Молекулярно-генетические основы метаболических остеопатий

Хусаинова, Рита Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические основы метаболических остеопатий
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические основы метаболических остеопатий"

На правах рукописи

ХУСАИНОВА РИТА ИГОРЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ОСТЕОПАТИЙ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

11 МАР 2015

005560326

Уфа-2015

005560326

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ижевская Вера Леонидовна Доктор медицинских наук, профессор

Носиков Валерий Вячеславович Доктор биологических наук, профессор

Жукова Ольга Владимировна Доктор биологических наук, доцент

Доктор биологических наук, профессор, зав. Отделом геномики ИБГ УНЦ РАН Хуснутдинова Эльза Камилевна

ФГБУ Медико-генетический научный цен Российской академии медицинских наук, заместитель директора по научной работе

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», зав. лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии

ФГБУН Институт общей генетики им. Н. Вавилова РАН, зав. лабораторией генети человека

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится заседании Диссертационного государственном бюджетном

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университе им И.М. Сеченова Минздрава России РФ

« С'1 » апреля 2015 г. Д 002.133.01

науки Институте

в « часов на при Федеральном

совета

учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться на сайте ИБГ УНЦ РАН (ibg.anrb.ru/dissov.html) и в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, просп. Октября, д. 71), е-таП: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан 2015

г.

Ученый секретарь диссертационного к.б.н

совета,

С.М. Бнкбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Метаболические остеопатии - заболевания скелета, общим признаком которых является нарушение метаболизма костной ткани, приводящее к снижению плотности и прочности кости с последующим увеличением риска возникновения переломов. Разновидностью метаболических остеопатии являются остеопороз (ОП) и незавершенный остеогенез (НО).

Остеопороз (МКБ-10 - М80-М85) является причиной более 8,9 млн. переломов ежегодно во всем мире и занимает значимое место среди заболеваний с высокой инвалндизацней и смертностью, характеризуется низкой минеральной плотностью (МПКТ) и микроархнтектурными нарушениями костной ткани, которые совместно значительно увеличивают риск переломов (NIH Consensus Development Panel on Osteoporosis Prevention, Diagnosis and Therapy, 2001; Gass and Dawson-Hughes, 2006; Tosteson et al., 2007; Siris et al., 2012, 2014). Распространенность остеопороза широко варьирует, достигая 5-10-кратных различий между географическими регионами. Причина такой вариабельности до конца не ясна и может частично объясняться наследственным характером величины скелета и региональными особенностями рациона питания и физической активности. По результатам близнецовых и семейных исследований показано, что до 80% вариабельности МПКТ обусловлено генетическими факторами (Pocock et al., 1987, Nguyen et al., 1998). В развитии остеопоретических переломов в целом на долю генетических факторов приходится около 25%, их наследуемость зависит от возраста, вклад генетической компоненты в патогенез перелома менее выражен у пожилых людей (Michaelsson et al., 2005; Ralston and Uitterlinden, 2010). Несмотря на то, что риск переломов повышен при низком уровне МПКТ (высокая специфичность), нормальный уровень МПКТ не является фактором пониженного риска переломов (низкая чувствительность), ряд исследователей предполагают, что многочисленные гены оказывают влияние на предрасположенность к переломам независимо от показателей МПКТ (Andrew et al., 2005; Ralston and Uitterlinden, 2010).

В последнее десятилетие, благодаря достижениям в области геномных технологий, достигнут значительный прогресс в выявлении генетических основ метаболических остсопатий в целом, и остеопороза, в частности. Проведен ряд полногеномных исследований ассоциаций (GWAS) сотен тысяч однонуклеотидных полиморфных вариантов (ОНП) с уровнем МПКТ и переломами и выявлены более 60 локусов, ассоциированных с фенотипами остеопороза (Kiel et al., 2007; Richards et al., 2008; Styrkarsdottir et al., 2008, 2009; Timpson et al., 2009; Xiong et al., 2009; Cho et al., 2009; Rivadeneira et al., 2009; Guo et al., 2010; Tan et al., 2010; Koller et al., 2010; Paternoster et al., 2010; Hsu et al., 2010; Kung et al., 2010; Duncan et al., 2011; Kou et al.,

2011; Estrada et al., 2012; Zhang et al., 2013). До эпохи GWAS генетика остеопороза была ограничена в рамках очень большого количества исследований "анализ сцепления" и "поиск ассоциаций с кандидатными генами". В ретроспективе, с некоторыми исключениями, большинство из них были небольшими исследованиями с недостаточной мощностью, зачастую с получением спорных и невоспроизводимых результатов. Сейчас с помощью GWAS подхода можно свободно, без ограничений исследовать различные гипотезы. На современном этапе одной из важнейших задач идентификации генетических факторов остеопороза является репликация результатов GWAS-исследований в различных популяциях, позволяющая выявить как общие закономерности, так и этноспецифичные маркеры заболевания.

В последнее время большое внимание уделяется наследственным изменениям в экспрессии генов без первичного изменения ДНК, названными эпигенетическими факторами (Holroyd et al., 2012). Особый интерес вызывает изучение роли микроРНК, регулирующих посттранскрипционную экспрессию генов путем связывания с таргетными мРНК в сайтах, преимущественно расположенных в их З'-области. Полиморфизм сайтов связывания микроРНК может менять сродство микроРНК и мРНК и приводить к развитию фенотипических изменений и патологических состояний (Lei et al., 2011; Taipaleenmaki et al., 2013; van Wijnen et al., 2013). Углубленное понимание роли этих регуляторных РНК в остеогенезе и ремоделировании костной ткани может иметь большое значение для разработки новых методов диагностики и лечения заболеваний скелета.

Незавершенный остеогенез (НО) (МКБ-10 - Q78.0), известный также как синдром голубых склер или несовершенный остеогенез, - клинически и генетически гетерогенное наследственное заболевание, встречающееся с частотой от 1:10000 до 1:30000 новорожденных в различных странах мира, приводящее к инвалидизации с детского возраста из-за многочисленных переломов. На сегодняшний день идентифицировано 16 генов, ответственных за развитие 14 типов НО (Cheung et al., 2008; Bodian et al., 2009; Balasubramanian et al, 2013; Caparros-Martin et al., 2013) и продолжается поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания. У больных НО обнаружены мутации в генах, кодирующих белки коллагена 1 типа (COL1A1, COL1A2) (Stephen et al., 2014), пролил-3 пщроксилазы 1 (LEPRE1), хрящ-ассоциированного белка (CRTAP) и пептидил-прэлил цис-транс изомеразы В (PPIB) (Vranka et al., 2004; Baldridge et al., 2008), молекулярного шаперона проколлагена 1 FKBP65 (FKBP10) (Barnes et al., 2012), ингибиторов серпинпептидаз HI и F1 (SERPINH1 и SERPIF1) (Becker et al., 2011), костного морфогенетического белка 1 (BMP]) (Asharani et al., 2012), кость-сопряженного IFITM-подобного белка BRIL (IFITM5), трансмембранного белка 38В, вовлеченного в регулирование уровня

внутриклеточного кальция (ТМЕМ38В) (Cho et al., 2012), сигнальной молекулы WNT1, необходимой для функционирования остеобластов и развития костей (WNT1) (Fahiminiya et al.. 2013), транскрипционных факторов, регулирующих днфференцировку костных клеток (SP7) н экспрессию проколлагена 1 типа (CREB3L1) (Caparros-Martin et al., 2013). Гены PLOD2 и PLS3, кодирующие лнзилглдроксилазу и пластин 3, соответственно, идентифицированы недавно, молекулярный механизм, обусловливающий развитие НО, до конца не выяснен (van Dijk et al., 2013; Symoens et al., 2013).

Большинство обнаруженных мутаций в генах, обусловливающих НО, как правило, являются уникальными для каждой семьи, их профили не ограничиваются специфическими регионами генов, а разбросаны по всем структурным областям и характеризуются большим разнообразием. Показано, что существуют мутации, характерные только для отдельных популяций (Ries-Levavi et al., 2004; Lee et al, 2006; Liu et al., 2007; Kataoka et al, 2007; Witecka et al., 2008; Swinnen et al., 2009).

Таким образом, генетическая архитектура метаболических остеопатии представляет собой сложную систему, в которой редкие генетические варианты со значительным эффектом приводят к развитию моногенных форм, таких как незавершенный остеогенез, частые варианты имеют небольшой эффект в патогенезе многофакторных форм и необходимо выявить большое количество генетических маркеров для прогнозирования риска развития заболевания. Областью активных исследований на современном этапе является поиск неизвестных вариантов генов с умеренным эффектом, предрасполагающих к развитию метаболических остеопатии.

В России изучение молекулярно-генетических основ метаболических остеопатий развито недостаточно и носит фрагментарный характер. Несколькими группами исследователей проведено изучение небольшого числа кандидатных генов в малочисленных выборках с различными формами остеопороза (Баранов с соавт., 2000, 2009; Москаленко с совт., 2004, 2005; Тагиева с соавт., 2005; Мякоткин с соавт., 2011). Исследование незавершенного (несовершенного) остеогенеза, в основном, сосредоточено на клшшко-генстичсских аспектах заболевания (Хлусов с соавт., 2010; Кадурина, 2010; Ельчннова с соавт., 2014).

Несмотря на значительные достижения в понимании механизмов костного метаболизма, проблема генетической предрасположенности к переломам чрезвычайно актуальна и еще далека от разрешения. Существование моногенных и многофакторных форм метаболических остеопатии свидетельствует о важной роли генетической составляющей в их патогенезе, а наличие противоречивых результатов обуславливает необходимость дальнейшего всестороннего изучения генетических основ данных заболеваний с учетом этнических факторов, оптимальных для

конкретных регионов, что позволит разработать эффективные методы их диагностики, лечения и профилактики. В связи с вышесказанным были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: Оценка роли генов, вовлеченных в остеогенез и костное ремоделирование, в развитии незавершенного остеогенеза и постменопаузалыюго остеопороза в Волго-Уральском регионе России.

Задачи исследования:

1. Поиск структурных изменений в генах COLI AI, COL1A2, LEPRE1, PPIB1, CRTAP, SERPINF] у больных незавершенным остеогенезом.

2. Анализ гено-фенотипических корреляций идентифицированных мутаций с формой заболевания и типом наследования, поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов COL1A1, COL1A2, LEPRE1, PPIB1, CRTAP, SERPINF1 с риском развития переломов.

3. Поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов остеопороза с переломами, уровнем минеральной плотности костной ткани у женщин русской и татарской этнической принадлежности.

4. Репликативное исследование локусов, ассоциированных с переломами и уровнем МПКТ по данным полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), в выборке женщин из Волго-Уральского региона.

5. Поиск ассоциаций изученных кандидатных локусов остеопороза с переломами различных отделов скелета у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона.

6. Анализ вариабельности уровня минеральной плотности костной ткани шейки бедра и поясничных позвонков в зависимости от генотипов исследованных кандидатных локусов остеопороза.

7. Исследование полиморфизма сайтов связывания микроРНК и поиск ассоциаций с остеопоретическими переломами н уровнем минеральной плотности костной ткани у женщин русской и татарской этнической принадлежности.

8. Мета-анализ результатов исследования ассоциаций полиморфных вариантов кандидатных локусов остеопороза с развитием переломов у женщин татарской и русской этнической принадлежности.

9. Поиск прогностических моделей формирования остеопоретических переломов у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона.

Положения, выносимые на защиту

1. В 28,57% семьях больных незавершенным остеогенезом из Республики Башкортостан идентифицировано 11 мутаций в генах COLI AI, LEPRE1, CRTAP и SERPINF1. Мутации c.967G>T (p.Gly323X) и c.3540_3541insC (p.Glyll81AlafsX293) в

гене COLI Al, c,1724+4G>A в гене LEPRE1, с.641Т>С (p.Val214Ala) в гене CRTAP, c.9]3C>G (p.Leu305Val) в гене SERPINFl описаны впервые.

2. В генах COLI Al, COL1A2, LEPRE 1, PP1B1, CRTAP, SERPINFl идентифицировано 37 полиморфных вариантов, аллель *G локуса rs17639446 и гаплотип *T*Dcl локусов rsl800012 и rs2412298 гена COL1A1 ассоциированы с развитием переломов у больных незавершенным остеогенезом. Варианты с.544-24С> Т и c.957+10insA в гене COL1A1, c.l 153-78G>A в гене CR ТАР описаны впервые и являются уникальными.

3. Низкий уровень МПКТ ассоциирован с полиморфными вариантами генов COLI Al, TNFRSF1 IB, PTH, SÖST, RPS6KA5, KIAA2018, SOX9 в общей выборке женщин, COLI Al, TNFRSF1 IB, SÖST, RPS6KA5, SOX9, MAGE A4, FAM9B y женщин русской этнической принадлежности, CYP19A1, TNFRSF1 IB, PLVAP, CBR3, MAGEE2, DNM, PKI A, RTDR1, BCL11A y женщин татарской этнической принадлежности.

4. На вариабельность уровня МПКТ шейки бедра оказывают влияние полиморфные варианты генов VDR, CALCA, CaSR, C12orß3, локусы rsl878526 (2ql4.2), rs6830890 (4q25), rs49S7742 (5q21.3), поясничных позвонков - PTH, SP7 и локусы rs4233949 (2pl6.2), rs7427438 (3p24.1), rs7326472 (13ql4.ll).

5. Развитие переломов в общей выборке женщин из ВУР ассоциировано с полиморфными вариантами генов TNFRSR11B, ZNF239, Сбог/97, DCDC5, С17офЗ, PKIA и локусом rs5926033 (Хр22.11), у женщин русской этнической принадлежности - VDR, DBP, TPD52, ZNF239, CDK15. EFNA5. МАРТ, RTDR1, UBE4B и локусами rs17284960 (5q34) и rs11788458 (9q31.3), у женщин татарской этнической принадлежности - TNFRSR11B, ESR1, CALCA, FGF2, ZNF239. FU11506, FBX05, TPD52, STARD3NL, SALL1, CYP19A1, SP7, ABCF2.

6. Полиморфные варианты генов VDR (rs2228570), TNFRSF11B (rs3102734), DCDCS (rsl63879) и локус rs5926033 (Xp22.ll) ассоциированы с остеопоретическими переломами по данным мета-анализа у женщин постменопаузального возраста татарской и русской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона. Выявлены этноспецифичные маркеры (rs3134069 (TNFRSF11 В), rsl0793442 (ZNF239)) риска развития переломов у женщин татарского происхождения.

7. Переломы позвонков и бедра ассоциированы с полиморфными вариантами генов CALCR, FGF2, PLEKHG1, ESR1, LRP5, FOXL1, переломы позвонков - C12oif23, RSP03, JAG1, переломы бедра - IFLTD1, L1N7C, ALK, C6orJ97, переломы лучевой кости - AX1N1, DCDC5, SALL1, WLS, PKIA, COL1A1 и rs5926033 (Хр22.31), любые другие переломы - SMG6, DUSP21, ZNF239

8. Прогностические модели риска на основе полиморфных вариантов rs4869742 (C6orß>7), rs3736228 (LRP5) и индекса массы тела предсказывают переломы бедра с

вероятностью 74,1%; rs3134069 (OPG), rs4869742 (С6оф>7), rsl0048146 (FOXL1) и возраст - переломы позвонков (74,6%); rs3134069 (OPG), rs4869742 (C6orß7) и уровень МП KT шейки бедра - переломы в целом.

Научная новизна исследования. Впервые проведено молекулярно-генетическое изучение двух заболеваний, относящихся к метаболическим остеопатиям: моногенной - незавершенного остеогенеза и многофакторной -постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе России. Выявлен спектр и частота мутаций в генах COL1A1, LEPRE1, CRTAP и SERPINF1 у больных незавершенным остеогенезом из Республики Башкортостан и разработаны подходы к ДНК-диагностике заболевания. Впервые идентифицированы мутации c.967G>T (p.Gly323X) и с.3540 3541ins С (p.Glyl 181AlafsX293) в гене COLI AI, c,1724+4G>A в гене LEPRE1, с.641Т>С (p.Va!2I4Ala) в гене CRTAP, C.9130G (p.Leu305Val) в гене SERP1NF1 у больных незавершенным остеогенезом из РБ.

Впервые проведено репликативное исследование локусов, ассоциированных с переломами и уровнем МПКТ по данным полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), включая исследования генетических и эпигенетических факторов (полиморфизм сайтов связывания микроРНК), в выборке женщин из Волго-Уральского региона. Установлена ассоциация низкого уровня МПКТ с полиморфными вариантами генов COL1A1, TNFRSF11B, РТН, SÖST, RPS6KA5, К1АА2018, SOX9, MAGEA4, FAM9B, CYP19A1, PL FAP, CBR3, MAGEE2, DNM, PK1A, RTDR1, BCLI1A у женщин из Волго-Уральского региона.

Впервые на основе мета-анализа установлена ассоциация локусов rs2228570 (VDR), rs 3102734 (TNFRSF11B), rs5926033 (Xp22.11), rsl63879 (DCDC5) с остеопоретическими переломами у женщин постменопаузального возраста татарской и русской этнической принадлежности и выявлены этноспецифичные маркеры (rs3134069 (TNFRSF11B), rsl0793442 (ZNF239)) риска переломов у женщин татарского происхождения.

Выявлены генетические маркеры, как общие для двух эндофенотнпов остеопороза, так и специфические для переломов и низкого уровня МПКТ, а также генетические факторы, определяющие вариабельность уровня МПКТ поясничных позвонков и шейки бедра и формирующие переломы различных отделов скелета.

Научно-практическая значимость. На основе проведенных исследований разработаны подходы к ДНК-диагностике незавершенного остеогенеза и прогностические модели формирования остеопоретических переломов у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона. Разработан и зарегистрирован патент на изобретение №2526189 «Способ прогнозирования риска возникновения переломов» от 25 июня 2014 г. Молекулярно-генетический анализ

незавершенного остеогенеза внедрен в практику медико-генетического консультирования Республиканского перинатального центра Республики Башкортостан. Полученные результаты представляют ценную информацию о генетической архитектуре метаболических остеопатнй, имеющую важное медицинское и социальное значение для повышения эффективности медико-генетического консультирования семей с наследственными и многофакторными формами заболеваний костного метаболизма в регионе с этнически подразделенной структурой населения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на таких научных форумах как: конференция Европейского общества генетиков человека (Прага, 2005, Амстердам, 2006, Ницца, 2007, Барселона, 2008, Вена, 2009, Гетеборг, 2010, Амстердам, 2011, Нюрнберг, 2012, Париж, 2013), международный конгресс по генетике человека (Монпелье, 2010, Дубай, 2011), школа-семинар по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007, 2011), научно-образовательная конференция "Современные проблемы травматологии и ортопедии" (Дубна, 2007), международный конгресс по остеопорозу (Бангкок, 2008), Европейский симпозиум кальцифицированных тканей (Барселона, 2008), Российский конгресс по остеопорозу (Ярославль, 2005, Екатеринбург, 2008, Санкт-Перербург, 2010), Съезд российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конференция Европейского общества кальцифицированных тканей и международного общества исследователей костной ткани (Афины, 2011), ежегодная конференция Американского общества исследователей костной ткани (Сан Диего, 2011), 11-я международная конференция по незавершенному остеогенезу (Дубровник, 2011), II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториалыюй патологии» (Курск, 2011), Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотсхпологий» (Санкт-Петербург, 2012), конференция ВОГИС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013), V Российский конгресс по остеопорозу и другим метаболическим заболеваниям скелета (Москва, 2013), IV международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 70 работ, в том числе 30 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 2 главы в коллективной монографин, 1 патент на изобретение.

Личный вклад. Все результаты, представленные в работе, получены при непосредственном участии автора, начиная с этапа планирования, разработки

методических подходов и их выполнения, сбора первичных данных, создания банка ДНК больных незавершенным остеогенезом, остеопорозом и контрольных групп сравнения, проведения экспериментальных исследований, статистического анализа полученных данных, обобщения и апробации полученных результатов на конференциях различного уровня, а также написания и оформления статей в научные журналы и рукописей диссертации и автореферата.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 489 страницах машинописного текста, состоит из трех глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 633 источника, приложения. Работа иллюстрирована 124 таблицами и 46 рисунками.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность за помощь в сборе материала для исследований д.м.н., профессору Лесняк Ольге Михайловне и сотрудникам кафедры семенной медицины Уральской государственной медицинской академии (г. Екатеринбург), к.м.н. Нурлыгаянову Радику Зуфаровичу (Уфимская городская клиническая больница №21), к.м.н. Фазлыевой Эльзе Ахметовне (женская консультация №5 г. Уфы), к.м.н. Мардановой Альбине Кадимовне и сотрудникам медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра РБ, а также сотрудникам лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН за помощь в проведении экспериментов и обработке результатов исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. В качестве материала были использованы образцы ДНК 45 больных незавершенным остеогенезом, состоящих на учете в медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ из 35 семей (42,4% татарских, 33,3% русских, 12,1% башкирских, 3,1% марийских, 9,1% метисных) и 70 их родственников. Данные об этнической принадлежности обследованных индивидов получены на основании анкетных данных с учетом национальной принадлежности родителей до третьего поколения. В ходе исследования особое внимание уделялось выявлению кровнородственных браков в семьях обследованных пациентов. В качестве контроля использованы ДНК 50 здоровых индивидов с нормальным уровнем МПКТ, сопоставимых по полу, возрасту и этнической принадлежности с обследуемой группой.

Для исследования остеопороза использованы образцы ДНК 882 женщин в возрасте от 45 до 80 лет, средний возраст составил 62 года, проживающих на территории Республики Башкортостан и Свердловской области. Формирование выборки осуществлялось на базе Городских клинических больниц №5, №21 и №22 г. Уфы и Областной клинической больницы №1 г. Екатеринбурга. У 471 женщины

проведено исследование уровня МПКТ, среди них МПКТ шейки бедра исследованы у 383 женщин, МПКТ поясничного отдела позвоночника - у 384 женщин.

Сбор материалов для исследования проводился в соответствии со стандартами, разработанными Хельсинскон декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» и с одобрения биоэтического комитета ИБГ УНЦ РАН.

Опрос участников исследования проводился по специально составленному протоколу, включавшему в себя сведения о количестве имевшихся переломов, их локализации и характере травмы. Также проводился сбор гинекологического анамнеза (возраст начала менархе, количество беременностей и родов, наличие эпизодов дис- и аменореи в репродуктивном возрасте, возраст наступления менопаузы и длительность периода постменопаузы) и оценка факторов риска остеопороза (наличие сопутствующих заболеваний, потребление кальцийсодержащих продуктов, курение, потребление алкоголя) .

Критериями для исключения из исследования были: наличие сопутствующих заболеваний и состояний, которые могут привести к потере костной массы (инсулинозависимын сахарный диабет, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хроническая почечная недостаточность, удаление яичников, резекция желудка, а также длительный прием глюкокортикоидов, нммунодепрессантов и т.д.) Все женщины подписали информированное согласие на участие в исследовании.

В группу с переломами вошли женщины с наличием низкотравматичных переломов (возникающих при падении с высоты собственного тела, при незначительной нагрузке или без видимых причин), произошедших в постменопаузе. Все переломы были подтверждены рентгенологически.

Выборка женщин была разделена на группы сравнения в зависимости от этнической принадлежности, наличия и отсутствия переломов, уровня МПКТ, показателей Т-критерия (согласно рекомендациям ВОЗ, выше -1 стандартного отклонения (SD) от показателя пика костной массы молодых женщин в возрасте 30-35 лет относятся к нормальным значениям МПКТ, значения от -1SD до -2,5SD классифицируются как остеопения, отклонение ниже -2,5 SD - остеопороз). Оценка МПКТ шейки бедра и поясничного отдела позвоночника проводилась методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA) на аппарате QDR 4500А («Hologic», США). Характеристика групп сравнения представлена в таблице. 1. Методы исследования. ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984).

Таблица 1 - Характеристика исследованных групп женщин

Показатели Выборки

с переломами M±s без переломов M±s Остеопороз Mis Остсопення M±s Здоровые M±s

Объем выборки 365 517 187 178 106

Возраст, годы 62,89±5,02 61,58±5,31 64,94±6,45 62,33±7,93 59,38i8,54

ИМТ, кг/м2 26,60±3,81 28,37±3,99 29,99±3,86 28,01±5,2 26,61±5,35

Возраст наступления менопаузы, годы 49,3 (47-53) 49,3 (48-52) 48,9(47-51) 48,3(46-51) 50(49-52)

Длительность постменопаузы (г.) 13,7 (8-16) 12,1 (7-15) 16,1(9-18) 13,4(7-19) 9,6(3-20)

МПКТ поясничных позвонков, г/см2 - - 0,68±0,09 0,78i0,09 1,02±0,15

МПКТ шейка бедра, г/см2 - - 0,65i0,09 0,85i0,08 0,92±0,14

Женщины русской этнической принадлежности

Объем выборки 254 330 158 142 78

Возраст, годы 63,58±4,11 62,47±4,79 65,20i6,45 63,27±7,93 60,31i8,54

ИМТ, кг/м2 26,57±3,38 28,39±3,63 25,81 ±3,86 28,44±5,2 29,50i5,35

Возраст наступления менопаузы, годы 49,2(46-51) 49,4 (50-52) 48,8(47-51) 48,5(46-51) 50(49-52)

Длительность постменопаузы (г.) 14,3(11-17) 12,9(10-15) 16,44(7-18) 14,5 (7-19) 10,3 (3-20)

МПКТ поясничных позвонков, г/см* - - 0,68i0,09 0,83i0,09 1,01±0,15

МПКТ шейка бедра, г/см2 - - 0,64i0,09 0,77±0,08 0,93±0,14

Женщины татарской этнической принадлежности

Объем выборки 98 183 29 32 28

Возраст, годы 60,86±6,11 59,91±4,79 65,52±6,4 57,41±7,93 56,79i8,54

ИМТ, кг/м2 26,69±3,38 28,31 ±2,63 27,01 ±3,8 26,21±5,2 29,93±5,35

Возраст наступления менопаузы, годы 49,6(47-51) 49,2(48-51) 49,8(47-51) 50,7(46-51) 50(49-52)

Длительность постменопаузы (г.) 11,9(7-13) 10,5 (7-12) 14(7-18) 7(5-15) 7,5 (3-20)

МПКТ поясничных позвонков, г/см" - - 0,72i0,09 0,91 ±0,09 1,04±0,15

МПКТ шейка бедра, г/см" - - 0,67±0,09 0,83±0,08 0,90±0,14

Примечания: М - среднее, в - среднее квадратичное отклонение

При остеопорозе проведено изучение 149 локусов, расположенных на всех хромосомах человека, кроме У хромосомы (генотипирование 100 локусов

осуществлялось в рамках исследований международного консорциума «GEFOS») с применением методов ПЦР «в реальном времени» с использованием технологии TaqMan, аллель специфической ПЦР (The Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system (KASP™)) и ПЦР-ПДРФ анализа.

При незавершенном остеогенезе проводился поиск структурных изменении кандидатных генов с применением методов SSCP-анализа (анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) и секвеннрования.

Работа частично выполнена на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК».

В качестве инструментов вычислений использованы пакеты программ MS Office Excel 2007 (Microsoft), Statistica v.6.2 (StatSoft), SPSS v. 13 (SPSS Inc).

Подбор праймеров осуществлялся с помощью программ Primer 3 v 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) и BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Для подбора эндонуклеаз рестрикции и определения рестрикционных сайтов использована программа Lasergene (DNAStar Inc).

Расчет показателя D', используемого для оценки неравновесия по сцеплению каждой пары полиморфных локусов, а также определение частот гаплотипов и тестирование различий в распределении частот гаплотипов в группах больных и в контроле осуществлялись с помощью программы Haploview 4.2. (Barret, 2005).

Оценка потенциального влияния структурных изменений проводилась с помощью моделирования с использованием программ PolyPhen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) и Human Splicing Finder - Version 2.4.1 (www.umd.be/HSF/).

Оценка генетической структуры изученной выборки проведена с помощью метода анализа главных компонент в программе Smartpca (Patterson et al., 2006), гетерогенность оценивали с использованием Q-критерия Кохрена, статистически значимыми считали различия при р<0,1, уровень гетерогенности выявляли при помощи критерия I2, фильтрация проводилась в программе Plink (Purcell et al., 2007).

Вид распределения количественных данных (возраст, ИМТ, количество лет после менопаузы, длительность постменопаузалыюго периода, употребление кальция, показатели МПКТ, уровень кальцитонина и эстрадиола) оценивался по критерию Шапиро-Уилка. Данные были представлены для нормально распределенных признаков как среднее арифметическое (М) и среднее квадратичное отклонение (s), в других случаях как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75). Корректировка значений МПКТ с учетом возраста и ИМТ проводилась с помощью множественного регрессионного анализа. При сравнении частот аллелей и

генотипов в группах больных и контроля, а также у лиц с различными диагнозами применялся критерий у\ Для таблиц сопряженности 2x2 применяли критерий у с поправкой Иетса на непрерывность, если частота, хотя бы в одной ячейке таблицы, была меньше или равна 5, применялся точный критерий Фишера. В случае статистически значимых различий силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов (Odds Ratio, OR), 0R>1 рассматривали как положительную ассоциацию с аллелем или генотипом (фактор повышенного риска) и ORcl - как отрицательную ассоциацию (фактор пониженного риска). Все статистические тесты выполнялись для двустороннего уровня значимости, статистически значимыми считали различия при р<0,05, где р - уровень значимости критерия.

Для мета-анализа результатов использовали программу WinPepi v. 11.32 (http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.htinl). Для вычисления среднего значения OR и уровня значимости рассматривали модели с фиксированным (метод Мантеля-Хензеля) и случайным эффектами (метод Дерсимоняна-Лэйрда). Для оценки статистической гетерогенности различных выборок использовали Q □ критерий Кохрена, статистически значимыми считали различия при р<0,1. Уровень гетерогенности определяли при помощи статистического критерия I2 (доля изменчивости, обусловленная неоднородностью выборок) (Higgins and Thompson, 2002). При значении I2 менее 30%, гетерогенность оценивали как легкую, при I2 в пределах 30-50% - как умеренную, а при I2 > 50% - как гетерогенную.

Для выявления связи между качественными и количественными признаками проведен многофакторный логистический регрессионный анализ с целью определения совокупности наиболее значимых факторов, определяющих формирование изучаемых градаций. Относительный вклад отдельных предикторов выражали величиной статистики Вальда (х2), а также показателем стандартизированного коэффициента регрессии, модуль которого определял влияние на зависимую переменную. В качестве критерия согласия реального распределения наблюдений по отдельным градациям признака на основе уравнения логистической регрессии использовался процент правильной переклассификации (показатель согласия или конкордации; чем ближе к 100%, тем выше качество модели), а также величина коэффициента связи Д-Зоммера, отражающая связь между фактической принадлежностью пациента к той или иной группе и теоретической, полученной по уравнению логистической регрессии (0 - полное несовпадение, 1 - полное совпадение). Для определения качества полученной модели прогнозирования использовался ROC (Receiver Operating Characteristic) - анализ, определялись чувствительность и специфичность модели, а также показатель AUC (Area Under Curve) - численный показатель площади под ROC-кривой (Wray N.R., 2010).

Дизайн исследования. Исследование включает молекулярно-генетическое изучение двух заболеваний, относящихся к метаболическим остеопатиям - моногенной формы - незавершенного остеогенеза и многофакторной - постменопаузалыюго остеопороза.

При изучении незавершенного остеогенеза проведен поиск структурных изменений генов COL1A1, COL1A2, CRTAP, LEPRE1, PPIB и SERPINF1 с последующей идентификацией обнаруженных изменений последовательности ДНК изученных генов, проведением гено-фенотипического анализа и оценкой значимости выявленных полиморфных вариантов в развитии заболевания.

Исследование остеопороза проводилось с использованием двух подходов: изучение полиморфных вариантов кандидатных генов и репликация результатов GWAS исследований, включая исследования генетических и эпигенетических факторов (полиморфизм сайтов связывания микроРНК).

В качестве кандидатных рассматривались 48 полиморфных вариантов 23 генов, среди которых гены компонентов костного матрикса (альфа 1 цепи коллагена 1 типа (COL1A1), альфа 1 цепи коллагена 11 типа (COL11А1)), Wnt сигнального пути (LRP5, WLS, WNT4, íVNT16), белков, участвующих в регуляции Са гомеостаза (витамин Д-связывающего белка (DBP), рецептора чувствительности к кальцию (CaSR)), гормонов и их рецепторов (кальцитонина (CALCA), рецептора кальцитонина (CALCR), паратиреоидного гормона (РТН)), ядерных рецепторов (рецептора витамина Д (VDR), рецептора эстрогенов альфа (ESR1)), цитокинов (остеопротегерина (TNFRSF11), рецептора фактора некроза опухоли 11 A (TNFRSF11A)) и ферментов (лактазы (LCT), ароматазы (CYP19A1)), а также 7 полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК в 5 генах (табл. 2).

Таблица 2 - Характеристика изученных локусов кандидатных генов остеопороза

Полиморфизм Обозначение Локализация Ген Роль

rs!800012 c,104-441G>T (+1546G>T) 17q21.33 COL1A1 Компоненты костного матрикса

rs1107946 c.-2116T>G (-1997G>T) 17q21.33 COL1A1

rs2412298 c.-l 781 C>T (-1663indelT) 17q21.33 COL1A1

rsl 1809524 c.2223+1883G>A 1p21.1 COL11A1

rs2277268 c.1932G>A (p.Gtu644=) 1 lql3.2 LRP5 Wnt сигнальный путь

rs545382 c,1647T>C (p.Phe549=) 11 ql 3.2 LRP5

rs3736228 c.39890T (p. Ala1330Val) 1 lql3.2 LRP5

rsl 7482952 c.374-14455T>C lp31.3 WLS

rsl2407028 c.373+11922A>G lp31.3 WLS

rs7521902 g.9170812C>A lp36.12 WNT4

rs3801387 c.603+2747A>G 7q31.31 WNT 16

(ТААА)п - 4Ч11-<]13 ЭВР

^1801725 с.29560Г (р.А!а9963ег) Зя21.1 САБЯ

(СА)„ 11р15.2 САЬСА регуляция гомеостаза

г$1801197 с.1340Т>С (р.Ьеи447Рго) 7ч21.3 С А 1С К кальция

/■¡20364} 7 &13617608А>С 11р15.2 РТН

189630182 &13620172Т>С 11р15.2 РТН

п7125774 &13618804С>Т 11р15.2 РТН

п7975232 с.1025-49в>Т 12ql3.ll КОЯ

П1544410 с. ¡024+2830А 12ql3.ll гоя

П731236 с.1056Т>С (р.11е352=) 12ql3.ll кол

п2228570 с.2Т> А/С/С 12ql3.ll УОЯ

п2234693 с.453-397Т>С 6q25Л Е8Н1 Ядерные рецепторы

П9340799 с.453-351А>С 6Ч25.1 ЕЗК1

(ТА),, - 6q25.1 ЕЬШ

п1514348 с.643+18393Т>в 6ч25.1 £5Л/

гз7766585 с.1369+13777Т>в 6Ч25.1 Е5Ш

гз3020314 с.1096+5029С>Т 6Ч25.1 ЕЗМ

ш7844539 с.817+8А>С 8Ч24.12 ТА'РЯЗтВ

пЗ102734 с.30+15С>Т 8ц24.12 тЕ^Епв

г$2073617 с.-223С>Т 8q24.12 ТЫЕКЗЕ11 в

п3102735 с.-1010А>в 8Ч24.12 ТЫЕЮЕНВ Цитокины

П2073618 с. РОС (р.АяпЗЬуз) 8я24.12 гдта^/Уй

Г53134069 с.-928Т>С 8ц24.12 ТХЕЯЯЕНВ

>■$2062377 8.120007420Т>А 8q24.12 ТМГЯЗЕИВ

™884205 с.*2590А>С 18д21.33 ТЫЕЯ5Е11А

(ТААА)п - 15ц21.2 СУР19А1

к¡062033 с.-38-1279Ю>С 15ц21.2 СУР19А1

п-2118784 8.22241742С>А 15ц21.2 СУР 19А1

rs28757¡90 с. 7900Т (р.Лг£264Су.ч) 15д21.2 СУР19А1 Ферменты

г.ч4988235 с.1917+326С>Т 2ц21.3 ьст

^¡82549 с.1362+117в>А 2q21.4 ьст

п2745426 с.*935С>Т 6q23.2 ¥NN1

кч17054320 с.*821Т>А 6я25.1 РЬЕКНС!

к 1712 с. *433С> Т 6Ч25.2 ЕВХ05 Сайты

гх 10098470 с.*10730Т 8я21.13 ТРЭ52 связывания

к10793442 с.*3320Т 10ч11.21 2№239 микроРНК

п10518716 с.*336С>С 15q22.33.q23 Ей 11506

^685408! с. *3156Т>С 4ч28.1 ЕвЕ2

Анализ 100 локусов, отобранных по результатам вХУАЗ исследований, проводился в рамках международного консорциума по поиску генетических факторов остеопороза «ОЕРОБ» в стадии репликации С\УА8 результатов (табл. 3).

Таблица 3 - Характеристика локусов, использованных для репликации GWAS исследований остеопороза

№ пп Полиморфизм Локализация Ближайший ген № im Полиморфизм Локализация Ближайший ген

2 3 4 5 6 7 8

1 rs2l20461 1р36.23 RERE 51 rs7851693 9q34.11 FUBP3

2 rs2295294 lp36.22 UDE4B 52 rs3905706 1 Opl 2.1 MPP7

3 rs6426749 lp36.12 ZBTB40 53 rsl373004 I0q2I.I MBL2

4 rs 12137389 lp34.1 TESK2 54 rs7071206 10q22.3 KCNMA1

5 rs7417366 lq24.2 - 55 rs2784767 10q22.3 PLAC9

6 rs479336 lq24.3 DNM3 56 rs7084921 10q24.2 CPN1

7 rsl2120297 lq41 SUSD4 57 rsl1602954 11p 15.5 BETIL

8 rsl3413210 2p23.2 ALK 58 rs7108 738 1 Ipl 5.2 SOX6

9 rs7584262 2p21 PKDCC 59 rs3781719 11p 15.2 CALCA

10 rs4233949 2p 16.2 SPTBN1 60 rsl0835187 11 p 14.1 LIN7C

11 rs 730402 2p 16. BCLIIA 61 rsl63879 1 lpl4.1 DCDC5

12 rs! 7040773 2ql3 ANAPCI 62 rs7932354 llpll.2 ARHGAP1

13 rsl878526 2ql4.2 1NSIG2 63 rs600231 1 lq 13.1 SCYL1

14 rs1346004 2q24.3 GALNT3 64 rs2887571 12pl 3.33 ERC1

15 rs 11675051 2q32.2 NAB1 65 rsl 1048046 12p 12.1 IF LT Dl

16 rs 12995369 2q33.1 ALS2CR7 66 rs7953528 12pl 1.22 KLHDC5

17 rs6436440 2q36.1 AP1S3 67 rs!2821008 12q 13.12 DHU

17 rs105103 73 3p26.1 - 68 rs2016266 12q 13.13 SP7

19 rs2291296 3p24.2 RARB 69 rs736825 12ql3.13 HOXC6

20 rs7427438 3p24.1 RBMS3 70 rsl053051 12q23.3 C12orf23

21 rs430727 3p22.1 CTNNB1 71 rs9533090 13ql4.11 AKAP11

22 rsl026364 3ql3.2 KIAA2018 72 rs7326472 13q 14.11 AKAP11

23 rs344081 3q25.31 LEKR1 73 rs!286083 I4q32.11 RPS6KA5

24 rs3755955 4p 16.3 1DUA 74 rs3748317 14q32.13 SERPIN AI

Продолжение табл. 7

№ пп 2 3 4 5 6 7 8

25 rs4832734 4pl4 - 75 rsll623869 14q32.32 MARK3

26 rs6532023 4q22.1 МЕРЕ 76 rsl2900333 15q25.1 -

27 rs6830890 4q25 - 77 rs9921222 16pl3.3 AXIN1

28 rsl366594 5ql4.3 MEF2C 78 rsl3336428 16pl3.3 C16orß8

29 Ы957742 5q21.3 EFNA5 79 rs4985155 16pl3.11 NTAN1

30 rs! 7284960 5q34 - 80 rsl564981 16ql2.1 CYLD

31 rs9466056 6p22.3 CD KA LI 81 rsl566045 16q 12.1 SALL1

32 rsl 1755164 6p21.1 SUPT3H 82 rsl0048146 16q24.1 FOXL1

33 rsl3204965 6q22.33 RSP03 83 rs4790881 17pl3.3 SMG6

34 rs4869742 6q25.1 C6orf97 84 rs4792909 17q21.31 SÖST

35 rs775I941 6q25.1 C6orf97 85 rs227584 17q21.31 Cl 7or/53

36 rs7788807 7p22.1 FOXK 86 rsl864325 17q21.31 МАРТ

37 rs2008425 7p22.1 RNF216 87 rs7226305 17q22 KIF2B

38 rsl0226308 7pl4.1 TXNDC3 88 rs7217932 17q24.3 SOX9

39 rs6959212 7pl4.1 STARD3NL 89 Ы796995 18pl 1.21 C18orfl9

40 rs2282930 7pl2.1 GRB10 90 rs2717096 18q23 -

41 rs4727338 7q21.3 SLC25A13 91 rs7257450 19pl3.11 PLVAP

42 rs!3245690 7q31.31 С7оф8 92 rsl0416218 19q 13.11 GPАТС 111

43 rs7812088 7q36.1 ABCF2 93 rs3790160 20pl2.2 J AGI

44 rsl670346 7q36.3 PTPRN2 94 rs4817775 , 21q22.12 CBR3

45 rsl405534 8p21.2 - 95 rs4820539 22q 11.22 RTDR1

46 rs7017914 8q 13.3 XKR9 96 rs5934507 Xp22.31 FAM9B

47 rsl3272568 8q21.12 PKIA 97 rs5926033 Xp22.11 -

48 rsI0756362 9p23 - 98 rs5952638 Xpll.3 DUSP21

49 rsl 1788458 9q31.3 - 99 rs4492531 Xql3.3 MAGEE2

50 rs4240467 9q33.2 DAB2IP 100 rs964181 Xq28 M AGEA4

Проведен поиск ассоциаций изученных 149 локусов, расположенных на всех хромосомах человека (кроме У хромосомы), с переломами в целом и различных отделов скелета, с уровнем минеральной плотности костной ткани (МПКТ) с учетом этнической принадлежности индивидов, а также анализ вариабельности уровня МПКТ шейки бедра и поясничных позвонков в зависимости от генотипов изученных локусов, мета-анализ результатов исследования, поиск прогностических моделей риска развития переломов. Схематическое изображение дизайна исследования представлено на рис. 1.

Метаболические остеопатии (переломы, низкая МПКТ)

3ZEZ

Постменопау зальный остеопороз

Незавершенным остеогенез

Исследование генов кандидатов

Исследование полиморфизма сайтов связывания микроРНЬС

Репликация результатов G WAS

Поиск структурных изменений генов

COLI Al, COL1A2, LEPRE1, PPÎB1, CRTAP, SERPINFl

Анашгзкандидатньгсл оку сов о стеопор оза в этнических группахрусскихнтатар

Анализ ассоциации изученных локусов с перепомамп

Анализ ассоциации с уровнем МПКТ

Идентификация

мутаций и проведениегено-фенотипических корреляций

жительныи анализ полиморфных вариантов изученных генов и поиск ассоциаций с переломами

Вь1явпеннегенепР1еаакмаркфовгфедратапоукеннос1пк остеоиорешческнм пфепомам и к фор кпц)ованню низкого уровня МПКТс^етом этгепескон принадлежности женщин и разработка подходов к ДНК диагностике незавершенного остеогенеза II остеопороза

Рисунок 1. Схема дизайна исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярно-генетическое изучение незавершенного остеогенеза

В результате поиска структурных изменении генов коллагена I типа (СОЫА1, СОЫА2), хрящ-ассоциированного белка (СИТАР), лепрекана 1 (1ЕРКЕ1), пептидил-пролил изомеразы В (РР1В) и ингибитора серпинпептидазы Р1 (БЕ11РШР1) у больных НО из Республики Башкортостан выявлено 11 мутаций, 5 из которых идентифицированы впервые, 28,57% семей информативны для проведения прямой ДНК-диагностики заболевания, в том числе пренатальной.

В гене СОЫА1 обнаружено 8 мутаций, 5 из которых нонсенс-мутации (с.358С>Т (р.Аг^120Х), С.9670Т (р.в1у323Х), С.10810Т (р.Аг^361Х), с.1243С>Т (р.А^415Х), с.2869С>Т (р.С1п957Х)), две мутации сдвига рамки считывания (с.579с!е1Т (р.С1у194Уа^Х71). с.2444<1еЮ (р.С1у815А1а/зХ293)) и одна мутация сайта сплайсинга (с.40005+Ю) (табл. 4). Мутация с.967С>Т (р.ау323Х) описана впервые.

Таблица 4 - Спектр мутаций в генах, обуславливающих развитие НО, у больных из РБ

Ген Изменения Эффект мутации Число хромосом*

на уровне ДНК на уровне белка

COL1A1 С.3580Т p.Argl20X нонсенс 1

c.579delT p.Gly!94ValfsX71 сдвиг рамки 2

считывания

c.967G>T p.Gly323X нонсенс 1

с. 1081 ОТ p.Arg361X нонсенс 1

С.12430Т p.Arg41SX нонсенс 1

c.2444delG p.Gly815AlafsX293 сдвиг рамки

считывания 1

С.28690Т p.Gln957X нонсенс 1

C.40005+1G - сайт сплайсинга 1

LEPRE1 c.!720+4G>A - сайт сплайсинга 1

CRT АР с.641Т>С p. Val214Ala миссенс 1

SERPINFJ c.913C>G p.Leu305Val миссенс 1

Примечание: * - число хромосом, несущих мутацию, у неродственных больных.

Наши результаты согласуются с данными других исследователей. Несмотря на большое количество мутаций, зарегистрированных в базе данных по незавершенному остеогенезу (https://oi.gene.le.ac.uk), для каждой популяции характерен свой спектр, состоящий из небольшого числа мутаций, при этом большинство исследователей находят ранее неописанные в литературе мутации, наряду с известными.

Шесть мутаций приводили к аутосомно-доминантной форме НО, три возникли de novo, из них мутация c.579delT (p.Glyl94ValfsX71) встречалась в двух

неродственных семьях, в одном случае имела аутосомно-доминантный тип наследования, в другом - возникла de novo (табл. 5).

В гене COLI AI также выявлены 17 полиморфных вариантов, три из которых расположены в промоторном регионе (rsl800012, rsl 107946, rs2412298), одиннадцать - в интронных областях (rs2256835, rs67207840, rsl 7639446, rs2734281, rs2141279, rsl007086, rsl800695, rs2696247, rs2857396, rs2075559, rs2586488), один - в 45-ом экзоне (rsl800215) гена COL1A1: распределение частот аллелей и генотипов данных полиморфных локусов оказалось схожим с таковым в контрольной группе, что свидетельствует об их нейтральном характере в развитии НО. Два полиморфных варианта: с.544-24Т>С и c.957+10insA, расположенные в 5 и 14 интронах гена COLI AI, обнаружены нами впервые только у одного пациента русской этнической принадлежности, оценка их влияния на вероятность возникновения альтернативных сайтов сплайсинга, проведенная с помощью программы математического моделирования (http://www.umd.be/HSF/), не выявила значимых изменений. Большинство из 17 обнаруженных полиморфных вариантов гена COLI AI имеют нейтральный характер, аллель *G полиморфного локуса rs!7639446 (х2=3,91, р=0,048; OR=3,310, 95% ДИ 0,954-11,48) и гаплотип *Tdel локусов rsl800012 и rs2412298 гена COLI AI (х2=6,568; р=0,010; OR=6,32; 95% ДИ 1,30-30,75) статистически значимо чаще встречались у больных по сравненню с контрольной группой и, вероятно, могут оказывать влияние на утяжеление клинической картины заболевания.

В гене COL1A2 мутаций не обнаружено, идентифицировано 7 однонуклеотидных полиморфных вариантов, ранее описанных в литературе, пять из которых располагались в интронных участках гена (rs42518, rs28754326, rs2521206, rs421587, rs2301643), два - в экзонах (rs412777, rs42524). Все полиморфные варианты обнаружены как у больных, так и в контрольной группе здоровых индивидов, значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов не выявлено.

Анализ генов пролил-3-гидроксилирующего комплекса (LEPRE1, CRTAP и PPIB) у больных незавершенным остеогенезом выявил ранее неописанные мутации с.641Т>С (p. Val214Ala) в 10 экзоне гена CRTAP и c,1724+4G>A в 11 экзоне гена LEPRE1, а также 9 полиморфных вариантов (rs3738497, rs3738498 и rs3738499 - в гене LEPRE1; rs4234239, rs58617854 и c.H53-78G>A - в гене CRTAP; rs4904, rs2307247 и rs2253557 в гене PPIB), один из которых (c.l 153-78G>A в гене CRTAP) идентифицирован впервые.

В результате анализа гена SERPINF1 выявлена ранее неописанная миссенс мутация c.913C>G (p.Leu305Val) у больного НО башкирской этнической принадлежности с предположительно IV типом НО, у которого также обнаружена мутация с.641Т>С (p.Val214Ala) в гене CRTAP. Нами также обнаружены

полиморфные варианты к1136287 (с.2150Т, р.Т11г72Ме1) в экзоне 3 гена ЗЕЯРШР! и п58697961 (С.-9+170А); гз11658342 (С.85-420А), 1?2071022 (с.787-21А>в) в интронных областях гена, которые встречались как у больных, так и в контрольной группе со схожими частотами аллелей и генотипов. По литературным данным полиморфизм гя1136287 (с.2150Т, р.Ткг72Ме1) гена ЯЕЯРМЕ! ассоциирован с развитием диабетической ретинопатии у японцев (Нгика Н., 2007).

Таблица 5 - Характеристика идентифицированных мутаций у больных НО из РБ

Мутация Экзон Тип мутации Эффект мутации Изменение на уровне белка Тип НО Наследование

Ген al цепи коллагена 1 типа (COLIAI)

С.3580Т 4 транзиция нонсенс p.Argl20X I de novo

c.579deIT 7 делеция сдвиг рамки считывания p.Glyl94ValfsX71 1 de novo и АД

c.967G>T 15 трансверсия нонсенс p.Gly323X I АД

C.10810T 17 транзиция нонсенс p.ArgSôlX IV АД

C.12430T 19 транзиция нонсенс p.Arg415X III IV de novo

c.2444delG 36 делеция сдвиг рамки считывания p. Gly815AlafsX293 I АД

C.28690T 41 транзиция нонсенс p.Gln957X I АД

с.4005+Ю>Т 50 трансверсия сайт сплайсинга - I АД

Ген лепрекана 1 (LEPRE1)

c,1720+4G>A 11 транзиция сайт сплайсинга - VI АД

Ген хрящ-ассоциированного белка (CRTAP)

c.641T>C 3 транзиция миссенс p. Val214Ala IV АР

Ген серпина Fl (SERPINF1)

c.9130G 7 трансверсия миссенс | p.Leu305Val IV АР

Примечание: АД - аутосомно-доминантный, АР - аутосомно-рецессивный

Таким образом, все выявленные мутации определены в гетерозиготном состоянии и являются уникальными для каждой семьи (за исключением мутации c.579delT (p.Glyl94ValfsX71) в гене COL1AL идентифицированной в двух неродственных семьях). Один больной с IV типом НО с аутосомно-рецессивным типом наследования является компаунд-гетерозиготным носителем двух мутаций (с.641Т>С (р. Val214Ala) в гене CRTAP и c.913C>G (p.Leu305Val) в гене SERP1NF1). В генах COL1A2 и PPIB у больных НО из РБ мутаций не обнаружено.

Проведенное нами исследование выявило 8 мутаций в 8 экзонах гена COLI AI (4, 7, 15, 17, 19, 36, 41, 50), расположенных в разных участках гена, в генах CRTAP, LEPRE1 и SERPINF1 обнаружены единичные мутации и только 28,57% семей оказались информативными для проведения прямой ДНК-диагностики.

Таким образом, широкому внедрению методов прямой диагностики незавершенного остеогенеза препятствуют объективные причины. Во-первых, отсутствие мажорных мутаций и явных "горячих точек" в кандидатных генах. Во-вторых, несмотря на разнообразие применяемых методов, скрининг мутаций в больших генах, какими являются гены коллагена 1 типа, является слишком дорогостоящим и требует много времени, чтобы использовать его в качестве универсального диагностирующего метода. В-третьих, существование мутаций de novo и, как следствие, спорадических случаев возникновения заболевания. ДНК-диагностика НО, в том числе пресимптоматическая и пренатальная, основанная на идентификации мутаций, возможна только в семьях, в которых были выявлены мутации. Проведенное нами исследование показало, что для больных НО из РБ поиск мутаций в гене COL1A2 является нецелесообразным. Наши данные не противоречат результатам ряда исследователей. Так, у больных НО из Литвы, Китая и Израиля также обнаружены мутации только в al цепи и не выявлены в а2 цепи гена коллагена I типа [Benusiene et al., 2003; Ries-Levavi et al, 2004; Yang et al., 2011].

Несмотря на гетерогенный характер заболевания и отсутствие мажорных мутаций в генах, ответственных за развитие НО, мы сформулировали подходы к ДНК-диагностике незавершенного остеогенеза и предположили следующие этапы анализа: при аутосомно-доминантном типе наследования заболевания в первую очередь нужно проводить анализ гена al цепи коллагена I типа (COLIAI); при аутосомно-рецессивном типе наследования и спорадических случаях - скрининг мутаций в генах CRTAP, LEPRE1; при тяжелых формах НО с аутосомно-рецессивным типом наследования — скрининг мутаций в гене SERP1NF1. Независимо от обнаружения мутаций можно проводить генотипирование полиморфных вариантов is17639446, rs1800012 и rs2412298 гена COLLAI. Поиск мутаций в генах COL1A2 и PPIB у больных НО из РБ не целесообразен (рис. 2).

Таким образом, учитывая тяжесть заболевания и ннвалидизирующее течение, несмотря на трудоемкость процесса обнаружения мутаций, семьи больных НО нуждаются в определении генетического дефекта заболевания для предотвращения рождения больных детей в отягощенных семьях.

С развитием технологий генотипирования и широкого внедрения методов глубокого ресеквенирования и полноэкзомного секвенирования станет возможным идентифицировать не только новые мутации в известных генах, но и выявлять новые гены, вовлеченные в развитие заболевания и оптимизировать алгоритм ДНК-диагностики НО.

Рисунок 2. Подходы к ДНК-диагностике незавершенного остеогенеза.

Проведенные нами исследования вносят существенный вклад в понимание молекулярно-генетических основ незавершенного остеогенеза и являются теоретической и методической основой для разработки и оптимизации молекулярно-генетической диагностики заболевания.

Анализ генетической структуры выборки женщин постменопаузалыюго возраста из Вол го-Уральского региона Нами проведен анализ генетической структуры исследованной выборки, состоящих преимущественно из женщин татарской и русской этнической принадлежности, на основе изучения полиморфных вариантов кандидатных генов остеопороза, а также локусов, использованных для репликативных исследований методом анализа главных компонент в программе Smartpca (Patterson et al., 2006). В исследование были включены индивиды, у которых доля успешного генотипирования составляла 97% и ОНП (SNPs) с долей успешного генотипирования 97%. Фильтрация проводилась в программе Plink (Purcell et al., 2007).

В целом не обнаружено генетической дифференциации изученной выборки по исследованным локусам кандидатных генов в зависимости от их этнической принадлежности, что продемонстрировано на рис. ЗА. При этом в пространстве двух главных компонент наблюдается группирование в два кластера, независимо от происхождения женщин. Дальнейший анализ показал, что кластеризация обусловлена принадлежностью женщин к группам больных или контроля, а не этническим фактором (рис. ЗБ). В первом кластере наблюдается скопление индивидов из

контрольной группы, тогда как во втором кластере, наоборот, чаще представлены женщины из группы больных.

¡ж-'

а "*

Л •

1 •

.....

'■¡Як

^ - '

Рис. 3. Генетическая структура исследованной выборки женщин из ВУР с учетом их этнического происхождения (А) и в зависимости от принадлежности к группам сравнения (Б) по изученным полиморфным вариантам кандидатных генов.

При анализе локусов, использованных для репликации результатов ОХУАБ исследований, также не выявлено выраженной гетерогенности выборки женщин по изученным локусам в зависимости от их этнической принадлежности (рис. 4А). Проведенный дальнейший анализ показал, что размытость кластера обусловлена вкладом контрольной группы, для которой характерен широкий спектр разброса индивидов по сравнению с группой больных, что свидетельствует о большем генетическом разнообразии в выборке здоровых индивидов (рис. 4Б).

.. -3. "х.-л-

Рис. 4. Расположение выборки женщин из ВУР в пространстве двух главных компонент по локусам, использованным для репликации результатов СХУАБ-исследований с учетом их этнического происхождения (А) и принадлежности к

группам сравнения (Б).

При попарном сравнении изученных локусов обнаружено, что этнические группы русских и татар статистически значимо различаются по распределению частот аллелей 16 локусов из 149 изученных, что составляет 10,74% (rs2887571 (12р13.33), rs4817775 (21q22.12), rs227584 (¡7q2¡.31) C17or/53, rsl053051 (12q23.3) C12orf23, rs2036417 (PTH), rs7125774 (PTH). rs2228570 (VDR), rsll07946 (COL1A1), rsl80¡197 (CALCR), rs2073618 (TNFRSFUB), rs4988235 (LCT), rsl82549 (LCT), rsl514348 (ESR1), rsl0518716 (FUI1506), rsl0098470 (TPD52), rs6854081 (FGF2)). Среди них только 4 локуса из 96, использованных при репликативном изучении, 3 -полиморфные сайты связывания микроРНК и 9 - полиморфные варианты 6 кандидатных генов.

Таким образом, в целом, этнические группы женщин русского и татарского происхождения демонстрируют слабую генетическую дифференциацию по локусам, изученным в рамках исследования остеопороза, однако, учитывая статистически значимые различия по 10,74% локусам, поиск г.ссоциаций изученных локусов с эндофенотипами остеопороза проводился с учетом этнического фактора.

Анализ полиморфных вариантов кандидатных генов остеопороза у женщин русской и татарской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона

С середины 1990-х годов начались многочисленные попытки идентифицировать кандидатные гены, обусловливающие наследственный компонент остеопороза, однако, исследования зачастую показывали противоречивые результаты, причиной которых, вероятно, были различия в генетической структуре исследованных популяций [Peacock et al., 2002; Beaven et al., 1996; Dvornyk et al., 2003; Lei et al., 2003; Hubacek et al., 2006; Kim et al., 2007; Ralston et al., 2010; Canto-Cetina et al., 2013; Wang et al, 2014]. В связи с этим анализ ДНК-локусов генов-кандидатов остеопороза в этнических группах, отличающихся по лингвистическому и территориальному признакам, является необходимым условием для выявления генетических маркеров заболевания, как общих, так и специфичных для отдельных популяций и регионов.

Исследование полиморфных вариантов генов COL1A1, COL11A1, LRP5, WLS, WNT4, WNT16, DBP, CaSR, CALCA, CALCR, PTH, VDR, ESR1, TNFRSF11, TNFRSFUA, LCT, CYP19A1 у женщин постменопаузального возраста из ВУР позволило выявить ассоциации с уровнем МПКТ и переломами в целом, так и в зависимости от их этнической принадлежности.

В результате изучения генов компонентов костного матрикса обнаружена ассоциация генотипа *G*G полиморфизма rsl 107946 гена COL1A1 (х2=4,598; р=0,032; OR=l,37; 95% ДИ 1,03-1,83) с переломами у женщин общей группы. У женщин

русской и татарской этнической принадлежности наблюдается схожая тенденция, однако различия не достигают статистической значимости из-за уменьшения размера выборок. Выявлена ассоциация аллеля *G локуса rsl 107946 гена COLI AI с развитием переломов лучевой кости у женщин из ВУР (х2=9,958; р=0,002; OR=l,82; 1,25-2,66).

При разделении выборки женщин в зависимости от Т-критерия на группы с остеопорозом, остеопенией и нормальными показателями обнаружена ассоциация аллеля *Т полиморфизма rsl80012 гена COLI AI с остеопорозом в общей выборке (Х2=5,554; р=0,018; OR=l,69; 95% ДИ 1,09-2,62) и у женщин русской этнической принадлежности (х2=4,685; р=0,030; OR=l,71; 95% ДИ 1,05-2,78), у татар наблюдается схожая тенденция, различия не достигают статистической значимости. Генотип *Т*Т локуса rsl80012 гена COLI AI является маркером повышенного риска развития остеопороза у женщин из ВУР (^=4,307; р=0,038; OR=4,45; 95% ДИ 1,01-20,65).

Аллель *£> и генотип *1*D локуса rs2412298 гена COLI AI ассоциированы с остеопорозом (*2=4,604; р=0,032; OR=l,53; 95% ДИ 1,04-2,25 и х2=5,523; р=0,033; OR=l,69; 95%ДИ 1,014-2,74, соответственно), а также с остеопенией (х2=3,764; р=0,052; OR=l,54; 95% ДИ 1,01-2,28 и ^=5,337; р=0,021; OR=l,83; 95% ДИ 1,09-3,06, соответственно) в общей выборке женщин из ВУР.

Наблюдается тенденция уменьшения уровня МПКТ поясничных позвонков у носителей генотипов *D*D локуса rs2412298, *Т*Т локуса rsl800012 и *Т*Т локуса rsl 107946, однако различия не достигают статистической значимости. При этом уровень МПКТ шейки бедра статистически значимо ниже у носителей генотипа *Т*Т локуса rsl800012 (0,641), как по сравнению с носителями генотипа *С*Т (0,746), так и генотипа *G*G (0,773) (р=0,049 и р=0,002, соответственно) (рис. 5).

гЫ800012 (COL 1А1}

0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 о.ао 0.66

Рисунок 5. Оценка уровня МПКТ (г/см2) шейки бедра у лиц различными генотипами полиморфизма rsl800012 гена COLI AI.

Мета-анализ доступных опубликованных работ по результатам изучения полиморфных локусов (rsl 107946, rs2412298 и rsl800012) гена COL1A1 (24 511 участников, из них у 7864 были переломы) показал, что все три локуса ассоциированы с уровнем МПКТ, а локус rsl800012 был ассоциирован и с переломами (Jin et al., 2011).

Исследование генов, вовлеченных в \Vrit сигнальный путь, показал, что полиморфизм к! 7482952 гена ассоциирован с переломами лучевой кости

(Х2=6,513; р=0,011; 011=1,85; 95% ДИ 1,15-2,98). Обнаружена ассоциация генотипа *С*С полиморфизма г.ч545382 гена ЬЯР5 с остеопенией (х2=3,945; р=0,047; (Ж=2,42; 95% ДИ 1,01-5,90). У носителей генотипа *А*А полиморфизма гя3801387 гена \YNT16 статистически значимо снижен уровень МПКТ (г/см2) поясничных позвонков по сравнению с женщинами с генотипом *С*С (р=0,014).

Исследование полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции гомеостаза кальция, выявило ассоциацию генотипа *С*С локуса г$9630182 гена РТН с риском развития переломов (х2=4,565; р=0,032; 011=1,465, 95%ДИ 1,031-2,082) у женщин постменопаузального возраста русской этнической принадлежности.

Генотип *С*Т локуса г$7125774 гена РТН является маркером повышенного риска остеопении (х2=5,344; р=0,020; ОЯ-1.705; 95% ДИ 1,082-2,684) и остеопороза в общей выборке (х2=5,344; р=0,020; 011=1,71; 95% ДИ 1,08-2,68), генотип *С*С (Х2=4,293; р=0,038; СЖ=0,51; 95% ДИ 0,27-0,29) - маркер пониженного риска развития низкого уровня МПКТ. У носителей генотипа *Т*Т локуса гя2036417 гена РТН отмечается самый низкий средний уровень МПКТ поясничных позвонков (0,76 г/см2) и статистически значимое повышение уровня МПКТ поясничных позвонков у женщин с генотипом *С*Т гена РТН локуса г$9630182 по сравнению с носителями генотипа *Т*Т(р=0,027) и *С*С (р=0,044).

п2036417 (ген РТН) п96301.Ч2 (ген РТН)

тест Краскала-Уоллес: Н-7.49: р=0.024

тест Кэускала-Уоллес: Н=5.9:1: р=0,051

□ (ЛеагввЁ I МвагаБО Д

I М<мг>180 ^

Рисунок. 6. Вариабельность уровня МПКТ поясничных позвонков у женщин с различными генотипами локусов г,ч2036417 (А) и 9630182 (Б) гена РТН.

При 0\УА5 исследованиях остеопороза ген РТН не оказался в ряду наиболее значимых маркеров, однако мета-анализ результатов изучения различных популяций мира показал перспективность этого гена в качестве кандидатного гена заболеваний, связанных с нарушением метаболизма костной ткани (Xiong с! а1., 2009; Zeggini е1 а1., 2009; Сио е1 а!., 2010).

Выявлена ассоциация аллеля *17 полиморфизма (СА)п гена CALCA с повышенным риском развития остеопоретических переломов (OR=l,95; 95% ДИ 1,113,46) у женщин татарской этнической принадлежности. У носителей генотипа *10*10 (СА) „ повторов гена CALCA уровень МПКТ шейки бедра статистически значимо выше (р=0,038), *17*17 - уровень МПКТ поясничных позвонков ниже по сравнению с другими генотипами (р=0,026).

Выявлено статистически значимое повышение уровня кальцитонина у гомо- и гетерозиготных носителей аллеля *17 (2.7 пг/мл и 3,1 пг/мл, соответственно) по сравнению с женщинами с отсутствием данного аллеля (2,04 пг/мл) русской этнической принадлежности (р=0,014).

Обнаружена ассоциация гетерозиготного генотипа *с*Т полиморфизма rsl801197 гена CALCR с повышенным риском возникновения остеопоретических переломов в общей выборке женщин (х2=5,185; р=0,022; OR=l,38; 95% ДИ 1,05-1,82) и у русских (х2=9,389; р=0,002; OR=l,71; 95% ДИ 1,21-2,40). У женщин с генотипом *С*С наблюдалось значимое снижение МПКТ шейки бедра по сравнению с носителями генотипов *С*Т и *Т*Т полиморфизма rs 1801197 гена CALCR (таб. 6).

Таблица 6 - Сравнительный анализ вариабельности уровня МПКТ в зависимости от генотипов полиморфизма гя 1801197 гена CALCR

Генотипы МПКТ шейки бедра (среднее, г/см") МПКТ поясничных позвонков (среднее, г/см2)

*С*С 0,68 0,81

*с*т 0,76 0,84

0,78 0,79

тест Крускапа-Уоллес Н=10,588; р=0.005 Н=3,267; р=0.195

U тест Манна-Уитни

*с*с/*т*т U=1321,0; Z=-3,206; р=0.001 U=2591,5; Z=-0,319; р=0,749

*с*т/*т*т U=12905,0; Z=-l,355; р=0,176 U=12361,0; Z= 1,794; р=0,479

*с*т/*с*с U=1526,5; Z=-2,50; р=0,012 U=2445,5; Z=-0,707; р=0,267

Выявлена ассоциация аллеля *11 (ТААА),, полиморфизма гена DBP с развитием остеопоретических переломов (£2=4,28; р=0,038; OR=l,93; 95% ДИ 1,06-3,48) у женщин русской этнической принадлежности.

Обнаружено статистически значимое снижение уровня МПКТ шейки бедра у носителей генотипа *Т*Т полиморфизма rs1801725 (c.2956G>T) гена CaSR по сравнению с носителями генотипов *G*T и *G*G (U=294,5; р=0,024 и U=829,5; р=0,018, соответственно). Средний уровень МПКТ шейки бедра у женщин с генотипом *G*G составил 0,770, генотипом *G*T - 0,759, с генотипом *Т*Т 0,650.

Исследование полиморфных вариантов генов ядерных рецепторов выявил, что аллель *А локуса гя2228570 гена УГ)к является маркером повышенного риска развития переломов (^2=3,812; р=0,050; ОК=1,26; 95% ДИ 1,01-1,59) в общей выборке женщин и у женщин русской этнической принадлежности (х2=6,001; р=0,014; (Ж=1,41; 95% ДИ 1,07-1,85).

Выявлено статистически значимое снижение уровня МПКТ шейки бедра у носителей генотипа между носителями генотипов '*А*А и *А*С локуса 544410 (Взт1) (р=0,022), *С*С, и *С*Т локуса г.ч7975232 С.1025-490ТАраI) гена УОк (р=0,007).

rs!544410 (Bsm!) VDR

П7975212 (Ара!) гена VDR

□ MeentSE I MearitSD

□ MeamSE X MeaoiSD

Рисунок 8. Оценка вариабельности МПКТ шейки бедра в зависимости от генотипов локусов 544410 и гх7975232 гена УВЕ.

Генотипы *Т*Т локуса rs3020314, *А*А локуса rs2234693 гена ESR1 являются маркерами повышенного риска переломов у женщин татарской этнической принадлежности (х2=3,885; р=0,048; OR=2,21; 95%ДИ 1,00-4,94 и OR=l,66; 95% ДИ 1,01-2,76, соответственно).

Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов гена ESR1 с МПКТ и переломами в GWAS исследовании "DeCode" [Styrkarsdottir et al., 2008; 2009], однако несколько GWAS исследований [Richards el al., 2008; Kiel et al., 2007; Xiong et al., 2009] не подтвердили роль гена ESR1 в формировании МПКТ, что предполагает небольшой эффект гена в формировании уровня МПКТ и/или риска переломов.

Исследование полиморфных вариантов генов цитокинов выявило, что аллель *Т и генотип *Т*Т полиморфного варианта rs31Q2734 гена OPG ассоциированы с повышенным риском развития переломов в общей выборке женщин (%2=5,482; р=0,019; OR=l,55; 95% ДИ 1,07-2,25 и OR=l,63; 95%ДИ 1,10-2,42) и у татар (х2=4,002; р=0,045; OR=2,14; 95% ДИ 1,01-4,57 и %2=6,820; р=0,009; QR=3,02; 95% ДИ 1,28-7,14).

Аллель *Т и генотип *Т*Т полиморфного варианта пЗ134069 гена ОРО ассоциирован с повышенным риском развит™ переломов в общей выборке женщин (Х2=8,488; р=0,003; СЖ=1,76; 95% ДИ 1,19-2,59 и х2=10,361; р=0,001; СЖ=1,94; 95% ДИ 1,29-2,91) и у татар (х2=7,609; р=0,005; СЖ=3,06; 95% ДИ 1,33-7,02 и х2=9,986; р=0,002; (Ж=3,98; 95% ДИ 1,61-94,59), у которых с риском развития остеопоретических переломов ассоциирован также гаплотип *ТО по локусам пЗ 102735 и г.?3134069 (х2=5,865; р=0,015; СЖ=1,98; 95% ДИ 1,11-3,51).

95°оД11 1.03-1.83

1.05-1.82 1.01-1,59 1.10-2.«

1.20-2.59 1.29-2.91 1.07-1.85 1.03-2.08

1.21-2.40

1.06-3.48

1.11-3.46 1.01-2.76 1.01-4.94

1.12-5.02 1.28-7.14 1.33-7.02 1.61-94.59 1.11-3.51 1.11-2.80 1.17-3.76

Рисунок 9. Маркеры повышенного риска переломов у женщин из ВУР.

Поиск ассоциаций локусов гена остеопротегерина (ОРС, ТЫ1-'К8У11В) с уровнем МПКТ показал, что генотип *С*С полиморфизма кЗ102735 ассоциирован с остеопенией (х2=4,782; р=0,028; СЖ= 10,71; 95% ДИ 1,00-195,94), гаплотип локусов 1^3102734, 1^2073617, г$2073618 и пЗ134069 ассоциирован с повышенным риском развития остеопении (х2=6,157; р=0,013; (Ж=4,09; 95% ДИ 1,24-13,49) и остеопороза (%2=5,815; р=0,016; (Ж=3,87; 95% ДИ 1,17-12,76) у женщин русской этнической принадлежности, генотип *С*С полиморфизма гя3102734 - в общей выборке (х2=4,169; р=0,041; 0к=9,08. 95% ДИ 0,47-171,14), с остеопорозом ассоциированы аллель *С ^=5,145; р-0,023; (Ж=1,91 (1,09-3,36) и генотип *С*С (Х2=7,324; р=0,006; ОГ<=3,68; 95%ДИ 1,39-9,76) полиморфизма пч2073618, аллель *Т (Х2=4,813; р=0,028; (Ж=3,79, 95% ДИ 1,07-13,43) и генотип *Т*Т (у?=5,333; р=0,020;

OR=4,24; 95% ДИ 1,15-15,62) локуса rs3134069, аллель *Т (х =4,204; р=0,040; OR=3,52, 95% ДИ 0,99-12,56) и генотип *Т*Т (£=4,629; р=0,031; OR=3,90; 95% ДИ 1,05-14,43) полиморфизма rs3102734 гена OPG у женщин татарской этнической принадлежности.

По литературным данным анализ ассоциаций между полиморфными вариантами гена OPG и уровнем МПКТ, переломами или другими фенотипами остеопороза дают противоречивые результаты [Arko et al., 2002, 2005; Langdahl et al., 2002; Ohmori et al., 2002; Wynne et al., 2002; Yamada et al., 2003; Daroszewska et al., 2004; Jorgensen et al., 2004; Brandstrom et al., 2004; Soufi et al., 2004; Zhao et al., 2005; Choi et al., 2005; Vidal et al., 2005; Hsu et al., 2006; Rhee et al., 2006; Ueland et al., 2007].

В последних GWAS исследованиях минеральной плотности костной ткани и переломов регион гена OPG был значимо ассоциирован с костными фенотипами [Styrkarsdottir et al., 2008; Richards et al., 2008; Estrada et al., 2012]. Низкая костная масса имеет самое прямое отношение к риску переломов, но только несколько исследователей изучали взаимосвязь между уровнем ОПГ и риском переломов у людей и эти результаты противоречивые.

CYP19*C*C(rsl062033)

TNFRSFUB*T*Trs3134069

TNFRSF11 B*T?s3134069

TNFRSFHBTT(rs3102734) TNFRSFllB*T(rs3102734) TNFRSFUB*C*C(rs20736¡8) TNFRSFllB*C(rs20736l8)

COLlAl*T(rsl80012) TNFRSFUB*CGTO

PTH*C*T(rs7125774) COL1A1 *D(rs2412298)

COL1A1 *I*D(rs2412298) COLlAl"T*T(rsl 80012)

COL1A1 *T(rsl80012) OR

Á,

9?»оДП 1.09-2.62 J 1.01-20.6 1.01-2.7-1

1.04-2.25

1.05-2.6S 1.17-12.' 1.05-2.78

1.00-5.86 139-9."6

1.01-12.5 1.05-14.4 1.07-13.4

-15.6

1.01-5.9"

0 1 2 3 4 5

Рисунок 10. Локусы, ассоциированные с низкими показателями МПКТ на уровне остеопороза (по Т-критерию).

Обнаружена ассоциация генотипов *С*С полиморфизма rsl062033 гена CYP19A1 (х2=4,044; р=0,044 OR=2,45; 95% ДИ 1,01-5,97), 11/11 (х2=4,342; р=0,037;

OR=3,64; 95% ДИ 1,02-12,99), аллеля *11 ()Г=6,802; 0,009; OR=2,12; 95% ДИ 1,193,39) полиморфизма (ТААА)п повторов с развитием остеопороза у женщин татарской этнической принадлежности.

Таким образом, выявлена значимость полиморфных вариантов генов коллагена 1 типа, кальцитонина и его рецептора, витамин Д-связывающего белка, остеопротегерина, ароматазы, рецепторов витамина Д, эстрогена альфа, паратиреоидного гормона в развитии переломов, гены коллагена 1 типа, остеопротегерина, ароматазы, паратиреоидного гормона также ассоциированы с низким уровнем МПКТ у женщин постменопаузалыюго возраста из ВУР.

Исследование полиморфизма сайтов связывания мнкроРНК

Проведено изучение полиморфных вариантов, расположенных в сайтах связывания микроРНК, генов, кодирующих белок 239 «цинковых пальцев» (ZNF239), фактор роста фибробластов 2 (FGF2), ванин 1 (VNN1), белок, связывающийся с альфа и гамма субъединицами адаптина (FU11506), белок, содержащий домен гомолог плекстрина (PLEKHG1), белок Emil, ингибитор митоза на ранней стадии (FBX05), опухолевый белок D52, связанный с клеточной пролиферацией и апоптозом (TPD52), и поиск ассоциаций с риском развития переломов и низким уровнем МПКТ.

Проведенное исследование позволило установить, что аллель *Т и генотип *С*Т локуса rs10098470 гена TPD52 ассоциированы с переломами у женщин русской этнической принадлежности (7/=4,262; р=0,039; OR=3,64; 95% ДИ 0,98-13,53) и Г=4,310; р=0,037; OR=3,69; 95% ДИ 0,99-13,79). У женщин татарской этнической принадлежности выявлена ассоциация генотипа *А*С локуса rs10793442 гена ZNF239 (х2=6,264; р=0,012; OR=2,01; 95% ДИ 1,16-3,48) с развитием переломов.

Маркерами повышенного риска развития остеопороза являются аллель *А (х2=4,139; р=0,041; OR=l,53; 95%ДИ 1,01-2,32) и генотип *А*С (х2=4,714; р=0,029; OR= 1,67; 95%ДИ 1,05-2,66) локуса rs10793442 гена ZNF239 в общей выборке и у женщин русской этнической принадлежности (х2=5,908; р=0,015; OR=2,02; 95% ДИ 1,14-3,60 и х2=5,813; р=0,015; OR=2,18; 95% ДИ 1,45-4,13, соответственно), у татар наблюдается такая же тенденция, не достигая статистической значимости из-за меньшей выборки (рис. 11).

Исследования полиморфизма сайтов связывания микроРНК при заболеваниях скелета находятся в зачаточном состоянии. Существуют единичные исследования сайтов связывания мнкроРНК (поли-miiRTS) у больных остеопорозом. Наиболее значимым является крупномасштабное исследование 997 европеоидов с использованием технологии чипов и набора из 568 поли-miiRTS, которые, предположительно, могут влиять на предрасположенность к ОП (Lei et al., 2011). Данное исследование позволило выявить 3 полиморфизма (rs6854081, rsl048201 и

г.<>7683093) в З'-НТО гена фактора роста фибробластов 2 f7гGF2^), которые были ассоциированы с уровнем МПКТ шейки бедра и оказались потенциальными сайтами связывания для 9 микроРНК. В нашем исследовании у женщин с генотипом *Г*7локуса г$685408 гена РСР2 уровень МПКТ шейки бедра статистически значимо ниже по сравнению с носителями генотипа *Т*С (р=0,034), однако не достигает ассоциации со сниженными показателями МПКТ на уровне остеопении или остеопороза.

ZNF23P тЛ "C*frs№ 793 442)

г 1 S

7T>DS2*CrmTtrsI0OS>84 7O) TPD52 "Tfrs I 0098470) ZNF239 -A "C(rs10793442) ZNF2 39-A(rs10 793442) ZNF239 -Л *C(rs ¡O793442) ZNF239"Mrs l О793442)

l-OX-I.-t.~9 1.16-3.4S 95». ДН

Рисунок. 11. Полиморфные варианты сайтов, связывания микроРНК. ассоциированные с переломами и низким уровнем МПКТ.

Представленные результаты являются первыми шагами к пониманию роли полиморфизма сайтов связывания микроРНК в формировании низкого уровня МПКТ и развитии остеопоретических переломов у женщин постменопаузального возраста.

Репликация данных полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) Исследование консорциума по поиску генетических факторов остеопороза (GEFOS), который включал более 32000 образцов из 17 различных популяций и независимую выборку более 50000 человек для репликации исследований, является самым крупным GWAS исследованием остеопороза, опубликованным на сегодняшний день (Estrada et al., 2012). В этом исследовании выявлено 56 локусов в значительной степени ассоциированных с МПКТ, 14 из которых были также ассоциированы с переломами. Мы участвовали в исследовании международного консорциума «GEFOS» в стадии репликации GWAS результатов.

Анализ 100 локусов, отобранных по результатам GWAS исследований, в выборках женщин из Волго-Уральского региона показал, что с переломами ассоциированы 5 локусов, один из которых (rs5926033) расположен в участке генома с неидентифицированным геном, два других - в регионах с открытой рамкой считывания (rs227584 и rs4869742), rsl63879 - вблизи гена белка 5, содержащего домен doublecortin, rsl3272568 - вблизи гена цАМФ-зависимой каталитической

протеннкиназы, ингибитор альфа (табл. 7). При разделении выборки в зависимости от этнической принадлежности женщин выявлено, что у татар генетическими маркерами повышенного риска развития переломов оказались локусы rs6959212 вблизи гена белка 3, содержащего старт домен, активирующий гены, участвующие в биосинтезе холестерина, rsl566045 в гене гомолога регион-специфического гомеозисного гена дрозофилы spalt, rs7812088 в гене АТФ-связывающего белка, участвующего в энергозависимых транспортировках разнообразных субстратов через мембраны и rs2016266, расположенного в гене транскрипционного фактора SP7, регулирующего дифференцировку костных клеток.

У женщин русского происхождения с переломами ассоциированы локусы rs2295294 в гене убиквитинового фактора Е4, являющегося сигналом протеолитической деградации, rs4820539 в гене RTDR1 (rhabdoid tumor deletion region gene 1), rsl864325 вблизи гена тау-белка — гиперфосфорилированного белка внутри нейронов, нарушающего их деятельность и структуру, rs4957742, локализованного рядом с геном лиганда 7 рецептора тирозинкиназы ЕРН, мембранного белка, координирующего рост, дифференцировку и формирование практически всех органов и тканей, в том числе костной, rs12995369 в гене циклин-зависимой киназы 15, участвующего в смене фаз клеточного цикла и регуляции транскрипции и процессинга мРНК, а также локусы, расположенные ' в участках с неидентифицированными генами: rsl7284960 (5q.34) и rsll788458 (9q31.3), последний из которых показал наибольший уровень статистической значимости (р=2х10"4) по сравнению с другими локусами.

При разделении выборки женщин на группы с остеопорозом, остеопенией и нормальными показателями МПКТ по Т-критерию, согласно рекомендациям ВОЗ, получены следующие результаты: обнаружена ассоциация локусов rs4 792909 гена склеростина, rsl286083 гена рибосомалыюй протеннкиназы s6, rsl026364 гена основного белка, содержащего домен спираль-петля-спираль как с остеопорозом, так и остеопенией в общей выборке женщин. При этом полиморфизм rs7217932 в гене SOX9, связывающегося с энхансером и активирующего ген COL2A1, оказался ассоциированным только с остеопорозом, а локусы rs964181, расположенный на X хромосоме в области гена антигена меланомы, семейство А4 (MAGEA4), rs430727 вблизи гена CTNNB1 катенина, участвующего в образовании цитоскелета, rs600231 рядом с геном SCYL1, подобной N-терминальной киназе - с остеопенией.

У русских женщин со сниженным уровнем МПКТ также ассоциированы локусы rs4792909, rs¡286083, rs7217932 и rs964181, кроме них локус rs5934507 вблизи гена FAM9B, расположенного на X хромосоме.

Таблица 7 - Локусы, ассоциированные с переломами по результатам репликации результатов 0\УА5 исследований

Выборки Гены Полиморфизм (Ж 95%ДИ Локус

общая выборка Неизвестный ген гя5926033*С 1,4 1,10-1,79 Хр22.11

гх5926033*С*С 1,74 1,05-2,89

ОСйС5 п163879*Т*Т 1,39 1,04-1,87 11р14.1

гэ163879*Т 1,27 1,02-1,59)

С17офЗ г.ч227584 *А 1,25 1,01-1,55 17ц21.31

п227584*А*А 1,53 1,14-2,06

С6оф7 гз4869742*Т 1,36 1,09-1,69) 6ц25.1

гя4869742*Т*С 1,51 1,12-2,04

РК1А г.ч13272568*С 1,24 1,00-1,53 8ц21.12

татары 5ТА1ЮЗКЬ п6959212*С 1,57 1,00-2,45 7р14.1

п6959212*С*С 1,89 1,05-3,38

БА1Ы гя15б6045*Т 2,04 1,02-4,11 16я12.1

п!566045*Т*Т 2,19 1,02-4,72

5Р7 г.ч20!6266*А 1,68 1,04-2,72 12Ч13.13

гх20!6266*А *А 1,86 1,04-3,34

АВСЕ2 п7812088*А 2,12 1,15-3,91 7я36.1

русские 11ВЕ4В г$2295294*А 1,38 1,08-1,77 1р36.22

ятти >\ч4820539*А 1,33 1,05-1,69 22ц 11.22

п4820539*А 1,67 1,18-2,35

МАРТ пч1864325*Т 1,48 1,03-2,14 17Ч21.31

ЕРМА5 г.ч4957742*С 1,36 1,02-1,80 5я21.3

Неизвестный ген 1788458*0 1,96 1,36-2,80 9Ч31.3

г.ч11788458*А*в 1,99 1-33-2,98

Неизвестный ген к17284960*С 1,48 1,15-1,90 5ц34

п!7284960*С*С 1,51 1,06-2,15

СОК ¡5 П12995369Ю 1,38 1,08-1,76 2Я33.1

У женщин татарской этнической принадлежности маркерами остеопороза оказались локусы ге7257450 в гене РЬУАР - плазмалемма-везикул-ассоциированного белка, гэ4817775 в гене карбонил-редуктазы СВКЗ, 1^4492531 в гене МАСЕЕ2 (антиген меланомы, семейство Е2), ге479336 в гене динамина ОА'МЗ, гх/3272568 вблизи гена цАМФ-зависимой протеинкиназы (РК1А), ге4820539 в гене ЯТИЯ! (ген 1

делецнонного региона рабдоидной опухоли) и rs730402 в гене цинковых пальцев BCL11A.

Некоторые из этих локусов или ОНП кластеры расположены в пределах или вблизи генов, которые кодируют белки, участвующие в системе RANK-RANKL-OPG, дифференциации мезенхимальных стволовых клеток, эндохондральном окостенении и Wnt сигнальном пути. Процесс дифференциации мезенхимальных стволовых клеток весьма актуален для костной ткани, т.к. мезенхимальные стволовые клетки являются мультипотентными стромальными клетками, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток, в том числе в остеобласты, хондроциты и адипоциты (Clarke В., 2008). Однако есть локусы, ассоциированные с низким уровнем МПКТ и остеопоретическими переломами, дня которых нет предварительных молекулярных или биологических знаний об их участии в скелетных фенотипах.

Мы провели анализ вариабельности МПКТ шейки бедра и поясничных позвонков в зависимости от генотипов изученных GWAS-локусов без учета Т-критерия, что позволяет оценить вклад ДНК-локусов в вариабельность МПКТ и в пределах нормальных показателей.

Выявлено, что генотипы полиморфных вариантов rsl878526 (2ql4.2), rs6830890 (4q25), rs4957742 (5q21.3), rs227584 (С17офЗ) и rs1053051 (C12orf23) связаны с вариабельностью уровня МПКТ шейки бедра, три из них расположены в участках генома с неидентифицированными генами, локус rsl053051 в гене с открытой рамкой считывания (C12orf23). Не обнаружено ассоциации данных локусов со сниженным уровнем МПКТ у женщин из ВУР в целом, так и с учетом их этнической принадлежности. Аллель *А и гомозиготный генотип *А*А полиморфизма rs227584 гена C17orf53 ассоциированы с переломами в общей выборке женщин из ВУР, тогда как у носителей генотипа *А*А наблюдается более высокий уровень МПКТ шейки бедра по сравнению с носителя генотипа *С*С и более низкий уровень по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа, что демонстрирует отсутствие прямой зависимости риска возникновения переломов от уровня МПКТ. Локус rs7257450, расположенный в гене PLVAR, ассоциированный с низким уровнем МПКТ у татар, демонстрирует тенденцию к статистически значимым различиям в вариабельности уровня МПКТ шейки бедра у носителей различных генотипов исследуемого локуса (рис. 12).

Остатьные локусы, использованные для репликативных исследований, не оказывали влияние на вариабельность МПКТ (г/см:) шейки бедра.

Анализ полиморфных вариантов генов-кандидатов показал, что из 48 локусов 23-х изученных генов на вариабельность уровня МПКТ шейки бедра влияют

полиморфные варианты rsl544410 (VDR). (СА)„ (CALCA), rsl801725 (CaSR) генов, участвующих в гомеостазе кальция.

rsl878526 1*6830890

СП

Kruskal-Wallis tes»: Н=6,114; р=0,047^

1 -.0

га

Kruskal-Wallis test: Н=6,877; р=0,032

СП

Kruskal-Wallis test: Н=б,091; р=0,048

Kruskal-Wallis test: Н=13,974; р =0,001

Kruskal-Wallis test: Н=7,587; р=0,023

Kruskal-Wallis test:

H=S

205; p=0,074

Meen □ Mean, SE TMeantSD

Рисунок 12. Анализ вариабельности уровня МПКТ шейки бедра в зависимости от генотипов 0\¥А8-локусов.

Генотипы полиморфных вариантов г.ч4233949 (2р16.2), гх 742 7438 (Зр24.1), г$2016266 (БР7), Ы796995 (С18оф9), гэ5952638 (ХрП.З) оказывают влияние на вариабельность поясничных позвонков у женщин из Волш-Уральского региона (рис.

13). Три из них расположены в участках генома с неидентифицированными генами, локусы гэ4796995 в гене с открытой рамкой считывания (С18ог/19), 2016266 в гене БР7, кодирующего специфический для костной ткани транскрипционный фактор, необходимый для дифференцировки остеобластов и формирования костей \Zh\i Р., 2012], были также ассоциированы с переломами у женщин татарской этнической принадлежности.

Кги5ка1-М/а1П5 1е51: Н=7,783; р=0,020

Кги5ка1-ШаШ51е5г: — Н=7,533; р=0,023

г »

■=Р

Кги5ка1-\Л/а1И5 1е51:: Н=11,471; р=0,003

СЗГ1

Кги5ка1^Л/а1П5 - Н=7,533; р =0,023

КгиБка^аШэ1ей: Н=5,888; р=0,053

КгигкаМЛ/аШБ 1ей: Н=9,231; р =0,0099

Рисунок 13. Анализ вариабельности уровня МПКТ поясничных позвонков в зависимости от генотипов С\¥А8-локусов.

Локус п3790160 в гене ЗАО! имеет тенденцию к ассоциации с уровнем вариабельности поясничных позвонков. Не обнаружено ассоциаций с низким уровнем МПКТ локусов, влияющих на вариабельность уровня МПКТ поясничных позвонков.

Таким образом, в результате анализа всех изученных локусов обнаружена связь генотипов полиморфных вариантов rsl544410 (VDR), (СА)„ (CALCA), rsl801725 (CaSR), rsl878526 (2ql4.2), rs6830890 (4q2S), rs4957742 (5q21.3) и rsl053051 (C12orf23) с вариабельностью уровня МПКТ шейки бедра, rs9630182 (РТН), rs4233949 (2р16.2), rs7427438 (Зр24.1), rs2016266 (SP7) и rs7326472 (13ql4.ll) -поясничных позвонков.

Поиск ассоциаций изученных локусов с переломами различных отделов скелета

Перелом является гетерогенным фенотипом не только с точки зрения клинических проявлений, но и с точки зрения фактсров риска, что, вероятно, связано с различиями в структурных параметрах костей и приходящимися на них функциональными нагрузками.

В исследованной нами выборке женщин чаще всего наблюдались переломы лучевой кости (40,5%), переломы позвонков встречались у 13,2% женщин с переломами, бедра и шейки бедра - 11,2%, на долю других типов переломов приходилось 35,1%. У 16 человек (4,5%) выявлены сочетанные переломы луча и позвонков, у 6 (1,7%) - луча и бедра и у одной женщины (0,2%) встречались переломы позвонков, бедра и лучевой кости. Таким образом, характерные для остеопороза переломы бедра, позвонков и лучевой кости чаще встречаются изолированно, а их сочетание является достаточно редким событием, что предполагает наличие генетических маркеров, характерных для отдельных видов переломов различных отделов скелета.

Проведенный нами поиск ассоциаций изученных локусов с переломами различных участков скелета выявил, что переломы бедра, его шейки и позвонков имеют наибольшее количество совпадающих генетических маркеров повышенного риска по сравнению с переломами других отделов скелета (табл. 8).

Так обнаружена значимость локусов rsl801197, rs6854081, rsl7054320, rs2234693, rs9340799, rs3736228, rs10048146 в формировании переломов, как шейки бедра, так и позвонков. При этом локусы rsl053051 и rsl3204965 были ассоциированы только с переломами позвонков, a rs3790160, rsl 1048046, rsl0835187 и rsl3413210 - с переломами бедра или шейки бедра. С переломами лучевой кости оказались ассоциированы совершенно другие локусы, такие как rsl 107946, rs9921222, rs5926033, rsl63879, rsl566045, rs17482952 и rsl3272568. При рассмотрении выборки женщин с любыми другими переломами, кроме вышеперечисленных, выявлено, что всего для трех полиморфных вариантов (rs4790881, rs5952638 и rsl0793442) обнаружены статистически значимые различия между больными контрольной группой.

Таблица 8 - Генетические маркеры переломов различных отделов скелета

Локус | Ген Аллель Х~ р СЖ(95%ДИ)

Переломы позвонков

^1801197 с.и.сн *С 4,389 0,036 1,64(1,03-2,63)

г$6854081 7,459 0,006 2,18(1,23-3.86)

7054320 РЬЕКНС! *Г 5,778 0.016 3,21 (1,18-8,77)

г$2234693 ЕЯМ *А 4,033 0,045 1,72(1,01-2,94)

п9340799 *Т 4,458 0,035 1,69(1.03-2.78)

гз3736228 Ш'5 *Г 4.644 0,0312 1,92 (1,05-3,51)

г.ч 10048146 гохи *С 4.213 0.040 1.67(1,02-2,75)

гз1053051 С12огПЗ *С 5.932 0.015 1,84(1.12-3,03)

гэ 13204965 Я8РОЗ *А 4.038 0,045 1,99(1,01-3,94)

Переломы бедра и шейки бедра

п1801197 СА1СК *С 4,006 0,045 1,59(1,01-2,53)

гя6854081 ЕСЕ2 *С 8.577 0,003 2,26(1,29-3,96)

ге17054320 РЬЕКНС! *т 4,876 0,027 2,82(1,08-7,38)

п2234693 ЕЪШ *л 3,965 0,047 1,70(1,00-2,89)

г.ч9340799 ЕЯШ *т 4,62 0,032 1.70(1,04-2,77)

гя3790160 ма *т 5,421 0,020 1,83 (1,09-3,07)

П10835187 ьше *т 5.389 0,020 1.96(1,10-3,48)

гз13413210 АЬК *с 6,292 0,012 2,26(1,18-4.33)

пЗ 736228 ЬИР5 *с 4,425 0.035 4.08 (0,89-16.82)

П10048146 г ох и *А 6.734 0,009 2.93 (1,25-6,87)

Ш4869742 С6оф7 *т 7,136 0,008 1.98(1.19-3,30)

Переломы луча

п9921222 АХ1\<1 *с 6,672 0,010 1,44(1.09-1.91)

п5926033 Хр22.31 *с 8.651 0,003 1,57(1,16-2,13)

>■3163879 ОСОС5 *т 6,552 0,011 1.48(1,09-2,01)

к1566045 ЬАШ *т 4,399 0,036 1,72(1.03-2,86)

Г517482952 КХ5 *с 6.513 0,011 1,85(1,15-2,99)

п13272568 РК1А *с 8,919 0,003 1.54(1,16-2,07)

п1107946 СОЫА1 9.958 0.002 1,82(1.25-2.66)

Любые другие переломы

гз4790881 •ШС6 *А 4,328 0.038 1,37(1,02-1,84)

г$5952638 йЬ8Р21 *А 4.057 0,044 1,78(1,01-3,14)

гз10793442 г№239 *А 6.239 0,013 1.58(1,11-2,26)

Полученные результаты свидетельствуют, что переломы являются генетически гетерогенным фенотипом остеопороза и требуется дальнейшее углубленное изучение независимых этнически гомогенных выборок с изолированными случаями переломов отдельных участков скелета, для подтверждения полученных нами результатов.

Мета-анализ результатов исследования ассоциаций с переломами

Мы провели мета-анализ результатов исследования ассоциаций полиморфных вариантов кандидатных локусов остеопороза с развитием переломов у женщин татарской и русской этнической принадлежности из ВУР. Результаты представлены в

таблице 9. Используя мета-анализ, удалось обнаружить статистически значимые ассоциации локусов rs2228570, rs3102734, rs5926033, rsl63879, гетерогенности по всем этим локусам между татарами и русскими не обнаружено. Для локуса rs2228570 при мета-анализе увеличилась статистическая мощность и различия, которые не достигали статистической значимости при анализе в таблице сопряженности 2x2, стали значимыми. По локусам rs3134069 и rsl0793442 выявлена высокая гетерогенность выборок (12>50%) и мы применили значения рандомизированного р (P(R)), для модели со случайным эффектом, которые не показали значимость этих локусов для общей выборки женщин из ВУР и оказались этноспецифичными маркерами для татар.

Таблица 9 - Локусы, ассоциированные с переломами у женщин из ВУР

Полиморфизм ген Модель с фиксированным эффектом Модель со случайным эффектом Q I2,%

Р OR P(R) OR

rs163879 DCDC5 0,015 0,76 0,015 0,76 0,933 0,00

rs5926033 Xp22.11 0,013 1,94 0,013 1,94 0,679 0,00

rs3102734 TNFRSFUB 0,029 0,65 0,296 0,64 0,268 18,44

rs3134069 TNFRSF11B 0,013 0,60 0,088 0,53 0,118 59,13

rs10793442 ZNF239 0,007 1,48 0,175 1,56 0,027 79,70

rs2228570 VDR 0,023 0,76 0,023 0,76 0,333 0,00

Поиск прогностических моделей развития переломов

Для интеграции полученных статистически значимых ассоциаций, а также для выявления связи между качественными и количественными признаками проведен многофакторный логистический регрессионный анализ, который позволил выявить наиболее значимые факторы, определяющие остеопоретические переломы в целом и отдельно наиболее тяжелые переломы - позвонков и шейки бедра. Получена регрессионная модель, состоящая из полиморфных вариантов rs4869742 и rs3736228, а также ИМТ (BMI) для переломов бедра и rs3134069, rs4869742 и уровня МПКТ шейки бедра для переломов в целом (рис. 14).

А ------------- Б

Рис. 14. КОС-кривая уравнения логистической регрессии (А-переломы в целом, АиС=0,677; Б - переломы бедра, АиС=0,741; В - переломы позвонков, АиС=0,746).

С целью определения качества полученной модели прогнозирования использовался ROC (Receiver Operating Characteristic) - анализ, определялись чувствительность и специфичность модели, а также показатель AUC (Area Under

Curve) - численный показатель площади под ROC-кривой.

***

Таким образом, проведенное исследование моногенных и многофакторных форм метаболических остеопатий позволило выявить генетические маркеры, общие для двух эндофенотипов остеопороза, так и специфические для переломов и низкого уровня МПКТ (рис. 15), а также определяющие вариабельность уровня МПКТ поясничных позвонков и шейки бедра и формирующие переломы различных отделов скелета.

DBP CALCA TPD52 AAGAB (FLJ11506). FCF2 / VBE4B / МАРТ I

EFNAS I

9<,31.3

':,/./ I

SPF7 I STAKD3NI \ SALL1 \ Xp21.ll > DCDC5 C17orfS3 C6oif9 7

LSRI

Laps COLI 1 Al RPS6KAS SÖST

{magea2

I FAM9B I SOX9

CBR3 PLVAR DNM3 BCL11A KIAA20JS CDK1S

COL1A1

TNFRSF11B

СГР19А1

PKIA

Остеопороз

Переломы Ншкий уровень

МПКТ

Рисунок. 15. Гены, вовлеченные в формирование остеопоретических переломов и низкого уровня МПКТ у женщин постменопаузального возраста из ВУР.

Выводы

1. На основе анализа генов COLI Al, COL1A2, LEPRE 1, PPIB, CRTAP и CRTAP в 28,57% семей больных незавершенным остеогенезом из Республики Башкортостан установлена причина заболевания. Идентифицировано 11 мутаций в генах COLI AI, LEPRE1, CRTAP и CRTAP; 5 из них описаны впервые: c.967G>T (p.Gly323X) и c.3540_3541insC (p.Glyl 181AlafsX293) - в гене COL1A1, c,1724+4G>A - в гене LEPRE 1, с.641Т>С (p. Val2I4Ala) - в гене CRTAP, c.913C>G (p.Leu305Val) - в гене SERPINF1.

2. Мутация с.579de!T (p.Glyl94Va!fsX71) в гене COL1A1 идентифицирована в двух неродственных семьях, остальные мутации являются уникальными для каждой семьи. Установлено, что семь мутаций ответственны за аутосомно-доминантные формы

незавершенного остеогенеза, три возникли de novo, мугацин с.641Т>С (p.Yai214Ala) в гене CRTAP и c.913C>G (p.Lcu305Va¡) в гене SERPINF1 в компаунд-гетерозиготном состоянии обусловливают заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования.

3. Идентифицировано 37 полиморфных вариантов в генах COLI Al, COL1A2, LEPRE1, PPIBI, CRTAP, SERP1NF1, три из которых - C.544-240T и c.957+10¡nsA в гене COL1A1, c.l 153-78G>A в гене CRTAP - описаны впервые и являются уникальными. Большинство обнаруженных вариантов имеют нейтральный характер, аллель *G полиморфного локуса rsl7639446 и гаглотип *TJel локусов rsl800012 и rs2412298 гена COLI Al являются маркерами повышенного риска НО.

4. В результате анализа генов-кандидатов остеопороза установлено, что на формирование переломов оказывают влияние полиморфные варианты rs3134069 и rs3102735 гена TNFRSR11B - в общей выборке женщин, rs2228570 гена VDR, (ТААА)„ гена DBP - у женщин русской этнической принадлежности, rs3134069, rs2073618, rs3102734 гена OPG и rs2234693 гена ESR1, (СА)„ гена CALCA - у женщин татарской этнической принадлежности.

5. На формирование низкого уровня МПКТ в общей выборке женщин влияют полиморфные варианты генов-кандидатов COLI Al (rs180012, rs2412298), TNFRSF1 IB (rs3102734), PTH (rs7125774), у женщин русской этнической принадлежности -COLI Al (rsl80012 и rs2412298), TNFRSF1 IB (rs3102735), у женщин татарской этнической принадлежности -CYP19A1 (rsl062033, (TAAA),J TNFRSF1 IB (rs3134069, rs3102734).

6. Установлена ассоциация полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК с переломами: rsl0793442 (ZNF239) - у женщин татарской, rsl0098470 (TPD52) - русской этнической принадлежности. С низким уровнем МПКТ ассоциирован локус rs]0793442 (ZNF239) в общей выборке и у женщин русской этнической принадлежности.

7. В результате репликатнвного исследования GWAS-локусов выявлены маркеры повышенного риска развития переломов у женщин Волго-Уральского региона: 7-S4869742 (C6orf97), rs5926033 (Хр22.11), rsl63879 (DCDC5), rs227584 (С17офЗ) , rsl3272568 (РК1А), rs4869742 (C6orj97); у женщин русской этнической принадлежности - rs2295294 (UBE4B), rs4820539 (RTDR1), rsl864325 (МАРТ), rs4957742 (EFNA5), rsl2995369 (CDК15): rsl 7284960 (5q.34) и rsl1788458 (9q31.3); у женщин татарской этнической принадлежности - rs6959212 (STARD3NL), rsl566045 (SALL1), rs7812088 (ABCF2) rs2016266, SP7.

8. Обнаружена ассоциация GWAS-локусов с низким уровнем МПКТ: в общей выборке женщин - rsl286083 (RPS6KA5), rs721 7932 (SOX9), rs4792909 (SÖST), rs964181 (MAGEA4), rs5934507 (FAM9B), rs60023i (SCYL1), rs430727 (CTNNB1), у русских женщин - rs4792909 (SÖST), rsl286083 (RPS6KA5), rs7217932 (SOX9), rs96418l (MAGEA4), rs5934507 (FAM9B), у женщин татарской этнической

принадлежности - MAGEE2 (rs449253l), CBR3 (rs48l7775), PLVAR (rs725 7450), DNM3 (rs479336), PK1A (rsl3272568), RTDR1 (rs4820539), BCL11 (rs730402).

9. Обнаружено влияние полиморфных вариантов генов VDR (rsl544410), CALCA ((CA),), CaSR (rsl801725), локусов rsl878526 (2ql4.2), rs6830890 (4q25), rs4957742 (5q21.3) и rs!053051 (Cl2orj23) на формирование вариабельности уровня МПКТ шейки бедра, РТН (rs9630182), SP7 (rs2016266), rs4233949 (2р16.2), rs7427438 (Зр24.1) и rs7326472 (13ql4.11) - поясничных позвонков.

10.Установлена ассоциация полиморфных вариантов генов CALCR (rsl801197), FGF2 (rs6854081), PLEKHG1 (rsl 7054320), ESRl(rs2234693, rs9340799), LRP5 (rs3736228), FOXL1 (rsl0048146) с переломами позвонков и бедра, C12orJ23 (rsl053051), RSP03 (rsl3204965) - с переломами позвонков, JAG1 (rs3790160), 1FLTD1 (rsl 1048046), LIN7C (rsl0835187), ALK (rsl3413210), C6orfi>7 (rs4869742) -бедра, AXIN1 (rs9921222), Xp22.31 (rs5926033), DCDC5 (rsl63879), SALL1 (rsl566045), WLS (rsl7482952), PKIA (rsl3272568), COL1A1 (rsll07946) - лучевой кости, SMG6 (rs4790881), DUSP21 (rs5952638), ZNF239 (rsl0793442) - с любыми другими переломами.

11.В результате мета-анализа установлены ассоциации локусов rs2228570 (VDR), rs3102734 (TNFRSF1 IB), rs5926033 (Xp22.U), rsl63879 (DCDC5) с переломами в целом у женщин постменопаузального возраста татарской и русской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона. Локусы rs3134069 (TNFRSF11B) и rsl0793442 (ZNF239) являются этноспецифичными маркерами риска возникновения переломов для женщин татарской этнической принадлежности.

12.Выявлены регрессионные модели, прогнозирующие развитие переломов различных участков скелета: локусы rs4869742 (C6orJ97), rs3736228 (LRP5) и индекс массы тела (ИМТ) прогнозируют развитие переломов бедра с вероятностью 74,1%; rs3134069 (OPG), rs4869742 (C6orJ97), rsl0048146 (FOXL1) и возраст - переломы позвонков (74,6%); rs3134069 (OPG), rs4869742 (C6orf97) и уровень МПКТ шейки бедра - переломы в целом (67,7%).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Попова С.Н. ПЦР-анализ микросателлитных ДНК-маркеров: возможность ошибочного определения генотипов / С.Н. Попова, М.И. Шадрина, Р.И. Фатхлисламова (Хусаинова), Э.К. Хуснутдинова, П.Л. Сломинский // Генетика. - 1998. - №6. - С. 843-845.

2. Хуснутдинова Э.К. Генетические расстояния и таксономический анализ популяций народов Волго-Уральского региона по данным о полиморфизме ДНК / Э.К. Хуснутдинова, U.M. Хндиятова, Т.В. Викторова, Р.И. Фатхлисламова (Хусаинова), А.Р.Галеева, С.А. Лимборская // Генетика. - 1999. - .М<7. - С. 843-848.

3. Хуснутдинова Э.К. Оценка относительного вклада европеоидного и монголоидного компонентов в формирование народов Волго-Уральского региона по данным полиморфизма ДНК / Э.К. Хуснутдинова, Т.В. Викторова, Р.И. Фатхлисламова (Хусаинова), А.Р. Галеева // Генетика. - 1999. - №8. - С.887-893.

4. Хусаинова Р.И. Генетическая структура народов Волго-Уральского репюна и Средней Азии по данным ALU полиморфизма / Р.И. Хусаинова, В.Л. Ахметова, И.А., Кутуев, Ю.Б. Лебедев, Э.К. Хуснугдинова // Генетика. - 2004. - № 4. - С. 443-450.

5. Хуснугдинова Э.К.Этногеномика Тюрских и Финноязычных народов Волго-Уральского региона, Средней Азии и Северного Кавказа / Э.К. Хуснугдинова, И.А. Кутуев. Р.И. Хусаинова, МА. Бермишева, B.J1. Ахметова, Р. Виллемс //Медицинская генетика. - 2004. - № 6. - С.259-269.

6. Мурзабаева С.Ш. Генетический мониторинг врожденных пороков развития в Республике Башкортостан / С.Ш. Мурзабаева, А.К. Марданова, Р.В. Магжанов, Н.Х. Давленуров, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснугдинова // Медицинская генетика. - 2005. - № 9. -С.425-431.

7. Kutuev 1. From East to West: patterns of genetic diversity of populations living in four Eurasian regions /. 1. Kutuev, R. Khusainova, A. Karur.as, B. Yunusbayev, S. Fedorova, Y. Lebedev, G. Hunsmann, E. Khusnutdinova // Hum Hered. - 2006. - V. 61 (1). - P. 1 -9.

8. Селезнева Л.И. Генетические аспекты остеопороза / Л. Селезнева, Р. Хусаинова, Э. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2006. - Т.5.- № 12. - С. 3-12.

9. Хуснутдинова Э.К. Этногеномика и филогенетические взаимоотношения народов Евразии / Э.К. Хуснутдинова, И.А. Кутуев, Р.И. Хусаинова, Б.Б. Юнусбаев, P.M. Юсупов, Р. Виллемс // Информационный вестник ВОГнС. - 2006. - Т. 10. - № 1. - С. 24-40.

10. Зинченко P.A. Медико-генетическое изучение населения Республики Башкортостан. Сообщение II. Разнообразие наследственной патологии в трех районах Республики / P.A. Зинченко, A.A. Морозова, В.А. Галкина, И.М. Хидиятова, О.В. Хлебникова, А.Б. Кононов, В.П. Федотов, Р.И. Хусаинова, В.Л. Ахметова, Л.У. Джемилева, O.A. Щагнна, Э.К. Хуснугдинова, Е.К.Гинтер // Медицинская генетика. -2007. - Т.6. - №7. - С. 18-25.

П.Селезнева Л.И. Анализ ассоциаций полиморфизмов и гаплотипов 5' региона гена COL1A1 с риском развития остеопоретических переюмов у женщин Волго-Уральского репюна России / Л.И. Селезнева, Р.И. Хусаинова, Р.З. Нурлыгаянов, Э.А. Фазлыева, К.П. Усенко, О.М. Лесняк, Э.К. Хуснутдинова// Генетика. - 2008. - №2. - С.219-225.

12. Хусаинова Р.И. Исследование ряда полиморфных ДНК-локусов генов-кандидатов остеопороза в трех этнических группах Республики Башкортостан / Р.И. Хусаинова, Л.И. Селезнева, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2008. - Т.7. - №6. - С. 36-42.

13. Селезнева Л.И. Ассоциация полиморфного варианта (СА)„ гена кальцитонина (CALCA) с риском развития постменопаузального остеопороза и уровнем кальцитонина в сыворотке крови у русских женщин Волго-Уральского региона России / Л.И. Селезнева, Р.И. Хусаинова, Р.З. Нурлыгаянов, Э.А. Фазлыева, Е.В. Кожемякина. О.М. Лесняк, Э.К. Хуснутдинова // Остеопороз и остеопатии. - 2009. - №2. - С. 15-21.

14. Хусаинова Р.И. Изучение молекулярно-генетических основ развития постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе / Р.И. Хусаинова, Л. Селезнева, Р. Валиев, Э. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2009. - №8. - С. 12-19.

15. Хусаинова Р.И. Роль полиморфных вариантов ггна рецептора эстрогена-a (ESR1) в развитии постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе России / Р.И. Хусаинова, Л.И. Селезнева, Э.А. Фазлыева, с соавт. /' Якутский медицинский журнал. -2009. - №2 (26). - С.96-99.

16. Надыршина Д.Д. Современное состояние клинико-генетических аспектов несовершенного остеогенеза / Д.Д. Надыршина, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2010. -№4. - С. 12-21.

17. Хидиятова И.М. Популяционное исследование структурных особенностей генов моногенных заболеваний в Республике Башкортостан / И.М. Хидиятова, В.Л. Ахметова, Р.И. Хусаинова с соавт. // Медицинская генетика. 2011. - Т. 10. - №6 (108). - С. 13-23.

18. Надыршина Д.Д. Исследование а 1 цепи коллагена 1 типа (COL1A1) у больных несовершенным остеогенезом / Д.Д. Надыршина, P.II. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Генетика. - 2012. - Т 48. - № 3. - С. 372-380.

19. Estrada К. Genome-wide meta-analysis identifies 56 bone mineral density loci and reveals 14 loci associated with risk of fracture / K. Estrada, U. Styrkarsdottir, E. Evangelou, ... R. Khusainova, ... E. Khusnutdinova, ... F. Rivadeneira. GEFOS Consortium (Collaborators 181). // Nature Genetics. - 2012-V.44(5).-P.491-501.

20. Liu C.T. Assessment of gene-by-sex interaction effect on bone mineral density / C.T. Liu, K. Estrada, L.M... R.I. Khusainova,... E.K. Khusnutdinova, ... Hsu YH. GEFOS Consortium (Collaborators 90) // J Bone Miner Res. - 2012. - V. 27 (10). - P. 2051 -64.

21. Хусаинова Р.И. Поиск мутаций в гене COLIAI у больных несовершенным остеогенезом из Республики Саха (Якутия) / Р.И.Хусаннова, Д.Д. Надыршина, И.Р. Гилязова, С.П. Алексеева, А.Н. Ноговицына, A.JI. Сухомясова, С.А. Федорова, Э.К. Хуснутдинова // Якутский медицинкии журнал. - 2012. - №3 (39). - С. 39-41.

22. Боринская С.А. Ассоциация генотипа СС по полиморфизму LCT-13910C/T в регуляторном участке гена лактазы с возрастным снижением минеральной плотности кости / С.А. Боринская, А.В. Сафонова, А.Н. Пстрнн, С.Д. Арутюнов, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова с соавт. // Медицинская генетика. - 2012. - №10. - С.17-23.

23. Надыршина Д.Д. Исследование а 1 цепи коллагена 1 типа (COL1A1) у больных несовершенным остеогенезом / Д.Д. Надыршина, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Генетика. - 2012. - Т. 48. - № 3. - С. 372-380.

24. Надыршина Д.Д. Молекулярно-генетические основы несовершенного остеогенеза / Д.Д. Надыршина, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2013. -№6. -С. 15-23.

25. Хусаинова Р.И. Роль микроРНК в развитии остеопороза / Р.И. Хусаинова, А.В. Мальцев, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2013. - № 11. - С.3-11.

26. Хусаинова Р.И.Поиск ассоциаций полиморфизма (ТААА)п гена витамин D связывающего белка (DBP) с развитием остеопороза в Волго-Уральском регионе России / Р.И. Хусаинова, Л.И. Селезнева, А.В. с соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - №2. - С. 218-222.

27. Хусаинова Р.И. Исследование полиморфизма сайтов связывания микроРНК у больных постменопаузальным остеопорозом / Р.И. Хусаинова, А.В. Мальцев, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2014. - № 2. - С.9-18.

28. Тюрин А.В. Поиск ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора витамина Д (VDR) с остеоартритом и дисплазией соединительной ткани / А.В. Тюрин, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2014. - №8. - С. 18-26.

29. Хусаинова Р.И. Современные представления о генетических аспектах остеопороза / Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2014. - № 4. - С.20-29.

30. Марычева Н.М. Несовершенный остеогенез: внутрисемейный клинический полиморфизм этиологической единой формы заболевания / Н.М. Марычева, Д.Д. Надыршина, Р.И. Хусаинова, Н.А.Жученко, А.Ю.Асанов // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. - 2014. - №6. - С. 198-199.

31. Хусаинова Р.И. Молекулярно-генетические основы остеопороза / Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Биомика. - 2014. - Т.6 - №1. - С.24-51.

32. Хусаинова Р.И., Надыршина Д.Д., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетическое изучение несовершенного остеогенеза. / в кн. Этногеномика народов Центральной Евразии: структура генофонда и молекулярно-генетические основы наследственной патологии / Под редакцией Хуснутднновой Э.К. - Уфа «Гилем». - 2014. — С. 150-160.

33. Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Поиск генетических маркеров предрасположенности к остеопорозу. / в кн. Этногеномика народов Центральной

Евразии: структура генофонда и молекулярно-генетическне основы наследственной патологии Под редакцией Хуснутдиновой Э.К. - Уфа «Гилем». - 2014. - С. 210-226.

Патент

Патент на изобретение №2526189 «Способ прогнозирования риска возникновения переломов». Регистрационный номер 2012140862. Зарегистрирован 25 нюня 2014 г. Надыршина Д., Хусаинова Р., Селезнева Л., Шакирова Р., Мальцев А., Хуснутдинова Э.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

имт индекс массы тела

мпкт минеральная плотность костной ткани

мск мезенхимальные стволовые клетки

НО незавершенный остеогенез

ОБ остеобласт

ок остеокласт

оп остеопороз

ПДРФ полиморфизм длин рестрикцнонных фрагментов

пп поясничные позвонки

ШБ шейка бедра

З'-НТО 3' - нетранслируемая область гена

полиморфизм сайтов связывания микроРНК

95% ДИ доверительный интервал

САЬСА кальцнтонин

слься рецептор кальцитонина

САБЯ рецептор чувствительности к кальцию

СИУз варианты количества копий

СОЫА1 альфа-1 цепь коллагена первого типа

СОЫА2 альфа-2 цепь коллагена первого типа

СИТАР хрящ-ассоциированный белок

ОВР витамин Д-связывающий белок

БЕХА двуэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия

ЕБЯ рецептор эстрогенов

GWAS полногеномный анализ ассоциаций

ЬЕРЯЕ1 пролил-3 гидроксилаза 1

белок 5, ассоциированный с липопротеином низкой

ОЯ плотности

Ро1у1ш11Т8 - отношение шансов

РР1В полиморфизм сайтов связывания микроРНК

РТН пептндил-пролил цис-транс изомераза В

5Е1ШЫР1 - паратиреоидный гормон

БИР, ОНП - ингибитор серпинпептидазы Р1

УБЯ анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК

рецептор витамина Д

Подписано в печать 27.01.15 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №03. Гарнитура «Тнпе5№\уЯотап». Отпечатано в типографии ИИЯЛ УНЦ РАН г.Уфа, пр. Октября, 71. Тел. 8(347)235-60-50

Информация о работе

Хусаинова, Рита Игоревна
доктора биологических наук
Уфа, 2015
ВАК 03.02.07

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярно-генетические основы метаболических остеопатий ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические основы метаболических остеопатий"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические основы метаболических остеопатий
ВАК РФ 03.02.07, Генетика