130. Obermayer-Pietsch BM, Friihauf GE, Lipp RW, Sendlhofer G, Pieber TR. Dissociation of lepthr and body weight in hyperthyroid patients after radioiodine treatment // Int J Obes Relat Metab Disord. 2001 Jan;25(l):115-20.

131. Orwoll ES. Bauer DC. Vogt TM. Fox KM: Axial bone mass in older women. Study of Osteoporotic Fractures Research Group //Ann-Intern Med. 1996. V124(2). P187-96

132. Ozono K. Liao Jl Kerner SA. Scott RA. Pike JW The vitamin D responsive element in the human osteocalcin gene. Association with a nuclear proto-oncogene enhencer// J'Biol. Chem. 1990. V265(35). P21881-8

133. Palomba S, Numis FG, Mossetti G,' Rendina D, Vuotto P, Russo T, Zullo F, Nappi O, Nunziata V Raloxifene administration in postmenopausal women with osteoporosis: effect of different BsmI vitamin D receptor genotypes. Hum Reprod 2003b 4:1-7

134. Parazzini F, Bidoli E, Franceschi S, Schinella D, Tesio F, La Vecchia C, Zecchin R Menopause, menstrual and reproductive history, and bone density in northern Italy // J Epidemiol Community Health. 1996 Qct;50(5):519-23.

135. Ralston SH. The genetics of osteoporosis // Bone. 1999. V25(l). P85-6

136. Ralston SH. Genetic control of susceptibility to osteoporosis // J Clin Endocrinol Metab. 2002. V87(6). P2460-6

137. Ray NF. Chan- JK. Thamer M. Melton LJ. Medical expenditures for the treatment of osteopporotic fractures in the US in 1995: Report from the National Osteoporosis Foundation // J Bone Miner Res. 1997. V12(l). P24-35

138. Recker RR. Deng HW. Role of genetics in osteoporosis // Endocrine. 2002. V17(l). P55-66

139. Rosen CJ. Beyond'one gene-one disease: Alternative strategies for deciphering genetic determinants of osteoporosis // Calcif Tissue Int. 1997. V60(3). P225-28

140. Sainz J5. Van Tornout JM'. Sayre J. Kaufman F. Gilsanz V. Association of' collagen type 1 alphal gene polymorphism with bone density in early childhood // J Clin Endocrinol Metab. 1999. V84(3). P853-5

141. Sambrook P. Birmingham J! Kempler S. Kelly P. Eberl S. Pocock N. Yeates M. Eisman J. Corticosteroid effects on proximal femur bone loss // J Bone Miner Res. 1990. V5(12). P1211-6

142. Sambrook PN. Kelly PJ'. Morrison NA. Eisman JA. Genetics of osteoporosis // Br J Rheumatol. 1994. V33(ll). P1007-11

143. Schneider V. McDonald" J. Skeletal calcium homeostasis and countermeasures to prevent disuse osteoporosis // Calcif Tiss Int. 1984. V36. P151

144. Schwahn B, Rozen R. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences // Am J Pharmacogenomics. 2001;1(3):189-201

145. Seeman E. Hopper JL. Bach LA. Cooper ME. Parkinson E. McKay J. Jerums G. Reduced bone mass in daughters of women with, osteoporosis // N Engl J Med. 1989. V320(9). P554-8

146. Simsek M, Getin ZvBilgen T, Taskin O; Luleci Gj Keser L Effects ofehormone. replacement therapy on bone mineral density in Turkish patients with or without COL1A1 Spl binding site polymorphism // J Obstet Gynaecol1 Res. 2008 Feb;34(l):73-7. . ; '

147. Schwahn B., Rozen; R. Polymorphisms in? the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences // Am. JL Pharmacogenomics., 2001, 1, 189-201.

148. Slemenda CWt ChristianvJC^HuiiS^ Fitzgerald Ji Johnston CC. Jr. No evidence for an effect of lactase deficiency on bone mass in pre- or postmenopausal women; //J Bone Miner Res. 1991. V6(12). P1367-71

149. Slemenda CW. Johnston CC. High intensity activities in.young women: site specific bone mass effects among female figure skaters // Ji Bone Miner-. Res: 1993. V20(2). P125-32

150. Slemenda CW. Longcope C. Zhou L. Hui SL. Peacock M: Johnston CC. Sex steroids and bone mass in older men: Positive associations with serum?estrogens and negative associations with androgens // JiClinThvest. 1997. V100(7). P1755-9

151. Sowers M,. Willing M, Burns. T, Deschenes S, Hollis B, Crutchfield M, Jannausch M Genetic markers, bone mineral density, and serum osteocalcin levels //J Bone Miner Res 1999 14:1411-1419

152. Spotila LD. Colige A. Sereda L. constantinou-Deltas CD. Whyte MP Mutation analysis of coding sequences for type I procollagen in individuals with low bone density // J. Bone Miner. Res. 1994. V9. P923-932

153. Spotila LD. Caminis J. Johnston R. Shimoya KS. O'Connor MP. Prockop DJ. Tenenhouse A. Tenenhouse HS. Vitamin D receptor genotype is not associated with bone mineral density in three ethnic/regional groups // Calcif Tissue Int. 1996. V59. P235-237

154. Sugiyama T, Kawai S Carboxylation of osteocalcin may be related to bone quality: a possible mechanism of bone fracture prevention'by vitamin K. J Bone Miner Metab 2001, 3:146-149

155. Suissa S., Baltzan M., Kremer R., Ernst P. Inhaled and nasal corticosteroid use and the risk of fracture // Am.J.Respir.Crit.Care.Med. 2004; 169 (1): 83-88.

156. Tobias S. The role of vitamin D receptor gene in the pathogenesis of osteoporosis // Clin. Lab. 1997. V43. P137-140

157. Toroptsova NV, Benevolenskaya LI, Karyakin AN, Sergeev IL, Erdesz S. "Gross-sectional." study of low back pain among workers at an industrial enterprise in Russia // Spine (Phila Pa 1976)^ 1995'Feb l;20(3):328-32l

158. Tsai:KS* Hsu SH|. Cheng WC, Chen*CK, Ghieng PU, Pan WH: Bone mineral density and:bonc markers in:relation to vitamin D receptor gene polymorphisms in Chinese men and women // Bone. 1996 Nov;19(5):513-8.

159. Uitterlinden AG, Fang Y, Bergink AP,.van Meurs JBJ van Leeuwen HP, Pols HA. The role of vitamin D receptor gene polymorphisms in bone biology // Mol Cell Endocrinol. 2002 Nov 29;197(l-2): 15-21.

160. Uitterlinden AG, van Meurs JB, Rivadeneira F, Pols HA. Identifying genetic risk factors for osteoporosis // J Musculoskelet Neuronal Interact. 2006 Jan-Mar;6(l): 16-26.

161. Weel A.E.A.M. Colin E.M- et al. Vitamin D receptor alleles are associated with the rate of bone turnover- only in women with low bone mineral density // Bone. 1998. V23(5). Suppl. S372

162. Weichetova M. Stepan JJ. Michalska D. Haas T. Pols HA. Uitterlinden AG. COL1A1 polymorphism contributes to bone mineral density to assess prevalent wrist fractures // Bone. 2000. V26(3). P287-90

163. Wen SY, Zhang CT. Identification of isochore boundaries in the human genome using the technique of wavelet multiresolution analysis // Biochem Biophys Res Commun: 2003 Nov 7;311(l):215-22.

164. Wen-Feng L., Shu-Xun H., Bin Y., Meng-MengL., Claude F., Jian-Min C. Genetics of osteoporosis: accelerating pace in gene identification and validation // Hum-Genet., 2010,127:249-285

165. WHO Study Group. Assessment of fracture risk and its application to posmenopausal osteoporosis // World Health Organization technical Report Series № 843. 1994

166. Willing MC. Deschenes SP. Slayton RL. Roberts EJ Premature chain termination is a unifying mechanism for COL1A1 Null alleles in Osteogenesis Imperfecta type I cell,strains // Am J Hum Genet. 1996: V59. P799-809*

167. Willing MC. Tomer JC. Burns TL. Segar ET. Werner JR. Determinants of bone mineral density in postmenopausal-white Iowans // J'Gerontol* A* Biol Sci Med Sci. 1997. V52(6). P337-42'

168. Wolffe A.P. Architectural transcription factors // Science 1994;264:1100-1101

169. Wong C. Walsh L. Smith C. Wisniewski A' Inhaled corticosteroid use bone-mineral desity in patients with,asthma // The Lancet. 2000. V355. P1399-403

170. Wood RJ. Fleet JC. The genetics of osteoporosis: vitamin' D receptor polymorphisms // Annu Rev Nutr. 1998. V18. P233-58

171. Yamada Y., Ando F., Niino N., Shimokata Hi Association of a -1997G-»T polymorphism- of the collagen Ialphal gene with- bone mineral, density in-postmenopausal Japanese women // Hum. Biol. 2005;77:27-36.

172. Yazdanpanah N., Zillikens M.C., Rivadeneira F., de Jong R., Lindemans J., Uitterlinden A.G., Pols H.A., van Meurs J.B. Effect of dietary B vitamins on BMD and risk of fracture in elderly men and women: The Rotterdam study // Bone. 2007, 41, 987-994.

173. Ye W.Z., Reis A.F., Velho G., Identification of a novel Tru9 polymorphism in the human Vitamin D receptor gene // J. Hum. Genet. 45 (2000) 56-57.

174. Yeap SS. Beaumont M. Bennett A. Keating N.A. White D.A. Genetic and environmental factors affecting bone mineral density in large families // Postgrad Med J. 1998. V74. P872

175. Zmuda JM. Cauley JA. Danielson ME. Wolf RL. Ferrell RE. Vitamin D receptor gene polymorphisms, bone turnover, and rates of bone loss in older African-American women // J Bone Miner Res. 1997. V12(9). P1446-52