Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование генетических факторов развития постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетических факторов развития постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе"

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РАЗВИТИЯ ПОСТМЕНОПАУЗАЛЬНОГО ОСТЕОПОРОЗА В ВОЛГО-УРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 СЕН 2014

Уфа-2014

005552685

005552685

Работа выполнена на кафедре генетики и фундаментальной медицины ФГБОУ ВГ10 Башкирского государственного университета совместно с лабораторией молекулярной генетики человека ФГБУН Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Хуснутдинова Эльза Камилевна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Асанов Алий Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор

Спицын Виктор Алексеевич доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится «_

заведующий кафедрой медицинской генетики ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России

заведующий лабораторией экологической генетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН

ФГБУН Институт общей генетики Н.И. Вавилова РАН

2014 г. в« »часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71 и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ PAH:ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «_»

2014г.

Ученый секретарь /)

диссертационного совета, к.б.н с-м- Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. ! Всемирной организацией здравоохранения предложено определение остеопороза (ОП) как системного заболевания скелета, характеризующегося снижением плотности костной ткани и нарушением микроархитектоники с последующим повышением хрупкости костей и учащением риска переломов (ВОЗ, 1993). В основе патогенеза ОП лежит нарушение механизма костного ремоделирования, который протекает в течение всей жизни человека в костной ткани, с превалированием процессов костной резорбции над процессом костеобразования. В результате происходит деминерализация костного матрикса, деградация костной ткани, что влечет за собой повышение хрупкости костей и, как следствие, повышенный риск низкотравматичных переломов. Риску развития ОП наиболее подвержен контингент женщин в постменопаузальный период жизни. Это связано с изменением баланса половых гормонов, которые вовлечены в процессы костного ремоделирования. Около 40% женщин в период постменопаузы получают остеопоретические переломы (Audi et al., 1999). Локализация переломов может находиться в любой части скелета, наиболее опасным переломом считается перелом шейки бедра. Смертность в первые полгода после полученного перелома шейки бедра составляет 18%, а инвалидизация происходит более чем в 50% случаев (Tosteson et al., 2007). Оценка мировых тенденций показала, что только за счет старения населения земного шара частота переломов шейки бедра увеличится к 2050 г. в 2 раза (ВОЗ, 2003). В связи с тем, что развитие ОП протекает без симптомов и наличие заболевания определяется уже по факту полученного перелома, ОП называют безмолвной эпидемией. Таким образом, по мнению экспертов ВОЗ, ОП по эпидемиологической, научной, профилактической и клинической значимости стоит на четвёртом месте после инфекционной, сердечно-сосудистой, опухолевой и эндокринной патологий (WHO report, 1994).

Остеопороз является многофакторным заболеванием, на развитие которого влияют генетические и географические факторы, факторы окружающей среды, уровень физической активности, питание, наличие

вредных привычек. Многими исследователями была показана ключевая роль генетических факторов: так, индивидуальные вариации минеральной плотности костной ткани (МПКТ) на 50-85% зависят от генетических факторов (Sigurdsson et al., 2008; Ralston, 2010). В результате проведенных многочисленных научных работ во всем мире было выявлено около 150 генов-кандидатов, отвечающих за развитие ОП, причем, вклад каждого из генов составляет приблизительно 1-2%. Кроме того, в последнее время большое внимание уделяется эпигенетическим механизмам регуляции экспрессии генов, в частности, роли микроРНК в развитии ОП. Множество проведенных ранее работ позволяют пролить свет на понимание механизмов развития ОП (Ralston et al., 2006; Langdahl et al., 2008; Marini et al., 2010; Селезнева с соавт., 2006), однако многие результаты противоречивы и проблема генетической предрасположенности к остеопоретическим переломам и низкому уровню МПКТ до конца не изучена. Для полного понимания требуется проведение более детальных исследований, с учетом этнических и региональных особенностей различных популяций.

На основании вышеизложенного были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель работы: изучение молекулярно-генетических основ развития постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе России Задачи исследования:

1) Поиск генетических маркеров предрасположенности к переломам на основе изучения полиморфных вариантов

rs4988235 и rsl82549 гена лактазы (LCT), rsl801197 гена рецептора кальцитонина (CTR), rs1801725 гена рецептора чувствительности к кальцию {CASK), rs9630182, rs2036417, rs7125774 гена паратиреоидного гормона (РТН), rs7844539, rs3102734 rs2073617, rs3102735, rs2073618 и rs3134069 гена остеопротегерина (OPG, TNFRSF1 IB),

rs3020314, rs1514348 гена рецептора эстрогена 1 типа (ESR1), rs1062033, (TTTA)n гена араматазы (CYP19A1).

2) Анализ ассоциаций вышеперечисленных полиморфных локусов кандидатных генов с низким уровнем минеральной плотности костной ткани у женщин из Волго-Уральского региона.

3) Исследование эпигенетических факторов предрасположенности к остеопоретнческим переломам н формированию уровня МПКТ на основе анализа полиморфизма сайтов связывания мнкроРНК гх/0793442 гена 2Л7Г2.?9. гх6854081 гена ГСГС. \s2745426 гена ГТЛУ/. ^¡0098470 гена ТРИ52. гх¡0518716 гена РЕП 1506, г.ч17054320 гена РЬЕКНа. гя1712 гена ТВХ05.

