Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи

ПОЛЯКОВ АЛЕКСАНДР СВЯТОСЛАВОВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В РАЗВИТИЕ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Специальность - 03.00.26 - «молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории нейро генетики и генетики развития Института биологии гена РАН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член- корреспондент РАН

кандидат биологических наук

Л.И. Корочкин

Г.В. Павлова

Официальные оппоненты:

член- корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор К.В. Анохин

доктор биологических наук, профессор С.А. Лимборская

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «22» декабря 2006 года в « часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им, В.А, Энгельгардта РАН, по адресу: 119991, г, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан Лй У/ .2006]

Ученый секретарь Диссертационного совета ~

кандидат фарм. наук СГТ^Я^^^1^^^^1 Граб0ВСКаЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. В последние годы обнаружена существенная генетическая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека. Роль наследственности в формировании личности оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно- биологической и молекулярно-генетической техники. Понятно, что особое внимание уделяется при этом тем отделам головного мозга, которые играют определяющую роль в детерминации поведения в первую очередь теяенцефалону.

Основными компонентами теленцефалона являются палпиум (pallium) (кора головного мозга у млекопитающих) и субпаллиум (subpallium) (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейрональиых структур, таких как таламус, гипоталамус, обонятельный эпителий и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так н за ее интеграцию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенческих реакций.

Теленцефалон человека- это область, где сосредоточены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры приводят к специфическим сенсорным, моторным н эмоциональным расстройствам, к существенным изменениям личности. Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных и основные элементы его организации теленцефалона в эволюции в ряду позвоночных, несмотря на высокую морфологическую вариабельность.

Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерностей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливающие у человека ряд поведенческих особенностей и заболеваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как

формируется теленцефалон откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых нейрологических и психических расстройств.

До последнего времени исследования развития теленцефалона ограничивались изучением морфологии и анатомии. И в этой области накоплен значительный фактический материал. Однако молекулярно- биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значительной степени непознанными. Определенный прорыв в определении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона был сделан благодаря применению методов молекулярной генетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обусловленных ими поведенческих реакций.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования — идентификация генов, вовлеченных в регуляцию развития коры головного мозга. Задачи исследования предусматривают: 1) разработку методики поиска и отбора генов, дифференциально экспресснрующихся в коре головного мозга; 2) клонирование и определение первичной последовательности полноразмерных кДНК полученных генов; 3) анализ экспрессии; 4) функциональный анализ.

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода вычитающей гибридизации клонирован ряд транскриптов, дифференциально экспресснрующихся в коре головного мозга. Проведен анализ паттернов экспрессии выявленных генов в эмбриональной коре головного мозга.

Выявленные в ходе данной работы гены являются молекулярными маркерами различных слоев коры и могут быть использовании как инструмент для изучения развития коры головного мозга.

Один из генов, Sipl был подвергнут функциональному анализу с использованием метода ткане-специфической инактивации белкового продукта гена. Показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры головного мозга.

Линия мышей с инактнвированныы геном Sipl в коре головного мозга является моделью синдрома Mowat- Wilson человека. Данная линия мышей

поможет при изучении данной болезни, характеризующейся дефектами в структуре медиального аспекта коры головного мозга.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатиые работы.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на двух международных конференциях (Annual meeting of German genetic society, Kassel, 2003; Neural Stem Celt Conference, Melboum, 2003), семинар лаборатории «нейро генетики и генетики развития», Институт биологии гена РАН (февраль 2006),

Структура дистертаиии. Диссертационная работа итожена на « 92 » страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (95 источников). Содержит 21 рисунок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Применение вычитающей гибридизации на модели топы головного мозга мыши. Для идентификации генов, регулирующих развитие коры головного мозга, мы использовали метод супрессионной вычитающей гибридизации ПЦР-амплифироваиных кДНК библиотек коры головного мозга. Для вычитающей гибридизации использовались библиотеки кДНК, приготовленные на основе тотальной РНК коры головного мозга, взятой на стадиях Е13 и Е15 эмбрионального развития мыши. Е13 • стадия, при которой происходит ранняя регионализация коры головного мозга н определяется клеточная судьба глубоких слоев коры. Данные о роли регуляторкых молекул пролиферативного компартмента в развитии коры головного мозга продолжают накапливаться. Предполагается, что направление клеточной дифференцирован определяется регуляторными молекулами в пролнферативном слое. Эти регуляторные молекулы определяют пролиферацию в зоне деления и размечают территорию внутри коры головного мозга.

Для идентификации генов вентрнкулярной зоны была получена библиотека гДНК, обогащенная транскриптам и, специфичными для Е13- Отобранные после первичного скрининга транскрипты секвенировались и далее были использованы в качестве зондов для гибридизации против исходных амплифицированных кДНК стадий Е13 и Е15. Транскрипты, воспроизводящие дифференциальностъ, отбирались для детального анализа экспрессии. На основе ДНК фрагментов ДЭГ синтезировались РНК-зонды, меченные изотопом серы 35. Далее проводилась м situ гибридизация со срезами эмбриональной ткани мыши двух стадий: Е13 и Elf.

Особый интерес представляли транскрипты, экспрессирующиеся в вентрнкулярной зоне коры ГМ. Для анализа паттерна экспресии на стадий Е13 использовались сагиттальные срезы целого эмбриона. Детальный анализ экспрессии отобранных генов внутри стадии Е15 фрональные и сагиттальные срезы головного мозга. Гены, паттерны экспрессии которых приведены ниже были отобраны для дальнейшего анализа (Рис. 1,2).

Рис, 1,Распределение мРНК клонов 10hl, IglO и 6gS в эмбриональной ткани мыши стадии Б13.

Гибридизация in situ рибопроб клонов 10hl (A), 1gl0 (Б) и 6gS (В) с сагиттальными срезами ткани эмбриона мыши.

I- кора головного мозга, 2- зона медиального кортикального организатора, 3- базальный ганглий, 4- таламус, 5- средний мозг, б- мост, 7- продолговатый мозг, спинной мозг.

Следующим этапом было клонирование кодирующей части мРНК и детальное изучение экспрессии отобранных генов.

Рис. 2. Распределение мРНК клонов 10hl, lglO и 6gg в эмбриональной ткани мозга мыши стадии EIS.

Гибридизация ш situ рибопроб клонов 10hl (A), lglO (Б) и 6g8 (В) с

сагиттальными срезами ткани мозга мыши стадии EIS.

А- вид светлого поля. 1- кортикальная пластинка, 2- зона пролиферации коры головного мозга, 3- гнппокамп, 4' базальный ганглий. Экспрессия клона lglO в маргинальной зоне коры обозначена стрелкой.

Анализ генов, полученных в результате вычитающей гибридизации. Клонирование гена праьЗ. нового нейроиального Фактора транскрипции, содержащего PAS домен.

В образце кДНК, обогащенном транскриптамн, специфическими для 13-го дня эмбрионального развития, был найден клон IglO. В результате вычитающей гибридизации бьш получен фрагмент длиной 800 п о., несодержащий открытой рамки считывания (ОРС). Мы предположили, что данный фрагмент относится к нетранслируемой З1- концевой части гена. С помощью метода амплификации 5'-концевых участков кДНК (RACE) и набора специфических праймеров нам удалось клонировать 5,8 т.п.о. Среди полученных 6 т.п.о. не было найдено ОРС дпинее 230 п.о.

Анализ общедоступных баз данных не выявил значимой гомологии последовательности клониро ванного нами фрагмента с известными последовательностями нуклеотндов. Анализ коммерческой базы данных CELERA (http://www.celera.com), недавно опубликовавшей аннотацию генов мыши показал.

что клонированный ранее фрагмент идентичен последовательности нитрона 3 гена npasi и имеет ту же ориентацию на хромосоме. С помощью метода ОТ-ПЦР нам удалось подтвердить существование данной кДНК в развивающейся коре ГМ , взятой на стадии Е13. Для этого на уникальные участки кодирующей

г

последовательности гена npasi были сконструированы специфические праймеры, которые и использовались для ОТ-ПЦР пары. Фрагмент, полученный в результате ОТ-ПЦР, использовался в качестве зонда гибридизации. Распределение сигналов для гена npasi и клона lglO, клонированного в результате вычитающей гибридизации оказались идентичными. Таким образом, было показано, что клон lglO является частью гена npasi. Стратегия клонирования гена npasi схематично

Рис. 3. Схема структурной организации гена Npas3 (клон lglO) и стратегия его

клонирования. Клон IgJO был получен из библиотеки кДНК, обогащенной транскриптами, специфичными для 13 показывают продукты амплификации 5'-концевого участка кДНК. Пара специфических праймеров, которые использовались для ОТ-ПЦР, обозначена треугольниками. Светлыми сегментами показаны экзоны 3- 5, кодирующие PAS- ДНК- связывающий домен. Волнистая линия показывает фрагмент кДНК, взятый в in situ гибридизацию для подтверждения идентичности генов lglO и Npas3,

представлена ниже (Рис. 3).

продукты RACE, 16 kb

lglO

I 5т.п.н.

In situ гибридизация

дня эмбрионального развития мыши. Стрелки

Npas3 принадлежит к bHLH-PAS- суперсемейству транскрипционных факторов. Белки данного семейства выполняют широкий спектр функций, таких как регуляция суточных ритмов (Period, Clock), контроль процессов нейрогенеза (Sim), регуляция развития дыхательных органов (Trh).

Недавно сотрудниками лаборатории Muir WJ было показано, что npas3 мутировал у пациентов, больных шизофренией [1996, J. Med. Genetics]. Анализ взрослой ткани мозга мышей, несущей мутацию по гену npas3 показал значительное снижение уровня экспрессии гена reetin. Недавно коллегами из лаборатории MCKnight SL было установлено, что мыши npesi -(- обнаруживают ряд существенных отклонений при анализе поведенческих реакций. Таким образом, клонированный нами ген npas3 необходим для нормального развития переднего мозга [2004, Ргос Natl Acad Sei U S A],

Анализ экспрессии гена tipas} в эмбриогенезе мыши.

Известно, что транскрипты гена npas3 начинают определятся в уже иа стадии Е9.5. На данной стадии экспрессия обнаруживается только в дорзапьной части нервной трубки. В результате проведенного нами анализа распределения мРНК npas3 в ткани эмбриона мыши на 13 день эмбрионального развития было установлено, что для таких регионов ЦНС как мост, мозжечок и продолговатый мозг экспрессия гена npas3 характеризуется высоким уровнем в пролифератнвном компартменте (вентрикулярная зона) в сравнении с зонами клеточной дифференцировки Рис. 1Б. Также было показано, что на стадии Е13 ген празЗ начинает экспрессироваться в ряде тканей за пределами ЦНС; перикард, мезенхимальная ткань, окружающая носовой эпителий, соединительная ткань, подстилающая эпидермис, мезенхима зачатков конечностей (Рис. 1Б). Анализ распределения мРНК гена npasí в ткани переднего мозга мыши на стадии EI5.5 выявляет экспрессию в вентрнкулярной зоне коры ПМ и базального ганглия (Рис. 2Б), Интересно то, что помимо зон пролиферации транскрипты гена npas3 были обнаружены и в маргинальной зоне коры ГМ (Рис. 2Б), Маргинальная зона коры ГМ становится морфологически различимой с появлением кортикальной пластинки и формируется нейронами, рано вышедшими из митоза. Среди них

особое место занимает субпопуляиия нейронов К ах ала- Ретциуса, экспрессирующих Reelin, Ранее было показано, что белок Red in необходим для нормального формирования стратификации коры ГМ.

Клонирование транскрипционного фактора Sipl.

Другой клон 6g8, полученный в результате вычитающей гибридизации, также не имел ОРС среди клонированных 880 п.о,, (см. ниже). Первым этапом получения полноразмерной кДНК клона 6gS был скрининг библиотеки кДНК, приготовленной на основе суммарной РПК из теленцефалонов, взятых на 15 день эмбрионального

развития мыши. Среди исследованных 10 клонов были получены 12 позитивных, общей длиной 6157 п.о. Далее, с помощью метода быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК (RACE) дополнительно был клонирован фрагмент длиной 1.2 т.п.о. Полученные 6.4 т.п.о. не содержали открытых рамок считывания длиной большей, чем 252 п.н. Предполагалось, что клонированный фрагмент относится к 3' или 5* нетранслируемой части гена. Для идентификации белков, кодируемых данным локусом была использована аннотация белков из базы данных Cetera. В данном локусе были найдены 3 гена (mCTI8031B, mCT177259, тСТ181019), имеющие то же направление смысловой цепи. На основе предсказанных последовательностей генов локуса были сконструированы пары прабмеров для ОТ-ГТЦР. Последующий анализ экспрессии с помощью метода гибридизации in situ показал, что один из предсказанных генов mCT1772J9 — Siplt воспроизводит паттерн экспрессии ранее полученного клона 6g8 (Рис. 4).

Рис. 4. Сравнение паттерна экспрессии мРНК гена Sipl и клона 6gS.

Гибридизация in situ рибопроб клона 6gS (Б) и мРНК гена Sipl (Г) с сагиттальными срезами ткани мозга мыши стадии Е18. Региональная специфичность экспрессии гена Sipt в коре показана стрелками

Из этого следует, что данный клон содержит часть гена Sipl. Паттерн экспрессия гена Siol в период эмбрионального развития.

Мы проанализировали экспрессию Sipl начиная с 12-ого дня эмбрионального развития. Экспрессия Sipl в спинном мозге разграничивает вентральную его часть от дорзалькой с максимумом, приходящимся на вевтрикулярную зону (Рис. 5В-М).

Рис. 5. Распределение мРНК гена в ткани эмбриона мыши. А- М- фронтальные срезы 12-го дня эмбрионального развития мыши. Н-Т-сагиттальные срезы 13-го дня эмбриогенеза. П, Р- увеличенный вид теленцефалона. С,Т- вид коры головного мозга. 1-новая кора (неокортекс), 2- базальный ганглий, 3-таламус, 4- губы, 5-пищевод, 6-

продоловатый мозг, 7-спинной мозг, 8- легкие, 9- кишечник, 10-тройничный нерв, 1I-

ганглий дорзальных корешков, 12- средний мозг, 13- варолиев мозг, 14- язык.

В Г1НС экспрессия Sip! была обнаружена в следующих типах нервов и ганглиев: ганглий дорзальных корешков, спинальный акцессорный нерв, корешки и ганглий тройничного нерва, корешки и ганглий вестабулокохпеарного нерва (Рис. 5В, Д, Ж, И, J1). В некоторых регионах, таких как варолиев мост, средний мозг, таламус и базальный ганглий мозга, экспрессия Sip! маркирует зону клеточной пролиферации (вентрикулярную зону). Sip! найден в клетках пролиферативного нейроэпителия, разделяющих варолиев и продолговатый мозг, валики ромбовидной ямки и крышу варолиева моста (Рис. 5А, В, Д). Транскрипты гена Sip! также были обнаружены в ряде тканей за пределами ЦИС: верхние и нижние губы, пищевод и носовая капсула (Рис. 5).

Диализ паттерна экспрессии SinI в конечном мозге.

Анализ распределения мРНК гена Sip! в ткани коры головного мозга мыши показал, что Sip! начинает эрепрессироваться с 12 дня эмбрионального развития. Транскрнпты обнаруживаются, главным образом, в зоне кортикальной пластинки (Рис. 5Р, Т). Позднее, на Е15 помимо кортикальной пластинки, продукты гена Sipl были найдены также в зоне клеточной пролиферации (венгр икулярной зоне) коры ГМ (Рис. б Ж). Далее, на lS-ый день эмбриогенеза транскрипты гена Sipl определяются только в кортикальной пластинке (Рис. 6Г, И). В результате анализа распределения мРНК SIPI на стадии Е18.5 был установлен интересный факт -региональная специфичность экспрессии гена SIP! внутри кортикальной пластинки. В передней части коры большинство клеток SifV-позитивны, а в каудальных ее зонах SIP! экспрессируется только в клетках слоя VI (Рнс. 6Г, Л). Дифференциальный характер экспрессии в коре головного мозга воспроизводится также при иммуноокрашивании антителами против белка SIPI (Рис. бО).

Рис. б. Распределение мРНК гена Sipl и белка Sipl в ткани мозга мыши в период эмбрионального и постнатального развития. Гибридизация in sita рибопробы гена Sipl с сагиттальными и фронтальными срезами мозга мыши стадий Е15 (А, Б, Д, Ж) и EIS (В, Г, 3, И, Т, У). К, Л- увеличенные виды В и Г, слои коры головного мозга обозначены латинскими цифрами, региональная специфичность показана стрелками. М, Н, Р, С- Распределение мРНК гена Sipl в ткани мозга мыши, несушей мутацию Reeler. О-распределение белка Sipl в коре на стадии EIS. П-гибршшзация in situ рибопробы гена Sipl с фронтальными срезами ткани взрослого мозга мыши. I- кора головного мозга, 2- гиппокамп, 3- базальный ганглий, 4-таламус, 5- средний мозг, б- пириформная кора, 7- обонятельная луковица.

В области вентрального теленцефалона экспрессия гена SIP! также показывает дифференциальный характер. Начиная с 12-го дня эмбрионального развития, экспрессия гена SIP1 обнаруживается, главным образом, в пролифератнвной зоне (вентрикулярная и субвентрикулярная зоны базального

ганглия), в отличие от дорзальной части теленцефалона, где транскрнпты SIP! были найдены только в зоне дифференцировки (кортикальная пластинка) (Рис. 5Д).

Также было установлено, что во взрослой ткани мозга основными регионами S1P1 экспрессии являются гнппокамп, зубчатая извилина и белое вещество коры головного мозга (Рнс. 6П), Посредством последовательного двойного окрашивания антитепами против белка SIP и антитепами против Vgtutl-маркера глютамат- продуцирующих нейронов, было показано, что SIP1 специфичен для глютамат- продуцирующих нейронов коры головного мозга (Рис. 7).

Рнс. 7. Двойное иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани мозга мыши антителами против Sipl (В) и антителами против белка VGLUT1 (Б). А-нзображение, полученное в результате компьютерного совмещения изображений Б и В.

Экспрессия SfPt в Reefer мутанте.

Reeier - это мутация, которая характеризуется инвертированной стратификацией коры головного мозга. Ранее было показано, что данный дефект связан с мутацией гена реелин. Продукт гена реелин, белок экстраклеточного мзтрикса, необходимый для нормального формирования коры в радиальном направлении. С мутациями гена реелин ассоциировании такие заболевания человека, как аутосомная рецессивная лизенцефалия и гипоплазия мозжечка. Мы исследовали экспрессию гена SIP J в тканн мозга у новорожденных Reeler-мутантов мыши, В результате анализа было установлено, что у дикого типа экспрессия гена SIPI выявляется исключительно в верхних слоях пириформнон коры, тогда как у мутанта экспрессия гена SIP1 в этой областн имеет диффузный характер (Рис, 6 М, И.Р,С).

Анализ функции гена SIP1 в развитии конечного мозга. Тка[«специфическая инактивация гена SIP1.

И» литературы следует, что SJP1 был обнаружен в двух-гибридной системе, как белок, реагирующий с факторами транскрипции Smad. Smad белки являются внутриклеточными медиаторами путей передачи сигнала, запускаемого BMP и TGF-b. Последние регулируют процессы пролиферации, миграции, дифференцировки и запрограмированной клеточной смерш в развитии. Интересным фактом является то, что BMP вовлечен в спецификацию медиального региона коры головного мозга. Вместе с геном dEFI, SIP1 формирует семейство ZFHX1 транскрипционных факторов у позвоночных. Белок SIP1 содержит 7 доменов типа цинковые пальцы, организованных в С- » № концевые кластеры. Также SIP1 содержит неканонический гомео-домен и является транскрипционным репрессором. Было показано, что SJPI мутировал у пациентов, страдающих синдромной формой болезни Гиршпрунга. Болезнь Гиршпрунга- генетически-обусловленная неонатальная кишечная непроходимость с частотой встречаемости ] на 5000 новорожденных. Около 30% пациентов имеют отклонения от нормы, такие как умственная отсталость, микроцефалия. S1P! был мутирован у пациентов, показывающих данные дефекты. Также интересным фактом является то, что ген SIP1 мутирован у пациентов с умственной отсталостью не страдающих болезнью Гиршпрунга. У них также наблюдались задержки в развитии моторных навыков и эпилептические припадки.

Линия, несущая аллель SlPl^" была предоставлена коллегами D.Huylebroeck и T.Van de Putte из Фландерского института биотехнологии и описана ранее.

Нами было показано, что основными доменами экспрессии гена SIP1 в конечном мозге являются кортикальная пластинка и зона клеточной пролиферации (вентрикулярная зона) базального ганглия. Для установления функции гена SIPI m vivo были созданы две линии мышей, несущих делецию экзона 7 в выше указанных компартментах теленцефалона. Для инактивации SIP! в базальном ганглии использовалась линия, несущая ген Cíe- рекомбиназы под контролем промотора гена Sii3. Линия была предоставлена коллегами Y. Fumta и G. Oliver. Six3-

гомеобокс содержащий ген, гомолог sine oculis D. melanogaster, регулирующий развитие зрительной системы. Основными сайтами активности Сге- рекомбиназы лннни Six3- Сге в переднем мозге являются клетки пролифератнвного нейроэпителия гипоталамуса и базального ганглия (Рис. 9И).

Для установления функции гена SIP1 в коре головного мозга была взята линия несущая knock- in гена Сге в локус гена Ею1, Сге- рекомбнназа Емх1- Сге линии зкспресснруется во всех клетках коры головного мозга, включая клетки-предшественники. Линия была создана К. Jones из университета Колорадо.

Первой стадией получения мутантов является совмещение трансгенов SIP У"' и Сге в одном генотипе. Далее, животные с генотипом Sipf°* /+ ; Сге/+ (двойные трансгенные гетерозиготы) скрещивали между собой для получения мутанта SIP У"' 1 SIP У"; Сге / +.

Анализ морфологии мозга мышей, полученных при инактивации гена SIPI в базальном ганглии.

Для установления функции гена SIP1 в вентральной части теленцефалона была использована трансгенная линия, экспрессирующая Сге- рекомбиназу под контролем промотора гена Six3. Помимо вентрикулярной зоны базального ганглия, активность Сге- рекомбиназы также детектируется в гипоталамусе, где зкспресснруется и ген SIPI. Таким образом, фенотипические изменения следует ожидать в вышеуказанных компартментая. Мутанты SIP У" / S//7"™ ; Сге / + легко различимы от гетерозигот по наличию экзенцефалии (Рис. 8),

Рис. 8. Общий вид эмбрионов 13- го дня. А- дикий тип. Б- мутант.

Мутация проявляется рано в кортикогенезе и впервые была выявлена на Е11. Окрашивание срезов ткани мозга эмбрионов 13-го и 16-го дня эмбриогенеза по Нисслю показало, что в районах коэкспресснн S1P1 и Сге наблюдается изменение морфологии ткани {Рис. 9А-Е). Интересно то, что в результате анализа морфологии было также обнаружено изменение морфологии и ткани коры головного мозга, где экспрессия CRE не обнаруживается (Рис. 9Ж, 3). Непонятно, является ли изменение морфологии коры головного мозга результатом инактивации гена SIP] в базальном ганглии. Также остается выяснить, что является причиной повышенного уровня клеточного роста в районах базального ганглия и гипоталамуса (Рис. 9А-Е).

■

.Г/% л

■ Е -

VV

-tes-i-r-':]

и

■' i-. (í * ¿VVv* Г Z. W ► -tHÍ"!*1': v ij

Рис. 9. морфологии эмбрионов полученных

Анализ мозга мыши, при

инактивации гена Sip! в вентральной части

теленцефалона. Окрашивание по

протоколу Nissl

корональных срезов ткани мозга мыши стадий Е13 (А, Б) и Е1б (В, Г, Д, Е). Ж, 3- увеличенный вид коры головного мозга эмбриона мыши, несущей мутацию гена Sip/ЛЬ тест активности Сге-

рекомбиназы линии Six3-Сге (линия, несущая ген cíe под контролем

промотора гена 31x3). А, В, Д- дикий тип, Б, Г, Е, Ж, 3- мутант. 1- базальный ганглий, 2- таламус, 3- кора головного мозга.

ФеиотипическиЙ анализ мутантов, получении* пом ннакгтнвацня гена SIP1 в коре головного мозга.

Для установления роли гена SIPI в развитии дорзальной части теленцефалона была выбрана линия мышей Emxl-Cre. В данной линии Сге-рскомбиназа экснреосируется в каждой клетке коры головного мозга. Анализ морфологии ткани мозга на ранних стадиях кортикогенеза (El2- EIS) не выявил существенных фенотипических различий между мутантом и диким типом. Первые фенотнпические изменения в структуре ко>ры обнаруживаются на стадии El7. Проведенные исследования морфологии коры Sipí- мутантов и анализ экспрессии генов показали, что зоны гиппокампа CAI- САЗ и зубчатая извилина нормально специфицируются в ходе эмбриогенеза (Рис. 10,11). В норме CAI- САЗ зоны гиппокампа на 17-ыЙ день эмбрионального развития уже заложены, зубчатая извилина на данной стадии представлена четко выраженной структурой (Рис. 10А, В). У мутантов район зубчатой извилины выглядит как

менее морфологически оформленная группа клеток (Рис. 10Б, Г).

Рис. 10. Анализ морфологии мозга мыши, несущей мутацию гена в коре головного мозга с помощью окрашивания по протоколу

Корональные срезы ткани мозга мыши 17- ого дня эмбрионального развития. А, В-дикий тип. Б, Г- мутант. Район зубчатой извилины отмечен стрелками, к- кора головного мозга, с- зиЫсШит, з- зубчатая извилина.

Рис. 11. Распределение мРНК гена пр2 в ткани мозга эмбриона мыши. Гибридизация in situ рибопробы гена пр2, меченой DIG с корональными срезами ткани мозга мыши стадии Е17. А-дикий тип, Б- мутант.

В результате анализа также было найдено, что у взрослых животных полностью отсутствуют гиппокамп и зубчатая извилина (Рис. 12). Медиальный район коры головного мозга представлен пре- и парасубикулярным комплексом (Рис. 12Б). Зона subiculum выглядит значительно тоньше (Рис. 12Б). Также интересным фактом является отсутствие corpus callosum у мышей, мутантных по гену Sipl

(Рис. 12В, Г).

Рнс. 12. Морфологический анализ ткани мозга мыши, полученной при

инактивации гена 51р1 в коре головного мозга. --V. '^¡¡р'—| Окрашивание по протоколу . С; А ' N¡5»! корональных срезов

' ткани мозга мыши стадии РЗО.

А, В- дикий тип. Б, Г- мутант. 1- кора головного мозга, 2- гиппокамп, 3- зубчатая извилина, 4- мозолистое тело.

Как было показано раньше, зоны, отсутствующие у взрослых животных нормально специфицируются в эмбриогенезе. Поэтому, дальнейшим предположением было то, что дефект происходит вследствие низкого уровня пролифератнвной активности клеток примордиума каудо-медиального района

коры. Анализ клеточной пролиферации изучался с использованием метода иммунноокрашивания парафиновых срезов эмбриональной ткани мозга мыши антителами против бромдеоксиуридина.

Разницы в уровне пролиферации между мутантом и диким типом на стадии Е16.5, в период, когда клетки каудомедкапьного района коры головного мозга отличаются максимальной пролифератнвной активностью, не было выявлено (Рис. 13).

ганглий, 2- кора головного мозга, 3- таламус, 4- гиппокамп, 5- choroid plexus, fifi mbria fornix.

Далее, мы решили проверить уровень клеточной смерти в медиальном паплнуме. Окрашивание ткани мозга мыши стадии E17.S по протоколу TUNEL показало высокий уровень запрограмированной клеточной смерти у мутантов в медиальном районе коры. В остальной части коры уровень клеточной смерти остается одинаковым (Рис. 14),

Также был проведен сравнительный анализ уровня генной экспрессии для двух пулов (мутант и дикий тип) тотальной РНК гиппокампа 16- ого дня эмбрионального развития с помощью микрочипов. В результате, были выявлены гены, экспресеирующиеся на более высоком уровне в ткани мутанта, позитивно регулирующие процесс апоптоэа. Среди них были обнаружены Mc2/cd99t Ttk, Iraki. К другой группе транскриптов, экспрессирующнхся на более высоком уровне в мутанте, относятся гены ответной реакции клетки на окскдатнвный стресс Mil, Mt2, AkrlbS и Gasl. Информация, полученная в результате анализа

Рис. 13. Анализ пролиферативноой активности клеток гиппокампа мышей с инактивированным геном Sipl в коре головного мозга. Корональные срезы мозга мыши 16- ого дня эмбрионального развития окрашенные антителами против BrdU. А, В- дикий тип, Б, Г- мутант. 1- базальный

микрочипов коррелирует с данными о повышенном уровне програмированной клеточной смерти в ткани гиппокампа мышей мутанта ых по гену 3>р1.

А ■ Б

В Г

* 4

Л -f

Рис. 14. Анализ уровня клеточной смерти в ткани мозга эмбриона мыши, полученной при инактивации гена Sipí в коре головного мозга. Окрашивание по протоколу TUNEL фронтальных срезов ткани мозга мыши стадии Е17. А, В- дикий тип. Б, Г- мутант. В, Г- увеличенные виды, выделенные прямоугольниками на А и Б соответственно. Стрелками обозначены клетки, показывающие окраску.

Недавно стало известно, что мутация гена Sip! у человека ведет также к изменениям в развитии медиального паплиума. Было показано также, что у пациентов с мутированным Sipl наблюдается агенез мозолистого тела. В результате анализа морфологии мозга мышей мутагггных по Sipl был обнаружен подобный дефект (Рис. 12В, Г).

Ранее в литературе, был описан ряд направленных генных мутаций, приводящих к дефектам развития медиального паллиума. Было показано, что Wnt3A локально регулирует рост каудо- медиальной части коры , из которой формируется гиппокамп. При инактивации Wnt3a, также как и фактора

транскрипции Emx2, спецификация клеток- предшественников каудо- медиальной зоны коры головного мозга проходит нормально, однако гиппокамп не формируется вследствие дефекта пролиферации. Недавно было показано, что Етх2 является прямой транскрипционной мишеныо №пг и Бтр. Для экспрессии Етх2 в дорзальной часта теленцефалона также необходима активность медиаторов Wut- и Вшр- сигнального пути, факторов транскрипции Smad н Tcf. Ранее было показано, что Smad- белки, медиаторы Вшр сигнального пути напрямую реагируют с Sipl. Также известно, что один ш членов генного семейства Tcf- Tcß!ZEB~l выполняет функцию, обратную функции SipltZEB-2 в регуляции TGF-beta/BMP- сигнального пути. Мутации генов H'nl3a, Leflt Етх2 и Sipl приводят к схожим фенотипнческим проявлениям.

Для точного установления роли Sipl в развитии медиальной коры и о месте Sipl в генной иерархии Wut- и Tgf-beta- сигнального пути требуются дальнейшие исследования. На основании выше приведенных данных можно сделать вывод о том, что активность гена Sipl необходима для нормального развития таких компонентов медиальной коры, как гиппокамп и зубчатая извилина.

Выводы.

1. Проведен сравнительный анализ мРНК пулов коры головного мозга мыши стадий 13-го н 15-го дня эмбрионального развития. Выявлен ряд генов, дифференциально экспрессирующихся в коре.

2. Идентифицирован ген нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS- домен. Проведен анализ распределения мРНК гена Npasl в эмбриональной ткани коры головного мозга. Показано, что экспрессия гена МразЗ в коре имеет дифференциальный характер.

3. Идентифицирован ген транскрипционного фактора Sipt. Проведен анализ паттерна экспрессии гена Sip! в эмбриональном развитии. Показано изменение характера эскпрсссии гена Sip] в ткани мозга мыши reeler.

4. Анализ линии мышей с инактивированным геном Sipl в коре головного мозга показал, что активность Sipl необходима для нормального развития гиппокампа и зубчатой извилины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. А.С.Поляков, О.В.Брнтанова, К.Ю.Усман, Н.А.Пунькова, С.А.Лукьянов, В.С.Тарабыкнн, Л.И.Корочкин. Новые нейрогены млекопитающих // Докл. АН, 2003, т. 392, N 3, С. 467-470.

2. А.С.Поляков, Н.Шпеер, О.В.Брнтанова, С.А.Лукьянов, В.С.Тарабыкнн, Л.И.Корочкин. Клонирование и анализ нового нейрогена мыши // Генетика, 2004, т. 40, N б, С. 853-857.

Тезисы конференций ;

]. Polyakov AS, Britanova OB, van de Putte T, Korochkin LI, Tarabykin VS. Smad- interacting protein 1 (Sipl) in the cerebral cortex development: expression and functional analysis study. Annual meeting of German genetic society, Kassel, 2003, p. 175.

2. Polyakov AS, Britanova OB, van de Putte T, Korochkin LI, Tarabykin VS. Smad- interacting protein 1 (Sipl) in the cerebral cortex development expression, and functional analysis study. Neural Stem Cell Conference (NSCC), MelboumJ 2003, p. 220. /

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Поляков, Александр Святославович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Нейральная индукция. Гены, участвующие в раннем паттернинге нервной ткани.

1.2 Генетический контроль ранней спецификации теленцефалона.

1.3 Формирование слоев коры головного мозга.

1.4 Типы миграций в дорзальной части теленцефалона.

1.5 Гены и их взаимодействия, лежащие в основе региональной спецификации теленцефалона.

1.6 Современные модели детерминации региональной клеточной судьбы в коре головного мозга.

1.7 Морфогены в определение клеточной судьбы в дорзальной части теленцефалона.

1.8 Гены етх2 и рахб - два градиента экспрессии в спецификации фенотипа клеток коры головного мозга.

1.9 Гены- молекулярные маркеры дорзального теленцефалона.

1.10 Нарушение развития коры головного мозга и болезни коры головного мозга.

1.11 Ген Sipl и нарушения, вызванные мутацией этого гена.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы и оборудование.

2.1.1. Лабораторные животные.

2.1.2. Оборудование.

2.1.3. Реактивы.

2.1.4 Буферные растворы.

2.1.5. Микробиологические среды.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение библиотек кДНК.

2.2.2. Дифференциальный скрининг библиотек кДНК.

2.2.3. Подтверждение дифференциальности фрагментов, отобранных в результате дифференциального скрининга.

2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности

2.2.5. Клонирование 5'-концевых частей генов.

2.2.6. Подготовка биологического материала.

2.2.7. Анализ распределения РНК в ткани методом гибридизации in situ на парафиновых секциях.

2.2.8. Анализ распределения белка SIP1 в эмбриональной ткани мозга мыши.

2.2.9. Анализ морфологии посредством окрашивания секций ткани мозга мыши по протоколу Nissl.

2.2.10. Анализ уровня запрограмированной клеточной смерти в эмбриональной ткани мозга мыши, полученной при инактивации гена Sipl в коре головного мозга.

2.2.11. Анализ пролиферативной клеточной активности методом встраивания и последующей иммунодетекции

BrdU.

2.2.12. Анализ распределения мРНК в ткани методом гибридизации in situ на «замороженных» секциях.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Применение вычитающей гибридизации на модели коры головного мозга мыши.

3.2. Анализ генов, полученных в результате вычитающей гибридизации.

3.2.1. Клонирование гена npas3, нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS домен.

3.2.2. Анализ экспрессии гена npas3 в эмбриогенезе мыши.

3.2.3. Доменная организация белка Npas3.

3.2.4. Клонирование фактора транскрипции Sipl.

3.2.5. Паттерн экспрессии гена Sipl в период эмбрионального развития.

3.2.6. Анализ паттерна экспрессии Sipl в конечном мозге.

3.2.7. Экспрессия SIP1 в Reeler мутанте.

3.2.8. Анализ функции гена SIP1 в развитии конечного мозга.

3.2.9. Тканеспецифическая инактивация гена Sipl.

2.10. Анализ морфологии мозга мышей, полученных при инактивации гена SIP1 в базальном ганглии.

3.2.11. Фенотипический анализ мутантов, полученных при инактивации гена SIP1 в коре головного мозга.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих"

Актуальность работы. В последние годы обнаружена существенная генетическая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека. Роль наследственности в формировании личности оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно- биологической и молекулярно- генетической техники. Понятно, что особое внимание уделяется при этом тем отделам головного мозга, которые играют определяющую роль в детерминации поведения в первую очередь теленцефалону.

Основными компонентами теленцефалона являются паллиум (pallium) (кора головного мозга у млекопитающих) и субпаллиум (subpallium) (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейрональных структур, таких как таламус, гипоталамус, обонятельный эпителий и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так и за ее интеграцию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенческих реакций.

Теленцефалон человека- это область, где сосредоточены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры приводят к специфическим сенсорным, моторным и эмоциональным расстройствам, к существенным изменениям личности. Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных и основные элементы его организации теленцефалона в эволюции в ряду позвоночных, несмотря на высокую морфологическую вариабельность.

Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерностей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливающие у человека ряд поведенческих особенностей и заболеваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как формируется теленцефалон откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых нейрологических и психических расстройств.

До последнего времени исследования развития теленцефалона ограничивались изучением морфологии и анатомии. И в этой области накоплен значительный фактический материал. Однако молекулярно- биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значительной степени непознанными. Определенный прорыв в определении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона, был сделан благодаря применению методов молекулярной генетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обусловленных ими поведенческих реакций.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования -идентификация генов, вовлеченных в регуляцию развития коры головного мозга. Задачи исследования предусматривают: 1) разработку методики поиска и отбора генов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга; 2) клонирование и определение первичной последовательности полноразмерных кДНК полученных генов; 3) анализ экспрессии; 4) функциональный анализ.

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода вычитающей гибридизации нам удалось клонировать ряд транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга. Был проведен анализ паттернов экспрессии выявленных генов в эмбриональной коре головного мозга. Выявленные в ходе данной работы гены являются молекулярными маркерами различных слоев коры и могут быть использован^ как инструмент для изучения развития коры головного мозга.

Один из генов, Sipl был подвергнут функциональному анализу с использованием метода ткане-специфической инактивации белкового продукта гена. Было показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры головного мозга.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на двух международных конференциях (Annual meeting of German genetic society, AMGGS, Kassel, 2003; Neural Stem Cell Conference (NSCC), Melbourn, 2003), а также на семинаре лаборатории «нейрогенетики и генетики развития», института биологии гена (февраль 2006).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на « 92 » страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (95 источников). Содержит 21 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Поляков, Александр Святославович

выводы

1. Проведен сравнительный анализ мРНК пулов коры головного мозга мыши стадий 13-го и 15-го дня эмбрионального развития. Выявлен ряд генов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга.

2. Идентифицирован ген нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS- домен. Проведен анализ распределения мРНК гена Npas3 в эмбриональной ткани коры головного мозга. Показано, что экспрессия гена Npas3 в коре имеет дифференциальный характер.

3. Идентифицирован ген транскрипционного фактора Sipl. Проведен анализ паттерна экспрессии гена Sipl в эмбриональном развитии. Показано изменение характера эскпрессии гена Sipl в ткани мозга мыши reeler.

4. Анализ линии мышей с инактивированным геном Sipl в коре головного мозга показал, что активность Sipl необходима для нормального развития гиппокампа и зубчатой извилины.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной диссертационной работе описан путь от дизайна скрининга до анализа функции одного из полученных генов. Для поиска дифференциально экспрессирующихся генов использовался актуальный на тот момент метод вычитающий гибридизации. В результате нам удалось выполнить сугубо прикладную задачу-создать коллекцию генов- маркеров различных зон и слоев коры головного мозга. Данная коллекция является мощным инструментом для изучения развития дорзальной части теленцефалона.

Далее мы получили два различных изменения фенотипа при независимой инактивации гена Sipl в вентральной и дорзальной части теленцефалона.

Линия мышей с инактивированным геном Sipl в коре головного мозга является моделью синдрома Mowat- Wilson человека. Данная линия мышей поможет при изучении данной болезни, характеризующейся дефектами в структуре медиального аспекта коры головного мозга. Фенотипический анализ, описанный в диссертационной работе не ответил на вопрос о месте Sipl в генной иерархии Wnt и Tgf-beta сигнальных путей.

В заключение надо сказать, что данная работа ставит множество вопросов и открывает широкие перспективы для дальнейших научных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поляков, Александр Святославович, Москва

1. Mangold О. Uber die induktionsfahighkeit der verschiedenen bezirke der neurula von Urodelen. Naturwissenshaften 21, 761-766 (1933)

2. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers? Nature Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).

3. Beddington, R. S. & Robertson, E. J. Anterior patterning in mouse. Trends Genet. 14,277-284 (1998).

4. Lu, С. C., Brennan, J. & Robertson, E. J. From fertilization to gastrulation: axis formation in the mouse embiyo. Curr. Opin. Genet. Dev. 11,384-392(2001).

5. Thomas, P. & Beddington, R. Anterior primitive endoderm may be responsible for patterning the anterior neural plate in the mouse embiyo. Curr. Biol. 6,1487-1496 (1996).

6. Beddington, R. S. & Robertson, E. J. Axis development and early asymmetry in mammals. Cell 96,195-209 (1999).

7. Nieuwkoop, P. D. & Nigtevecht, G. V. Neural activation and transformation in explants of competent ectoderm under the influence of fragments of anterior notochord in Urodeles. J.Embryol. Exp. Morph. 2,175-193 (1954).

8. Sasai, Y. & De Robertis, E. M. Ectodermal patterning in vertebrate embryos. Dev. Biol. 182,5-20 (1997).

9. Moon, R. T. & Kimelman, D. From cortical rotation to organizer gene expression: toward a molecular explanation of axis specification in Xenopus. Bioessays 20,536-545 (1998).

10. Altmann, C. R. & Brivanlou, A. H. Neural patterning in the vertebrate embryo. Int. Rev. Cytol. 203,447-482 (2001).11 .Schier, A. F. Axis formation and patterning in zebrafish. Curr. Opin. Genet. Dev. 11,393-404 (2001).

11. Bouwmeester, Т., Kim, S., Sasai, Y., Lu, B. & De Robertis, E. M. Cerberus is a head-inducing secreted factor expressed in the anterior endoderm of Spemann's organizer. Nature 382,595-601 (1996).

12. Glinka, A. et al. Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature 391, 357-362 (1998).

13. M.Thomsen, G. H. Antagonism within and around the organizer: BMP inhibitors in vertebrate body patterning. Trends Genet. 13, 209-211 (1997).

14. Harland, R. Neural induction. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 357-362 (2000).

15. Wessely, O. & De Robertis, E. M. Neural plate patterning by secreted signals. Neuron 33,489-491 (2002).

16. Shimamura, K. & Rubenstein, J. L. Inductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain. Development 124, 2709-2718 (1997).

17. Houart, C., Westerfield, M. & Wilson, S. W. A small population of anterior cells patterns the forebrain during zebrafish gastrulation. Nature 391, 788-792 (1998).

18. Heisenberg, C. P. et al. A mutation in the Gsk3-binding domain of zebrafish Masterblind/Axinl leads to a fate transformation of telencephalon and eyes to diencephalon. Genes Dev. 15, 1427-1434 (2001).

19. Masai, I. et al. floating head and masterblind regulate neuronal patterning in the roof of the forebrain. Neuron 18,43-57 (1997).

20. Houart, C. et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron 35, 255265 (2002).

21. Ericsson, J. et al. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: a common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell 81, 747-756 (1995).

22. Chiang, C. et al. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature 383,407-413 (1996).

23. Kohtz, J. D., Baker, D. P., Corte, G. & Fishell, G. Regionalization within the mammalian telencephalon is mediated by changes in responsiveness to Sonic Hedgehog. Development 125, 5079-50891998).

24. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H. & Fishell, G. A method for rapid gain-of-fiinction studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neurosci. 2, 812-819 (1999).

25. Reichert, H. & Simeone, A. Conserved usage of gap and homeotic genes in patterning the CNS. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 589-5951999).

26. Rallu, M. et al. Dorso-ventral patterning is established in the telencephalon of mutants lacking both Gli3 and Hedgehog signaling. Development 129,4963-4974 (2002).

27. Schuurmans, C. & Guillemot, F. Molecular mechanisms underlying cell fate specification in the developing telencephalon. Curr. Opin. Neurobiol. 12,26-34(2002).

28. Knoetgen, H., Teichmann, U. & Kessel, M. Head organizing activities of endodermal tissues in vertebrates. Cell. Mol. Biol. 45, 481-492 (1999).

29. Shimamura K, Rubenstein JL. Inductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain. Development. 1997 Jul; 124( 14):2709-18.

30. Fukuchi-Shimogori T, Grove EA. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 2001 Nov 2;294(5544): 1071-4.

31. Furuta Y, Piston DW, Hogan BL. Bone morphogenetic proteins (BMPs) as regulators of dorsal forebrain development. Development. 1997 Jun;124(ll):2203-12.

32. Lee KJ, Dietrich P, Jessell TM. Genetic ablation reveals that the roof plate is essential for dorsal interneuron specification. Nature. 2000 Feb 17;403(6771):734-40.

33. Millonig JH, Millen KJ, Hatten ME. The mouse Dreher gene Lmxla controls formation of the roof plate in the vertebrate CNS. Nature. 2000 Feb 17;403(6771):764-9.

34. Monuki ES, Porter FD, Walsh CA. Patterning of the dorsal telencephalon and cerebral cortex by a roof plate-Lhx2 pathway. Neuron. 2001 Nov 20;32(4):591-604

35. Dou CL, Li S, Lai E. Dual role of brain factor-1 in regulating growth and patterning of the cerebral hemispheres. Cereb Cortex. 1999 Sep;9(6):543-50.

36. Lee SM, Tole S, Grove E, McMahon AP. A local Wnt-3a signal is required for development of the mammalian hippocampus. Development. 2000 Feb;127(3):457-67.

37. Megason SG, McMahon AP A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 2002 May; 129(9):2087-98.

38. Tole, S. et al (2000) Emx2 is required for growth of the hippocampus but not for hippocampal field specification. J. Neurosci. 20, 2618— 2625

39. Bishop KM, Goudreau G, O'Leary DDM: Regulation of area identity inthe mammalian neocortex by Emx2 and Рахб. Science 2000, 288:344-349.

40. Mallamaci A, Muzio L, Chan CH, Parnavelas J, Boncinelli E: Areaidentity shifts in the early cerebral cortex of Emx2-/- mutant mice. Nat Neurosci 2000,3:679-686.

41. Porteus MH, Brice AE, Bulfone A, Usdin ТВ, Ciaranello RD, Rubenstein JL. (1992) Isolation and characterization of a library of cDNA clones that are preferentially expressed in the embryonic telencephalon. Mol Brain Research. 12, 7-22.

42. Usui H, Ichikawa T, Miyazaki Y, Nagai S, Kumanishi T. (1996) Isolation of cDNA clones of the rat mRNAs expressed preferentially in the prenatal stages of brain development. Brain Res Dev Brain Res. 97,185-93.

43. Rubenstein JL, Anderson S, Shi L, Miyashita-Lin E, Bulfone A, Hevner R. (1999) Genetic control of cortical regionalization and connectivity. Cereb Cortex. 9, 524-32.

44. Weimann JM, Zhang YA, Levin ME, Devine WP, Brulet P, McConnell SK. (1999) Cortical neurons require Otxl for the refinement of exuberant axonal projections to subcortical targets. Neuron. 24,819-31.

45. Toma JG, El-Bizri H, Barnabe-Heider F, Aloyz R, Miller FD. (2000) Evidence that helix-loop-helix proteins collaborate with retinoblastoma tumor suppressor protein to regulate cortical neurogenesis. J Neurosci. 20, 7648-56.

46. Dobyns WB, Truwit CL. (1995) Lissencephaly and other malformations of cortical development: 1995 update. Neuropediatrics. 26,132-47.

47. Pilz DT, Macha ME, Precht KS, Smith AC, Dobyns WB, Ledbetter DH. (1998) Fluorescence in situ hybridization analysis with LIS1 specific probes reveals a high deletion mutation rate in isolated lissencephaly sequence. Genet Med., 29-33.

48. Sicinski P, Donaher JL, Parker SB, