Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А, прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А, прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A"
□□3444993
На правах рукописи
Щепотина Елена Георгиевна
Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства ЗА, прегнанового X рецептора и вариабельность активности СУРЗА
Г
03 00 04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 4 ИЮЛ 2008
Новосибирск - 2008
003444993
Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Научный руководитель:
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор
Вавилин Валентин Андреевич
доктор биологических наук,
академик РАМН
Ляхович Вячеслав Валентинович
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, Гимаутдинова Ольга Ивановна
доктор медицинских наук, Максимов Владимир Николаевич
Ведущая организация
Институт цитологии и генетики СО РАН
Защита состоится «
2008 г в
часов на заседании
Диссертационного совета Д 001 034 01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул Академика Тимакова, 2, тел 8(383)3335481
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского ииститута биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Автореферат разослан « 2008г
Ученый секретарь
диссертационного совета Русских Г С
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Хорошо известно, что реакция на воздействие химических факторов, в том числе, на прием лекарственных препаратов, индивидуальна и зависит от образа жизни, возраста, пола, этнической принадлежности, состояния здоровья, питания, взаимодействий применяемых лекарств, особенностей метаболизма По некоторым оценкам, от 50 до 90% вариабельности ответов на воздействие ксенобиотиков определяется генетическими особенностями индивидов (Özdemir et al, 2000) Актуальность проблемы безопасности взаимодействия организма с химическими агентами окружающей среды возрастает с расширением числа используемых химических соединений, внедрением в клиническую практику новых лекарственных средств Химические соединения, поступив в организм, подвергаются метаболизму посредством системы ферментов биотрансформации ксенобиотиков Активность этих ферментов определяет протекание процесса обезвреживания токсичных соединений и их метаболитов Основные процессы обезвреживания протекают в печени, где содержание ферментов метаболизма чужеродных соединений превалирует Особо стоит выделить роль суперсемейства цитохромов Р450, отвечающих за первый этап биотрансформации В частности, подсемейство CYP3A, которое составляет в печени 30% от остальных CYP, и метаболизирует порядка 50% лекарственных препаратов (Bertz and Granneman, 1997, Guengerich, 2003) CYP3A участвуют также в различных метаболических реакциях стероидных гормонов (Shou et al, 1997, Stevens et al, 2003), поддерживая гормональный баланс, нарушение которого играет важную роль в развитии ряда заболеваний, таких как рак предстательной железы, рак молочной железы, гипертензия, синдром Кушинга У человека подсемейство цитохромов Р450 ЗА включает четыре фермента CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, содержание которых превалирует в печени, кроме CYP3A43, который в большей степени представлен в предстательной железе Ферменты подсемейства имеют перекрывающуюся субстратную специфичность, что затрудняет оценку их индивидуального вклада в метаболизм ксенобиотиков (Williams et al, 2002) Для всех членов подсемейства характерно гидроксилирование стероидов по öß-положению Это свойство позволяет определять активность ферментов CYP3A неинвазивным способом по эндогенным кортизолу и его бр-гидроксилированному метаболиту, отношение концентраций которых является признанным биомаркером активности CYP3A (Waxman et al, 1994, Furuta et al, 2003)
Метаболический полиморфизм подсемейства был известен еще в середине 1980-х г г, но надежда его объяснить появилась с открытием генетического полиморфизма CYP3A в 1998 году В настоящее время известно более 200 полиморфных вариантов и мутаций в генах CYP3A (www cypalleles ki se, www pharmgkb org) Несмотря на долгий поиск причин вариабельности активности CYP3A, до сих пор нет однозначного ответа на вопрос, что приводит к значительным межиндивидуальным различиям в ферментативной активности, достигающим нескольких десятков раз (Yamamoto et al, 2000) В гене CYP3A4 не обнаружено полиморфного варианта, определяющего подобную вариабельность активности фермента Для CYP3A5 наблюдается
бимодальное распределение активности белка, которое объясняется наличием аллеля *ЗС Данный аллель вносит определенный вклад в активность всего подсемейства, но не определяет все межиндивидуальные различия (Hustert et al, 2001, Kuehl et al, 2001, Sim, 2007) He так давно выявлен вариант CYP3A7*2, белок которого CYP3A7 2 более активен in vitro, чем аллозим «дикого» типа CYP3A7 1 (Rodriguez-Antona et al, 2005) В гене CYP3A43 выявлены три полиморфных варианта белок-кодирующей области, один из которых приводит к редуцированному белку (Cauffiez et al, 2004), но полиморфизму CYP3A43 посвящено мало работ, и его влияние на ферментативную активность не изучено
В последние годы оценка функциональных проявлений открываемых мутаций проводится in vitro, если проводится вообще В то же время, работы, посвященные изучению влияния генетических факторов на активность CYP3A у человека и лабораторных животных in vivo, представлены не для всех полиморфных вариантов Поэтому изучение активности CYP3 А по эндогенным субстратам и поиск ассоциаций генетического полиморфизма с активностью может привнести новые знания в понимание роли генетических факторов в формировании активности всего подсемейства Причина вариабельности активности CYP3A, возможно, кроется не только в изменениях нуклеотидных последовательностей генов подсемейства, но и в регуляции их транскрипционной активации Поэтому комплексное изучение полиморфизма CYP3A и их генов-регуляторов, основным из которых является прегнановый X рецептор, может прояснить генетическую основу вариабельности ферментативной активности CYP3A
Другим важным фактором изменения ферментативной активности CYP3A является возраст Отличия метаболизма ксенобиотиков, обусловленные возрастом, наиболее отчетливо проявляются у новорожденных и лиц пожилого возраста Недостаточно развитая система метаболизма чужеродных соединений у детей младшего возраста делает их особенно чувствительными к ряду токсикантов В литературе отсутствуют данные об изменении метаболической активности CYP3A у детей раннего детства Поскольку ферментативная активность способна существенно изменяться в течение коротких отрезков онтогенеза, изучение возрастной динамики активности также может привести к идентификации важных факторов в регуляции CYP3A
Многими исследователями для обнаружения и выявления мутаций используется метод секвенирования ДНК, который требует специального дорогостоящего оборудования и реактивов и не всегда доступен большинству лабораторий для рутинного генетического анализа Для выявления известных мутаций широко используется метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), а также метод конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP), который позволяет обнаружить как новые, так и уже известные мутации Несмотря на то, что полиморфизм CYP3A изучается многими исследователями, для ряда полиморфных вариантов не предложены способы их детекции методами ПДРФ и SSCP, а для изучения полиморфизма генов PXR и CYP3A43 не найдена
информация об их использовании Поэтому оптимизация методов ПДРФ и ББСР в изучении генов СУР ЗА и РХЯ имеет существенное значение
Цель исследования изучение влияния полиморфизма генов СУРЗА4, СУРЗА5, СУР ЗА 7, СУРЗА43, РХЯ на вариабельность активности СУР ЗА Задачи исследования:
1 Изучить ферментативную активность СУРЗА по содержанию эндогенных кортизола и бр-гидроксикортизола в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в возрастной период от 1 года до 14 лет
2 Оптимизировать способы выявления полиморфных вариантов генов СУРЗА и РХЯ методами полимеразной цепной реакции, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов и конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК
3 Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов и мутаций генов СУРЗА4 (*1В, *2, *5, *17, -11129_-111281пзТОТ), СУРЗА5 (*ЗС, *6), СУРЗА 7 (*2), СУРЗА43 (*1В, *2А) и РХР (-15700Т, -205_-200с1е1САОААС, с 106С>А, g 4444А>0) у здоровых европеоидов
4 Проанализировать ассоциации генотипов СУРЗА и РХЯ с активностью СУРЗА
Научная новизна. Впервые изучено изменение активности СУРЗА, оцененной по бр-гидроксилированию кортизола, в возрастной период с 1 г до 14 лет у европеоидов Впервые выявлено, что основной рост активности происходит в первые два с половиной года жизни, а после 5 лет темпы ее роста снижаются
Предложено выявлять полиморфные варианты и мутации СУРЗА4 (*1В, *2, *5, *17), СУРЗА5 (*ЗС, *6), СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (*1В, *2А), РХК ^ ЮбОА, ё4444А>0, -1570С>Т) методом ПЦР-ПДРФ, вставку СУРЗА4 -11129_-ПШи^ЮТ методом БЗСР и делецию РХЯ -205_-200delGAGAAG полимеразной цепной реакцией с дальнейшим разделением продуктов в 12% полиакриламидном геле
Впервые охарактеризована частота встречаемости аллелей генов СУРЗА4 (*17, *5, -11129 -11128тзТСТ), СУРЗА5 (*ЗС, *6), СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (*1В, *2А), РХЯ -205_-20(МеЮАОААО и нуклеотидных замен РХЯ ^ ЮбОА, g4444A>G, -1570С>Т) у европеоидов России Частота встречаемости изученных полиморфных вариантов и мутаций не отличается от частоты встречаемости в других популяциях европеоидов
Впервые в России проведен анализ сравнения показателя активности СУРЗА, оцененного по бр-гидроксилированию кортизола, у носителей разных генотипов СУРЗА и РХР В группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС среднее значение показателя активности СУРЗА в 3,15 раза выше относительно группы гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС (р=0,014) В группе комбинации гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/*1 среднее значение показателя активности СУРЗА в 3,08 раза ниже относительно группы комбинации гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*1/*2 (р=0,031) В группе комбинации генотипов СУРЗА4*1/*1В, СУРЗА5*1/*3С, СУРЗА7*1/*2 показатель активности СУРЗА в
4,11 раза выше по сравнению с группой комбинации генотипов СУРЗА4*1/*1, СУРЗА5*ЗС/*ЗС, СУРЗА7*1/*1 (р=0,042)
Практическая значимость. Предложенные способы детекции полиморфных вариантов генов СУРЗА и РХЯ могут быть использованы в исследованиях, посвященных изучению функциональных проявлений полиморфных вариантов, в исследованиях по выявлению маркеров предрасположенности к каким-либо заболеваниям, связанным с метаболическими путями, в которые вовлечены СУРЗА и РХЯ, в популяционно-генетических исследованиях Данные о частотах распределения изученных аллелей могут служить материалом для сравнения результатов в популяционных исследованиях другими авторами
Данные об индивидуальной активности ферментов СУРЗА могут иметь важную ценность при назначении лекарственных препаратов и при определении их терапевтических доз Знания об особенностях ферментативной активности СУРЗА особенно важны при комплексной лекарственной терапии для предупреждения нежелательных реакций, которые могут возникать при взаимодействии лекарственных препаратов
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Распределение активности цитохромов Р450 ЗА в возрастной группе от 1 года до 14 лет является полимодальным и позволяет выделить фенотипы со сниженной, средней и повышенной активностью Активность СУРЗА увеличивается с возрастом, максимально выражен прирост активности в период от 1 года до 2,5 лет
2. В группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС наблюдаются более высокие значения показателя активности СУРЗА, относительно группы гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС В группе комбинации гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*]/*2 - более высокие значения показателя активности, относительно группы комбинации гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/*1
3. Распределение полиморфных вариантов генов подсемейства и гена прегнанового X рецептора между фенотипическими группами (сниженная, средняя, повышенная активность) не имеет закономерности Это свидетельствует об отсутствии сильного влияния полиморфизма изученных генов на ферментативную активность СУРЗА, оцененную по бр-гидроксилированию кортизола
Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации изложены на V Молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), Московской конференции вычислительной молекулярной биологии (МССМВ'05) (МГУ, 2005), XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), 10-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино,
б
2006), 9-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), Общероссийской IV научной школе молодых ученых по Экологической генетике (Санкт-Петербург, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008)
Вклад автора Автором лично выполнен весь объем биохимического и молекулярно-генетического анализов Выполнена высокоэффективная жидкостная хроматография с предварительной пробоподготовкой методом жидкостной экстракции и всеми сопутствующими модификациями методов Проведен анализ полиморфных вариантов и мутаций генов CYP3A и PXR и их отбор в исследование Выполнены компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, дизайн праймеров, полимеразная цепная реакция, ферментативный гидролиз, анализ полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК, подготовка проб к секвенированию Все полученные данные проанализированы автором самостоятельно с помощью статистических методов
Подготовка образцов к секвенированию проведена совместно с к б н Катохиным А В (ИЦИГ СО РАН) Секвенирование образцов проводили в ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН (г Новосибирск, http //sequest niboch nsc ru) Забор клинического материала осуществляли сотрудники ДГКБ №1 г Новосибирска под руководством к м н Мананкина Н А
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 в рецензируемой печати
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц, 33 рисунка Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 240 источников
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на выборке здоровых европеоидов г Новосибирска от 1 г до 14 л (п=145) Методом градиентной ВЭЖХ анализировали содержание 6ß-гидроксикортизола (6ß-OHCL) и кортизола (CL) в моче (п=48), по отношению их концентраций оценивали активность CYP3A Гормоны предварительно экстрагировали методом жидкостной экстракции Нами внесены модификации в пробоподготовку и собственно хроматографию относительно исходного метода Lykkesfeldt et al (1994)
Молекулярно-генетический анализ CYP3A и PXR проводили на образцах ДНК, выделенных стандартным фенол-хлороформным методом из лейкоцитов периферической крови (п=145) ПЦР проводили по собственным методикам для вариантов CYP3A4*1B, *2, -11129_-11128insTGT, CYP3A5*3C, *6, CYP3A7*2, CYP3A43*2A, PXR с 106G>A, g4444G>A, -15700T, -205_-200delGAGAAG, кроме CYP3A4*5, CYP3A4*17 (Hsieh et al, 2001) и CYP3A43*1B (Caufflez et al, 2004) Фрагменты ПЦР разделяли в 1,5-2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере Полиморфные варианты выявляли методами ПДРФ и SSCP Для аллелей CYP3A4*1B и ЗА5*ЗС использовали опубликованные методики ПДРФ
7
(Schälk et al, 2000, 2002, соотв), для остальных оптимизировали метод самостоятельно
Фрагменты ферментативного гидролиза разделяли в 8% ГТААГ в трис-боратном буфере Вариант PXR -205_200delGAGAAG выявляли ПЦР с дальнейшим разделением продуктов в 12% ПААГ в трис-боратном буфере Все фрагменты окрашивали бромистым этидием и сканировали в УФ-свете Длину идентифицировали с помощью маркеров точных длин ДНК
Вариант CYP3A4 -11129_-11128insTGT выявляли методом нерадиоактивного SSCP к 10 мкл раствора, содержащего 95% формамид, 10 mM NaOH, 0,05% ксилен цианол, 0,05% бромфеноловый синий, добавляли 10 мкл продукта ПЦР, инкубировали в течение 5 мин при 95°С и быстро охлаждали на льду, денатурированные продукты разделяли в 12% ПААГ, содержащем 10% глицерин, в трис-боратном буфере при 10°С Фрагменты окрашивали нитратом серебра (Bassam et al, 1994)
Анализ последовательностей исследуемых генов, включая поиск сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции исследуемых областей генов, проводили с помощью программы Vector NTI Suite 8 Сравнение последовательностей генов CYP3A (NG_000004) проводили с помощью программы ClustalW (http //www ebi ас uk/clustalw) Дизайн праймеров осуществляли с помощью программы FastPCR (http //www biocenter helsmki fi/bi/bare-l_html/oligos htm)
Статистическую обработку результатов проводили с помощью ППП STATISTICA V 6 0 (StatSoft Inc , США) Распределение генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга При проведении попарного сравнения частот аллелей исследованных вариантов генов между собственными и литературными данными использовали критерий Анализ различий независимых групп осуществляли с помощью критериев Манна-Уитни для двух групп и Краскела-Уоллиса для трех и более групп Анализ связи признаков проводили с помощью метода Спирмена Статистически значимым принимали уровень р<0,05
Характеристика исследуемых вариантов генов CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43 и PXR представлена в таблице 1
Таблица 1
Характеристика изученных вариантов CYP3A4,А5,А7,А43 и PXR
Вариант Функциональное проявление
CYP3A44B (-392A>G) Замена в нифедипин-чувствительном элементе
CYP3A4*2 (с 664Т>С) Ser222Pro Снижает скорость метаболизма нифедипина в 6-9 раз и тестостерона по 6ß-положению in vitro
CYP3A4*5 (с 6530G) Pro218 Arg в сайте связывания эритромицина
CYP3A4* 17(с566Т>С) Phel89Ser Serl89 снижение активности in vitro
CYP3A4 -11129 -11128insTGT Нарушение фактора стимуляции USF1 и снижение активности энхансера на 36%
CYP3A5*ЗС (g 6986A>G) Дефект сплайсинга, преждевременный стоп-кодон
Продолжение таблицы 1
Вариант Функциональное проявление
CYP3A5*6{g 146900А) Образуется транскрипт с делецией 7 экзона, неактивный белок
CYP3A7*2 (g 12260G) Thr409Arg Приводит к повышению активности in vitro
CYP3A43*1B (с 10470T) Синонимичная замена
CYP3A43*2A с 74delA Сдвиг рамки считывания, преждевременный стоп-кодон
PXR с 106G>A Gly36Arg в области AF-1 Нарушает активирование рецептора
Л0Ы5700Т Замена в 5'UTR Может влиять на регуляцию транскрипции
PXR -205 -200 delGAGAAG Делеция 6 п н в промоторе hPAR-2, нарушает сайт связывания с HNF1
PXR g 4444A>G Aspl63Gly
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В мировой популяции человека наблюдаются более чем 50-кратные различия в количествах белка CYP3A4 между индивидами, которые приводят к более чем 20-кратным различиям в клиренсе лекарств (Eichelbaum and Burk, 2001), но до сих пор в литературе обсуждаются причины такой вариабельности В формировании активности предположительно участвует не только полиморфизм самих генов CYP3A, но и их генов-регуляторов, таких как PXR, в меньшей степени САЛ, VDR, а также HNF, который одновременно является и транскрипционным регулятором PXR, CAR и др (Watt and Duncan, 2003) Функционирование транскрипционных факторов определяет как конститутивную, так и индуцибельную экспрессию CYP3A В нашей работе мы проанализировали связь активности CYP3A и полиморфизма генов CYP3A и PXR в группе здоровых европеоидов г Новосибирска
Активность CYP3A
Модификация методов экстракции и ВЭЖХ В исходном методе (Lykkesfeldt et al, 1994) описана твердофазная экстракция на колонках При использовании колонок Sep Pack С)8 мы наблюдали потерю 6ß-OHCL при промывке колонок водой и слишком прочную фиксацию кортизола и внутреннего стандарта сорбентом, для количественного смыва которых требовался большой объем элюента, следствием чего была значительная потеря времени на высушивание образцов Замена твердофазной экстракции жидкостной повысила эффективность экстракции всех трех определяемых соединений
Изменения в проведении ВЭЖХ заключались в изменении профиля градиента, который позволил лучше разделять пики кортизола и внутреннего стандарта, в качестве которого мы использовали метилпреднизолон. Типичные хроматограммы разделения гормонов с известными концентрациями и проб мочи представлены на рисунке 1.
