Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск и структурно-функциональные особенности генов, участвующих в процессе опухолеобразования у человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Поиск и структурно-функциональные особенности генов, участвующих в процессе опухолеобразования у человека"
\
О^^О^ На правахрукописи
БарановаАнна Вячеславовна
Поиск и структурно-функциональные особенности генов, участвующих в процессе опухолеобразования
у человека
Специальность - 03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2004
Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор биологических наук, профессор
Янковский Николай Казимирович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук, академик РАН Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор
Шестаков Сергей Васильевич Киселев Федор Львович Миронов Андрей Александрович
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН
Защита состоится "_" июня 2004 г. в_на заседании
диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И, Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095)132-89-62
С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Автореферат разослан "_"_2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат биологических наук Г.Н. Полухина
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
В настоящее время онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности в развитых странах. Эти заболевания представляют собой большую проблему как медицинского, так и социального характера. Поэтому исследования в области онкологии представляют собой громадный пласт медико-биологических исследований. Получение новой информации о нарушениях структур и функций при опухолеобразовании одновременно развивает наши представления о фундаментальной биологической проблеме границ нормы - нормы структуры и функции на молекулярно-генетическом, клеточном, тканевом и организменном уровне.
Первопричиной опухолеобразования является изменение структуры или регуляции генома соматических клеток и последующее изменение функционирования их генома. Структурно-функциональные исследования генома человека в последние годы перешли на качественно более высокий уровень в результате реализации программы «Геном человека». Созданы принципиально новые технологии- исследования геномов, которые, в сочетании с современными концепциями генетики, позволяют значительно углубить наше понимание молекулярно-генетических основ опухолеобразования, понять роль областей генома и генов человека критически важных для предотвращения образования опухолей. В результате таких фундаментальных исследований могут быть разработаны новые методы обнаружения онкопатологий, что особенно важно на начальных стадиях развития опухоли, когда еще возможно лечение без серьезного ущерба для организма. Поэтому исследования особенностей структуры и функционирования областей генома, часто повреждаемых при возникновении и развитии опухолей, высоко актуальны.
Цели исследования
Гены, контролирующие поддержание нормальной структуры и функции генома, клеточное деление и межклеточные взаимодействия необходимы, в частности, и для подавления развития опухолей. Поэтому такие гены были названы генами супрессорами опухолевого роста. Перестройки участков генома соматических человека могут приводить к утрате или к дефектам генов супрессоров опухолевого роста и возникновению соответсвующей патологии. Участок 13ql4 генома человека часто оказывается поврежденным при различных онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других.
ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА {
Основной целью диссертационной работы было структурно-функциональное исследование области 13ц14 генома человека и выявление связи этих особенностей с опухолеобразованием. Главный акцент был сделан на поиске и характеристике потенциальных генов супрессоров опухолей в этой области генома человека. Кроме того, исследовали также тонкую структуру и полиморфизм двух ранее известных генов хромосомы 13, вовлеченных в развитие опухолей.
Другим феноменом, сопряженным с опухолеобразованием, является изменение пормалыюго уровня экспрессии генов, структура которых может оставаться при этом неизменой. Целью диссертационной работы в данном направлении являлось выявление генов человека, маркирующих процесс опухолеобразования изменением уровня своей экспрессии.
Задачи исследования.
1) Выявление у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ) перестроек хромосомы 13. в области 1 Зс|14; физическое картирование границ выявленных перестроек хромосомы; выявление минимального общего района, повреждаемого у пациентов В-ХЛЛ
2) Установление последовательности нуклеотидов между маркерами 0138810 - 01381469 области 13ql4; биоинформатический анализ данной последовательности нуклеотидов; выявление и исследование распределения в этой области повторов всех известных для человека типов; предсказание и эксперименталная проверка наличия в этой области транскрибируемых участков (генов), интрон-экзогаюй структуры этих транскриптов (в том числе альтернативно сплайсируемых форм), характеристика регуляторных участков и белок-кодирующих областей выявленных генов.
3) Предсказание возможных функций продуктов выявленных генов путем биоинформатического поиска генов паралогов с ранее установленной функцией, а также паралогов для отдельных предсказанных доменов в белках, кодируемых выявленными генами.
4) Экспериментальное и биоинформатическое иследование областей генома мыши, синтенных области 13(]14 генома человека. Установление тонкой структуры и сравнительный анализ генов ортологов в исследуемых областях генома.
5) Установление интрон-экзонной структуры и характеристика полиморфизма двух генов хромосомы 13 человека (СКАР2 и Ш01), вовлеченных в развитие опухолей.
6) Биоинформатический поиск генов человека, маркирующих существование опухоли изменением уровня своей экспрессии. Анализ структуры этих генов и их возможной функции, в нормальпых и опухолевых тканях.
Научная новизна._
Построен космидный контиг размером 620 т.п.н., перекрывающий участок 13q14.3 генома. человека. Выявлен минимальный общий участок, утрачиваемый в составе указанной хромосомы у больных В-ХЛЛ. Впервые собрана референтная нуклеотидная последовательность между STS маркерами D13S810 и D13S1469 общей длиной около 2 млн.н.п., перекрывающая исследуемую область нестабильности хромосомы 13 у больных В-ХЛЛ. Впервые выявлены биоинформатически и подтверждены экспериментально транскрибирующиеся участки в составе исследованного 2 млн.п.н. участка хромосомы 13. В составе этого участка выявлен сегмент, в котором повышенна плотность Alu-повторов, особено наиболее молодого из известных подсемейств повторов этого типа, AluY. Впервые выдвинуто- предположение, что данная структурная особенность области 13ql4 (высокая концетрация Alu повторов, особенно повторов AluY) может являться причиной повышенной нестабильности данного района, возникающей в результате неравпого кроссинговера и приводящей к перестройкам при ряде опухолевых заболеваний человека.
Впервые методами компьютерного анализа проведена характеристика структуры и функции генов, картированных в составе фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами D13S810 и D13S1469. Проведено, сравнительное исследование участков генома мыши, синтенных району генома человека, и выявлены наиболее
вероятные кандидаты на роль генов супрессоров опухолеобразования. Впервые экспериментально описаны изоформы мРНК генов человека DLEU1, DLEU2, RFP2, RFP2OS, KCNRG, C13ORF1 и установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Функциональная характеристика этих генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в. развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка RFP2 выявлены десять потенциальных партнеров по взаимодействию. Впервые описана экзон-интронная структура и изоформы мРНК генов ING1 и СКАР2 вовлеченных в процесс опухолеобразования. Создана программа HSAnalyst, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов и выявить гены человека, маркирующие своей повышенной экспрессией опухолевые ткани.
Практическая значимость работы. В области 13q14 картированы рекомбинантные космиды, которые используются в клинической цитогенетике на ДНК пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек в этой области генома человека. Полученные данные о тонкой структуре генов ЯЕР2, ЯЕР205, КСЫЯО, С130ЯЕ1, ШС1 и СКАР2 позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с перестройками хромосомы 13. Найден ряд генов человека, повышенная экспрессия которых маркирует процесс образования и/или прогрессии опухоли. В результате создана панель новых потенциальных маркеров опухолей человека, тестрование которых доступно на основе единого, чувствительного, быстрого и дешевого метода ПЦР, что имеет большое значение, как для научных исследований, так и для диагностики опухолей в клинике. Основные положения выносимые на защиту;
1. Выявлен минимальный общий участок, утрачиваемый в составе хромосомы 13 у больных В-ХЛЛ, и построен космидный контиг размером 620 т.п.н., перекрывающий участок указанный участок.
2. Впервые собрана референтная нуклеотидная последовательность между STS маркерами 0138810 и Б1381469 общей длиной около 2 млн.н.п., перекрывающая исследуемую область 13 у больных В-ХЛЛ.
3. Впервые выявлены биоинформатически и подтверждены экспериментально транскрибирующиеся участки в составе исследованного 2 млн.п.н. участка хромосомы 13.
3. Повышенная плотность А1и-повторов может являться причиной нестабильности района 13q14.3, приводящей к перестройкам при ряде опухолевых заболеваний человека.
4. Впервые методами компьютерного анализа и сравнительной геномики построена транскрипционная карта фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами 0138810 и 0138Н69.
5. Впервые экспериментально описаны изоформы мРНК и проведена первичная функциональная характеристика генов человека БЬЕШ, БЬЕШ, ЯГР2, ЯГР208, КСШО, С130ЯП и установлен
профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов.
6. Впервые описана экзои-интронная структура и изоформы мРНК генов N01 и СКАР2 вовлеченных в процесс опухолеобразования.
7. Создана программа ЖЛпа^!, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов и выявить гены человека, маркирующие своей повышенной экспрессией опухолевые ткани.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были апробированы на межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен РАН им. Н.И.Вавилова (2001 и 2004 гг.), а также в виде 5 устных докладов и более 80 стендовых сообщений, представленных на 13 конференциях (5 всероссийских, 8 международных). В том числе: на годовых итоговых конференциях ФЦНТП «Геном человека» 1998, 1999 и 2000 гг.; II (IV) российском съезде медицинских генетиков, Курск, 17-19 мая, 2000 г.; на 2-м Съезде Московского Общества Генетиков «Современные Проблемы Генетики», 14-19 февраля 2003 года; на ежегодных съездах Human Genome Organization (HUGO) в 1999, 2000, 2001, 2002 и 2003 гг.; на Летней Исследовательской Конференции FASEB "Hematological malignancies- 2003" (Вермонт, США), на съезде RECOMB2002, 18-21 (Rockwill, Maryland, USA), на 52-ом ежегодном съезде Американского Общества Генетиков Человека (American Society of Human Genetics) в Балтиморе, США.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, методические разработки вошли в учебник «Методы вирусологии», издательство МГУ, 2002.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов с обсуждениями, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Пояснения к выбору стратегий поиска генов, принимающих участие в процессе образования опухолей у человека.
Данная работа по поиску генов-супрессоров опухолевого роста, начатая до появления сиквенса всего генома человека, была построена в соответствии с принципами "обратной генетики". Вначале приблизительно определяли местоположение искомого гена в геноме, к какой хромосоме и какому хромосомному району он принадлежит. Затем исследовали большие выборки пациентов, отыскивая случаи с наименьшим утраченным районом. После этого строили подробную транскрипционную карту повреждаемого участка ДНК, стараясь нанести на нее все гены, расположенные в интересующей области. В идеале размер минимального участка перекрывания делеций должен быть сокращен до среднего размера гена на хромосоме человека, то есть до 30 т.п.н. Это позволяет избавиться от стадии собственно транскрипционного картирования и перейти к определению функции гена-кандидата. На практике удается сократить размер минимальной общей утрачиваемой области генома лишь до участка размером 0.3 - 1 млн.н.п., способного вместить десятки генов-кандидатов. Затем проводили выявление и анализ генов-кандидатов, расположенных в минимальной утрачиваемой области: определяли открытые рамки считывания, экзон-интронную структуру, возможные альтернативные формы сплайсинга. После этого проводили проверку опухолевого материала на наличие внутригенных мутаций, повреждающих один и тот же ген в клетках независимо возникших однотипных опухолей.
Данная стратегия была использована нами в процессе поиска гена-супрессора опухолевого роста, расположенного в районе 13q14.3. Результаты применения данной стратегии для исследования района 13q14.3 описаны в разделе 3.2. Кроме того, мы использовали элементы данной стратегии для описания структуры известного ранее гена-супрессора опухолевого роста ING1 и картирования гена СКАР2, также вовлеченного в процесс образования опухолей. Результаты этих работ описаны в разделах 3.3 и 3.4.
С другой стороны, гены, вовлечение в процессы опухолевого роста могут быть обнаружены и без «привязки» к конкретному хромосомному локусу или конкретному онкологическому заболеванию. Одним из наиболее распространенных методов, основанных на данной стратегии, является дифференциальпый дисплей - сравнение спектров экспрессии генов в опухолевых и контрольных
образцах. Однако, экспериментальные методы дифференциального дисплея либо достаточно дороги (SAGE или экспрессионные микрочипы), либо настолько трудоемки, что не позволяют достичь автоматизации, необходимой для обработки сотен образцов (вычитательная гибридизация и RDA). Одним из самых эффективных и удобных методов поиска опухолеспецифичных генов по нашему мнению является метод «компьютерного дифференциального дисплея» (КДД). Результаты применения КДД для поиска генов, дифференциально экспрессирующихся в опухолях человека, причем отсутсвующих, или практически отсутствующих в его нормальных тканях, описаны в разделе 3.5.
2. Поиск гена-супрессора. опухолевого роста, расположенного в районе 13ql4.3.
Поиск гена-супрессора опухолевого роста, расположенного в районе 13ql4.3 был предпринят в соответствии с принципами «обратной генетики». При этом был пройден путь от определния приблизительного местоположения искомого гена в геноме до подробной транскрипционной карты повреждаемого участка ДНК, с последующим функциональным анализом кандидатных генов.
2.1. Поиск минимального участка, хромосомы 13, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ.
В 1995 году в рамках сотрудничества между Институтом Общей Генетики им. Н.И.Вавилова РАН и Каролинским Институтом (Стокгольм, Швеция) были начаты поиски области перекрывания делеций в ДНК пациентов с В-ХЛЛ, проходивших лечение в Каролинском Госпитале. В качестве основного метода исследования была выбрана гибридизация геномной ДНК пациентов по Саузерну. Для этого геномную ДНК из отсортированных В-клеток пациентов подвергали расщеплению эндонуклеазами EcoRl или Hindlll, образовавшиеся фрагменты разделяли в агарозных гелях и переносили на нейлоновые мембраны, а затем гибридизовали с радиоактивно мечеными пробами, равномерно расположенными вдоль области хромосомы 13, утрачиваемой у пациентов. Наличие, ослабление или отсутствие гибридизационного сигнала говорило о количестве копий исследуемого фрагмента в опухолевой ДНК (два, один или ноль). Главное преимущество метода гибридизации по Саузерну по сравнению с FISH и LOH это возможность непосредственного обнаружения границы дслеции в случае, если гибридизационная проба находится в пределах того же рестрикционного фрагмента, что и точка
разрыва ДНК. При этом появляется рестрикционный фрагмент, несовпадающий по размеру с фрагментом, присутствующим в ДНК из нормальной ткани того же пациента. Такие перестроенные фрагменты, ограничивающие минимальную общую утрачиваемую область, были выявлены у трех из 206 исследованных пациентов с В-ХЛЛ. Размер минимальной общей утрачиваемой области составил 10 т.п.н. При этом 95 из 206 (46%) исследованных образцов опухолевой ДНК содержали делеции, перекрывающие минимальный общий утрачиваемый участок: 28 образцов ДНК содержали гомозиготные делеции, 67 образцов -делеции в одной из хромосом.
2.2. Первичная характеристика генов DLEU1 и DLEU2, расположенных в составе минимального утрачиваемого участка хромосомы 13
Участок хромосомы 13 перекрываемый минимальной. общей утрачиваемой областью размеров 10 т.п.н., был полностью секвенирован в ходе даной работы и сопоставлен с экспрессирующимися последовательностями (EST), содержащимися в общедоступной базе данных GenBank. Это позволило обнаружить в составе минимальной общей утрачиваемой области первые экзоны друх генов, названных нами DLEU2 и DLEUJ, а также разделяющий их участок, тогда как большая часть нитронов. и концевые экзоны указанных генов находятся за пределами утрачиваемой области. Эти гены были впервые описаны в ходе данной работы, и их названия зарегистированы нами в Комитете по Номенклатуре HUGO.
В дальнейшем была исследована интрон-экзонная структура этих генов, изоформы их МРНК и спектры экспрессии этих изоформ в нормальных и опухолевых тканях человека. Так, секвенирование кДНК, соответствующих генам <DLEU1 И DLEU2, а также участков геномной последовательности, соответствующих их экзонам позволило установить, что полные последовательности их мРНК составляют 980 т.н. и 1735 т.н., соответственно. Анализ указанных последовательностей с использованием программ BLAST и FASTA не выявил гомологии ни с одним из ранее опубликованных генов. Предполагаемым открытым рамкам считывания генов DLEU1 и DLEU2 соответствуют два белка, состоящие из 72 и 84 аминоксилотных остатков соответственно. Предсказанная молекулярная масса этих белков составляет 8 и 10 кДа соответственно. Промоторный регион, общий для обоих генов, не содержит канонического ТАТА-бокса, однако, содержит участки распознавания для транскрипционных факторов Spl, ETF, API, AP2, GCF, РЕАЗ и СР1. Расстояние между
стартами транскрипции составляет менее 300 иуклеотидных пар. Гены транскрибируются в противоположных направлениях.
Гомо- и гемизиготные делении, удаляющие разные участки генов DLEU1 и DLEU2 обнаружены у большинства больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом. Этот факт говорит в пользу того, хромосомный участок, перекрываемый генами DLEU1 и DLEU2, или последовательности, прилежащие к нему, содержат гены, обладающие функцией супрессоров опухолевого роста.
Методом SSCP исследована ДНК из опухолевых образцов от больных В-ХЛЛ из двух независимых выборок, у которых в одной из хромосом гомологов исследуемый участок был утрачен, а у другого гомолога - сохранен. Опухоль-специфические точковые мутации в генах DLEU1 и DLEU2 обнаружены не были.
Ввиду отсутствия очевидных открытых рамок считывания в составе генов DLEU1 и DLEU2, а также отсутствия мутаций этих генов в образцах В-ХЛЛ, на этом мы прекратили работу над функциональной характеристикой этих генов. В дальнейшем другими группами ученых было показано, что оба эти гена, подвергаются множественному альтернативному сплайсингу, но изоформы их РНК не кодируют белок [Rondeau G. et al., 2001; Migliazza A. Et al., 2001; Bullrich F. Et al, 2001]. Возможно, что множество изоформ РНК генов DLEU1 и DLEU2 необходимо для выполнения регуляторных функций и утрата этого региона в опухолевых клетках приводит к нарушению этих функций.
2.3. Построение космидного контига между STS-маркерами D13S1168 и D13S2S хромосомы 13 человека.
Параллельно с данной работой минимальные общие участки хромосомы 13, утрачиваемые у больных В-ХЛЛ, были описаны еще двуми разными группами исследователей и оказались расположешхыми в пределах района размером около 600 т.п.н., но не перекрывались друг с другом. Поэтому поиск гена супрессора был предпринят нами по всей длине области заявленной в работах всех трех групп. Для этого был построен космидный контиг, перекрывающий участок между STS-маркерами D13S1168 и D13S25 хромосомы 13 человека. Такой космидный контиг должен был предоставить материал для определения нуклеотидной последовательности указанного хромосомного участка, а его отдельные клоны - послужить пробами для последующего скрининга кДНК клонотек и цитогенетического клинического анализа на ДНК из опухолевых образцов пациентов.
В качестве исходного материала для построения космидного контига, перекрывающего район хромосомы 13, часто утрачиваемый у больных В-ХЛЛ, использовали космидные клоны, ранее приписанные к
STS-маркерам, расположенным в исследуемом участке хромосомы [Капанадзе, Б.И. и др., 1997]. Другим источником материала явилась подвыборка космид, созданная на основе YAC-клонов СЕРН 745еЗ и ICRF 61 cl, соответствующих району 13ql4.3.
На первом этапе построения космидного контига в качестве гибридизационных зондов использовали <фибопробы», получаемые от концов вставок ДНК. В качестве матрицы для транскрипции использовали как индивидуальные концы космидных клонов клонотеки LANL, содержащие промоторы ТЗ и Т7 (в дальнейшем ТЗ- и Т7-концы), так и смесь РНК-продуктов, полученных от обоих концов космидного клона. Для генерации космидного контига использованы рибопродукты 172 индивидуальных концов космидных клонов. В качестве гибридизационных матриц использовали набор нейлоновых фильтров, содержащих как ДНК космидной подвыборки, так и набор фильтров, соответствующих полной клонотеке LANL.
Полученные гибридизационные данные были объединены с результатами гибридизации. клонотеки LANL с олигонуклеотидными пробами, соответствующими известным STS и EST-маркерам, расположенным в районе построения контига. Космидный контиг, полученный в результате компьютерной обработки гибридизационных данных, перекрыл исследуемый район, однако содержал брешь между маркерами-D13S272 и AFM206xfl2. Для перекрывания бреши и верификации структуры контига использовали космидных клоны, полученные путем субклонирования YAC ICRF 61cl, ICRF 126а9, СЕРН 922а8 [Corcoran ct al., 1998]. Восемнадцать космидных клонов из этой регион-специфической клонотеки использовали для получения РНК-зондов и их последующей гибридизации с клонами LANL и ICRF.
Верифицированный непрерывный космидный контиг перекрывает участок хромосомы 13, ограниченный STS-маркерами D12S1168 и D13S25. Общая длина космидного контига составлила приблизительно 620 т.п.н. Данные этого раздела получены совместно с Б.И.Капанадзе, В.М.Бродянским и А.Б.Семовым (ИОГен РАН).
Возможность использования нескольких различных космидных клонотек создало определенные преимущества для изучения выбранного района хромосомы. Во-первых, введение дополнительного числа клонов увеличило репрезентативность. Во-вторых, были обнаружены вектор-специфичные различия по клонируемости и стабильности для определенных участков генома, перекрытых указанным контигом. Успешное перекрытые брешей и слабых участков стало возможным только в результате использования двух
дополнительных, независимо сконструированных, клонотек.
2.4. Составление транскрипционной карты участка между STS-маркерами D13S1168 и D13S25 хромосомы 13 человека.
Применяли два независимых подхода для поиска генов, расположенных внутри области размером 620 т.п.н., которая, по данным разных групп исследователей, часто утрачивается у больных В-ХЛЛ.
Первый из этих подходов сводился к гибридизационному скринингу клонотек кДНК, приготовленных на основе РНК мозга 24-недельного эмбриона человека и плаценты человека. В качестве проб для гибридизации использовали как продукты расщепления, так и нативную ДНК космид сба, с25а, cla, c32a, сЗОа, 71 all после блокирования повторяющейся ДНК, проводимого с помощью отжига с ДНК человека Cot-1, а также отдельные фрагменты ДНК космид, не содержащие повторяющихся участков ДНК по данным предварительной гибридизации этих космид с меченой ДНК человека. В результате, гибридизационного скрининга отобрали 7 индивидуальных рекомбинантных клонов, содержащих фрагменты экспрессирующихся последовательностей, расположенных в интересующем участке генома. Эти клоны соответствовали генам FAM10A4 и RFP2. Ген RFP2 был впервые описан в ходе указанной работы, и. его название зарегистировано нами в Комитете по Номенклатуре HUGO. Ген FAM10A4 был описан и зрегистрирован другой группой ученых, работавшей параллельно с нами [Sossey-Alaoui К. et al., 2002].
Другой из примененных подходов заключался в компьютерном анализе нуклеотидной последовательности участка ДНК, затрагиваемого делециями при В-ХЛЛ. Нуклеотидная последовательность участка ДНК размером 9.5 т.п.н. была определена в Отделении Онкологии и Патологии Каролинского Госпиталя (Стокгольм, Швеция) при нашем участии и хранится в базе данных GenBank под номером Y15381. Кроме того, во время выполнения данной работы общедоступные базы данных постепенно пополнялись последовательностями из интересовавшего нас района, опредленными другими группами ученых. В результате постоянного слежения за состоянием баз данных за год до выхода в свет полной последовательности генома человека нам удалось собрать полную последовательность участка между STS-маркерами D13S1168 и D13S25 хромосомы 13 человека. Отдельные бреши в составе такого «контига последовательностей» были перекрыты нами с помощью секвенирования концов и отдельных фрагментов космидных клонов, имевшихся в нашем распоряжении в результате построения космидного контига, описанного выше. Общая длина проанализированной
«результирующей» нуклеотидной последовательности составила 2 млн.н.п.
Полученная «результирующая» нуклеотидная последовательность была использована для анализа базы данных dbEST посредством ее выравнивания против всех последовательностей, содержащихся в базе данных dbEST, что позволило выявить все экспрессирующиеся участки генома (EST), находящиеся в анализируемом районе. Часть выявленных последовательностей EST принадлежит к кластерам EST, сгруппированным в базе данных UniGene. Всего к исследованному нами району удалось приписать 62 кластера UniGene. Двенадцать из них относятся к уже известным генам, описанным выше - это кластеры Hs.279799, Hs.49927, Hs.298490, Ifc.3886, Hs.151428, Hs.192062, Hs.20149, Hs.248126, Hs.343817, Hs.343673, Hs.126590, Hs.58570. Еще четыре кластера соответствуют «мастер-генам» псевдогенов, картированных нами в составе исследуемого участка генома человека. Оставшиеся 46 кластеров EST принадлежали не описанным ранее генам. В данной рукописи мы рассмотрим лишь наиболее интересные из описанных нами генов, которые мы отобрали по принципу их относительно небольшой удаленности от минимального утрачиваемого участка, описанного в разделе 2.1. Описанию каждого из отобранных генов будет посвящен отдельный раздел.
2.5. Картирование повторяющихся последовательностей и анализ их распределения в составереферентной нуклеотидной последовательности.
С целью определения местоположения повторяющихся последовательностей, находящихся в составе референтной нуклеотидной последовательности, классификации этих повторов и анализа их распределения базовая нуклеотидная последовательность была проанализирована с помощью программы RepeatMasker.
Опираясь на проведенный анализ распределения повторов, исследованный район можно условно разделить на два участка, примерно соответствующих его центромерной (интервал D13S810 - D13S319) и теломерной (интервал D13S319 - D13S25) частям.
Для интервала DJ3S8I0 - D13S319 характерно наличие большого числа Alu-повторов. Так, например, в области маркера WI9598 длиной 200 т.п.н. находится 182 повтора этого типа, что составляет 28,37% от всей длины дапиой области. Следующий за ним в сторону теломеры хромосомный интервал D13SU68 - D13S810 также обогащен повторами семейства Alu, оба Alu-богатых интервала обогащены экспрессирующимися последовательностями описанными ниже.
Теломерная граница последнего из Alu-богатых интервалов расположена на расстоянии не более 180 т.п.н. от интервала GCT16C05 -
D13S25. Этот интервал экстремально-беден как Alu-повторами, так и транскрибирующимися участками. Только 4,1% общей длины последнего интервала соответствуют повторам Alu. Одновременно с этим обращает на себя внимание тот факт, что повторы типа LINE (L1 и L2) представлены и в Alu-бедных, так и в Alu-богатых интервалах примерно с одинаковой частотой.
С этой точки зрения весьма интересно, что исследуемый нами хромосомный район, расположенный между маркерами D13S1168 -D13S25 и характеризующийся резким переходом содержания Alu-повторов от высокой плотности к низкой в направлении от центромеры к теломере, расположен на границе цитогенетически различимых полос 13ql4.3 и 13q21.1. Примерно в том же хромосомном районе проходит граница перехода синтении хромосомы 13 человека с хромосомами 14 и 8 мыши (Sturm, Baker et al. 1994). Возможно, изменение плотности Alu-повторов отражает какое-то фундаментальное свойство указанного хромосомного района и как-то связано с его перестройкой при видообразовании.
Наблюдение о том, что центромерная часть исследованной нами нуклеотидной последовательности содержит избыток Alu-повторов может определять высокую частоту делений данного хромосомного участка как у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом, так и у пациентов с теми солидными опухолями, для которых также характерны делеции 13ql4.3.
Обращает на себя внимание очень высокая доля повторов подсемейства AluY в составе выявленных Alu-богатых интервалов исследуемого района. Так, интервал D13S1168 - D13S319 содержит 24 повтора типа Alu Y, которые составляют 5,08% от всей длины этой области, что на порядок чаще, чем в среднем по геному человека.
Подсемейство AluY представляют собой наиболее молодое, и, как следствие, наиболее консервативное по последовательности нуклеотидов Alu-подсемейство. Поскольку эти повторы лишь в незначительной степени отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности, они являются наиболее эффективными мишенями для ферментов, осуществляющих общую рекомбинацию.
Рекомбинация хромосом соматических клеток по практически идентичным AluY повторам, расположенным в негомологичных учасках будет приводить к появлению продуктов неравного кроссинговра в области 13ql4.3 и, следовательно, к утрате в одной из хромосом тех генов, которые расположены в геноме между прорекомбинировавшими AluY повторами. Среди них может быть и искомый ген-супрессор.
Наличие многих мишеней для неравного кроссинговера будет выражаться в гетерогенности перестроек, в том числе и в разных клетках одной опухоли. Феномен межклеточной гетерогенности перестроек характерен для клеток опухолей при В-ХЛЛ.
2.6. Получение клонов, содержащих участки геномной ДНКмыши,
соответствующие участку, утрачиваемому у больных В-ХПЛ.
Поскольку анализ генов и генных фргментов, расположенных в составе минимальной области, утрачиваемой у больных В-ХЛЛ не позволил однозначно выбрать кандидатный ген - онкосупрессор, пригодный для дальнейшего функционального анализа, мы предприняли сравнительный анализ исследуемого участка хромосомы 13 у человека и мыши.
Поиск клонов геномной ДНК мыши, соответствующих участку, утрачиваемому у больных В-ХЛЛ был проведен па материале геномной клонотеки мыши RPCI21, состоящей из 128000 клонов, представлишых на семи фильтрах высокой плотности размером 22.5 х 22.5 см каждый. Было проведено четыре последовательных эксперимента по гибридизации указанных фильтров с четырьмя радиоактивно-мечеными пробами, соответсвующим генам DLEU1, DLEU2, RFP2 и 9Е4.3. Первые три из указанных генов были описаны выше. Проба 9Е4.3 соответствовала расположенному несколько теломернее гена RFP2 CpG-островку человека, впервые описанному партнерской лабораторией в Королевском Госпитале в Борнмуте, Великобритания (Corcoran et al., 1998).
В результате трех гибридизационных скринингов с пробами DLEU2, RFP2 и 9Е4.3 были выявлены 22 РАС-клона, каждый из которых давал хотя бы один позитивный сигнал с этими пробами. Из этих 22 РАС-клонов были отобраны для дальнейшего анализа три клона, отвечающие наиболее выраженным сигналам и носящие номера 454-С18, 602-N13, и 588-К23. Эти клоны были получены из Британского Центра по Изучению Генома Человека (UK HGMP) в виде живых трансформированых клеток E.coli, которые были затем наращены в жидкой LB-среде. Данпые Саузерн-гибидизации ДНК этих клонов, переваренной с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, BamHl и Hindlll свидетельствовали о том, что все три РАС-клона соответствуют нативной структуре исследуемого участка геномной ДНК мыши, поскольку все информативные пробы идентифицировали идентичные рестрикционные фрагменты.
Гибридизация тех же самых фильтров высокой плотности с радиактивно-меченой пробой DLEU1 не привела к обнаружению позитивных гибридизационных сигналов, даже при значительном снижении температуры гибридизационного раствора. Несмотря на то, что ген DLEU1 у человека расположен между геном RFP2 и фрагментом, соответствующим пробе 9Е4.3, DLEUl-позитивные сигналы не были обнаружены и при Саузерн-гибридизации продуктов
расщепления РАС-клонов 454-С18, 602-N13, 588-К23 и геномной ДНК мыши, которые содержали обе фланкирующие последовательности. Таким образом, и при полногеномном гибридизационном поиске фрагмента генома мыши, соответствующего гену DLEUJ, и при его поиске в составе конкретных РАС-клонов, перекрывающих участок его наиболее вероятной локализации были получены негативные результаты. Это позволило предположить, что в геноме мыши либо отсутствует ортолог гена DLEU1, либо эта ортологичная последовательность так сильно изменилась в процессе эволюции, что не может быть более выявлена путем гибридизации нуклеиновых кислот. Данный вывод подтвержают эксперименты по Норзерн-гибридизации пробы, соответствующей гену DLEU1 человека с мРНК из различных тканей мыши, которые также не привели к выявлению ортологичных экспрессирующихся последовательностей. Указанные эксперименты были проведены вместе с к.б.н. Макеевой Н.В. (ИОГен РАН). Данная работа была начата и завершена до выхода в свет полных последовательностей генома человека и мыши.
С помощью гибридизации флуоресцентно-меченой пробы, соответствующей РАС-клону 602-N13 in situ с препаратом клеток мыши, находящихся на стадии метафазы (FISH-гибридизации) данный клон был приписан к участку D1-3 14 хромосоме мыши, по литературным данным синтенному интересующему нас участку хромосомы 13 (эксперимент был проведен в Госпитале г.Худдинг, Швеция, автор эксперимента M.Heyman).
2.7. Сравнительный геномный анализ нуклеотидных последовательностей гомологичных, участков ДНК мыши и человека.
Поскольку данная работа была начата и завершена до выхода в свет полных последовательностей генома человека и мыши, первым подготовительным этапом, необходимым для начала сравнительного анализа участков синтенных хромосомы 13 человека и хромосомы 14 мыши явилось определение нуклеотидной последовательности изучаемого участка генома у мыши. Для этого было произведено субклонирование вставок клонов РАС 454-С18, 602-N13, и 588-К23 и создание субклонотеки на основе фрагментов вставок из этих РАС и вектора pUC18. Полученая субклонотека состояла из 280 индивидуальных клонов размером от 1 до 10 т.п.н. каждый, упорядоченых в составе 96-луночных планшетов. Данная клопотека была скринирована с пробами, соответствующими генам DLEU2, RFP2 и 9Е4.3, позитивные клоны были подвергнуты автоматическому секвенированию. Полное двунаправленое севенирование множества независимых ПЦР продуктов, полученными с различных праймеров,
расположеных как в составе вектора pUCl 8, так и внутри вставок ДШС в клонах 15, А10 и 5D7, позволило впервые определить нуклеотидную последовательность 8170 нуклеотидных пар геномной консенсусной нуклеотидиой последовательности мыши. Данная последовательнсть была помещена в общедоступную базу данных GenBank под номером AF302838. Геномные последовательности мыши, соответствующие кодирующему экзону гена RFP2 и CpG островку 9Е4.3 были помещена в общедоступную базу данных GenBank под номерами и АН010785 и AF302840. Длина помещенных последовательностей составила 2735 н.п. и 4532 н.п. соответственно. Расстояние между участками RFP2 и DLEU2 у мыши мы оценили как 40 т.п.н, а расстояние между участками DLEU2 и 9Е4.3 как 35 т.п.н. Эти расстояния оказались немного короче, чем соответствующие расстояния между гомологичными участками в геноме человека, приведенными у M.Corcoran (Corcoran etal., 1998).
Пары нуклеотидных последовательностей мыши и человека, соответствующие участкам DLEU2, RFP2 и 9Е4.3 были подвергнуты анализу с помощью программ семейства BLAST. В результате анализа были выявлены участки со значительным сходством человеческой последовательности и гомологичной ей последовательности мыши. Максимальная степень сходства последовательностей (95% идентичных нуклеотидных остатков) была показана для участка 9Е4.3, соответствующего одиночному CpG-островку, не связанному с известными генами человека. Гомологичный геномный участок мыши также охарактеризован как CpG островок (69% нуклеотидов G или С у мыши; 72% нуклеотидов G или С в гомологичном участке у человека). Исследованная нами нуклеотидная последовательность CpG островка 9Е4.3 мыши содержит участок совершенного сходства с экспрессирующейся последовательностью (EST) мыши AI047357, полученной на основе клона кДНК IMAGE: 1450753, принадлежащего клонотеке из печени мыши. Это наблюдение позволило нам высказать гипотезу о наличии ортологичной экспрессирующейся последовательности у человека. В дальнейшем наличие такой последовательности у человека было подтверждено экспериментально путем RT-PCR и RACE-PCR-экспериментов с праймерами, подобранными на основе геномной последовательности CpG-островка 9Е4.3 человека и EST, соответствующих клонам кДНК, полученным с мРНК лимфоцитов периферической крови человека и мыши (данные получены совместно с О. Sangfelt, Каролинский Госпиталь, Швеция и не приведены). Выравнивание геномных последовательностей, окружающих CpG-островок 9Е4.3 у человека и мыши, определенных нами последовательностей RT-PCR и RACE-PCR продуктов, а также последовательностей EST человека и мыши, соответствующих мРНК
гена DLEU2 позволило нам сделать вывод о том, что и у человека и у мыши CpG-островок 9Е4.3 содержит альтернативный промотор и альтернативный первый экзон гена DLEU2, получивший название 1В. С этого промотора и у мыши, и у человека затравляется синтез альтернативных IB-содержащих изоформ мРНК гена DLEU2, получивших общее название DLEU2B. Полная последовательность одной из этих изоформ мРНК помещена в общедоступную базу данных GenBank под номерами AF302840 для мРНК DLEU2B мыши (размещено нами) и AF380424 для мРНК DLEU2B человека (размещено M.Pekarsky). В соответствии со введенным названием мРНК DLEU2B, клонированные ранее изоформы мРНК гена человека DLEU2 получили общее название DLEU2A, а первый экзон, общий для всех этих изоформ - название 1 А.
Ген DLEU2 содержит ряд человек-специфических и мышь-специфических экзонов, причем у обоих видов ген DLEU2 подвергается множественному альтернативному сплайсингу. Разнообразие изоформ гена DLEU2 у человека и гена-ортолога DLEU2 у мыши отражает существование реальных изоформ этого гена у двух сравниваемых видов, но не все возможные комбинаторные варианты сочетанного включения/исключения альтернативных экзонов. Ни одна из описанных изоформ мРНК гена DLEU2 у человека не содержит протяженных открытых рамок считывания.
Выравнивание нуклеотидных последовательностей более центромерно расположенных участков ДНК, соответствующих кодирующей области гена RFP2 у человека и мыши, показало, что данный участок также является высоко консервативным (89% идентичных нуклеотидных позиций), что подтверждается наличием в базе данных dbEST множества EST мыши, соответствующих мышиному ортологу гена RFP2. Информация о полных нуклеотидных последовательностях соответствующего участка генома у человека и мыши позволила нам провести детальный сравнительный анализ этого локуса с помощью программы Alfresco.
Одним из наиболее интересных наблюдений является полное отсутствие в исследуемом участке генома мыши консервативных блоков, соответствующих первому экзону ранее описанного человеческого гена DLEU1, у человека отделенному от первого экзона гена DLEU2 всего лишь двумя сотнями нуклеотидных позиций, полностью перекрытых выраженным CpG островком.
2.8. Анализ генов RFP2, KCNRG, C130RF1 и FAM10A4 -потенциальных онкосупрессоров, обнаруженных в результате построения транскрипционной карты участка генома, утрачиваемого у больных В-ХЛЛ.
Как описано выше мы картировали ряд генов и псведогенов в составе реконструированной нами 2 млн.п.н. пуклеотидной последовательности в области 13ql4. Для дальнейшей работы мы выбрали четыре из найденных генов. Критериями отбора являлась близость гена к минимальному общему участку, утрачиваемому у больных В-ХЛЛ (см. раздел 2.1), а также наличие в исследуемом гене протяженной открытой рамки считывания.
2.8.1. Ген RFP2
Ген RFP2, кодирующий Ret finger-подобный белок, был впервые описан в рамках данной работы. Его название зарегистировано нами в Комитете по Номенклатуре HUGO. Ген RFP2 состоит из 3 экзонов. Ген RFP2 транскрибируется в направлении от центромеры к теломере. С помощью Нозерн-гибридизации показано наличие, по крайней мере, трех изоформ мРНК гена RFP2, размер которых составил 1,4 т.н., 2,4 т.н. и 7,5 т.н. Эти изоформы представленны практически во всех типах тканей человека, хотя и имеют в них разный уровень экспрессии. Все изоформы кодируют один и тот же белковый продукт размером 407 аминокислот. Данный белок содержит цинк-связывающий домен RING-типа способный к белок-белковому взаимодействию, «В-бокс»- домен, взаимодействующий с ДНК, и спиральпо-скрученый домен. Такое сочетание домепов называется Rfp-подобным трехчастным доменом, по названию белка Rip (Ret finger protein). Все ближайшие гомологи белка RFP2 вовлечены в процессы, связанные с клеточной дифференциацией, регуляцией раннего развития эмбриона, иммунный ответ, а также в неопластическую трансформацию клеток. Домен RTNG-типа обнаружен также в таких генах-супрессорах как BRCA1 и BRCA2. Многие белки, содержащие цинк-связывающий домен RING типа, являются Е2-зависимыми ЕЗ-убиквитин-лигазами. Мы предполагаем, что и белок RFP2 принимает участие в одном из этих процессов.
Для того, чтобы обнаружить партнеров белка RFP2 по взаимодействию была использована дрожжевая двухгибридная система MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 (Clontech, USA). В результате проведенного скрининга были исследованы белки из более чем 106 независимых клонов, из них 13 оказались положительными. Мы определили нуклеотидную последовательность 5'- и 3'-концов
вставки кДНК в этих 13 клонах. Было показано, что последовательность 5'- конца вставки содержит открытую рамку считывания в той же рамке, что и последовательность активизирующего домена белка Gal4. Как показал анализ базы данных GenBank, нуклеотидные последовательности вставок ДНК клонов соответствовали известным генам человека LRPAP1, PRKCSH, PMF1, MCF2L, VPS18, CAPNS1, RPLPJ и ССТ5, а также двум генам человека FLJ10719 и GC5309 с неизвестной функцией. Функциональная значимость взаимодействия белка RFP2 с указанными белками-партнерами требует дальнейшего изучения. Данная часть работы выполнена совместно с к.б.н. Д.В. Ивановым.
Интересно, что промоторная область гена RFP2 и область его первого экзона и интрона частично перекрываются с другим транскриптом, впервые описанным нами и названным RFP2OS. Эта последовательность была зарегистрирована нами в базе данных под номером AF529010. Транскрипт RFP2OS не содержит открытой рамки считывания. Транскрипт RFP2OS является эндогенным антисмысловым траснкриптом для гена RFP2. Поскольку взаимодействие между мРНК гена и его антисмысловой РНК приводит к образованию димеров, что препятствует прохождению трансляции, и способствует гидролизу дуплекса РНК клеточными рибонуклеазами, мы полагаем, что изоформа РНК гена RFP2OS может принимать участие в регуляции транскрипции и/или трансляции гена RFP2. Транскрипт RFP2OS обнаружен нами в тех же опухолевых клеточных лилиях, что и RFP2. Данная часть работы выполнена вместе с к.б.н. Тяжеловой Т.В.
2.8.2. Геи KCNRG
Ген KCNRG впервые описан в рамках данной работы. Его название зарегистировано нами в Комитете по Номенклатуре HUGO. Ген KCNRG располагается в З'-нетранслируемоЙ области гена RFP2. Ген KCNRG транскрибируется в направлении от центромеры к теломере. Расстояние от стоп кодона открытой рамки считывания гена RFP2 до возможной точки инициации транскрипции гена KCNRG составляет геномной последовательности около 2 т.п.н. Не исключено, что указагагые гены составляют единую транскрипционную единицу, поскольку одна из РНК изоформ, соответствующих локусу RFP2/K.CNRG включает в себя экзоны как одного, так и другого гена.
Предполагаемый белковый продукт гена KCNRG состоит из 272 аминокислотных остатков и содержит единственный домен Т1, который является доменом тетрамеризации, характерным для калиевых каналов, открывающихся в зависимости от разности потенциалов на
мембране клетки. Однако белок KCNRG не содержит трансмембранных доменов и является растворимым. Эти данные позволяют нам выдвинуть гипотезу, что белковый продукт гена KCNRG регулирует активность потенциал-зависимых калиевых каналов через процесс их сборки в октамеры. Для того чтобы проверить эту гипотезу, нами была создана конструкция pGFP-KCNRG на базе вектора pEGFP-Nl, кодирующего зеленый флюоресцентный белок. Данная часть работы была выполнена совместно с к.б.н. Д.В.Ивановым. Эта конструкция была передана нашим французским коллегам из лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France). Эта конструкция была использована, для того чтобы проверить возможное участие KCNRG в регуляции тока калия в клетке. На клеточной линии LNCaP (рак простаты) сотрудниками лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France) было показано, что гиперэкспрессиия белка KCNRG приводит к снижению тока калия. Этот результат свидетельствует о возможном участии белкового продукта гена KCNRG в регуляции калиевых каналов, по крайней мере, в клеточной линии LNCaP.
В последнее время появились работы, в которых показано, что активность калиевых каналов является одним из ключевых факторов определяющих переход клеток из фазы G1 клеточного цикла к митозу (Abdul M. and Hoosein N., 2002). В некоторых клеточных типах, усиление экспрессии генов калиевых каналов или понижение активности их белковых продуктов ассоциированы с делением этих клеток. Например, Скрима с соавторами (Skryma R.N. et al., 1997) показали, что клеточная линия LNCaP рака простаты активно пролиферирует при активации потенциал-зависимых калиевых каналов. Когда калиевые каналы блокированы, митогенная активность клеток оказывается подавленной. В частности, активность потенциал-зависимых калиевых каналов важна при пролиферации лимфоцитов (Chung I. et al., 1997; Chang M.C. et al., 2001; Levite M. et al., 2000.
Возможно, любой фактор, подавляющий активность калиевых каналов, может ослаблять митотическую активность некоторых типов клеток (лимфоцитов, клеток простаты). Если белок KCNRG также влияет на. митотическую активность, то его ген становится первостепенным кандидатом на роль гена супрессора опухолевого роста.
2.8.3. Геи C130RF1
Ген C130RF1 был впервые описан в рамках данной работы. Его название зарегистировано нами в Комитете по Номенклатуре HUGO. Последовательность мРНК предсказанного гена имеет длину 3054 и. и разбивается на 5 экзонов. Ген C13ORFJ транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Пятый экзон гена C13ORF1 содержит STS-маркер D13S1168. Гибридизация по Нозерну позволила выявить три изоформы мРНК гена C13ORF1 длиной 1.1 т.н., 1.5 т.н. и 3 т.н. Все три изоформы мРНК гена C13ORF1 содержат одну и ту же ОРС, которой соответствует предсказанная последовательность, состоящая из 196 аминокислотных остатков. Данная часть работы выполнена совместно с к.б.н. Тяжеловой Т.В.
Предполагаемый белковый продукт гена C13ORF1 содержит единственный домен SPRY, занимающий в его составе положение с аминокислотной позиции 84 по позицию 196. Функция этого домена не установлена, но в большинстве исследованных белков, содержащих этот домен, присутствуют и другие, более хорошо изученные домены. Так, чаще всего SPRY-домен ассоциирован с DEAD-доменом, цинк связывающими доменами ВВОХ и RING типа, PRY-доменом и ВВС-доменом. Многие гены, белковые продукты которых содержат домен SPRY, являются мембранными рецепторами. Самый известный из них и наиболее изученный — это рецептор рианодина RYR1 (MacLennan, Duff et al. 1990). Этот белок формирует мембранный канал, который высвобождает ионы кальция из саркоплазматического ретихулума клеток скелетных мышц. Белок C13ORF1 не содержит трансмембранных доменов и является растворимым.
Белок, содержащий только SPRY-домен, и не содержащий дополнительных аминокислотных мотивов, является уникальной моделью для исследования функции этого домена в клетках. Возможно, изучение данного гена позволит высказать предположения о функции SPRY-домена и в других белках.
2.8.3. Ген FAM10A
Ген FAM10A был впервые описан в ходе данной работы под названием псевдогена с неизвестным статусом экспрессии.
«Мастер-ген» ST13/HIP состоит из 12 экзонов и локализован на хромосоме 22 в области ql3.2. «Мастер-ген» ST13 кодирует белок, связывающий цитозольные шапероны HSP70 и HSP90 на промежуточной стадии агрегации их с рецепторами стероидов (Prapapanich, Chen et al. 1996). В составе хромосомы 13 последовательность фланкирована двумя тандемными
повторами, что указывает на ее происхождение в результате встраивания в хромосому кДНК, образовавшейся на основе мРНК «мастер-гена» ST13IHIP. В пользу данной гипотезы говорит также наличие короткой поли-А последовательности длиной 9 нуклеотидов, расположеной на расстоянии 35 п.н. после сайта полиаденелирования ААТААА в 3'-концевой области псевдогена \yST13.
С другой стороны, нуклеотидная последовательность псевдогена практически не отличается от исходной последовательности «мастер-гена» ST13/HIP - наблюдаемое различие составляет лишь 4%, или 18 из 1594 нуклеотидов. Перед началом 5'-концевого участка псевдогена расположен
«классический» ТАТА-box, способный обеспечивать транскрипцию данного гена. Открытая рамка считывания псевдогена не содержит стоп-кодонов и кодирует белковый продукт длиной 485 аминокислот, отличающийся от белкового продукта гена ST13IHIP только одной аминокислотной заменой. Можно ожидать, что мы имеем дело с транскрибируемым псевдогеном, способным производить мРНК, не подвергающуюся дальнейшему сплайсингу.
В этой связи интересно, что «мастер-ген» ST13IHIP способен подавлять деление опухолевых клеток карциномы кишечника. По локусу, содержащему «мастер-ген» ST13/HIP в образцах карцином молочной железы, яичников и толстой кишки часто наблюдается потеря гетерозиготности (Zhang, Cai et al. 1998). Другие авторы показали, что экспрессия «Мастер-гена» ST13/HIP понижена в тканевых образцах и клеточных линиях карциномы толстого кишечника (Cao, Cai et al. 1997). Возможно, что псевдоген ST13/FAM10A производит мРНК и белок, функционально эквивалентный белку ST13/HIP. Делеции района 13ql4.3, приводящие к утрате псевдогена могут приводить к снижению уровня
мРНК и белка ST13/HIP, и вызывать ослабление контроля за делением клетки. Данная часть работы выполнена совместно с к.б.н. Тяжеловой Т.В.
3. Структура гена-онкосупрессора JNG1 и описание его
ближайших гомологов
Ген человека ING1, принимающий участие в контроле деления клетки, был клонирован [Garkavtsev I., et al., 1996] с помощью стратегии, основанной на отборе фрагментов кДНК, вызывающих неоплатическую трансформацию. Этот ген кодирует ядерный белок с молекулярной массой 33 кД который взаимодействует с белком р53 и модулирует р53-зависимую активацию транскрипции [Garkavtsev I., et al., 1998]. При иммунопреципитации белки p33ING' и р53 могут быть осаждены в составе единого комплекса [Garkavtsev I., et al., 1998]. Содержание белка ING1 и соответствующей ему мРНК повышено в стареющих диплоидных фибробластах человека [Garkavtsev I. et al., 1997]. Белок p33ING1 способствует процессу клеточной смерти, причем его действие усиливает Мус-зависимый апоптоз [Helbing C.C. et al., 1997]. Выборочный анализ клеточных линий показал, что в нейробластомной линии SK-N-SH 3'-участок гена ING1 перестроен или содержит делеции [Garkavtsev I., et al., 1996]. Содержание белка рЗЗл01 снижено в культурах, полученных из злокачественных клеток от больных раком молочной железы [Garkavtsev I., et al., 1996]. Совокупность этих данных указывает на то, что ген ING1 может являться геном-супрессором опухолевого роста, утрата или инактивация которого приводит к образованию опухоли. Однако, до начала настоящей работы оставалось неясным, ассоциированы ли мутации гена ING1 с какими-либо конкретными типами опухолей. Основным препятствием для экспериментального подтверждения роли повреждений гена JNG1 в образовании опухолей у человека являлось на момент проведения дагаюй работы отсутствие информации о полной нуклеотидной последовательности генома человека и, в частности, о геномной организации гена ING1. Мы описали геномную структуру гена ING1 и две изоформы его
Ген ING1 локализован в теломерном районе хромосомы 13 (13q34) как по данным FISH-гибридизации [Garkavtsev I et al., 1997], так и с помощью ПЦР-скрининга панели радиационных гибридов Stanford G3 [Zeremski M et al.,1997]. С целью выявления рекомбинантных клонов, соответствующих геномному локусу ING1, мы провели гибридизационный скрининг хромосома 13-специфичной космидной клонотеки человека LANL, используя в качестве пробы кодирующую часть JNG1. Гибридизационный скрининг
позволил выявить 5 позитивных клонов: 80Н9, 147Е9, 24D9, 53A3 и 125Н5. В результате автоматизированного определения нуклеотидной последовательности участков космидных клонов 80Н9 и 125II5, содержащих геномный локус ING1, обнаружено, что ген ING1 устроен
относительно просто. З'-конец гена ING1 состоит из одного непрерывного экзона (далее - экзон 2) размером 1845 нуклеотидов. Кроме, 3'-концевого экзона, ген ING1 содержит 5'-концевой экзон 1а, отделенный от экзона 2 интроном размером 3.5 т.п.н. (по данным ПЦР-анализа космидных клонов 80Н9 и 147Е9) и альтернативный 5'-концевой экзон 1Ь. Экзоны 1а и 1Ь входят в состав двух отличающихся изоформ мРНК гена ING1.
Доказательства существования двух независимых изоформ мРНК ING1 были получены с помощью RT-ПЦР на суммарной РНК, выделенной из Т-клеточной лимфобастоидной линии MOLT и bcr/abl-позитивной линии К562, полученной из клеток больного хроническим миелобластным лейкозом. Для каждого из экзонов нами были подобраны специфичные ПЦР-праймеры: 5'- GTG AAC TAT GTG GAG GAC T-3\ inglaltback для экзона 1а, 5'- TAG CAG TAG CAG TGA ТСС C-3', inglintlc и 5' - GGG АТС ACT GCG ACT GCT A, inglintl для экзона lb, 5' - TGC TGA ТСС АСА GAC CAC TTT -3', inglb для экзона 2. Размеры полученных ПЦР-фрагментов совпали с ожидаемыми и составили 1,0 т.п.н. (изоформа мРНК ING1 1а, пара праймеров ingl altback\inglb) и 1.1 т.п.н. (изоформа мРНК ING1 lb, пара праймеров inglintlc\inglb). В суммарной мРНК из обеих иссследованных клеточных линий присутствуют обе изоформы мРНК INGL ПЦР-продукт пары праймеров ingaltback\inglintl не определялся ни в одной из клеточных линий, что указывает на независимость образования изоформ мРНК JNG1 1а и lb.
Полученные нами данные позволили другим исследователям приступить к скринингу мутаций в образцах опухолей человека, а также определению статуса метилирования этого гена в норме и опухоли. В частности, в четырех образцах карциномы пищевода, шести образцах шюскоклеточной карциномы с локализацией в области головы и шеи и в одном образце базалыю-клеточной карциномы были обнаружены мутации участка гена JNG1, кодирующего его PHD-домен [Gunduz M. et al., 2000; Chen В et al., 2003; Chen L et al., 2001].
Локус INGJ отличается необычно высоким содержанием нуклеотидов G и С. Каждому из трех экзонов ING1 сопутствует выраженный CpG-островок, содержащий множество участков, распознаваемых редкощепящими эндонуклеазами рестрикции. На расстоянии 152 п.н. от начала экзона 2 обнаружен простой пентануклеотидный повтор (TTGTG)g. На основе этого тандемного пентануклеотидного повтора нами был создан полиморфный внутригенный STR-маркер, зарегистрированный нами в базе данных EMBL под номером AJ277387. В популяции 119 неродственных представителей народов Волго-Уральского региона выявлено три
аллеля, содержащих семь, восемь и девять мономеров. Частоты этих аллелей составили 0.24,0.74, and 0.02, соответственно.
Достаточно высокий уровень гетерозиготности (0.45) по указанному STR-маркеру позволяет использовать его для определения частоты потерь локуса ING1 в ДНК из опухолей человека. Данный маркер был использован учеными из госпиталя города Борнмут (Великобритания) для определения частоты потери локуса ING1 в лимфомах человека (M.Corcoran, личное сообщение).
Мы обнаружили несколько несоответсвий между последовательностями референтных клонов AF001954 и AF044076 для мРНК изоформ гена ING1 из базы данных GenBank, и последовательностью мРНК гена ING1, определенной в настоящей работе на основе геномного локуса ING1. Эти несответствия были представлены нуклеотидными заменами либо инсерциями в 16 позициях. Шесть из этих нуклеотидных изменений соответствовали уточнениям аминокислотных остатков в белковом продукте p33INGl, группирующимся на участках между нуклеотидными позициями 425 -485 в последовательности AF001954 и позициями 411 - 471 в последовательности AF044076. Это изменения валинов-123, -129 и -139 (в последовательности из GenBank, транслированной in silico) на аланины, аспарапша-135 на лизин, аспарагиновой кислоты-137 на глутаминовую кислоту, серина-142 на аланин. Остальные нуклеотидные несоотвествия группируются в З'-концевой нетранслируемой области ING1. Уточненная нуклеотидная последовательность экзонов гена ING1, входящих в состав изоформы мРНК ING1 1b размером 2295 н.п., позволяет предсказать образование белка массой 31,9 кДа.
Уточненную аминокислотную последовательность белка ING1 человека, кодируемого изоформой мРНК ING11b сравнили с аминокислотными последовательностями, хранящимися в GenBank (использована программа BLASTP+BEAUTY). Белок ING1 имеет сходство с несколькими белками человека, нематоды С. elegans и дрожжей, содержащими цинк-связывающий домен PHD (тип С4НСЗ), опосредующий регуляцию транскрипции путем изменения конденсации хроматина. Ближайший гомолог белка ING1 - белок человека ING1L, описан ранее [Shiraada Y. et al., 1998]. Он является продуктом гена, расположенного на хромосоме 4 и сильно экспрессирующегося в опухолях толстой кишки. Среди последовательностей GenBank нами обнаружен еще один протеин человека (gi3041855, ING1L-7), гомологичный ING1 и полученный в результате трансляции in silico клона РАС DY0872F07, расположенного в районе q31 хромосомы 7. Впоследствии этот ген был описан другой
группой ученых и зарегистирован в Комитете по номенклатуре HUGO под названием ING3 [Nagashima M. et al., 2003].
Белок ING1L обладает значительным сходством с белком ING1 и приблизительно такую же массу, тогда как белок ING1L-7 в два раза больше размером и содержит вставочный срединный домен с неизвестной функцией. Все три INGl-подобных белка человека, ING1, ING1L и ING1L7, содержат участки протяженной гомологии, проходящие через их С-концевые цинк-связывающие домены PHD-типа и N-концевые домены ISNT. Мы предложили выделить ING1-подобные белки в отдельное семейство, объединенное общими структурными доменами PHD и ISNT.
Данная работы выполнена вместе с ТА.Бородиной, к.б.н. Н.В. Макеевой и к.б.н. Д.В. Ивановым (Институт Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН).
4. Структура гена-онкосупрессора СКАР2
Ген СКАР2 (LB1) был обнаружен при поиске мРНК, дифференциально экспрессирующихся у больных В-клеточной лимфомой диффузного типа [Maouche-Chretien, L. et al., 1998]. Этот ген кодирует белок, состоящий из 683 аминокислот, не содержащий участков, сходных с известными белковыми последовательностями. Белок СКАР2 присутствует в цитоплазме и тесно связан со структурами цитоскелета. Экспрессия гена СКАР2 усиливается во время злокачественной трансформации клеток человека или при формировании клеточных линий. Поэтому было высказано предположение о том, что ген СКАР2 играет важную роль в процессе канцерогенеза [Maouche-Chretien, L. et al., 1998]. Ген СКАР2 расположен в области хромосомы 13ql4, что установлено с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) на метафазных хромосомах человека [Maouche-Chretien, L. et al., 1998]. Однако исследований одним лишь методом FISH недостаточно для проверки того, является ли ген СКАР2 кандидатом в гены-супрессоры заболеваний, сопровождающихся делениями в указанной области.
Поэтому для З'-нетранслируемой области гена СКАР2 были подобраны специфичные праймеры LB1-31 (5'-tatcctaagcattcacggcag-3') и LB1-32 (5'-ggcagggaggtacatcataac-3'). С помощью полимеразной цепной реакции амплифицировали участок ДНК длиной 303 п.н., соответствующий позициям 2249-2552 в полной нуклеотидной последовательности гена СКАР2. Для определения локализации гена СКЛР2 использовали коммерческий препарат панели радиационных гибридов GeneBridge 4 RH-Pancl (фирма Research Genetic, Inc.). Мы определили, что ген СКАР2 локализован в области хромосомы 13q14.3
между маркерами WI15460 и WI3673 и на 14,39 cR (при 4,8 cR на сМ) ниже маркера рабочей рамки WI5867 (при LOD > 2,26). Ген расположен на границе области 13q21.1 ближней к центромере, но вне области, обычно утрачиваемой при В-клеточном хроническом лимфолейкозе и при карциноме простаты (см. соответствующие разделы Обзора Литературы). Данная работа была проделана вместе с д.б.н. Г.Е.Сулимовой и д.б.н. ИГ.Удиной (Институт Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН) до выхода в свет полной геномной последовательности человека.
В результате сопоставления последовательностей EST, соответствующих гену СКАР2 и полной последовательности генома человека мы определили, что ген СКАР2 состоит из 8 экзонов, занимающих 21 т.п.н. хромосомы 13 человека между генами C13ORF9 KLOC387929.
Впоследствии группой ученых из Кореи [Bae CD. et al., 2003] было показано, что ген СКАР2 не экспрессируется ни в нормальной мукозе желудка, ни в других тканях нормального желудочно-кишечного тракта. В то же время мРНК гена СКАР2 обнаружены в 23 из 42 образцов первичной карциномы желудка. Наличие белка СКАР2 в клетках карциномы желудка и аденомы желудка подтверждено также в исследованиях с помощью иммуно гистохимических методов. Иммуногистохимическое определение содержания белка СКАР2 может быть использовано для дифференциальной диагностики аденомы желудка и аденокарциномы желудка., т.к. в злокачественных опухолях желудка белок СКАР2 присутствует в среднем в 48,8% клеток, а в аденомах - в 9,1% клеток [Bae CD. et al., 2003].
5. In silico скрининг последовательностей нуклеотидов генома человека, специфически экспрессирующихся в опухолях.
Целью данной части работы являлся поиск генов, имеющих повышенный уровень экспрессии в опухолях человека. Основной задачей исследования являлся анализ данных по экспрессии генов человека, имеющихся в общедоступной базе данных (БД) UniGene, поддерживаемой NCBI [http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/]. В этой БД содержится информация о последовательностях нуклеотидов клонированных молекул кДНК, синтезированных на основе тотальной мРНК, выделяемой из клеток различных тканей и клеточных культур человека. Секвенированные фрагменты клонов кДНК называются EST (Expressed Sequence Tag). Все EST в БД объединены в кластеры по принципу взаимной гомологии. Предположительно каждый кластер представляет собой «образ гена», а точнее его мРНК, составленный из
EST, представляющих разные ткани, в частности опухолевые и нормальные.
База данных UniGene во время выполнения работы находилась в состоянии развития из-за непрерывного совершенствования ее внутренних алгоритмов и периодической перестройки внутренних структур. Кроме того, количество EST в базе dbEST неуклонно и довольно быстро растет, из-за чего каждый месяц в анализ UniGene добавляются десятки тысяч новых описаний EST.
На момент выполнения работы база UniGene состояла из:
• 48 440 последовательностей мРНК, полученных в результате выравнивания EST относительно друг друга и нуклеотидных последовательностей генов, выравнивания мРНК относительно полной последовательности генома человека.
• 1 107 625 EST, соответствующих индивидуальным 3' концам клонов кДНК,
• 714 343 EST, соответствующих индивидуальным 5' концам клонов кДНК,
• 361 388 сиквенсов других типов, в том числе сиквенсов, соответствующих продуктам RT-PCR.
Таким образом, полное число последовательностей составило 2 231 796.
Эти последовательности были сгруппированы в 88 399 кластеров.
На момент выполнения этого этапа работы для обработки были доступны 1,7* 106 EST, принадлежащих к 691 независимой клонотеке кДНК человека. Эти клонотеки получены из различных органов и клеток организма человека, находящегося на разных стадиях его развития. Большинство из использованных клонотек были четко классифицированы как опухолевые или нормальные, однако некоторые из них имели недостаточно точное описание. Это привело к тому, что в рамках данной работы описания этих клонотек пришлось уточнять. Так, в процессе данной работы было выявлено 4 клонотеки: NCI CGAP СоЗ, NCI CGAP Со4 и Soares NSF F8 9W ОТ PA P SI, NCI CGAP Li8, описания которых в UniGene не соответствовали их происхождению, либо содержали принципиально важные неточности. Мы известили об этом специалистов UniGene, а данные клонотеки были выведены в отдельную группу, определенную нами как «неклассифицируемые клонотеки».
5.7. Пилотный эксперимент
Перед нами стояла задача найти кластеры, состоящие исключительно или преимущественно из EST, происходящих из опухолевых клонотек. Обнаружение таких кластеров означало бы, что существуют гены, экспрессирующиеся преимущественно или исключительно в клетках злокачественных опухолей. Для анализа были сформированы два пула клонотек представляющих часть доступных в БД данных. В один из пулов вошли клонотеки, которые по источнику ткани происходили из опухолей, а в другой вошли клонотеки, полученные из нормальных тканей. В составе «опухолевых» клонотек было около 750 000 EST, а в составе нормальных - около 780 000 EST.
На данном этапе работы была поставлена задача выявления кластеров содержащих не менее 16 EST, из которых более 80% EST приходилось бы на любые клонотеки опухолевого происхождения.
Мы создали программу HsAnalyst, оперирующую задаваемыми пользователем наборами клонотек - «пулами» клонотек. Каждый пул составляется пользователем путем последовательного выбора любых отдельных клонотек. Наиболее простым и частым случаем является использование двух пулов, отличающихся по какому-либо критерию, например «происхождение: опухоль-норма».
Программа HsAnalyst была написана па языке С++ в интегрированной среде программирования Borland Builder к.б.н. А.ВЛобашевым. Исходными данными для программы служил файл UniGene «Hs.data» с описаниями кластеров EST и файл с упрощенными описаниями клонотек, полученный из LibraryRegistry (оставлены только поля индекса клонотеки и опухолевой принадлежности). Обобщенный алгоритм работы программы таков:
Шаг1:
1) Из файла Hs.data построчно считывается описание одного кластера, в которое входят строки заголовка описания - помер кластера, название соответствующего гена, данные об экспрессии этого гена, локализация на геноме, дополнительная информация. Также в описании кластера имеется группа строк, содержащих информацию о последовательностях (идентификационных номерах EST), вошедших в данный кластер;
2) В информации о каждой последовательности дана ссылка на индекс клонотеки-источника. Для каждой последовательности кластера из таблицы LibraryRegistry берутся данные о том, относится ли она
(последовательность) к опухолевому, нормальному типу или неклассифицирована;
3) подсчитываются числа последовательностей каждого типа;
4) формируется описание кластера в виде: «индекс кластера (текст); наличие гомологии с каким-нибудь геном (да/нет); полное число последовательностей в кластере (число); число белковых последовательностей (число); число опухолевых EST (число); нормальных EST (число); неклассифицированных EST (число)» и заносится в отдельный файл, имя которого задается пользователем;
5) программа переходит к пункту 1 и считывает строки описания следующего кластера, если конец файла еще не достигнут.
Шаг 2: пользователь задает порог удельного содержания опухолевых последовательностей в кластере. Кластеры, содержащие долю опухолевых EST больше заданного порога, будут считаться опухолеспецифичными. Также пользователь задает среднее (или ожидаемое им) количество опухолевых EST во всей БД. Затем определяются границы интервалов по числу последовательностей, в которые будут попадать кластеры в зависимости от количества EST в них (наиболее часто используемый тип разбиения на интервалы: 1-2,3-4,5-8,9-16,1732 и т.д.). Для каждого интервала /„ будет подсчитываться число последовательностей Nest, полное число кластеров N^t и число опухолеспецифичных кластеров которые в него входят.
Далее программа:
1) считывает (следующую) строку описания кластера из файла, полученного на этапе 1;
2) в соответствующем по количеству EST интервале увеличивает число на 1;
3) проверяет, проходит ли кластер по удельному содержанию опухолевых EST, если да, то кластер откладывается для дальнейшего анализа;
4) повторяет этапы 1-3, пока не исчерпаются все описания кластеров;
5) подсчитывает ожидаемое количество опухолевых кластеров в каждом интервале с учетом введенных пользователем данных, подсчет проводится в предположении, что вероятности событии подчиняются биномиальному закону (пример события - некоторое количество EST в кластере оказываются опухолевого
происхождения). Как известно, вероятность того, что из п попыток произойдут т событий, вероятность каждого из которых р, подчиняется биномиальному закону и вычисляется по формуле (С - число
сочетаний по m элементов, выбираемых из множества элементов п);
6) вывод результатов в текстовый файл - список кластеров, удовлетворяющих условиям пользователя и таблицы данных о распределении числа кластеров по их EST составу.
Полученный файл с результатами легко можно преобразовать для просмотра в виде электронной таблицы Microsoft EXCEL.
В результате работы программы HsAnalyst с выбранным массивом около 1.5 млн EST из данных БД был получен список из 26 кластеров EST, которые сохранили свою структуру при проверке. Эти кластеры, соответствуют генам, экспрессия которых оказалась (в соответствии с выбранными статистическими критериями) выше в клетках, имеющих опухолевое происхождение. Таким образом, результат пилотного эксперимента показал, что компьютерные методы пригодны для поиска генов, экспрессирующихся преимущественно или исключительно в опухолевых тканях. Разработанный нами метод анализа мы назвали «компьютерный дифференциальный дисплей»
5.2. Результаты полномасштабного сопоставления спектров экспрессии нормальных и опухолевых клеток
На следующем этапе работы метод КДД был применен к анализу всего доступного массива данных ёЪЕ8Т. Из ипЮепе были последовательными запросами получены описания всех имеющихся на тот момент в базе данных 3995 клонотек. В описание каждой клонотеки входили данные о тканевых источниках, использованных при приготовлении каждой клонотеки, и (в некоторых случаях) о патологических состояниях источника.
Ключевым на данном этапе работы являлось однозначное отнесение каждой из клонотек в базе данных к одной из сравниваемых групп в соответствии с источником материала для клонирования: «опухолевые», «нормальные» и отнесение всех остальных к группе «неклассифицируемые». Мы ожидали, что гены, специфически экспрессирующиеся в опухолях, будут встречаться достаточно редко. Поэтому было особенно важно избежать попадания в пул «норма», тех клонотек, которые реально были получении из опухолевых
(КДД).
источников. В случае такой ошибки пул «норма» содержал бы не нулевое значение числа опухолеспецифичных EST. При этом отношение числа EST «опухоль»/«норма» для данного кластера могло не достигать порогового значения, и реально опухоспецифичный по экспрессии ген не был бы выявлен.
Чтобы приписать каждую кДНК клонотеку к одному из трех пулов (норма, опухоль, неклассифицируемая) использовали ряд критериев и источпиков информации, наряду с информацией из базы данных UniGene (Homo sapiens).
Клонотека считалась опухолевой, если;
1. В ее названии, описании ткани-источника или комментариях была прямо указана опухолевая патология и клонотека не была получена из смеси образцов тканей включающей нормальные (не имеющие опухолевого фенотипа). Прямое утверждение авторов работы об опухолеспецифичности клонотеки расценивалось как истинное.
2. По происхождению относилась к группе клонотек, полученных одним методом из одной и той же опухолевой ткани в рамках одной экспериментальной работы.
3. Была приготовлена из клеточной линии какой-либо опухолевой ткани.
4. Описание клонотеки неясного происхождения по данным из других источников было опухолевым.
К нормальным относились клонотеки:
1. Имеющие подробное описание в UniGene с указанием донора ткани, состояния организма и адекватной экспериментальной методики получения. Такие методы взятия образцов как микродиссекции прилежащей к опухоли ткани считались неадекватными, так как при микродиссекции невозможно достоверно знать попали или не попали в образец злокачественные клетки.
2. Полученные из тканей эмбриона или плода человека, в том случае если нет указаний на опухолевые и подобные образования.
3. По происхождению относящиеся к группе клонотек, полученных одним методом из одной и той же нормальной ткани в рамках одной экспериментальной работы.
К неклассифицируемым были отнесены клонотеки:
1. Нормальные по описанию, но приготовленные из препаратов тканей, могущих содержать злокачественно трансформированные клетки (например, образцы нормальных учасков печени от больных опухолями печени или метастазирующими опухолями других органов)
2. Приготовленные из смесей тканей (норма с опухолью)
3. Приготовленные из тканей, которые в силу своих физиологических особенностей демонстрируют необычный спектр генной экспрессии, как, например, ткань яичек.
Данные по каждой клонотеке из UniGene проверялись вручную с использованием информации, находящейся в открытом доступе через сеть Интернет:
По описанию этой клонотеки в dbEST (по ссылкам на клонотеку в разделе NCBI Nucleotide)
по электронным версиям статей, в которых описывалось получение клонотеки (раздел PubMed в NCBI)
для клонотек, полученных в ходе коммерческой работы молекулярно-биологических фирм (например STRATAGENE) по их каталоговым номерам на веб-сайте производителя либо в базе данных TIGR [http://www.tigr.org/].
Из 3995 клонотек, присутствовавших в базе данных UniGene на конец 2000 г. иеклассифицируемыми оказались 227 штук (5,6%), в состав которых вошло 500462 EST. Остальные клонотеки были классифицированы как опухолевые - 2681 штук (67%) и нормальные -1087 штук (27%). К опухолевым клонотекам принадлежали 921237 EST, входящих в состав 56241 кластеров, к нормальным - 810097 EST в составе 53762 кластеров. Данная работа была проделана совместно с к.б.н. Тяжеловой Т.А.
Таким образом, опухолевые клонотеки составили большинство, что можно объяснить закономерным интересом исследователей к патологическим состояниям организма человека, в частности к злокачественным образованиям. Всего же на тот момент в базе данных содержалось EST.
Несмотря на то, что число клонотек, классифицированных нами как опухолевые более чем в два раза превышало число нормальных, среднее содержание опухолевых EST в базе данных составило приблизительно 41% от полного числа EST.
Благодаря проведенному этапу уточнения происхождения и сортировки клонотек мы получили возможность применить метод компьютерного дифференциального дисплея для всех кластеров из базы данных UniGene, использовав программу HSAnalyst.
Проводили поиск кластеров с относительным содержанием опухолевых EST не менее 90%, а также с содержанием 100% (напомним, что среднее содержание опухолевых EST в БД составило 41%). Кластеры с числом EST менее 10 исключали из анализа.
В результате были выявлены 21070 кластеров по порогу в 90% и 20909 кластеров с 100%-м содержанием опухолевых EST. Вывод результатов статистической обработки осуществлялся в текстовый файл, имеющий формат таблицы. В Таблице представлены результаты статистической обработки массива кластеров, отобранных по 90 и 100% содержанию EST из опухолевых клонотек. В первом столбце
обозначен размер кластера, выраженный в количестве EST, во втором -количество последовательностей во всех кластерах данного диапазона, в третьем - количество кластеров соответствующего размера. Четвертый столбец - относительное количество опухолевых EST в данном диапазоне размеров кластеров. Далее в пятом и шестом столбцах указаны реальные и ожидаемые числа кластеров с 90%-м содержанием опухолевых EST, а в седьмом и восьмом - то же для 100% порога. Ожидаемое количество кластеров с данными характеристиками рассчитывалось по формуле вероятности для биномиального распределения.
Таблица 9. Результаты статистической обработки массива кластеров, отобранных по 90 и 100% содержанию EST из опухолевых клонотек
Размер кластера Количество Опухолевых EST, % Количество опухолевых кластеров по относительному солержаняю EST, */■*
Последовательностей Кластеров такого размера >90% 100%
Реальное ожидаемое Реальное ожидаемое
1-2 59111 44373 42% 18342 23073 9325 9572
3-4 45400 13401 35% 1880 1884 921 882
5-8 53569 8742 37% 567 279 284 172
9-16 63421 5407 39% 168 5 99 4
17-32 83968 3607 41% 45 0 17 0
33-64 176845 3762 43% 16 0 2 0
65-128 349008 3790 45% 10 0 2 0
129-256 460493 2588 47% S 0 0 0
257-512 339482 975 50% 3 NA** 0 NA
513-1024 208171 303 53% 1 NA 0 NA
1025-2048 130524 96 57% 0 NA 0 NA
2049-4096 95180 36 60% 0 NA 0 NA
4097-8192 49804 10 66% 0 NA 0 NA
8193-16384 14725 1 67% 0 NA 0 NA
Для случаев, когда ожидаемое при биномиальном распределении число кластров равно нулю, мы обнаружили 83 кластера с >90%-м содержанием опухолеспецифичных EST и 21 кластер со 100%-м содержанием опухолеспецифичных EST.
Полученные в результате работы программы HSAnalyst наборы кластеров содержали и те кластеры, которые были ранее найдены в результате пилотного эксперимента. Это явилось достаточным подтверждением адекватности примененного метода КДД, реализованного в виде разработанной программы.
Обнаруженные кластеры опухолеспецифических EST были подвергнуты углубленному анализу. Для каждого кластера реконструировалась обобщенная последовательность нуклеотидов исходя из последовательностей всех составляющих его EST. Обобщенную последовательность использовали для поиска гомологии
с известными последовательностями нуклеотидов генома человека, имеющимися в базе данных. Это делалось при помощи программы BLASTN, расположенной в сети Интернет на сайте NCBI по адресу [http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/]. Найденные участки гомологии служили основой для анализа структуры гена, которому соответствовал рассматриваемый кластер.
Этот анализ был ориентирован на то, чтобы обеспечить возможность экспериментального исследования участков генома человека, возможно соответствующих генам, специфически экспрессирующимся в опухолях.
Все найденные опухолеспецифичные кластеры можно разделить на три больших группы по свойствам обобщенных последовательностей нуклеотидов:
1) кластеры, имеющие 100%-е сходства с известными белками;
2) гены, кодирующие последовательности, имеющие гомологию с известными ранее или предсказанными белками;
3) белок-некодирующие РНК со строго опухолевой экспрессией;
В случаях, где это оказалось возможным, была установлена
локализация генов, соответствующих выявленным кластерам, их экзон-интронная структура, подобраны пары праймеров для исследования этих генов с помощью метода RT-ПЦР.
Некоторые кластеры на момент работы не представляли интереса для анализа (например Hs.253298, Hs.172708, Hs.156810, Hs.285026), так как по ряду объективных причин (повторы низкой сложности в Hs.172708; множественные нуклеотидные дупликации в EST Hs.156810; повторы типа LTR в Hs.285026) для них нельзя было подобрать праймеры. Такие кластеры были исключены из дальнейшего анализа. Данная часть работы была проделана вместе с к.б.н. Ивановым Д.В. Остальные обнаруженные и проанализированные последовательности, вошедшие в состав данной работы характеризуется выскоим уровнем экспрессии в опухолях человека, при практически полном отсутствии экспрессии в нормальных тканях человека. Результаты данной работы являются принципиально интересными с точки зрения создания новых молекулярно-генетических маркеров.
выводы
1. Впервые собрана последовательность нуклеотидов геномной ДНК человека между STS-маркетами 0138810 и Б1381469 в области. 13д14, часто утрачиваемой при ряде опухолевых заболеваний. Проведена аннотация и полный. биоинформатический анализ этой последовательности, что позволило выявить ее структурные особенности и гены, которые могут быть связаны с возникновением и/или прогрессией опухолей у человека.
2. Выявлен минимальный общий участок в области 13д14, утрачиваемый у больных В-ХЛЛ.
3. В составе фрагмента 2 млн.п.н. геномной ДНК человека между STS-маркерами Б138870 и Б1381469 выявлен сегмент, в котором в 3 раза повышена плотность А1и-повторов (особенно повторов наиболее молодого подсемейства А1иУ). Выдвинуто предположение, что данная структурная особенность области 13д14 может являться причиной ее повышеной нестабильности, возникающей в результате неравного кроссинговера и приводящей к перестройкам, ассоциированным с рядом опухолевых заболеваний человека.
4. Методами компьютерного анализа выявлены транскрибируемые участки фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами Б138810 и Б1381469. Впервые описапы 6 новых генов человека БЬЕт, БЬЕШ, С13вКЕ1, КЕР2, КЕР208, ХСЖв. Экспериментально установлена интрон-экзонная структура этих генов, в том числе изоформы их мРНК. Установлен профиль тканеспецифичности их экспрессии. Предсказаны возможные функции продуктов этих генов
6. Обнаружены мышь-специфические и человек-специфические экзоны в генах-ортологах БЬЕ1!2 у человека и мыши. В области генома мыши, синтенной области 13д14.3 генома человека, отсутвует ген, ортологичный гену БЬЕШ человка.
7. Впервые экспериментально установлена хромосомная локализация, охарактеризована экзон-интронная структура, изоформы мРНК, а также полиморфизм генов Ш01 и СКАР2, вовлеченных в процесс опухолеобразования.
8. Биоинформатический и экспериментальный анализ исследованных генов указывает, что потенциальными генами супрессорами опухолей человека могут являться в первую очередь гены RFP2, RFP2OS, KCNRG, C13ORF1, INGJи СКАР2.
Полученные данные о тонкой структуре этих генов позволяют приступить к экспериментальной проверке их функции в качестве генов супрессоров опухолей.
9. Создана программа ШАпа^!, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов, группируя их по заданному иследователем числу параметров, с установленным порогом значения признака по каждому из этих параметров.
10. В результате применения программы ШАпа^! создана панель новых потенциальных маркеров опухолей человека, тестрование которых доступно на основе единого, чувствительного, быстрого и дешевого метода ПЦР, что имеет большое значение, как для научных исследований, так и для диагностики опухолей в клипике.
Все результаты, изложенные в материалах диссертации, опубликованы в 24 статьях (10 - в международных журналах).
Список статей, опубликованных по теме диссертации.
1. Б.И.Капанадзе, В.М.Бродянский, А.В.Баранова,
C.Ю.Севастьянов, Н.Д.Федорова, М.М.Курсков, М А.Костина, А.А.Миронов, С.ПСинеокий, В.М.Захарьев, А.С.Графодатский, Н.Н.Модянов, Н.К.Янковский."Исследование космидных библиотек, содержащих ДНК хромосомы 13 человека" Генетика, 1996, т.32, N3, с.331-340
2. Капанадзе Б.И., Бродянский В.М., Семов А.Б., Баранова А.В., Сулимова Г.Е., Аитова С.С., Удина ИХ., Птицина С.Н., Сальникова Л.Е., Чудинов О.С., Борбиев Т.Э., Кашуба В., Гизатуллин Р., Забаровская В., Забаровский Е.Р., Федорова Л.И., Зеленин А.В., Лью И, Расул О., Грандер Д., Эйнхорн С, ван Эвердинк В., Бауш Ч., Коркоран М., Чапмен Б., Янковский Н.К. "Космидный контиг и карта кДНК в области 13ql4 часто утрачиваемой при В-клеточном хроническом лимфолейкозе у человека". Молекулярная Биология, 1997, N3c.515-519
3. Yie Liu, Martin Corcoran, Omid Rasool, Ganka Ivanova, Rachel Ibbotson, Dan Grander, Arati Iyengar, Anna Baranova, Vladimir Kashuba, Mats Merup, Xiushan Wu, Anne Gardiner, Roman Mullenbach, Andrew Poltaraus, Anna Linda Hultstrom, Gunnar Julisson, Robert Chapman, Mary Tiller, Gosta Gahrton, Nick Yankovsky, Eugene Zabarovsky, Stefan Einhorn, David Oscier. Cloning of two candidate tumor suppressor genes within a 10 kb region on chromosome 13ql4, frequently deleted in chronic lymphocytic leukemia. Oncogene 1997 15,2463-2473
4. Баранова А.В., Янковский Н.К. Тены-супрессоры опухолевого роста" Молекулярная биология 1998, том 32, с. 206 - 218.
5. Kapanadze В, Kashuba V, Baranova A, Rasool О, van Everdink W, Liu Y, Syomov A, Corcoran M, Poltaraus A, Brodyansky V, Syomova N, Kazakov A, Ibbotson R, van den Berg A, Gizatullin R, Fedorova L, Sulimova G, Zelenin A, Deaven L, Lehrach H, Grander D, Buys C, Oscier
D, Zabarovsky ER, Yankovsky N. A cosmid and cDNA fine physical map of a human chromosome 13ql4 region frequently lost in B-cell chronic lymphocytic leukemia and identification of a new putative tumor suppressor gene, Leu5. FEBS Lett 1998 Apr 17; 426(2):266-270
6. А.В. Баранова, Д.В. Иванов, Н.В. Макеева, М. Коркоран, Е.А. Никитип, Т.А. Бородина, А.Б. Полтараус, О. Глишцикова, А.Б. Судариков, Д. Осциер, Н.К. ЯНКОВСКИЕ. Геномная организация гена-супрессора опухолевого роста ING17/ "Молекулярная биология", 2000, N2, С. 263-269
7. Баранова- А.В., Иванов Д.В., Макеева КВ., Никитин Е.А., Сангфельдт О., Бородина ТА, Капанадзе Б.И., Тяжелова Т.В., Коркоран М., Федорова Л.И., Шагин Д.В., Немцова М.В., Полтараус А.Б., Зеленин А.В., Залетаев Д.В., Лукьянов С.А., Грандер Д., Эйнхорн С, Янковский Н.К. Клонирование кандидатного гена Leu5, утрачиваемого у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом, как иллюстрация современной стратегии поиска генов-супрессоров опухолевого роста.// Тематология и трансфузиология", 2000, т.45, №3, с.15-19
8. Никитин Е.А., Баранова А.В., Асеева Е.А., Домрачева Е.В. Молекулярные-цитогенетические нарушения при хроническом лимфолейкозе.// «Гематология и трансфузиология», 2000, т.45, с. 61-63.
9. Bagrat Kapanadze, Natalia Makeeva, Martin Corcoran, Niclas Jareborg, Marianne Hammarsund, Ancha Baranova, Eugene Zabarovsky, Olga Vorontcova, Mats Мепф, Gosta Gahrton, Nick Yankovsky, Stefan Einhorn, David Oscier, Dan Grander, Olle Sangfeft. Comparative sequence analysis of a region on human chromosome 13q14, frequently deleted in B-cell chronic lymphocytic leukemia and its homologous region on mouse chromosome 14. Genomics, 2000, V. 70., P. 327-334.
10. Компашшцев А.А., Удина И.Г., Баранова А.В., Сулимова Г.Е. Эволюционно-консервативный ген СКАР2 расположен в области 13ql4.3, часто перестраиваемой в различных опухолях человека. Генетика, 2001, VoL 37, N1, Р. 120-123
11. Т.А.Бородина, Д.В.Иванов, Э.К.Хуснутдинова, ВАСшщын, А.В.Баранова, Н.КЛнковский. Новый пентануклеотидный STR-маркер, расположенный в интроне гена-супрессора опухолевого роста ING1 и его аллельный полиморфизм. Генетика, 2001, VoL 37, N1, Р. 117-119
12. Тяжелова Т.В., Иванов Д.В., Макеева Н.В., Капанадзе Б.И., Никитин Е.А., Сангфельдт У., Грандер Д., Воробьев А.И., Эйнхорн С, Янковский Н.К., Баранова А.В. Транскрипционная карта района
13q14, часто утрачиваемого у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом. Генетика, 2001, т. 37, №11, с. 1530-7.
13. A.V. Baranova, A.V.Lobashev, D.V. Ivanov, L.L. Krukovskaya, N.K. Yankovsky, A.P: Kozlov. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. FEBS Letters, 2001, V. 508 (1) P. 143-148
14. Baranova A.V., Lobashev A.V., Ivanov D.V., Krukovskaya L.L., Znichenko V.V., Shestakov S.V., Kozlov A.P., Yankovsky N.K. A computer differential display reveals genes with with specific expression patterns: from potential human tumor markers down to plant stress-resistance genes. // Proc. Third International conference on bioinformatics of genome regulation and structure. (BGRS'2002), voL 3, July 14-20, Novosibirsk 2002. P.80-81.
15. Тяжелова Т.В., Иванов Д.В., Баранова А.В., Янковский Н.К. Поиск транскрибируемых участков в области ql4.3 хромосомы 13 человека in silico. Генетика, 2004, т. 40, №4,
16. Н. В. Макеева, А. А. Пестова, Т. А. Бородина, Д. А. Мадера, Д. В. Иванов, Е. В. Степанова, А. В. Баранова. Фундаментальные и прикладные аспекты сравнительной геномики позвоничных животных. Генетика, 2003, Т. 396 N9, с. 973-985
17. D.V. Ivanov, T.V. Tyazhelova, L. Lemonnier, N. Kononenko, A.A. Pestova, N. Prevarskaya, R. Skryma, Y.V. Panchin, N.K. Yankovsky, A.V. Baranova. A new human gene KCNRG encoding potassium channel regulating protein is a cancer suppressor gene candidate located in 13ql4.3 FEBS Letters 2003 Mar 27;539( 1-3): 156-60
18. А.ВЛобашев, А.В.Баранова, Н.КЛнковский, А.ПКозлов. Выявление генов человека с необычной экспрессией в опухолях с помощью анализа электронных баз данных. В сборнике трудов X юбилейная международная конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии», июнь 2002, Ялта-Гурзуф, Украина, с. 184-186;
19. A.V. Baranova, A.V.Lobashev, D.V. Ivanov, N.K. Yankovsky, A.P. Kozlov. Tumor-specific genes in human genome. Материалы IX международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 27мая - 1июня 2001; стр. 45-51.
20. Semova N, Kapanadze В, Corcoran M, Kutsenko A, Baranova A, Kisselev L, Semov A. Molecular cloning, structural analysis, and expression
of human IRLB, MYC promoter-binding protein: new DENN domain containing protein family emerges. Genomics. 2003 Sep;82(3)343-54.
21. van Everdink WJ, Baranova A, Lummen C, Tyazhelova T, Looman MWG, Ivanov D, Verlind E, Pestova A, Faber H, van der Veen AY, Yankovsky N, Vellenga E, Buys CHCM. RFP2, cl3ORFl and FAM10A4 are the most likely tumor suppressor gene candidates for B-cell chronic lymphocytic leukemia Cancer Genetics and Cytogenetics, 2003, 146/1 pp. 48-57
22. Ancha Baranova, Marianne Hammarsund, Dmitry Ivanov, Mikhail Skoblov, Olle Sangfeh, Martin Corcoran, Tatiana Borodina, Natalia Makeeva, Anna Pestova, Tatiana Tyazhelova, Svetlana Nazarenko, Francesco Gorreta, Tariq Alsheddi, Karen Schlauch, Eugene Nikhin, Bagrat Kapanadze, Dmitry Shagin, Andrey Pokaraus, Andrey Ivanovich Vorobiev, Eugene Zabarovsky, Sergey Lukianov, Vikas Chandhoke, Rachel Ibbotson, David Oscier, Stefan Einhora, Dan Grander and Nick Yankovsky. Distinct organization of the candidate tumor supperssor gene RFP2 in human and mouse: multiple mRNA isoforms in both species and human-specific antisense transcript RFP2OS. Gene. 2003 Dec 4;321:103-12.
23. Ancha Baranova, Dmitry Ivanov, Nadezda Petrash, Anya Pestova, Mikhail Skoblov, Ilya Kelmanson, Dmitry Shagin, Svetlana Nazarenko, Elena Geraymovych, Oxana Litvin, Anya Tiunova, Timothy L. Born, Natalia Usman, Dmitry Staroverov, Sergey Lukyanov, Yury Panchin. The mammalian pannexin family is homologous to the invertebrate innexin gap junction proteins. Genomics, 2004, Vol 83/4 pp 706-716
24. A.B. Баранова, Д.В. Иванов, Т.В. Тяжелова, Н.К. Янковский. Структурно-функциональная характеристика области 13ql4 генома человека и поиск в ней потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста. Молекулярная биология, 2004, т.38, №2, с.203-212
Главы в книге:
Практикум по общей вирусологии «Методы вирусологии». Учебное пособие под ред. И-Г.Атабекова. М.: Изд-во МГУ, 2002
1. Баранова А.В. Полимеразная цепная реакция, с 113-121
2. Скоблов M.^^, Баранова А.В.Определение нуклеотидной последовательности ДНК по методу Сенгера. с. 121-129
3. Иванов Д.В., Баранова А.В. Гибридизация нуклеиновых кислот, с. 129-141
Благодарности:
Я благодарю моего научного консультанта заведующего лабораторией анализа генома ИОГен РАН д.б.н., проф. Янковского Николая Казимировича, а также руководство и сотрудников Института Общей Генетики им. Н.И.Вавилова за безмерную поддержку оказанную мне в годы становления моей научной карьеры.
Выполнение этой работы было бы невозможно без участия студентов и аспирантов лаборатории анализа генома, как защитившихся под моим руководством, так и принимавших живейшее участие в обсуждении отдельных ее аспектов. За что им огромное спасибо.
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 06.04.2004 г. Формат 60x901/16. Усл.печл. 2,75. Тираж 100 зкз. Заказ 165. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
Р- 67 04
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Баранова, Анна Вячеславовна
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Цели исследования.
Задачи исследования.
Научная новизна.
Практическая значимость работы.
Основные положения выносимые на защиту.
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Патогенез В-клеточных лимфатических опухолей.
2.1.1. Общая характеристика генетических повреждений при лимфомах.
2.2. Ремоделирование генов Ig: перестройка генов иммуноглобулинов, соматическая гипермутация и сдвиг изотипа в норме.
2.2.1. Перестройка генов иммуноглобулинов.
2.2.2. Соматическая гипермутация и события в терминальном центре.
2.2.3. Сдвиг изотипа.
2.3. Хромосомные транслокации с участием локусов иммуноглобулинов.
2.3.1. Хромосомные транслокации, возникающие в процессе V(D)J рекомбинации.
2.3.2. Хромосомные транслокации, возникающие во время сдвига изотипа.
2.3.3. Значение соматической гипермутации в лимфомагенезе: хромосомные транслокации и мутации генов вне локусов Ig.
2.4. Оценка степени зрелости клеток-предшественниц В-клеточных лимфом путем анализа ремоделирования генов иммуноглобулинов.
2.5. Роль антигенной селекции при В-клеточных лимфомах.
Антигенная стимуляция и селекция.
2.6. Патогенез отдельных видов лимфом.
2.6.1. Лимфома из клеток мантийной зоны (JIM3).
2.6.2. Хронический лимфолейкоз.
2.6.3. Лимфомы из клеток центра фолликула.
2.6.3.1 .Центрофолликулярная лимфома.
2.6.3.2. Лимфома Беркитга.
2.6.3.3. В-крупноклеточная лимфома (В-ККЛ).
2.6.4. Лимфоплазмацитоидная лимфома.
2.6.5. Зрелоклеточные лимфомы, возникающие из клеток памяти.
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Экспериментальные методики.
3.1.1. Рекомбинантные космидные клонотеки.
3.1.1.1. Клонотека ICRF С108 DH5 L4/FS13.
3.1.1.2. Клонотека LANL 13NC01.
3.1.2. Клонотека РАС и ее гибридизационый скрининг.
3.1.3. Создание субклонотеки из отдельных фрагментов отобранных клонов РАС.
3.1.4. Рестрикционный анализ ДНК и Саузерн - блоттинг.
3.1.5. Приготовление радиоактивно меченых ДНК-зондов.
3.1.6. Гибридизация панелей космидных клонов и РАС-клонов.
3.1.7. Нозерн-блоттинг.
3.1.8. Радиоавтография.
3.1.9. ПЦР-анализ.
3.1.10. Выделение космидной, плазмидной ДНК, а также ДНК
РАС-клонов из клеток Е. coli и выделение
ДНК из клеток дрожжей.
3.1.11. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле.
3.1.12. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.
3.1.13. Клонирование фрагментов ДНК.
3.1.14. Трансформация клеток E.coli и дрожжей.
3.1.15. Определение нуклеотидных последовательностей плазмид и ПЦР-продуктов.
3.1.16. Экспресс ионная кДНК библиотека для дрожжевой ^ двугибридной системы.
3.2. Реагенты и оборудование.
3.2.1. Среды, условия хранения и культивирования бактерий.
3.2.2. Ферментные препараты.
3.2.3. Другие реактивы и расходные материалы.
3.3. Программы для компьютерного анализа.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Пояснения к выбору стратегий поиска генов, принимающих участие в процессе образования опухолей у человека.
4.2. Поиск гена-супрессора опухолевого роста, расположенного в районе 13ql4.3.
4.2.1. Поиск минимального участка хромосомы 13, утрачиваемого у пациентов с B-XJIJI.
4.2.2. Первичная характеристика генов DLEU1 и DLEU2, ^ расположенных в составе минимального утрачиваемого участка хромосомы 13.
4.2.3. Построение космидного контига между
STS-маркерами D13S1168 и D13S25 хромосомы 13 человека.
4.2.4. Составление транскрипционной карты участка между STS-маркерами D13S1168 и D13S25 хромосомы 13 человека.
4.2.5. Картирование повторяющихся последовательностей и анализ их распределения в составе референтной нуклеотидной последовательности.
4.2.6. Получение клонов, содержащих участки геномной ДНК мыши, соответствующие участку, утрачиваемому у больных B-XJIJ1.
4.2.7. Сравнительный геномный анализ нуклеотидных последовательностей гомологичных участков ДНК мыши и человека.
4.2.8. Анализ генов RFP2, KCNRG, С130RF1 и FAM10A4 - потенциальных онкосупрессоров, обнаруженных в результате построения транскрипционной карты ф участка генома, утрачиваемого у больных B-XJIJI.
4.2.8.1. Ген RFP2.
4.2.8.2. Ген KCNRG.
4.2.8.3. Ген C130RF1.
4.2.8.4. Ген FAMI OA.
4.3. Структура гена-онкосупрессора ING1 и описание его ближайших гомологов.
4.4. Структура гена-онкосупрессора СКАР2.
4.5. In silico скрининг последовательностей нуклеотидов генома человека, специфически экспрессирующихся в опухолях.
4.5.1. Пилотный эксперимент.
4.5.2. Результаты полномасштабного сопоставления спектров экспрессии нормальных и опухолевых клеток.
5. ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и структурно-функциональные особенности генов, участвующих в процессе опухолеобразования у человека"
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящее время онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности в развитых странах. Эти заболевания представляют собой большую проблему как медицинского, так и социального характера. Поэтому исследования в области онкологии представляют собой громадный пласт медико-биологических исследований. Получение новой информации о нарушениях структур и функций при опухолеобразовании одновременно развивает наши представления о фундаментальной биологической проблеме границ нормы - нормы структуры и функции на молекулярно-генетическом, клеточном, тканевом и организменном уровне.
Первопричиной опухолеобразования является изменение структуры или регуляции генома соматических клеток и последующее изменение функционирования их генома. Структурно-функциональные исследования генома человека в последние годы перешли на качественно более высокий уровень в результате реализации программы «Геном человека». Созданы принципиально новые технологии исследования геномов, которые, в сочетании с современными концепциями генетики, позволяют значительно углубить наше понимание молекулярно-генетических основ опухолеобразования, понять роль областей генома и генов человека критически важных для предотвращения образования опухолей. В результате таких фундаментальных исследований могут быть разработаны новые методы обнаружения онкопатологий, что особенно важно на начальных стадиях развития опухоли, когда еще возможно лечение без серьезного ущерба для организма. Поэтому исследования особенностей структуры и функционирования областей генома, часто повреждаемых при возникновении и развитии опухолей, высоко актуальны.
Цели исследования.
Гены, контролирующие поддержание нормальной структуры и функции генома, клеточное деление и межклеточные взаимодействия необходимы, в частности, и для подавления развития опухолей. Поэтому такие гены были названы генами супрессорами опухолевого роста. Перестройки участков генома соматических человека могут приводить к утрате или к дефектам генов супрессоров опухолевого роста и возникновению соответсвующей патологии. Участок 13ql4 генома человека часто оказывается поврежденным при различных онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других.
Основной целью диссертационной работы было структурно-функциональное исследование области 13ql4 генома человека и выявление связи этих особенностей с опухолеобразованием. Главный акцент был сделан на поиске и характеристике потенциальных генов супрессоров опухолей в этой области генома человека. Кроме того, исследовали также тонкую структуру и полиморфизм двух ранее известных генов хромосомы 13, вовлеченных в развитие опухолей. Другим феноменом, сопряженным с опухолеобразованием, является изменение нормального уровня экспрессии генов, структура которых может оставаться при этом неизменой. Целью диссертационной работы в данном направлении являлось выявление генов человека, маркирующих процесс опухолеобразования изменением уровня своей экспрессии.
Задачи исследования.
1) Выявление у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (B-XJIJI) перестроек хромосомы 13 в области 13ql4; физическое картирование границ выявленных перестроек хромосомы; выявление минимального общего района, повреждаемого у пациентов В-ХЛЛ
2) Установление последовательности нуклеотидов между маркерами D13S810 - D13S1469 области 13ql4; биоинформатический анализ данной последовательности нуклеотидов; выявление и исследование распределения в этой области повторов всех известных для человека типов; предсказание и эксперименталная проверка наличия в этой области транскрибируемых участков (генов), интрон-экзонной структуры этих транскриптов (в том числе альтернативно сплайсируемых форм), характеристика регуляторных участков и белок-кодирующих областей выявленных генов.
3) Предсказание возможных функций продуктов выявленных генов путем биоинформатического поиска генов паралогов с ранее установленной функцией, а также паралогов для отдельных предсказанных доменов в белках, кодируемых выявленными генами.
4) Экспериментальное и биоинформатическое иследование областей генома мыши, синтенных области 13ql4 генома человека. Установление тонкой структуры и сравнительный анализ генов ортологов в исследуемых областях генома.
5) Установление интрон-экзонной структуры и характеристика полиморфизма двух генов хромосомы 13 человека (СКАР2 и ING1), вовлеченных в развитие опухолей.
6) Биоинформатический поиск генов человека, маркирующих существование опухоли изменением уровня своей экспрессии. Анализ структуры этих генов и их возможной функции, в нормальных и опухолевых тканях.
Научная новизна.
Построен космидный контиг размером 620 т.п.н., перекрывающий участок 13ql4.3 генома человека. Выявлен минимальный общий участок, утрачиваемый в составе указанной хромосомы у больных В-XJIJI. Впервые собрана референтная нуклеотидная последовательность между STS маркерами D13S810 и D13S1469 общей длиной около 2 млн.н.п., перекрывающая исследуемую область нестабильности хромосомы 13 у больных B-XJIJI. Впервые выявлены биоинформатически и подтверждены экспериментально транскрибирующиеся участки в составе исследованного 2 млн.п.н участка хромосомы 13. В составе этого участка выявлен сегмент, в котором повышенна плотность Alu-повторов, особено наиболее молодого из известных подсемейств повторов этого типа, AluY. Впервые выдвинуто предположение, что данная структурная особенность области 13ql4 (высокая концетрация Alu повторов, особенно повторов AluY) может являться причиной повышенной нестабильности данного района, возникающей в результате неравного кроссинговера и приводящей к перестройкам при ряде опухолевых заболеваний человека.
Впервые методами компьютерного анализа проведена характеристика структуры и функции генов, картированных в составе фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами D13S810 и D13S1469. Проведено сравнительное исследование участков генома мыши, синтенных району 13ql4 генома человека, и выявлены наиболее вероятные кандидаты на роль генов супрессоров опухолеобразования. Впервые экспериментально описаны изоформы мРНК генов человека
DLEU1, DLEU2, RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1 и установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Функциональная характеристика этих генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка RFP2 выявлены десять потенциальных партнеров по взаимодействию. Впервые описана экзон-интронная структура и изоформы мРНК генов ING1 и СКАР2 вовлеченных в процесс опухолеобразования. Создана программа HSAnalyst, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов и выявить гены человека, маркирующие своей повышенной экспрессией опухолевые ткани.
Практическая значимость работы.
В области 13ql4 картированы рекомбинантные космиды, которые используются в клинической цитогенетике на ДНК пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек в этой области генома человека. Полученные данные о тонкой структуре генов RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1, ING1 и СКАР2 позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с перестройками хромосомы 13. Найден ряд генов человека, повышенная экспрессия которых маркирует процесс образования и/или прогрессии опухоли. В результате создана панель новых потенциальных маркеров опухолей человека, тестрование которых доступно на основе единого, чувствительного, быстрого и дешевого метода ПЦР, что имеет и большое значение, как для научных исследований, так и для диагностики опухолей в клинике.
Основные положения выносимые на защиту:
Выявлен минимальный общий участок, утрачиваемый в составе хромосомы 13 у больных B-XJIJI, и построен космидный контиг размером 620 т.п.н., перекрывающий участок указанный участок. Впервые собрана референтная нуклеотидная последовательность между STS маркерами D13S810 и D13 S1469 общей длиной около 2 млн.н.п., перекрывающая исследуемую область 13 у больных B-XJIJI. Впервые выявлены биоинформатически и подтверждены экспериментально транскрибирующиеся участки в составе исследованного 2 млн.п.н участка хромосомы 13. Повышенная плотность Alu-повторов может являться причиной нестабильности района 13ql4.3, приводящей к перестройкам при ряде опухолевых заболеваний человека.
Впервые методами компьютерного анализа и сравнительной геномики построена транскрипционная карта фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами D13S810 и D13S1469.
Впервые экспериментально описаны изоформы мРНК и проведена первичная функциональная характеристика генов человека DLEU1, DLEU2, RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1 и установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов.
Впервые описана экзон-интронная структура и изоформы мРНК генов ING1 и СКАР2 вовлеченных в процесс опухолеобразования. Создана программа HSAnalyst, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов и выявить гены человека, маркирующие своей повышенной экспрессией опухолевые ткани.
1. ВВЕДЕНИЕ
Онкологическое заболевание" - это достаточно общий термин, обозначающий болезненные состояния, вызванные неконтролируемой клеточной пролиферацией, возникающей из-за изменения структуры или характера экспрессии множества генов, входящих в состав геномов отдельных человеческих клеток, составляющих опухолевую массу.
Относительный вклад наследствености и среды в развитие онкологических заболеваний обсуждался с момента появления полвека тому назад классических теорий канцерогенеза. Строгие доказательства значения наследственной предрасположенности появились сначала лишь для некоторых достаточно редких опухолей, таких как нейрофиброматоз типа 1 (NF1), синдром множественных опухолей эндокринного происхождения типа 1 (MEN1), а также ряд синдромов, сопровождающихся развитием карциномы кишечника (АРС, HNPCC). К настоящему моменту список наследственных синдромов, отягченных развитием солидных опухолей и лейкозов, значительно расширен, однако, даже взятые вместе, они объясняют не более 5% всех случаев развития опухолей у человека. Все остальные случаи онкологических заболеваний классифицируются как "спорадические". Спорадические опухоли развиваются в результате комбинированного воздействия целого ряда параметров окружающей среды, наложенного на имеющуюся в данной человеческой клетке совокупность аллельных состояний ее генов [Shields P.G. and Harris С.С., 2000].
Не удивительно, что для многих спорадических опухолей довольно трудно выделить гены, повреждения которых служат "спусковым крючком" активного канцерогенеза. Поэтому для поиска таких генов используют материал, взятый у носителей наследственных синдромов, сопровождающихся опухолями той же локализации и гистологии, что и у спорадических больных. Так, для клонирования гена АРС, часто повреждаемого при раке кишечника, использовали ДНК пациентов с семейной предрасположенностью к этому типу опухолей, известной под названием "Множественный полипоз кишечника", а исключительная важность мутаций широко известного гена р53, впоследствии обнаруженных в почти 50% всех человеческих опухолей, впервые была показана для носителей весьма редкого синдрома Ли-Фраумени.
По всей видимости, большинство "раковых11 генов, которые можно было найти таким способом, уже найдено. Общенаучный "бум", связанный с их описанием, пришелся на начало девяностных годов. Однако, одновременно со всеобщим воодушевлением по поводу подробной характеристики "центральных" раковых генов, пришло и открытие, что раковые опухоли не похожи одна на другую - пациенты с одним и тем же гистологическим, иммунохимическим и даже "молекулярным" диагнозом по-разному отвечают на терапию, весьма различается и скорость прогрессии их опухолей. Оказалось, что в процессе опухолевого роста клетки приобретают мутации в самых разных генах - некоторые из них относительно нейтральны, и остаются простыми "свидетелями" повышенной частоты мутаций в раковых клетках, другие же предоставляют клетке-носительнице селективное преимущество, которое закрепляется в опухоли благодаря повышенной скорости деления этих клеток, либо снижению их ответа на стимулы, в норме вызывающие клеточную смерть (апоптоз).
К настоящему моменту хорошо охарактеризовано более пятидесяти генов-супрессоров опухолевого роста и онкогенов, изменение экспрессии или мутации которых являются «опорными точками» процесса образования опухолей. Место этих генов в многомерной "сетке" биохимических и молекулярно-биологических путей клеточной регуляции (pathways или «генных сетей») установлено достаточно точно. Более или менее убедительные доказательства участия в развитии опухолей получены для нескольких сотен генов человека, многие из этих генов охарактеризованы только с точки зрения их влияния на скорость процессов клеточного деления и апоптоза, но не с точки зрения настоящей функции этих генов. Главным выводом, сделанным в многочисленных и скрупулезных исследованиях в области молекулярной онкологии, остается вывод о том, что универсального пути озлокачествления нормальной человеческой клетки попросту не существует. Клетки одной и той же ткани способны трансформироваться в опухоли, различающиеся как по их гистологии, так и по степени злокачественности. В связи с этим наиболее перспективными для выявления «общей картины» геномных изменений являются комплексные подходы, позволяющие одновременно анализировать десятки, сотни и даже тысячи генов. К таким подходам относятся методы дифференциального дисплея, основанные как на экспериментальных данных, например, полученных с помощью экспрессионных микрочипов [Alizadeh А.А. et al., 2000; Martin K.J. et al., 2000; Scherf U. et al., 2000; Ross D.T. et al., 2000], так и на данных компьютерного анализа, полученных путем сопоставления информации, находящейся в общедоступных базах данных. В данной работе использован метод комьютерного дифференциального дисплея, позволивший описать группу последовательностей человека, экспрессирующихся только (или преимущественно) в опухолевой ткани. Данные последовательности являются новыми опухолевыми мшкерами и могут быть использованы для диагностики или мониторгинга опухолевых заболеваний человека.
В то же время, комплексные подходы анализа состояния опухолевой клетки обязательно должны дополняться молекулярно-биологическими исследованиями отдельных генов, описанию их связи с конкретными опухолевыми заболеваниями, их функции в нормальной и опухолевой клетке, и, как следствие, точного установления их роли в процессах озлокачествления. В качестве модельного исследования такого типа здесь будет описан процесс поиска и харакетристики генов, расположенных в районе ql4.3 хромосомы 13, часто повреждаемом при В-клеточном хроническом лимфолейкозе, лимфоме мантийоной зоны и множественной миеломе. Для удобства читателя этот экспериментальный раздел будет предварен литературным обзором, посвященным молекулярным механизмам лимфомагенеза, с одной стороны, суммирующим современное состояние знаний о данном вопросе, а с другой стороны исследующим уровень сложности процессов, приводящих к образованию опухолей у человека.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Баранова, Анна Вячеславовна
5. ВЫВОДЫ
1. Впервые собрана последовательность нуклеотидов геномной ДНК человека между STS-маркерами D13S810 и D13S1469 в области 13ql4, часто утрачиваемой при ряде опухолевых заболеваний. Проведена аннотация и полный биоинформатический анализ этой последовательности, что позволило выявить ее структурные особенности и гены, которые могут быть связаны с возникновением и/или прогрессией опухолей у человека.
2. Выявлен минимальный общий участок в области 13ql4, утрачиваемый у больных В-ХЛЛ.
3. В составе фрагмента 2 млн.п.н. геномной ДНК человека между STS-маркерами D13S810 и D13S1469 выявлен сегмент, в котором в 3 раза повышена плотность Alu-повторов (особенно повторов наиболее молодого подсемейства AluY). Выдвинуто предположение, что данная структурная особенность области 13ql4 может являться причиной ее повышеной нестабильности, возникающей в результате неравного кроссинговера и приводящей к перестройкам, ассоциированным с рядом опухолевых заболеваний человека.
4. Методами компьютерного анализа выявлены транскрибируемые участки фрагмента хромосомы 13 между STS маркерами D13S810 и D13S1469. Впервые описаны 6 новых генов человека DLEU1, DLEU2, C130RF1, RFP2, RFP20S, KCNRG. Экспериментально установлена интрон-экзонная структура этих генов, в том числе изоформы их мРНК. Установлен профиль тканеспецифичности их экспрессии. Предсказаны возможные функции продуктов этих генов
5. Обнаружены мышь-специфические и человек-специфические экзоны в генах-ортологах DLEU2 у человека и мыши. В области генома мыши, синтенной области 13ql4.3 генома человека, отсутвует ген, ортологичный гену DLEU1 человка.
6. Впервые экспериментально установлена хромосомная локализация, охарактеризована экзон-интронная структура, изоформы мРНК, а также полиморфизм генов ING1 и СКАР2, вовлеченных в процесс опухол еобразования,.
7. Биоинформатический и экспериментальный анализ исследованных генов указывает, что потенциальными генами супрессорами опухолей человека могут являться в первую очередь гены RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1, ING1 и СКАР2.
Полученные данные о тонкой структуре этих генов позволяют приступить к экспериментальной проверке их функции в качестве генов супрессоров опухолей.
8. Создана программа HSAnalyst, позволившая провести анализ электронных баз данных о транскрибируемых последовательностях нуклеотидов, группируя их по заданному иследователем числу параметров, с установленным порогом значения признака по каждому из этих параметров.
9. В результате применения программы HSAnalyst создана панель новых потенциальных маркеров опухолей человека, тестрование которых доступно на основе единого, чувствительного, быстрого и дешевого метода ПЦР, что имеет большое значение как для научных исследований, так и для диагностики опухолей в клинике.
БЛАГОДАРНОСТИ:
Я благодарю моего научного консультанта зав. лаб. анализа генома ИОГен РАН д.б.н., проф. Янковского Николая Казимировича, а также руководство и сотрудников Института Общей Генетики им. Н.И.Вавилова за безмерную поддержку, оказанную мне в годы становления моей научной карьеры. Хотелось бы также отдельно отметить участие начальника отдела аспирантуры и докторантуры ИОГен РАН к.б.н. Галины Николаевны Полухиной, много помогавшей мне на каждом из этапов становления моей карьеры.
Выполнение этой работы было бы невозможно без участия студентов и аспирантов лаб. анализа генома, как защитившихся под моим руководством, так и принимавших живейшее участие в обсуждении отдельных аспектов, в особенности к.б.н. Татьяне Тяжеловой, к.б.н. Андрею Лобашеву, к.б.н. Наталье Макеевой, к.б.н. Дмитрию Иванову, аспирантам ИОГен РАН Михаилу Скоблову и Анне Пестовой, а такжу бывшим студентам - выпускникам лаборатории Татьяне Бородиной и Константину Шахбазову. Всем им огромное спасибо. Я таже благодарна моему «первому учителю» к.б.н. Баграту Капананадзе, за привитую мне широту научных взглядов. Огромное спасибо также Дмитрию Ивановичу Коптеву, всегда выручавшему меня в самые трудные минуты.
Кроме того, я очень благодарна член-корр. РАН Сергею Луъянову и сотрудникам его лаборатории (ИБХ РАН), а также к.б.н. Евгению Никитину (Гематологический Центр РАМН) за стимулирующие дискуссии и помощь в проведении многих экспериментов.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Баранова, Анна Вячеславовна, Москва
1. Abdul М., Hoosein N. Expression and activity of potassium ionchannels in human prostate cancer. // Cancer Lett, 2002. Vol. 186 — P. 99.
2. Adams PD. Regulation of the retinoblastoma tumor suppressor proteinby cyclin/cdks. // Biochim Biophys Acta. 2001. Mar 21;1471(3):M123-33.
3. Agarwal ML, Taylor WR, Chernov MV, Chernova OB, Stark GR. Thep53 network.// J Biol Chem. 1998. Jan 2;273(l):l-4. Review.
4. Aggarwal S, Gupta A, Nagata S, Gupta S. Programmed cell deathapoptosis) in cord blood lymphocytes. // J Clin Immunol. 1997. Jan;17(l):63-73.
5. Agrawal A, Eastman QM, Schatz DG. Transposition mediated by
6. RAG1 and RAG2 and its implications for the evolution of the immune system. //Nature. 1998. Aug 20;394(6695):744-51.
7. Akasaka H, Akasaka T, Kurata M, Ueda C, Shimizu A, Uchiyama T,
8. Ohno H. Molecular anatomy of BCL6 translocations revealed by long-distance polymerase chain reaction-based assays. // Cancer Res. 2000. May 1;60(9):2335-41.
9. Algara P, Mateo MS, Sanchez-Beato M, Mollejo M, Navas 1С, Romero
10. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A,
11. Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G,
12. Allen JE, Hough RE, Goepel JR, Bottomley S, Wilson GA, Alcock HE,
13. Baird M, Lorigan PC, Vandenberghe EA, Hancock BW, Hammond DW. Identification of novel regions of amplification and deletion within mantle cell lymphoma DNA by comparative genomic hybridization. // Br J Haematol. 2002. Feb;l 16(2):291-8.
14. Allsopp RC, Chang E, Kashefi-Aazam M, Rogaev EI, and Piatyszek MA, .1995. Telomere shortening is associated with cell division in vitro and in vivo. // Exp. Cell Res. 220:194-200.
15. Amati B, Land H. Myc-Max-Mad: a transcription factor network controlling cell cycle progression, differentiation and death. // Сип-Орт Genet Dev. 1994. Feb;4(l): 102-8.
16. Andrew Murray and Tim Hunt. The Cell Cycle // In: Oxford University Press; (June 1993.).
17. Angelin-Duclos C, Cattoretti G, Lin KI, Calame K. Commitment of В lymphocytes to a plasma cell fate is associated with Blimp-1 expression in vivo. // J Immunol. 2000. Nov 15;165(10):5462-71.
18. Antonsson B. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion. // Cell Tissue Res. 2001. Dec;306(3):347-61. Epub 2001. Oct 30.
19. Au WY, Gascoyne RD, Viswanatha DS, Connors JM, Klasa RJ, Horsman DE. Cytogenetic analysis in mantle cell lymphoma: a review of 214 cases. //Leuk Lymphoma. 2002. Apr;43(4):783-91.
20. Babbage G, Garand R, Robillard N, Zojer N, Stevenson FK, Sahota SS. Mantle cell lymphoma with t(ll;14) and unmutated or mutated VHgenes expresses AID and undergoes isotype switch events. // Blood. 2003. Oct 9 Epub ahead of print.
21. Bae CD, Sung YS, Jeon SM, Suh Y, Yang HK, Kim YI, Park KH, Choi J, Ahn G, Park J. Up-regulation of cytoskeletal-associated protein 2 in primary human gastric adenocarcinomas. // J Cancer Res Clin Oncol. 2003. Nov;129(11):621-30. Epub 2003. Aug 26.
22. Baens M, Maes B, Steyls A, Geboes K, Marynen P, De Wolf-Peeters C., The product of the t(l 1;18), an API2-MLT fusion, marks nearly half of gastric MALT type lymphomas without large cell proliferation. // Am J Pathol. 2000. Apr; 156(4): 1433-9.
23. Bassing CH, Swat W, Alt FW. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. // Cell. 2002. Apr; 109 Suppl:S45-55.
24. Batliwalla FM, Damle RN, Metz C, Chiorazzi N, Gregersen PK. Simultaneous flow cytometric analysis of cell surface markers and telomere length: analysis of human tonsilar В cells. // J Immunol Methods. 2001. Jan l;247(l-2): 103-9.
25. Bechter OE, Eisterer W, Pall G, Hilbe W, Kuhr T, and Thaler J. 1998. Telomere length and telomerase activity predict survival in patients with В cell chronic lymphocytic leukemia. // Cancer Res. 58:4918-22.
26. Bernasconi NL, Onai N, Lanzavecchia A. A role for Toll-like receptors in acquired immunity: up-regulation of TLR9 by BCR triggering in naive В cells and constitutive expression in memory В cells. // Blood. 2003. Jun 1;101(11):4500-4. Epub 2003. Jan 30.
27. Bernasconi NL, Traggiai E, Lanzavecchia A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory В cells. // Science. 2002. Dec 13;298(5601):2199-202.
28. Bevan S, Yuille MR, Marossy A, Catovsky D, Houlston RS. Ataxia telangiectasia gene mutations and chronic lymphocytic leukaemia. // Lancet. 1999. Feb 27;353(9154):753.
29. Bhatia K, Huppi K, Spangler G, Siwarski D, Iyer R, Magrath I. Point mutations in the c-Myc transactivation domain are common in Burkitt's lymphoma and mouse plasmacytomas. // Nat Genet. 1993. Sep;5(l):56-61
30. Binet JL. Prognostic factors in chronic lymphocytic leukaemia. // Haematologica. 1999. Jun;84 Suppl EHA-4:96-7.
31. Bouyge-Moreau I., Rondeau G., Avet-Loiseau H . Construction of a 780-kb РАС, ВАС, and cosmid contig encompassing the minimal critical deletion involved in В cell chronic lymphocytic leukemia at 13ql4.3 //Genomics. 1997. Vol. 46. P. 183-190.
32. Boxer LM, Dang CV. Translocations involving c-myc and c-myc function. //Oncogene. 2001. Sep 10;20(40):5595-610
33. Breckenridge DG, Germain M, Mathai JP, Nguyen M, Shore GC. Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways. // Oncogene. 2003. Nov 24;22(53):8608-18.
34. Bross L, Fukita Y, McBlane F, Demolliere C, Rajewsky K, Jacobs H. DNA double-strand breaks in immunoglobulin genes undergoing somatic hypermutation. //Immunity. 2000. Nov;13(5):589-97.
35. Brown A. G., Ross F. M., Dunne E. M. . Evidence for a new tumour suppressor locus (DBM) in human B-cell neoplasia telomeric to the retinoblastoma gene. // Nature Genet., 1993. Vol. 3. - P. 67-72.
36. Bullrich F, Rasio D, Kitada S, Starostik P, Kipps T, Keating M, Albitar M, Reed JC, Croce CM. ATM mutations in B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Cancer Res. 1999. Jan l;59(l):24-7.
37. Bullrich F, Veronese ML, Kitada S, Jurlander J, Caligiuri MA, Reed JC, Croce CM. // Minimal region of loss at 13ql4 in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1996. Oct 15;88(8):3109-15.
38. Burg G, Kempf W, Haeffher A, Dobbeling U, Nestle FO, Boni R, Kadin M, Dummer R. // From inflammation to neoplasia: new concepts in the pathogenesis of cutaneous lymphomas. Recent Results Cancer Res. 2002.; 160:271-80
39. Caligaris-Cappio F, Hamblin TJ. B-cell chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather. // J Clin Oncol. 1999. Jan;17(l):399-408.
40. Campo E, Raffeld M, Jaffe ES. Mantle cell lymphoma. // Semin Hematol. 1999. Apr;36(2):l 15-27.
41. Cao J, Cai X. Characterization of colorectal-cancer-related cDNA clones obtained by subtractive hybridization screening. // J Cancer Res Clin Oncol 123(8): 447-51.
42. Capello D, Carbone A, Pastore C, Gloghini A, Saglio G, Gaidano G. Point mutations of the BCL-6 gene in Burkitt's lymphoma. // Br J Haematol. 1997. Oct;99(l): 168-70.
43. Cario G, Stadt UZ, Reiter A, Welte K, Sykora KW. Variant translocations in sporadic Burkitt's lymphoma detected in fresh tumour material: analysis of three cases. // Br J Haematol. 2000. Sep;l 10(3):537-46.
44. Cesarman E, Dalla-Favera R, Bentley D, Groudine M. Mutations in the first exon are associated with altered transcription of c-myc in Burkitt lymphoma. // Science. 1987. Nov 27;238(4831): 1272-5.
45. Cesarman E. Epstein-Barr virus (EBV) and lymphomagenesis. // Front Biosci. 2002. Feb l;7:e58-65.
46. Chang M.C., Khanna R., Schlichter L.C. Regulation of Kvl.3 channels in activated human T lymphocytes by Ca(2+)-dependent pathways. // Cell Physiol Biochem, 2001. Vol. 11 - P. 123-34.
47. Chen B, Campos EI, Crawford R, Martinka M, Li G. Analyses of the tumour suppressor ING1 expression and gene mutation in human basal cell carcinoma. // Int J Oncol. 2003. Apr;22(4):927-31.
48. Chen L, Matsubara N, Yoshino T, Nagasaka T, Hoshizima N,
49. Shirakawa Y, Naomoto Y, Isozaki H, Riabowol K, Tanaka N. Genetic alterations of candidate tumor suppressor ING1 in human esophageal squamous cell cancer. // Cancer Res. 2001. Jun 1;61(11):4345-9.
50. Chen, S. J., Z. Chen Are most secondary acute lymphoblastic leukemias mixed acute leukemias? // Nouv Rev Fr Hematol 1999. 31(1): 17-22.
51. Cher M L, MacGrogan D. Comparative genomic hybridization, allelic imbalance, and fluorescence in situ hybridization on chromosome 8 in prostate cancer. 1999. Genes Chromosomes Cancer 11(3): 153-62.
52. Cher M L., Bova GS.Genetic alterations in untreated metastases and androgen-independent prostate cancer detected by comparative genomic hybridization and allelotyping. // Cancer Res 1996. 56(13): 3091-102.
53. Chesi M, Bergsagel PL, Shonukan OO, Martelli ML, Brents LA, Chen T, Schrock E, Ried T, Kuehl WM. Frequent dysregulation of the c-maf proto-oncogene at 16q23 by translocation to an Ig locus in multiple myeloma. //Blood. 1998. Jun 15;91(12):4457-63.
54. Chung I., Schlichter L.C. Native Kvl.3 channels are upregulated by protein kinase C. // J Membr Biol, 1997. Vol. 156 - P. 73-85.
55. Cole MD, McMahon SB. The Мус oncoprotein: a critical evaluation of transactivation and target gene regulation. // Oncogene. 1999. May 13;18(19):2916-24.
56. Coleman WB and Tsongalis GJ. The Molecular Basis of Human Cancer. // Humana Press; 1st edition; 2001.
57. Cong P, Raffeld M, Teruya-Feldstein J, Sorbara L, Pittaluga S, Jaffe ES. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. // Blood. 2002. May 1;99(9):3376-82.
58. Coqueret O. New roles for p21 and p27 cell-cycle inhibitors: a function for each cell compartment? // Trends Cell Biol. 2003. Feb;13(2):65-70.
59. Corcoran MM, Rasool O, Liu Y, Iyengar A, Grander D, Ibbotson RE,
60. De Rienzo A. Jhanwar SC. Loss of heterozygosity analysis of 13q and 14q in human malignant mesothelioma. // Genes Chromosomes Cancer 2000.; 28(3): 337-41.
61. Deb SP. Cell Cycle Regulatory Functions of the Human Oncoprotein MDM2.// Mol Cancer Res. 2003. Dec;l(14):1009-16.
62. Denny CT, Hollis GF, Magrath IT, Kirsch IR. Burkitt lymphoma cell line carrying a variant translocation creates new DNA at the breakpoint and violates the hierarchy of immunoglobulin gene rearrangement. // Mol Cell Biol. 1985 Nov;5(l 1):3199-207.
63. Dent AL, Vasanwala FH, Toney LM. Regulation of gene expression by the proto-oncogene BCL-6. // Crit Rev Oncol Hematol. 2002. Jan;41(l):l-9.
64. Devilder M. C., Francois S., Bosic C. . Deletion cartography around the D13S25 locus in B-cell chronic lymphocytic leukemia and accurate mapping of the involved tumor supressor gene. // Cancer Res. 1995. Vol. 55. P. 1355-1357.
65. Dighiero G. Biology of the neoplastic lymphocyte in B-CLL. // Baillieres Clin Haematol. 1993. Dec;6(4):807-20.
66. Dolken G, Illerhaus G, Hirt C, Mertelsmann R. BCL-2/JH-rearrangements in circulating В cells of healthy blood donors and patients with nonmalignant diseases. // J Clin Oncol. 1996.;14:1333-1344
67. Dolken L, Schuler F, Dolken G. Frequency of BCL-2/J(H) translocation in healthy males exposed to low-level radiation in comparison to age-matched health controls. // Blood. 2002. Aug 15; 100(4): 1513-4.
68. Du M, Peng H, Singh N, Isaacson PG, Pan L. The accumulation of p53 abnormalities is associated with progression of mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma. //Blood 1995.; 86: 4587.
69. Durandy A. Activation-induced cytidine deaminase: a dual role in class-switch recombination and somatic hypermutation. // Eur J Immunol. 2003. Aug;33(8):2069-73.
70. Eilers M. Control of cell proliferation by Мус family genes. // Mol Cells. 1999. Feb 28;9(l):l-6.
71. E1-Deiry W. and Melton M.S. Tumor Suppressor Genes: Pathways and Isolation Strategies. // Humana Press; 2003.
72. Elnenaei MO, Hamoudi RA, Swansbury J, Gruszka-Westwood AM, Brito-Babapulle V, Matutes E, Catovsky D. Delineation of theminimal region of loss at 13ql4 in multiple myeloma. 11 Genes Chromosomes Cancer. 2003. Jan; 36(1): 99-106.
73. Eshleman JR, Markowitz SD. Microsatellite instability in inherited and sporadic neoplasms. // Curr Opin Oncol. 1995. Jan;7(l):83-9. Review.
74. Fischer M, Klein U, Kuppers R. Molecular single-cell analysis reveals that CD5-positive peripheral blood В cells in healthy humans are characterized by rearranged Vkappa genes lacking somatic mutation. // J Clin Invest. 1997. Oct 1; 100(7): 1667-76.
75. Fitchett M., Griffiths M. J., Oscier D. G. . Chromosome abnormalities involving band 13ql4 in hematologic malignancies. // Cancer Genet. Cytogenet, 1987. Vol. 24 - P. 143-150.
76. Fleury C, Mignotte B, Vayssiere JL. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. // Biochimie. 2002. Feb-Mar;84(2-3):131-41
77. Fugmann SD, Lee Al, Shockett PE, Villey IJ, Schatz DG. The RAG proteins and V(D)J recombination: complexes, ends, and transposition. // Annu Rev Immunol. 2000.; 18:495-527. Review.
78. Furstenthal L, Swanson C, Kaiser BK, Eldridge AG, Jackson PK. Triggering ubiquitination of a CDK inhibitor at origins of DNA replication. //Nat Cell Biol. 2001. Aug;3(8):715-22.
79. Gabrea A, Bergsagel PL, Chesi M, Shou Y, Kuehl WM. Insertion of excised IgH switch sequences causes overexpression of cyclin D1 in a myeloma tumor cell. // Mol Cell. 1999. Jan;3(l): 119-23.
80. Gaidano G, Hauptschein RS, Parsa NZ, Offit K, Rao PH, Lenoir G, Knowles DM, Chaganti RS, Dalla-Favera R. Deletions involving two distinct regions of 6q in B-cell non-Hodgkin lymphoma. // Blood. 1992. Oct l;80(7):1781-7.
81. Gamberi B, Gaidano G, Parsa N, Carbone A, Roncella S, Knowles DM, Louie DC, Shibata D, Chaganti RS, Dalla-Favera R. // Microsatellite instability is rare in B-cell non-Hodgkin's lymphomas. Blood. 1997. Feb l;89(3):975-9.
82. Garkavtsev I., Demetrick D., Riabowol K. Cellular localization and chromosome mapping of a novel candidate tumor suppressor gene (ING1). // Cytogenet. Cell. Genet. 1997. V. 76 P. 176-178.
83. Garkavtsev I., Grigorian I.A., Ossovskaya V.S., Chernov M.V., Chumakov P.M., Gudkov A.V. The candidate tumour suppressor p33INGl cooperates with p53 in cell growth control. // Nature. 1998. V. 391 P. 295-298.
84. Garkavtsev I., Kazarov A., Gudkov A., Riabowol, K. Suppression ofthe novel growth inhibitor p33INGl promotes neoplastic transformation. //Nature Genet. 1996. V. 14. P. 415-420.
85. Garkavtsev I., Riabowol K. Extension of the replicative life span of human diploid fibroblasts by inhibition of the p33INGl candidate tumor suppressor. //Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 2014-2019.
86. Ghia P, Prato G, Scielzo C, Stella S, Geuna M, Guida G, Caligaris-Cappio F. Monoclonal CD5+ and CD5- В lymphocyte expansions are frequent in the peripheral blood of the elderly. // Blood. 2003. Nov 20 Epub ahead of print.
87. Gordon MS, Kanegai CM, Doerr JR, Wall R. Somatic hypermutation of the В cell receptor genes B29 (Igbeta, CD79b) and mbl (Igalpha, CD79a). // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. Apr 1; 100(7):4126-31.
88. Gronbaek K, Straten PT, Ralfkiaer E, Ahrenkiel V, Andersen MK, Hansen NE, Zeuthen J, Hou-Jensen K, Guldberg P. Somatic Fas mutations in non-Hodgkin's lymphoma: association with extranodal disease and autoimmunity. // Blood. 1998. Nov 1;92(9):3018-24.
89. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig VH genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. // Blood. 1999.;94:1848-1854
90. Han S, Dillon SR, Zheng B, Shimoda M, Schlissel MS, Kelsoe G. V(D)J recombinase activity in a subset of germinal center В lymphocytes. // Science. 1997. Oct 10;278(5336):301-5.
91. Hashimoto T, Takishita M, Kosaka M, Sano T, Matsumoto T. Superantigens and autoantigens may be involved in the pathogenesisof gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma. // Int J Hematol. 2001. Aug; 74(2): 197-204.
92. Hecht JL, Aster JC. Molecular biology of Burkitt's lymphoma. // J Clin Oncol. 2000. Nov 1;18(21):3707-21.
93. Helbing C.C., Veillette C., Riabowol K., Johnston R.N., Garkavtsev I. //CancerRes. 1997. V. 57. P. 1255-1258.
94. Hiom K, Melek M, Gellert M. DNA transposition by the RAG1 and RAG2 proteins: a possible source of oncogenic translocations. // Cell. 1998. Aug 21 ;94(4):463-70.
95. Hoang AT, Lutterbach B, Lewis ВС, Yano T, Chou TY, Barrett JF, Raffeld M, Hann SR, Dang CV. A link between increased transforming activity of lymphoma-derived MYC mutant alleles, their defective regulation by pi07, and altered phosphorylation of the c
96. Мус transactivation domain. // Mol Cell Biol. 1995. Aug;15(8):4031-42.
97. Houldsworth J, Mathew S, Rao PH, Dyomina K, Louie DC, Parsa N, Offit K, Chaganti RS. REL proto-oncogene is requently amplified in extranodal diffuse large cell lymphoma. // Blood. 1996. Jan l;87(l):25-9.
98. Houldsworth J, Mathew S, Rao PH, Dyomina K, Louie DC, Parsa N, Offit K, Chaganti RS. REL proto-oncogene is frequently amplified in extranodal diffuse large cell lymphoma. // Blood. 1996. Jan l;87(l):25-9.
99. Ни ВТ, Lee SC, Marin E, Ryan DH, and Insel RA. 1997. Telomerase is up-regulated in human germinal center В cells in vivo and can be re-expressed in memory В cells activated in vitro. // J. Immunol. 159:1068-71.
100. Hughes JA, Weckert HA, van Hoist Pellekaan C, Benson EM, Dunn IS. Translocations into human chromosome 14 JH region: factors influencing downstream abortive immunoglobulin class switching. // Mol Immunol. 2003. Dec;40(9):573-83.
101. Irsch J, Irlenbusch S, Radl J, Burrows PD, Cooper MD, Radbruch AH. Switch recombination in normal IgAl+ В lymphocytes. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. Feb 15;91(4):1323-7.
102. Isaacson PG. Gastric MALT lymphoma: from concept to cure. // Ann Oncol. 1999. Jun; 10(6): 637-45.
103. Ishibe N, Goldin LR, Caporaso NE, Sgambati MT, Dean M, Albitar M, Manshouri T, Gerrard B, Marti GE. ATM mutations and protein expression are not associated with familial B-CLL cases. // Leuk Res. 2003. Oct;27(10):973-5.
104. Jaeger U, Karth GD, Knapp S, Friedl J, Laczika K, Kusec R. Molecular mechanism of the t(14;18)~a model for lymphoid-specific chromosomal translocations. // Leuk Lymphoma. 1994. Jul; 14(3-4): 197-202. Review.
105. Jaeger U, Purtscher B, Karth GD, Knapp S, Mannhalter C, Lechner K. Mechanism of the chromosomal translocation t(14;18) in lymphoma: detection of a 45-Kd breakpoint binding protein. // Blood. 1993. Apr 1;81(7): 1833-40.
106. Janeway C., Travers P., Walport M., Shlomchik M. Immunobiology // Garland Publishing, New York, 2001.
107. Jelinek DF, Tschumper RC, Stolovitzky GA, Iturria SJ, Tu Y, Lepre J, Shah N, Kay NE. Identification of a global gene expression signature of B-chronic lymphocytic leukemia. // Mol Cancer Res. 2003. Mar;l(5):346-61.
108. Johnson ТА, Rassenti LZ, Kipps TJ. Ig VH1 genes expressed in B-cell chronic lymphocytic leukemia exhibit distinctive molecular features. // J Immunol. 1997.; 158:235-246.
109. Juliusson G., Oscier D., Gahrton G. Cytogenetic findings and survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia.Second IWCCLL compiliation of data on 662 patients. // Leukemia Lymphoma, 1991. Suppl. 21-25.
110. Kawasaki С, Ohshim К, Suzumiya J, Kanda M, Tsuchiya T, Tamura K, Kikuchi M. Rearrangements of bcl-1, bcl-2, bcl-6, and c-myc in diffuse large B-cell lymphomas. // Leuk Lymphoma. 2001. Sep-Oct; 42(5): 1099-106.
111. Keating M, Chiorazzi N, Messmer B, Damle R, Allen S, Rai K, Ferrarini M, Kipps T. Biology and Treatment of Chronic Lymphocytic Leukemia. Hematology // Am Soc Hematol Educ Programm 2003.:153-175.
112. Kepler, T. and Perelson, A. (1993.). Cyclic re-entry of germinal center В cells and the efficiency of affinity maturation. // Immunol.Today 14:412-415
113. Kipps TJ, Tomhave E, Pratt LF, Duffy S, Chen PP, Carson DA. Developmentally restricted VH gene expressed at high frequency in chronic lymphocytic leukemia. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989.;86:5913-5917.
114. Klein U, Kuppers R, Rajewsky K. Evidence for a large compartment of IgM-expressing memory В cells in humans. // Blood. 1997. Feb 15;89(4):1288-98.
115. Knodel M, Kuss AW, Berberich I, Schimpl A. Blimp-1 over-expression abrogates IL-4- and CD40-mediated suppression of terminal В cell differentiation but arrests isotype switching. // Eur J Immunol. 2001. Jul;31(7):1972-80.
116. Knudson, A. G., Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1971. 68(4): 820-3.
117. Konigsberg R, Ackermann J. Deletions of chromosome 13q in monoclonal gammopathy of undetermined significance." // Leukemia 2000. 14(11): 1975-9.
118. Krober A, Seiler T, Benner A, . V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. //Blood. 2002.;100:1410-1416.
119. Kruetzmann S, Rosado MM, Weber H, Germing U, Tournilhac O, Peter HH, Berner R, Peters A, Boehm T, Plebani A, Quinti I, Carsetti R. Human immunoglobulin M memory В cells controlling
120. Streptococcus pneumoniae infections are generated in the spleen. // J Exp Med. 2003. Apr 7;197(7):939-45.
121. Kiippers R, Klein U, Hansmann M, Rajewsky K. Cellular origin of human B-cell lymphomas // N Engl J Med. 1999. Nov 11;341(20): 1520-9. Review.
122. Kuppers R, Schwering I, Brauninger A, Rajewsky K, Hansmann M. Biology of Hodgkin's lymphoma. Biology of Hodgkin's lymphoma. // Ann Oncol. 2002.; 13 Suppl 1:11-8. Review.
123. Lam KP, Ktihn R, Rajewsky K. In vivo ablation of surface immunoglobulin on mature В cells by inducible gene targeting results in rapid cell death. // Cell 1997.;90:1073-1083.
124. Landowski TH, Qu N, Buyuksal I, Painter JS, Dalton WS. Mutations in the Fas antigen in patients with multiple myeloma. // Blood. 1997. Dec l;90(ll):4266-70.
125. Li YS, Hayakawa K, Hardy RR. The regulated expression of В lineage associated genes during В cell differentiation in bone marrow and fetal liver. // J Exp Med. 1993. Sep l;178(3):951-60.
126. Liggett WH Jr, Sidransky D. Role of the pi 6 tumor suppressor gene in cancer. //J Clin Oncol. 1998. Mar; 16(3): 1197-206. Review.
127. Limpens J, de Jong D, van Krieken JH, Price CG, Young BD, van Ommen GJ, Kluin PM. Bcl-2/JH rearrangements in benign lymphoid tissues with follicular, hyperplasia. // Oncogene. 1991. Dec;6(12):2271-6.
128. Lin К, Sherrington PD, Dennis M, Matrai Z, Cawley JC, Pettitt AR. Relationship between p53 dysfunction, CD38 expression, and IgV(H) mutation in chronic lymphocytic leukemia. // Blood. 2002.; 100:14041409.
129. Lin KI, Angelin-Duclos C, Kuo TC, Calame K. Blimp-1-dependent repression of Pax-5 is required for differentiation of В cells to immunoglobulin M-secreting plasma cells. // Mol Cell Biol. 2002. Jul; 22(13): 4771-80.
130. Lindstrom MS, Wiman KG. Role of genetic and epigenetic changes in Burkitt lymphoma. // Semin Cancer Biol. 2002. Oct;12(5):381-7.
131. Lindstrom MS, Wiman KG. Role of genetic and epigenetic changes in Burkitt lymphoma. // Semin Cancer Biol. 2002. Oct;12(5):381-7.
132. Liu Y, Hernandez AM, Shibata D, Cortopassi GA. BCL2 translocation frequency rises with age in humans. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994.; 91:8910-8914л
133. Liu Y., Grander D., Soderhall S. . Retinoblastoma gene deletions in B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Genes Chrom. Cancer, 1992. -Vol. 4.-P. 250-256.
134. Liu Y., Hermanson M., Grander D. et al 13q deletions in lymphoicd malignancies. //Blood, 1995. Vol. 86 P. 1911-1915.
135. Liu Y., Szekely L., Grander D. . Chronic lymphocytic leukemia cells with allelic deletions at 13ql4 commonly have one intact RBI gene: Evidence for a role of an adjacent locus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. -Vol. 90 P. 8697-8701.
136. Lossos IS, Okada CY, Tibshirani R, Warnke R, Vose JM, Greiner TC, Levy R. Molecular analysis of immunoglobulin genes in diffuse large B-cell lymphomas. //Blood. 2000. Mar 1;95(5): 1797-803
137. Luscher B. Function and regulation of the transcription factors of the Myc/Max/Mad network. // Gene. 2001. Oct 17;277(1-2):1-14.
138. MacLennan I. Immunology. The centre of hypermutation. // Nature. 1991. Dec 5;354(6352):352-3.
139. Maes B, Baens M, Marynen P, De Wolf-Peeters C. The product of the t(ll;18), an API2-MLT fusion, is an almost exclusive finding in marginal zone cell lymphoma of extranodal MALT-type. // Ann Oncol. 2000. May; 11(5): 521-6.
140. Maestro, R, Piccinin S. Chromosome 13q deletion mapping in head and neck squamous cell carcinomas: identification of two distinct regions of preferential loss. // Cancer Res 1996. 56(5): 1146-50.
141. Maizels N. Immunoglobulin class switch recombination: will genetics provide new clues to mechanism? // Am J Hum Genet. 1999. May;64(5): 1270-5. Review.
142. Marculescu R, Le T, Bocskor S, Mitterbauer G, Chott A, Mannhalter C, Jaeger U, Nadel B. Alternative end-joining in follicular lymphomas' t(14;18) translocation. // Leukemia. 2002. Jan;16(l):120-6
143. Martin A, Li Z, Lin DP, Bardwell PD, Iglesias-Ussel MD, Edelmann W, Scharff MD. Msh2 ATPase activity is essential for somatichypermutation at a-T basepairs and for efficient class switch recombination. I IJ Exp Med. 2003. Oct 20; 198(8): 1171-8.
144. Martinou JC, Green DR. Breaking the mitochondrial barrier. I I Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. Jan;2(l):63-7.
145. McDonnell TJ, Deane N, Piatt FM, Nunez G, Jaeger U, McKearn JP, Korsmeyer SJ. bcl-2-immunoglobulin transgenic mice demonstrate extended В cell survival and follicular lymphoproliferation. // Cell. 1989. Apr 7;57(l):79-88.
146. Migliazza A, Martinotti S, Chen W, Fusco C, Ye BH, Knowles DM, Offit K, Chaganti RS, Dalla-Favera R. Frequent somatic hypermutation of the 5' noncoding region of the BCL6 gene in B-cell lymphoma. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Dec 19;92(26): 125204.
147. Mitelman F, Mertens F, Johansson B. A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia. // Nat Genet. 1997. Apr; 15 Spec No:417-74.
148. Mitelman F, Mertens F, Johansson B. A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia. // Nat Genet. 1997. Apr; 15 Spec No:417-74.,
149. Mitelman F. Restricted number of chromosomal regions implicated in etiology of human cancer and leukemia. //Nature 310:325, 1984
150. Momand J, Jung D, Wilczynski S, Niland J. The MDM2 gene amplification database. // Nucleic Acids Res. 1998. Aug l;26(15):3453-9.
151. Morin GB. 1989. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. // Cell 59:52129.
152. Murray PG, Young LS. Epstein-Barr virus infection: basis of malignancy and potential for therapy. 11 Expert Rev Mol Med. 2001. Nov 15;3:l-20.
153. Muschen M, Re D, Jungnickel B, Diehl V, Rajewsky K, Kuppers R. Somatic mutation of the CD95 gene in human В cells as a side-effect of the germinal center reaction. H /J Exp Med. 2000. Dec 18; 192( 12): 1833-40.
154. Nakamura T, Inagaki H, Seto M, Nakamura S. Gastric low-grade B-cell MALT lymphoma: treatment, response, and genetic alteration. // J Gastroenterol. 2003.; 38(10): 921-9.
155. Nasi S, Ciarapica R, Jucker R, Rosati J, Soucek L. Making decisions through Мус. H FEBS Lett. 2001. Feb 16;490(3): 153-62.
156. Nay lor M, Capra JD. Mutational status of Ig V(H) genes provides clinically valuable information in B-cell chronic lymphocytic leukemia. //Blood. 1999.;94:1837-1839.
157. Neri A, Knowles DM, Greco A, McCormick F, Dalla-Favera R. Analysis of RAS oncogene mutations in human lymphoid malignancies. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. Dec;85(23):9268-72.
158. Niu H. The proto-oncogene BCL-6 in normal and malignant В cell development. // Hematol Oncol. 2002. Dec;20(4): 155-66.
159. Norrback KF, Hultdin M, Dahlenborg K, Osterman P, Carlsson R, Roos G. Telomerase regulation and telomere dynamics in germinal centers. //Eur. J. Haematol. 67:309-17)
160. Notidis E, Hande S, Manser T. Enforced expression of Bcl-2 selectively perturbs negative selection of dual reactive antibodies. // Dev Immunol. 2001.;8(3-4):223-34.
161. Nunez G, Hockenbery D, McDonnell TJ, Sorensen CM, Korsmeyer SJ. Bcl-2 maintains В cell memory. // Nature. 1991. Sep 5;353(6339):71-3.
162. Nussenzweig MC. Immune receptor editing: revise and select. // Cell 1998.;95:875-878.
163. Oertel SH, Riess H. Immunosurveillance, immunodeficiency and lymphoproliferations. // Recent Results Cancer Res. 2002.;159:l-8.
164. Oeschger S, Brauninger A, Kuppers R, Hansmann ML. Tumor cell dissemination in follicular lymphoma. // Blood. 2002. Mar 15;99(6):2192-8.
165. Offit K, Wong G, Filippa DA, Tao Y, Chaganti RS. Cytogenetic analysis of 434 consecutively ascertained specimens of non-Hodgkin's lymphoma: clinical correlations. //Blood. 1991. Apr 1;77(7): 1508-15.
166. Oscier DG, Gardiner AC, Mould SJ, . Multivariate analysis of prognostic factors in CLL: clinical stage, IGVH gene mutational status, and loss or mutation of the p53 gene are independent prognostic factors. // Blood. 2002.; 100:1177-1184.
167. Papavasiliou F, Casellas R, Suh H, Qin XF, Besmer E, Pelanda R, Nemazee D, Rajewsky K, Nussenzweig MC. V(D)J recombination in mature В cells: a mechanism for altering antibody responses. // Science. 1997. Oct 10;278(5336):298-301.
168. Papavasiliou FN, Schatz DG. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. // Nature. 2000. Nov 9;408(6809):216-21.
169. Parsa NZ, Gaidano G, Mukherjee AB, Hauptschein RS, Lenoir G, Dalla-Favera R, Chaganti RS. Cytogenetic and molecular analysis of 6q deletions in Burkitt's lymphoma cell lines. // Genes Chromosomes Cancer. 1994. Jan;9(l):13-8.
170. Pasqualucci L, Neumeister P, Goossens T, Nanjangud G, Chaganti RS, Kuppers R, Dalla-Favera R. Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas. //Nature. 2001. Jul 19;412(6844):341-6.
171. Pei, L., S. Melmed Frequent loss of heterozygosity at the retinoblastoma susceptibility gene (RB) locus in aggressive pituitarytumors: evidence for a chromosome 13 tumor suppressor gene other than RB. // Cancer Res 1995. 55(8): 1613-6.
172. Peng H, Diss T, Isaacson PG, Pan L. c-myc gene abnormalities in mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphomas. // J Pathol. 1997. Apr; 181(4): 381-6.
173. Peng HZ, Du MQ, Koulis A, Aiello A, Dogan A, Pan LX, Isaacson PG. Nonimmunoglobulin gene hypermutation in germinal center В cells. //Blood. 1999. Apr l;93(7):2167-72.
174. Pittman S, Russell PJ. Flow cytometric and karyotypic analysis of a primary small cell carcinoma of the prostate: a xenografted cell line. // Cancer Genet Cytogenet. 1987.26(1): 165-9.
175. Prapapanich V., Chen S. Mutational analysis of the hsp70-interacting protein Hip. // Mol Cell Biol 1996. 16(11): 6200-7.
176. Rada С, Williams GT, Nilsen H, Barnes DE, Lindahl T, Neuberger MS. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. // Curr Biol. 2002. Oct 15;12(20):1748-55.
177. Rajewsky K. Clonal selection and learning in the antibody system. // Nature 1996.;381:751-758.
178. Rooney S, Alt FW, Lombard D, Whitlow S, Eckersdorff M, Fleming J, Fugmann S, Ferguson DO, Schatz DG, Sekiguchi J. Defective DNA repair and increased genomic instability in Artemis-deficient murine cells. // J Exp Med. 2003. Mar 3;197(5):553-65.
179. Rothe M, Pan MG, Henzel WJ, Ayres TM, Goeddel DV. The TNFR2-TRAF signaling complex contains two novel proteins related to baculoviral inhibitor of apoptosis proteins. // Cell. 1995. Dec 29; 83(7): 1243-52.
180. Rudner J, Jendrossek V, Belka C. New insights in the role of Bcl-2 Bcl-2 and the endoplasmic reticulum. // Apoptosis. 2002. Oct;7(5):441-7.
181. Rufer N, Dragowska W, Thornbury G, Roosnek E, and Lansdorp PM. 1998. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. // Nat. Biotechnol. 16:743-47.
182. Schaffner C, Stilgenbauer S, Rappold GA, Dohner H, Lichter P. Somatic ATM mutations indicate a pathogenic role of ATM in B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Blood. 1999. Jul 15;94(2):748-53.
183. Schlissel MS. Does artemis end the hunt for the hairpin-opening activity in V(D)J recombination? // Cell. 2002. Apr 5;109(l):l-4
184. Schuler F, Hirt C, Dolken G. Chromosomal translocation t(14;18) in healthy individuals. // Semin Cancer Biol. 2003. Jun;13(3):203-9
185. Scorrano L, Korsmeyer SJ. Mechanisms of cytochrome с release by proapoptotic BCL-2 family members. // Biochem Biophys Res Commun. 2003. May 9;304(3):437-44
186. Shaffer AL, Rosenwald A, Staudt LM. Lymphoid malignancies: the dark side of B-cell differentiation. // Nat Rev Immunol. 2002. Dec;2(12):920-32.
187. Shaffer AL, Yu X, He Y, Boldrick J, Chan EP, Staudt LM. BCL-6 represses genes that function in lymphocyte differentiation, inflammation, and cell cycle control. // Immunity. 2000. Aug; 13(2): 199-212.
188. Shen HM, Peters A, Baron B, Zhu X, Storb U. Mutation of BCL-6 gene in normal В cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. // Science. 1998. Jun 12;280(5370): 1750-2.
189. Shimada Y., Saito A., Suzuki E., Takahashi E., Horie M. Cloning of a novel gene (ING1L) homologous to INGI, a candidate tumor suppressor. // Cytogenet Cell. Genet. 1998. V. 83, P. 232-235.
190. Skryma R.N., Prevarskaya N.B., Dufy-Barbe L., Odessa M.F., Audin J., Dufy B. Potassium conductance in the androgen-sensitive prostate cancer cell line, LNCaP: involvement in cell proliferation. // Prostate, 1997.-Vol. 33-P. 112-22.
191. Sparano JA. Human immunodeficiency virus associated lymphoma. // Curr Opin Oncol. 2003. Sep;15(5):372-8
192. Stacey DW. Cyclin D1 serves as a cell cycle regulatory switch in actively proliferating cells. // Curr Opin Cell Biol. 2003. Apr; 15(2): 158-63.
193. Stankovic T, Weber P, Stewart G, Bedenham T, Murray J, Byrd PJ, Moss PA, Taylor AM. Inactivation of ataxia telangiectasia mutatedgene in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. // Lancet. 1999. Jan 2;353(9146):26-9.
194. Staudt LM, Dent AL, Shaffer AL, Yu X. Regulation of lymphocyte cell fate decisions and lymphomagenesis by BCL-6. // Int Rev Immunol. 999; 18(4):3 81-403.
195. Stilgenbauer S, Bullinger L, Lichter P Dohner H and the German CLL Study Group (GCLLSG). Genetics of chronic lymphocytic leukemia: genomic aberrations and VH gene mutation status in pathogenesis and clinical course. // Leukemia. 2002. 16, 993-1007
196. Stilgenbauer S, Bullinger L, Lichter P, Dohner H. Genetics of chronic lymphocytic leukemia: genomic aberrations and V(H) gene mutation status in pathogenesis and clinical course. // Leukemia. 2002.; 16:9931007.
197. Stilgenbauer S., Leupolt E., Ohl S. . Heterogeneity of deletions involving RB-land the D13S25 locus in B-cell chronic lymphocytic leukemia revealed by fluorescence in situ hybridization. // Cancer Res, 1995.-Vol. 55-P. 3475-3477.
198. Stilgenbauer, SJ, Nickolenko J. Expressed sequences as candidates for a novel tumor suppressor gene at band 13ql4 in B-cell chroniclymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma. // Oncogene. 1998. 16(14): 1891-7.
199. Stoppa-Lyonnet D, Soulier J, Lauge A, Dastot H, Garand R, Sigaux F, Stern MH. Inactivation of the ATM gene in T-cell prolymphocyte leukemias. //Blood. 1998. May 15;91(10):3920-6.
200. Swinnen L.J. Transplantation-related lymphoproliferative disorder: a model for human immunodeficiency virus-related lymphomas. // Semin Oncol. 2000. Aug;27(4):402-8.
201. Takada K. Role of Epstein-Barr virus in Burkitt's lymphoma. // Curr Top Microbiol Immunol. 2001.;258:141-51.
202. Takakuwa T, Dong Z, Takayama H, Matsuzuka F, Nagata S, Aozasa K. Frequent mutations of Fas gene in thyroid lymphoma. // Cancer Res. 2001. Feb 15;61(4):1382-5.
203. Tamura K, Zhang X. Deletion of three distinct regions on chromosome 13q in human non-small- cell lung cancer." // Int J Cancer. 1997. 74(1): 45-9.
204. Tanaka S, Louie DC, Kant JA, Reed JC. Frequent incidence of somatic mutations in translocated BCL2 oncogenes of non-Hodgkin's lymphomas. // Blood. 1992. Jan l;79(l):229-37.
205. Thieblemont C, de la Fouchardiere A, Coiffier B. Nongastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas. // Clin Lymphoma. 2003. Mar; 3(4): 212-24.
206. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. // Nature. 1983 Apr 14;302(5909):575-81. Review.
207. Tong W, Pollard JW. Genetic evidence for the interactions of cyclin D1 and p27(Kipl) in mice. // Mol Cell Biol. 2001. Feb;21(4): 1319-28.
208. Torino M, Tari AM, McDonnell TJ, Cabanillas F, Garcia-Conde J, Lopez-Berestein G. Apoptotic induction in transformed follicular lymphoma cells by Bcl-2 downregulation. // Leuk Lymphoma. 1998. Jul;30(3-4):367-79.
209. Tsai CL, Chatterji M, Schatz DG. DNA mismatches and GC-rich motifs target transposition by the RAG1/RAG2 transposase. // Nucleic Acids Res. 2003. Nov l;31(21):6180-90.
210. Tsujimoto Y, Louie E, Bashir MM, Croce CM. The reciprocal partners of both the t(14; 18) and the t(l 1; 14) translocations involved in B-cell neoplasms are rearranged by the same mechanism. // Oncogene. 1988. Apr;2(4):347-51.
211. Van Krieken JH, Kluin PM. The association of c-myc rearrangements with specific types of human non-Hodgkin's lymphomas. // Leuk Lymphoma. 1992. Aug;7(5-6):371-6.
212. Viardot A, Barth TF, Moller P, Dohner H, Bentz M. Cytogenetic evolution of follicular lymphoma. // Semin Cancer Biol. 2003. Jun; 13(3): 183-90
213. Vogel F. Genetics of retinoblastoma // Hum Genet 1987. 52(1): 1-54.
214. Vogelstein B, Kinzler KW. The Genetic Basis of Human Cancer. // McGraw-Hill Professional; 2nd edition (March 19, 2002.).
215. Wada T, Louhelainen J. Bladder cancer: allelic deletions at and around the retinoblastoma tumor suppressor gene in relation to stage and grade // Clin Cancer Res 2000. 6(2): 610-5.
216. Wagner M, Rose VA, binder R, Schulze HJ, Krueger GR Human pathogenic virus-associated pseudolymphomas and lymphomas with primary cutaneous manifestation in humans and animals. // Clin Infect Dis. 1998. Nov;27(5): 1299-308.
217. Watanabe T, Hotta T, Ichikawa A, Kinoshita T, Nagai H, Uchida T, Murate T, Saito H. The MDM2 oncogene overexpression in chronic lymphocytic leukemia and low-grade lymphoma of B-cell origin. // Blood. 1994. Nov 1;84(9):3158-65.
218. Watanabe T, Ichikawa A, Saito H, Hotta T. Overexpression of the MDM2 oncogene in leukemia and lymphoma. // Leuk Lymphoma. 1996. May;21(5-6):391-7
219. Weng NP, Granger L, and Hodes RJ. 1997. Telomere lengthening and telomerase activation during human В cell differentiation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10827-32.
220. Westphal CH. Cell-cycle signaling: Atm displays its many talents. // Curr Biol. 1997. Dec l;7(12):R789-92. Review.
221. Wotherspoon AC, Doglioni C, Diss TC, . Regression of primary low-grade B-cell gastric lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue after eradication of Helicobacter pylori.// Lancet 1993.;342:575-577.
222. Wyatt RT, Rudders RA, Zelenetz A, Delellis RA, Krontiris TG. BCL2 oncogene translocation is mediated by a chi-like consensus. // J Exp Med. 1992. Jun 1; 175(6): 1575-88.
223. Xu X, Nakano T, Wick S, Dubay M, Brizuela L. Mechanism of Cdk2/Cyclin E inhibition by p27 and p27 phosphorylation. // Biochemistry. 1999. Jul 6;38(27):8713-22.
224. Yasukawa M, Bando S, Dolken G, . Low frequency of BCL-2/JH translocations in peripheral blood lymphocytes of healthy Japanese individuals. // Blood. 2001.;98:486-488.
225. Yokoyama T, Tanahashi M, Kobayashi Y, Yamakawa Y, Maeda M, Inaba T, Kiriyama M, Fukai I, Fujii Y. The expression of Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bak and Bim) in human lymphocytes. // Immunol Lett. 2002. Apr 22;81(2):107-13.
226. Yoneda T, Imaizumi K, Maeda M, Yui D, Manabe T, Katayama T, Sato N, Gomi F, Morihara T, Mori Y, Miyoshi K, Hitomi J, Ugawa S, Yamada S, Okabe M, Tohyama M. Regulatory mechanisms of
227. TRAF2-mediated signal transduction by Bel 10, a MALT lymphoma-associated protein. // J Biol Chem. 2000. Apr 14; 275(15): 11114-20.
228. Young LS, Murray PG. Epstein-Barr virus and oncogenesis: from latent genes to tumours. // Oncogene. 2003. Aug 11;22(33):5108-21.
229. Zeremski M., Horrigan S.K., Grigorian I.A., Westbrook C.A., Gudkov, A.V. Localization of the candidate tumor suppressor gene ING1 to human chromosome 13q34. // Somat. Cells and Mol. Genet. 1997. V. 23. P. 233-236.
230. Zhang Q, Cui X, Sangster MY, Marshall DR, Rehg JE, Xue L Selective hyperexpansion of marginal zone (MZ) B-cells in Ee-BCL10 mice. // Blood 2000.; 96: 822a
231. Zhang Y, Cai X. Assignment 1 of human putative tumor suppressor genes ST13 (alias SNC6) and ST14 (alias SNC19) to human chromosome bands 22ql3 and Ilq24~>q25 by in situ hybridization." // Cytogenet Cell Genet 1998. 83(1-2): 56-7.
232. Zojer N, Konigsberg R. Deletion of 13ql4 remains an independent adverse prognostic variable in multiple myeloma despite its frequent detection by interphase fluorescence in situ hybridization." Blood 2000. 95(6): 1925-30.
233. Eiriksdottir G, Johannesdottir G. Mapping loss of heterozygosity at chromosome 13q: loss at 13ql2-ql3 is associated with breast tumour progression and poor prognosis. Eur J Cancer 1998. 34(13): 2076-81.
-
Баранова, Анна Вячеславовна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.15
- Изучение молекулярно-генетических аспектов опухолеобразования у редиса Raphanus sativus
- Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML
- Изучение экспрессии генов, участвующих в системном контроле деления клеток и дифференцировки у высших растений, на модели спонтанного опухолеобразования у инбредных линий редиса (Raphanus sativus var. Radicula Pers.)
- Создание модели для изучения опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. с использованием трансгенных растений по гену IPT
- Молекулярно-генетические исследования функционирования полиморфных вариантов генов цитокиновой сети и биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии
