Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм последовательностей гена дистрофина в семьях с высоким риском мышечной дистрофии Дюшенна и региональных популяциях Украины

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм последовательностей гена дистрофина в семьях с высоким риском мышечной дистрофии Дюшенна и региональных популяциях Украины"

. ЛКМ1ЕМ1Я НАУК УКРАТНИ 1КСТИГГТ КОЛЕКУЛПГНОГ БЮЛ0П1 ТА ГЕНЕТИКИ

Fi'O ОЛ

На правах рукопнсу.

ГРНИКО Валентина IonniBHii

УЛК 577.217.32:570.31

t

ШШИОМ13М ПОСЛ1ДОВ!ГОСТЕЯ ГЕНА ЛИСТГОФ1НУ В РОДИЛА* Э ВИСОКНН РИЗИКОН М"ЯЭЕВ01 ДМСТРОФП ДЮВЕИНА ТА РЕПОНАЛЬНИХ ПОПУЛЯЦИЯХ

УКРА1НИ

ОЗ.ОО.ОЭ - модвкудярна 6)одог1я

Автореферат . дисартацИ не эдобуття сченого ступени . кандидата б!одог1чних нэук

KhYB- 1В93

Гобота вихонана у в1дд1д1 генетики дюдини 1нстнтуту молекулярной Cioxorl* та генетики ЛИ Укра?ни.

Hay ко в 1 керквникш

©♦tulflHt опонвнти:

Ведуча орган!эац1я-

доктор медичних наук, професор Т.I.Бухисвська, кандидат б!одог1чних наук Л1вшиць Л.А.

член- кореспондент АН УкраХни, доктор б1одог!чних наук, профосор Б.А.Кордюн, доктор б!одогЛчних наук Дуброва П.С.

УкраХнський науковий центр медичноХ генетики МОЭ УкраКнн та АН УкраХни, Ки¥в

Захист днсертац!* в!дбудетьсв " 22 'лютого ' 1804 р.

• _ годин на sacUaHHi спец1ал 1эованоХ ради Д 016.11.01

Хнстмтуту молекулярной &1одогН та генетики 'АН УкраХнм sa ад» расою : 252143, КнХв-143, вул\акад.Заболотного, 150.

3 дисертац1ы» можна оэнафомнтися в б1Сл1отец1 Хнституту • молекулярной б!ологП та генетики АН УхраХни.

Автореферат розicдано

1994 р.

Вчиний секретер спец1ад!»оЬаноХ ради кандидат б!олог1чних наук

I У

.

ч1}>

л.л.лукая

- 1-

ЭАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТН актулльи1рть проблемы. Стр1мкий роэвиток метод!в молекулярной С1олог1i та генно* 1нженерН докор!нмо вплинув на вивчення основ . спадковост!, завдяки чому в>дкрилися прннципово нов! можливоот* прогресу у медицин1, с!льському господарств! та б1отехнолог1Х.

Важливин етапом .у роэвитку б!олог1чних наук про людину стало створення м1жнародноХ прогреми "Геном людини", основною метою яко* с виэначения нуклеотидноУ посл1дооност1 ДИК всього геному.людини. Ц1досл1дження пера, за все спрямован! на вивчоння rente, мутацИ в яких призводять до розвнтку тяжких спадкових захворювань, що мае вааливе теоретичне та практично значения для медичноХ генетики при розробц! saxofltB д!агностики, профилактики та л!кування спадкових хвороб. •

М'язева дистрофкя Дювонна (НАД)- найб1лыя поширене та найб1лыв тяжке захворювання в rpynt спадкових прогресуючих нейром'язевих патолог1й,мо зустр£чаеться э частотою 1:3000- 1:3500 нозонароджв-иих хлопчик1в I Enery А.E.H.. 1887]. Висока частота м'яэево¥ диет-,' роф!К Двшенна, наявнЮть великой к!лькост! р!зних кл1н!чни* форм, t поряд . э цим поена в!дсутм1сть ефоктиимого л1кування, цо приводить до тяякоХ 1нвал1дизац1¥ та смортност! у Bint 10-20 рокi в, . эумовили нагальну неое>к1д»исть вивчення молекулярной природи данного захворювання.

Ген м'язево! дистроф1'1 Дютенна було кпртовано у локус* Хр21 Х-хромосоми людини у 1935 pout эавдпкн викорнстанню цитогенетичних метод1в та метод!в "эворотньо* генетики" [ Franoke U. et al., 1985,-Kunkel L.M. et al., 1985]. Iliaiitme ^y л о клоновано велик'у к1льк!сть ' посл!довностей цього гену, по виявився нпПб1лыоим серед вс1х в1до-мих ген»в ссавц)в, його роэм!р становить близько 2,5 млн.п.н. Вод-ночас э цим було вид!лено мГПК гену м'язево* дистроФП Дюшонна [ Koenlfl Н. et al., 1907]. У 1988 роц1 було описано бЛлковий продукт гену. м'язевоХ дистроф1Х Дюшенна, названий дистроф!ном [Hoffoan Е.Р. et al., 1988] .' Завдякн цим досягнонням стало можлиоим вивчення р!эних тип!в мутаций, цо лриводять до роэвитку цього тяжкого захворювання. Виявилося, чо перерагаючимн серод них е* делец!* гену р!зноХ довжини [Kevin H.A. et al., 1989]. На сьогодн1он1й день у багатьох лаборатор!ях cbItjt проводиться досл!джекня частоти та спектру р!зних мутац!й в ген! дистроф!ну. а також aconlautY певних THtiiB мутац!й э р*эними кл!н1чиими формами м'яэевоХ дистроф1'1 дю-пенна.

Для пошуку нових мутац!й, а також для диагностики, в тому чис-л! 1 пренатально!, в родинах, де причиною м'яэово'1 дистрофН Дюшенна с нев1дом1 мутацН гена, вгжливим також е вивчення acouiani'i по-л!норфних ДНК- маркеров з мутац!пми гена дистроф1ну.

-2- •

Кр1м того, вивчення Н1*1мд»ь1дуально* м!ндивост! ДНК в цих д!'-¿янках е - вожяивин дли анад1эу популяц1й дюдини. На сьогодн! уак! досл!дхення с актуальном« в рамках проекту "Геном дюдини", оск!дьхи вони доповнюють анализ нуклеотидноХ поел1довност1 ДНК , но «икону-сться на матер1ад! дек!лькох 1ндивид!в.

Нотою ддиого досл!ддення_було вивчвння частот« двлвц1й у

М"язево-специф!чному промотор! та 3, в, 8, 13. 1?. 19. 43, 44, 46, 47, 48, 50, 52, 80-му екэонах гена дистрофЫу у хворих на м'язвву дистроф!» Дюшенна э р!зних рег!он!о Укра¥ни. . а також вивчвння В'.адьного пол!норф!эму внутр!гейних поел1довностей рЕВТ-локусу в системах рЕЙТ87-15-ВаюШ . рБ11Те7-8-Тач1, рЕВТ87-15-Хпп1 та вар1ац!Х 0ТАА- танденних повтор1в э 3'-нетр&нсдьованоХ обдаст! тема дистро-♦ !ну я родинах э високнм рнэиком эахворювання та рег!онадьних попу-\ляц!ях УкраУни. '

В лроцес! внконання роботи вир1шувалися так! задач!:

1. отриманн.1 банку ДНК э лайхоцит!в перифер1йнрХ кров! хворих на м'аэеву дистрор!») Дювемна та член 1. о *х родин э р!зних рег!он!в /крайни, а гакох здорових доиор!в Киева, Львова,' Кременчука Под-. ;| тавс-ькоК обдастI таАлчевська ЛуганськоУ обдаст!. м1 I '

2.. Проведения ДНК- анал!зу делец!й у н'яэево-специф1чному промотор! те 14 екэонах гену дистроФ!ну у хворих,на м'язвву дистроф!» Дювенна.

3. Проведения анал!эу пол1морФ!зну довжини рестрикцЮних фрагмент^ (ПДРФ) посд!довностей рЕЯТ- локусу гена дистроф!ну у родинах а високии рнэиком эахворювання.

4. Вивчвння н!нливост! СТАА-тандеиних повтор1в в З'-нетрансль-ованоХ обдаст! гена дисгроф!ну у цих родинах.

Б. Вивчвння пэд!морф!зму посл1довностей рЕЯТ-докусу та вар!а- _ ц!1 ОТАА-тандемних повтор1в в труп! здорових к1нок Та 4 рег!онадь-них понуляцЫх Украйни: м!?т Киева, Львова, Кременчука, Алчавська. -

V

Наукова нопизна та практична.и1ни1ьть рвботи.

Створено банк ДНК, який над!чуе 235 зраэк1в лейкоцитарной ДНЕ член!в 60 родин э високин рнэиком м'язевоХ дистроф!! Дювекна э р!эних рег1он!в УкраХни, а таков 450 эразк!в лейкоцитарной ДНК здо-< рових донор!в Киева, Львова, Крененчука, Адчевська.

Проведено анад!з дедец!й у_м'язево-специФ!чному. промотор! та 3, в, в, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48,-50, -52, 80-му екэонах гена «истроф!ну у хворих на и'яэеву дистроф1к> Дюаенна з р!зних рег!он!в УкраКни. Отрнмано дан! про докад!зац!к> де«ец!й в окречих ««зонах, показано, чо абсолютна е1льв1сть виэначених делец!й зконцонтрована б!дя центрально)! частини гена.

О-

Розроблено модиФ1кований метод для одночасного теступання до-л«ц!й у вицевказаних 15 поел1довностях гама листроф1ну у 3 вар1ан-тах мультилокусно* пол1мераэно.К ланцюгово* реакц!У.

Проведано анал1э алольного пол1морф1зму поел1довностей рЕИТ-докусу в родинах э .високим ризиком МЯЛ, г груп! эдорових х!нок та в 4 рвг1оиальних популяц!ях Укра'1'ни. Продомонстровано, то у вехх цнх проанал1эованих трупах переважно зустр!чаютьси Х-хром_осоми э ^сайтом рестрикц!* у во!х системах рЕИТ-локусу: рЕЙТ07-0-Т»ч1, рЕЙТ87-15-ВаюН1, рЕДТ87-15-Хвп1. Показано високий р!вень гетерози-roтнocтt У вивеэгаданих посл!довностях як серед матер!в пробанд!в, так I серед эдорових ж!нок, во св1дчить про високу 1нФормативнхсть цих систем для д!агностикн МДД в Укра'1'н1.

В тих «в родинах та в популяц1¥ здорового населения проведено анал!з м1нливост1 СТАА-тандемних повтор!в э 3'-нетрчнсльованоХ облает! гена дистроФ1ну. Показано, во у' пс»х проанал1зованнх трупах пораваналн Х-хромосоми з наяшНсте СТАА-тетромер!в у 3'-облает! гена. НиЗька частота гетерозигот як серед матер!в пробандхв, так 1 серед эдорових ж!нок дае подставу ввакати, то цей тип ДНК- маркер!в не с !нформативнин для дкагностики МПЛ в Украх'нК | -П

Дан!, отринанх при анал!э! м!нливост! 1ЩРФ-генотип1в в системах рЕИТ-локусу та певннх вар1ант!в СТАА-тандемних повтор!в, св!д-чать про внбеок ц!е¥ м!нливост1 у формування генетичио1£ гетероген-ност! вивчених рег1ональних популяц1й Укра'пш, причому найб!лыа ва-гомий внесок вносить у цю гетерогенн1сть иол1морф!зм ДНК у систем! рЕЙТ87-8-Тач1.

Результати роботи мають значения в план! подальшого- вивчення частоти та спектру р!зних мутацЫ гена дистрофхну та 5£х рол! у роэ-витку р!зних кл!н!чних форм н'язевоК дистрофII Дюшонна в Укра1'н!.

Отринан! результати продемонстрували чринципову моклив1сть ви-користання- пол1морф!зму ДНК в локус! рЕ1*Т та 5ТАА- тандемннх повтори з 3'-нетрансльовано!' облаетI гена днетроФ!ну для вивчення гене-тичнок' тетерогенност! рег!ональних популяц1Я Укрпх'ни 1 можуть бути перспективними для анал!зу генетично'г структури !нших пэпуляц!й.

Отриман! дан! - иають важлипе практично значения для розробки ефективно* стратег!* визначення гетерозиготного нос!йства тд прена-тально!' д!агностики у родинах з високин ризиком й;язево!( дистроф!* Дюшенна в Украхн!.

Апро6ан>я роботи. нятир>яди дис°ртац1К докладалися на друг!й Всесою^н1й конференц^* "Геном людини" (Переславль-3ал!ський, 1990, 1991), 2-му симпоз!ум! по генн!й теропП (КиКв, 1990), м1жнародн!й конференцИ "Нитап белове Марр1пй" (Коба, Япон!я. 1993).

иуйЛ1КШ1Х_)1о натер 1пла|( дисрртаиГх опубл!ховано 6 друкованих праць■

Сб." cu.-liQCu.Tiu_ПнгертацШ склаласться !э вступу, огляду л1тера-

турн, описания матер!ал1в то мнтодхо досл!д*еннп, отринацих результата, IX о'ггогорепнп, внсмоик1п та списку л1торатури- 135 джерел. Роботу пиклпдоно . на 90 сторНжах машинописного тексту, м!стить 5; тоблииь та 13 маль'нккп. '

ИАТЕР1ЛЛИ ТА ИГ.ТОДИ Д0СЛ1Д1ЕШ1Я Эраэки периферичнох кровх э стандпртним консервантом донорсъ-ко¥ кров! <глыгициром) хворих на МЯЛ та член1П хх родин було отри-мано э установ, де пони проходили клНично обстеження: КНД1 ПАР !м.11.М.Буйко ноз Украхни, ЛПД1 11 Асп ноэ Украхни, мхжоблаених моди-ко-генетичних цантргв ПОЗ Украхни. Зраэки донорськох кров! було от-рнмамо на Ки'хвськШ, Льв1пськ!й, КременчуцькI» станцхях перели-вання крон!. Или т1ал1зу також було рикористано зраэки кров! здорового населения Ллчевська, сород якнх було проведено п1лотний скри-н!нг делец!* Е50в гена муков!сцнлоэу.

Олхгонуклоотидн! праЛмори було синтезовано в АТ "Екотур" (м.В!льнюс,Литва). • '

Вид!лання та очищения препаратов леПкоим'тарно! ,"ИК проводили по методу Н.Неппог1 е1 а1 [1988], 1>ид1лення препарат!в ДНК з б!оп-тат!в хорхону та плацонтн проводили по эагальноприйнятим нетодам [Т.Ман!ат1с та 1н., 1905]. •

Пол1мераэну ланцюгову реакЩю (ПЛР) "проводили за эагальною схемою, запрононовоною В.?п 1Н 1 I19Н5) з пласниии модифхкац!ями. Для анал1эу делецШ в р!зннх скзонах гену листрофхну пикористовували Э вар!анта нультилокуснох плг. Продукт НЛР Р0зд1ляли за допомогою електрофорезу у 1,4Х-ному агарозному гелх за стаидартними методами [Т.Нан1ат!с та 1н., 108М. Для аналх^у пол1морф!зму довкини рест-рикцхйних фрагиент1в у системах рЕПТ-локусу гена Дистроф!ну спочат-ку проводили специф1чну анпл!ф!кац}|о полхиорфних'поелгдовностей. пхеля закхнчоння ПЛР у 20 мкл реакцШнох сум!Ш1 додавали 10-15 о.а. в!дпов!днох ендонуклеази рестрикцГх 1 проводили г1дрол!з 10-15 годин в оптимальних темпоратурних умовах. Продукти г!дрол!зу аналхэу-вали за допомогою електрофорезу у 2Х-ному агарознону або у 5Х-ному пол1акрилаи!дному гел! за стандартными методами з подальшим Фарбу-ванням гел!в бромистим ет1д!ен. Для анал!зу вар!ац1х ОТАА-тандемни* повтор!в у 3'-иетрансльован1П ■ облает! гена дистроф!ну проводили специФ1чну ампл1ф!кац1ю 1п по'сл1довностх ДНК, то и!стить ц!

повтори, продукти полЫеразнох ланцюговох реахи1°х' анал1эуоали у ць~ ому випадку за допомого» 12Х-ного пол1акрилам.!диого гелю.

roTepoauroTHtCTb Визничали 5a методом Mal H. et al. f 197-1] та Chakravorty R. [1301], частоти renin та теоретичиий розпод1л генотипов розраховували по Ч.Л4 1197Q), показании гонотично!' схояост! 1 в1дпов1дн1 KpHTeplï 1дектичност! розрахонунали по л.А. Жиоотоьському [1983]. Дандрограни гонэтнчно'х схожост! ьудували за методой незиа-хених групових саредн1х (Б.Дыра, М.Одалл. 1977). ОоиоиШ розрихуики проводили з викорнстанням комп"ютор|Ш1 программ "Syat nt" [MilkIneon, 1985] та оригЬтльних програнпх лпборатор1* попу яяцi îUiûï гоне гики 1нституту 3araflbiioï генетики ImqiiI h.i.Ъив1лоиа l'Ail.

РЕЗУЛЬТАТИ ГА IX ОБГОЦОРЕМПЯ Анал1з двлвц1й у rent дистро^ну учхиорих ни н'яюиу

дистроф1ю Дюшенна ДНК- анал!з долацШ в м" яэево-споциЦчпому проногор! та 3, 8, 8, 13, 17, 19, £3, 44, 45, 47, 48, 50, 52, 60-му энзимах гена дист-роф!ну проводили еврад п~робанд1в з 00 родии з иисокнм ризпком н'-nsesoï дистрофШ Дюшеино э р1зиих perlonio Украсим. Прачки дик цих пробанд1в використовували пк матриц» длл ГШ' при проподеши спаци- ' <Jt4HOÏ ампл1ф1кац1.Х In vitro поел 1дописцта(1 м"нэ%ио-спеинф1чного промотору та 14 екэон!в гена дистриф1пу. ол 1гонуклйотплШ прьПмари буди гомолог1чшши 5" та З'"к1нцям екзон1в. В цьону пиплдку при проаэденн! ПЛР ампл!Ф1кувалась поел 1доим1сть ц!лого окзону, riaiiB-HiCTb при алактрофоратичному■ анал!э1 ИЛР-иродукт1в в!дпоп1дного розм!ру св!дчила про в1дсутн!сть далоцШ у в1диои1Дпнх.екзонах, а , в!доутн1сть ПЛР-продукт1п пенного розм1ру св!дчила про надышать ' делец!* в аиал!зованому акзои!. KpiM того, и роамЦЛиу сум!ш для контролю реакц!? вносили ща одну пару iipafluopiu для ампл1ф!кац1¥ д!лянки КН-19 хромосоми 7 людими. OcTOliiilM часом э'яиилися роботи, а яких для ДНК-анал1зу далацШ було замропоновоно иикористовуьати так зваиу мультилокусну ПЛР, коли в одн1Л реакцШнЮ cyMiioi вияии-лося можливим одиочасно ампл1ф1кувати док1л1,ки поел1довностеП ДНК. 1!анп були модифхкован! умови Taxoï мультилокусно'1 11Л1>, цо дозволило значно спростити проведения paaKuiï f J .С .Chamber 1 ain et al., 1989]. В даному досл1джонн1 було використано 3 вар!анти тп-• «oï ПЛР для ампд!ф4кац1Х 15 поел 1дошюотой гена днстроф1иу. При иь-«му останн! виступали вэаснним|внутр1шны контролем одних по в!дно-иенню до 1нших. У першому sapianTi мультилокусиоХ ПЛР ампл!ф1:ку-оали поел1довиост1 8, 17. 19, 44, 45, 48 окзоп1 в гена диотроф!ну, «Xt ствновлять п!дпоВ1Дно Фрагменты роэм1ром 300, 41G, 459, 288, 547,' 508 п.«., а в1дсутн!сть одного або док1лькох Фрагмвмт1в св!д-

чила про делец! i у в!дпов!дних вкаонах. Dei проанал!зован! у даному sapiaHTi ПЛР далец!И ехэон!о гена дистроф!ну булм энайдвн! в обстехен!й rpynt хворих.

У другому BapiatiTi мульти-локусноК ПЛР одночасно ампл!ф!-хувалн посл!довност! м'нэево-специф!чного промотора, 13, .43; 47,50, 52, 60-го екзон!в гена дистроф!ну роэм!ром 535, 238, 357, 181,271, 139, 113 п.н.. в!дсутн!сть OAMie'i або док1лькох ампд!ф!коьанмх посд!довностей св!дчила про долецН у витепере-рахованих ехзонах. На малюнку 2 приведено результати анял!зу цнх дедец!й у хворих на МДД'.В третьему эразку ДНК було виявлено делец!)! 50 та 52 екэон1в .гена дистроф!ну, в четвертону-делец1я 50-го окэону гена дистроф!ну. У цьому вар!ант! ПЛР- анад!зу делец!* у хворих буЛО ВИЯВЛвНО TiXbXH у 13, 47, 50, 52-му ехзонах гена дистроф!-ну. Нарешт!, у тратьому вар1ант! одночасно анпд1ф1куоад№-«асд}д-новност! розм!роы 410 та 202л.н. -3 та в-го екзон!в гена дистро-♦!иу. Серед обстехених нами хро-рих таких долец!й 'виявлено не було.

В результат! проведеного Досд!дхення делец!! р!зних екэо- ' н!в гена дистроф1ну було виявдено Г 18 з 60 проанад!аоваиих лро-банд!». *

[i »-i

950 п.н. 547 п.м. 506 п.н.

ш п Hi

Над.1. ДНК- анал!э дедец!й в ген! дистроф!на у хворого К. на м'язеву дистроф!» Дюаенна. КМ-19- посд!довн!сть роэн!рок 850 п.н. 7 хромосомн. ' Hap^op-j днкЛ/PetI, 1,4Х-ний агвйоа'ннй:1; гедь,1 дор!хка- 45 екзон^2,Гдо» рожка- 47 ехзон.З -46 екэоН, 4- дедетований 50 екэон. ,

«в* ««* № —

i ст ——'¿I» П *' 7Z ¡т*» jf| пн'

Мал.2.. ДНК-анад1э дедец!й у м'яэево-специф1чному промотор! та 43. 47, 50, 52, 60 екзонах гена дистроф!ну.. Маркер-ДНК X/PatI.l-4-Дорохки- ДНК хворих на н'язеву дистроф!». 1,4Х-ний агарозний гель.

На малюнку 3 представлоно результати розпод!лу далец1й у ген! днстроф!ну серед проаналiaonamix хпорих. Э них 16 пробанд!в т!лькн в одного було виявлено побдиноку далец!ю 44-го екзону гена дистро-Ф!на. Ще в чотирьох пац1ент!в було вияплено делец!'! одного екзону, але оск!льки анал!э грайичних екзонхв не проводився, ми не мохемо стверджувати, що ц! делецН спгають граничь в1дпов!дних екэон!в. Абсолютна б!льи!сть виявлених делецШ: 13 э 10 простягались э 45-ГО по 52-й екзони, тобто коицентрувались бглп центральной частини гона. У двох пац!ент!в були делец!'!, що простягались з 8-го по 19-ий окзони гена дистроФ!ну. '

Сл!д в!дзначнти,що отриМан! в цьому досл!д*енн! floni по розпо-д!лу делецШ в ген! дистроф1ну дацо niдр!эняються за спектром та частотою останн!х в окромих окэонпх г!д дпинх, отриманих у !ншнх лаборатор!ях [Upadhyaya Н, ot ni., 1990, евграфов О.В. та 1н.,1992]. Поясните це можно ножлипимм популяц!йними або етн!чними особливостями природи нутлц1й, лк! машть Micuo в Укра¥н1. Б!льи точно о!дпов!сти на цо питания можна будо при проведонн! 6i«i,ia дэ'г-тального картування вкэомних границь вс!х Прочная!зопаних - делец!Д, по стане можливим в подальшону анал!э1. Шкапин с те, що серед про-анал!эоват1х нпми родин з високим ризиком м'язепо* дистроФ!У Дюшен-; на надэвичвйно високим виявився процент пипадк1в !з спонтанною формою эахворювання- 60* в пор!пнянн! з ЗОХ у.других рег!онах св!ту [ Нопасо А.Р. et al.,1988]. Це моле бути пов'язано з тим, цо серед спадковнх випадк!а б!льпе зустр!чаеться так званих "стертих" форм з пени тяжкою точ!ею эахворювання, цо не зпвхди д!агностуеться як МДД. Але но виключено, цо досл!джена нами група bípho в!дображае сп1вв!дношення спадкових-та спонтанних випадк!в МДД в Укра*н!. Баз сумн!ву, досл!дження такого гена, як дистроф1н, можа мати ваялиоо значения для вирнпання питань спонтанного мутагенезу у людини, в тому- числ! для вивчання генетичних насл!дк1в Чорнобиля, цо дужа актуально для укра?нськоХ популяц!!.

Алельний лол!морФ!зм посл!довностеЙ pERT-локусу гена дистроф!ну у родинах з високим ризиком м'язево! \ дистроф!* Дюшенна

Поряд э анал!зом делец!й у НЛД-ппц!ент!в в родинах з високим ризиком цього эахворювання э рхзних рег!он!в УкраКни був проведений анал!з пол!морф{?ну допжини рестрикц!Яних Фрагмент1в посл1довностей !нтрагенного pERT-локусу гена дистроф!ну в 12-14 ек-зонах гена дистроф1ну в системах pERT87-15- Batilll, pKRT87-8-TaqI,

Pn 3 в 8 13 17 19 43 44 45 47 48 50 52 ВО

Нал.З. Розпод!л делвцШ у ген! днстроф!ну. серед хворих на м'язеву дистроф!ю Дютенна в Укра'хн!. Кожна горизонтальна риса вказуе на характер делоц1П в одного пац!ента. Знизу показаний, номер анал!зовпних окэон1в.

pEBT87-15-XiinI. Праймери для специф!чно1 ампл!ф!кац1¥ in vitro були гомолог!Ч1шми посл1довностпм, що фланкують дан! пол1морфн! д!лянки.

При ампл!ф!кац!1 эраэк!в ДНК хворих на м'язеву дистроф!» Дю-шенна та чдеихп 'fx родин для анал1зу у систем! pERT87-15-BonllI роз-м!р ПЛР- продуктов складав 216 п.н., при наявност! BanHI-оайту спостер!гали ЯНК-фрагненти ропм!ром 1G6 п.н. та 50 п.н. (мал.4). В результат! ироведоного анзл!зу спостер!гали два види гвм!зигот серед ос!б чолов1чох ' стпт!: В1- то мали Х-хромосому з в!дсутн!стю сайту для ендонуклеази pecTpuKiui BamHI у П0,СЛ1Д0ВН0СТ1 pERT87-15 та В2- ио мали Х-хромосому э наявн!стю сайту рестрикцГх. Серед ос!б jino4oi стат! були яи^ьлен! т!лькн три пиди генотип!в: В1В1-,гомо-эиготи по в!дсутност! сайту pecTpitKUÍi, В1В2- гетерозиготи, D2B2-гомозиготи lio наявност! Вяш(Ц-сайту у анлл 1зоцгкtfl посл!довност!. При спвцифхчнхй ампл 1ф!кпц! i пол!морфно'1 для ферменту Xnnl посл1-

довност! рЕКТ87-15 утворюиався ДНК-фрагмент розм1рок 730 п.н.При наив-ност! в а»ал1зованому эразку Х«т1-сайту п1оля г!дрол!зу 1Ш*-иродукт!и спостер!галн Фрагменты розн1ром 520 та 210n.ii. <кал.5>.В эалнкнос-т! а!д наявност! Хвп1-саПту рест-рнкц!¥ у полЫорфнЫ посл!довност! у ос!б чо»оп1чоМ стат! спост<зр1га-дн 2 вид» гем!зиготних генотип!в: Х1-в!дсутн1сть сайту рэстрикц11. 82- наявн!сть останього.а такох 3 вид« генотнп!в серед хЫок -Х1Х1-гомозиготи по в1дсутн0ст1 Хшг1-сайту у Пол1морфи1й паел!дов-ност! рБКТ87-15, Х1Х2-гетерозиготи, Х2Х2- гомознготн по наявност! цього х сайту на обох X-.хромосомах. При ^н-коркстанн! ол!гонуклеотндних праймар!е для спецнф!чно* ампл ЬргкчцН полхморф-ко£ посд!довност! рЕЙТ87-в-Тач1 утпо-рюраася пЛР-продукт рози1рон 145it.ii. В раз! наявност! в ампл!ф!кован!й пос-л!довкосг! сайту д«п ТачХ при г1дрол1-з! ПЛР- продукту утворювалися фрагмвн-ти розм!ром 74<-71 п.и., яиг при олвкт-рофоретичному розд!ленн! у 2Х-ному агарозиому год! виглидадн лк 1 Фрагмент (мад.в). По аналог!* з вищеопн-саннмй пох!норфннкн послтдовностяни п!сла спецкф!чно5: ампл!ф!кац!*' та наступно^ растрикцгк' ПЯР- продукт ¡в епоствр!гали 2 видп ген1зигот серед ос!б чодов!чо¥ сгат!:Т1-п1дсут- • н!сть сайту рестрикцхг та Т2- нанесет«. останнього. Кр!м цього,сор 'Д • ос£б к!кочоК сгат! спостерггали 3 видя геиотип!в- Т1Т1, Т1Т2, 'Г2Т2.

®п

'Ъ

кя вш

50 <1 «

Нал.4. ПДГ'*-анаЛ1Э у ло»1-моН'Н'й с истой I рККТ07-15-ВаиШ.Ньркьр модакудярнох вчгн-ДНкД/ Ра(:I . 1 дор!«ка генотип В1В2, 2 дор^хка-гонотип 131 , 3- юнотип 02, 1,4Х-ннй агарозшШ !гель.

О,О

13б п и.

520 п.4.,

22О п и.

Мал.5. ПДРФ-ацад!з у пог1-мор4>н!й систем! рЕЙ107-15-Хпп1. Наркор молекулярно¥ ваги- ДНК Л/Р^Х. 1 ДОр1х-ка-гаиотии X1X2, 2 дор1я-ка- XI, 3-генотип Х2. 1.4Х-11ИЙ агароэний'гель.

\

Лнал1з пол1нор4>1зму довхини рест-рмкц!йннх фрагмьнт1в у тпцепорерахо-ваних пол!морфних системах був проведений у труп! !1ровамд1о, Кх смвс1в, матер11> пробаид!в, а такое при пажи ноет! матер!алу для досл1дхення -серед батьк!в матер1в. Як показали отриман! результат« по ДНК- анад!зу •|атар!в, у вс!х под1морфних системах спостер!галося перев.ахання Х-хромосом з сайтами рестрикции в анал!зованих посл!довностях. при цьому сл!д эазна-чнтн, цо у матер!в хворих д!тей пере-в&каа гетерозиготний генотип у. полгмор-ф!шх системах р£РГ87-15-Ваю111 (57.45Х). а також у иол!морфн!й систем! рКЙТв7-е-Тач1 <42.ЗХ). Цей факт с по-эитивним для використання ПДРФ-анал!зу в даних системах з метоп д!агносгнкн. В той же час частка гетерозигот у снс-

ж

¿ш « -1 t«s п.н ; _» & 74*71 mt.

Нал.в. ПДРФ-анад!э у под!морфн!й систем! pERT07-O-TaqI. маркер-,ДНК «4 /Petl.l ^eilOTHOHJ i дор 1хка-Т1Т2» 2>- Т5Ц 3 дор!хка-Г1Г2» 2Х~кий

агарозннй годь,

тем! pERT87-15-XnnI саред матар!в склада лицо 30,6Х. У груп! хворнх на м'яэеву д!строф!ю Дюшенна а yclx проанал!зованих родин спостер!-гадося абсолютно г.ераважоннн Х- хромосом а сайтами рестрикц11С для вс!х проанад!эованих поод!довностей pERT-локусу. .

tioptouoBaxiiicTb по эчвплвнию ПДРФ- генотип! в у доку с! pKRT гена дистрофику.

У родинах з высоким рнэнном и'взаво! дистроф!* Дюшенна анад!-зувадн осоц!ац!ю ПДРФ-гаП*о*мп!о у докус! pERT гена дистроф!ну на хромосомах X з мутац!пми ь гон! та па нормадьних гомологах. Гапло-тнпн м&торннськнх хромосом X з мутац!анм сп!впадади з гвм!зиготнин генотипом xeopoi дитини. матриц! стаид&ртних коеф!ц!ент!в нер!вно-вадност! м1стяться у таблиц! 1.

Отриман! результаты св!дчать про сэгатистично в!рог!дну нер!в-коважнксть по зчепленнп' м!х гаплотипами у пол!морфннх системах рЕМв7-15-ВаюН1 i pERT87-lS-XnnI як на мутвн-тних хромосомах X, так t на нормадьних гомологах. . При цьому сл!д в!дзначити, ио ПДРФ-гап-лотипи у цих системах энаходяться у фаз! прнтяж1нна, тобто гаплотип В1 част!ае всього асоцШоввний э гаплотипом XI на одн!й Х-хромосо-

-u-

Таблнцл 1. Матриц! iigplBiiouaiiiocTl по эчепленн» ПДР*- гопдотнп!»

ph'HT- локусу иа "нормальных" хромосомах X та хромосомах X з мутац1ями у гчн! днстроф!ну.

Хромосоми X а мутац!ямн ген! дистрофину в "Нормально" • хромосомн X

ПДРФ- сиотама Т П ' X ПДРФ-смстена Т В X

Т 0,2035 0,155 Т - 0. ( 142 .0,091

В 2,17 0,60 В 1,028 0.4U&

X 1,03 20,38»» X 0,34 ' 10,35*

Т- под1морфнв система pBilT07-8-Taql, В-пол1морфна система pERTC7-15-BnoHI, Х- пол!морфна система. pERTU7-15-XtmI. Вица д!агонал1- показчики нор»вноряжност!.по эчепленн».' <гл), ниача д!агонал1- значения* - Р< 0,01, -р< 0,001

Mi, гаплотип D2 з. Гаплотнпон Х2. Така ouliixa нас вежлива значения » дхя лtaniocTiiMHOi: tii$oprisTHBHocTt викорпстаних пДро- систем, ос' к1льки великиП розм!р гона дистроф!ну зуновлюе високо!мов!рний 1нт-рагошшА кросинговер, цЬ усоаднюз д!агностику и'язавоК дистроф!!! Дюавнна, пка саэуеться на acotUauiit ПДР®-маркор1в э ндд- мутац1ямн. У результат! такого кросинговору ИДД-мутац1я та подЫирфнд посл!довн1сть мохуть потрапитн на р!эн1 Х-хроносони. Використання . дек!яькох маркор!в, тин б!льпо асоц!йованих один з одним,эменауе лод1бний риэик. г ,

Анал1э пол!мор<Яэну ОТАА- тамденних повтори э 3'-Л , нетрансльованоК облает! гена дкстроФ1ну у родинах

Э внеокин риэиком м'яэотЯ дистроЯ* Драенна. Кр!м маркер!в пол!морф!зму довхнни рестрикц1йних Фрагмснт!в, в родина;: з високим риэиком МДД з р!зннх рог Юн 1 в у крайни э нетсю використання для,диагностики захворювання був проведений онал!э пол!-норф!зму другого типу, маркер!в-тетрануклоотндних ОТЛЛ- танденних Повтор!в э З'-нэтрансльовано? облает! гена дистроФ1ну. Прайнерн ддя спвциф!чноХ емгм1ф1кацИ ДНК in vitro сули гонолог!чннмн посл!дов-

ностям, що обнакуюгь область цих повтор!в. Шсля електрофоретнчного розд!лення 11ЛР-продукт1в зраэк1в чолои1чо'г стат» спостар1гади т1ли-кн два видн гом1зиготннх гепотнп1в:Н1- Х-хромосома з напвнгсти амп-д!ф}ковано2 поол1довност1 роэм^ром 03 п.п., що пхдповгдае 4-м тет-рануклеотиднин (ЗГАА-иооторам та Н2- Х- хромосома э наяшЦстю ампл!-ф!ковано¥ посд1доиност1 роэм!ром 67».н.. що а!ди6в!дае 5 таким повторам. У ж!нск в!дпов!дно спостер!-гали так1 генотип»: Н1Н1, Н1Н2, Н2Н2 (мал.7). Результат» пропеденого ДНК- анал1зу продамрнстрували абсолютна порепахання серед пробанд!в та чден1в родин Х-хромосом з наяцк1стю 4 0ТАА-повтор1в у З'-не-трансльовант облает! гону. Нами такок остановлена низька частота геторозигот серод матер!в пробанд!в (20,7*), «а дае п!дставу дда висно-вку про невисоку 1н4>ормативн1сть .. под 1морф!зму ОТЛА-тондемннх'новтор!В для Д1агностнки ИДД в Украгн!.

||

Ьшт*

ш

67 пЛ-65 л «.;

Мал,7. Анад1з гюл!морф1зну вТАА-тапдамнмх ио^тор^в ;у|, натерев ИДД- хворых,; Ганц-тшш*. 1, Э ~дор!хка- 'ЦНи 2- Н1М2, Ь-гетеродупдекси, 12Х-1ЩЙ ИААГ. I'

Використання результат!в ДНК- анад1зу родин з вксокик ризиком м'язево'х дистрофй* Двшенна дда пренатадьноХ д!агностнк.н та вканачешш носШства МДД- ыутац!А.

Газультати ороввденого ДНК-•над!эу у родинах з внеокиы рнэнном м'язево¥ днетроф!'* Дюаенна еуло викорнстано нами для преиатадьно! д!агностики захворыванна,¿уда проведана у трьох родинах. У родим!* В. таку д!агностику було проведено на матер!ал! б!опс1* хор!она плоду. Поп.ародньо у пробанда з ц1с! родннн Суло виявдеко делвцГг 47-50 екзон!в гена дистроф1ну. У плоду чолов!чоХ стат! такох буда выявлено и1дпоо!д-«I дедецхХ. Ваг1чн!сть перервана. (кад.8). У друг!й родин!. да тахох. у двох пробанд!в буди дрдоц!5£ С- 19 вкэон!в гена дмстро^ну, пд!д ВНЯВ11ВСЯ х!|1£Ч01 стпт1, тому ДНК-- акал!з делиц!и нй прор>дився.

ТГ 1 «

ш

Г-'.

I

£¡3

,_

тай: ? il.il;

Над.8. Пренатадьна д!агно'стика НДД у родин! В, ДНК-анад!з дет доцхй у 13.43,47,50-му екаоиах. гена диг.троф!ну.Наркер-ДНК Л/ Реи. I дор!хха- ДНК матер!, 2 дор!хка -ДНК пробанда. 3 дорожка- ДНК пдода. 2,3 дорожки-де-днц1 К 47,50-го екзон!в, 1,4Х-н 1н» агароэний гель. .

але було проведено анал!з на itociflcTPO д1*вчинкою, що нала народи-тися, МДД- мутацхХ.Результати ПДГФ-анал!зу у систем! рЕПТВ?- 8-Taql та pERT87-15-BemHI показали] що лона успадкувала П1Д матер! ; Х -хромосому 3 гаплотипом Т1 < В1дсутн1сть епПту pocTpHKlliï у пол!-!' норфнШ Систем!), в той час як МДД-мутац!п у цШ родин! була асоц!-Лована з гаплотипом' Т2, то>у був зроблоний висновок, що д!вчинка не отримала Х-хромосому э идд-мутаихею. У родин i К., де в пробанда не було вилвлоно делецхй в проанал!эооаних окзопах гена дистроф!ну» було проведено пренптальну диагностику у плода ч0Л0в!ч0! стат! ПО !нФормативним для flanoï родинн ПДРФ-систпмам pE!lT07-8-TaqI 1 pERT87-15-BanIII. В результат! було встпновлено, що пл!д отримав в!д матер! ту х саму хромосому X э не!донтиф!кованою мутац!ею в ген! дистроф!ну та В2 ! Т2 -гаплотипами, що i пробанд з uieï родинн. Вп-г!тн!сть було перервано.

Серед с!бс!в XÎH040Ï стат! в родинах э високим ризиком МДД^ булоь проведено ДНК-анал!з на мохлипе нос!йстоо МДД*мутац11! за 'допо.чфг.о'к}! ПДРФ- маркер!в. ЩкавмП результат було отримано в родин! К., де в пробанда та floro брата було ви-явлено делец!'! в 13-19 екзоилх гена дистроф!ну, а тпко* були де-летован! bcí 3 оналхзопан! посл!-довност! pERT-локусу, пкий локаЛ!-зуеться .Mix 12 та 14 екзонамн. При анал!з1 сестри пробанда було вста-новлено.що ïï ПДРФ- генотип такий, як ! в батька, який не мав на X-хромосом! сайту для Taql i ВалШ в пол!морфних системах pERT87-15-BamMI i pERT87-8-TaqI, в той час як мати мала генотип, що вхдповх-дав наявност! caflTio рестрикц!'! на обох Х-хромоеомах. Було зробле-но висновок, що дочка у ц!й родин! нотип Х2Х2, 2 дор1хка- гено-успадкурала Х-хромосому матер! з тип XI, 3- генотип Xl/pERT-делец!ею у pERT-локус! ! таким чи- i del, 1,4Х-ний агарозний ггль. ном у neï ампл1ф!кувалися в1дпов!лн! посл!довностх ,Т1Льки бать-к!всько! Х-хромосоми. Таким чином, у ц!й родин! виявилося мохливим базпосередньо визначити нос!йство Х-хромосоми э МДД- мутац!ею у д!вчинки (мал.9).

QrO

(à

7.50 пч. 520 пч. _

¿20 п.Н. —.

»

Мал.9. ПДРФ- анал!3 в пол1-морфн1й систем! PERT87-15-Xmnl у родин! К. Маркер-ДНК чЛ/Pntl. 1 дор!кка- ге-

Поя1мор<Нэм ДНК- поел 1 довноетей pBRT-локусу та ОТАА- танденних тетранукявотидних повтор!в гена дистроф1му в популпц1У здорового поседения УкрвУни.

В 4 рвг!ональних популяц1ях УкраЪ'ни: ки!?вськ1й, льв1вськ1А, кременчуцьк!й (Полтавська обл.), Q таков ''алчевськШ (Лугансько обл.) був проведений анал1э частот алольних вар1ант1в пол1морф!эну ОТАА-тандеинИх тетрануклоотидних повтор1в э 3'-натрансльсваноК облает», а такоя пол1морф1эму ПДРФ-снетем рЕВТВ7-15-ВвпН1 1 pBRT07-8-7«<jl.ОтриманI дан 1 по роэпод1лу частот алелей приведен! у твблиц12.

Вивчоиия роэпод1лу генотип!в у ПДГФ- системах рКНТ- локусу то ОТАА- твндвммих nouTopjo гена дистрофкну проводили у rpynl здорових iIhok. Внявлен1 та оч1куван1 (у в1дпов!дност1 э р1вноваго» Хард1-Ввйнберга) розпод!ли гоногшйв наведен! у таблиц^ 3.

Твблиця 2. Частоти молНюрфних BaptaHTin ОТЛА- твндемних пов-тор1в та ПДРФ- гпплогиЩв полЫорфних систем pERT-' локуса renn днстро'У1"а в рег1она*ьнмх популяциях УкрпЪ'ии.

Пол1морфн1 .систем и 11опулац1я pERTQ7-8-T»ql pERTB7-15-ВаюН! ОТАА- повтори

T1 Т2 В1 В2 Ml Н2

КиУв 0,108 . 0, 812 0, ,24 0, ,78 0, ,082 0, ,838

Льв! 3 0,16 0, 04 0, ,29 0, ,71 0, ,044 0, ,ose

Полтава 0187 0, ,813 0, ,09 0, ,91 0, ,073 0, ,927

Лугпнськ 0,38 0, , 84 0, ,23 0, ,77 0, ,04 0, ,89

Т1, В1- Х-хромосоми з сайтом рестрихцИ впол1морфн1й посл1довност1. Т2, В2- Х- хромосоми э в1дсутн1ст» сайту. Ml- x-хроносома э 5 ОТАА- повторами, Н2- э 4 такими

повторами. .

Таблиця 3. Пол!морфн! системи pERT- локуса 1 QTAA- танденних тетрануялеотидних повтор!в 3'- нетранслюваноХ облает! гена дистроф!му в ipynt эдоропих я1нок.

Система Генотип ' МО N8 Частота алелей jT*(dfal)

P8BT87-0- Т1Т1 53 80,11 Т1 s 0,8395 8,4«

Taql ' Т1Т2 82 87,78 Т2 = 0,3805

« Т2Т2 12 19,11

pERT87-15- В1В1 88 88,01 В1* 0,7808 -

QasMI 01В2 52 49,07 В2* 0,2102 0,24

Э2В2 ■ 8 7,01

PHRT87-13- Х1Х1 85 70,21 XI« 0,7057 4,47* ,

Хеп1 Х1Х2 89 68,57 Х2 = 0,2943

Х2Х2 7 12,21

ОТАА-поо- М1М1 93 '92,1ё " Н1* 0,98 4,7»

тори Н1Н2 а 7,88 ' Н2= 0,04

Н2Н2 1 0,18 -

* - Р< 0,05, НО- фактична чисельн!сть генотил!в,

ИВ- теоретична чиоальм1сть генотип!в.

I

Високов!рог!дна в!дпоо1дн1сть отриманого та оч!куваного poi-под!л!в спостер!галась для ПДРФ-систенн pBHT87-15-BanHI. У двох !н-НИХ проаиал!эованих сиотемах! pKRT87-15-XnnI i p"8BT87-0-TeqI, а та-коя у систем! QTAA- танденних повтор!в спостер!галася статистично о!рог!днд 1<ов!дпов1дн!сть отриманих при ДНК- аиал!з! групи эдорових а!иох розпод!л!в.гвнотип!в теоретично розрахованим чнсельнсстян. Для б!лыа глибокого анал!зу tbkoï нав!дпов!диост! окремо пор!вшивали покаэннки отриманого та оч!куваного р!вн!в гетероаиготност! по до«л!давним сиотеиам ДНК- анад!ву, як! наведено У трблиц! 4.

Таблиця 4. Гетерозш'отпхсть (очхкувана та выявлена) та

в!дносно вхдхилоннн ви.чвлонох гетерозиготност! (D) ДЛЯ 4 Д1ЛЯНОК хромосоми X в rpyni эдорових StHOK

Система Гетероэи виявлена ГОТН i С Т Ь оч1 купана td D ♦

¥kqt 82 67,78 2.2043 +0,2098

bhulll 52 49,97 0,2891 +0,0400

t>6RTB7-15-Xmnl 89 58,57 1,5519 +0,1781

ПойТори 8 7,68 t 0,4834 . -0,2187

td- значения критерде Стыодента для пор1вняння середн1х показник1в виявленоЯ та очхкувано! гетерозиготност!

При пор!внянн1 эначенъ виявлено¥ та оч1кувано^ гетерозиготнос-*t й fpynt здорових жхнок по 4-х пол1морфних системах було встанов-fce«o, цо цей показиик для полхморфно* системи pERT87-8-TaqI суттево ЫнДОй у пор1в»Я1Шг з теоретично розрахованим (td= 2,2043; Р< 0,05). iU* ucix 1нших систем ДНК- анализу не було вмявлено в!рог!дних Btfl-Vc«лень виявлених pioiiiB готврозиготност! в!д теоретично розрахова-ММХ у в!дпов1Дност1 з р1вновагою Хард1-Вайнберга.

Таким чином, англ1з розпод!лу частот пол!морфних BapiaHTiB у Системах pERT-локусу гена дистроф!ну продемонстрував перевахання у порулнц!* Укра1'ни Х- хромосом з сайтами рестрикции для BanHI, Taql, Xmnl у пол1морфн1й посл1довност1. Taxi закономхрностt буди виявлен!' як для натер1в хворих на м'язеву, днстроф1ю Дюшенна, так i в труп! эдорових ж1нок, а тахох в досл!д*ених рег!ональних популяц1ях Укра-Кни. Д1 дан! в1дпов1дають даним, отриманим по пол1морф!эму ДНК в цнх д1лннках гена дистроФ1ну у деяких 1нших популяциях европи та США [Papihs S.S. et äl., 18Й9] . Можна припустити, цо зберехена о попудяц!Х висока частота Х- хромосом, як! мають в!дпов1днх сайти р&стрикц!* у поелiдовностнх pERT- ¿окусу, еволыцШю гПдтримуеться

в популяцГх. Цхлком !мов!рно, що цоП факт св!дчить про вахливу Функц1оналы1у роль певних вархантхв послхдовност1 ДНК у цих д!лян-кох геному. Як в1домо, одпхею э найвахлнвхпшх характеристик нерхв-новахно зчеплепох систоми, особливо у випадку Х-хроносоми е гетеро-энготн!сть. Результат» досл!дхоннп р!внп останньо^ як серед матвр!в хпорих на м'яэеву днстрофхю Дюшенна. так 1 серед групп здорових жх-нок продемонстрували достатньо високиП р1поиь гетороэиготност! по системам рЕСТ-локусу гена дистрофхна, що дозволяе эробити висновок про перспехтивн1сть викормстання них систем для д!агностики, в тому числх 1 пренатальиоУ,'м'язево1 днстрофх'х Дюпемиа в Украхм!. Бзагалх перевахання гетероэигот в популяцИ часто трактуеться як мохлива селективна перевага гетерознгот по даному локусу в уморах !снування дано! популяЦ11. Очевидно, до таху мохлнв!сть не мохна вхдкннути ! в нашому випадку. Але для остаточного впсновку необх!дно подальше проведения додаткових дослхдкень.

В продовхення ран!ше проведених нани [¡об!т по внкористанню ДКК- маркерхв для оц1нки генетичнох гетерогенностх регхональних популяций Украхни [ Л!вш<ць Л.А. та хн. . 1991], лолхморфн! посл!дов-иост! рЕЙТ- локуса та ОТЛЛ- тандомнх повтори гена дистроф1Ну було внкористано. для аналхэу покаэннкхв схо*ост1 (г) та пхдпов!дних хм критарххв идентичности (I) п чотирьох рег!оиалышх попуЛнц1ях Укрс-1ни. Отриман! дан! свхдчать про хснування-вхрог!дних в!дм!нностей. мхж ки'1ВСЬкою та полтавською (г=0,9928+0,0037, 1-15,18;. Р<0,05), кН1Вськок> та луганською (г=0,9932+0,0028; 1 = 23,673, Р<0,05), а такой мхж львовською та полтавською ! льв!вською та.луганською попу-ляцхями (г=0,9876+0,0045; 1=25,463; Р<0,05; г=0,9903+0,0038; 1=29,482, Р< 0,05). Найбхльш суттевх вхднхнностх булн виявлвн! м!ж полтавською та луганською популяц!ями <г=Р,9884+0,0049; 1=35,754, - Р<0,Т)5). При цьому оц!нка генетичнох гетерогенностх по всхм пол!-морфхзмам ДИК показала, во найб!льта вагомий внесок у встановлен! М!ЖП0ПУЛЯЦ1ЙН! ВХДМ!НИ ВНОСИТЬ ПОЛ1НОрф!ЗМ у ПДРФ-систом1 рЕЙТ87-8-Тад! ((вг=3)=40, 4205; Р<0,001>. На мал.10 представлена дендрограма генетичнох схочост! 4 рег1ональних популяцШ У крайни, . на як!й пидхлено три кластери, в перший з яких входять популяцН Кихва тд Львова, а- другий- полтавська та в трет!й- луганська попу-ляцП.

1 I

I I

I->

Msл.10. Дендрограма генетичноУ cxoiocri полудяцкй! .

1-полтавсьха популяц1я,

2-льв!вська популяц!я,

3-кмУвська популяц!я,

4-луганська популяц!я.

Виснооки ,

1. У хворих на м'яэеву дистроф!ю Дюшенна э ркэних рег!он!» УкраУни досл!дхено частоту та спектр делец!й у м'язево-спецнф!чному , промотор! та 14 ехзонах гена дистроф!ну. локал!эованих 5'- • та:'; центрадьн!й частннах гена. Встановлено. цо абсолютна б!дьв.!сть в»-' явдених делец!й кластрован1 у централенtn частнн! гена, прнчому част!в за все (в 50Х) випадк!в делетовлн! 48 та 50-й екзонк,-

2. Роэроблено модиф!копаннй вар!ант методу мультидокусноХ по-л!меразноУ данцюговоУ реакцН для одмочагного тестування дек!лькох двлеЩй у ген! дистроф1ну.

3. Було проведено анал!з асоц|пцН м'яэевоУ дистрофН Дюшенна а аледьними вар!антамн пол!морф!зму довхини рест£икц!йних фрагмен-• т!в (НДР») посл!довностей !нтрпгенного рЕПТ-локуса гена дистроф!ну.* Не було встановлено slporlAMoi ocoulauti mIi делецкями гена та^пев-ннм типон ндр» pERT-локусу.

4. Анал!з аледьного пол!морф!зму иосл!довностей pERT-локусу гена дистроф1ну у системах pERT07-15-XenI, pEBT87-15-BaoHI, pEBT87-B-TeqI серед член!в родин э високим риэиком м'язево! дистро-Ф1К Дюшенна та соред здорового населения УкраУни продемонстрував в!рог!дне перевахання Х-хромосом э сайтами для в:дпов!дних ендонух-деаэ рестрихц!Х. _

5Г На л1дстав1 отричанмх дзннх про гетерозмготи!сть в анал!эо-ваних ПДРФ-системпх pERT-локусу та ОТАА-тандемних повтор!в » Э'-нетрансльованоУ сбласт! грня дметроф1ну в r'pynt эдорових , .х!нох та матер!в хворих на м'яэопу дистрс-ф!» Дюаенна мохна эробити висно-вок про перспективн!сть використання родинного ПЛРФ-анад!зу в ГЕВТ-локус! для ДНК-д!агностики в УкраУн».

9. Ревультати аналИу пол1морФ»зну ДНК посл1довноствй pSRT-ло-кусу та ОТЛЛ-тандемиих повтор!в тема дистроф!ну св»дчать про геие-тичну гетерогенн1сть досл!д«ених популяцкй, найМльи суттевмй вне-оок » аку вносять м1впопуляц1йи1 а>дм1нноот1 » роэпод1л1 под1морф-них генотип 1в у енотом! pEHT07-8-Te<jI .

Список праць, мадрукованих за темою дисергац1Х<

1. Полиморфизм некоторых ДНК- локусоа Х-хромосомы человека в сам.,*х о высоким риском мыаечной дистрофии Дпаанна и у моровых женщин • Украмне./З.И.Грипко.О.Г.Налярчук, Т.И.Syкиевская, D.О.Баранов// Тезисы докд.II Всео.конф. "Геном человека- 91", Носква, 1991, с 109

2. ДНХ-анаднэ дедеций а гене днетрофина в украинских семьях о высоким риском мивечной дистрофии Дюаенна./ В.И.Грншко, А.Н.Бычкова» Л.П.Иихайлец, Л.А.Ливвиц, Т.И.Бу«невская, в.С.Варанов// Доклады АН, | Украины, 1991, N9, о.150-152. ' ' '

3. Нодливост1 та Аерспэктнви використання ана*1эу дик для д1агнос-тики та'проф1дактики опадковнх эахворхшаиь в Укра1н1./ Л.А.Ливвиц, В.И.Гриако, О.А.Кравченко //Цитолог1я то генетика,1992, т.28, Н4, 0.55-41.

4. Распределение некоторых деяециП в гене диотрофина у пациентов.о. иикэчноЯ дистрофией Дюаенна в Украине/ О.И.Гривко, С.Г.Налярчук,

Л.Д.Лнзанц// Цитология и генетика, 1993, т.27, N2/ с.88-70.

■ ' i

5. Полиморфизм pERT- докуса гона днетрофина а спмьях с высоким'риском ниточной дистрофии Дюаенна и среди здоровых кенцнн Украины/ О.И.Гривко, С.Г.Налярчук, Л.А.Ливвиц// Биополимеры и клетка, 1893, Т.0, Н4, о.103-100.

0. DílA polyaorphlana of hunan ohronoaonea 7 and X ав nurkara for , cnalyala of gateroganelty of hunan populatlona ./L,. A .Llvahlta, ' 3.A.Eravohenko, V.1,0rlshfio, 3.0.Halarohuk// Abstracta of International Conferenoe "Hunan Oenooe H»pplna", tobe, Japan, 1993, AAA3 publ,, 69, -