Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Рогоза, Татьяна Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РОГОЗА Татьяна Михайловна

00461

1931

Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта с помощью

скрининга инсерционного банка генов у дрожжей БассИаготусез сежтае

Специальность 03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 нов 7010

Санкт-Петербург 2010

004611931

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Людмила Николаевна Миронова кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор

Михаил Давидович Тер-Аванесян НИИ Экспериментальной Кардиологии РКНПК МЗ РФ, Москва

профессор, доктор биологических наук

Тыну Рихович Сойдла

Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Пушкин

Защита диссертации состоится " $ " 2010 г. в ^ часов на заседании

совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета

Автореферат разослан "_"_2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.23 2.12 кандидат биологических наук

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что некоторые белки могут существовать in vivo в форме амилоидов - агрегатов фибриллярной формы. Образование амилоидов обусловлено полимеризацией молекул белка, сопровождающейся их конформационной перестройкой с формированием специфической «кросс-(3-структуры». Амилоиды являются причиной амилоидозов - обширной группы заболеваний человека и животных. Особой разновидностью амилоидов являются прионы (от «proteinaceous infection»), отличающиеся от других амилоидов своей трансмиссибельностыо. Прионы были открыты при изучении инфекционных губчатых энцефалопатии человека и животных. Оказалось, что эти заболевания обусловлены переходом в прионную форму клеточного белка PrP (Prusiner el al, 1984). Прион, возникающий на основе белка РгР, является примером инфекционного возбудителя, имеющего белковую природу.

Существенный прогресс в исследовании явления прионизации белков был достигнут, когда выяснилось, что некоторые белки дрожжей Saccharomyces cerevisiae также могут существовать в форме прионов. Однако есть существенное различие между прионами млекопитающих и прионами дрожжей. Прионы млекопитающих -это инфекционные агенты, а прионы дрожжей представляют собой цитоплазматические наследственные детерминанты. Обнаружение дрожжевых прионов позволило выявить новый механизм передачи информации в ряду клеточных поколений, в основе которого лежит наследование конформационно измененной белковой молекулы. Первыми были открыты три дрожжевых приона: [PSt], прионная форма белка Sup35 (Сох, 1965), [URE3], прионная форма белка Ure2 (Lacroute, 1971) и [PIN*], прионная форма белка Rnql (Derkatch et al., 1997). Эти прионы в настоящий момент наиболее хорошо изучены. Список дрожжевых прионов постоянно увеличивается; за последние два года к нему добавлено еще четыре детерминанта: [SW71"] (Du et al., 2008), [МСЛ] (Nemecek et al., 2008), [ОСГ] (Patel et al., 2009) и [MOT3+] (Alberti el al., 2009), которые являются прионными формами белков Swil, Meal, Сус8 и Mot3, соответственно.

К настоящему моменту выяснены основные закономерности возникновения и поддержания прионов в клетке дрожжей, сформулированы критерии прионного наследования (Wickner, 1996). Считается, что основополагающим параметром в детерминации прионных свойств белков дрожжей является присутствие в них участков, обогащенных остатками аспарагина и/или глутамина. Анализ протеома дрожжей показал, что такие белки составляют примерно 1,7% от всех белков дрожжевой клетки (Michelitsch and Weissman, 2000). Это позволяет предполагать, что помимо уже известных прионов у дрожжей существуют и другие наследственные детерминанты, имеющие сходную природу. Нельзя исключить также, что подобными свойствами могут обладать и белки с другими особенностями первичной структуры, поскольку прионный белок млекопитающих, РгР, не содержит аспарагин/глутамин-богатых последовательностей (Prusiner, 1998). Все это делает актуальным поиск новых прионов у дрожжей.

В нашей лаборатории ранее обнаружен детерминант, свойства которого сходны со свойствами прионов (Volkov et al., 2002). Фенотипически этот детерминант, обозначенный [/i£P+], проявляется как антисупрессор, нейтрализующий проявление некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в гене SUP35. Подобно другим дрожжевым прионам [ISP+] наследуется цитоплазматически, элиминируется при росте дрожжей на среде с гидрохлоридом гуанидина (GuHCl) и с высокой частотой

возникает вновь после элиминации. Фенотип [/5Р+] доминантен по отношению к фенотипу [¿у?"]. Вместе с тем, существенное отличие [/5Р+] от уже найденных прионов дрожжей состоит в независимости его поддержания от maneponaHspl04.

Для выяснения природы [ISP1] необходимо идентифицировать гены, от которых зависит присутствие [/5Р+] в клетке. Среди этих генов должен быть и его структурный ген, то есть ген, кодирующий белок, прионной форме которого соответствует [/5Р+].

В связи с этим целью исследования явилась идентификация структурного гена [ISP+] и изучение способности к прионизации белка, кодируемого этим геном.

В ходе работы решались следующие задачи: (1) поиск генов, инактивация которых приводит к элиминации (2) характеристика влияния найденных генов

на возникновение, проявление и поддержание [/£Р+]; (3) выявление среди найденных генов кандидата на роль структурного гена детерминанта [/5Р+]; (4) доказательство связи между этим геном и детерминантом [/5/,+]; (5) изучение прионных свойств белка - продукта этого гена.

Научная новизна исследования. Получены генетические, биохимические и цитологические доказательства того, что обнаруженный ранее нехромосомный детерминант дрожжей [/5Р+] представляет собой прионную форму белка Sfpl. Таким образом, это В-й по счету наследственный детерминант дрожжей, имеющий белковую природу. Прион [ISP*] отличается по многим существенным свойствам от других прионов дрожжей, описанных к настоящему моменту. К числу таких свойств следует отнести ядерную локализацию, независимость поддержания от шаперона Hspl04, более высокую частоту спонтанного и индуцированного сверхэкспрессией гена SFP1 возникновения. Кроме того, прионизация белка Sfpl не равнозначна последствиям делеции гена SFP1, что позволяет предполагать, что прионное превращение приводит не к потере функции белка Sfpl, а к ее модификации. Полученные данные имеют приоритетный характер и расширяют представления о феномене прионного превращения белков у дрожжей и его функциональной и адаптивной роли.

Практическая ценность. Прионизация белка РгР человека и животных лежит в основе заболеваний, относящихся к инфекционным амилоидозам. Эти заболевания неизлечимы; более того, существует возможность передачи инфекции от животных человеку. Кроме того, существует группа неинфекционных амилоидозов, среди которых такие заболевания как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Исследование прионов дрожжей позволяет разрабатывать простые модели для изучения механизмов амилоидогенеза, поиска агентов, способных предотвращать амилоидизацию белков или элиминировать амилоидную (прионную) форму белка из клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 22-й Международной конференции по генетике дрожжей и молекулярной биологии (Братислава, Словакия 2005), на 23-й Международной конференции по генетике дрожжей и молекулярной биологии (Мельбурн, Австралия, 2007), на конференции по белковому синтезу и трансляционному контролю (Гейдельберг, Германия 2007), на 3-й Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на 12-м Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008), на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008), на конференции, посвященной 90-летию кафедры генетики и селекции СПбГУ (СПб, Россия 2009), на 27-м Международном специализированном дрожжевом симпозиуме (Париж,

Франция 2009), на конференции ЕМВО по транскрипции у дрожжей (Барселона, Испания, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 146 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (193 наименования). Работа содержит 10 таблиц и 40 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Генотипы основных штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Генотипы основных штаммов дрожжей

Штамм Генотип Происхождение

5Б-П4513 MATaadel-14 his7-l lys2-87 игаЗА 1еи2-1 mell3-Al sup35-25 sup45-400 {ISP*} и f«p"l Volkov et al., 2002

25-25-2В-П3982 MAT aadel-14 his7-l lys2-87 игаЗА leu2-l thr4-B15 sup35-25 sup45-400 \ISP+] и \i.sp]

hspl04A-25-2В-П3982 MAT a adel-14 his7-l lys2-87 игаЗА leu2-l thr4-B15 suP35-25 suP45-400 hspl04A \1SP*]

Примечания. Аллели ас!е1-14. №2-87 содержат нонсенс-мутацию 1ТСА; аллель Ыв7-1 несет нонсенс-мутацию иАА; игаЗА - делеция гена ШМЗ; тр35-25 -рецессивная омнипотентная супрессорная мутация в гене 811Р35, $ир45-4(Ю -критическая мутация в гене 81/Р45, не имеющая собственного проявления, но влияющая на фенотипическое проявление [/573+].

Плазмиды. Инсерционный банк генов, содержащий инсерции транспозона тТпЗ в открытые рамки считывания генома дрожжей, получен из Иельского Центра по Анализу Генома (Burns et al. 1994). Плазмиду pRSQ2-URA3 использовали для интеграции в транспозон тТпЗ бактериального ориджина репликации. Плазмида pRS315-UPFl, содержащая аллель гена UPF1 дикого типа, получена на основе центромерного вектора pRS315 (Sikorski and Hieter, 1989). Плазмиды pRS425-SFPl и pRS426-SFPl получены при клонировании аллели гена SFP1 дикого типа в 2-рш векторы pRS425 и pRS426, соответственно. Плазмиды рМТ3193 и рМТ3453 содержат SFPI и GFP-SFP1, соответственно, под контролем собственного промотора SFP1 (Jorgensen et al., 2004). Плазмида pRS315-SFPl получена при клонировании открытой рамки считывания гена SFP1 плюс 799 н.п. до и 300 н.п. после рамки считывания из плазмиды рМТ3193 в вектор pRS315. Плазмида pSFP-GFP содержит ген SFP1, открытая рамка считывания которого слита с 5' концом гена GFP, под контролем GAL1/10 промотора (Fingerman et al., 2003). Плазмида pLH105, сконструированная на основе 2-ргп вектора, содержит ген HSP104 под контролем конститутивного GPD-промотора (Chernoff et al., 1999). Плазмиду pCORE использовали для замещения генов UPF1 и SFP1 на кассету, содержащую ген URA3 (Storici et al., 2001).

Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей и стандартные среды: YPD, полную синтетическую среду SMM, а также селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SMM (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986). Кроме того, использовали среду на основе SMM, содержащую галактозу и раффинозу в качестве источника углерода. Элиминацию [ISP+] проводили на среде, содержащей гидрохлорид гуанидина (GuHCl). Тест на чувствительность к антибиотикам проводили, используя бумажные фильтры диаметром 0,5 см, на

которые наносили по 4 мкл паромомицина в концентрации IM или циклогексимида в концентрации 5мМ. Фильтры помещали на чашки, на которые высевали газоном штаммы дрожжей. На четвертый день проводили измерение зон ингибирования.

Качественную оценку эффективности нонсенс-супрессии осуществляли визуально по росту штаммов на средах SMM-His (his7-l) и SMM-Lys (lys2-87), с использованием последовательных разведений, что повышало разрешающую способность метода и позволяло регистрировать даже незначительные отличия в росте штаммов.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР), рестрикционный анализ, выделение геномной и плазмидной ДНК, трансформацию дрожжей и E.coli, гель-электрофорез ДНК, иммуноблоттинг (с использованием моноклональных антител против GFP) проводили в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994; Gietz et al., 1992; Inoue et al., 1990). Электрофорез белков в полиакриламидном геле с использованием холодного SDS (SDS-PAGE) осуществляли по методике, предложенной В.В.Кушнировым (Kushnirov et al., 2006). Приготовление и фракционирование клеточных экстрактов проводили согласно протоколу, предложенному Ю.О.Черновым (Chernoff et al., 2002). Делеции генов UPF1 и SFP1 получали с помощью плазмиды pCORE (Storici et al., 2001).

Флуоресцентную микроскопию клеток, содержащих гибридный белок Sfpl-GFP проводили на микроскопе Leica DM6000B Leica Microsystems GmBH. Для обработки изображений использовали программу Leica QWin Standard (версия 3.2.0).

Для измерения площади клеток штаммы выращивали в среде YPD до стадии раннего стационара, затем клетки помещали в камеру Горяева и фотографировали в режиме проходящего света на микроскопе Leica DM LS, оборудованном объективом FLUOTAR 20х/0,40 и камерой Leica DFC 320. Измерение площади клеток проводили с помощью программы Image J 1,34 (http://rsb.infb.nih.gov/ii/'). Различия средних значений площади клеток были оценены с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Скрининг инсерцнонного банка генов дрожжей S.cerevisiae

Для поиска структурного гена детерминанта [ISP] мы применили подход, основанный на использовании инсерционной библиотеки генов. Этот подход позволяет разрушать хромосомные копии генов вставкой транспозона, таким образом может быть разрушен и структурный ген [/5Р+]. Исходный штамм 25-25-2В-П3982 [/SP*] несет мутации his7-l, lys2-87 и sup35-25 и имеет фенотип His'Lys" (в дальнейшем обозначаемый как Sup"), поскольку в присутствии [75Р+] нонсенс-супрессорный эффект мутации snp35-25 не проявляется. Инактивация структурного гена [ISP+] должен приводить к элиминации этого детерминанта, вследствие чего проявится супрессорный эффект мутации sup3S-25, то есть фенотип штамма изменится на His+Lys+ (Sup+). Однако изменение фенотипа может быть связано не только с элиминацией [/57>+], но и с маскировкой его проявления вследствие того, что инсерция транспозона в какой-либо ген теоретически может приводить к самостоятельному (скорее всего, рецессивному) эффекту нонсенс-супрессии, не связанному с эффектом sup35-25. Различить эти два события можно путем скрещивания интегрантов с тестерными штаммами [ISP+] и [z'.s//]. Вследствие того, что фенотип [/5Р+] доминирует над фенотипом [isp'} (Volkov et al., 2002), скрещивание интегрантов, утративших [/5Р+], с тестером [ISP' ] должно приводить к образованию диплоида Sup', а скрещивание таких интегрантов с тестером [мр"]

должно давать диплоиды с фенотипом Sup+. В случае маскировки проявления [ISP+] в обоих скрещиваниях должны появляться диплоиды Sup".

С другой стороны, известно, что прионизация нарушает функции белков и, следовательно, может приводить к таким же последствиям, как и инактивация гена, кодирующего этот белок. Если дизрупция структурного гена имеет такой же эффект, как и прионизация, исходный штамм [ISP+] после интеграции транспозона не изменит свой фенотип. К таким же последствиям (сохранение фенотипа Sup"), будет приводить интеграция транспозона в какие-то другие участки генома. Чтобы различить эти два типа интегрантов, необходимо скрестить их со штаммом [йр"]. Если интегранты содержат дизрупцию гипотетического гена ISP, то полученные гибриды (JSP:: mTn//ISP sup35-25llsup35-25 будут иметь фенотип Sup+. Далее с помощью гибридологического анализа необходимо подтвердить, что элиминация [/SP^] обусловлена инсерцией транспозона в геном, а не является случайным событием.

В результате трансформации штамма [/5Р+] инсерционным банком генов было получено более 730 тысяч интегрантов, среди которых было обнаружено 1484 интегранта, проявляющих фенотип Sup+. Остальные интегранты, не изменившие свой фенотип, были скрещены со штаммом [isp~], в результате чего было отобрано 157 гибридов, проявляющих фенотип Sup+. Однако гибридологический анализ (тетрадный анализ и случайная выборка аскоспор) этих диплоидов не выявил ни одного гибрида, у которого наблюдалась бы корреляция между вставкой транспозона и элиминацией [й,/5+]. Это говорит о случайной элиминации [ZS73*] у этих интегрантов.

Для того чтобы выявить среди 1484-х интегрантов, проявляющих фенотип Sup+, штаммы, потерявшие [7ЖР+], проводили их скрещивание с тестерными штаммами [ISP+] и [isp']. Для дальнейшего анализа было отобрано 105 интегрантов, гибриды которых от скрещивания со штаммами [75Р+] и [isp"\ имели фенотип Sup" и Sup+, соответственно. Среди них с помощью тетрадного анализа и случайной выборки аскоспор были выявлены 32 интегранта, у которых потеря детерминанта [ISP+] коррелировала со вставкой транспозона.

Затем была проведена идентификация точки инсерции транспозона у этих 32-х интегрантов. Участки дрожжевой ДНК, содержащие вставку транспозона, у семи интегрантов, были секвенированы. Было обнаружено, что инсерция транспозона у одного интегранта произошла в ген SFP1, у четырех - в ген UPF1 и еще у двух - в ген UPF2. Оставшиеся 25 интегрантов были проанализированы ПЦР с использованием праймеров к генам SFP1, UPF1 и UPF2, для того чтобы исключить из анализа интегрантов, содержащих вставки транспозона в уже выявленные гены, и найти интегрантов со вставками транспозона в другие гены. Однако все 25 интегрантов содержали вставки в какой-то из трех уже найденных генов. Три интегранта несли вставку в гене SFP1, 10 других - в гене UPF1 и еще 12 - в гене UPF2. Далее подробно изучалась связь между этими генами и детерминантом [/£Р+].

2.Изучение связи между генами UPF1 и UPF2 и

На предыдущем этапе мы показали, что инсерция транспозона в гены UPF1 и UPF2 приводит к изменению фенотипа штаммов, содержащих детерминант [75Р+], с Sup" на Sup+. Судя по результатам предварительного генетического анализа, в нашем случае такое изменение фенотипа обусловлено элиминацией [/5Р+]. Белки Upfl и Upf2 входят в состав системы NMD, обеспечивающей избирательную деградацию

нонсенс-содержащих мРНК (Wang et al., 2001). Влияние UPF1, как ключевого компонента системы NMD, на стабильность [ASP*] было проанализировано более подробно.

Для ответа на вопрос, действительно ли дизрупция/делеция гена UPF1 приводит к исчезновению детерминанта [AS!P+], или при скрининге банка мы отобрали интегрантов, у которых одновременно с инсерцией транспозона в ген UPF1 произошла спонтанная потеря [А5Р+], были получены 10 штаммов, содержащих детерминант [ASP+] и несущих делению хромосомной копии UPF1, а также компенсаторную плазмиду с геном UPF1. Это позволило оценить количественно частоту потери [ISP+] при потере компенсаторной плазмиды. Для потери плазмиды штаммы трижды пассировали на полной среде, в результате чего все 10 штаммов изменили фенотип с Sup" на Sup+. Однако популяция клеток этих штаммов может быть гетерогенной и содержать, наряду с клетками [isp'], какую-то долю клеток [КР+]. Для количественной оценки частоты потери [ASP+] производили рассевы штаммов, потерявших компенсаторную плазмиду, и анализировали фенотип выросших клонов. Как следует из таблицы 2, для клонов, утративших плазмиду, характерна высокая, хотя и варьирующая от штамма к штамму, частота потери [ASP+], Таким образом, можно сделать вывод, что делеция гена UPF1 приводит к потере детерминанта [ASP+], а не к маскировке его проявления.

При дальнейшей работе со штаммами, утратившими [А£Р+], вследствие инактивации генов UPF1 или UPF2, мы обнаружили, что такие штаммы фенотипически нестабильны. После хранения этих штаммов в течение месяца при +4°С и последующего клонирования значительная часть клонов изменяет фенотип с Sup+ на Sup". Скрещивание ауксотрофных по лизину клонов с тестерными штаммами [ASP+] и [мр"] приводит к образованию диплоидов Sup" (рис.la), а пассирование на среде, содержащей 5мМ GuHCl, - к изменению фенотипа этих диплоидов на Sup+ (рис. 16). Таким образом, инактивация генов UPF1 и UPF2 приводит к временной элиминации [ASP*]. Возможность повторного возникновения [ASP+] в штаммах с дизрупцией генов UPF1 и UPF2 свидетельствует о том, что эти гены не являются структурными генами прионоподобного детерминанта [/SP+], но участвуют каким-то образом в контроле его поддержания.

3. Идентификация гена SFP1 в качестве структурного гена [FSP+]

Третьим из генов, выявленных в результате скрининга инсерционного банка, был ген SFP1. Этот ген кодирует белок, обогащенный аспарагином и глутамином, и входит в список потенциально прионогенных белков. Таким образом, SFP1 изначально был наиболее вероятным кандидатом на роль структурного гена [ASP+], Чтобы выяснить, действительно ли ген SFP1 является структурным геном [А£Р+], был проведен всесторонний анализ роли этого гена в возникновении и поддержании детерминанта [ASP+],

3.1 Делеция SFP1 приводит к необратимой потере [ASP+]

Мы показали, что дизрупция гена SFP1 приводит к проявлению фенотипа Sup+ (рис.2) и потере [fSP+]. Кроме того, штаммы с дизрупцией этого гена стабильны, то есть в них не происходит повторного возникновения [ASP*], в отличие от штаммов [ир"], полученных при обработке штаммов [ASP*] 5мМ GuHCl. Чтобы получить дополнительные доказательства того, что инактивация гена SFP1 приводит к потере [ASP*], а не к маскировке его проявления, был получен штамм с делецией гена SFP1 -

з/р1Л-25-25-2В-П3982. Затем делеция гена в этом штамме была

компенсирована копией гена 5'/г/>/ на плазмиде рЯБЗ 15-8РР1. Из 559-и отобранных в этом эксперименте трансформантов 556 сохранили фенотип 8ир+. Этот факт свидетельствует о том, что изменение фенотипа штамма ,ч/р1А происходит вследствие потери [Л>Р+], а не в результате маскировки его проявления.

Таблица 2. Частота потери [й'/^] клонами, несущими компенсаторную плазмиду рЯЗЗ 15-ЮТ1, и клонами, утратившими эту плазмиду. __

Сегрегант Количество Из них Частота Количество Из них

клонов, потерявших потери клонов, потеряв-

потерявших [ISP+] сохранивших ших

плазмиду плазмиду F /ЯП

1-7-П4635- 466 126 0,27 289 0

UPFl::pCORE

2-7- 858 819 305 0

3-7- 756 [729 0,96 257 0

4-7- 106 88 0,83 295 0

6-7- 1415 948 0,67 300 0

1-8-П4635- 807 492 0,61 345 0

UPF1 : :pCORE

2-8- 234 149 0,63 361 0

5-8- 1078 842 0,78 276 0

6-8- 614 256 0,41 334 0

7-8- 1291 1231 0,95 268 0

Рисунок 1. Анализ клонов upflA, повторно изменивших фенотип с SupT на Sup", а -рост гибридов от скрещивания клонов Sup" с тестерными штаммами 5Б-П4513 [isp] (1) и [ISP+] (2); 3,4 - контрольное скрещивание исходного штамма [isp'J. б - рост клонов Lys" до (два верхних ряда) и после (два нижних ряда) пассирования на среде, содержащей 5мМ GuHCl

SMM-Lys SMM-His

SMM

s/pi j£

Рисунок 2. Делеция гена SFP1 приводит к изменению фенотипа штаммов [ISP+] с Sup" на Sup+

3.2. Сверхэкспрессия SFP1 приводит к индукции l/ST* ]

Известно, что увеличение продукции прионогенных белков индуцирует возникновение соответствующих прионов de novo (Wickner et al., 1996). Мы показали, что сверхэкспрессия гена SFP1 в штамме [isp~~\ у 99,6% трансформантов приводит к изменению фенотипа с Sup+ на Sup". Важно при этом, что потеря плазмиды pRS426-SFPl, с которой осуществлялась сверхэкспрессия, у большинства клонов не приводит к изменению фенотипа с Sup" на Sup+ (было исследовано 1946 клонов, потерявших плазмиду, 1389 из них сохранили фенотип Sup"). Это может свидетельствовать об индукции [/£Р+], или аналогичного ему по проявлению

детерминанта, при сверхэкспрессии SFP1.

Фенотип Sup", обусловленный присутствием этого детерминанта, проявляет доминантность в скрещивании с тестерным штаммом [isp*]. При обработке штаммов GuHCl происходит изменение их фенотипа на Sup+ (рис.3,4). Это говорит о том, что изменение фенотипа трансформантов связано не с проявлением эффекта сверхэкспрессии SFP1, а с индукцией антисупрессорного детерминанта. Помимо эффекта антисупрессии этот детерминант проявляет и другие свойства, сходные со свойствами [!SP+] (рис.3).

Ранее было показано (Volkov et al., 2002), что детерминант [/5Р+] не зависит от действия шаперона Hspl04. Для того чтобы получить еще одно доказательство того, что при сверхэкспрессии гена SFP1 индуцируется именно [75Р+], мы проверили влияние делеции и сверхэкспрессии HSP104 на поддержание детерминанта, возникающего в результате сверхэкспрессии SFP1. Для этого штамм hspl 04 Л-25-2В-П3982 D'sp"] трансформировали плазмидой pRS426-SFPl. 141 из 156-и трансформантов (-90%) проявляли фенотип Sup". При этом потеря плазмиды не приводила к изменению фенотипа с Sup" на Sup+. Таким образом, можно сделать вывод, что делеция гена HSP104 не препятствует индукции антисупрессорного детерминанта, возникающего при сверхэкспрессии Sfpl.

Кроме того, было изучено влияние сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание детерминанта, индуцированного сверхэкспрессией SFP1. Для этого тестерный штамм [/SP*], а также штамм, в котором был индуцирован [ЛУ/>+]-подобный детерминант, были трансформированы плазмидой pLH105, содержащей ген HSP104 под конститутивным GPD-промотором. 3168 из 3177-и трансформантов штамма 25-25-2В-П3982, а также все 340 трансформантов тестерного штамма [ЙУ1], сохранили фенотип Sup". Таким образом, сверхэкспрессия гена HSP104 не влияет на проявление и поддержание детерминанта, индуцированного сверхэкспрессией гена SFP1. Все эти факты позволяют считать, что при сверхэкспрессии SFP1 в штамме [isp] происходит эффективная индукция [AST5'].

Известно, что прионизация белков приводит к образованию амилоидных агрегатов (Wickner et al., 2001). Чтобы доказать присутствие агрегатов белка Sfpl в клетках [/SP], была использована конструкция SFP1-GFP, в которой последовательность полноразмерной копии гена SFP1 слита с последовательностью гена GFP - зеленого флуоресцентного белка (green fluorescence protein). Предварительно необходимо было проверить, не препятствует ли GFP возникновению и поддержанию [/5Р+]. Для этого мы использовали центромерную плазмиду рМТ3453. Этой плазмидой был трансформирован штамм sfplA-25-25-2В-П3982, имеющий стабильный фенотип Sup\ В митотическом потомстве трансформантов появлялись клоны с фенотипом Sup" с частотой, соответствующей частоте спонтанного возникновения [ISP^] (-10"4 на клетку на генерацию) (Volkov et al., 2002). Таким образом, GFP не мешает спонтанному возникновению [/5Р ].

Чтобы изучить возможность индукции [ISP+] при сверхэкспрессии конструкции SFP1-GFP, мы трансформировали штамм [м//] плазмидой pSFPl-GFP, экспрессирующей эту конструкцию под контролем индуцируемого промотора GAL1/10. Среди 674-и клонов, отобранных в митотическом потомстве десяти трансформантов, 577 клонов изменили фенотип с Sup+ на Sup" на индукторной среде, содержащей галактозу, и сохранили этот фенотип, когда были перенесены на среду, содержащую глюкозу. Мы показали также, что фенотип Sup" этих трансформантов доминантен, а их обработка GuHCl приводит к восстановлению фенотипа Sup+.

Таким образом, сверхпродукция Sfpl-GFP индуцирует появление В

совокупности эти данные позволяют использовать конструкцию SFP1-GFP для изучения агрегации Sfpl в клетках [Л?Р+].

Рисунок 3. Сверхэкспрессия гена SFP! приводит к индукции детерминанта, сходного по проявлению с [/SP*]. (1) - фенотип типичного трансформанта, сверхэкспрессируюшего SFP1: (2) - сохранение фенотипа Sup" того же штамма после потери мультикопийной плазмиды pRS426SFPl; (3) - восстановление супрессии после пассирования на GuHCl; (4) - контроль -штамм [/.?//]

5Б-П4513 || Рисунок 4. Фенотип Sup", вызванный временной

1 сверхэкспрессией гена SFP1 доминантен.

2 Гибриды от скрещивания тестерного штамма 5Б-П4513 ; 3 [ир ] с клонами, полученными в результате

сверхэкспрессии SFP1 (1-3); со штаммом 25-25-2В-П3982

5| (контроль) (4); со штаммом 25-25-2В-П3982 [up]

I bMM-Met- I'hr-Lys j (контроль) (5).

3.3. Биохимические доказательства агрегации белка Sfpl-GFP

Полученный при сверхэкспрессии SFP1-GFP штамм [/5Р+] был использован для изучения агрегации гибридного белка Sfpl-GFP. Экстракт клеток этого штамма анализировали с помощью SDS-PAGE с использованием холодного SDS и последующего вестерн-блота с антителами против GFP. Суть этого метода состоит в том, что холодный SDS разрушает только неамилоидные комплексы, в то время как при кипячении в SDS-содержащем буфере белок из агрегатов переходит в мономерную фракцию. Если изучаемый белок содержится в клетке в виде агрегатов, то в некипяченых пробах он входит в гель хуже, чем мономерная фракция того же белка, поэтому его количество снижено (Kushnirov et al., 2006). Мы обнаружили, что количество SfplGFP в кипяченых пробах штамма [ISP+] существенно превышает его количество в некипяченых пробах (рис.5). Поскольку кипяченая и некипяченая пробы содержат одинаковое количество тотального белка, разница в количестве Sfpl-GFP очевидно связана с тем, что в штамме [КР+] этот белок находится в агрегированной форме.

Рисунок 5. Белок Sfpl-GFP агрегирует в клетках [/SP4]. (А) - Вестерн-блот некипяченой, RT room temperature (1) и кипяченой, 95°С (2) проб экстрактов клеток штамма .$/р./Л-25-25-2В-П3982, сверхэкспрессируюшего гибридную конструкцию SFP1-GFP. (3) - контроль, кипяченая проба экстракта клеток штамма 25-25-2В-Г13982 [isp~], не содержащего конструкцию SFP1-GFP. В эксперименте использовали моноклональные антитела против GFP.

(Б) - контроль нанесения - мембрана, окрашенная Coomassie G250

Вместе с тем, в этом эксперименте нам не удалось детектировать Sfpl-GFP в штаммах, продуцирующих этот белок под контролем промотора SFP1, поэтому агрегация Sfpl-GFP была дополнительно изучена с помощью дифференциального

1 2 RT 95°

bFPIGFP

центрифугирования клеточных экстрактов и последующего вестерн-блота. Использовали два варианта штамма [Д>Р+]: один был получен при сверхэкспрессии конструкции SFP1-GFP в штамме .ф/Л-25-25-2В-П3982, а во втором [ISP+] возник спонтанно при экспрессии SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1. Кроме того, использовали штамм [isp~], также экспрессирующий SFP1-GFP под контролем промотора гена SFP1

С помощью дифференциального центрифугирования мы показали, что клетки [isp~] содержат гибридный белок Sfpl-GFP только в надосадочной фракции, в то время как клетки [75Р+] содержат часть белка также и в осадочной фракции (рис.6).

Рисунок 6. Гибридный белок Sfpl-GFP образует агрегаты в клетках [ISP+], но не в

клетках [ир~]. Детекция белка Sfpl-GFP с помощью вестерн-блота в осадочной (Р) и надосадочной (S) фракциях экстрактов клеток, экспрессирующих конструкцию SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFPI (1 и 2), промотора GAL1/10 (5 и 6), и в клетках [кр"] (3 и 4). В эксперименте использовали моноклональные антитела против GFP.

■VäALf

PSP1 IW I

p в P S p s №e

Наличие белка в осадочной фракции подтверждает наличие агрегатов в клетках штаммов [/£Р+].

3.4. Цитологические доказательства агрегации Sfpl-GFP, внутриклеточная локализация агрегатов

Дополнительное доказательство агрегации Sfpl-GFP было получено с помощью флуоресцентной микроскопии. Сравнивали характер свечения GFP в клетках штаммов [¡«р"] и [/5Р+]. Как и в предыдущем эксперименте, использовали два варианта штаммов [75Р+]: один был получен при сверхэкспрессии конструкции SFP1-GFP в штамме ^/¿1-25-25-2В-П3982, а во втором [ISP+] возник спонтанно при экспрессии SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1.

В шести независимых клонах штамма [isp'] мы наблюдали слабое свечение, распределенное между ядром и цитоплазмой, при этом более сильное свечение наблюдалось в ядре (рис.7). Сходное распределение свечения для Sfpl-GFP отмечали и другие авторы (Marion et al2004, Jorgensen et al., 2004).

В штаммах [/ÄP+] видны ярко светящиеся гранулы Sip 1-GFP, сходные с гранулами, образуемыми другими прионами. Такие гранулы наблюдаются в -5-7% клеток. Гранулы присутствуют как в клетках, сверхэкспрессирующих SFP1-GFP, так и в клетках экспрессирующих SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1 (рис.7).

В отдельных экспериментах была проведена внутриклеточная локализация агрегатов SfplGFP в клетках [iSP+]. Для визуализации ДНК использовали окрашивание DAPI. Мы обнаружили, что в подавляющем большинстве клеток агрегаты Sfpl-GFP локализуются в клеточных ядрах (рис.8).

Таким образом, биохимические и цитологические данные, в совокупности, свидетельствуют в пользу агрегации белка SfplGFP в клетках штаммов [/5Р+]. Более того, впервые показана локализация прионной формы белка в ядрах дрожжевых клеток.

3.5. Влияние приоиизации Sfpl на его функции

Принято считать, что прионизация приводит к нарушению функций соответствующих белков, вследствие этого фенотипические эффекты прионизации и инактивации соответствующего приону гена совпадают. Однако, прионизация белка Sfjpl приводит к фенотипу Sup", в то время как делеция гена SFP1 в нашем случае приводит к фенотипу Sup+.

Совме-

Рисунок 7. Визуализация агрегатов белка SfplGFP с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки [isp~] (а) и [ISP*] (б), экспрессирующие SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1. (в) - Клетки штамма полученного при

сверхпродукции Slpl-GFP в штамме [isp~\. (г) -клетки штамма полученного при

сверхпродукции Sfpl-GFP в штамме sfplA-25-25-2В-П3982

Рисунок 8. Ядерная локализация агрегатов8ф1-ОРР в клетках штамма |75Р+]. (а) - клетки [75Р+], сверхэкспрессирующие БРРЬОРР (б) - клетки ' экспресссирующие 8РР1-ОРР под контролем собственного промотора гена 0РР1

Известно, что делеция гена SFP1 приводит к уменьшению размера клеток, снижению устойчивости к антитрансляционным антибиотикам циклогексимиду и паромомицину и скорости роста штаммов (Fingerman et al., 2004). Мы провели сравнение штаммов [/5"Р+], [isp~] и штаммов с делецией гена SFP1 по этим признакам. Для этого были использованы [/£Р+], [мр ] варианты штамма 25-25-2В-П3982, а также производные этих штаммов, несущие делению гена SFP1.

В результате измерения площади 100 клеток каждого штамма были получены средние значения, представленные в таблице 3.

Различия средних значений площади клеток были оценены с помощью t-критерия Стьюдента. Показано, что различия между штаммами [ISP+] и sfplA - достоверны: t(diff)=32,14. Таким образом, прионизация Sfpl не приводит к уменьшению размера клеток, в отличие от делеции гена SFPL

На следующем этапе эти же штаммы сравнивали по устойчивости к циклогексимиду и паромомицину. Наиболее устойчивым к обоим антибиотикам оказался штамм [ISP+], наиболее чувствительными - оба штамма, несущих делецию

гена ЖРЛ а штамм [мр"] показал промежуточный результат (табл.4).

Таблица З.Средние значения площади клеток штаммов [/£Р+], [/.?/>"] и штаммов, несущих делецию гена £РР/.___

Штамм Средняя площадь клетки, мкм2

25-25-2В-П3982 32,3+0,49

25-25-2В-П3982 [щГ] 31,8+0,57

.Ф/Л-25-25-2В-П3982* 14,5+0,37

ф1А-25-25-2В-П3982** 14,4+0,21

* делеция гена 5РР7 получена у штамма 25-25-2В-П3982 [/5РГ] ** делеция гена 5РР/ получена у штамма 25-25-2В-П3982 [ир"]

Таблица 4. Штаммы [75Р+], [ир"] и яф1А проявляют различную устойчивость к

Антибиотик Зона ингиби1 эования, мм

[/5Р+] Гйр'1 вф1А* .ф/Л**

Циклогексимид 23,2+0,28 26,3+0,40 31,7+0,13 31,6+0,11

Паромомицин 11,4+0,23 14,2+0,20 23,3+0,07 23,4+0,01

* делеция гена получена у штамма 25-25-2В-П3982 [/5Р+] ** делеция гена БРР1 получена у штамма 25-25-2В-П3982 [¿ур"]

Таким образом, прионизация 8ф1 приводит к увеличению устойчивости к паромомицину и циклогексимиду по сравнению со штаммом [юр"], а делеция - к уменьшению.

Сравнение скорости роста штаммов [/ЯР+], [мр'] и э/р1А показало (рис.9), что штамм [/5Р+] растет быстрее, чем штаммы [мр"], а штаммы, несущие делецию гена ЖР/, растут гораздо медленнее.

[ЙР+] [¡¡р]

эЛ>1А*

Уф¡А**

Рисунок 9. Кривые роста [/5Р+], [¡5р~] и з(р!А вариантов штамма 25-25-2В-П3982, ; среда УРБ

Г" ,г « ,„ »ч г, Т,ЧаСЫ 1

Итак, по всем трем критериям (размер клеток, устойчивость к антитрансляционным антибиотикам и скорость роста штаммов) штамм [/£Р+] существенно отличается от штаммов, несущих делецию гена ЖРУ/. На основании этих данных можно предположить, что прионизация ЭТр1 ведет не к потере, а к модификации функции этого белка.

ОБСУЖДЕНИЕ

Разработанная в ходе настоящей работы методика скрининга инсерционного банка генов дрожжей, направленного на идентификацию генов, контролирующих проявление и поддержание прионоподобного детерминанта [7ЯР+], позволила

выявить три гена, инактивация которых приводит к изменению фенотипа штаммов [75Р+] с Sup" на Sup+. Это гены UPF1, UPF2 и SFP1. Такое изменение фенотипа может быть следствием не только элиминации [7SP+], но и следствием маскировки его проявления в результате нарушения функции этих генов.

Тем не менее, генетический анализ показал, что инактивация всех трех выявленных в скрининге генов приводит к элиминации [/£Р+], эффективность которой приближается к 100%. В то же время элиминация [ZSP+] у штаммов с инактивированными генами UPF1 и UPF2 носит обратимый характер: после непродолжительного хранения в этих штаммах вновь начинают накапливаться клетки [ISP']. Это говорит о том, что гены UPF1 и UPF2 не являются структурными генами [7SP+], хотя и участвуют в контроле поддержания [7SP+].

Причины временного исчезновения [7SP+] из клеток, в которых инактивированы гены UPF1 и UPF2, пока непонятны. Возможно, это связано с тем, что мы имеем дело с системой взаимодействующих белков, в состав которой входят белки Upfl и Upf2, факторы терминации трансляции eRFl и eRF3, на фоне изменения которых проявляется [Л£Р+], и белок, прионной формой которого является [7£Р+]. Нарушение функции одного из компонентов этой системы может приводить к изменению состояния других компонентов (в нашем случае, к элиминации [7£Р+]) и, соответственно, к изменению фенотипа. Однако это изменение носит временный характер и быстро компенсируется за счет повторного возникновения [ZSP+].

Наиболее существенные результаты работы связаны с третьим геном, выявленным в ходе скрининга инсерционного банка, SFP1. Этот ген изначально был наиболее вероятным кандидатом на роль структурного гена [75Р+], поскольку белок, кодируемый этим геном, подобно другим прионным белкам дрожжей, обогащен аспарагином и глутамином (Michelitsch and Weissman, 2000).

Мы получили исчерпывающие генетические, биохимические и цитологические доказательства того, что [75Р+] действительно представляет собой прионную форму белка Sfpl. В соответствии с критериями прионного наследования, сформулированными Р. Викнером (Wickner, 1996), делеция гена SFP1 приводит к необратимой элиминации [7£Р+], а сверхэкспрессия эффективно индуцирует возникновение антисупрессорного детерминанта, все свойства которого идентичны свойствам [/5'Р+]. Подобно [7SP+], этот детерминант излечивается при воздействии GuHCl и возникает вновь с высокой частотой; его поддержание в ряду клеточных поколений, как и поддержание [7SP+], не зависит от шаперона Hspl04. Фенотип Sup", обусловливаемый этим детерминантом, проявляет доминантность в скрещивании со штаммом [«/?"], имеющим фенотип Sup+.

Важнейшим доказательством того, что [7SP+] - это прионная форма белка Sfpl, является обнаружение агрегатов Sfpl в клетках [7SP+], в то время как в клетках [ир"] такие агрегаты не выявлены. В этих экспериментах использовали гибридный белок Sfpl-GFP. Мониторинг его состояния проводили как с помощью антител на белок GFP, так и с помощью флуоресцентной микроскопии. Важно отметить, что в предварительных экспериментах было показано, что гибридный белок не препятствует возникновению и поддержанию [75!Р+]. Биохимически агрегаты были выявлены с помощью двух методов - метода дифференциального центрифугирования клеточных экстрактов штаммов [ISP'] и [i's-р"] и метода SDS-PAGE с использованием холодного SDS. На следующем этапе присутствие агрегатов в клетках [tSP+] было подтверждено цитологически, с помощью флуоресцентной микроскопии, показавшей наличие светящихся гранул в клетках, содержащих как

спонтанно возникший [ISP+], так и индуцированный сверхпродукцией гибридного белка. Примечательно, что присутствие агрегированной формы белка зарегистрировано в ядрах клеток [ISP+], но не в их цитоплазме. Это первый случай ядерной локализации прионного детерминанта у дрожжей.

Как уже упомянуто, белок Sfpl обогащен аспарагином и глутамином. Известно, что участки, обогащенные этими аминокислотами, являются ключевыми компонентами прион-формирующих доменов. Как правило, такие домены находятся HaN- или С-конце белковой молекулы. В случае Sfpl вероятным кандидатом на роль прион-формирующего домена является последовательность, находящаяся в центральной части молекулы и не содержащая участков, существенных с функциональной точки зрения, таких как сайты фосфорилирования или цинковые пальцы, обнаруженные в составе этого белка. Однако пока это только предположение, которое нуждается в экспериментальной проверке.

Идентификация [ISP+] в качестве прионной формы белка Sfpl интересна с нескольких точек зрения. Этот белок представляет собой глобальный регулятор транскрипции, участвующий в контроле экспрессии около 10% дрожжевого генома. Это уже пятый транскрипционный фактор дрожжей, который, наряду с белками Ure2, Swil, Сус8 и Mot3, способен переходить в прионное состояние. При этом функции Swil, Сус8, Mot3 и Sfpl носят глобальный характер. Возможно, таким образом, что прионизация играет существенную роль в регуляции экспрессии генов у дрожжей и представляет собой гибкий адаптивный механизм, позволяющий обратимо изменять уровень экспрессии большого количества генов без изменения уровня экспрессии самого транскрипционного фактора.

Еще один аспект, открывшийся благодаря сравнению свойств штаммов [/5Т5'] и [/sp], состоит в том, что прионизация Sfpl приводит к другим фенотипическим эффектам, нежели делеция гена SFP1. Это отличает [ISP+] от других дрожжевых прионов, поскольку считается, что прионизация приводит к инактивации соответствующего белка. Соответственно штаммы, содержащие прион, должны быть идентичны по фенотипу штаммам, несущим делецию соответствующего гена. Однако штаммы с делецией гена SFP1 проявляют фенотип Sup+, в отличие от штаммов [/5Р+], проявляющих фенотип Sup". Кроме того, штаммы [Й'Р+] отличаются от штаммов sfplA по скорости роста, размеру клеток и устойчивости к антибиотикам-ингибиторам трансляции. Эти факты можно рассматривать как свидетельство того, что прионизация не инактивирует Sfpl, а модифицирует его функции, хотя возможны и другие объяснения (можно предположить, например, что прионизация Sfp 1 влияет на статус каких-то других белков, вызывая специфические изменения фенотипа). Этот аспект также требует дальнейших исследований. Обращает на себя внимание и тот факт, что штаммы, содержащие [/5Р+], характеризуются более высокой скоростью роста, большей устойчивостью к антибиотикам, большим размером клеток. Это говорит о том, что наличие приона может давать преимущество штаммам дрожжей.

Ядерная локализация позволяет высказать некоторые предположения, объясняющие некоторые свойства [ZSP+] и его отличия от других известных дрожжевых прионов.

1. Высокая частота спонтанного и индуцируемого сверхэкспрессией SFP1 возникновения [ISP+], Помимо того, что Sfpl выполняет свои функции в ядре, регулируемые им гены располагаются кластерами и, возможно, их транскрипция происходит в какой-то определенной области ядра. Такая компартментализация дает

большую возможность для агрегации сравнительно небольшого количества молекул Sfpl, присутствующих в клетке.

2. Низкая эффективность цитодукции. Эффективность передачи прионов при цитодукции в случае [URE3] и [Р^] близка к 100%, в то время как эффективность цитодукции для [ISP+] составляет всего 17% (Volkov et al., 2002). Такие различия могут быть связаны с тем, что [URE3] и [Р574] локализуются в цитоплазме, а [ASP*] -в ядре, в результате его передача при цитодукции может происходить только случайно.

3. Независимость от шаперона Hspl04. Ядерная локализация [/573+] позволяет предположить, что именно это обстоятельство определяет его независимость от Hspl04, поскольку данные об активности Hspl04 в ядре отсутствуют. Вместе с тем, это не объясняет излечиваемость [ТЖР*] гидрохлоридом гуанидина, поскольку в основе механизма излечивания под действием GuHCl других дрожжевых прионов лежит ингибирование этим агентом активности ГТФ-азного домена Hspl04. В этой связи можно предположить, что GuHCl ингибирует активность каких-либо других шаперонов, работающих в ядре. С другой стороны, нужно отметить, что элиминация [AST^] под действием GuHCl связана не только с излечиванием, но и с селекцией против клеток [ISP*], более чувствительных к GuHCl, нежели клетки [и//]. Известно, что GuHCl является агентом, вызывающим стресс, который может, в частности, служить причиной выхода Sfpl из ядра в цитоплазму, что предотвращает образование новых прионных агрегатов.

Таким образом, нехромосомный детерминант f/5!P+] может рассматриваться в качестве нового дрожжевого приона, отличающегося по некоторым, весьма существенным, свойствам от уже известных прионов дрожжей. Это позволяет заключить, что современные представления о механизмах и последствиях прионного превращения белков еще далеко не окончательны, и делает перспективными дальнейшие исследования этого явления.

ВЫВОДЫ

1. Скрининг инсерционного банка генов дрожжей выявил три гена, инактивация которых приводит к элиминации детерминанта [ASP"]. Это гены SFP1, UPF1 и UPF2.

2. Роль генов UPF1 и UPF2 в поддержании [Й'Р'], очевидно, не существенна, поскольку их инактивация приводит лишь к временной элиминации этого детерминанта.

3. Инактивация гена SFP1 приводит к необратимой элиминации [ISP*], а его сверхэкспрессия эффективно индуцирует возникновение [/£Р+], что позволило предположить, что SFPI является структурным геном [ASV+].

4. Это предположение подтверждено биохимическими и цитологическими данными, в соответствии с которыми белок Sfpl образует агрегаты в клетках, содержащих [ASP+], а в клетках [isp'} находится в растворимом состоянии.

5. Показано, что агрегаты белка Sfpl локализуются в ядрах клеток [/SP4].

6. Штаммы [/£Р+] существенно отличаются по своим свойствам от штаммов, несущих делецию гена SFP1. Это дает основание предполагать, что прионизация белка Sfpl приводит не к потере, а к модификации его функций.

7. Характер различий в свойствах штаммов [AST5" ] и [isp~] подтверждает гипотезу, согласно которой прионизация белков у одноклеточных эукариот может представлять собой эффективный механизм, обеспечивающий адаптацию клеточной популяции к меняющимся внутриклеточным и внешним условиям.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1) Rogoza Т., Goginashvili A., Rodionova S., Ivanov М., Viktorovskaya О., Rubel А., Volkov К., Mironova L. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfpl // PNAS. 2010. V. 107. № 23. P. 10573-10577.

2) Рогоза T.M., Викторовская O.B., Родионова C.A., Иванов М.С., Волков К.В., Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+] у дрожжей, с помощью инсерционной библиотеки генов // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 1-8.

Тезисы:

1) Rogoza Т., Goginashvili A., Mironova L. Unusual properties of [AS'P+], the prion form of the global transcriptional regulator Sfpl. EMBO Conference on Gene Transcription in Yeast (San Feliu de Guixols, Spain, June 19-24, 2010) - Book of Abstracts, P. 96.

2) Rogoza Т., Goginashvili A., Mironova L. The non-Mendelian determinant [/SP+] is a prion form of Sfpl transcription factor, which co-localizes with nucleus. 27lh International Specialized Symposium on Yeasts (Paris, France, August 26-29,2009) - Book of Abstracts, P. 53.

3) Goginashvili A., Rogoza Т., Matveenko A., Mironova L. Prion conversion does not disturb the Sfpl function. 27tfl International Specialized Symposium on Yeasts (Paris, France, August 26-29, 2009) - Book of Abstracts, P. 225.

4) Rogoza Т., Goginashvili A., Ivanov M., Mironova L. Nonsense Suppression Efficiency is Yeasts Depends on the Level of SFP1 Expression. CSHL Meeting on Translational Control (Cold Spring Harbor, USA, September 3-7, 2008) - Book of Abstracts, P. 277.

5) Rogoza Т., Goginashvili A., Volkov K., Mironova L. The SFP1 gene is a likely candidate to a role of structural gene encoding the prion-like determinant [/5P+]. 12th International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15, 2008) - Book of Abstracts, P. 148.

6) Goginashvili A., Rogoza Т., Volkov K., Mironova L. Over-expression of RPS24A increases the rate of the prion-like determinant [/SP+] appearance. 12th International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15,2008) - Book of Abstracts, P. 144.

7) Rogoza Т., Viktorovskaya O., Volkov K., Mironova L. Identification of genes influencing manifestation and propagation of the prion-like determinant [/SPr] in Saccharomyces cerevisiae, using yeast insertion library. Materials of 3 International Young Scientists conference "Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution dedicated to 100 anniversary from birth of famous Ukrainian lichenologist Maria Makarevych" (Odessa, Ukraine, May 15-18,2007) - Book of Abstracts, P. 218.

8) Viktorovskaya O., Rogoza Т., Volkov K., Mironova L. Manifestation of the yeast prion-like determinant [ISP+] depends on genes controlling nonsense-mediated mRNA decay in yeast Saccharomyces cerevisiae. Materials of 3 International Young Scientists conference "Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution dedicated to 100 anniversary from birth of famous Ukrainian lichenologist Maria Makarevych" (Odessa, Ukraine, May 15-18, 2007)-Book of Abstracts, P. 232.

9) Mironova L., Rogoza Т., Volkov K., Viktorovskaya O., Ivanov M.The SFP1 gene encodes a potential new yeast prion involved in regulation of translation termination efficiency. Materials of the XXIIIrd International Conference on Yeast Genetics and

Molecular Biology, Melbourne, Australia, July 1-6, 2007 - Book of Abstracts, P. 223

10) Rogoza T.M., Viktorovskaya O.V., Volkov K.V., Ivanov M.S., Mironova L.N. Sfpl is involved in the control of stop codons read-through efficiency in yeast. Materials of EMBO conference on protein synthesis and translational control (Heidelberg, Germany, September 5-11, 2007) - Book of Abstracts, P.365

11) Рогоза T.M., Викторовская O.B., Волков K.B., Миронова JI.H. Использование инсерционной библиотеки генов для поиска генов, влияющих на поддержание прионоподобного детерминанта [Й7>+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae// материалы международной школы-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е.Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов, Санкт-Петербург 10-13 ноября, 2007, - Сборник тезисов, С.78

12) Викторовская О.В., Волков К.В.,Родионова С.А., Рогоза Т.М., Миронова Л.Н. Идентификация генов, влияющих на поддержание и проявление детерминанта [Л>Р+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с использованием инсерционной библиотеки генов// Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им.Н.И.Вавилова, Россия, Москва, 28 июня- 2 июля 2006., - Сборник тезисов, С.32.

13) Рогоза Т.М., Родионова С.А., Волков К.В., Миронова Л.Н. Влияние продуктов генов системы деградации нонсенс-содержащих мРНК (NMD) на поддержание и проявление детерминанта [fSP+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им.Н.И.Вавилова, Россия, Москва, 28 июня- 2 июля 2006, - Сборник тезисов, С. 167.

14) Rodionova S., Rogoza Т., Volkov К., Mironova L. The SFP1 is a potential host gene for yeast prion-like determinant [ISP']// 22-nd international conference on yeast genetics and molecular biology (Bratislava, Slovakia, August 7-12, 2005) - Book of Abstracts, P. 130.

15) Волков К.В., Аксенова А.Ю., Родионова С.А., Гиль Ю.П., Рогоза Т.М., Бурдаева 51.В., Миронова Л.М. Характеристика генетической системы, контролирующей поддержание и проявление дрожжевого приона [ISP+]II III съезд ВОГиС. Россия, Москва, 6-12 июня 2004, - Сборник тезисов, С58.

Подписано в печать 02.09.2010г. Формат 60.ч84:'16 П.л. 1,25 Уч.-изд.л 1,25. Тир. 100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 191186, Санкт-Петербур!, ул. Миллионная д.1. toroussel@mail.ru Зак. № 13247 от 22.09.2010г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рогоза, Татьяна Михайловна

Введение

1. Прионы дрожжей S. cerevisiae и способы их поиска (Обзор литературы)

1.1. Модели прионизации

1.2. Наследственные детерминанты [PS/4"] и [URE3]

1.3. Критерии прионного наследования

1.4. Структура белков Sup35 и Ure

1.5. Прионоподобный детерминант [PIN*]

1.6. Прионы [SWf], [OCT*], [МОТЗ+], [МСА]

1.7. Прионы дрожжей и шапероны

1.8. Возможная биологическая роль прионов дрожжей S.cerevisiae

1.9. Прионоподобный детерминант [7SP+]

2. Материалы и методы

2.1. Штаммы

2.2. Плазмиды

2.3. Среды и условия культивирования

2.4. Генетические методы

2.5. Молекулярно-генетические методы 51 2.6 Методы флуоресцентной микроскопии

2.7. Измерение площади клеток

2.8. Статистические методы

3. Результаты

3.1. Трансформация штамма 25-25-2В-П3982 [/5Р+] инсерционным Банком генов

3.2. Генетический анализ интегрантов, проявляющих фенотип Sup+

3.3. Генетический анализ интегрантов, потерявших [ISP +]

3.4. Генетический анализ интегрантов, сохранивших фенотип Sup"

3.5. Идентификация точки инсерции транспозона тТпЗ

З.б.Секвенирование плазмид рО.1, рб.4 и р9.1 и анализ полученных данных

3.7. Анализ отобранных интегрантов с использованием ПЦР

3.8. Изучение влияния продуктов генов \JPF1 и \JPF2 на [//5.Р+]

3.9. Изучение влияния гена ЖР7 на [/5!Р+]

3.9.1 Изучение влияния делеции гена на [/£Р+]

3.9.2 Сверхэкспрессия гена БГР! приводит к индукции [/5Р+]

3.9.3 Биохимические и цитологические доказательства связи между вф1 и [Ш+]

3.9.3.1 Сверхэкспрессия конструкции БРРЬОРР приводит к индукции [/6Р+]

3.9.3.2 Биохимические доказательства агрегации белка 8ф 1 -ОРР

3.9.3.3 Цитологические доказательства агрегации 8ф1-ОРР

3.9.4 Влияние прионизации 8ф1р на его функции

4. Обсуждение

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Одним« из значимых событий, произошедших во второй половине XX века в биологии, стало открытие прионов. Прионами называются возбудители трансмиссивных губчатых энцефалопатий, таких как болезнь Крейцфельда-Якоба и куру человека; скрейпи у овец и «коровье бешенство» у крупного рогатого скота.

Долгое время попытки выявить возбудителя подобных заболеваний, не приводили к желаемому результату (см. Prusiner, 1982). Длительные исследования позволили установить, что возникновение прионных заболеваний связано с собственным белком организма, названным прионом от «proteinaceous infection», РгР. Этот белок способен принимать специфическую прионную конформацию и воспроизводить ее автокаталитически (см. Prusiner, 1994, cM.Prusiner, 1996).

Существование белков, проявляющих сходную по своей молекулярной природе способность к превращению в прионы, было обнаружено и у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Появление в клетке дрожжей прионной формы белка также связано с образованием специфически организованных агрегатов, называемых амилоидами, способных к автокаталитическому поддержанию и к передаче от организма к организму. Однако есть существенное различие между прионами млекопитающих и прионами дрожжей. Прионы млекопитающих — это, как уже было отмечено, инфекционные агенты, локализующиеся- на мембране клеток, а прионы дрожжей представляют собой цитоплазматические наследственные детерминанты. Таким образом, обнаружение дрожжевых прионов позволило выявить новый механизм передачи информации в ряду клеточных поколений, в основе которого лежит матричный процесс особого типа -копирование конформации одного белка другим.

К началу нашей работы было найдено три приона дрожжей: [PS1/], [URE3] и [/Wf] (Сох, 1965; Lacroute, 1971; Derkatch et al., 1997). Актуальной задачей являлась идентификация и описание новых прионов. Это важно для выяснения закономерностей процесса прионизации и распространения феномена прионного превращения белков в природе. Создание простых и эффективных модельных систем позволило существенно интенсифицировать поиск новых прионных белков, что поможет исследовать молекулярные механизмы прионообразования и найти подходы к разработке методов терапии неизлечимых прионных болезней человека и животных. В последние годы у дрожжей выявлено еще четыре приона: \SWfl, [ОСТ*], [МОТЗ ] и [МСА] (Би а а1, 2008; Мешесек ег а12009; Ра1е1 ег а1, 2009; А\ЪеШ ег а1., 2009).

Несколько лет назад в нашей лаборатории был обнаружен нехромосомный детерминант, проявляющий антисупрессорные свойства по отношению к некоторым мутациям по гену 31/Р35. Этот детерминант был обозначен как [/5Р+] (Уо1коу е! а1., 2002). Генетические свойства этого детерминанта говорили о том, что он может иметь прионную природу. Дальнейшему изучению детерминанта [/5!Р+] посвящена настоящая работа.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рогоза, Татьяна Михайловна

5. ВЫВОДЫ:

1. Скрининг инсерционного банка генов дрожжей выявил три гена, инактивация которых приводит к элиминации детерминанта [75Р+]. Это гены SFP1, UPF1 и UPF2.

2. Роль генов UPF1 и TJPF2 в поддержании [/£Р+], очевидно, не существенна, поскольку их инактивация приводит лишь к временной элиминации этого детерминанта.

3. Инактивация гена SFP1 приводит к необратимой элиминации [/£Р+], а его сверхэкспрессия эффективно индуцирует возникновение [/6Р+], что позволило предположить, что SFP1 является структурным геном [/&Р+].

4. Это предположение подтверждено биохимическими и цитологическими данными, в соответствии с которыми белок Sfpl образует агрегаты в клетках, содержащих [AST3'], а в клетках [¿sp~] находится в растворимом состоянии.

5. Показано, что агрегаты белка Sfpl локализуются в ядрах клеток

6. Штаммы [ZSP+] существенно отличаются по своим свойствам от штаммов, несущих делецию гена SFP1. Это дает основание предполагать, что прионизация белка Sfpl приводит не к потере, а к модификации его функций.

7. Характер различий в свойствах штаммов [/SP+] и \isp"\ подтверждает гипотезу, согласно которой прионизация белков у одноклеточных эукариот может представлять собой эффективный механизм, обеспечивающий адаптацию клеточной популяции к меняющимся внутриклеточным и внешним условиям.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рогоза, Татьяна Михайловна, Санкт-Петербург

1. Глотов Н.В., Животовский А.Л., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия // Учебное пособие. Л.: изд. Ленинградского Университета, 1982.- 140 с.

2. Задорский С.П., Сопова Ю.В., Инге-Вечтомов С.Г. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 2000. - Т.36. - С. 1322-1329.

3. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984. 143с.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

5. Миронова Л.Н., Гогинашвили А.И., Тер-Аванесян М.Д. Биологические функции амилоидов: факты и гипотезы // Молекулярная биология. 2008. - Т.42(5). - С.798-808.

6. Тер-Аванесян М.Д., Кушниров В.В. Прионы — инфекционныебелки e генетическими свойствами //Биохимия. 1999. - Т.64. - С.1638-1647.

7. Холлендер М., Вулф Д. Непараметрические методы статистики. -М.: Финансы и статистика, 1983. 518 с.

8. Шабельская С.В. Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae Н Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. -Санкт-Петербург 2005.

9. Aigle M., Lacroute F. Genetical aspects of URE3., a non-Mendelian cytoplasmically inherited mutation in yeast // Mol. Gen. Genet. 1975. - V.136. -P.327-335.

10. Albanese V., Yam A.Y., Baughman J., Parnot C., Frydman J. Systems analyses reveal two chaperone networks with distinct functions in eukaryotic cells // Cell. 2006. - V. 124(1). - P.75-88.

11. Alberti S., Halfmamr R., King O., Kapila A., Lindquist S. A systematic survey identifies prions and- illuminates sequence features of prionogenic proteins // Cell. 2009. - V. 137(1). - P. 146-58.

12. Allen K.D., Wegrzyn R.D., Chernova T.A., Muller S., Newnam G.P.,

13. Winslett P.A., Wittich K.B., Wilkinson K.D., Chernoff Y.O. Hsp70 chaperones astmodulators of prion life cycle: novel effects ofSsa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion PS/. // Genetics. 2005. - V.169. - P. 1227.

14. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool //Mol. Biol. J.-1990.-V. 215.-P. 403-410.

15. Bagriantsev S.N., Gracheva E.O., Richmond J.E., Liebman S.W. Variant-specific PSI*. Infection is Transmitted by Sup35 Polymers within [PSf] Aggregates with Heterogeneous Protein Composition // Mol. Biol. Cell. 2008. -V.19(6). -P.2433-43.

16. Bagriantsev S., Liebman S.W. Specificity of prion assembly in vivo. PS1/. and [PIN*] form separate structures in yeast // J. Biol. Chem. 2004. -V.279 (49).-P.51042-51048.

17. Baxa U., Cassese T., Kajava A.V., Steven A.C. Structure, function, and amyloidogenesis of fungal prions: filament polymorphism and prion variants // Adv. Protein. Chem. 2006. - Y.73. - P.125-180.

18. Blumberg H., Silver P. A split zinc-finger protein is required for normal yeast growth // Gene. 1991. - V. 107(1). - P. 101-10.

19. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976. - V.7(72). - P.248-54.

20. Bradley M.E., Edskes H.IC., Hong J.Y., Wickner R.B., Liebman S.W. Interactions among prions and prion "strains" in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99. - P. 16392-9.

21. Bums N., Grimwade B., Ross-Macdonald P.B., Choi E.-Y., Finberg K., Roeder G.S., Snyder M. Large-scale characterization of gene expression, protein localization and gene disruption in Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev. 1994. -"V.8 - P. 1087-1105.

22. Byrne L.J., Cox B.S., Cole D.J., Ridout M.S., Morgan B.J., Tuite M.F. Cell division is essential for elimination of the yeast PST4. prion by guanidine hydrochloride II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V. 104(28). -P.l 1688-11693.

23. Chabelskaya S., Gryzina V., Moskalenko S., Le Goff C., Zhouravleva G. Inactivation of NMD increases viability of sup45 nonsense mutants in Saccharomyces cerevisiae II BMC Mol.Biol. 2007. - V.8. - P.71.

24. Chacinska A., Szczesniak B., Kochneva-Pervukhova N.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Boguta M. Ssbl chaperone is a PS/*. prion-curing factor // Curr Genet. 2001. V.39. P. 62-67.

25. Chernoff Y.O. Amyloidogenic domains, prions and structural inheritance: Rudiments of early life or recent acquisition? // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004. - V.8. - P.665-71.

26. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de novo appearance of P£7".-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr.Genet. 1993. - V.24. - P.268-270,

27. Chernoff Y.O., Galkin A.P., Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy S.M. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein // Mol. Microbiol. 2000. - V.35. - P.865-76.

28. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PST. // Science. 1995. - V.268. - P.880-884.

29. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the P574". prion // Mol.Cell Biol. 1999. -V.19. - P.8103-8112.

30. Chernoff Y.O., Uptain S.M., Lindquist S.L. Analysis of prion factors in yeast// Methods Enzymol. 2002. - V. 351. - P.499-538.

31. Cipollina C., van den Brink J., Daran-Lapujade P., Pronk J.T., Porro D., de Winde J.H. Saccharomyces cerevisiae SFP1: at the crossroads of central metabolism and ribosome biogenesis // Microbiology. — 2008a. V.154(Pt 6). -P.1686-1699.

32. Cipollina C., van den Brink J., Daran-Lapujade P., Pronk J.T., Vai*M., de Winde J.H. Revisiting the role of yeast Sfpl in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study // Microbiology. 2008b. - V.154(Pt 1). - P.337-346.

33. Cohen F.E., Pan K.M., Huang Z., Baldwin V., Fletterick R.J., Prusiner S.B. Structural clues to prion replication // Science.-1994.-V.264- P.530-531.

34. Collins S.R., Douglass A., Vale R.D., Weissman J.S. Mechanism of prion propagation: amyloid growth occurs by monomer addition // PLoS Biol.' -2004.-V.2. -E321.

35. Cox B.S. PS7*., a cytoplasmic supperssor of supersuppressors in yeast // Heredity. 1965. - V. 20. - P. 505-521.

36. Cox B.S. A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and otherpsi phenomena // Heredity. 1971. - V.26. - P.211-232.

37. Cox B.S., Tuite M.F., McLaughlin C.S. The PST*. factor of yeast: a problem in inheritance // Yeast. 1988. - V.4. - P. 159-178.

38. Cox B.S., Tuite M.F., Mundy C.J. Reversion from suppression to nonsuppression in SJJQ5 PST*. strains of yeast: the classificaion of mutations I I Genetics. 1980. - V.95. - P.589-609.

39. Culbertson M.R., Neeno-Eckwall E. Transcript selection and the recruitment of mRNA decay factors for NMD in Saccharomyces cerevisiae // RNA. 2005. - V.l 1(9). - P. 1333-9.

40. DePace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion // Cell 1998. - V.93. - P.1241-1252.

41. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of PSf. and [PIN*]: a two-prion system in yeast? // EMBO J". 2000. - V.2; 19(9). -P. 1942-52.

42. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of-fP/iV*. // Cell. 2001. - V. 106. - P. 171-182.

43. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PS/*. prion in Saccharomyces cerevisiae II Genetics.-1997.-V.147(2).-P.507-19.

44. Derkatch I.L., Liebman S.W. Prion-prion interactions //Prion. 2007. — V.l(3). -P.161-9.

45. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. - V.144. - P.1375-1386.

46. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2- mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. 1994. - V.137. -P.659-670.

47. Douglas P.M., Cyr D.M. Interplay between protein homeostasis networks in protein aggregation and proteotoxicity // Biopolymers. 2010. -V.93(3). -P.229-36.

48. Douglas P. M., Treusch S., Ren H. Y., Halfmann R., Duennwald M. L., Lindquist S., Cyr D.M. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2008. V.105. - P.7206-7211.

49. Douglas P.M., Summers D.W., Ren H.Y., Cyr D.M. Reciprocal efficiency of RNQ1 and polyglutamine detoxification in the cytosol and nucleus // Mol Biol Cell. -2009. -V.20(19). -P.4162-73.

50. Du Z., Park K.W., Yu H:, Fan Q., Li L Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Saccharomyces cerevisiae I I Nat Genet. 2008. - V.40(4). - P.460-5.

51. Edskes H.K., Gray V.T., Wickner R.B. The URE3. prion is an* aggregated formof Ure2p that can be cured,by overexpression of Ure2p fragments // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1999. - V.96. - P.* 1498-1503.

52. Erhardt M., Wegrzyn R.D., Deuerling E. Extra N-terminal residues have a profound effect on the aggregation properties of the potential yeast prion protein Meal // PLoS One. 2010. - V.5(3). - P.e9929.

53. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gaumer S., Komar A.A., Cullin C. Characterization of the interaction domains of Ure2p, a prion-like protein of yeast //Biochem.J. 1999. - V.338. - P.403-407.

54. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Cullin C. The yeast prion URE3. can be greatly induced by a functional mutated URE2 allele // EMBO J. 2000. -V.19. - P.3215-3222.

55. FeiTone F. Analysis of protein aggregation kinetics // Methods Enzymol. 1999. - V.309. - P.256-274.

56. Fingerman I., Nagaraj V., Norris D., Vershon A.K. Sfpl plays a key role in yeast ribosome biogenesis // Eukaryot Cell. 2003. - V.2(5). - P.1061-8.

57. Ganusova E.E., Ozolins L.N., Bhagat S., Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Sherman M.Y., Chemoff Y.O. Modulation of prion formation, aggregation, and toxicity by the actin cytoskeleton in yeast // Mol Cell Biol. 2006. - V.26(2). -P.617-29.

58. Gao Q., Das B., Sherman F., Maquat L.E. Cap-binding protein 1-mediated and eukaryotic translation initiation factor 4E-mediated pioneer rounds of-translation in yeast // Proc. Natl. Acad. Sd. USA.- 2005. V. 102(12). - P.4258-63.

59. Garvik B., Haber J.E. New cytoplasmic genetic element that controls 20S RNA synthesis during sporulation in yeast // J.Bacteriol. 1978. - V.134. -P.261-269.

60. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PSf., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae II Cell. 1997. - V.89. - P.811-819.

61. Glover J.R., Lindquist S. Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins // Cell. 1998: -V.94(l). - P.73-82.

62. Gonzalez C.I., Bhattacharya A., Wang W., Peltz S. W. Nonsensemediated mRNA decay in S. cerevisae II Gene-2001.-V.274.-P. 15-25.

63. Griffith J.S. Self-replication and scrapie // Nature. 1967. - V. 215. -* P. 1043-1044.

64. Harrison P.M., Gerstein M. A method to assess compositional bias in biological sequences and its application to prion-like glutamine/asparagine-rich domains in eukaryotic proteomes // Genome Biol. 2003. — V.4(6). - P.R40.

65. Harrison P., Kumar A., Lan N., Echols N., Snyder M., Gerstein M. A small reservoir of disabled ORFs in the yeast genome and its implications for the dynamics ofproteome evolution//J. Mol. Biol. 2002. - V.316. - P.409-419.

66. Hartwell L.H., Culotti J., Pringle J.R., Reid B.J. Genetic control of the cell division cycle in yeast// Science. 1974. - V. 183(4120). -P.46-51.

67. Herker E., Jungwirth H., Lehmann K.A., Maldener C., Fröhlich K.U., Wissing S., Büttner S., Fehr M., Sigrist S., Madeo F. Chronological aging leads to apoptosis in yeast // J. Cell Biol. 2004. - V.164. - P.5011-7.

68. Hilleren P., Parker R. Mechanisms of mRNA surveillance in eukaryotes // Genetics. -1999.-V.33.-P.229-260.

69. Hosoda N., Kobayashi T., Uchida N., Funakoshi Y., Kikuchi Y., Hoshino S., Katada T. Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation // Biol Chem. J. 2003. - V.278(40). -P.38287-91.

70. Jensen M.A., True H.L., Chernoff Y.O., Lindquist S. Molecular population genetics and evolution of a prion-like protein- in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2001. - V. 159. - P.527-35.

71. Johnston G.C., Singer R.A., McFarlane S. Growth and cell division during nitrogen starvation of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bacterid: — 1977. - V. 132(2). - P.723-30.

72. Jones G., Song Y., Chung S., Masison D.C. Propagation of Saccharomyces cerevisiae PS/^. prion is impaired by factors that regulate Hsp70 substrate binding // Mol. Cell Biol. 2004. - V.24. - P.3928.

73. Jorgensen P., Nelson B., Robinson M.D., Chen Y., Andrews B., Tyers M., Boone C. High-resolution genetic mapping with ordered arrays of Saccharomyces cerevisiae deletion mutants // Genetics. — 2002. — V. 162(3). — P.1091-9.

74. Jorgensen P., Rupes I., Sharom J.R., Schneper L., Broach J.R., Tyers M. A dynamic transcriptional network communicates growth potential to ribosome synthesis and critical cell size II Genes Dev. 2004. - V.18. - P.2491-2505.

75. Joo Y.J., Kim J.H., Baek J.H., Seong K.M., Lee J:Y., Kim J. Determination of the core promoter regions of the Saccharomyces cerevisiae RPS3 gene II Biochim. Biophys. Acta. 2009. - V. 1789(11-12). - P.741-50.

76. Ishigaki Y., Li X., Serin G., Maquat L.E. Evidence for a pioneer round of mRNA translation: mRNAs subject to nonsense-mediated decay in mammalian cells are bound by CBP80 and CBP20. Cell. - 2001. - V. 106(5). -P1607-17.

77. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. // Cold« Spring Harbor Laboratory Press. 1994.-234p.

78. King C.Y., Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three yeast prion strains //Nature. 2004. - V.428(6980). - P:319-23.

79. King C.Y., Tittmann P., Gross H., Gebert R., Aebi M:, Wuthrich K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.6618-6622.

80. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. Yeast prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 // J. Biol. Chem. 2003. - V.278 (49) - P.49636-49643.

81. Kryndushkin D., Wickner R.B. Nucleotide exchange factors, for Hsp70s are required for URE3. prion propagation in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Biol. Cell. 2007. - V.18. -P.2149-54.

82. Kurahashi H., Ishiwata M., Shibata S., Nakamura Y. A Regulatory Role of the Rnql Nonprion Domain for Prion Propagation and Polyglutamine Aggregates // Molecular and Cellular Biology. 2008. - V. 28:10. - P. 3313-3323.

83. Kurahashi H., Shibata S., Ishiwata M., Nakamura Y. Selfish prion of Rnql mutant in yeast // Genes Cells. 2009. - V. 14(5). - P.659-68.

84. Kushnirov V.V., Alexandrov I.M., Mitkevich O.V., Shkundina I.S., Ter-Avanesyan M.D. Purification and analysis of prion and amyloid aggregates // Methods. -2006. -V.39(l). -P.50-5.

85. Kushnirov V.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B, Frolova N.S., Ter-Avanesyan M.D. Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica //EMBO J. 2000. - V.19. - P.324-331.

86. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and Replication of Yeast Prions // Cell. 1998.-V.94.-P.13-16.

87. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae // Gene. 1988. - V.66. - P.45-54.

88. Kushnirov V.V., Vishnevskaya A.B., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D. Prion and nonprion amyloids: a comparison inspired by the yeast Sup35 protein // Protein-Based Inheritance. Ed. ChernoffY.O. 2007. - P.73-82.

89. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast //J.Bacteriol. 1971. - V.106. - P.519-522.

90. Lansbury P.T., Caughey B. The chemistry of scrapie reaction: the "ice 9" metaphore // Chem. Biol.-1995.-V.2.-P.l-5.

91. Lempiainen H., Uotila A., Urban J., Dohnal I., Ammerer G., Loewith R., Shore D. Sfpl interaction with TORC1 and Mrs6 reveals feedback regulation on TOR signaling // Mol. Cell. 2009. - V.33(6). - P.704-16.

92. Le Hir H., Izaurralde E., Maquat L.E., Moore MJ. The spliceosome deposits multiple proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions // EMBO J. 2000. - V. 19. - P.6860-6869.

93. Li Z.Y., Ke X.S., Liu D.P., Liang C.C. Insights into mechanism of NMD: digging from the NMD-related protein complexes // Curr Med Chem. -2006. 13(14).-P.1693-705.

94. Li, B., Nierras, C., and Warner, J. Transcriptional elements involved in the repression of ribosomal protein synthesis // Mol.Cell. Biol. 1999. - V.19. -P. 5393-5404.

95. Liebman S.W., Derkatch I.L. The yeast PSI*. prion: making sense of nonsense //J.Biol.Chem. 1999. - V.274. - P. 1181-1184.

96. Liebman S.W., Sherman F. Extrachromosomal PST. determinant suppresses nonsense mutations in yeast // J.Bacteriol. 1979. - V.139. - P.1068-1071.

97. Liu J J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast//Nature. 1999. - V.400. - P.573-576.

98. Loovers H.M., Guinan E., Jones G.W. Importance of the Hsp70 ATPase domain in yeast prion propagation // Genetics. 2007. - V. 175. - P.621-30.

99. Lund P.M., Cox B.S. Reversion analysis of ps/-. mutations in Saccharomyces cerevisiae II Genet Res. 1981. - V.37(2). — P. 173-82.

100. Lykke-Andersen J., Shu M.D., Steitz J.A. Human Upf proteins target an mRNA for nonsense-medicated decay when bound downstream of a termination codon// Cell.-2000. V.103.-P.1121-1131.

101. Maddelein M.L., Wickner R.B. Two prion-inducing regions of Ure2p are nonoverlapping // Mol.Cell Biol. 1999. - V.19. - P.4516-4524.

102. Marion R.M., Regev A., Segal E., Barash Y., Koller D., Friedman N., O'Shea E.K. Sfpl is a stress- and nutrient-sensitive regulator of ribosomal protein gene expression // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. - V. 101. - P. 14315-14322.

103. Masel J. Cryptic genetic variation is enriched for potential adaptations // Genetics. -2006. V.172. - P. 1985-1991.

104. Masison D.C., Kirkland P. A., Sharma D. Influence of Hsp70s and their regulators on yeast prion propagation // Prion. — 2009. — V.3:2. P.65-73.

105. Masison D.C., Maddelein M.L., Wickner R.B. The prion model for URE3. of yeast: spontaneous generation and requirements for propagation // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.12503-12508.

106. Masison D.C., Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells // Science. 1995. -V.270. - P.93-95.

107. McReady S.J., McLaughlin C.S. A comparison of small circular DNA molecules in PST*. and [psf] strains of Saccharomyces cerevisiae II Biochim.Biophys.Acta. 1977. - V.479. - P. 119-121.

108. McReady S.J., Cox B.S. Antisuppressors in yeast // Mol.Gen.Genet. -1973. V.124. — P.305-320.

109. Michelitsch M.D., Weissman J.S. A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. - V. 97. - P. 11910-11915.

110. Miller E.M., Nickoloff J.A. Escherichia coli electrotransformation // Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ. 1995. -105 p.

111. Moore S.A. Kinetic evidence for a critical rate of protein synthesis in the Saccharomyces cerevisiae yeast cell cycle // J Biol Chem. 1988. V.263(20). -P.9674-81.

112. Moriyama H., Edskes H.K., Wickner R.B. URE3~\ prion propagation in Saccharomyces cerevisiae: requirement for chaperone Hspl04 and curing by overexpressed chaperone Ydjlp II Mol. Cell Biol. 2000. - V.20 (23). - P.8916-8922.

113. Nakayashiki T., Ebihara K., Bannai H., Nakamura Y. Yeast PS/. "prions" that are crosstransmissible and susceptible beyond a species barrier through a quasi-prion state // Mol. Cell. 2001. - V.7. - P.l 121-1130.

114. Nakayashiki T., Kurtzman C.P., Edskes H.K., Wickner R.B. Yeast prions URE3. and [PSf] are diseases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. -V.102. - P.10575-80.

115. Namy O., Galopier A., Martini C., Matsufuji S., Fabret C., Rousset J.P. Epigenetic control of polyamines by the prion PSf. II Nat. Cell Biol. 2008. -V.10. -P.1069- 1075.

116. Naumov G.I., Masneuf I., Naumova E.S., Aigle M., Dubourdieu D. Association of Saccharomyces bayanus var. uvarum with some French wines: genetic analysis of yeast populations // Res. Microbiol. 2000. - V.151. - P683-691.

117. Neigeborn, L. and Carlson, M. Genes affecting the regulation of SUC2 gene expression by glucose repression in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. — 1984.-V.108.-P. 845-858.

118. Nemecek J., Nakayashiki T., Wickner R.B. A prion of yeast metacaspase homolog (Mcalp) detected by a genetic screen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. V. 106(6). - P. 1892-6.

119. Ness F., Ferreira P., Cox B., Tuite M. Guanidine hydrochloride inhibits the generation of prion "seeds" but not prion aggregation in yeast. //Mol. Cell Biol. 2002. - V.22. - P.5593-5605.

120. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing II Mol. Cell Biol. 1999. - V.19(2). - P.1325-33.

121. Ohba M. Modulation of intracellular protein degradation by SSB1-SIS1 chaperon system in yeast S. cerevisiae II FEBS Lett. 1997. - V.409. - P. 307-311.

122. Osherovich L.Z., Cox B.S., Tuite M.F., Weissman J.S. Dissection and design of yeast prions // PLos Biol. 2004. - V.2 (4). - E86.

123. Osherovich L.Z., Weissman J.S. Multiple Gln/Asn-rich prion domains confer susceptibility to induction of the yeast PS/*. prion // Cell.-2001.-V.106.-P.183-194.

124. Parsell D.A., Kowal A.S., Singer M.A., Lindquist S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04 // Nature. 1994. - V.372 (6505). - P.475-478.

125. Patel B.K., Gavin-Smyth J., Liebman S.W. The yeast global transcriptional co-repressor protein Cyc8 can propagate as a prion // Nat. Cell Biol.- 2009.-V.l 1(3).-P.344-9.

126. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. - V.273.- P.622-626.

127. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smimov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science. -1997. V.277. - P.381-383.

128. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like PSI*~. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor // EMBO J. 1996. - V.15. - P.3127-3134.

129. Perrett S., Jones G.W. Insights into the mechanism of prion propagation // Curr. Opin. Struct. Biol. 2008. - V. 18(1). - P.52-9.

130. Prusiner, S. B. Molecular biology of prion diseases // Science. 1991. -V.252.-P. 1515-1522.

131. Prusiner S.B. Inherited prion diseases // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 1994.-V. 91.-P. 4611-4614.

132. Prusiner S.B. Molecular biology and pathogenesis of prion diseases // Trends.Biochem.Sci. 1996. - V.21. - P.482-487.

133. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie // Science. 1982. - V.216. - P.136-144.

134. Prusiner S.B., Groth D.F., Bolton D.C., Kent S.B., Hood L.E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein // Cell. 1984. -V.38. - P.127-134.

135. Prusiner S.B., McKinley M.P., Bowman K.A., Bolton D.C., Bendheim P.E., Groth D.F., Glenner G.G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods // Cell. 1983. - V. 35(2 Pt 1). - P.349-58.

136. Prusiner S.B., Scott M.R., DeArmond S.J., Cohen F.E. Prion protein biology // Cell. 1998. - V. 93. - P. 337-348.

137. Resende C.G., Outeiro T.F., Sands L., Lindquist S., Tuite M.F. Prion protein gene polymorphisms in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. — 2003. V.49. -P.1005-17.

138. Ripaud L., Maillet L., Cullin C. The mechanisms of URE3. prion elimination demonstrate that large aggregates of Ure2p are dead-end products // EMBO J.-2003.-V.22 (19).-P.52551-9.

139. Roberts B.T., Moriyama H., Wickner R.B. URE3. prion propagation is abolished by a mutation of the primary cytosolic Hsp70 of budding yeast // Yeast. 2004. - V.21 (2). P. 107-117.

140. Safar J., Wille H., Itri V., Groth D., Serban H., Torchia M., Cohen F.E., Prusiner S.B. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations IINat. Med. 1998. - V.4(10). - P.l 157-1165.

141. Sadlish H., Rampelt H., Shorter J., Wegrzyn R.D., Andre'asson C., Lindquist S., Bukau B. HspllO Chaperones Regulate Prion Formation and Propagation in S. cerevisiae by Two Discrete Activities // PLoS ONE. 2008. -V.3(3). — P.el763-9.

142. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. -723 p.

143. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier // Cell. 2000. - V.100. - P.277-288.

144. Schwimmer C., Masison D. Antagonistic Interaction between yeast PSf. and [URE3] Prions and Curing of [URE3] by Hsp70 protein Chaperone Ssalp but not Ssa2p // Mol. Cell. Biol. 2002. - V.22 - P.3590-3598.

145. Sharma D. and Masison D.C. Hsp70 Structure, Function, Regulation and Influence on Yeast Prions // Protein Pept Lett. 2009. - V. 16(6). - P.571-581.

146. Sherman F., Fink G.R., Hincks J.B. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. 367 p.

147. Shkundina I.S., Ter-Avanesyan M.D. Prions // Biochemistry (Mosc). -2007.-72(13).-P.1519-36.

148. Shlumpberger M., Prusiner S. B., Herskowitz I. Induction of distinct URE3. yeast prion strains II Mol. Cell Biol. 2001. - V.20. - P.7035-7046.

149. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1989.-V. 122(1).-P.19-27.

150. Singh J., Tyers M. A Rab escort protein integrates the secretion system with TOR signaling and ribosome biogenesis // Genes Dev. 2009. -V.23(16).-P. 1944-58.

151. Sondheimer N., Lindquist S. Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast// Mol.Cell 2000. - V.5. - P. 163-172.

152. Song Y., Wu Y.X., Jung G., Tutar Y., Eisenberg E., Greene L.E., Masison D.C. Role for Hsp70 chaperone in Saccharomyces cerevisiae prion seed replication II Eukaryot. Cell. 2005. -V.4. - P.289.

153. Storici F., Lewis L.K., Resnick M.A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides //Nat. Biotechnol. 2001. - V.19(8). - P.773-6.

154. Summers D.WDouglas P.M., Ren H.Y., Cyr D.M. The type I Hsp40 Ydjl utilizes a farnesyl moiety and zinc finger-like region to suppress prion toxicity// J. Biol. Chem. 2009. - V.284(6). - P.3628-39.

155. Talarek N., Maillet L., Cullin C., Aigle M. The URE3. prion is not conserved among Saccharomyces species // Genetics. 2005. -V.171. - P.23-34.

156. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p // Science. 1999. - V.283. - P.1339-1343.

157. Thual C., Komar A.A., Bousset L., Fernandez-Bellot E., Cullin C., Melki R. Structural characterization of Saccharomyces cerevisiae prion-like protein Ure2 // J.Biol.Chem. 1999. - V.274. - P.13666-13674.

158. True H.L., Berlin I., Lindquist S.L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits // Nature. -2004. V.431. - P. 184-187.

159. True H.L., Lindquist S.L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity // Nature. 2000. - V.407. - P.477-483.

160. Tuite M.F., Cox B.S. Propagation of yeast prions // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. - V.4(l 1). - P.878-90.

161. Tuite M.F., Lund P.M., Futcher A.B., Dobson M.J., Cox B.S., McLaughlin C.S. Relationship of the PST^. factor with other plasmids of Saccharomyces cerevisiae // Plasmid. 1982.-V. 8.-P.103-111.

162. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from PST^. to \psi] in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. -1981.-V. 98. -P. 691-711.

163. Urakov V.N., Vishnevskaya A.B., Alexandrov I.M., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Interdependence of amyloid formation in yeast: implications for polyglutamine disorders and biological functions // Prion. -2010. V.4(l). -P.45-52.

164. Volkov K., Osipov K., Valouev I., Inge-Vechtomov S., Mironova L. N-terminal extension of Saccharomyces cerevisiae translation termination factor eRF3 influences the suppression efficiency of sup35 mutations // FEMS Yeast Res.2007. 7(3):357-65.

165. Wang W., Cajigas I.J., Peltz S.W., Wilkinson M.F., González C.I. Role for Upf2p phosphorylation in Saccharomyces cerevisiae nonsense-mediated mRNA decay // Mol. Cell. Biol. 2006. - V.26(9). - P.3390-400.

166. Wang W., Czaplinski K., Rao Y., Peltz S.W. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts // EMBO J. 2001. - V.20(4). - P.880-90.

167. Weng, Y., K. Czaplinski, and S. W. Peltz. Genetic and biochemical characterization of mutations in the ATPase and helicase regions of the Upfl protein//Mol.Cell.Biol. -1996.-V.16. P. 5477-5490.

168. Wickner R.B. URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae II Science. 1994. - V.264. - P.566-569.

169. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K. PSf. and [URE3] as yeast prions // Yeast. 1995. - V.l 1:16. - P. 1671-85.

170. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K., Maddelein M.L. Prions of yeast, PS/1". and [URE3], as models for neurodegenerative diseases // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 1996. - V.61. - P.541-550.

171. Wickner R.B., Taylor K.L., Edskes H.K., Maddelein M.L., Moriyama H., Roberts B.T. Yeast prions act as genes composed of self-propagating protein amyloids // Adv Protein Chem. 2001.- V.57. - P.313-334.

172. Wittung-Stafshede P., Guidry J., Home B.E., Landry S.J. The J-domain of Hsp40 couples ATP hydrolysis to substrate capture in Hsp70 // Biochemistry. 2003. -V. 42. -P.4937-44.

173. Wu Y.X., Greene L.E., Masison D.C., Eisenberg E. Curing of yeast PSP~\ prion by guanidine inactivation of Hspl04 does not require cell division // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V.l02(36) - P.12789-12794.

174. Xu Z., Norris D. The SFP1 gene product of Saccharomyces cerevisiae regulates G2/M transitions during the mitotic cell cycle and DNA-damage response // Genetics. 1998. - V.l50(4). -P. 1419-28.

175. Xue W.F., Homans S.W., Radford S.E. Systematic analysis of nucleation-dependent polymerization reveals new insights into the mechanism ofamyloid self-assembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. - V.105(26). -P.8926-8931.

176. Young J.C., Agashe V.R., Siegers K., Hartl F.U. Pathways of chaperone-mediated protein folding in the cytosol // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2004. — V.5. P.781-91.

177. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a supersuppression system of yeast. II. Relations with other extrachromosomal elements // Heredity. 1972. - V.28. - P.189-199.

178. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a supersuppression system of yeast. I. A nuclear genes controlling the inheritance of extrachromosomal elements // Heredity. 1971. - V.26. - P.413-422.

179. Zhang Z.R., Perrett S. Novel glutaredoxin activity of the yeast prion protein Ure2 reveals a native-like dimer within fibrils // J. Biol. Chem. 2009. -V.284(21). - P.14058-67.

180. Zhouravleva G., Alenin V., Inge-Vechtomov S., Chemoff Y. To stick or not to stick: Prion domains from yeast to mammals // In: Pandalai SG, ed. Recent Res. Devel. Mol. Cell Biol. 2002. - V.3. - P. 185-218.1. БЛАГОДАРНОСТИ

181. Автору хотелось бы поблагодарить своих научных руководителей: Людмилу Николаевну Миронову, Кирилла Владимировича Волкова А также:

Информация о работе

Рогоза, Татьяна Михайловна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы