Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение генов Хеnорus Loevis, дифференциально экспрессирующихся при нейральной дифференцировке

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение генов Хеnорus Loevis, дифференциально экспрессирующихся при нейральной дифференцировке"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

мстит БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХШИН'ИМЕНИ М .«.ШЕМЯКИНА.

На правах рукописи Васильев Олег Леонидович

Поиск и изучение генов Хепориз 1аеи1з, дифференциально экспрессирующихся при нейральной дифференцировке,

Специальность- 03.00.03 - молекулярная биология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Москва 1932 г.

Работа выполнена в одена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии км.М.М.Шемякина РАН.

\

Научный руководитель - кандидат химических наук

Чертов О.Ю.

Официальные оппонента: доктор биологических наук

Лопаиов Г.В. кандидат химических наук Гришин A.B.

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР.

Защита состоится 13 Пая 1992 г.

в 11 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им М. Ы. Ееиякша по адресу: II787I ГСП-7, Москва, В-437, ул. Шклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке теке Института бвоорганичесхой химии им. М. М. Шемякина РАН. -- •■

Автореферат разослан_1932 г.

Ученый секретарь стгещюиизиробанного совета кандидат зишческих- неук

В.А. НЕСМЕЯНОВ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

.Актуальность проблема!. Ужа более полувека изучается явление индукции осевой мезодермой диф^аронцировки сстодерш в нервную систему- нейрэльная индукция. Однако, геш, контролирующие эта процессы, до сих пор не были выявлены из-за отсутствия эффективных способов выделения и анализа продуктов вх экспрессии в эмбриональном материале. В настоящее время в результате развития высокоэффективных методов генетической ингсЕврш, в частности метода получения кДНКовых библиотек из сотен меток с использованием PGR, гегеотся реальная возможность клонировать данкко гены. Изучение их экспрессии позволит перейти от чисто эмбриологического к молекулярно-генеткческому уровню ревеяля таких фундаментальные проблем®: как установление передне-задней полярности у эмбриона а такие патерна нервной системы ( т.е. четких границ в пределах которых Судет формироваться нервная система).

Следует отметать, что зародыши амфибий представляются наиболее подходящим объектом для создания подобные библиотек, т.к. имеют сравнительно крупные размеры, удобны для кгкрохирургии к, следовательно, позволяют получить достаточное коллкчество мРНК.

Настоящая работа является частью обширного исследования нейраль-ной индукции у Хепориэ laevia, проводимая совместно с лаборато-- рией "Структуры и функции генов человека" Института бкоорганячес-коЯ химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Цель работы:

1.Создание "амшификацяонных" кДНКовшс банков из материалов пре-зумптивной нейроэхтодеры и презумптивного эпидермиса на стадии ц1/2-12 развития Тепариз 1аси1з.

2. Разработать метод получения обогащенных по_ дифференциально экслрессирующимся генам кДНКовых банков.

3. Провести дифференциальный скрининг полученных обогащенных кДНК банков к установить первичную структуру выделенных клонов.

4. Проанализировать экспрессию подученных генов в процессе эмбрионального развития Х.1ает1з.

Научная новизна и практическая ценность работн. В результате проделанной работы получены кДНКовые банки из материалов лрезумтишЕЫХ эш1Дер»гаса и нвйроэктодерма, доказана возможность использования этих банков для поиска дифреренциалъко-экспрессирукщшзя генов. Разработана эффективная схема получения обогащении! по даффервнциально-экспрессирувдимся генам кДНКх банков. Проведен дайээренцизльный скрининг обогащенных кДШСовнх. банков презумпгиЕных иейроэктодермы и эпидермиса,и выделены даЬ-ференцяально-зкспрэссирущиеся гслоны. Проведен анализ экспрессии эпидершсспецифкчеасого клона.

Тагам образом а) выделен новый ранний эпидермальный маркер, эксп-рессирукщийся в наружнем слое клеток презумптивного эпидермиса, в) показано ингибирование его экспрессии в презуштивной нейро-эктодермо при нейральной индукции на 12 стадии. Объем работы. Диссертационная работа изложена на 90. страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,обсуждения результатов, экспериментальной части к списка литературы.

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ.

I. Конструирование "амплифякациошгах" кДНК-овых

банков из материалов презумиивной нейроэктодерш и _;_ *

презуштивкого эпидермиса поздней гаструлы Хепориэ I.

У 4х зародышей X. 1ае71а с симметричным дроблением на стадии Т/2

II ' - 12 были вырезаны зовы презумптивной нейроэктодерш и прэ-зумптивного ¡эпидермиса. В качестве носителя при выделении тотальной РНК и синтезе первой цепи с т-праЯмера использовали 53 РНК Е.соИ, а затем, на стадии удаления Т-праймера, ро1у1ро!уС. После тщятельного удаления Т- праймера осуществляли олиго(бС)-тзйлинг и удаление РНК щелочным гидролизом. С полученным материалом проводили аналитическую амплификацию с (Г) и (С^прайме-рами для определения колличества необходимых циклов, а также для подбора равных исходных коллитоств тэйлированной первой цепи Аналитическую амплификацию, очистку и клонирование кДНК в плазми-де рСеш-1 осуществляли по /94/. Схема получения амшшфикационных банков а также Механизм клонирования показаны на ( рис.4).

Для оценки качества, полученных кДНКшх банков с каадого из них снимали 2 эквиваленише^ешини по I тыс. клонов, и скринировали двумя эквивалентными, по колличэству радиоактивдо-мечвнной кДНК,

ч

зондами (1й- кДНК презумптивкой нейроэктодерш, 2й- кДНК презум-птивного эпидермиса). Сравнение эквивалентных решшк показало: из I тыс. клонов не было ни одного дифференциально распределенного. Это подтвердило наше предположение о сохранении неизменным относ Конструирование кДНКовых банков проводилось совместно с--А.В.Белявским ( Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН)-.

КЛЕТКИ.

выделение тотальной FHK

07-59% ЮЛЕ (Г)РЯК

" I цепь

--"С

Г i ЦЕТаб

J I I, агароза

L S Qiagen ОЛИРО isГ) ТЭ1ШИ5Г ]

V

5"_

g. f^s*---

ГЕДро.тз:з FHK |

О ' * О ------—

' N 5'

б-

1й ЦИКЛ PCR

i Т--праймэр С-лраймер

3'

:лялйфшсация i

V" N 6' 3'

'Ч/Ч 5'

з- "V4-

арагсзнт Клэнова j cUTS.dGTP j

5 ' GGGAGGCCCC (ï L с -ГгЩ? G дА г.

GGG5(A)^g JW1U (C^^Ï'l'AACGAA

носители

б'---/ч /х/Э'

гпРНК ! "

ежгез I непи (Т)-праймзр

^vV'3'

—5'

РКК

noj.ur.'по

!

GGIACCGCλAÏCCJffiGGCAûGCCQC (S). , ^rw G). ,AAH'CClïGCGGCCGCTCGÀG......

CGAÏGGCGGCÏAG&TACC320CGGGG (A)] g î^ (Cj'^TWGGAAGGCGGGCGAC-CTCOAii..

Рис.4. 1- Этапы получения "ашлифлцируемых'' цЦНКоаых ûsiîkqh

(пояснения в теюте). Б- Схема клонирования амшфщироганяой с (Т) и (С)-праймеров кдНК вмодафацированнуа плазмиду pGem-1 (pGem-1 резали по Eco РЛ-Хйа 1 и датировали с 4. адаптореш, -ш. нуклзоти.гная последоЕательЕогеь ввделанЪ жирным шрифтом.

[гена в мРНК нейроэкг.1 / Сгена в мРКК эпидерм.3

шения: - для

[гвна в кДНК нейроэкт.] / 1гена в кДШ эпидерм.]

большинства генов, т.е. амплификация любого клона происходила одинаково, и в "нeйpaльнoй:,,, и в "эпздзрмальной" кДНК. Следует заметить, что различие между нейроэктодермой и прэзумптивным эпидермисом на этой стадии развития очень не значите льш, поэтому обнаружить дифференциально распределенные ( на уровне мРНК) гены описанным выше методом было нз возможно т.к. колличество клонов, которые

необходимо проскринировать, для обнаружения интересующего нас рас-

log.Po

пределенного гена описывается формулой: н= —- , где Po- Belogt 1-А)

роятность пропустить желаемый клон, А-его доля в массе мРНК /95/. Следовательно при прекрестном скрининге 500 клонов можно с вероятностью 99% обнаружить распределенный ген составляющий 1% от мРНК. С помощью +-/- скрининга можно обнаружить гены составляющие не менее 0.1 % от мРНК. Поскольку амплификация ( PCR ) не искажала распределение генов мы попытались "обогатиться" по дафференциальнорас-пределенным генам. Обогащение позволяет вести поиск генов составляющих 0.01% от мРНК. Следует заметить, что обогащение не только увеличивает концентрацию распределенных генов ( в . результате значительно снижается колличество скринируемых кланов ), но и позволяет вести перекрестный скрининг обогащенными зондами. Низкая концентрация в радиоактивно-меченном зонде редких последовательностей (составляющих как правило 50-70Х всей мРНК) является главным ограничением чувствительности описанных методов. Именно поэтому при скрининге кДНКовых банков радиоактивно-меченной кДЕйС положительный сигнал дает около 30% клонов. Кроме того обогащенные зонды давали значительно пике фон по 'сравнении с зондами из первичных амплификатов,

что облегчает тестировку редких генов.

2. ПОЛУЧШЕ И ПЕРЕКРЕСТНЫЙ СКРИНИНГ ОБОГАЩЕННЫХ ПО да®ЕРШЩШЮ-РАСЯ1РЕДШШЫМ ГЕНАМ кДНКовых БАНКОВ ЕРЕЗУМПТИВНЫХ НЕЙР03КТ0ДЕРШ и ЭПВДЕРШСА.

Для поиска дифференциально-распределенных генов мы разработали систему вычитания в основу которой был положен принцип использования для конструирования обогащенного банка только "самосхлоп-нувшхся" кДНК грэйсера, т.е. после гибридизации избытка биотини-лированного драйвера о не биотишишрованшм трэйсером и удаления биотан-содержащих гибридов, в амплификацию вступали только те молекулы трэБсера, которые "саносхлопнулиеь" (т.е. в двухцепочечной ДНК обе комплементарные цепи из трэйсера. рис.6 ). Идея использовать "самосхлошувшуюся" ДНК была высказана в работе /96/и независимо Н. .Лисицыным (лаборатория "Структуры и функции генов человека" ИБХ АН СССР,личное сообщение ). Для отбора "самосхлопнувшей-ся" фракции оба автора использовали различие в степени лигировяния мэкду двух- и одшзцепочечной ДНК. Б нашем варианте для этого используется достройка Та^-полимеразой 3'-концевых фрагментов, имеющих Ш3-прайм8ра, только-у " самосхтопнувшейся " ДНК. Последующая амплификация с М13-праймеров позволяет получить (фракции "самосхло-пнувиейся" кДКК в чисток вида.

Использование "самосхлопнувииеся" ДНК имеет преимущества перед классическим вариантом (когда для конструирования банка используют весь оставяшйся после удаления биотиншшрованных гибридов трэйсер) т.к. в процесс аггшпфжащк ( не вовлекается негибрпдизоваЕшкйся трэйсер. Причем, чем ниже эффективность гибридизации, тем предщоч-

А

сагиттальный срез

амшшфицируемая • "эпидермальная"кДНК

амшифицаруемая "нейральная" кДНК

(С)-праймер

б' яагаеэ-Д—

3' *

биогашлирование: РСй с (Т)- и (С>-прай-ми и Ыо-сШТР

3'

5'

б гКЗДР»—

3' _<

Гцикл РСИ с (М1 ЗН-Т)пр-М (М13Б-С)пр-М

(Г)-праймер

удаление биотини-лироваяной кдак.

-. ¿1 б'

(М13В-Т)

(Т)-праЯмер

трэйсер драйвер

гибридизация

| удаление биотишшшовая-ных гибридов и праимеров.

вычтенная "пейральная" кДНК

дифференциальный скрининг

(М13Б-С)пр-р.

| достройка концов

I Тад полимеразой.

з-„ б-

(М13Я-Т)пр-р. ♦ ТСЯ. с М13Н и ШЗВ пр-ми.

вычтенная —

"эпидерыальная" кДНК

| клонирование

вычтенная "эпндериальная* кДНКовая библиотека

I

дифференциальный скрининг

клоны

Рис. 5. (Обяснения в тексте.)

тительнее использовать "самосхлопнувшийся" тройсер для конструирования обогащенного банка. Низкая эффективность гибридизации может быть обусловлена тремя причинами: I-низкая концентрация ДНК или ее

большая сложность; 2- наличие плохо гибридизующихся последователь>

ностей; 3-наличие повторов. Если в трэйсере присутствуют плохо гибридизушциеся последовательности или повторы,то помимо ухудшения эффективности гибридизации, в "классическом" варианте, будет также происходить обогащение по знш последовательностям. В нашем варианте, как плохо гибридизувдиеся последовательности,- так и повторы не будут вступать в амплификацию поскольку они не могут Сыть фланкированы MI3 праймэрами.

Очистка от биотишшфованных продуктов осуществлялась путем добавления стрелташдаша, образующего высокоаффинные комплексы с биотином, и удалением ДНК-белковых комплексов фенолом /97/. Степень очистки оценивалась в предварительных опытах, с радио активно-меченным биоишшшрованным материалом и составляла 93% ( т.е. из Змкг биотинилированного драйвера оставалось ЗОнг ). Для отделения обогащенного материала трэйсера от следов драйвера, после разведения, проводили 33 цикла амплификации с MI3 праймэрами. А затем замену MI3 прайлеров на Т- и С- праймера, выполнив'еде 17 циклов амплификации с Т- и С- праймерами.

Замена {ДЗ праймеров на Т- и С-праймера позволила во-первых: эффективно клонировать фланкированные Т- и С-праймерами кДНК, во-вторых: уменьшить доли не специфических последовательностей,появившихся после 1го цикла амплификации с MI3 праймерами.

Обогащенные "нейральнув" и "эпидермальнув" кДНКи фракционировали в I% агарозном геле (рис.6). На фоне шмара кДНК хорошо видно наличие дифференциально-распределенных полос. Гибридазационный анализ показал, что, выделенный нами ранее "нейро-споцифический" ген преде-

Рис. 6. Фракционирование обогащенных кДНЕС нейроэктодермы и эпидермиса в I% агарозе. 1,4- дорожси кДНК эпидермиса; 2,5- нейроэктодермы после I и 2 циклов вычитания. 3 дорожка-маркер X Hlnd III.

Рис. 7. Гибридизация радиоактивно- меченным клоном ХЕр-1 на фракционированные в 1% агарозе и перенесенные на Hybond-N первичные амплификаты I- презумптивного эпидермиса, и 2- нейроэктодермы.

2

тавлен двумя полосами с длкняами Б50 п.н.и 950 п.н. ( -лунки 2 и 5 ), причем, на второгл цикле вычитания происходит дальнейшее обогащение по нейро-специфическому клону.

Эпидермально-специфический ген ( полоса с длинной 670 п.н. в 1й дорожке) наоборот теряется на 2-ом цикле вычитания (лунка 4, рис.6) поскольку из-за менее кэсткого распределения,по сравнению с нейраль-ным кленом, присутствующие в драйвере биотиншшрованные цепи эпидер-мального клона будут гибридизоваться с кошлеменгарными цепями трэй-сера и уменьшать распределение гена на последующих циклах вычитания. Из-за риска потерять слабо распределенные гены мы не проводили дальнейшие циклы вычитания.

Дифференциальный скрининг (по 500 клонов из каждого обогащенного банка ) позволил выделить эпидермис-специфический клон, и несколько

слабо распределенных нейральных клонов. Для подтверждения и оценки степени распределения выделенных клонов в первичном амшшфикате радиоактивно-меченые клоны гибридизовали с "нейральным" и "эпидермаль-ным" первичными амплификатами, фракционированными в 1% агарозе и перенесенным на нейлоновую мембрану ( НуЪопй- N ). Сканирование ра-диоавтограмм на лазерном денситометре показало, что эпидермадьного клона, по меньшей мере, в 20 раз больше в презумптивном эпидермисе, чем в лрвзумптивной нэйроэктодарме ( рис.7 2 и I соответственно ). На (рис.7) также представлены результаты гибридизации радиоактивно-меченного клона ХЕр-1 на обогащенные банки после 2 цикла вычитания. На фотографии видно, что нам удалось обогатиться по эпидермисспеци-фическому гену по меньшей мере в 80 раз.

Гибридизация на первичные амплификатн 4х других подозреваемых клонов не подтвердило их распре деление.Следует отметить, что эти клоны в обогащенных банках были распределены значительно слабее чем ХЕр-1 .

3. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ЭПВДЕРМИС-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ГШ (ХЕр-1).

Рестрикций анализ клона ХЕр-1 указал на наличие 2 сайтов "для Sau ЗА к I сайта для Alu-1.

Определение нуклеотидной последовательности было проведено по методу Септера с использованием меченного по 5'концу универсального MI3 праймера, причем клоны для сиквенирования в MI3mp18 и MI3mpI9 были получены методом направленного клонирования,при котором каждый рестрикциокный фрагмент выделяется и клонируется в вектор индшзи-дуально. Компьютерный; анализ последовательности, составленной по результатам сиквзыфования трех клонов гена ХЕр-1 .каждый из которых пропел по IG3 цкелов а^щ£икации,показал уникальность обнаруженного

Eco R1 AlU 1 Sau ЗА

Sau ЗА

Xma 1

1=_I_I

1

A

Xma 1 Hind 111

Eco H1

Xma 1

-L=>

<a

N-3 • N-1

N-2

В

Рис. 8 Рестриктная карта и стратегия секвенирования по Сен-геру гена ХЕр-1 полученного (А) из обогащенного кДНК-го банка, после 109 циклов амплификации, и его фрагментов (В) клонированных после 33-х циклов PCR со специфическими праймзрами N-I, N-2, N-3 и Г-праймером. Сайты рестрикции показаны стрелками (жирной-встроенные в праймера, светлой-обкаруженные в гене), гена. Для исправления возможных ошибок, появившихся в результате большого колличества циклов амплификации в вуклеотидной последовательности, ген ХЕр-1 был "поднят" за 33 цикла PCR с тэйлированной poly(сю).кДНК гаструлн, используя следующие комбинации праймеров: пр. ИЗ + пр.N2; np.NI -тар.N2; np.NI+ Т-пр.; пр. U2 + С-пр., причем в каздом варианте была определена нуклеоткдная последовательность по меньшей мэре 3-х клонов полученных в результате независимых PCR. Стратегия сиквэнирования клонов, полученных после 109 и ЗЗх циклов амплификации и рестриктная карта показали на (рис. 8). Полная аминокислотная последовательность белка приведена на (рис. 9).

Компьютерный анализ вероятности сочетания соседствующих аминокислот ( программа СепеЬее ), проведенный для последовательностей транслированных со всех трех рамок считывания, показал высокую вероятность трансляции белка как во 2-й (177а.к.) так и в 3-й' (74а.к.) рамках (рис.10). Однако, наличие стоп кодона на расстоянии 42х нук-леотидов от начала транслированной в" 3-й рамке последовательности, а так же удаленность (Зй от начала гена ) возможного инициирующего АЮ-кодона не только уменьшают длинну белка до 54 а.к., но и ставит под сомнение существование транслированного с неб белка.-

Трансляция в 1й рамке блокируется как большим колличеством стоп-кодонов, так и низкой вероятностью соседства транслированных с нее аминокислот. Наиболее вероятна трансляция со 2-ой рамки. Во-первых это самая длинная открытая рамка, во-вторых положение первого мети-онина точно совпадает с началом последовательности построенной на основе вероятности встречаемости аминокислот.

Нозерн гибридизация показала, что мРНК имеет длинну около 600-650 п.н. следовательно, определенная нуклеотидная последовательность ( 657 п.н. ) соответствует полному гену.

Для предсказания возможной функции гена ХЕр—1 был проведан поиск-гомологов в банке ЕМВЬ (ишь 1991 г.) - ■ На оснавании полученных* данных можно предположить, что белок способен экспрессироваться через клеточную мембрану в межклеточное пространство, поскольку имеет на Н-конце структуру похожую на лидерный пептид ( Met-Arg-Yal.-Leu.-Pro-

Рйе-С 1п-А1 а-1еа-Т11г-Уа1-А1а-Су з-7а1-РЬе-5 ег-Плт-й 1у-Б ег-Иу-Аэр-Азп

Иу-Аэр-) Литературные данные /99/ свидетельствуют, что для лидерных пептидов не существует ярковыракенной аминокислотной гомологии, а общими чертами для них является наличиё "функциональных" блоков. Это

-13-

5' А TTC CAC TGA GCA AC-G TTG TCA CTG GGA GAG TTT TCA TCT GGG GAA TGT

TAT TGC TTT CAA AGT AC-C CTG ACT TGG GAC TCA ACG GAA ■TCA GGG ACT ACT GTC

AG С TGC тот GGT TCC ATT TTG GCT AAA ACT ATG AGG -GTA GTT CCC TTC CAG GCT

R V L P ? Q A

(JTG ACT GTC GCC TGC GTC AGC ACT GGG TCT GGA GAT AAT GGA GAT TCC TTC

I T V A С V — s T G s C- D i? G D С F

TTC TAC GAT CAG GTC TAC ААД GAT GGA GAT ACT ATT AAA TAT GAC TGC см АТС

V Y D Q V* 1 7 ir I) G T! T 'Г Y В С q T

IGT GM TGT ACO АЛГ GGA ACA ATT ACA GAC TGT GCA GGT n < m U-'iJ. GOG ЛАС TGC АФГ-

С ^ С Г N ^ , G H I T В ^ Ä R и А I'í 1 u T

тгт АЛА ЛАГ, Gi'G GGT ACA ССГ GAG CAG A4T КС? GAT GCG ATA GTC TAT GAT г» А ,-Я o. i!

г L\ К XT A T P T? Q H <7 Б ■ А T V Y T) Tj

GAT GAT COA ЛАТ АТС ATT GM AGC AGC Л n n AGC A AG C-GG AAT GTT СС-А C-CG AAA

Т) В 2 15 I 1 E S 3 E s К G S "V R A К

CGG G CT GCG TCT níi л üu'j GAO АГА AGA AGA Í.CC CCA GTC GTT ATG AGA CAA. ACA ATA

I? A A s G D T R Я I P v I Ii Й - Q T I

АА'Т TCA AGG CAA ACC AAA GCA ACC GÍA ATG AT А ATG ATG ACT CAG CAA GGA ACT

Я S S Q T К A 5? V" Ii 1 Ы M m X Q Q G T

CAA C-GÁ TAG TAA CAA AGG GU ЛС-С- AGA GAA AAT GAA CAA TGT ATT GTC AAA GC-A

Q G St

TIC A'TG TGA AGA AAA TGC АТС m AGA AAA ATG GAG TCA TGA AAA GAA TGA

ТАА АЛТ CAA GAG AAA AG

ñic.S Первичная структура швдермисспецифаческого гена ХЕр-1 (657 п.н.).

Аминокислотная последовательность соответствует 2-ой раже считывания.' заряженная аминокислота после первого Met ( в ХЕр-1 это Arg ), далее блок из 12 - 25 гидрофобных аминокислот (подчеркнут сплошной линией), блок из слабозарякенянх аминокислот, часто содержали Ser и Gly (подчеркнут прерывистой линией ) и, наконец, несколько силькозарякеяных

аминокислот (у ХЕр-1 это Asp-Asn-... -Asp-)

Это предположение хорошо согласуется с результатами гибридизация in situ, показывающими что мРНК гена ХЕр-1 локализована в клетках наружного слоя презумптивного эпитермиса не равномерно а около плазматической мембраны, что также характерно для экспрессирующихся белков (рис. II, см. раздел 2.4).

Обнаруженные гомологичные участки позволяют предположить, что белок ХЕр-1 способен связывать ионы мэталов (по гомологии с метал-лотионинами) и,возможно, с ДНК (гомология с рецепторами ретиноевой кислоты и Zn-фингерами). Большое колличество Суз (7) и низкая молекулярная масса наряду с возможность» экспрессироваться, характерны для ростовых факторов, для которых также характерно иметь четное колличество остатков Cys (после отщепления лидерного пептида, имеющего Cys их останется 6).

4. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ХЕр-1 НА РАННИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ Xenopus laevls.

Анализ экспрессии эпидермального клона проводился на уровне мРНК двумя методами:!- гибридизацией In situ. ( 30Hfl:dIg0xigenln-Me4eHHaa рибопроба, синтезированная 17 РНК-полимеразой, срезы делали у зародыша взятого на стадии нейрулы ( 15ст. ) и 2- амплификацией (PCR) фрагмента гена ХЕр-1, расположенного между праймерами N-2 и N-I, с кДНК. Синтез кДНК проводили с рассеянной затравкой с тотальной РНК, выделенной из кусочков ткани зародышей . Хепориз laevts. Для контроля качества выделения РНК, синтеза сДНК и РСН для всех образцов проводилась амплификация фрагмента гена Na+, К+-АТФазы.

Результаты In situ, гибридизации показали,что при нейруляции (ст.15) ХЕр-1 экспрессируется только в наружном слов клеток презумптивного эпидермиса, причем его мРНК локализована около плазматической мем-

А. Б.

3 4 5 6 8 9 IQ II

.pXv.-f-'v? "Cii.jiiyj-;-.'^ - xEp-i -

Рис. 12 А. Экспрессия mFHK XEp-I на ранних стадиях развития Xenopus laevls. I-ооцит, 2-бластула (8-9 ст), 3-ракняя гаструла (Ю^ст.), 4-поздняя гаструла (12 ст), 5-рашяя нейрула (14 ст) 6- поздняя нейрула (18-19 ст.).

Б. Распределение мРНК ХЕр-1 по тканям на поздней гаструле (12 ст.). 8-осевая мезодерма, 9-энтодерма, Ю-нейроэктодерма.П-пре-зумптязннй эпидермис, брапн (рис. II)

На (рис.12а) представлены результата анализа зкспресспи ХЕр-1 по стадиям развития, полученные с помощью PCR. Экспрессия начинается на стадии ранней гаструлы (101//4 ст.) и медленно нарастает.

На (рис. I2ö) показан анализ экспрессии XSp-1 по тканям взятым на поздней гаструле (ст. 12). На фотографии видно, что экспрессия гена ХЕр-1 наблюдается только в эктодерме, прячем в эпидермисе мРНК в 20 раз больше чем в нейроэктодерме. Эти данные хорошо согласуются с распределением гена в первичных амплификатах (рис. 7)

Анализируя раннюю экспрессию гена ХЕр-1 ма обнаружили, что на II стадии его мРНК на распределена ( рис. 33). Таким образом подавление

экспрессии ХЕр-1 в нейроэктодерме происходит в конце гаструляцик т /"?

(ст.II -12.) Следует заметить, что на этих стадиях развития^труднс вырезать не загрязненные друг другом материалы нейроэктодермы и эпидермиса .поэтому в зародыше ген может быть распределен сильнее чем на

фэтографиях.

Макао предположить,что подавление экспрессии ХЕр-1 в нейроэктодерме происходит в результате первичной нейральной индукции распространяющейся' вдоль эктодермального пласта. Полученные нами данные так ие позволяют предположить что эти события происходят с II до 12 ст.

Следует отметить, что и ХЕр-1 и ХАКМ являются самыми ранними маркерами нейральной дкфферекцировкк, поэтому детальное изучение механизмов регуляции их экспрессии на молекулярном уровне прольет свет н ранние этапы нейральной индукции.

ВЫВОДЫ.

1. Созданы " амплификационные " кДНКе банки из материалов презумп-

тивных нейроэктодэры и презумптивного эпидермиса взятых на т /?

II ' -12 стадиях развития Хепориа \aevts.

2. Разработан метод получения обогащенных по дифференциально эксп-ресснруюцимся генам кДНК банков.

3. Проведен дифференциальный скрининг полученных обогащенных кДНК банков и установлена первичную структуру не известного ранез эпидермисспэцифического гена: ХЕр-1. Анализ аминокислотной последовательности транслированной с 2й рамки показал, что продукт гена ХЕр-1 скорее всего экспрессйрующийся за пределы эпидермаль-ных клеток белок с молекулярным весом около 13 кДа- Вероятно, связывающий металы и ДНК. .

4. Проанализирована экспрессия гена ХЕр-1 на ранних этапах эмбрионального развития Х.1ае71з. Впервые экспрессия гена ХЕр—1 тестируется с помощью РОЛ на ранней гаструлв (ст.ГО1^4) и постепенно возрастает при нейруляции, причем на ранней и средней гаструле мРНК обнаруживается во всей эктодерме. На поздней гаструле ( 12 ст.) наблюдается 20-кратное снижение уровня экспрессии в нейро-

эктодерме которое усиливается при нейруляции. Гибридизация in situ показала что мРНК гена ХЕр-1 локализована вблизи внешней мембраны эпидермальных клеток.

Ряд фактов (экспрессия за пределы клеток, низкий Ы.В. и обилие остатков Cys ) позволяют предположить, что ген ХЕр-1 может быть или морфогеном или не известным фактором роста.

Основные результаты диссертации опубликованы "в следующих печатных -работах:

1. Zaraisiy А.G., lukyanov S.A., Vasil'ev 0.1., Smlrnov Yu.V., Belyavsky 1.4.- Developmental Biology 1992. (in press).

2. lukyanov S.A., Vasil'ev O.b., Zaralsky A.G., Smlrnov YU.V., Belyavsky A.V.- XEP-1 - New gene speclllcally expressed In presumptive epidermis ol the Xenopus laevls embrlo. Soviet-Finnish Symposium on Developmental Biology, 1991, USSA- ( Онтогенез.1991. т. 22, N. 4, стр.412.)

3. Zaraisky A.G., Lukyanov S.A., "Vasil'ev 0.1., Smlrnov Yu.V, Belyavsky A.7.- Xenopus anterior neural lold gene (XAMF-1): A new homeobox- containing gene expressed specifically In the anterior part oi presusptlv neuroectoderm of Xenopus laevls embrlo.- Soviet- Finnish Symposium on Developmental Biology, 1991, USSA. ( Онтогенез. 1991. Т. 22, Н. 4, стр.411.) Материалы . диссертации были доложены на Советско-финском симпозиуме. по биологии развития " Сигнальные молекулы и клеточная дифферэнцировка " ( Суздаль, 1991 г. ), а также на и Европейском конгрессе по биологии развития" (Израиль, 1991г.)