4) Идентификация маркеров повышенного риска развития переломов и низкого уровня МПКТ у женщин татарской м русской этнической принадлежности.

5) Анализ ген-генных взаимодействий полиморфных локусов изученных генов и оценка их вклада в формирование переломов и уровня МПКТ у женщин с учетом их этнической принадлежности.

Научная новизна исследования. Впервые собрана коллекция ДНК женщин больных иостменопаузальным остсопорозом в Волго-Уральском регионе России. Впервые проведен анализ ассоциаций 17 полиморфных локусов в 7 генах кандидатах (С 77?. СаБЯ. ¿СТ. ЕБК1. СУР 19. ОРС. РТН) с риском развития переломов п низким уровнем минеральной плотносктп костной ткани (МПКТ) у женщин русской и татарской этнической принадлежности постменопаузального возраста, проживающих на территории Волго-Уральского региона России. Впервые проведено изучение полиморфизма сайта связывания мнкроРНК в 7 генах у женщин с остеопорозом и поиск ассоциаций изученных локусов с риском развития переломов и уровнем МПКТ. Выявлены генетические и эпигсиетнчекис маркеры повышенного и пониженного риска развития переломов и низкого уровня МПКТ. Установлены модели межгенных взаимодействий, участвующие в формировании предрасположенности к постмепопаузальному ОП и переломам с учетом этническое! принадлежности женщин.

Научно-практическая значимость. Представленные в работе результаты расширяют представления о молскулярпо-генетнческих основах

развития постменопаузального остеопороза, служат основой для разработки ДНК-диагностики заболевания, оптимальной для Республики Башкортостан и Волго-Уральского региона в целом. Полученные данные могут послужить основой для предиктивной медицины и разработки индивидуальных профилактических и лечебных мероприятий. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международной конференции европейского общества генетиков человека «European Human Genetics Conference» (Амстердам, 2011; Нюрнберг, 2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты

мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины и нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012), П и Ш Всероссийской школе-семинаре «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» (Уфа,

2012), конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск

2013), а также V Российском конгрессе по остеопорозу и другим метаболическим заболеваниям скелета (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из которых 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 315 страницах машинописного текста. Состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 179 таблицами. Список литературы включает 226 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. В работе использованы образцы ДНК 843 женщин постменопаузального возраста (от 40 до 84 лет), проживающих на территории Республики Башкортостан и Свердловской области. Забор крови осуществлялся на базе Городских клинических больниц № 5 и №21 г. Уфы и Областной клинической больницы №1 г. Екатеринбурга. Опрос проводился по специально составленному протоколу, включавшему в себя сведения о количестве имевшихся переломов, их локализации и характере травмы. Все женщины подписали информированное согласие на участие в исследовании. Выборка была разделена по этнической принадлежности и наличию переломов: русские - 547 индивидов (249 - с переломами; 298 - без переломов), татары -259 индивидов (91 - с переломами; 168 - без переломов). Все переломы были подтверждены рентгенологически. Оценка МПКТ шейки бедра и поясничного отдела позвоночника проводилась методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA) на аппарате QDR 4500А («Hologic», США). Согласно результатам денситометрического обследования, диагноз остеопороз был поставлен 224 женщинам (40,6%), остеопения - 145 (26,3%), а у 183 обследованных (33,1%) были нормальные показатели МПКТ (группа здоровые). Для диагностики ОП были использованы критерии ВОЗ (WHO, 1994), согласно которым к нормальным значениям МПКТ относятся показатели выше -1 SD от референтной базы данных по Т-критерию, значения от -1 SD до -2,5 SD классифицируются как остеопения, отклонение ниже -2,5 SD - как остеопороз.

Методы исследования. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Генотипирование полиморфных локусов rs1801197 гена CALCR; rs1801725 гена CASR; rs182549, rs4988235 гена LCT; rs3102735, rs3134069, rs2073617, rs2073618, rs7844539, rs3102734 гена OPG осуществлялось методом ПЦР-ПДРФ с последующим гидролизом ферментами рестрикции и электрофоретическим разделением фрагментов в 7% полиакриламидном геле (ПААГ) с визуализацией в ультрафиолетовом свете. Для генотипирования

полиморфизма (ТТТА)п повторов гена CYP19A1 применялся метод ПЦР с последующим электрофорезом в 8% ПААГ. Полиморфные локусы rsl0793442 гена ZNF239; rs!712 гена FBX05; rs10518716 гена FUI1506; rs100098470 гена TPD52; rsl7054320 гена PLEKHG1; rs2745426 гена VNN1; rs6854081 гена FGF2; rs9630182, rs2036417, rs7125774 гена PTH; rs3020314, rs1514348 гена ESR1; rsl062033 гена CYP19 были исследованы с помощью метода ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке на приборе Bio-Rad CFX96. Работа выполнена частично на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК». Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ "Statistica for Windows ХР", BIOSTAT (Primer of Biostatistics v.4.03), программного обеспечения Microsoft Excel 2003. Анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ выполняли с помощью программы Haploview v.4.2 (Barett et al., 2005). Анализ межгенных взаимодействий выполняли с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007; Chen et al., 2011). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в исследованных группах использовали критерий х2 (р) Для таблиц сопряжённости 2x2 с поправкой Йетса на непрерывность. Различия считались достоверными при уровне значимости Р<0,05. Силу ассоциаций с риском развития ОП и риском переломов оценивали в значениях показателя соотношения шансов (odds ratio, OR) (Schlesselman, 1982). OR>l рассматривали как положительную ассоциацию («фактор повышенного риска») и OR<l - как отрицательную ассоциацию («фактор пониженного риска»).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов кандидатов с остеопоретическилш переломами у женщин постменопаузального

возраста из Волго-Уральского региона России Риск переломов в значительной степени определен генетическими факторами, обуславливающими формирование уровня минеральной плотности

костной ткани (МПКТ), однако, ряд исследователей предполагают, что генетические факторы влияют на предрасположенность к переломам независимо от уровня МПКТ (Andrew, 2005; Ralston et al„ 2010). Мы провели поиск ассоциаций полиморфных вариантов rs7844539, rs3102734 rs2073617, rs3102735, rs2073618 и rs3134069 гена остеопротегерина (OPG, TNFRSF1 IB), rs9630182, rs2036417, rs7125774 гена паратиреоидного гормона (PTH), rs4988235 и rsl82549 гена лактазы (LCT), rs3020314, rs1514348 гена рецептора эстрогена 1 типа (ESR1), rsl801197 гена рецептора кальцитонина (CTR), rs1801725 гена рецептора чувствительности к кальцию (CASR), rs 1062033, (ТААА)„ гена араматазы (CYP19A1) с остеопоретическими переломами у женщин из Волго-Уральского региона (ВУР) в целом, а также в зависимости от их этнического происхождения.

В общей выборке женщин маркерами повышенного риска переломов оказались генотип *Т*Т полиморфизма rs3102734 гена OPG (х2=5,993; р=0,014; OR=l,63, 95% ДИ: 1,09-2,41), аллель *Т и генотип *Т*Т полиморфного варианта rs3134069 гена OPG (f=8,488; р=0,003; OR=l,76, 95% ДИ: 1,19-2,58 и х2= 10,361; р=0,001; OR=l,93, 95% ДИ: 1,28-2,9, соответственно), генотип *С*Т полиморфного варианта rsl801197 гена CTR (х2=5,185; р=0,022 OR=l,37; 95% ДИ: 1,04-1,81) (рис.1).

Рисунок 1. Маркеры повышенного риска развития переломов у женщин в общей выборке

У женщин русского происхождения маркерами повышенного риска развития переломов являются генотип *С*Т полиморфного варианта Г51801197 гена С77? (х2=0,389; р=0,002 <Ж=1,7; 95% ДИ:1,21-2,4), генотип *С*С

полиморфного варианта гз9630182 гена РТН (х2=4,565; р=0,032; (Ж=1,46; 95% ДИ: 1,03-2,08) (Рис. 2).

1 1.2 1.4 1.5 1.8

Рисунок 2. Маркеры повышенного риска развития переломов у женщин русской этнической принадлежности

У женщин татарской этнической принадлежности с риском переломов ассоциированы аллель *Г и генотип *Т*Т полиморфизма гэЗ102734 гена ОРв (Х2=4,002; р=0,045; СЖ=2,13; 95% ДИ: 1-4,56; х2=6,820; р=0,009; (Ж=3,02; 95% ДИ: 1,27-7,14, соответственно), аллель *Т и генотип *Т*Т полиморфизма пЗ134069 гена ОРв (х2=7,609; р=0,005; (Ж=3,06; 95% ДИ: 1,33-7,01 и х2=9,986; р=0,0015; (Ж=3,97; 95% ДИ: 1,6-94,59, соответственно), гаплотип *ТС по локусам гэ3102735 и ^3134069 (£ =5,865; р=0,015; СЖ=1,98; 95% ДИ: 1,113,51), генотип АЗ/12 полиморфизма (ТААА)„ повторов гена СУР19 (х2=6,621; р=0,010; (Ж=13,44; 95% ДИ: 0,68-263,33), генотип *Т*Т полиморфного варианта га3020314 гена ЕБЯ1 (Х2=3,885; р=0,048; 011=2,21, 95% ДИ: 0,98-4,93) (Рис. 3).

*ТТ г*3а2031<1 Е5М ДЗ/12 (ТААА)п СУР19 •Тв ОРй »Т*Тгь313406ЭОР6 *Т гэЗ 134069 ОРб *Т (&3102734 ОРб "Т'Тг&3102734 0РС

1 3 5 7 9 11 13 15

Рисунок 3. Маркеры повышенного риска развития переломов у женщин татарской этнической принадлежности

Г

Ид

1,331 С1Г)Ь-4!

ЭЕ9 4,!

■3,51

■ 1,6(05-91,519

7,019

Гаплотипический анализ показал, что гаплотип *Ю по локусам к3102735 и гэ3134069) гена ОРй является маркером повышенного риска развития остеопоретических переломов у женщин татарской этнической принадлежности (Рис. 4).

1 1 1 1 1 I 1 В ? \ \ 2 ? 1 Ё 1 1 I Б г з " " д 8 1 1 г ? ? ?

¡Block 1 (0 kb) 1 I 2 3 4 5 J б 52 N. 69 60 83 69 N.88 75 П> 66 N. 94 / 75 ^^ 88 42 I Block 1 (0 kb) I 1 2 3 4 L 5 6 J 52 69 60 0Э \ 89 ^^ 66 94 75 * 89 ' -: «7 ▼

Рисунок 4.

Анализ неравновесия по сцеплению (D') изученных локусов гена OPG.

Маркерами пониженного риска переломов являются генотип *С*Т полиморфизма rs3102734 гена OPG в общей выборке (х2=5,986; р=0,014; OR=C),6; 95% ДИ: 0,4-0,9) и у татар (х2=9,874; р=0,001; OR=0,23; 95% ДИ: 0,080,61), аллель *G и гетерозиготный генотип *T*G полиморфного варианта rs3134069 гена OPG в общей выборке (х2=8,488; р=0,003; OR=0,56; 95% ДИ: 0,38-0,83 и х2=11,513; р=0,0006; OR=0,49; 95% ДИ: 0,32-0,74, соответственно) и у татар (х2=7,609; р=0,005; OR=0,32; 95% ДИ: 0,14-0,74 и х2=11,706; р=0,0006; OR=0,2; 95% ДИ: 0,07-0,54, соответственно), гаплотип *CGTG по локусам rs3102734, rs2073617, rs2073618 и rs3134069 и *GG по локусам rs3102734, rs2073617 гена OPG у женщин татарской этнической принадлежности (Х2=6,099; р=0,014; OR=0,324; 95% ДИ: 0,12-0,85 и £=9,522; р=0,002; OR=0,252; 95% ДИ: 0,097-0,656, соответственно), генотип *С*Т локуса rs9630182 гена РТН (х2=4,763; р=0,029; OR=0,68; 95% ДИ: 0,48-0,96), у женщин русской этнической принадлежности.

Исследование полиморфных вариантов rs4988235 и rsl82549 гена LCT и rs1801725 гена CASR не обнаружило ассоциаций с переломами у женщин русской и татарской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона России.

Таким образом, выявлена значимость полиморфных вариантов генов OPG, CTR, ESR1, CYP19 и РТН в развитии остеопоретических переломов у женщин в постменопаузе из ВУР.

В GWAS исследованиях остеопороза регионы генов OPG, CYP19 и РТН были значимо ассоциированы с костными фенотипами (Styrkarsdottir, 2008; Richards, 2008; Estrada, 2012), мета-анализ консорциума "GENOMOS" продемонстрировал значимые ассоциации полиморфных вариантов гена ESR1 с риском переломов, независимых от уровня МПКТ (Ioannidis et al., 2004), что согласуется с полученными нами результатами.

Поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов кандидатов с уровнем МПКТ у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского

региона России

Уровень МПКТ - важный предиктор риска перелома, является одним из самых наследуемых признаков у человека. Результаты близнецовых и семейных исследований неизменно показывают, что до 80% вариабельности МПКТ обусловлено генетическими факторами (Nguyen, 1998; Pocock, 1987). Уровень МПКТ меняется с возрастом, и его возрастная вариация также находится под генетическим контролем (Makovey, 2007).

В результате проведенных нами исследований было установлено, что маркерами повышенного риска развития остеопороза у женщин татарской этнической принадлежности являются аллель *С (х2=5,145; р=0,023; OR=l,91; 95% ДИ: 1,08-3,36) и генотип *С*С (%2=7,324; р=0,006; OR=3,68; 95% ДИ: 1,389,75) полиморфного варианта rs2073618, аллель *Г(х2=4,813; р=0,028; OR=3,78; 95% ДИ: 1,068-13,43) и генотип *Т*Т (х2=5,333; р=0,020; OR=4,24; 95% ДИ: 1,15-15,61) полиморфного локуса rs3134069, аллель *Т (%2=4,204; р=0,04; OR=3,52, 95% ДИ: 0,98-12,56) и генотип *Т*Т (х2=4,629; р=0,031; OR=3,9; 95% ДИ: 1,05-14,42) полиморфного варианта rs3102734 гена OPG, генотип *С*С полиморфного варианта rsl062033 гена CYP19 (х2=4,044; р=0,044; OR=2,45; 95% ДИ: 1-5,97), генотипы АЗ/12 и 11/11 полиморфизма (ТААА)„ повторов (Х2=3,889; р=0,048; OR=8,16; 95% ДИ: 0,38-174,46 и х2=5,633; р=0,017; OR=9,43;

95% ДИ: 0,37-240,71, соответственно) (Рис. 5).

12

11/11 (ТААА)п СУР19

ЛЗ/12 (ТААА)п СУР19

гэюбгоззсурю

*Т*Т Г5310273юре

*Тге3102734 0РС

"Т*Т Г53134069 0Р6

*Т Г531340€9 ОРС

*С*С Г52073 618 0РС

*С Г52073618 оре

1зМ-°4

,364

12,98 !

08-5^970 .054 I 0,087-1 1.1 : .068-| 1,388-9

14.42 561

>3-15

13.43 .759

619

!

Рисунок 5. Маркеры повышенного риска развития ОП у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона в зависимости от их этнической принадлежности.

У женщин русской этнической принадлежности с ОП ассоциирован гаплотип *ССт локусов кЗ ¡02734, п-2073617, гх2073618 и пЗ 134069 гена ОРв (х2=5,815; р=0,016; 011=3,87; 95% ДИ: 1,17-12,76).

Обнаружены ассоциации генотипов *С*С (х2=4,169; р=0,041; 011=9,07; 95% ДИ: 0,46-171,13) полиморфизма пЗ102734 гена ОРв, *С*Т полиморфизма гэ 7125774 гена РТН (х2=5,344; р=0,020; ОЯ=1,7; 95% ДИ: 1,08-2,68) с остеопенией в общей выборке женщин из ВУР, полиморфизма гя3102735

гена ОРв (х2=4,782; р=0,028; 011=10.70; 95% ДИ: 0,58-195,94) и гаплотипа *СвТв локусов к3102734, г.ч2073617, п2073618 и ™3134069 гена ОРС (х2=6,157; р=0,013; 011=4,08; 95% ДИ: 1,24-13,49) у женщин русской этнической принадлежности, генотипов *С*С полиморфного локуса кЗ 134069 (х2=5,412; р=0,019; ОЯ=9,14; 95% ДИ: 0,35-232,73), *С*С полиморфного варианта га3102734 гена ОРС (х2=8,432; р=0,003; 011=15,97; 95% ДИ: 0,73346,36) и Д3/12 полиморфизма (ТААА)„ повторов (х2=5,633; р=0,017; ОЯ=9,43; 95% ДИ: 0,37-240,71) у женщин татарской этнической принадлежности (Рис. 6).

Рисунок 6. Маркеры повышенного риска развития остеопении у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона.

Риск остеопороза снижен у носителей генотипов С*Т полиморфного варианта га2073617 (х2=4,183; р=0,040; СЖ=0,66; 95% ДИ: 0,44-0,98) гена ОРС АЗ/8 полиморфизма (ТААА)„ повторов в гене СУР 19 (х2=4,280; р=0,038; (Ж=0,45; 95% ДИ:0,2-0,97) в общей выборке, аллелей Ю (х2=5,145; р=0,023; СЖ=0,52; 95% ДИ:0,29-0,91) полиморфного локуса га2073618, *С полиморфного варианта га3/02734 (х2=4,204; р=0,040; СЖ=0,28; 95% ДИ: 0,07-1,01),(х2=4,813; р=0,028; (Ж=0,26; 95% ДИ: 0,07-0,93), генотипов *ТЮ (Х2=5,333; р=0,020; (Ж=0,23; 95% ДИ: 0,06-0,86) полиморфного локуса гаЗ134069, *С*Т локуса гаЗ102734 гена ОРС (х2=4,629; р=0,031; (Ж=0,25; 95% ДИ: 0,06-0,94), *А*А локуса га/52549 гена 1СТ {£=3,929; р=0,047; (Ж=0,10; 95% ДИ: 0,005-1,96), аллеля *11 полиморфизма (ТААА)„ повторов в гене СУР19 со снижением риска ОП (х2=6,802; р=0,009; СЖ=0,38; 95% ДИ: 0,18-0,79) у женщин татарской этнической принадлежности, гаплотипа *ТСС локусов гя2036417, гэ9630182 и га7125774 гена РТН (х2=7,117; р=0,008; СЖ=0,31; 95% ДИ: 0,11-0,83) у женщин русской этнической принадлежности.

Проведенный нами анализ полиморфных локусов га/507797 гена СТЯ и га 1801725 гена СаБЯ не выявил статистически достоверных ассоциаций с уровнем МПКТ у женщин из ВУР.

Таким образом, обнаружена значимость полиморфных вариантов генов OPG, РТН, LCT, ESR1, CYP19 в формировании уровня МПКТ у женщин татарской и русской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона.

На сегодняшний день проведено более 25 работ с помощью подхода полногеномных исследований ассоциаций (GWAS) фенотипов, связанных с остеопорозом, которые идентифицировали почти 100 независимых ассоциаций, среди них гены, вовлеченные в RANK-RANKL-OPG пути (TNFRSF11B (OPG), TNFRSF11А и TNFSF11), Wnt-ß-катениновый путь (LRP5, LRP4 и SÖST), эндокринные пути (ESR1, РТН) и область 1р36 (ZBTB40), были в значительной степени ассоциированы с остеопорозом (Styrkarsdottir, 2008; Richards, 2008; Rivadeneira, 2009; Zheng, 2011; Estrada, 2012). В проведенном нами исследовании полиморфные варианты генов OPG, ESRI и РТН оказались ассоциированными с переломами и низким уровнем МПКТ у женщин русской и татарской этнической принадлежности, что подтверждает их значимость в патогенезе остеопороза в популяциях различного происхождения.

Анализ ассоциаций полиморфизма сайтов связывания микроРНК с остеопоретическими переломами и уровнем МПКТ

Исследованные нами локусы rsl0793442, rs6854081, rs2745426, rsl0098470, rsl0518716, rsl7054320, rsl712 располагаются в 3' нетранслируемой области генов ZNF239, FGF2, VNN1, TPD52, FUI 1506, PLEKHG1, FBX05 в предполагаемых сайтах связывания микроРНК, согласно базе данных полиморфизмов сайтов связывания микроРНК (ПССмикроРНК) (http://compbio.utmem.edu/miRSNP).

Проведенные нами исследования позволили идентифицировать маркеры повышенного риска развития переломов. Так, в общей выборке рисковым маркером являлся генотип *G*G полиморфизма rs6854081 гена FGF2 (х2=4,152; р=0,041; OR=6,88; 95% ДИ: 0,8-59,18). В выборке женщин русской этнической принадлежности обнаружена ассоциация аллеля *Т (х2=4,262; р-0,039; OR=3,64; 95% ДИ: 0,98-13,53) и генотипа *С*Т (Х2=4,310; р=0,037; OR=3,69;

95% ДИ: 0,98-13,79) полиморфного варианта п10098470 гена ТРВ52 с повышенным риском переломов (рис. 7).

Рисунок 7. Полиморфные варианты сайтов связывания микроРНК, ассоциированные с переломами у женщин в постменопаузе из ВУР.

В выборке женщин татарского происхождения маркерами повышенного риска переломов является генотип *Т*Т полиморфного варианта г.ч6854081 гена гота (х2=4,757; р=0,029; СЖ=9,56; 95% ДИ: 0,45-201,29) и *А*С полиморфного варианта га 10793442 гена 2Ш239 (х2=6,264; р=0,012; ОЯ=2; 95% ДИ: 1,15-3,47).

При разделении выборки согласно Т-критерию нами были определены значимые ассоциации с ОП: так, аллель *С (х2=4,139; р=0,041; (Ж=1,53; 95% ДИ: 1,01-2,32) и генотип *А*С (х2=4,714; р=0,029; 011=1,67; 95% ДИ: 1,04-2,65) полиморфного локуса га10793442 гена ZNF239 оказались маркерами повышенного развития ОП в общей выборке. В выборке русских маркерами повышенного риска развития ОП также оказались аллель *А (х2=5,908; р=0,015; 011=2,02; 95% ДИ: 1,13-3,60) и генотип *А*С (х2=5,813; р=0,015; ОЯ=2,18; 95% ДИ: 1,45-4,13) полиморфного локуса п!0793442 гена 2Ш239 (Рис. 8).

1 1,2 1.А 1.6 1,8 2 2.2

Рисунок 8. Полиморфные варианты сайтов связывания микроРНК, ассоциированные с остеопорозом у женщин в постменопаузе из ВУР.

Не выявлено статистически значимых ассоциаций изученных полиморфных локусов сайтов связывания микроРНК с остеопорозом у женщин татарской этнической принадлежности.

Генотип *С*С полиморфного варианта к10793442 в гене ХШ239 оказался протективным (х2=5,247; р=0,021; СЖ=0,52; 95% ДИ: 0,3-0,91) в отношении переломов и остеопороза (х2=4,81; р=0,028; (Ж=0,6; 95% ДИ: 0,30,94) у женщин татарской этнической принадлежности.

Генотип *С*в локуса г.ч10518716 гена РЫ11506 (х2=4,519; р=0,033; СЖ=0,54; 95% ДИ: 0,31-0,95) и *С*С полиморфного варианта гх10098470 гена ТРИ52 оказались факторами пониженного риска развития переломов у женщин русского происхождения (х2=4,279; р=0,039; СЖ=0,27; 95% ДИ: 0,07-1,01).

Представленные результаты являются первыми шагами к пониманию роли полиморфизма сайтов связывания микроРНК в формировании низкого уровня МПКТ и развития остеопоретических переломов у женщин постменопаузального возраста русской и татарской этнической принадлежности из Волго-Уральского региона России.

Оценка вклада межгенных взаимодействий в формирование остеопоретических переломов и низкого уровня МПКТ

Формирование многофакторных заболеваний происходит под воздействием множества генетических и средовых факторов, а так же большое значение имеет взаимное влияние полиморфных вариантов генов, которое может привести либо к усилению эффекта тех или иных генов, либо, наоборот, к уменьшению влияния генетических вариантов на развитие фенотипа заболевания. Мы провели анализ межгенных взаимодействий изученных локусов кандидатных генов остеопороза на развитие остеопоретических переломов и низкого уровня МПКТ у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона России.

У женщин с переломами татарской этнической принадлежности выявлена двухлокусная модель взаимодействия полиморфных локусов 3102735 гена ОРС(ШРЯ8Р11В) и к10518716 гена Р1Л1506, которые действуют синергично,

предрасполагающая к повышенному риску переломов (р=0,011) (Рис. 9). Чувствительность для модели, состоящей из полиморфных вариантов rs3102735 гена OPG(TNFRSFllB) и rsl0518716 гена FUI 1506, составила 0,667, точность достигла 0,69, специфичность - 0,706. Полученная модель подтверждает значимость полиморфных вариантов генов OPG и сайта связывания для микроРНК 380 и 563 в гене белка, связывающегося с альфа- и гамма-субъединицами адаптина {FUI 1506), в формировании повышенного риска к переломам у женщин татарской этнической принадлежности, выявленную при анализе ассоциаций отдельных локусов.

- OPGr*207M1t " 0f>Gra310773e " FUIra10eif7ie

- ГШг«203в41Т

- ОРОПЭ134М«

- ОРСг*207Э617 " VNN1ra274642t

] ^ Синергия ^ Аддитивность ОЩ^ Синонимия

Рисунок 9. Графическое изображение межгенных взаимодействий у женщин татарской этнической принадлежности с переломами и без переломов.

У женщин русской этнической принадлежности с переломами ассоциированы две модели, состоящие из полиморфных вариантов гя1514348 гена ЕБЯ1, гб4988235 гена ЬСТ (р=0,001), которые действуют синергично, и гэ1514348 гена ЕБЯ1, Ы988235 гена ЬСТ и ^9630182 гена РТН (р=0,011), для которых характерен аддитивный эффект. При исследовании отдельных локусов выявлена значимость полиморфизма га9630182 гена РТН в развитии остеопении в общей выборке женщин (Рис. 10).

-d

CALCRn 1901197 ESR1ra1S14348 LCTre4988336 CYP19À1 г* 1082033

— РТНг*9вЭ01П

- OPGr«2073617

Рисунок 10. Дендрограмма межгенных взаимодействий при формировании переломов у женщин русской этнической принадлежности

У женщин русской этнической принадлежности также выявлена модель взаимодействия полиморфных вариантов к1062033 гена СУР 19 и гя2036417 гена РТН, ассоциированная с остеопорозом, характеризующаяся синергизмом (р=0,011) (Рис. 11). Чувствительность данной модели составила 0,642, точность - 0,586, специфичность - 0,534, воспроизводимость результата - 10 из 10.

--2НГг»107Э3442

■ СУР1ЯА1гв10вЗСЗЗ

I РТНг*7125774

-— Е8№гаШ4348

-ор<*»ао7эе17

Рисунок 11. Дендрограмма межгенных взаимодействий при формировании остеопороза у женщин русской этнической принадлежности

Таким образом, проведенный анализ межгенных взаимодействий позволил установить ассоциации между полиморфными вариантами изученных генов с риском развития остеопоретических переломов и низкими уровнями МПКТ в группах русских и татар. Наличие множества ассоциаций между различными генами оказывает совокупное действие на развитие переломов и ОП, что свидетельствует о необходимости их учета при прогнозировании заболевания.

Выводы

1. Установлено, что маркерами повышенного риска переломов являются генотипы *Т*Т (гб3102734) гена ОРв, *С*Т (га1801197') гена СТЯ в общей выборке и у русских, аллель *Т и генотип *Т*Т (г.чЗ134069) гена ОРБ в общей выборке и у татар, аллель *Т и генотип *Т*Т (г.<;3020314) гена ЕБШ,генотип Д3/12 (ТААА)п гена СУР19, гаплотип *Тв (к3102735 и гбЗ 134069) гена ОРО у женщин татарской этнической принадлежности, генотип *С*С (г$9630182) гена РТН у женщин русского происхождения.

2. Обнаружена ассоциация генотипов *С*С (гяЗ 102734) гена ОРО, *С*Т (га7125 774) гена РТН с остеопенией в общей выборке, генотипа *С*С (гя3102735) и гаплотипа *СОТС (га3102734, гэ2073617, г.ч2073618 и пЗ 134069) гена ОРО у женщин русской этнической принадлежности, генотипов *&*0

19

{rs3134069). *C*C (rs3102734) гена OPG и А3/12 (ТАЛА),, гена CYPJ9 у женщин татарской этнической принадлежности.

3. Выявлено, что маркерами повышенного риска остеопороза являются аллель *С и генотип *С*С {rs20 73618). аллель *Т и генотип *Т*Т {rs3134069), аллель *Т и генотипы *Г*Т {rs3102734) гена OPG, *С*С {rs1062033), АЗ/12 и 11/11 (ТААА) и повторов гена С} PI 9 у женщин татарской этнической принадлежности, гаплотип *CGTG (rs3102734, rs2073617, rs2073618 и rs3134069) гена OPG у женщин русской этнической принадлежности.

4. Показано, что эпигенетическими маркерами повышенного риска переломов являются полиморфные варианты сайтов связывания микроРНК rs6854081 (генотип *G*G) в общей выборке, rs10098470 (аллель *'Г и генотип *С*Т) в выборке русских, rs6854081 (генотип *Т*Т) и rsl0793442 (генотип *А*С) в выборке женщин татарского происхождения; маркерами повышенного риска ОП - rs 10793442 (аллель *С и генотип *А*С) в общей выборке, rs 10793442 (аллель *1 и генотип *А*С) в выборке русских.

5. Идентифицирована двухлокусная модель межгенного взаимодействия {rs3102735 гена OPG и rsl051S716 гена FLf), ассоциированная с риском развития переломов у женщин татарской этнической принадлежности; двухлокусная {rs1514348 гена ESR1 и rs4988235 гена LCT) и трехлокусная {rs 1514348 гена ESR1, rs4988235 гена LCT и rs96301S2 гена РТН) модели, ассоциированные с риском развития переломов у женщин русской этнической принадлежности), и двухлокусная модель {rs 1062033 гена CYP19 и rs7I25774 гена РТН), предрасполагающая к остеопорозу у женщин русской этнической принадлежности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Статьи и репетируемых научных журналах:

1. Хусаинова P.M. Поиск ассоциаций полиморфизма (ТААА)п гена витамин D связывающего белка {DBP) с развитием остеопороза в Волго-Уратьском регионе России / Р.И. Хусаинова, Л.И. Селезнева. A.B. Мальцев, Р.Я. Шакирова, Р.З. Нурлыгаянов, Д.Д. Надыршина, Э.К. Хуснутдинова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2014. -№2. - С. 218-222.

2. Хусаинова Р.И. Исследование полиморфизма сайтов связывания микроРНК у больных постменопаузальным остеопорозом / Р.И. Хусаинова, А.В. Мальцев, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2014. - № 2. - С. 9-18.

3. Хусаинова Р.И. Роль микроРНК в развитии остеопороза / Р.И. Хусаинова, А.В. Мальцев, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2013. - № 11.-С. 3-11.

4. Мальцев А.В. Молекулярно-генетическое исследование генов кандидатов постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе / А.В. Мальцев, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Вестник БашГУ. - 2013 -№4.-С. 1057-1061.

Тезисы докладов и статьи в сборниках конференций;

5. Шакирова Р.Я. Исследование генетических факторов нарушения костного ремоделирования у больных остеопорозом / Р.Я. Шакирова, Р.И. Хусаинова, А.В. Мальцев, Р.З. Нурлыгаянов, P.P. Якупов, Л.П. Евстигнеева, Е.Н. Кожемякина, Э.К. Хуснутдинова // // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии». - Курск. - 2011 - С. 117-118.

6. Мальцев А.В. Изучение P447L полиморфизма в гене рецептора кальцитонина (CALCR) у больных остеопорозом / А.В. Мальцев, Р.Я. Шакирова, Р.И. Хусаинова, И.А. Янбердин, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Всероссийской школы конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. "Биомика - наука XXI века". - Уфа. - 2011 - С.74-75.

7. Shakirova R. Lack of associations of CALCR and LCT gene polymorphisms with bone mineral density and osteoporotic fractures in the Volga-Ural region of Russia / R.Y. Shakirova, R.I. Khusainova, A.V. Maltzev, E.K. Khusnutdinova. //European Human Genetics Conference. - Amsterdam - 2011. - P. 310.

8. Maltcev A. The study of polymorphisms P447L of calcitonin receptor gene (CALCR) and A986S of calcium response receptor gene (CASR) in women with postmenopausal osteoporosis from Volga-Ural region of Russia / A.V. Maltcev, R.I.

Khusainova, I.A. Yanberdin // European Human Genetics Conference. - Nürnberg -2012.-P. 240.

9. Мальцев A.B., Изучение полиморфизма P447L в гене рецептора кальцитонина (CALCR) и полиморфизма A986S в гене рецептора чувствительности к кальцию (CASR) у женщин с постменопаузальным остеопорозом. / A.B. Мальцев, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова. // Тезисы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий». - Санкт-Петербург - 2012 -С. 65.

10. Мальцев A.B., Поиск ассоциаций полиморфных вариантов гена РТН с развитием остеопороза у женщин. / A.B. Мальцев, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Материалы всероссийской школы-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» - Уфа - 2012 - С. 30-32.

11. Янбердин И.А., Анализ ассоциаций полиморфных локусов гена рецептора витамина D (VDR) с риском развития переломов / И.А. Янбердин, Р.И. Хусаинова, Р.Я. Шакирова, A.B. Мальцев, Э.К. Хуснутдинова // Материалы Ш всероссийской школы молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волого-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» - Уфа - 2012 - С. 96.

12. Хусаинова Р.И. Изучение роли полиморфных вариантов гена остеопротегерина (OPG) в развитии остеопороза / Р.И. Хусаинова, Р.Я. Шакирова, A.B. Мальцев, Э.К. Хуснутдинова // Материалы конференции ВОГИС «Проблемы генетики и селекции». - 2013 - Новосибирск - С. 21.

13. Мальцев A.B., Исследование роли полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК в развитии остеопороза / A.B. Мальцев, Р.И. Хусаинова, Д.А. Шаповалова, О.М. Лесняк, Э.К. Хуснутдинова // Материалы «V российского конгресса по остеопорозу и другим метаболическим заболеваниям скелета». - 2013 - Москва - С. 77-78.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

95% ДИ - Доверительный интервал

ВУР - Волго-Уральский регион

МПКТ - Минеральная плотность костной ткани

ОП - Остеопороз

ПСС микроРНК - Полиморфизм сайта связывания микроРНК

CaSR - Ген рецептора чувствительности к кальцию

CTR - Ген рецептора кальцитонина

CYP19 - Ген ароматазы

DEXA - Двуэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия

ESR1 - Ген рецептора эстрогена 1 типа

GWAS - Полногеномные исследования ассоциаций

LCT - Ген лактазы

OPG - Остеопротегерин

OR (Odds Ratio) - Соотношение шансов

P - Уровень значимости

PTH - Ген паратиреоидного гормона

Корректор А. В. Мальцев Компьютерная верстка А. В. Мальцев Художественное оформление В. Н. Любцов

Отпечатано с готового оригинал-макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 10. Подписано в печать 10.09.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 00,88. Уч.-изд. л. 01,50. Тираж 100 экз.