А 2 Б
20.00 30.00 40.00 50.00
Рисунок 1. Типичная хроматограмма гормонов с известными концентрациями
(А) и экстракта мочи (Б) Времена выхода: (1) бЬ-гидроксикортизол - 9,60 мин., (2) кортизол - 31,90 мин., (3) метилпреднизолон - 35,60 мин.
Распределение показателя активности СУРЗА в выборке детей от 1 года до 14 лет и его динамика с возрастом. Значения показателя активности СУРЗА распределялись в выборке неравномерно от 0,303 до 49,0. Тест Шапиро-Уилка на нормальность распределения показал, что распределение показателя активности отлично от нормального (р<0,0001) (рис. 2А). Поэтому в качестве меры центральной тенденции и меры изменчивости мы использовали медиану и процентили, соответственно (Ме [25я; 75я процентили]).
На гистограмме выделяются три основные моды, между ними располагаются антимоды, которые разделяют выборку на группы со сниженной, средней и повышенной активностью (I, II, III, соответственно). При сравнении этих групп с использованием критерия Краскела-Уоллиса выявлено, что они сильно различаются между собой (р=0,0004) (рис. 2Б).
А Б
I
III
0,303 6,795
13,288 19,781 26,274 32,767 39,260
Показатель активности, ед.
а Медиана
□ 25я-75я процентили 1С тш-шах
Рисунок 2. Распределение показателя активности СУРЗА
Анализ фактора пола в качестве возможной причины полиморфного распределения показателя активности выявил отсутствие различий между мальчиками и девочками (р=0,754) (таблица 2). Среднее значение показателя активности в выборке составило 9,65 [5,31; 18,73].
Таблица 2
Показатель активности СУРЗА
Выборка Число наблюдений Показатель активности Р
Ме 25я и 75я процентили
Вся выборка 48 9,65 5,31; 18,73 —
Девочки 35 9,26 4,00; 23,00 0,754
Мальчики 13 9,67 6,37; 18,00
Примечание: р - уровень значимости различий между мальчиками и девочками по критерию Манна-Уитни. Ме - медиана.
Другим фактором, который мог обусловить полимодальный характер распределения показателя активности СУРЗА, является возраст. При анализе зависимости показателя активности от возраста выявлено увеличение показателя активности в период от 1 года до 5 лет (г=0,367, р=0,042); наибольший рост показателя активности СУРЗА наблюдается в группе от 1 года до 2,5 лет (г=0,628, р=0,016) (рис. 3). В период с 5 до 14 лет изменений в показателе активности СУРЗА не выявлено.
Таким образом, активность СУРЗА увеличивается с возрастом, основной прирост наблюдается в первые два с половиной года жизни.
Поскольку показатель активности СУРЗА зависел от возраста, особенно в первые 2,5 года жизни, была проанализирована его вариабельность в узких возрастных интервалах, равных одному году, чтобы уменьшить влияние этого фактора (рис. 4).
г =0.628 р=0.016 ;
--
О......................
• •
1,0 1,2 1,4 1,6 1.8 2.0 2,2 Возраст, лет
Рисунок 3. График рассеяния при анализе корреляционной связи между
показателем активности СУРЗА и возрастом в группах от 1 г. до 2,5 лет
1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 11-1212-1313-1414-15 Возрастной ингервап, лет
Рисунок 4. Вариабельность активности СУРЗА в узких возрастных интервалах
п
Распределение показателя активности СУРЗА показывает, что даже в таких узких возрастных интервалах наблюдается выраженная вариабельность активности СУРЗА (рис 4) Существенно, что и у детей старшего возраста (1415 лет), когда уже не отмечается статистически достоверной зависимости показателя активности СУРЗА от возраста, вариабельность активности СУРЗА достигает десятков раз (таблица 3) Это свидетельствует о том, что в ее формирование вносят вклад генетические факторы
Таблица 3
Возрастная группа N Me [25я ,75я процентили] Минимум Максимум Кратность между крайними значениями, разы
1-2 лет 10 5,69 ГО,94, 12,321 0,30 18,70 62,33
2-3 лет 9 9,62 [8,26, 18,75] 2,27 41,17 18,14
3-4 лет 8 10,91 Г4,92,23,231 1,83 46,39 25,35
4-5 лет 3 16,30 [14,55, 29,781 14,55 29,78 2,05
12-13 лег 3 7,41 [6,37,41,151 6,37 41,15 6,46
13-14 лет 3 7,04 [1,37, 14,091 1,37 14,09 10,28
14-15 лет 10 19,82 [7,74,36,18] 1,75 49,00 28,00
Вся группа 48 9,65 [5,31, 18,73] 0,30 49,00 163,33
Примечание N - число наблюдений Ме - медиана
Поскольку результаты по активности свидетельствуют о важном вкладе генетических факторов, в дальнейшем исследовании были проанализированы ассоциации ферментативной активности с аллельными вариантами регуляторной области СУРЗА4, белок-кодирующих областей СУРЗА5, СУРЗА7, СУРЗА43, а также ключевого фактора транскрипции РХЯ
Оптимизация методов выявления полиморфных вариантов генов СУРЗА и
РХЯ
Предварительно была проведена работа по оптимизации методов выявления полиморфных вариантов, поскольку не для всех мутаций в литературе предложены методы их детекции с помощью ПЦР-ПДРФ и ББСР Для полиморфных вариантов, которые мы выявляли методом ПЦР-ПДРФ, в таблице 4 описаны используемые нами эндонуклеазы рестрикции и представлена характеристика фрагментов, образующихся при ферментативном гидролизе
Таблица 4
Разработанные и оптимизированные методики ПДРФ для выявления
полиморфных вариантов и мутаций СУРЗА и PXR
Вариант Фермент Сайт узнавания Длина фрагментов при гидролизе
«дикий» тип мутантный
CYP3A44B PstI СТССАЛС 224,33,114 24,200,33,114
СУРЗА4*2 BstDEI СТлЫАв 129,146,19 129,165
Продолжение таблицы 4
Вариант Фермент Сайт узнавания Длина фрагментов при гидролизе
«дикий» тип мутантный
CYP3A4*5 BamHI G'GATCC 197,251 448
CYP3A4*17 НруШПГ TCANNGA 396, 52 115,281,52
CYP3A5*3C Sspl AATAATT 53,148, 20 53,168
CYP3A5*6 BstDEI CTANAG 50,103,25, 231 50,128, 231
CYP3A7*2 Acul CTGAAG(N),6A 253 40,213
CYP3A43*1B Bst2UI CCAWGG 21,217,24, 92 21,241,92
CYP3A43*2A Zsp2I ATGCAAT 108 22, 86
PXR с 106G>A BstDEI CTANAG 173,8, 197,58 22,151, 8,197, 58
PXR -1570 ОТ Bst6I CTCTTCNA 195,13 208
PXRx 4444A>G AccBlI GAGYRCC 134 115,19
Примечание Жирным цветом обозначены значимые фрагменты для выявления генотипа N - любой из нуклеотидов, = А или Т, У = С или Т, Я = А или в
Выявление аллеля CYP3A4*1B. Аллель CYP3A4*1B выявляли методом ПДРФ с использованием эндонуклеазы Sspl (Schaik et al, 2000) При воспроизведении ПЦР с праймерами, предложенными van Schaik и соавт (2000), кроме целевого фрагмента мы наблюдали неспецифически амплифицируемые фрагменты, от которых не удалось избавиться изменением концентраций компонентов реакционной смеси и температурного режима
Причиной этого, видимо, служит высокая гомология последовательностей генов CYP3A В работе Раменской и соавт (2002) также предложен способ детекции CYP3A4*1B Сравнение последовательностей генов с помощью программы ClustalW, показало, что последовательности праймеров, предложенные Schaik и Раменской частично повторяются в трех генах CYP3A4, ЗА5, ЗА7 (рис 5А) Вследствие этого, кроме отжига на последовательности CYP3A4, праймеры, вероятно, могут отжигаться и на CYP3A5 и CYP3A7 Интересно отметить, что в работе Раменской не было найдено ни одного аллеля CYP3A4*1B среди 290 европеоидов, хотя его частота в разных популяциях европеоидов составляет около 3% (Ingelman-Sundberg et al, 2007)
Для выявления CYP3A4*1B мы предложили использовать систему вложенных праймеров Были подобраны праймеры для CYP3A4 в наиболее негомологичной области генов CYP3A, для амплификации фрагмента длиной 1544 п н (рис 5Б) - матрицы для синтеза фрагмента длиной 371 п н, который в свою очередь подвергали гидролизу Pstl На рис 5В представлены электрофореграммы разделения продуктов ПЦР и ПДРФ при выявлении CYP3A4*1B
Раменская и соавт, 2002
CYP3A4 CACAGGCACAJ CYP3A7 CACAGCCACAJ CYP3AS CACAGGTACAI
ist------------
van Schaik et al., 2000
CYP3A4 GGGATGAATTTCAAGTATTTTGGAATGA CYP3A7 CGGATCüCT TTCAAGTATT CTGGAATl CYP3A5 AGGATGGAITTCAATTATT CTAGAATC
Раменская и соавт., 2002
GJ, ¡ж с
■ATGCCAATGCCTCCACTTCAGTTTCTGATAAGAACCCAGAACCC ■ATGCCAATCGCTCCACTTGÄGTTTGTGATAAGAACCCAGÄACCC ATGCCAATGCCTCCACTTCÄGTTTCTGATAAGAACCCAGAACCC
Б -855 -839
CYP3A4 СTCTGGC TGTATTAATGÄfiCtäöSGSÄB-----^—fOlCCRGAAAGTCAGAAGGGATGACATGCAGAGGCCCAGCAATCTCAG
CYP3A7 CT[J7'GGCTGTA\,T^T5AfXTAA:.AA[iAT30ArTTi;GTCA^CAGAJy.GTCAGAG&AA j-rSACACAiJAGGG^CCrAGCAATCTCAG
CYP3A5 CCATTAGTCTATTGCTA-------------------TCACCAGAGÄG7G GGAGGGGATGAGAC------GCCCAGCAATCTCAC
* * * **** * ****** * ******* * *** * **************
+673 +689
CVP3A4 GGACCCAAGGAGGATMGGMGGAAlffilllWaCWMCTeSTTCCAAACrrGGCTGTGGAAACCTGGCTTCTCCTrACTAAAC
CYT3A7 GTACCCAG----------------- ------------ --------------------------------СТГАССАААС
CYP3A5 ССТСТТГС--------------------------------------------------------CTGTGCCATGCCCCTGAAAA
van Schalk et al.. 2000
r
CYP3A4 TACCATATAAACAATCCAACAGCCTCACTGAATCACT^ CYP3A7 CAGCATATAAACAATCCAACACCCTCACTGAATCACTG5 CYP3AS CAGCACATAAATCTTTCAGCAGCTtGGCTGAAG-ACTd
242-1.
Рисунок 5. Сравнительный анализ фрагментов последовательностей генов CYP3A4, ЗА5 и ЗА7 (А, Б) и электрофореграммы разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза Pstl при выявлении аллеля CYP3A4*1B (В) А - выделены праймеры, предложенных Schaik et al. (2000) и Раменской и соавт. (2002). Б - праймеры, предложенные нами для амплификации фрагмента длиной 1544 п.н. Знаком «*» отмечены совпадающие нуклеотиды во всех трех генах. В -электрофореграмма 1 - продукты первой ПЦР; 2 - продукты второй ПЦР; 3 -гидролиз, дорожки 1-7 и 9-11 - гомозиготы по аллелю CYP3A4*!, дорожки 8 и 12 -гетерозиготы CYP3A4*1/*1B. М - маркер молекулярного веса ДНК.
Выявление CYP3A4 -11129_-11128insTGT. В 2004 г. Matsumura и соавт. обнаружен и охарактеризован полиморфный вариант в конститутивном печеночном энхансерном модуле CYP3A4 - вставка TGT в положении -11129_-11128. Авторами работы данный вариант предложено выявлять аллель-специфичной ПЦР, используя для синтеза мутантного фрагмента праймер с последним модифицированным нуклеотидом на 3'-конце. При использовании аллель-специфичной ПЦР могут возникать спорные вопросы в идентификации генотипа: велика вероятность синтеза фрагмента с использованием праймера даже с модифицированными последним и третьим с конца нуклеотидами. Поэтому мы предлагаем выявлять CYP3A4 insTGT методом SSCP. На рис. 6 представлены типичные электрофореграммы разделения денатурированных продуктов ПЦР. Фрагменты, имеющие отличающуюся электрофоретическую подвижность, секвенированы, было подтверждено, что они действительно представляют вставку TGT (рис. 6). В исследовании были обнаружены только гетерозиготы по варианту -11129_-11128insTGT CYP3A4, это видно из результата секвенирования (рис.6), и отражено в наложении сиквенса двух последовательностей, один из которых имеет вставку, а другой является фрагментом «дикого» типа.
фрагмент 'дикого" типа
insTGT
Рисунок 6. Электрофореграммы разделения денатурированных продуктов (SSCP-анализ) и результат секвенирования фрагмента, содержащего вставку CYP3A4 -
11129 -11128insTGT
Дорожки 1 и 7 - гетерозиготы, дорожки 2-6, 8 гомозиготы «дикого» типа. М -маркер молекулярного веса ДНК. Фрагменты окрашены нитратом серебра. Результат секвенирования гетерозиготного варианта представлен с праймера R.
Выявление аллеля CYP3A5*3C. Для выявления аллеля CYP3A5*3C мы использовали эндонуклеазу рестрикции Sspl, которую ранее применяли для детекции данного полиморфного варианта в работах van Schaik и соавт. (2002) и Hesselink и соавт. (2003). В результате амплификации с оригинальными праймерыми получали фрагмент длиной 221 п.н., который подвергали ферментативному гидролизу эндонуклеазой рестрикции Sspl.
На рис. 7 представлена типичная электрофореграмма разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза Sspl. Фрагменты длиной 20 и 53 п.н. не видны из-за низкого молекулярного веса.
Рисунок 7. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР (А) и ферментативного гидролиза Sspl «о (Б) при выявлении аллеля CYP3A5 *ЗС
Б: дорожки 2-6 - гомозиготы по аллелю CYP3A5 *ЗС; дорожка I -гетерозигота CYP3A5*IA/*3C. М - маркер молекулярного веса.
Выявление аллеля CYP3A7*2. Для выявления аллеля CYP3A7*2 (c,1226C>G) использовали эндонуклеазу рестрикции Acul. В ходе ПЦР с оригинальными праймерами синтезировался фрагмент длиной 253 п.н., который затем подвергали ферментативному гидролизу. На рис. 8 представлены типичные электрофореграммы разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза при выявлении аллеля CYP3A7*2. Фрагмент длиной 40 п.н. не виден из-за низкой молекулярной массы.
-«-710
168-Н
lllgjvffi 148
Рисунок 8. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР (А) и ферментативного гидролиза Аси! (Б) при выявлении аллеля СУРЗА7*2 Б: дорожки 1,2,4, 5,7-9 - гомозиготы по аллелю СУРЗА7*!, дорожка 6 -гомозигота по аллелю СУРЗА7*2; дорожка 3 - гетерозигота СУРЗА7*1/*2. М - маркер молекулярного веса ДНК.
М 1 23456789
Выявление СУРЗА43*1В. Для амплификации интересующего фрагмента последовательности гена СУРЗА43 использовали праймеры, предложенные Ст{йег и соавт. (2004) для обнаружения мутаций методом ЗБСР. Для выявления аллеля использовали метод ПДРФ-анализа. Фрагменты, синтезирующиеся в ходе ПЦР подвергали ферментативному гидролизу эндонуклеазой рестрикции Вз121Л. На рис. 9 представлены типичные электрофореграммы разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза при выявлении аллеля СУРЗА43*1В.
600300200-
-354
1500
Рисунок 9. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР (А) и ферментативного гидролиза Вз121Л (Б) при выявлении аллеля СУРЗА43*1В
Б: дорожки 1, 2, 4, б, 7 — гомозиготы по аллелю СУРЗА43*1\ дорожки 3,5-гетерозиготы СУРЗА43*1/*1В. М-маркер молекулярного веса ДНК.
3 4 5 6 7
Выявление -15700Т РХЯ. Для амплификации интересующего фрагмента гена РХЯ использовали оригинальные праймеры с модифицированным нуклеотидом для возникновения сайта узнавания эндонуклеазой Вб161. На рис. 10 представлена типичная электрофореграмма разделения продуктов и ферментативного гидролиза при выявлении мутации -15700Т РХЯ.
Рисунок 10. Электрофореграмма разделения продуктов ферментативного гидролиза Вз1б1 при выявлении -15700Т РХЯ Дорожки 2, 6, 10-12 - гомозиготы «дикого» типа; дорожки 1, 3-5, 79, 13 - гетерозиготы -1570С/Т. М - маркер молекулярного веса.
242190-
+-208
1011 1213
Выявление делеции -205_-200с1е!САСААС РХЯ Делецию ОАОААС выявляли полимеразной цепной реакцией с дальнейшим разделением продукта амплификации в 12% полиакриламидном геле. В ходе ПЦР с использованием оригинальных праймеров синтезировались фрагменты длиной 153/147 п.н. На рис. 11 представлена типичная электрофореграмма разделения продуктов ПЦР.
Рисунок 11. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР при выявлении -205_-200с1е1САСААС РХЯ
Дорожки 2,5,7,11,12 - гомозиготы «дикого» типа. Дорожки 4, б, 8-10 - гетерозиготы. Дорожки 1,3-гомозиготы по скЮАвААО РХЯ. М - маркер молекулярного веса.
Выявление с.106С>А РХЯ. Для выявления нуклеотидной замены с.1060>А, использовали метод ПДРФ-анализа. В ходе ПЦР с использованием оригинальных праймеров синтезировался фрагмент длиной 436 п.н., который подвергали ферментативному гидролизу ВбИ^Е!. На рис. 12 представлена типичная электрофореграмма разделения продуктов ПЦР и ферментативного гидролиза при выявлении с. 106в>А РХЯ.
Рисунок 12. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР (дорожка 1) и ферментативного гидролиза ВзШЕ1 (дорожки 2-13) при выявлении с.Ю60>А РХЯ Дорожки 2-5 и 7-13 - гомозиготы сЛОбв. Дорожка 6 - гетерозигота с.ОЮбА. М - маркер молекулярного веса ДНК.
Характеристика изученных полиморфных вариантов генов СУРЗА и РХЯ у здоровых европеоидов г. Новосибирска
В исследуемой группе здоровых европеоидов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при соблюдении равновесия Харди-Вайнберга: СУРЗА4*1В Р=0,934, ¡шТСТ Р=0,932, СУРЗА5*ЗС ^=0,464, СУРЗА7*2 Р=0,569, СУРЗА43*1В Р=0,976, *2А Р=0,947, РХЯ -15700Т Р=0,073, -205_-20С)ёеЮАОААО Р=0,276, сА060>АР=0,930.
При сравнении частот встречаемости аллелей среди европеоидов Западной Сибири и европеоидов других популяций в большинстве вариантов не было выявлено различий (табл. 5).
710-
190157-
436
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Таблица 5
Сравнение частот встречаемости вариантов генов СУР ЗА и РХК у европеоидов __Западной Сибири и других популяций_
Аллель Частота встречаемости мутантного аллеля P
Зап Сибири Литерату рные данные
N % мут N % мут Ссылка
СУРЗА4*1В (-392A>G) 290 2,96 118 196 " _ 520 ~ 546 " 4,20 . -.(Фин.)...... 3,57 зло 3,60...... Sata et al, 2000 Gars a et al, 2005 Spurdie et^a! , 2002 Ball et al, 1999 0,738 0,935 0,897 ~ 0,755
СУРЗА4*2 (с 664Т>С) 290 0,00 110 2,70 (фин) Sata et al, 2000 —
СУРЗА4*5 (с 6530G) 140 0,00 38 0,00 Eap et al, 2004 —
СУРЗА4*17 (с 5661>С) 140 0,00 48 2,10 Dai et al, 2001 —
CYP3A4 -11129.-11128 insTGT 264 1,51 500 3,10 (фр) Matsumura et al, 2004 0,264
CYP3A43*1B (g 335180Т) 210 12,00 98 10,40 (ФР) Cauffiez et al, 2004 0,436
CYP3A43*2A (g 8340delA) 140 6,80 98 5,20 (фр) Cauffiez et al, 2004 0,321
CYP3A5*6 (g 14690G>A) 140 0,00 1000 0,10 (нем) Schaik et al, 2002 —
308 0,00 Roy et al, 2005 —
CYP3A5*3C (g 6986A>G) 290 93,11 190 93,69 Garsa et al, 2005 0,803
1000 91,70 (нем) Schaik et al, 2002 0,514
CYP3A7*2 (g 12260G) 290 7,58 202 8,00 (исп) Rodnguez-Antona et al, 2005 0,891
PXR -15700T 290 43,79 254 " 80 42,13 50,00 ...... www pharmgkb org King et ai, 2007 0,702 0,330 "
PXR-205 -200 delGAGAAG 290 41,08 152 39,00 King et al, 2007 0,511
PXR с 106G>A 290 1,10 228 1,64 www pharmgkb org 0,535
PXR g 4444A>G 140 0,00 418 0,00 Hustert et al, 2001 —
Примечание N - число исследованных аллелей
Интересно отметить, что в работе Ма1зишига е1 а1 (2004) частота встречаемости СУРЗА4 -11129_-11128шзТОТ в два раза выше в популяции европеоидов Франции (3,10%) относительно наших данных (1,51%) (табл 5), впрочем, различия не достигают статистически значимого уровня (р=0,264) Учитывая, что количество обследованных в выборках европеоидов Зап Сибири
18
и Франции отличаются практически в два раза (п=264 и 500, соответственно), можно предположить, что различия могут быть значимыми при исследовании более обширной выборки методом ББСР, при сравнении с данными Ма1зитига е1 а1 (2004) Так, предполагая, что среди 1000 аллелей при выявлении методом ББСР будут наблюдаться 15 аллелей мутантного типа, а при выявлении методом аллель-специфичной ПЦР - 32 аллеля мутантного типа, можем получить статистически значимые различия между этими выборками (р=0,014)
Выявление ассоциаций между изученными полиморфными вариантами и
активностью СУРЗА
При анализе ассоциаций полиморфных вариантов и их комбинаций с показателем активности СУРЗА не было выявлено статистически значимых ассоциаций для вариантов СУРЗА4*1В, СУРЗА7*2, -11129_-1 [ШпиТОТ, ЗА43 *1В, *2А, РХЯ с 1060А, -15700Т, -205_-20(МеЮАОААО (таблица 6)
Таблица 6
Распределение показателя активности СУРЗА в группах генотипов
изученных аллельных вариантов
Вариант Генотипы сравнения Р тест Манна-Уитни (два генотипа) Р тест Краскела- Уоллиса (три генотипа)
СУРЗА4*1В *1/*1 *1/*1В 0,069 —
СУРЗА4 -11129 -ПШниТСТ -/- -/икТСТ 0,600 —
СУРЗА7*2 *1/*1 *1/*2 0,346 —
СУРЗА43*1В *1/*1 *1/*1В 0,328 —
СУРЗА43*2А * 1/* 1 *1/*2А 0,918 —
РХЯ-15700Т СС СТ 0,163 0,151
сс тт 0,757
ст тт 0,129
РХЯ -205_-20(МеЮАОААО -ш 0,117 0,174
-/- 0,928
-Л1е1 <1еШе1 0,193
Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в распределении генотипов по группам с разной скоростью метаболизма кортизола, следует отметить особенности их распределения При анализе распределения полиморфных вариантов регуляторной области СУРЗА4, наблюдается увеличение гетерозигот по аллелю СУРЗА4*1В в группах со средней и повышенной активностью, по сравнению с группой со сниженной активностью, и наоборот, гетерозиготы по аллельному варианту СУРЗА4 -11129_-11128шзТСТ находятся только в группах со сниженной и средней активностью (рис 13А) При анализе распределения полиморфных вариантов, белок-кодирующей области СУРЗА7, СУРЗА43 и интрона СУРЗА5, наблюдается увеличение гетерозигот по аллелю СУРЗА7*2 и уменьшение гомозигот по аллелю СУРЗА7*1, а также увеличивается количество гетерозигот относительно гомозигот по аллелю СУРЗА5*ЗС в направлении от группы со сниженной активностью к группе с повышенной активностью Распределение генотипов по
19
аллелям СУРЗА43*! В и СУРЗА43*2А в группах с различной активностью не имеет закономерности (рис. 13Б).
При анализе распределения полиморфных вариантов регуляторной и белок-кодирующей областей РХК было отмечено снижение количества гомозигот по дикому аллелю РХЯ и увеличение количества гетерозигот по аллельным вариантам РХЯ-1570С>Т и -205_-200с1еЮАСААС в направлении от группы со сниженной активностью к группе с повышенной активностью (рис. 13В).
Выявлены статистически значимые отличия в распределении полиморфных вариантов СУРЗА5*ЗС, СУРЗА7*2, СУРЗА4*1В в группах с разной активностью СУРЗА (таблица 7). Установлено статистически значимое увеличение в 3,15 раза среднего значения показателя активности СУРЗА в группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС относительно группы гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС (р=0,014) (таблица 7).
А CYP ЗЛ4*1В
СУРШ iiuTGT
I II III I II III
I II III I II III I II III I II III
-15700T MCAGAAG
I II III I II III I II III
I ■ сниженная активность
II- средняя активность
III- повышенная активность
Q гомозиготы "дикого" типа Л гегфошготы
[ | гомозиготы "мутантного" типа
Рисунок 13. Распределение генотипов аллельных вариантов регуляторной области СУРЗА4 (А), белок-кодирующей области СУРЗА7, СУРЗА43 и интрона СУРЗА5 (Б), регуляторной и белок-кодирующей областей прегнанового X рецептора (В) в группах с различной активностью СУРЗА
При анализе комбинаций генотипов аллелей СУРЗА5*ЗС и СУРЗА7*2 наблюдается уменьшение показателя активности СУРЗА в группе гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/*1 по сравнению с группой гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*1/*2 (р=0,031) (таблица 7). Различия между группами по медианам составляют 3,08 раз.
При анализе комбинаций генотипов аллелей СУРЗА4*1В, СУРЗА5*ЗС и СУРЗА7*2 наблюдается увеличение показателя активности СУРЗА в группе генотипов СУРЗА4*1/*1В, СУРЗА5*]/*ЗС, СУРЗА7*1/*2 по сравнению с группой генотипов СУРЗА4*1/*1, СУРЗА5*ЗС/*ЗС, СУРЗА7*1/*1 (р=0,042) (таблица 7) При этом различия между группами достигают 4,11 раз
Стоит заметить, что различия между группами не могут быть оценены только при сравнении их средних величин Для комплексной оценки использовали критерий Манна-Уитни для сравнения двух групп генотипов, включающий в себя анализ характера распределения показателя активности СУРЗА в каждой из групп (таблица 7)
Таблица 7
Характеристика распределения показателя активности в группах с разными
генотипами
Генотипы и их Медиана 25я 75я
комбинации процентиль процентиль Р
СУРЗА5
*ЗС/*ЗС 9,443 5,967 16,766 0,014
*1/*ЗС 29,778 8,737 43,545
СУРЗА5+СУРЗА 7
*ЗС/*ЗС+*1/*1 9,443 6,357 16,643 0,031
*1/*ЗС+*1/*2 29,118 8,737 41,167
СУРЗА4+СУРЗА5+СУРЗА7
*1/*1 + *ЗС/*ЗС+*1/*1 9,261 5,577 16,889 0,042
*1В/*1В+*1/*ЗС+*1/*2 38,083 29,778 46,389
Примечание р - уровень значимости различий по критерию Манна-Уитни
В целом можно заключить, что несмотря на выявленные ассоциации между генотипами и их комбинациями аллельных вариантов СУРЗА5*ЗС, СУРЗА7*2, СУРЗА4*1В с показателем активности СУРЗА, характер распределения полиморфных вариантов в разных фенотипических группах (когда гетерозиготный генотип встречается во всех фенотипических группах), все же свидетельствует об отсутствии сильного влияния генетического полиморфизма на вариабельность активности СУРЗА
Изучение полиморфизма цитохромов Р450 подсемейства ЗА и их регуляторных генов, несомненно, является важной задачей в поиске причин вариабельности ферментативной активности подсемейства Знания об активности СУРЗА особенно важны при назначении лекарственных препаратов и при выборе их дозировки, особенно при комплексной лекарственной терапии для предотвращения нежелательных лекарственных реакций, возникающих при взаимодействии соединений Мы выявили статистически значимые ассоциации между некоторыми полиморфными вариантами и их комбинациями с ферментативной активностью СУРЗА Тем не менее, совокупность литературных данных и наблюдаемое распределение показателя активности СУРЗА в собственном исследовании позволяют прийти к заключению, что в отличие от классических примеров фенотипического полиморфизма, когда
можно определенно говорить о «быстром» и «медленном» типе метаболизма, для СУРЗА ситуация является иной Возможно в будущем, с учетом большего числа полиморфных вариантов генов информативность генотипирования возрастет Однако распределение полиморфных вариантов генов подсемейства ЗА и прегнанового X рецептора между фенотипическими группами (сниженная, средняя, повышенная активность) свидетельствует об отсутствии сильного влияния полиморфизма изученных генов на ферментативную активность СУРЗА, оцененную по бр-гидроксилированию кортизола
ВЫВОДЫ
1 Активность цитохромов Р450 подсемейства ЗА в выборке здоровых европеоидов от 1 до 14 лет имеет полимодальное распределение, разделяющее выборку на группы со сниженной, средней и повышенной активностью Между мальчиками и девочками различия показателей активности в этом возрастном интервале отсутствуют (р—0,754)
2 Активность цитохромов Р450 ЗА у детей увеличивается с возрастом Наибольшая сила связи между показателем активности СУРЗА и возрастом наблюдается в группе от 1 года до 2,5 лет (г=0,628,р=0,016)
3 Разработаны способы выявления полиморфных вариантов генов СУРЗА4 (*2, *17), СУРЗА5 (*6), СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (*1В, *2А), РХЯ (-15700Т, с 1060>А, §4444А>в) методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, РХЯ -205_-2()Ос1еЮАОААО полимеразной цепной реакцией и СУРЗА4 -11129_-111281П5ТОТ методом конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов
4 Отсутствуют значимые различия в показателях активности СУРЗА между группами генотипов каждого из вариантов СУРЗА4 -11129_-111291П5ТСГ, СУРЗА43*1В, СУРЗА43*2А, РХЯ с 1060А, РХЯ -15700Т, РХЯ -205_-2СЮс1еЮАОААО в выборке здоровых европеоидов
5 В группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС среднее значение показателя активности СУРЗА выше в 3,15 раза относительно группы гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС (р=0,014)
6 В группе комбинации гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/*1 среднее значение показателя активности СУРЗА в 3,08 раза ниже относительно группы комбинации гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*1/*2 (р=0,031) В группе комбинации генотипов СУРЗА4*1/*В, СУРЗА5*1/*ЗС, СУРЗА7*1/*2 среднее значение показателя активности СУРЗА в 4,11 раз выше, чем в группе комбинации гомозигот СУРЗА4*1/*1, СУРЗА5*ЗС/*ЗС, СУРЗА7*1/*1 (р=0,042)
Список опубликованных работ по теме диссертации
1 Вавилин В А , Щепотпна Е.Г., Мананкин Н А , Казначеева Л Ф , Ляхович В В Активность СУРЗ А у детей // Бюлл Эксп Биол Мед -2004 -Т 138 -№9 - С 272-274
2 Щепотнна Е.Г., Никишина М В , Вавилин В А , Ляхович В В Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов гена цитохрома Р450 ЗА43 и определение частоты встречаемости аллеля СУРЗЛ43* ! В у европеоидов Западной Сибири //Бюлл Эксп Биол. Мед -2005 -Т 140 — № 12 -С 681-684
3 Щепотнна Е.Г., Вавилин В А , Горева О Б, Ляхович В В Некоторые мутации экзона 7 гена СУРЗА4 и их влияние на бр-гидроксилирование кортизола //Бюлл Эксп Биол Мед -2006 -Т 141 -№6 -С 649-651
4 Щепотнна Е.Г. Активность цитохрома Р450 ЗА у детей разного возраста // Материалы V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», Новосибирск, 2004, с 144-146
5 Щепотнна Е.Г. Фенотипирование цитохрома Р450 ЗА4 (СУРЗА4) у детей // Материалы 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2004, с 72-73
6 Щепотнна Е Г. Влияние на активность СУРЗА некоторых аллелей и их частоты встречаемости у здоровых европеоидов Западной Сибири // Материалы 9 Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», СПб, 2006, с 408-409
7 Щепотнна Е.Г. Частоты встречаемости аллелей *1В и *2 цитохрома Р450 ЗА4 (СУРЗА4) и их влияние на активность фермента // Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», Москва, 2006, с 256-257
8 Щепотнна Е.Г. Влияние на активность фермента мутаций гена цитохрома Р450 ЗА4 *2, *5, *17 и их частоты встречаемости // Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2006 с 104
9 Щепотнна Е.Г., Вавилин В А Влияние полиморфизма генов цитохромов Р450 ЗА и прегнанового X рецептора и возраста на активность СУРЗА // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, с 221
Список используемых сокращении
5'UTR- 5' иетранслпруемая область 6[i-OHCL - бр-гидроксикортизол AF-I - лиганд-независимый домен PXR
с - положение нуклеотида в кДНК последовательности (напр , с 653Т) g - положение нуклеотида в геномной последовательности (напр g 6986А) CAR — конститутивный андростановый рецептор HNF - ядерный фактор печени VDR - рецептор витамина D
CLEM - конститутивный печеночный энхансерный модуль
СУР - цитохром Р450
PXR- прегнановый X рецептор
SSCP — конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
Автор благодарит коллег за помощь, оказанную в процессе работы, в частности, к б н Никишину М В за консультации по методам ПЦР и ПДРФ, д м н Вавилина В А за помощь в освоении метода ВЭЖХ и за руководство работой, коллектив ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН (г Новосибирск, http //sequest niboch nsc ru) и лично к б н Катохина А В (ИЦИГ СО РАН) за помощь в секвенировании образцов ДНК, а также коллектив ДГКБ №1 г Новосибирска за предоставление клинического материала
Соискатель Щепотина Е Г
Подписано к печати 02 июня 2008г Тираж 100 экз Заказ М> 12) Отпечатано "Документ-Сервис", 63009Ц Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щепотина, Елена Георгиевна
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Цитохромы Р450 ЗА и их транскрипционный регулятор прегнановый X рецептор
1.1.1. Подсемейство цитохромов Р450 ЗА
1.1.1.1. Экспрессия цитохромов Р450 подсемейства ЗА в различных органах
1.1.1.2. Оценка метаболической активности СУРЗА
1.1.1.3. Геномная организация локуса СУРЗА
1.1.2. Прегнановый X рецептор
1.1.2.1. Внутриклеточная локализация РХЛ и экспрессия РХИ в различных тканях
1.1.2.2. Структура и функциональные особенности белка РХЛ
1.1.2.3. Геномная организация прегнанового X рецептора
1.2. Регуляция СУРЗА
1.2.1. СУРЗА и транскрипционные факторы
1.2.1.1. Ингибирование и индукция СУРЗА
1.2.1.2. Регуляция конститутивной экспрессии СУРЗА
1.2.1.3. Коэкспрессия ядерных рецепторов и СУРЗА
1.2.2. Метилирование СУРЗА4 и ассоциация с количеством мРНК
1.2.3. Функционально активные альтернативно-сплайсированные варианты СУРЗА
1.2.4. Метаболическая активность СУРЗА и генетический полиморфизм СУРЗА и РХЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Характеристика исследуемых вариантов генов СУРЗА4, СУРЗА5,
СУРЗА7, СУРЗА43 и РХЯ
2.2. МАТЕРИАЛЫ
2.2.1. Реактивы
2.2.2. Оборудование
2.3. МЕТОДЫ
2.3.1. Определение 6р-гидроксикортизола и кортизола в моче
2.3.1.1. Жидкостная экстракция гормонов из мочи
2.3.1.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
2.3.1.3. Расчет концентраций гормонов и показателя активности СУРЗА
2.3.2. Выделение ДНК из периферической крови
2.3.3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей изучаемых генов и олигонуклеотидных праймеров
2.3.4: Полимеразная цепная реакция
2.3.5'. Электрофорез и идентификация продуктов ПЦР
2.3.6. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
2.3.7. Ферментативный гидролиз
2.3.8. Анализ продуктов ферментативного гидролиза
2.3.9. Анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (88СР)
2.3.10. Окрашивание ДНК нитратом серебра
2.3.11. Подготовка фрагментов ДНК к секвенированию
2.3.12. Статистический анализ результатов исследования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Распределение показателя активности СУРЗА в выборке детей от 1 года до14 лет и его возрастная динамика
3.2. Анализ полиморфизма СУРЗА4, СУРЗА5, СУРЗА7, СУРЗА43 и РШ
3.2.1. Оптимизация методов выявления аллельных вариантов
3.2.2. Частоты встречаемости аллелей и генотипов изученных полиморфных вариантов
3.3. Выявление ассоциаций между изученными полиморфными вариантами и активностью СУРЗА
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А, прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A"
Хорошо известно, что ответ на воздействие химических факторов, в том числе, реакция на прием лекарственных препаратов, индивидуален и зависит от образа жизни, возраста, пола, этнической принадлежности, состояния здоровья, питания, взаимодействий применяемых лекарств, индивидуальных особенностей метаболизма. По некоторым оценкам, от 50 до 90% неблагоприятных фармакологических ответов определяется генетическими особенностями индивидов (Özdemir et al., 2000). Актуальность проблемы безопасности взаимодействия организма с химическими агентами окружающей среды возрастает с расширением числа используемых химических соединений, внедрением в клиническую практику новых лекарственных средств. Химические соединения, поступив в организм, подвергаются метаболизму посредством системы ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК). Активность этих ферментов определяет протекание процесса обезвреживания токсичных соединений и их метаболитов. Основные процессы обезвреживания протекают в печени, где содержание ФБК превалирует. Особо стоит выделить роль суперсемейства цитохромов Р450, отвечающих за первый этап биотрансформации ксенобиотиков. В частности, подсемейство CYP3A, которое составляет в печени 30% от остальных CYP, и отвечает за метаболизм 60% лекарственных препаратов (Bertz and Granneman, 1997; Guengerich, 2003). CYP3A участвуют также в различных метаболических реакциях стероидных гормонов (Shou et al., 1997; Stevens et al., 2003), поддерживая гормональный баланс, нарушение которого играет важную роль в развитии ряда заболеваний, таких как рак предстательной железы, рак молочной железы, гипертензия, синдром Кушинга и других.
У человека известны четыре гена подсемейства: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43. Все члены подсемейства, кроме CYP3A43, превалируют в печени и имеют перекрывающуюся субстратную специфичность, что затрудняет оценку их индивидуального вклада в метаболизм ксенобиотиков (Williams et al., 2002). CYP3A4 и CYP3A7 в течение развития организма проявляют противоположный профиль экспрессии: у плода CYP3A4 отсутствует, при этом основным представителем подсемейства является CYP3A7, а во взрослом организме CYP3A4 превалирует над CYP3A7 (Lacroix et al., 1997; Sim, 2007). CYP3A5 транскрибируется в печени на всех этапах развития у 10% индивидов (Stevens et al., 2003; Sim, 2007). CYP3A43 экспрессируется в печени в низких количествах, всего 0,1% от CYP3A4. Он экспрессируется в основном в предстательной железе, где, видимо, его роль наиболее важна (Gellner et al., 2001; Domanski et al., 2001). CYP3A43 имеет структурные изменения в наиболее консервативном участке активного центра, поэтому его субстратная специфичность отличается от остальных членов подсемейства (Sim, 2007). Так, выявлено, что CYP3A43 проявляет более низкую активность в 6(3-гидроксилировании тестостерона в сравнении с остальными ферментами подсемейства (Domanski« et al., 2001). Для всех членов подсемейства характерно гидроксилирование стероидов по 6(3-положению. Это свойство позволяет определять активность ферментов подсемейства неинвазивным способом: по эндогенным кортизолу и его 6(3-гидроксилированному метаболиту, отношение концентраций которых является признанным биомаркером активности CYP3A (Waxman et al., 1994; Furuta et al., 2003).
Метаболический полиморфизм подсемейства был известен еще в середине 1980-х г.г., но надежда его объяснить появилась с открытием генетического полиморфизма CYP3A в 1998 году. В настоящее время известно более 200 полиморфных вариантов и мутаций в генах CYP3A (www.cypalleles.ki.se, Ingelman-Sundberg et al., 2005; www.pharmgkb.org, Hewett et al., 2002). Несмотря на долгий поиск причин вариабельности ферментативной активности CYP3A, до сих пор нет однозначного ответа на вопрос, что приводит к значительным межиндивидуальным различиям в1 ферментативной активности. Унимодальное распределение метаболического профиля CYP3A4, наблюдаемое при оценках в. больших выборках, говорит об участии комплекса факторов в формировании ферментативной активности. Для CYP3A5 наблюдается бимодальное распределение, которое объясняется: наличием аллеля ЗА5*ЗС. Данный аллель вносит определенный вклад в активность всего подсемейства, но не определяет все межиндивидуальные различия (Hustert et al., 2001; Kuehl et al., 2001; Sim, 2007). Не так давно выявлен вариант CYP3A7*2, белок которого CYP3A7.2 более активен in vitro, чем- аллозим «дикого» типа CYP3A7.1 (Ródriguez-Antona et al., 2005). В гене CYP3A43 выявлены три полиморфных варианта, один их которых приводит к редуцированному белку за счет раннего стоп-кодона (Cauffiez et al., 2004), но полиморфизмуCYP3A43 посвящено мало работ, и его влияние на ферментативную активность не изучено.
В последние годы оценка функциональных проявлений открываемых мутаций проводится in vitro, если проводится вообще. В то же время, работы, посвященные изучению1 влияния генетических факторов на активность CYP3A у человека и лабораторных животных in vivo, представлены не для всех полиморфных вариантов; Поэтому изучение активности CYP3A по эндогенным субстратам неинвазивными методами может привнести новые знания в понимание роли генетических факторов в формировании активности всего подсемейства. Причина вариабельности активности CYP3A, возможно, кроется не только в изменениях нуклеотидных последовательностей генов подсемейства, но и в регуляции их транскрипционной . активации. Поэтому комплексное изучение полиморфизма CYP3A и их генов-регуляторов, основным из которых является ген прегнанового X рецептора, может прояснить генетическую основу вариабельности ферментативной активности.
Другим важным фактором изменения ферментативной активности CYP3A является возраст. Отличия метаболизма ксенобиотиков, обусловленные возрастом, наиболее отчетливо проявляются у новорожденных и лиц пожилого возраста. Недостаточно развитая система. метаболизма чужеродных соединений у детей младшего возраста делает их особенно чувствительными к ряду токсикантов. В литературе отсутствуют данные об изменении метаболической активности СУРЗА у детей в период с раннего детства до подросткового возраста. Поскольку ферментативная активность способна существенно изменяться в течение коротких отрезков онтогенеза, изучение возрастной динамики активности также может привести к идентификации важных факторов в регуляции СУРЗА.
Многими исследователями для обнаружения и выявления мутаций используется метод секвенирования ДНК, который требует специального дорогостоящего оборудования и реактивов и не всегда доступен большинству лабораторий. Оценка конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (88СР) позволяет обнаружить варианты последовательности гена, как новые, так и уже известные. Для выявления известных мутаций широко используют метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Несмотря на то, что полиморфизм СУРЗА изучается многими исследователями, для ряда полиморфных вариантов не предложены способы их детекции методами ПДРФ и 88СР, а для изучения полиморфизма гена РХЯ нами не найдена информация об их использовании. Поэтому оптимизация методов ПДРФ и ББСР в изучении генов СУРЗА и РХЯ имеет существенное значение.
Цель исследования: изучение влияния полиморфизма генов СУРЗА4, СУРЗА5, СУРЗА7, СУРЗА43, РХЯ на вариабельность активности СУРЗА.
Задачи исследования:
1. Изучить ферментативную активность СУРЗА по содержанию эндогенных кортизола и бр-гидроксикортизола в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в возрастной период от 1 года до 14 лет.
2. Оптимизировать способы выявления полиморфных вариантов генов СУРЗА и РХЯ методами полимеразной цепной реакции, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов и конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК.
3. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов и мутаций генов СУРЗА4 (*1В, *2, *5, *77, -11129-11128т8ТОТ), СТР5А5 (*5С, СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (ЧВ, *2А) и РХЯ (-1570С>Т, -205-200delGAGAAG, с.106С>А, §.4444А>С) у здоровых европеоидов.
4. Проанализировать ассоциации генотипов СУРЗА и /Ш? с активностью СУРЗА.
Научная новизна. Впервые изучено изменение активности СУРЗА, оцененной по бр-гидроксилированию кортизола, в возрастной период с 1 г. до 14 лет у европеоидов. Впервые выявлено, что основной рост активности происходит в первые два с половиной года жизни, а после 5 лет темпы ее роста снижаются.
Предложено выявлять полиморфные варианты и мутации СУРЗА4 (*1В, *2, *5, 47), СУРЗА5 (*ЗС, *б), СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (*1В, ПА), РЖ ^.1060>А, g.4444A>G, -1570С>Т) методом ПЦР-ПДРФ, вставку СУРЗА4 -11129-11 128и15ТОТ методом ввСР и делецию РХЯ -205-2()(МеЮАОААО полимеразной цепной реакцией с дальнейшим разделением продуктов в 12% полиакриламидном геле.
Впервые охарактеризована частота встречаемости аллелей генов СУРЗА4 (47, *5, -11129-11128тзТОТ), СУРЗА5 (*ЗС, *6), СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (*1В, *2А), РХЯ -205-20(МеЮАОААО и нуклеотидных замен РХЯ (§.106С>А, §.4444А>С, -1570С>Т) у европеоидов России. Частота встречаемости изученных полиморфных вариантов и мутаций не отличается от частоты встречаемости в других популяциях европеоидов.
Впервые в России проведен анализ сравнения показателя активности СУРЗА, оцененного по 6(3-гидроксилированию кортизола, у носителей разных генотипов СУРЗА и РХЯ. В группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС среднее значение показателя активности СУРЗА в 3,15 раза выше относительно группы гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС (р=0,014). В группе комбинации гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/*1 среднее значение показателя активности СУРЗА в 3,08 раза ниже относительно группы комбинации гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*1/*2 (р=0,031). В группе комбинации генотипов СУРЗА4*1/*1В, СУРЗА5*1/*ЗС, СУРЗА7*1/*2 показатель активности СУРЗА в 4,11 раза выше по сравнению с группой комбинации генотипов СУРЗА4*1/*1, СУРЗА5*ЗС/*ЗС, СУРЗА7*1/*1 (р-0,042).
Практическая значимость. Предложенные способы детекции аллелей и полиморфных вариантов генов СУРЗА и РХЯ могут быть использованы в исследованиях, посвященных изучению функциональных проявлений полиморфных вариантов, в исследованиях по выявлению маркеров предрасположенности к каким-либо заболеваниям, связанным с метаболическими путями, в которые вовлечены СУРЗА и РХИ., в популяционно-генетических исследованиях. Данные о частотах распределения изученных аллелей могут служить материалом для сравнения результатов в популяционных генетических исследованиях других авторов. Данные об индивидуальной активности ферментов СУРЗА могут иметь важную ценность при назначении лекарственных препаратов и при определении их терапевтических доз. Знания об особенностях ферментативной активности СУРЗА особенно важны при комплексной лекарственной терапии для предупреждения нежелательных реакций, которые могут возникать при взаимодействии лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Распределение активности цитохромов Р450 ЗА в возрастной группе от 1 года до 14 лет является полимодальным и позволяет выделить фенотипы со сниженной, средней и повышенной активностью. Активность СУРЗА увеличивается с возрастом, максимально выражен прирост активности в период от 1 года до 2,5 лет.
2. В группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС наблюдаются более высокие значения показателя активности СУРЗА, относительно группы гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС. В группе комбинации гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*1/*2 - более высокие значения показателя активности, относительно группы комбинации гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/Ч. 3. Распределение полиморфных вариантов генов подсемейства и гена прегнанового X рецептора между фенотипическими группами (сниженная, средняя, повышенная активность) не имеет закономерности. Это свидетельствует об отсутствии сильного влияния полиморфизма изученных генов на ферментативную активность СУРЗА, оцененную по бр-гидроксилированию кортизола.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации изложены на V Молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), Московской конференции вычислительной молекулярной биологии (МССМВ'05) (МГУ,
2005), XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), 10-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино,
2006), 9-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), Общероссийской IV научной школе молодых ученых по Экологической генетике (Санкт-Петербург, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Вклад автора. Автором лично выполнен весь объем биохимического и молекулярно-генетического анализов. Выполнена высокоэффективная жидкостная хроматография с предварительной пробоподготовкой методом жидкостной экстракции и всеми сопутствующими модификациями методов. Проведен анализ полиморфных вариантов и мутаций генов СУРЗА и РХК и их отбор в исследование. Выполнены компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, дизайн праймеров, полимеразная цепная реакция, ферментативный гидролиз, анализ полиморфизма однонитевых фрагментов
ДНК. Все полученные данные проанализированы автором самостоятельно с помощью статистических методов.
Подготовка образцов к секвенированию проводилась совместно с к.б.н. Катохиным A.B. (ИЦИГ СО РАН). Секвенирование образцов проводили в ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН (г. Новосибирск, http://sequest.niboch.nsc.ru). Забор клинического материала осуществляли сотрудники ДГКБ №1 г. Новосибирска под руководством к.м.н. Мананкина H.A.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 в рецензируемой печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц, 32 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 240 источников.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Щепотина, Елена Георгиевна
выводы
1. Активность цитохромов Р450 подсемейства ЗА в выборке здоровых европеоидов от 1 до 14 лет имеет полимодальное распределение, разделяющее выборку на группы со сниженной, средней и повышенной активностью. Между мальчиками и девочками различия показателей активности в этом возрастном интервале отсутствуют {р—0,754).
2. Активность цитохромов Р450 ЗА у детей увеличивается с возрастом. Наибольшая сила связи между показателем активности СУРЗА и возрастом наблюдается в группе от 1 года до 2,5 лет (г=0,628, р=0,016).
3. Разработаны способы выявления полиморфных вариантов'генов СУРЗА4 (*2, 47), СУРЗА5 (*б), СУРЗА7 (*2), СУРЗА43 (*1В, *2А), РХЯ (-15700Т, с.106С>А, gAAAAA>G) методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, РХЯ -205-200с1еЮАСААС полимеразной цепной реакцией и СУРЗА4 -11129-11128тзТОТ методом конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов.
4. Отсутствуют значимые различия в показателях активности СУРЗ А между группами генотипов каждого из вариантов: СУРЗА4 -11129-11129т8ТОТ, СУРЗА43ПВ, СУРЗА43ПА, РХЯ с.106С>А, РХЯ -1570С>Т, РХВ. -205-200delGAGAAG в выборке здоровых европеоидов.
5. В1 группе гетерозигот СУРЗА5*1А/*ЗС среднее значение показателя активности СУРЗА выше в 3,15 раза относительно группы гомозигот СУРЗА5С/*ЗС (р=0,014).
6. В группе комбинации гомозигот СУРЗА5*ЗС/*ЗС и СУРЗА7*1/*1 среднее значение показателя активности СУРЗА в 3,08 раза ниже относительно группы комбинации гетерозигот СУРЗА5*1/*ЗС и СУРЗА7*1/*2 (р=0,031). В группе комбинации генотипов СУРЗА4*1/*В, СУРЗА5*1/*ЗС, СУРЗА7*1/*2 среднее значение показателя активности СУРЗА в 4,11 раз выше, чем в группе комбинации гомозигот СУРЗА4*1/*1, СУРЗА5*3С/*ЗС, СУРЗА7*1/*1 (р=0,042).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щепотина, Елена Георгиевна, Новосибирск
1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. 327 с.
2. Белоусов; Ю.Б., Моисеев В.С., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М., 1997. - 530 с.
3. Головенко Н.Я. Биотрансформация физиологически активных веществ и лекарственных препаратов. В; кн.: Экспериментальная и клиническая; фармакокинетика. -М;, 19881-С. 86-93?
4. Головенко НШ2 Механизмы реакций« метаболизма ксенобиотиков в; биологических мембранах. Киев, 1981. - 220 с.
5. Кукес В .Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. -М.: Реафарм, 2004.
6. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Макарова С.И1, Гришанова А.Ю. Экогенетический аспект полифакторных заболеваний. // Вестник ВОГиС. 2006. - Т. 10. - № 3. - С. 514-519:
7. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж: Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование; М:: :Мир; 1984'.-480"с;
8. Метелица Д.И. Активация; кислорода! ферментными» системами: Мк Наука, 1982.-256 с.
9. Мишин В.М., Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р-450. -Новосибирск: Наука, 1985. 182 с.
10. Нароган М.В. Особенности вегетативной регуляции и энергетического обмена у новорожденных детей: Автореф. дис. док. мед. наук. М., 2007. -47с.
11. Раменская Г.В., Смолярчук Е.А., Кукес: ВШ. Изучение влияния полиморфизма гена: СУРЗА4 на фармакокинетику и клиническую эффективность верапамила. // Бюлл. Экспер. Биол. 2002. - Нрил. 1. -С.71-73.
12. Сычев Д.А., Раменская Г.В., Игнатьева И.В., Кукес В .Г. Клиническая фармакогенетика: Учебное пособие. / Под ред. академика РАМН В.Г. Кукеса и академика РАМН Н.П. Бочкова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -248 с.
13. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека: В 3-х т. Т.2: Пер. с англ. -М.: Мир, 1990. -378 с.
14. Anttila S., Hukkanen J., Hakkola J. et all Expression and localization of CYP3A4 and CYP3A5 in human lung. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997. -V. 16.-N3.-P. 242-249.
15. Bailey D.G., Spence J.D., Munoz C., Arnold J.M.O. Interaction of citrus juices with felodipine and nifedipine. // Lancet. 1991. - V. 337. - P. 268-2691
16. Ball S.E., Scatina J., Kao J. et al. Population distribution and effects on drug metabolism of a genetic variant in-the 5' promoter region of CYP3A4. // Glin. Pharmacol. Ther. 1999. - V. 66. - P: 288-294.
17. Barton R.N., Horan M.A., Weijers J.W.M. et al. Cortisol productions rate and the urinary excretion of 17-hydroxicorticosteroids, free Cortisol, and 60-hydroxicortisol in healthy eldery men and women. // J. Gerontol. 1993. - 48. -P. 213-218.
18. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels// Anal. Biochem. 1991. - V. 196. -Nl.-P. 80-83.
19. Beaune P., Dansette P., Flinois J.P. et al. Partialpurification of« human liver cytochrome P-450. // Biochern; Biophys. Rev. Commun. 1979. - V. 88. - P.1 826-832.
20. Bertilsson G., Heidrich J., Svensson K. et al'. Identification? of. a human nuclear,receptor defines a new signaling pathway for CYP3A induction. // Proc. Natl'. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 12208-12213.
21. Bertz R.J. and Granneman G.R.,Use of in,vitro and in vivo data to estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. // Clin. Pharmacokinet. 1997. - V. 32. - N 3. - P. 210-258.
22. Blanco J.G., Edick M.J., Hancock M.L. et al. Genetic polymorphisms in CYP3A5, CYP3A4 and1 NQOl in children who developed therapy-related myeloid malignancies. // Pharmacogenetics. 2002. - V. 12. - P. 605-611.
23. Blumberg B., Sabbagh Jr.W., Juguilon H. et al. SXR, a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. // Genes Dev. 1998. - V. 12. - P. 31953205.
24. Bosch T.M., Deenen M., Pruntel R. et al. Screening for polymorphisms in the PXR gene in a Dutch population. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2006. - V. 62. -N5.-P. 395-399.
25. Bowler-Wong S.J., Hay D.M., Lorscheider F.L. A protein-binding radioassay for 6beta-hydroxycortisol: detection in pregnancy urine and amniotic fluid. // Am. J. Obstet. Gynecol. 1981. - V. 139. - P. 243-249.
26. Brooks B.A., McBride O.W., Dolphin C.T. et al. The gene CYP3 encoding P450PCN1 (nifedipine oxidase) is tightly linked to the gene COL1A2 encoding collagen type 1 alpha on 7q21-q22.1. // Am. J. Hum. Genet. 1988. - V. 43. - P. 280-284.
27. Burk O. and Wojnowski L. Cytochrome P450 3A and their regulation. // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 2004. - V. 369. - P. 105-124.
28. Burk O., Tegude H., Koch I. et al. Molecular Mechanisms of Polymorphic CYP3A7 Expression in Adult Human Liver and Intestine. // J. Biol. Chem. -2002. V. 277 - N. 27 - P. 24280-24288.
29. Carnahan V.E. and Redinbo M.R. Structure and function of the human nuclear xenobiotic receptor PXR. // Curr. Drug Metab. 2005. - V. 6. - P. 357367.
30. Cauffiez C., Lo-Guidice J.M., Chevalier D. et al. First report of a genetic polymorphism of the cytochrome P450 3A43 (CYP3A43) gene: identification of a loss-of-function variant. // Hum. Mutat. 2004. - V. 23. - N 1. - P. 101.
31. Chen Z., Dunning L.A., Anderson K.E. et al. Within-person variability of urinary 6beta-hydroxycortisol to urinaryl ratios in Caucasian women. // Steroids. 2004. - V. 69. - N 1. - P. 67-70.
32. Chen W.S., Manova K., Weinstei D.C: Disruption of the HNF-4 gene, expressed in visceral endoderm, leads to cell death in embryonic ectoderm andimpaired gastrulation of mouse embryos. // Genes Dev. 1994. - V. 8. - P. 2466-2277.
33. Chrencik J.E., Orans J., Moore L.B. et al. Structural Disorder in the Complex of Human Pregnane X Receptor and the Macrolide Antibiotic Rifampicin // Mol. Endocrinol. 2005. - V. 19. - N 5. - P.l 125-1134.
34. Coon M.J., Strobel H.W., Boyer R.F. On the mechanism of hydroxylation reactions catalyzed by cytochrome P-450. // Drug Metab. Dispos. 1973. - N l.-P. 92-97.
35. Cupp M.J., Tracy T.S. Cytochrome P450: new nomenclature and clinical implications. // Am. Fam. Physician. 1998. - V. 57. - N 1. - P. 107-116.
36. Curi-Pedrosa R., Daujat M., Richard L. et al. Omeprazole and lansoprazole are mixed inducers of CYP1A and CYP3A in human hepatocytes in primary culture. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. - V. 269. - P. 384-392.
37. Dogra S.C., Whitelaw M.L., May B.K. Transcriptional activation of cytochrome P450 genes by different classes of chemical inducers. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1998. - V. 25. - N 1. - P. 1-9.
38. Domanski T.L., Finta C., Halpert J.R., Zaphiropoulos P.G. cDNA cloning and initial characterization of CYP3A43, a novel human cytochrome P450. // Mol. Pharmacol. 2001. - V. 59. - N 2. - P. 386-392.
39. Dotzlaw H., Leygue E., Watson P., Murphy L.C. The human orphan receptor PXR messenger RNA is expressed in both normal and neoplastic breast tissue. // Clin. Cancer Res. 1999. - V. 5. - N 8. - P. 2103-2107.
40. Dussault I., Yoo H.D., Lin M. et al. Identification of an endogenous ligand that activates pregnane X receptor-mediated sterol clearance. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - P. 833-838.
41. Eap C.B., Buclin T., Hustert E. et al. Pharmacokinetics of midasolam in CYP3A4- and CYP3A5-genotyped subjects. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2004. -V. 60.-P. 231-236. , .
42. Eichelbaum M. and Burk O. GYP3A genetics in drug metabolism. // Nat. Med. 2001. - V. 7. - N 3. - P. 285-287.
43. Eiselt: Rl, Domanski T.L., Zibat A. et al. Identification and functional characterization of eight CYP3A4 protein variants. // Pharmacogenetics. -2001.-V. 11.-P. 447-458.
44. Fakhoury M., Litalien C., Medard Y. et al. Localization; and mRNA expression of CYP3A and P-glycoprotein in human duodenum as a function of age. // Drug Metab. Dispos. 2005. - V. 33: - N il. - P. 1603-1607.
45. Felix G.A., Walker A.H., Lange B.J. et al. Association of CYP3A4 genotype with treatment-related' leukemia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. V. 95. - P. 13176-13181.
46. Finta C. and Zaphiropoulos P.G. Intergenic mRNA molecules resulting from trans-splicing. // J. Biol. Chem. 2002 - V. 277. - P. 5882-5890.
47. Finta C. and Zaphiropoulos P.G. The human cytochrome P450 3A locus. Gene evolution by capture of downstream exons. // Gene. 2000. - V. 260. - N 1-2.-P. 13-23.
48. Frantz A.G., Katz F.H., Jailer J.W. 6p-hydroxicortisol and other polar corticosteroids: measurement and significance in human urine. // J. Glin; Endocrinol. Metab. 1961. - V. 21. - P. 1290-1303.
49. Fukuen S., Fukuda T., Matsuda H. et al. Identification of the novel splicing variants for the hPXR in human livers. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2002a. V. 298. - P. 433-438.
50. Furuta T., Suzuki A., Mori C. et al. Evidence for the validity of Cortisol 6 beta-hydroxylation clearance as a new index for in vivo cytochrome P450 3Aphenotyping in humans. // Drug Metab. Dispos. 2003. - V. 31. - N 11. — P. 1283-1287.
51. Garcia-Martin E., Martinez C., Pizarro R.M. et al. CYP3A4 variant alleles in white individuals with low CYP3A4 enzyme activity. // Clin. Pharmacol. Ther. 2002. - V. 71. - P: 196-204.
52. Garfinkel D. Studies on pig liver microsomes // Arch. Biochem. and Biophys. 1958. - V. 77 - N 3. - P. 493-509.
53. Garsa A.A., McLeod H.E., Marsh S. CYP3A4 and CYP3A5 genotyping by Pyrosequencing. // BMC Med. Genet. 2005. - V. 6. - N 9. P.825-841.
54. Ged C., Rouillon J.M., Pichard E. et al. The increase in urinary excretion of 6P-hydroxicortisoli as a marker of? human- hepatic cytochrome P450 IIIA induction. // Br. J. Clin. Pharmacol. 1989. - V. 28. - P. 373-387.
55. Geick A., Eichelbaum M., Burk O. Nuclear receptor response elements mediate induction of intestinal MDR1 by rifampin. // J. Biol. Chem. 2001. — V. 276.-P. 14581-14587.
56. Gellner K., Eiselt R., Hustert E. et al. Genomic organization of the* human GYP3A locus: identification of a new, inducible CYP3A gene. //' Pharmacogenetics. -2001.-V. 11.-P. 111-121.
57. Gibson G.G., Plant N.J., Swales K.E. et al. Receptor-dependent transcriptional activation of cytochrome P4503A genes: induction mechanisms, species differences and interindividual variation in man. // Xenobiotica. 2002.-V. 32.-P. 165-206. 1
58. Goodwin B., Gauthier K.C., Umetani M. et al. Identification of bile acid precursors as endogenous ligands for the nuclear xenobiotic pregnane X receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - P. 223-228.
59. Goodwin B., Hodgson E., D'Costa D.J. Transcriptional regulation of the human CYP3A4 gene by the constitutive androstane receptor. // Mol. Pharmacol. 2002. - V. 62. - P. 359-365.
60. Goodwin B., Hodgson E., Liddle C. The orphan human pregnane X receptor mediates the transcriptional activation of CYP3A4 by rifampicin through a distal enhancer module. // Mol. Pharmacol. 1999. - V. 56. - P. 1329-1339.
61. Gorski J.C., Wang Z., Haehner-Daniels B.D., Wrighton S.A., Hall S.D. The effect of hormone replacement therapy on CYP3A activity. //Clin. Pharmacol. Ther. 2000. - V. 68. - N 4. - P. 412-417.
62. Greuet J., Pichard L., Bonfils C. et al. The fetal specific gene CYP3A7 is inducible by rifampicin in adult human hepatocytes in primary culture. // Biochem Biophys Res Commun. 1996. - V. 225. - N 2. - P. 689-694.
63. Guengerich F.P. Cytochrome P450, drugs, and- diseases. // Mol. Interv. — 2003. V. 3. - 4. - P. 194-204.
64. Guengerich F.P. Reactions and significance of cytochrome P450 enzymes. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 10019-10022.
65. Guengerich F.P. Role of cytochrome P450 enzymes in drug-drug interactions. // Adv. Pharmacol. 1997. - V. 43. - P. 7-35.
66. Guengerich F.P. and Kim D-H. In vitro inhibition of dihydropyridine oxidation and aflatoxin B, activation in human liver microsomes by naringenin: and other flavonoids. // Carcinogenesis. 1990. - V. 11. - P. 2275-22 79.
67. Guengerich F.P. and Shimada T. Oxidation of toxic and carcinogenic chemicalsby human cytochrome P450 enzymes. // Chem. Res. In Toxicol. -1991.-V. 4.-P. 391-407.
68. Haehner B.D., Gorski J.C., Vandenbranden M. et al. Bimodal distribution of renal cytochrome P450 3A activity in humans. // Mol. Pharmacol: 1996. - V. 50,-N1, -P. 52-59. ;
69. Hakkola J., Raunio 11., Purkunen R. et al. Cytochrome P450 3A expression in the human fetal liver: evidence that CYP3A5 is expressed in only a limited number of fetal livers. // Biol. Neonate. 2001. - V. 80. - N 3. - P. 193-201.
70. Hashimoto H., Toide K., Kitamura R. et al. Gene structure of CYP3A4, an adult-specific form of cytochrome P450 in human livers, and its transcriptional control. // Eur. J. Biochem. 1993. - V. 218. - P. 585-595.
71. Hatzis P. and Talianidis I. Regulatory mechanisms controlling human hepatocyte nuclear factor 4alpha gene expression. // Mol. Cell; Biol. 2001. -V. 21. -N 21. - P. 7320-3730.
72. Hayashi K. PCR-SSCP: A Simple and Sensitive Method for Detection of Mutations in the Genomic DNA. // PCR Methods Appl. 1991'. - V. 1. - N 1. -P. 34-38.
73. Hayhurst G.P., Lee Y.Hi, Lambert G. et al. Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis. // Mol. Cell. Biol. 2001. - V. 21. - P. 13931403.
74. Hirota T., Ieiri I., Takane H. et al. Allelic expression imbalance of the human CYP3A4 gene and individual phenotypic status // Hum. Mol. Gen.2004. V. 13. -N 23. - P. 1-11.
75. Homma M., Beckerman K., Hayashi. S. et al. Liquid chromatographic determination of urinary 6beta-hydroxyCortisol, to assess cytochrome p-450'3A activity in HIV positive pregnant women. // J. Pharm. Biomed. Anal. -2000. -V. 23.-N4.-P. 629-635.
76. Hongyo T., Buzardl G.S., Calvert R.J. et al. Cold SSCP: a simple, rapid and non-radioactive method for optimized single-strand conformation polymorphism analyses. // Nucl. Acids Res. 1993. - V. 21. - N. 16. - P. 3637-3642.
77. Honkakoski P. and Negishi M. Characterization of a phenobarbital-responsive enhancer module in mouse P450 Cyp2bl0 gene. // J. Biol. Chem. -1997. V. 272. - N 23. - P. 14943-14949.
78. Honkakoski P., Zelko I., Sueyoshi T., Negishi M. The nuclear orphan receptor CAR-retinoid X receptor heterodimer activates the phenobarbital-responsive enhancer module of the CYP2B gene. // Mol. Cell. Biol. 1998. -V. 18.-P. 5652-5658.
79. Hsieh K.P., Lin Y.Y., Cheng C.L. et al. Novel mutations of CYP3A4 in Chinese. // Drug Metab. Dispos. 2001". - V. 29. - P. 268-273.
80. Hukkanen J, Hakkola J, Anttila S. et al. Detection of mRNA encoding xenobiotic-metabolizing cytochrome P450s in human bronchoalveolar macrophages and peripheral blood lymphocytes. // Mol. Carcinog. 1997. - V. 20. - N 2. - P. 224-230.
81. Hukkanen J., Lassila A., Paivarinta K. et al. Induction and regulation of xenobiotic-metabolizing cytochrome P450s in human A549 lung adenocarcinoma cell line. // Am. J. respire. Cell. Mol. Biol. 2000. - V. 22. -P. 360-366.
82. Hukkanen J., Vaisanen T., Lassila A. et al. Regulation of CYP3A5 by glucocorticoids and cigarette smoke in human lung-derived cells. // Clin. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. - V. 304. - P. 745-752.
83. Hustert E., Zibat A., Presecan-Siedel E. et al. Natural-protein variants of pregnane X receptor with altered transactivation activity toward CYP3A4. // Drug Metab. Dispos. 2001. - V. 29. - N 11. - P. 1454-1459.
84. Ingelman-Sandberg M., Daly A., Nebert D.W. Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee Web Site. Available from: URL: http://imm.ki.se/CYPalleles. Accessed Jan 12, 2005.
85. Ingelman-Sundberg M., Sim S.C., Gomez A., Rodriguez-Antona C. Influence of cytochrome P450 polymorphisms on drug therapies: Pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects. // Pharm. Ther. -2007. V. 116. - N 3. - P. 496-526.
86. Inoue K., Inazawa J., Nakagawa H. et al. Assignment of the human cytochrome P-450 nifedipine oxidase gene (CYP3A4) to chromosome 7 at band q22.1 by fluorescence in situ hybridization. // Jpn. J. Hum. Genet. 1992. - V. 37.-P. 133-138.
87. Janardan S.K., Lown K.S., Schmiedlin-Ren P. et al. Selective expression of CYP3A5 and not CYP3A4 in human blood. // Pharmacogenetics. 1996. - V. 6. -N5.-P. 379-385.
88. John B., Enright A .J., Aravin A J. Human microRN A targets. // PLoS Biol. 2004. - V. 2. - N 11. - P. 1862-1879.
89. Jones S.A., Moore L.B., Shenk J.L. et al. The pregnane X receptor: a promiscuous xenobiotic receptor that has diverged during evolution. // Pharmacogenetics.,- 2000. V. 14. - P. 27-39.
90. Jounaidi Y., Hyrailles V., Gervot L., Maurel P. Detection ofCYP3A5 allelic variant: a candidate for the polymorphic expressionof the protein? // Biochem; Biophys. Res. Gommun; 1996; - V. 221. - P. 466-440;
91. Jover R., Bort R., Gomez-Lcchon M.J., Castcll J.V. Cytochrome P450a regulation by hepatocyte nuclear factor 4 in human hepatocytes: a study using adenovirus-mediated antisense targeting. // Hepatology. 2001V- V. 33. - P. 668-675.
92. Kamiya A., Inoue Y., Gonzalez F.J. Role of the hepatocyte nuclear factor 4alpha in control of the pregnane X receptor during fetal liver development. // Hepatology. 2003. - V. 37. - N 6 . - P. 1375-1384.
93. Kastncr P., Grondona J.M., Mark M. et al. Genetic analysis of RXR alpha developmental function: convergence of RXR and RAR signaling pathways in heart and eye morphogenesis. // Cell. 1994. - V. 78. - N.6. - P. 987-1003.
94. Kawana* K., Ikuta T., Kobayashi' Y., Gotob 0.% Takedas K., Kawajiri K.-Molecular mechanism of nuclear translocation of an orphan nuclear receptor, SXR. // Mol. Pharmacol. 2003. - V. 63. -N3.-P. 524-531.
95. King C.R., Xiao M., Yu J. et al: Identificationtof NR1I2 genetic variation using resequencing. // Eur. J. Glin. Pharmacol. 2007. - V. 63. - N 6. - P. 547554. . '
96. Kishida S. and Fukushima D.K. Radioimmunoassay of 6^-hydroxicortisol in humanjplasma and urine; // Steroidis. 1977. - V. 30; - P. 741-749.
97. Kitada M. and: Kamataki T. Partial purification and properties of cytochrome P450> from homogenates of human fetal livers. // Biochern. Pharmacol. -1979. V. 28. - P. 793-797.
98. Kivisto K.T., Bookjans G., Fromm M:F. et al. Expression of CYP3A4, CYP3A5 and CYP3A7 in human duodenal tissue. // Br. Ji Clin. Pharmacol; -1996. V. 42. - N 3. - P. 387-389.
99. KivistO'K.T., Fritz P., Linder A. et al. Immunohistochemical localization of cytochrome P450 3A in human pulmonary carcinomas and normal bronchial tissue. // Histochem. Cell. Biol. 1995. - V. 103. - N 1. - P. 25-29.
100. Kliewer S.A., Moore J.T., Wade L. et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. // Cell. -1998.-V. 92.-P. 415-421.
101. Klingenberg M. Pigments of rat liver microsomes. // Arch. Biochem. and Biophys. 1958. - V. 75. - N 2. - P. 376-386.
102. Kocarec T.A., Schuetz E.G., Strom- S.C. et al. Comparative analisys of« cytochrome P4503A induction in primary cultures of rat, rabbit, and human hepaticytes. // Drug Metab. Dispos. 1995. - V. 23. - P. 415-421.
103. Koch I., Weil R., Wolbold R. et al. Interindividual variability and tissue-specificity in the expression of cytochrome P450 3A mRNA. // Drug Metab. Dispos. 2002. - V. 30. - N 10. - P. 1108-1114.
104. Kodama S., Koike C., Negishi M., Yamamoto Y. Nuclear receptors CAR and PXR cross talk with FOXOl to regulate genes that encode drug-metabolizing andtgluconeogenic enzymes. // Mol. Cell Biol. 2004. - V. 24. -N18.-P. 7931-7940:
105. Kolars J.C., Lown K.S., Schmiedlin-Ren P. et al. CYP3A»gene expression in human gut epithelium. // Pharmacogenetics. 1994. - V. 4. - N 5. - P. 247259.
106. Kolars J.C., Schmiedlin-Ren P. Schuetz J.D. et al. Identification of rifampin-inducible P450IIIA4 (CYP3A4) in human small bowel enterocytes. // J. Clin. Invest. 1992. - V. 90. - P. 1871-1878.
107. Komori M, Nishio K, Kitada M. et al. Fetus-specific expression of a form of cytochrome P-450 in human livers. // Biochemistry. 1990. - V. 29. - N 18. -P. 4430-4433.
108. Koyano S., Kurose K., Ozawa S. et al. Eleven novel single nucleotide polymorphisms in the NR1I2 (PXR) gene, four of which induce non-synonymous amino acid alterations. // Drug Metab Pharmacokinet. 2002. - V. 17.-№6.-P. 561-565.
109. Krovat B.C., Tracy J.H., Omiecinski CJ. Fingerprinting of cytochrome P450 and microsomal epoxide hydrolase gene expression in human blood cells. // Toxicol. Sci. 2000. - V. 55. - P. 352-360.
110. Kunkel L.M., Smith K.D., Boyer S.H. et al. Analysis of human, Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - N 3. - P. 1245-1249.
111. Kurose K., Ikeda S., Koyano S. et al. Identification of regulatory sites in the human PXR (NR1I2) promoter region // Mol. Cell: Bioch. 2006. - V. 281. -P. 35-43.
112. Kurose K, Koyano S., Ikeda S. et al. 5V diversity of human hepatic PXR (NR1I2) transcripts and identification of the major transcription initiation site // Mol. Cell. Bioch. 2005. - V. 273. - P. 79-85.
113. Lakehal. F., Wendum D., Barbut V. et al. Phase I and phase II drug-metabolizing enzymes are expressed' and heterogeneously distributed in the-biliary epithelium. // Hepatology. 1999. - V. 30. - N 6. - P. 1498-1506.
114. Lamba V., Yasuda K., Lamba J.K. et al. PXR' (NR1I2): splice variants in human tissues, including brain, and identification of neurosteroids and nicotine as PXR1 activators. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004. - V. 199. - N 3. - P. 251-256.
115. Lechevrel M., Casson A.G., Wolf C.R. et al. Characterization», of cytochrome P450 expression in human oesophageal mucosa. // Carcinogenesis. 1999. - V. 20. - N 2. - P. 243-248.
116. Lee C. Urinary 6p-hydroxicortisol in humans: analisys, biological variations, and reference ranges. // Glin. Biochem. 1995: - V. 28. - P. 49-54.
117. Lehmann J.M., McKee D.D., Watson M.A. et al. The human orphan nuclear receptor PXR is activated by compounds that regulate CYP3A4 gene expression and cause drug interaction. // J. Clin. Invest. 1998. - V. 102. - P. 1016-1023.
118. Lepper E.R., Baker S.D., Permenter M. et al. Effect of common* CYP3A4 and CYP3A5 variants on the pharmacokinetics of the cytochrome P4503Aphenotyping probe midazolam in cancer patients. // Clin. Cancer Res. -2005. V. 11. - N 20: - P. 7398-7404.
119. Li A.P., Kaminski D.L., Rasmussen A. Substrates- of human hepatic cytochrome P450 3A4. // Toxicology. 1995. - V. 104. - N 1-3. - P. 1-8.
120. Lown K.S., Bailey D.G., Fontana R:J. et al. Grapefruit juice increases felodipine oral1 availability in humans by decreasing intestinal- CYP3A protein expression. // J. Clin. Invest. 1997. - V. 99. - P. 2545-2553.
121. Mangelsdorf D.J. and Evans R.M. The RXR heterodimers and orphan receptors. // Cell. 1995. - V. - 83. - N 6. - P. 841-850.
122. Marill J., Cresteil T., Lanotte M:, Chabot G.G. Identificationof human cytochrome P450s involved in the formation of alltrans-retinoic acid principal metabolites. // Mol. Pharmacol. 2000.' - V. 58. - P. 1341-1348.
123. Masubuchi N., Li A.P., Okazaki O. An evaluation of the cytochrome P450 induction potential of pantoprazole in primary human hepatocytes. // Chem. Biol. Interact. 1998. - V. 114. - P. 1-13.
124. Masuyama Hi, Hiramatsu Y., Kodama J.I., Kudo- T. Expression and potential roles of pregnane X receptor in endometrial cancer. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. - V. 88. - N 9. - P. 4446-4454.
125. Matsumura K., Saito T., Takahashi Y. et al. Identification of a novel polymorphic enhancer of the human CYP3A4 gene. // Mol. Pharmacol. 2004. -V. 65.-N2.-P. 326-334.
126. Mazumder B., Seshadri V., Fox P. Translational control by the -UTR: the end specify the means. // Trends Biochem. Sci. 2003. - V. 28. - N. 2. - P. 9198.
127. Meyer U.A. Overview of enzymes of drug metabolism. // J. Pharmacokinet. Biopharm. 1996. - V. 24. - N 5. - P. 449-459.
128. Miglioli P.A., Pivetta P., Strazzabosco M. et al. Effect of age on single- and multiple-dose pharmacokinetics of erythromycin. // Eur. J. Clin. Pharmacol. -1990.-V. 39.-P. 161-164.
129. Moore L.B., Goodwin B., Jones S.A. et al. St. John's wort induces hepatic drug metabolism through activation of the pregnane X receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000a. - V. 97. - P. 7500-7502.
130. Moras D. and Gronemeyer H. The nuclear receptor ligand-binding domain: structure and function. // Curr. Opin. Cell. Biol. 1998. - V. 10. - P. 384-391.
131. Nakamoto T., Hase I., Imaoka S. et al. Quantitative RT-PCR for CYP3A4 mRNA in human peripheral lymphocytes: induction of CYP3A4 in lymphocytes and in liver by rifampicin. // Pharmacogenetics. 2000. - V. 10. -P. 571-575.
132. Nebert D.W. and Gonzales F.J. P450 genes: structure, evolution, and regulation. // Ann: Rev. Biochem. 1987. - V. 56. - P. 945-993.
133. Nebert D.W., Nelson D.R., Coon M.J. et al. The P450 superfamily: update on new sequences,gene mapping, and recommended nomenclature. // DNA Cell. Biol.-1991.-V. 10.-P. 1-14.
134. Nebert D.W., Jorge-Nebert L., Vesell E.S. Pharmacogenomics and "individualized drug therapy": high expectations and disappointingachievements. // Am. J. Pharmacogenomics. 2003. - V. 3. - N 6. - P. 361370.
135. Nelson D.R., Kamataki T., Waxman DJ. et al. The P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers, early trivial names of enzymes and nomenclature. // DNA Cell. Biol. 1993. - V. 12. - P. 1-51.
136. Ng M.C., Young R:P., Critchley J.A. et al. Urinary 6 beta-hydroxycortisol excretion in Hong Kong Chinese patients with hepatocellular carcinoma and other chronic liver diseases. // Cancer. 1996. - V. 77. - N 8. - P. 1427-1433.
137. Niemi M., Backman J.T., Fromm M.F. et al. Pharmacokinetic interactions with rifampicin: clinical relevance. // Clin. Pharmacokinet. 2003. - V. 42. - N 9. -P. 819-850.
138. Nolte R.T., Wisely G.B., Westin S. et al. Ligand binding and co-activator assembly of the peroxisome proliferator-activated receptor-y. // Nature. 1998. - V. 395. - N 6698. - P. 137-143.
139. Nowakowski-Gashaw I., Mrozikiewicz P.M., Roots I., Brockmoller J; Rapid quantification of CYP3A4 expression in human leukocytes by real-time reverse transcription-PCR. // Clin. Chem. 2002. - V. 48. - N 2. - P. 366-370:
140. Ohmori S., Fujiki N., Nakasa H. et al. Steroid hydroxylation by human fetal CYP3A7 and human NADPH-cytochrome P450 reductase coexpressed in insect cells using baculovirus. // Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. -1998a.-V. 100.-P. 15-28.
141. Ohmori S., Nakasa H., Asanome K., Kurose Y. et al. Differential catalytic properties in metabolism of endogenous and exogenous substrates among CYP3A enzymes expressed in COS-7 cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1998b. -V. 1380.-P. 297-304.
142. Ohno M., Yamaguchi I., Ito T. et al. Circadian variation of the urinary 60-hydoxicortisol to Cortisol ratio that would reflect hepatic CYP3A activity. // Eur. J. Clin. Pharmacol. V. 55. - P. 861-865.
143. Omura T. and Sato R. The Carbon Monoxide-binding Pigment of Liver Microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. // J. Biol. Chem. 1964. -V. 239. - N 7. - P. 2370-2378.
144. Orans J., Teotico D.G., Redinbo M.R. The nuclear xenobiotic receptor pregnane X receptor: recent insights and new challenges. // Mol. Endocrinol. — 2005. V. 19. - N 12. - P. 2891-2900.
145. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H. et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. // Proc. Natd. Acad. Sci. USA 1989. - V. 86. - P. 2766-2770.
146. Ostberg T., Bertilsson G., Jendeberg L. et al. Identification of residues in the PXR ligand binding domain critical for species specific and constitutive activation. // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 4896-4904.
147. Ourlin J.C., Jounaidi Y., Maurel P., Vilarem MJ. Role of the liver-enriched transcription factors C/EBP' alpha and DBP* in- the expression of human CYP3A4 and CYP3A7. // J. Hepatol. 1997. - V. 2. - P. 54-62.
148. Ozdemir M1., Aktan Y., Boydag B.S. et al. Interaction between grapefruit juice and diazepam in humans. // Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 1998. -V. 23.-P. 55-59.
149. Ozdemir V., Kalow W., Tang B.K. et al. Evaluation of the genetic component of variability in CYP3A4 activity: a repeated drug administration^ method. // Pharmacogenetics. 2000. - V. 10. - P. 373-388.
150. Paine M1F., Khalighi M., Fisher J.M. et al. Characterization of interintestinal and intraintestinal variations in human CYP3A-dependent metabolism. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. - V. 283. - N 3. - P. 1552-1562.
151. Paris P.L., Kupelian.P.A., Hall J.M. et al. Association between a CYP3A4 genetic variant and clinical presentation in African-American prostate cancer patients. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1999. - V. 8-. - N 10. - P. 901905.
152. Park B.K. Assessment of urinary 6b-hydroxycortisol as an in vivo index of mixed-function oxigenase activity. // Br. J. Clin. Pharmacol. 1981. - V. 12. -P. 97-102.
153. Pascussi J.M., Gerbal-Chaloin S., Fabre J.M. et al. Dexamethasone enhances constitutive androstane receptor expression' in human hepatocytes: consequences on cytochrome P450 gene regulation. // Mol. Pharmacol. -2000b. V. 58. - P. 1441-1450.
154. Patel S.B., Toddywalla V.S., Betrabet S.S. et al. Age-related changes in urinary 6p-hydroxicortisol in normal infants. // Indian Pediatr. 1996. - V. 33. -P.398-401.
155. Pichard-Garcia L., Hyland R., Baulieu J. et al. Human hepatocytes in primary culture predict lack of cytochrome P-450 3A4 induction by eletriptan in vivo. // Drug. Metab. Dispos. 2000. - V. 28. - P. 51-57.
156. Plant N. The human» cytochrome1 P450 sub-family: transcriptional1 regulation, inter-individual variation* and interaction networks. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. - V. 1770. - N 3. - P. 478-488.
157. Porter T.D. and Coon M.J. Cytochrome P-450. Multiplicity of isoforms, substrates, and'catalytic and regulatory mechanisms. // J. Biol. Chem. — 1991'. -V. 266; №21. - P: 13469-13472.
158. Rais N., Chawla. Y.K., Kohli K.K. CYP3A phenotypes> and genotypes inNorth Indians. // Eur. J. Clin. Pharmacol: 2006: - V. 62: - P.417-422.
159. Ratanasavanh D., Beaune P.', Morel F. et al. Intraglobular distribution and quantitation'of cytochrome P-450 enzymes hvhuman liver as a function of age. // Hepatology. -1991. V. 13. - N 6. - P. 1142-1151.
160. Rebbeck T.R., Jaffe J.M;, Walker A.H. et al. Modification of clinicalpresentation of prostate tumors by a novel genetic variant in CYP3A4. // Jl Natl. Cancer Inst. 1998. - Y. 90. - P. 1225-1229.
161. Renaud J.P., Rochel N., Ruff M. et al. Crystal- structure of the RAR-gamma ligand-binding domain bound to all-trans retinoic acid. // Nature. 1995. - V. 378.-N6558.-P: 681-689.
162. RiddelBD.C., Wang H., Umbenhauer D. R. et al. Regional,assignment for the genes encoding human P450IIIA3 (CYP3) and P450IIC9 (CYP2C). // Cytogenet. Cell Genet. 1987. - V. 46. - P. 682.
163. Ripp S.L., Fitzpatrick J.L., Peters J.M., Prough R.A. Induction of CYP3A expression by dehydroepiandrosterone: involvement of the pregnane X receptor. // Drug Metab. Dispos. 2002. - V. 30. - N 5. - P. 570-575.
164. Rodrfguez-Antona C., Jande M., Rane A., Ingelman-Sundberg M. Identification and phenotype characterization of two CYP3A haplotypes causing different enzymatic capacity in fetal livers. // Clin. Pharmacol. Ther. -2005. V. 77. - N 4. - P. 259-270.
165. Roy J-N., Lajole J., Zijenah L.S. et al. CYP3A5 polymorphisms in different ethnic populations. // Drug Metab. Dispos. 2005. - V. 33. - P. 884-887.
166. Saenger P. 6b-Hydroxycortisol in random urine samples as an indicator of enzyme induction. // Clin. Pharmacol. Ther. 1983. - V. 34. - P. 818-821.
167. Sata F., Sapone A., Elizondo G. et al. CYP3A4 allelic variants with amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered catalytic activity. // Clin. Pharmacol. Ther. 2000. - V. 67. - N 1. - P. 48-56.
168. Savas U., Wester M.R., Griffin K.J., Johnson E.F. Rabbit pregnane X receptor is activated by rifampicin. // Drug Metab. Dispos. 2000. - V. 28. -P.529-37.
169. Savov A., Angelicheva D., Jordanova A. et al. High percentage acrylamide gels improve resolution in SSCP analysis. // Nucl. Acids Res. 1992. - V. 20. -N24.-P. 6741-6742.
170. Schmiedlin-Ren P., Thummel K.E., Fisher J.M. et al. Induction of cyp3a4 by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin d(3) is human cell line-specific and is unlikelyto involve pregnane x receptor. // Drug Metab. Dispos. 2001. - V. 29. - P. 1446-1453.
171. Schuetz J.D. and Guzelian P.S. Isolation of CYP3A5P cDNA from human liver: a reflection of a novel cytochrome P-450 pseudogene. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 261. - N 1. - P. 161-165.
172. Schuetz J.D., Kauma S., Guzelian P.S. Identification of the Fetal Liver Cytochrome CYP3 A7 in Human Endometrium and Placenta. // J. Clin. Invest. -1993.-V. 93.-P. 1018-1029.
173. Sempoux C., Starkel P., Stevens M. et al. Cytochrome P450 3A proteins are expressed in B lymphocytes but not in T lymphocytes. // Pharmacogenetics. — 1999.-V. 9.-P. 263-265.
174. Shayiq R.M. and Avadhani N.G. Purification and characterization^ of a hepatic mitochondrial cytochrome P-450 active in aflatoxin B metabolism. // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 7546-7554.
175. Silber B.M. //Pharmacogenomics / ed. Kalow W., Meyer U., Tyndale R.F. -New York: Marcel Dekker, 2001.
176. Sim S.C., Edwards R.J., Boobis A.R., Ingelman-Sundberg M. CYP3A7 protein expression is high in a fraction of adult human livers and partially associated with the CYP3A7*1C allele. // Pharm. Gen. 2005. - V. 15. - N 9. -P.625-631.
177. Sim S.C. Genetically determined inerindividual variation in CYP dependent drug metabolism: volecular basis and clinical implications. // Karolinska Instituted Stockholm, 2007.
178. Sladek F.M. and Darnell J.E. Mechanisms of liver-specific gene expression. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1992. - V. 2. - N 2. - P. 256-259.
179. Smirlis D., Muangmoonchai R., Edwards M. et al. Orphan receptor promiscuity in the induction of cytochromes p450 by xenobiotics. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 12822-12826.
180. Spurdle A.B., Goodwin B., Hodgson E. et al. The CYP3A4*1B polymorphism has no functional significance and is not associated with risk of breast or ovarian cancer. // Pharmacogenetics. 2002. - V. 12. - N 5. - P. 355366.
181. Squires E.J., Sueyoshi T., Negishi M. Cytoplasmic localization of pregnane X receptor and ligand-dependent nuclear translocation in mouse liver. // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - N 47. - P. 49307-49314.
182. Standop J., Schneider M.B., Ulrich A. et al. The pattern of xenobiotic-metabolizing enzymes in the human pancreas. // J. Toxicol. Environ. Health A. 2002. - V. 65. - N 19. - P. 1379-1400.
183. Staudinger J.L., Goodwin B., Jones S.A. et al. The nuclear receptor PXR isa lithoholic acid sensor that- protects against liver toxicity. // Proc. Natl; Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 3369-3374.
184. Stevens J.C., Hines R.N., Gu C. et al. Developmental Expression of the Major Human Hepatic CYP3A- Enzymes. // J. Pharm. Exp. Ther. 2003. - V. 307.-P. 573-582.
185. Sumida A., Kinoshita K., Fukuda T. et al. Relationship between mRNA levels quantified by reverse transcription-competitive PCR and metabolic activity of CYP3A4 and CYP2E1 in human liver. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 262: - P: 499-503.
186. Sy S.K., Ciaccia A., Li W. et al. Modeling of human hepatic CYP3A4 enzyme kinetics, protein, and mRNA indicates- deviation from» log-normal distribution in CYP3A4 gene expression. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2002'. -V. 58.-P. 357-365.
187. Synold T.W., Dussault I., Forman B.M. The orphan nuclear receptor SXR coordinately regulates drug'metabolism and efflux. // Nat. Med. 2001. - V. 7. -P. 584-590.
188. Tayeb M.T., Clark C., Sharp L. et al. CYP3A4 promoter variant is associated with prostate cancer risk in men with benign prostate hyperplasia. // Oncol. Rep. 2002. - V. 9. - P. 653-655.
189. Thompson P.D., Jurutka P.W., Whitfield G.K. et al. Liganded VDR induces CYP3A4 in< small intestinal and colon cancer cells via DR3 and ER6 vitamin,D responsive elements. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 299. -P. 730-738.
190. Toddy wall&V.S., Patel S.B., Betrabet S.S. et al. Can chronic maternal drug therapy alter the nursing infant's hepatic drug metabolizing enzyme pattern? // J. Clin. Pharmacol: 1995. - V. 35. - P. 1025-1029.
191. Tirona R.G., Lee W., Leake B.F. et al. The orphan nuclear receptor HNF4alpha determines PXR- and CAR-mediated xenobiotic induction of CYP3A4. // Nat. Med. 2003. - V. 9. - P: 220-224.
192. Tucker G.T: Advances in understanding drug metabolism and its contribution to variability in patient response. // Ther. Drug Monit. 2000. - V. 22.-P. 110-113.
193. Watt A.J., Garrison W.D., Duncan S.A. HNF4: a central regulator of hepatocyte differentiation and function. // Hepatology. 2003. - V. 37. — N 6. -P. 1249-1253.
194. Waxman D;J. P450 gene induction by structurally diverse xenochemicals: central role of nuclear receptors CAR, PXR, and PPAR. // Arch. Biochem. Biophys.-1999.-V. 369:-P. 11-23.
195. Weatherman R.V., Fletterick R.J., Scanlan T.S. Nuclear receptor ligands and ligand-binding domains. // Annu: Rev. Biochem. 1999 - V. 68. - P. 559. ,58i: ' ' • ;.'
196. Westlind A., Malmebo S., Johansson I: et al. Cloning and tissue distribution of a novel human cytochrome p450 of the CYP3A subfamily, CYP3A43. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2001. V. 281. - N 5. - P. 1349-1355.
197. Wilkinson G.R. Cytochrome P4503A (CYP3A) metabolism: prediction of in vivo activity in humans. // J. Pharmacokinet. Biopharm. 1996. - V. 24. - N5.-P. 475-490.
198. Wojnowski L., Hustert E., Klein. K. et al. Re: modification of clinical presentation of prostate tumors bya novel genetic variant in CYP3A4. // J. Natl. Cancer Inst. 2002. - V. 94. - P. 630-631.
199. Wong M:, Balleine R.L., Collins M. CYP3A5 genotype and midazolam clearance in Australian patients receiving chemotherapy. // Clin. Pharmacol. Ther. 2004. - V. 75. - N 6. - P. 529-538.
200. Wrighton S.A., Brian W.R., Sari M.A. et al; Studies on the expression and metabolic capabilities of human liver cytochrome P450IIIA5 (HLp3). // Mol. Pharmacol. 1990. - V. 38.-N 2. - P.207-213.
201. Xie W., Barwick J.L., Downes M. et al. Humanized xenobiotic response in mice expressing nuclear receptor SXR. // Nature. 2000a. - V. 406. - P. 435-9.
202. Xie W., Radominska-Pandya A., Shi Y. et al. An*essential role for nuclear receptors SXR/PXR in detoxification of cholestatic bile acids. // Proc. Natl. Acad. USA. 2001. - V. 98. - P. 3375-3380.
203. Xu H.E., Stanley T.B., Montana V.G. et al. Structural basis for antagonist-mediated recruitment of nuclear co-repressors by PPARa. // Nature. 2002. -V. 415.-N6873.-P. 813-817.
204. Yokose T., Doy M., Taniguchi T. et al. Immunohistochemical study of cytochrome P450 2C and 3A in human non-neoplastic and neoplastic tissues.// Virchows Arch. 1999. - V. 434. - N 5. - P. 401-11.
205. Zeigler-Johnson C., Friebel T., Walker A.H. et al. CYP3A4, CYP3A5, and CYP3A43 genotypes and haplotypes in the etiology and severity of prostate cancer. // Cancer. Res. 2004. - V. 64. - P. 8461-8467.
206. Zhang J., KuehL P., Green E.D. et al. The human pregnane X receptor: genomic structure and identification and functional characterization! of natural allelic variants. // Pharmacogenetics. 2001. - V. 11. - N 7. - P. 555-572.
207. Zheng W., Jin F., Dunning L.A. et al. Epidemiological study of urinary 6beta-hydroxycortisol to Cortisol ratios and breast cancer risk. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2001. - V. 10. - N 3. - P. 237-242.
208. Zhiri A., Mayer H.A., Michaux V. et al. 6p-hydroxicortisol in serum and urine as determined by enzyme immunoassay on microtitre plates. // Clin. Chem. 1986. - V. 32. - P. 2094-2097.
209. Zimniak P. and Waxman DJ. Liver Cytochrome P450 Metabolism of Endogenous Steroid Hormones, Bile Acids, and Fatty Acids. // Cytochrome P450. Handbook of Experimental Pharmacology. 1993. - V. 105.
210. Особую благодарность автор выражает родным за понимание и всестороннюю поддержку.
-
Щепотина, Елена Георгиевна
-
кандидата биологических наук
-
Новосибирск, 2008
-
ВАК 03.00.04
- Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В
- Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450
- Регуляция активности цитохромов Р450 химическими и физическими факторами
- Индуцибельность ферментов биотрансформации ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к гепатоканцерогенному действию орто-аминоазотолуола
- Регуляция активности цитохромов Р450 2В и 1А и экспрессии их генов
