Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм геномной ДНК на видовом и популяционном уровне, исследованной с помощью методов таксонопринта и PCR-RAPD

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм геномной ДНК на видовом и популяционном уровне, исследованной с помощью методов таксонопринта и PCR-RAPD"

^(^О^ЙЙи ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

• » »

им. М.В.ЛОМОНОСОВА

^ 13^ --:-

Биологический факультет

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА

УДК 575.1:576.57.085:577.1.

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОМНОЙ ДНК НА ВИДОВОМ И ПОПУЛЯЦИОННОМ УРОВНЕ, ИССЛЕДОВАННОЙ С ПОМОМОШЬЮ МЕТОДОВ ТАКСОНОПРИНТА И РСВ-ЕАРВ .1 НА ПРИМЕРЕ ДИКИХ, ДОМАШНИХ ОВЕЦ И АГАМНЫХ ВИДОВ РЕПТИЛИЙ) (03.00.03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа была выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского (МГУ) в лаборатории молекулярных механизмов микроэволюции и б институте молекулярной биологии РАН в отделе изотопных исследовании в 1991-1994 годах. .

Научные руководители: доктор биологических наук, проф. Б.М,Медников кандидат биологических наук В.В.Гречко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

A.Л. Мазин

кандидат биологических наук

B.Ф. Орлова

Ведущая организация:

Институт обшей генетики РАН

Зашита диссертации состоится "г^" 1995г. в / Т

часов на заседании специализированного совета Л 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 1995г.

Ученый секретарь специализированного .совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблему. Понятия биологического вида, как группы скрещивающихся естественных популяция, репродуктивно изолированных от других таких же групп (Мейр, 1974), и биологической популяции, как совокупности особей определенного вида, внутри которой скрещивание происходит случайно, являются одними из ключевых в современной биологии. Современная молекулярная биология представила исследователям вида и популяции целый набор методов, позволяющих с разной степенью разрешения дискриминировать генетическую дифференциацию природных группировок организмов.

Нам представлялось целесообразным провести анализ разрешающей способности нескольких новейших методов (таксонопринт. метод амплификации с одним и двумя случайными праямерами) для выработки соответствующих рекомендаций.

Наряду с этим, казалось желательным исследовать возможности использования этих методов для тех группировок организмов, которые, строго говоря, не соответствуют классическим определениям биологического вида и биологической популяции.

Л Цель и задачи исследование Основная цель данного исследования заключалась в изучении степени сходства некоторых участков геномной ДНК, оказавшихся достаточно специфичными, чтобы судить о степени родства между разными видами и внутривидовыми группировками.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести испытания двух новых методов - таксонопринта и амплификации с одним и двумя случайными праямерами (НАРШ с целью оценки возможности их применения для определения генетической дивергенции между близкими видами и популяциями внутри вида.

2. В качестве первой модели для изучения мы использовали лоро-

ды домашних овец. Аналогом природной популяции здесь является стадо, в которой асортативность скрещивания практически 100% (один баран мо^ет быть отцом всех ягнят в популяции). Для сравнения использовались ДНК диких баранов - муфлона и архара. Пара-лельно была поставлена задача исследовать генетическую дифференциацию диких баранов, так как о количестве видов в этой группировке до сих пор ведется дискуссия, а также получить материал о диком предке домашних овец и ареале их доместикации.

3. Вторым объектом исследования были агамные виды кавказских скалистых яшериц. Согласно А.Кэйну (1950) к таким организмам не применимо само понятие биологического вида. По мнению других-исследователей (Даревский, 1993) партеноклоны могут рассматриваться как отдельные виды, характеристика которых, однако, не соответствует полностью классическим характеристикам вида. В данной работе были исследованы не только партеногенетические виды, предположительно возникшие в результате гибридизации между нормальными бисексуальными видами, но и эти бисексуальные формы. Как и в случае первой модели, помимо чисто методических и молекулярно-биологических проблем была поставлена задача - проверить предположения о родительских формах этих видов.

Научная новизна исследование. В настоящей работе методами таксонопринта и ЙАРБ с одним и двумя случайными праймерами в геномах ящериц и овец выявлены достаточно гомогенные повторяющиеся последовательности ДНК. Исследование выявленных семейств повторяющихся последовательностей в будущем позволит получить данные об их функциональной значимости в геноме.

В данном исследовании впервые в геносистематике овец использован метод таксонопринта, а также метод полимеразной цепной реакции с одним и двумя случайными праймерами для филогенетичес-

кого анализа родства диких, домашних форм овец и ящериц рода Lacerta.

Практическая и теоретическая ценности. Полученные данные указывают на возможность, перспективность и информативность использования методов таксоноприНта и полимеразной цепной реакции с единичным и двумя случайными праймерами для оценки межвидовой и внутрипопуляционной дивергенции, а также родственных связей между исследованными дикими и домашними овцами и ящерицами рода Lacerta.

Теоретическая ценность работы обусловлена ее вкладом в разработку вопросов эволюции и происхождения партеногенетических организмов, путей доместикации животных, а также вопросов, связанных с выяснением функциональной значимости повторяющихся последовательностей в геномах эукариот.

Апробация работу. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета ИГУ и сектора эволюционной биохимии Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского (МГУ), октябрь 1994 г.

Объем работы^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и- их обсуждения и выводов. Работа изложена на / ^страницах машинописного текста, включает <¿ ¿ рисунков и / / таблиц. Список использованной литературы содержит / источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служила тотальная ДНК архара, муфлона и следующих пород овец: казахской тонкорунной, выведенной путем скрещивания казахских курдючных овец с тонкорунными баранами типа прекос; эдильбаевской, одной из древнейших казахских пород: каракульской - выведенной много веков назад в Средней Азии в районе

Бухары; породы линкольн, западноевропейской породы овец, выведенных в Англии; кроссбреда, полученного путем воспроизводительного скрещивания между породой линкольн с матками казахских тонкорунных овец; овец от прямого и реципрокного скрещивания межау эдиль-баевскими и казахскими тонкорунными овцами; гиссарской породы грубошерстных, курдючных мясо-сальных овец, происхождение которых недостаточно выяснено. Архар был добыт в заповеднике Аксу-Джабаглы, муфлон - из Бакинского зоопарка. Исследовались также ДНК так называемых скальных яшериц Кавказа (рода Lacerta), "знаменитых" тем, что в состав этой группы входят пять партеногенетических, т.е. размножающихся без оплодотворения форм, рассматриваемых сейчас систематиками как отдельные виды (Даревский, 1993). Четыре из них были в нашем распоряжении: I.armeniaca, I.dahli, L.rostombekovl и I.unisexual Is. Предполагается, что эти виды образовались в результате межвидового скрещивания других, двуполых видов этой группы: I.mixta, I.valentinl, I.portschínskíi, I.raddel и L.mlrensls (см. схему).

Препараты ДНК овец из фиксированных 96% этанолом семенников, выделяли по методу Арриджи (1958) в модификации Антонова (1965), препараты ДНК ящериц выделяли из крови методом фенол-хлороформной депротеинизации после обработки лизированных ядер протеиназой К (Mathew, 1684). По своим физико-химическим характеристикам выделенные образцы ДНК были пригодны для их анализа избранными методами .

Основными методами исследования являлись метод таксо-нопринта, метод PCS-RAPD с единичным случайным, праймером или с двумя случайными праймерами.

Методика таксонопринта, разработанная Федоровым и соавторами (1992) включает гидролиз ДНК какой-либо рестрикционной эндонукле-

азой, мечение укороченных ("липких") 3 '-концов рестриктазных фрагментов методом достройки с помощью фрагмента Кленова ■ ДНК-полимеразы I с использованием (а-Р32ШТР и последующее электро-форетическое Фракционирование фрагментов ДНК в 10% неденатурирую-щем полиакриламидном геле с авторадиографией в течении 2-3 суток.

Методика полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров (РСН-ЙАРБ) заключается в амплификации с одним или двумя случайными праймерами тотальной ДНК с последующим электро-форетическим фракционированием продуктов амплификации в 1,4Ж-ном агарозном (для единичного праймера) и в 6% полиакриламидном (для двух случайных праймеров) геле. После окраски геля бромистым эти-дием (0,05Ж) его фотографируют в ультрафиолетовых лучах через светофильтр ОС-12 на пленку Микрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Результаты исследования ДНК овец методом таксонопринта.

Как отмечалось ранее в работах Федорова с соавторами набор электрофоретических полос, образующихся после исчерпывающего гидролиза суммарной ДНК какой-либо рестрикционноя эндонуклеазой и концевого мечения фрагментов гидролиза радиоактивной меткой, характеризует расположение сайтов гидролиза данной зндонуклеазы в семействах повторяющихся элементов ДНК. Этот молекулярный признак оказался весьма консервативным и очевидным образом связанным с характеристикой вида по другим систематическим признакам.

В нашей работе мы попытались применить этот метод для характеристики исследуемой группы диких баранов и овец, надеясь выяснить степень филогенетической близости и расхождения как диких видов, так и происшедших от них одомашненных форм по этому молекулярному признаку, характеризующему повторы ДНК (таксонопринт>.

а 6 с

ШШГМизН¿3444 7 Н

1 .«Г

Рис.1 Таксонопринты ДНК овец по эндонуклеазам Шп/1 (а) и стз I (б), с- схема. 1-архар, 2-муфлон, 3-казахская тонн рунная, 4-гиссар, 5-лш5кольн, 6-каракуль, 7-эднльбай. М-маркеры,' Н-нуклеотиды (ДНК плазмиды рвизгг, переваренная эндонуклеазой нбрт.)

Рестриктазныя анализ проводили, используя рестрикционные эн-донуклеазы (далее рестриктазы) А1иI, ЫБр1, Тад1, СТгI, Н1пГ1 и Мзе1. Электрофоретические картины продуктов расщепления каждой из рестриктаз, специфика которых была различной в зависимости от рестриктазы, оказались идентичными у всех групп, включая и дикие и одомашненные формы овец.

В качестве примера на рис. 1 представлены таксонопринты ДНК следующих пород овец: казахской тонкорунной, линкольн, гиссар-ской, каракуль, эдильбаевской, а также архара и муфлона по двум рестриктазам. Видно, что таксонопринты всех семи групп овец одинаковы по числу и интенсивности полос при использовании каждой из рестрикционных эндонуклеаз.

В таблице 1 перечислены все эти полосы с указанием приближенных размеров по сравнению с размерами маркерных фрагментов ДНК рВй322, гидролизованной Мзр1.

Таблица 1

Длины рестриктазных фрагментов в таксонопринтах ДНК архара, муфлона и домашних овец

Рестриктаза Сайт растепления Размеры фрагментов. п.н.

Н1пП й^АНТС 230, 170, 145, 130, 122, 110. 100,

85, 78, 74, 67 , 58, 52, 45

№гр1 С+ССС 700, 527, 500, 275, 260, 215, 190

180, 175, 140, 120, 67, 50, 34

Мг131 С4-СИСС 200, 130, 90, 78, 75, 58 , 50

А1и1 АС*СТ 300. 260, 235. 215. 160. 140. 42

Тац1 ШСк 180, 160, 140. 105. 80, 75, 64. 58

55

Мее! ТЯАА 200. 155, 100. 55

Дикие бараны Евразии (без учета снежного барана северо-востока Сибири, еще мало изученного) в разное время рассматривались или как принадлежащие к семнадцати видам или к одному -Ovis аштоп I. Воронцов и соавторы (1972) считают, что дикие бараны подразделяются на три вида - переднеазиатския муфлон Ovis orlentalls' (2п=54), как и у всех домашних овец), уриал Ovis

vignei (2n=5ö) и архар Ovis ammori (2п=56). Как полагает H.H. Во>

ронцов, домашние овцы ведут начало от муфлона и были одомашнены в Передней Азии и лишь затем распространились на запад и восток.

Известно, однако, что все формы диких и домашних баранов не-ограничено скрещиваются и гибриды их плодовиты. В природе существуют гибридные зоны скрещивания уриала с муфлоном и архаром (Соколов 1963). Орлов (1978) указывает, что транслокации центрического соединения слабо нарушают мейоз и не снижают плодовитость гибридов. Нам кажется более привлекательным предложение рассматривать диких баранов как один политипический вид Ovis ашаюп L. с тремя хромосомными расами, рекомбинация между которыми ограничивается не столько структурой кариотипа, сколько разделенностью горных систем - их мест обитания. Идентичность таксонопринтов по нашим данным свидетельствует в пользу этого мнения.

Монофилетичность всех пород домашних овец также не бесспорна. Мы знаем по крайней мере два достоверно аргументированных примера; когда порода выводилась путем скрещивания с другими формами -архаром и уриалом: архаромеринос - гибрид между тонкорунными овцами и архаром, выведенный по инициативе Н.И. Вавилова и В.Я. Jly-са, и порода бабатагских овец, являющихся гибридами серых каракулей с уриалом (Глазко, 1985; Гигенейшвили, 1980).

По данным молекулярной гибридизации ДНК IТурарбеков и др.,

I98ÖI, близость к архару установлена и у других пород - в частности каракулей. О том же свидетельствуют данные RAPD, полученные нами. Все это позволяет заключить, что происхождение домашних овец не монофилетично. Возможно, овца действительно была одомашнена в Передней Азии, но расселяясь на восток и запад везде, где обитали дикие бараны, скрещивалась с ними. Однако за давностью этих гибридологических экспериментов следов о них не осталось.

Десять видов яшериц рода Lacerta (п/р Arehaeolacerta) методом таксонопринта в данной работе не исследовали, но такой анализ ранее был произведен (Гречко и др., 1993) и обнаружил удивительное сходство всех этих видов (см. Схему). Различия были обнаружены только по двум видам таксонопринтов - при использовании рес-триктаз Csfßl и fisuI, что и позволило подразделить всю группу из 10 видов на 2 равные подгруппы, Енутри которых виды не отличались друг от друга. Это свидетельствовало, как и в случае диких и домашних овец, о недавних сроках начала видообразования этих видов.

2 Результаты исследования ДНК овец и ящериц рода Lacerta методом RAPD (Randomly Amplified Polymorfic DNA).

Далее, для обнаружения межпопуляционных различий, мы избрали другой метод, позволяющий, судя по литературным данным, обнаруживать в ряде случаев более тонкие различия в структуре ДНК, связанные с разделением видов, популяций и штаммов (Welsh et al, 1990; Williams et al, 1990). Это метод амплификации анонимных участков ДНК при использовании случайных праймеров. Неисчерпаемое разнообразие последовательности ДНК позволяет обнаруживать фрагменты, фланкированные короткими последовательностями, комплементарными к случайно выбранным олигонуклеотидам. В ДНК имеются как участки, ограниченные одинаковыми кусками, выявляемыми при амплификации с единичным олигонуклеотидом,

так и участки, выявляемые при использовании дуплетов разных случайных праймеров. И в том и в другом случае образуется набор полос амплифицированных участков ДНК, весьма специфичный для исследуемой ДНК (Welsh et al, 1991).

Предварительно следует сделать несколько замечаний методического плана. В настоящее время неясно, чем определяется различная интенсивность амплификации разных участков ДНК, проявлявшаяся в разной и зачастую сильно различающейся интенсивности полос одной длины у разных видов и пород исследуемых нами животных. Неясно, следует ли принимать во внимание наличие слабой или едва намечающейся полосы в том месте, где у сопоставляемой ДНК имеется ярко выраженная интенсивная полоса. Очевидна невысокая степень разрешения полос при небольших расстояниях, разделяющих полосы на ага-розном геле; с другой стороны, поскольку длина получаемых фрагментов велика, то использование даже 5%-ных полиакриламидных гелей не дает хороших результатов. В связи с этим сравнительные исследования, подобно нашей работе, имеют качественный характер. В настоящей работе при сравнении были учтены практически все видимые на геле полосы. Тем не менее, несмотря на сделанные замечания, следует сказать, что метод PCR-RAPD действительно открывает хорошие возможности для изучения филогенетического родства между таксонами. Он может дать информацию о множестве локусов ДНК, что неизмеримо расширяет число вовлекаемых в г равнительный анализ групп ДНК по этим молекулярным признакам, а) Объект исследования - дикие бараны и овцы.

В своей работе мы предприняли попытку изучить паттерны продуктов RAPD перечисленных домашних пород овец и их диких родичей, а также еще трех пород: кроссбреда, гибридов F от скрещивания баранов эдильбаевской породы с матками казахских тонкорун-

Рис.2 Сравнение картин электрофоретического разделения продуктов рсн-нарп с одним праймером ДНК домашних и диких овец (а), б-схема. 1-архар, 2-муфлон, 3-гиссар, 4-казахская тонкорунная, 5-линкольн, 6-каракуль, 7-эдильбай, 8-гибрид (казахская тонкорунная х эдильбай), 9-кроссбред, Ю-гибрид р (эдильбай х казахская тонкорунная). Брали по два животных (кроме муфлона и казахской тонкорунной, которые имелись только в единственном экземпляре) в двух аликвотных пробах кавдое. М-маркеры, Н-нуклеотиды (ДНК фага а, переваренная эндонуклеазами нлмин и есовх)

ных овец и от аналогичного реципрокного скрещивания.

Для этих опытов нами была изучена возможность использования И единичных праимеров разной длины и структуры. Большинство из них оказались неактивными при наших условиях эксперимента. В данной работе был использован праимер CGC GGG ATG G.

В наших первых опытах мы исследовали воспроизводимость результатов "PCR в паралельных пробах, из опыта в опыт с разными партиями фермента. Обычно брали ДНК. двух особей одной породы в трех аликвотных пробах каждая (кроме муфлона и казахской тонкорунной породы, которые имелись только в одном экземпляре). Во всех описанных далее опытах все шесть проб каждой группы овец давали одинаковую картину.

Далее мы подобрали оптимальную температуру отжига, в нашем случае 40°С, и оптимальную концентрацию ионов Mg2, оказалось, что диапазон оптимальной концентрации неодинаков при использовании препаратов Taql-полимеразы разных изготовителей и, видимо, зависит от степени очистки фермента. Остальные параметры (концентрация праймера, ДНК и фермента) могли варьировать в довольно широком диапазоне без существенного изменения воспроизводимости результатов .

Результаты нашей работы показали, что паттерны исследованных пород диких и домашних овец, кроме гиссара, имеют очень большое сходство, по крайней мере, все они имеют шесть одинаковых полос длиной от 335 до 720 п.н., причем это наименьшее число наблюдается у муфлона, (рис.2). У других исследуемых форм были найдены незначительные различия - у архара и домашних пород овец - появляется еше одна полоса более высокомолекулярного материала длиной около Ö30 п.н. У гиссарской породы и кроссбреда желательного типа, имеется дополнительная полоса длиной около 260 п.н. Кроме то-

• <

го, у гиссара обнаруживается еще несколько полос, большая из которых достигает длины около 2027 п.н. Индивидуальных различии внутри каждой породы в этом исследовании выявлено не было. Длины полученных продуктов амплификации ДНК для всех исследованных пород овец и диких форм приведены в таблице 2.

Таблица 2

Длины фрагментов, полученных амплифмкациеи со случайным праимером ДНК овец.

№ полос \ Вид Мол\ массаЧ Ар Му<$> Гис Лин К. Т. Кар Эд Кр КхЭ ЭхК

1 260 260

2 335 335 335 335 335 335 335 335 335 335

3 410 410 410 410 410 410 410 410 410 410

4 510 510 510 510 510 510 510 510 510 510

5 565 565 565 565 565 565 565 565 565 565

6 640 640 640 640 640 640 640 640 640 640

7 720 720 720 720 720 720 720 720 720 720

8 630 830 830 830 830 830 830 830 830

9 983

10 1000

Результаты были обработаны на компьютере, с использованием программы NTSYS - UPGMA < Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averages) (Sneath, 1973). Полученная фенограмма приведена на схеме 1. Необходимо добавить, что здесь и далее мы воздержались от выводов по поводу корневого вида от которого исследованные нами виды происходят, поскольку на счет овец их делать рано, а присутствие среди исследованных видов ящериц парте-ногентических видов, которые являются некими тупиками эволюции вообще делает подобные рассуждения абсурдными. Поэтому приведенные в данной работе эволюционные деревья можно рассматривать только с точки зрения сходства (идентичности) пород.

Схема 1

(здесь и далее вверху цифрами обозначено генетическое расстояние)

0,66 0,92 0,96 1,00 1,04

| | | Г Г'

- Архар

->Казах.тонк.

~-Эд.хКаэ.т.

-> Каракуль

--- Каз.т.хЭд.

- Линкольн

---> Эдильбай

|->Кроссбред

' '->Гиссар

..-> Муфлон

Опыты с использованием метода БАРС с единичным праямером позволяет сделать следующие замечания. Гиссарская порода домашних овец значительно отличается от остальных. Это достаточно интересная и повидимому древняя порода, которая по своим морфологическим характеристикам сильно отличается от других. Известно, что она выведена в Таджикистане в результате длительного разведения курдючных овец. Также известно, что местность, в которой выведена эта порода, входит в ареал распространения более крупного, нежели муфлон, дикого барана уриала (2п=58). Поскольку паттерны полученные при исследовании гиссарскоя породы значительно отличаются как от паттернов муфлона, так и архара, то логично предположить, что гиссар скорее всего окажется похожим на уриала. Несмотря на то, что обосновать эту гипотезу напрямую мы пока не можем, из-за отсутствия ДНК уриала, остальные экспериментальные данные, изложенные в данной работе, можно также интерпретировать в ее пользу. Так, паттерны всех исследованных нами среднеазиатских пород до-

машних овец (ареал обитания дикого барана архара) полностью совпадают с паттернами архара, тогда как у муфлона отсутствует одна полоса величиной около 630 п.н.

Порода английский линкольн по паттернам идентичен среднеазиатским породам и архару. Можно предположить, что животные при долгом разведении в Казахстане оказались не -чистокровными или же что дикие предки западноевропейских пород генетически не были идентичны современному европейскому муфлону, от которого, как предполагают, они могли произойти.

Кроссбредные овцы являются исключением из гомологичного ряда исследованных среднеазиатских овец, В данном случае для получения породы было, проведено сложное воспроизводительное скрещивание между баранами линкольн и казахскими тонкорунными матками. В нашей работе паттерны этих гибридов, помимо стандартного набора полос, характерного для всех среднеазиатских пород, имеют еще одну полосу низкомолекулярного материала, величиной менее 500 п.н. Поскольку ни у одной, ни у другой породы, участвовавшей в создании кроссбредной овцы, данной полосы не обнаружено, этот факт (обнаруженный также при экспериментах с парами праймеров) объясняется, возможно, тем, что при таком сложном межпородном скрещивании мог появиться и закрепиться еще один тип праймероподобных последовательностей, иными словами возможен гибридогенный механизм возникновения различий.

, Однако некоторые породы и виды исследуемых в данной работе животных, морфологически хорошо различающиеся, по методу ЙАРО с одним праймером практически не отличались. Поэтому в поисках генетических различий можно было или продолжать поиски праймеров, дающих различия в паттернах амплификатов или использовать модификацию НАРБ С двумя праймерами, который имеет большую разрешающую

способность. Мы использовали второй путь.

0) Объект исследования - партеногенетические виды ящериц рода Lacerta и их предполагаемые родительские формы.

Обнаружение методом RAPD специфичности паттернов амплифицированных фрагментов у близкородственных форм диких и домашних овец, наряду с данными, опубликованых ранее работ (GwaKlsa et al, 1994; Joshi et al, 1993), позволило надеяться на выяснение одного из интереснейших вопросов, поставленных открытием партеногенеза у позвоночных животных |Даревский, 1993), в данном случае у рептилии - возникает ли способность к однополому размножению в каком либо одном виде спонтанно или, как предполагают многие авторы lOta et al, 1984), в следствии нарушений в процессе мейоза в гибридах, возникших после скрещивания достаточно разошедшихся групп таксона. Данные морфологии, зоогеографии и кариологического анализа свидетельствуют в пользу предположения о их гибридогенном происхождении tДаревскии,1993). Видовая специфичность, обнаруживаемая в паттернах амплифицированных фрагментов, представляющих собой не что иное, как некие локусы ДНК с неизвестном функцией и с размерами, сопоставимыми с размерами структурных генов, позволяет сравнивать картины видов-родителеи и партеногенетических видов в поисках общих локусов.

Выбор единичного случайного праимера был предложен ранее В.В. Гречко, осуществившей проверку активности 103 десятичленных праймеров, предоставленных фирмой "Cetus" (Biochemical Laboratory, University of British Co lambla). В данном исследовании использовали праимер CCG GCC ТТА С и изучали паттерны продуктов PCR-RAPD в группе видов скальных ящериц Кавказа, пять из которых являются партеногенетическими (четыре из них были в нашем распоряжении) (схема). Пять видов, указанные в разном их сочета-

Ншшм

J« -fdot

fS34 433О

— S3/

Рис.3 Сравнение паттернов pcr-rapd с одним праймером ДНК скальных ящериц Кавказа (а), б-схема.

I-L. nairensis, 2-L. unisexualis (П), 3-L.valentini, 4-L. armeniaca (П), 5-L. mixta, 6-L. dahli (II), 1-h. portschinskii, 8-L. rostombekovi (II), 9-L.raddei. БраЛИ по ДВЭ ЖИВОТНЫХ (В ОДНОЙ ЭЛИКВОТв КЭЖДОе), М-МЭркерЫ, Н-нуклеотиды (ДНК фага а, переваренная эндонуклеазами Hindin и ecori),

К-контроль без ДНК.

партеноклоны Lacerta armeniaca

dahli " rostombekovi " unisexualis " uzzelli

<f

L.valentini L.portschinskii L.portschinskii L.valentini L. nairens is

•нии, как полагают, и являются родительскими формами при межвидовой гибридизации, в результате которой образовались партеногене-тические формы.

9

L.mixta х L. mixta х L.raddei х L.nairensis x L.valentini x

На рис. 3 представлены паттерны продуктов амплификации девяти видов скальных ящериц (кроме uzzelli), причем, для удобства анализа, расположены они "триадами", в соответствии с их предполагаемым родством (см.Схема): по бокам помещены дорожки двуполых видов, один из которых "поставлял" для гибридизации самок, а другой - самцов; между ними расположен партеногенетический вид 1п>, который предположительно является продуктом их гибридизации.

Однако трактовка результатов электрофоретического разделения фрагментов встречает определенные трудности, поскольку, как это будет видно из табл. 3, все изучаемые здесь виды'имеют общие для всех них полосы, то есть некие признаки, роднящие все виды. Во-вторых, часть полос партеноклонов имеется и у видов, которые, по . .идее, не являются их родителями и важно оценить, насколько это совпадение значимо.

Поэтому мы про-анализировали, содержат ли партеновиды какие-нибудь полосы, которыми заведомо не обладают "чужие" виды. Оказалось, что во всех четырех партеноклонах имеется, по крайней мере, по одной специфичной полосе, которая прослеживается у родительских форм (или у одной из них) и не наблюдается у других двуполых видов. Так у L. ^arwentaca это две полосы,

соответствующие 510 и 725 п.н.; которые "роднят" ее с двумя предполагаемыми родительскими видами ll.valentlnl и L.mixta), но отсутствуют у других трех двуполых видов. У I.dahli имеется общая с родственной L.mixta полоса (480 п.н.), не наблюдающаяся у других видов; у I.unlsexualls полоса 725 п.н., также как у L.armsnlaca, роднит ее с I.valent 1ni (обшия предок для них обоих), но не имеется ни в одном другом виде.

Таблица 3

Длины фрагментов, полученных при амплификации со случайным праймером ДНК скальных ящериц.

№ полос \Вид Мол\ иассач. nalr uni val arm mix dahl port rast rad

1 200 200 200 200 200 200 200 200 200

2 285 285

3 375 375 375 375 375 375 375 375

4 445 445 445 445 445 445

5 480 480

6 510 510 510 510

7 565 565 565 565 565 565 565 565

8 620 620

9 725 725 725 725 725

10 780

11 830 830 830 830 830 830 830 830

12 985 985 985 985 985 985 985 985 985

13 1120 1120 1120 1120 1120 1120 1120 1120 1120

14 1190 1190 1190 1190

15 16 1260 1260 1260 1260 1260 1260 1260 1260 1260

17 1330 1330 1330 1330 1330 1330 1330 1330 1330

18 19 1985 1985 1985 1985 1985

20 1635 1635 1635 1635 1635

21 22 1900 1900

23 2000

24 25 2250 2250 2250 2250 2250

26 2500 2500 2500

И, наконец, L.rostombekovl также содержит эту полосу.

имеющуюся у всех партеногенетических видов, но из двуполых -

только у L.valentlní, не являвшейся родственной для L.rostoabekovl. Однако L.rostombekovl имеет полосу 1190 п.н., которая роднит этот вид с L.raááel или с L.nalrensls. Таким образом, схема родства кажется основательной в случае с L.araenlaca, L.úahlí и L.unlsexualls. Доказательства происхождения L.rostombekovl IL.raddel или L.nalrensls ) должны быть получены дополнительно.

3. Результаты исследование ДНК овец и яшериц рода Lacerta методом RAPD с двумя праймерами Далее для выяснения вопросов, поставленных в предыдущей главе мы использовали метод PCR-RAPD с двумя случайными праимерами: продукт амплификации фракционировали не в агарозе, а в полиакриламидном геле, что повышало разрешающую способность за счет увеличения пути пробега фрагментов.

Таблица N 4

Прайиеры м их сочетания, использованные в методе PCR-RAPD с двумя праймерами (даны произвольные номера праймеров>

N праи-иера Н опыта Последовательность, (с 5-конца) Число нуклеотидов

1 CACGTAACGAAGACCAGTCAT 21

2 GTTCACCCGTAGGTTTCACTTACCT 25

3 CAGGTGATGCCACTAGTACTTACCT 25

4 GCTGATGTTTAGTTCTGACTTG 22

5 GTAGGAAAAGCGTGTCTCTG 20

6 TGATTGTTGCTCTGCTTCCT 20

7 CTTTTTCTTGTGTCATGGTTG 21

Примечание: В опытах с парами праимеров использовали следующую нумерацию пар: 1-смесь 1 и 2 праймеров, II- 1 и 3. 111-1 и 4, IV-1 и 5, V- 2 и 4, У1- 3 и 4, VII- 4 и 5, VIII- 6 и 7.

а

¿Г

1 I з 4 61 В 9 юн{Г/£&ааМ К * 1 з 4б * 2 & м///г¿г/*

Рис.4 Сравнение паттернов продуктов рси-нарб, полученных с х парой праймеров (см.табл.4) ДНК домашних и диких овец (а), б-схема.

I,2-архар, 3,4-муфлон, 5,6-казахская тонкорунная, 7,8-гиссар, 9,Ю-линкольн,

II,12-каракуль, 13,14-эдильбай, 15,16-кроссбред, 17,18-гибрид Р1 (казахская тонкорунная х эдильбай), 19-гибрид (эдильбай х казахская тонкорунная). Брали по два животных (кроме муфлона и казахской тонкорунной, которые имелись только в единственном экземпляре) в двух аликвотных пробах каждое. М-маркеры, Н-нуклеотиды (ДНК рвг322, переваренная эндонуклеазой мь-р!), К-контроль без ДНк

МЫ исследовали продукты модификации RAPD, используя восемь пар праимеров, ДНК домашних и диких овец и яшериц рода Lacerta. Последовательности и сочетания праимеров приведены в табл.4.

Пары I, III, V, VI, VII и VIII использованы для исследования овец, пары II, IV, VI и VIII - для исследования ящериц. Брали оптимальные сочетания праимеров, обнаруженные в предварительных экспериментах, которые давали четкие паттерны при наших условиях проведения реакции. Всего рассмотрены результаты использования примерно сорока различных комбинация десяти разных праимеров. а) Результаты исследования с парой праимеров ДНК овец.

Были исследованы те же породы домашних и диких овец, что и в предыдущих разделах. В большинстве случаев паттерны продуктов амплификации достоверно различались у всех форм, однако распределение полос у домашних пород овец было более консервативным, т.е. они отличались друг от друга по двум-трем полосам, а по одной паре примеров не отличались вовсе (рис.4, схема 2).

Схема 2

0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 I-1-i-1-Г'

-:- Архар

Казах.тонк

-Гиссар

Линкольн

_:_ Эд.хКаз.т.

Каэ.т.хЭд. Кроссбред Эдильбай Каракуль

■.-- Муфлон

Отличия же между дикими формами носят более выраженный характер: во всех случаях они различаются по одноя-семи полосам, причем, как выяснилось, у архара больше сходства с домашними породами. нежели у муфлона. При использовании некоторых пар праимеров

Рис.5 Сравнение паттернов продуктов рси-еаро, полученных с V парой праймеров (см.табл.4) ДНК домашних и диких овец (а), б-схема.

I,2-архар, 3,4-муфлон, 5,6-казахская тонкорунная, 7,8-гиссар, 9,Ю-линкольн,

II,12-каракуль, 13,14-эдильбай, 15,16-кроссбред, 17,18-гибрид р1 (казахская тонкорунная х эдильбай), 19,20-гибрид р1 (эдильбай х казахская тонкорунная). Брали по два животных (кроме муфлона и казахской тонкорунной, которые имелись только в единственном экземпляре) в двух аликвотных пробах каздое. М-маркеры, Н-нуклеотиды (ДНК рвгзгг, переваренная эндонуклеазой мэрг;, К-контроль без ДШ

выявляется не только межпородная, но и внутрипопуляционная (индивидуальная) изменчивость; по одной-трем полосам различаются практически все породы домашних овец. Особенно заметна индивидуальная изменчивость у архара, линкольна и у трех гибридных форм овец (в качестве примера приведен рис. 5).

Следует отметить однако, что существенным недостатком этого анализа является, во-первых, наличие только одного образца индивидуальной ДНК муфлона, что связано с трудностью получения материала из дикой природы. Во-вторых, обнаруженные нами при использовании пары праймеров индивидуальные отличия ДНК из разных групп животных, делают необходимым в дальнейшем провести статистический анализ ДНК значимой выборки, по крайней мере, пород домашних овец.

В приведенном выше анализе в расчет принималось максимальное количество полос, то есть по существу рассматривались более значимыми ДНК тех индивидуумов, которые давали большее число полос. Это, по нашему мнению, было более логичным, поскольку отсутствие полос ДНК у второго индивидуума в большей мере могло определяться случайными, артефактными причинами, например степенью сохранности и очистки ДНК. Тем более, что дополнительные полосы в этих случаях, как правило наблюдались и в других группах и вероятность их случайного возникновения была ниже. При этом желательно было подобрать такую пару праймеров, которая, не давая межпопуляционной изменчивости (индивидуальной), давала тем не менее межпородную. Судя по нашим экспериментам это условие удалось выполнить, поскольку нами была найдена пара праймеров, дающая различия только между муфлоном и архаром, причем все остальные домашние породы были идентичны архару (рис.4>. Были также найдены пары праймеров, дающие как значительную межпородную, так и межпо-

пуляционную разницу между животными ib качестве примера дан рис.5). Идеальный вариант не был найден, но опыты с III и VIII парами праймеров, в которых породы хорошо отличимы друг от друга, а индивидуальный полиморфизм развит в незначительной степени, говорят о том, что такая проблема разрешима.

Обобщенные результаты (схема 3) при исследовании ДНК диких и домашних овец данным методом полностью подтверждают выдвинутую нами гипотезу при обсуждении данных, полученных с использованием метода HAPD с одним случайным праимером, и дают дополнительную информацию о породах, паттерны которых в том случае были идентичными.

Схема 3

0,45

0,60

0,75

0,90

"Т"

Т

1.05

—Г

ч:

—> Архар —>Казах.тонк.

— Гиссар

— Кроссбред —>Линкольн —vКаракуль

— Каз.т.хЭд.

— Эд.хКаз.т. —>ЭдильОай —>Муфлон

Так полностью подтвердились данные о большем сходстве домашних пород овец с архаром, нежели с муфлоном, причем, наиболее выраженным сходством обладают две породы - казахская тонкорунная и эдильбаевская. Интересен тот Факт, что при создании обеих пород в скрещивании учавствовали казахские курдючные матки - аборигенные овцы степей Казахстана.

Наиболее трудно объясним тот факт, что гиссарская порода практически по всем из использованных пар праймеров оказалась сходна с кроссбредной породой, чего быть не должно, если доверять описанию схемы гибридизации. Возможно, что данные гибриды не чистопородны. Этот вопрос требует дальнейшего исследования.

25

Гибридные формы овец занимают промежуточное положение между эдильбаевской и казахской тонкорунной породой, что само по себе понятно, поскольку они были получены при скрещивании именно этих пород овец.

Мы полагаем, что дальнейшие поиски сходства ДНК исследуемых нами животных, с включением других популяций диких овец и большего спектра рестрикционных эндонуклеаз и праймеров, необходимы и позволят сделать более основательные выводы. Как показывают результаты нашей работы, использованные методы весьма информативны, б) Результаты исследования с парой праймеров ДНК f скальных ящериц рода Lacerta.

были проведены исследования тех же видов скальных яшериц Кавказа, что и в случае исследований ящериц методом RAPD с одним случайным праймером. Е опыт брали по два разных животных каждого вида, опыты проверяли на воспроизводимость, сопоставляя результаты распределения фрагментов, полученные в " разных реакциях.

Обобщая все данные, полученные при исследовании ДНК яшериц методом RAPD с парами праймеров, можно сказать, что во всех случаях сильным сходством обладала пара . разнополых видов: L.valentlnl и L.mixta, менее близки были L.portschlnskll, L.raddel и L.nalrensis.

Все данные свидетельствуют также в пользу гибридогенного происхождения партеновидов. Об этом свидетельствуют во-первых, наличие некоторых специфических для предполагаемых "отцовского" и "материнского" видов локусов в геноме соответствующих партеновидов 1см. схема). Во-вторых, все партеновиды содержат основную массу локусов, характерных и общих для "отца" и "матери". Это говорит о том, что возможность возникновения партеноклона каким-то образом связано с весьма большим сходством геномов видов, всту-

2 6

* /t- «ь*

."J, ----- ■ 1

V А

1

303

1П 190

160

Рис.6 Сравнение паттернов продуктов pcr-rapd, полученные со н парой праймеров (см.табл.4) ДНК скальных ящериц Кавказа (а), б-схема. i-l. nairensis, 2-l. unisexual is (п), 3-L.ralentini, 4-L. armeniaca (II), 5-l. mixta, 6-L.dahli (li), 7-l. portschinskii, B-L. rostombekovi (II),

9-L.raddei. Брали по два животных (в одной аликвоте каждое), М-маркеры, Н-нуклеотиды (ДНК рвгзгг, переваренная эндонуклеазой wspij, К-контроль без ДНК

-ш

Рис.7 Сравнение паттернов продуктов pcr-rapd, полученные с iv парой праймеров (см.табл.4) ДНК скальных ящериц Кавказа (а), б-схема.

I-L. nairensis, 2-L.unlsexualis (П), 3-L.valentini, 4-L.armenlaca (П), 5-L. mixta, б-!., dahll (П), 1-L.portschlnshil. 8-L. rostombekorl (XI),

9-l.raddei. Брали по два животных (в одной аликвоте кавдое), М-маркеры, Н-нуклеотиды (ДНК рвгзгг, переваренная эндонуклеазой Hspi), К-контроль без ДНк

пасших в гибридные отношения, и наличие специфических для "матери" и "отца" локусов в геноме партеновида делает сам факт гиб-ридогенеза весьма возможным.

Наличие дополнительных локусов в партеновидах, не имеющихся у родительских форм, в принципе, не исключено, если вспомнить достаточно длинную и самостоятельную эволюционную историю партеновидов с момента их появления.

Что касается возможности назвать конкретно родительские виды и подтвердить или опровергнуть тем самым правильность приведенной выше схемы, то здесь однозначного ответа пока нет - слишком сходны все исследуемые виды.

Поэтому наши данные можно рассматривать лишь как "разрешение" на возможность гибридного происхождения партеновидов, представленных на схеме. Можно сделать лишь некоторые произвольные выводы.

На основании опыта со II парой праймеров (рис.6) из числа родственников i.dahli и L.armeniaca практически исключаются двуполые L.nalrensls и L.raddei, так как в этих партеновидах содержится одна, самая характерная и яркая полоса длиной около 200 п.н., которая не имеется ни у одного, ни у другого двуполого вида, но имеется у I.mixta и L.portschlnskll.

Аналогично, на основании опыта с IV парой праймеров (рис.7) L.armenlaca, L.dtahll и I.mixta имеют характерную только для них троих полосу (около 250 п.н.). Таким образом, идентификаций "материнских" видов, кажется, более надежной. Что касается "отцовских" видов, то этот вопрос требует дальнейшего изучения, поскольку кандидатом на "отцовство" во всех партеногенетических видах может выступать как I.valentini, так и L.portschlnskll.

Наибольшим сходством обладают два партеногенетических вида -L. armenlaca и L. dahii - как в опытах с единичным праймером.

так и с парой. Очевидно и большее сходство с ними вероятных для обоих партеноклонов родительских двуполых видов - I. mixta, I. valentini и L. portschinskii (рис.6,7). Эти данные соответствуют данным по сравнению мтДНК этих видов в работе Моритца и соавт. (1993). Оба упомянутый выше партеноклона по мтДНК не различаются и сходны с L. mixta.

Что касается второй подгруппы выделенной на основании данных таксонопринта, то L. raddel и L. nalrensIs сходны между собой в большей степени, чем с видами первой подгруппы, по данным с использованием одного праймера, но достаточно сильно различались в опытах с двумя (рис.3,6). Связать эти данные с какой-либо точкой зрения, одна из которых рассматривает эти группы как отдельные виды, а другая - как подвиды одного из них, пока не представляется возможным.

Тем более, что разные популяции L. raddel, как показали опыты

/

с мтДНК (Moritz et al, 1993), различаются по ее структуре в большей степени, чем отличаются одна из этих популяций от I. nalrensis. Здесь необходим широкий популяционный анализ обоих видов с привлечением разнообразных подходов, над чем сейчас работают разные группы исследователей (R.Murphy;. Eiselt et Darevsky -личные сообщения).На основании наших данных можно лишь сказать, что партеногенетические виды - L. rostombekovi и I.unisexualis -производные, как полагают, двух упомянутых двуполых видов, более сходны с ними, чем с ящерицами первой группы.

Выводы

1. С целью оценки генетической дивергенции между видами и популяциями внутри вида были использованы два новых метода - таксо-нопринт и амплификация с одним и двумя случайными праймерами. Объектами исследования являлись формы/диких баранов и пород домашних овец (в основном центральноазиатских), а также двуполых и парте-

ногенетических видов ящериц, о таксономических статусах которых до сих пор ведутся дискуссии.

2. Метод таксонопринта (гидролиза короткощепящими рестрикта-зами суммарной ДНК с последующим электрофорезом меченных по концам фрагментов) может быть рекомендован для исследования генетической дивергенции близких видов.

3. Метод амплификации ДНК с одним случайным праймером дает аналогичные результаты, то есть за некоторыми исключениями позволяет выявлять межвидовые, но не внутривидовые' различия.

4. Метод амплификации ДНК с двумя случайными праймерами позволяет выявлять различия между внутривидовыми формами (популяциями и породами), а в ряде случаев - внутрипопуляционными (фамильную и индивидуальную изменчивость).

5. Совместное использование всех испытанных методов позволяет достаточно точно оценить степень генетической дивергенции исследуемых форм и может быть рекомендовано для решения сложных таксономических ситуаций.

6. Результаты, полученные при исследовании методом таксонопринта ДНК диких и домашних овец подтверждают точку зрения о существовании одного вида Ovis аппаоп 1., представленного тремя хромосомными формами.

7. Ареал одомашнивания овцы включал, повидимому, не только Переднюю, но и Центральную Азию (возможно, и Европу) и на всем протяжении его, еда в древности, осуществлялась гибридизация всех трех диких форм с домашними породами. Поразительное сходство всех исследованных методом PCR-RAPD с одним и двумя случайными праймерами среднеазиатских пород овец с диким бараном архаром, нежели с муфлоном, и отличие гиссарской породы, выведенной в местах обитания дикого барана уриала, подтверждают эту точку зрения.

9. При исследовании ДНК домашних овец PCR-HAPD с двумя слу-

чайными праймерами выяснилось особенно выраженное сходство с архаром двух пород - казахской тонкорунной и эдильбаевской, при создании которых в скрещивании учавствовали казахские курдючные матки - аборигенные овцы степей Казахстана.

9. Использованные методы потверждают гибридогенное происхождение однополых видов ящериц и позволяют назвать виды, которые могли бы выступать как "родительские" при образовании этих видов. Это позволяет рекомендовать метод RAPD с двумя праймерами для работы с другими агамными формами (например, для исследования пар-тенокарпических и аллоплоидных пород растений).

10. Полученные данные практически позволяют исключть из числа родственников партеногенетических видов L.dahll и I.armeniaca двуполые виды l.nalrensls и I.raddei.

11. Наибольшим сходством обладают два партеногенетических вида - I.armeniaca и I.dahli и "материнский" для них обоих -I.mixta. Таким образом, идентификация "материнских" видов^ кажется, более надежной. Что касается "отцовских" видов, то этот вопрос требует дальнейшего изучения, поскольку кандидатом на "отцовство" во всех партеногенетических видах может выступать как I.valentlnl, так и L.portschlnskll.

12. Виды L.nalrensls и L.raddel по данным с использованием PCR-RAPD с одним праймером были практически идентичны между собой и отличались от всех остальных исследованных видов, однако по данным с двумя праймерами эти два вида достаточно сильно различались. Связать эти данные с какой либо точкой зрения, одна из которых рассматривает эти группы как отдельные виды, а другая - как подвиды одного из них, пока не представляется возможным.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. В.В.Гречко, М.В.Катаев, М.Н.Мельникова, И.С.Даревскии Исследование родственных связей партеногенетических форм ящериц рода ¿асег^а и предполагаемых родительских двуполых видов при сравнении части ДНК, считываемой в цепной полимеразной реакции с единичным праямером. // Молекулярная биология. 1993. т.27. с .1415-1424.

2. М.Н. Мельникова, В.В. Гречко, Б.М. Медников Исследование полиморфизма и дивергенции геномной ДНК на видовом и популяционном уровне (на примере ДНК пород домашних и диких овец). // Генетика, в печати.

ТОО "Нерей". ВНИРО. Зак. /УТир. 30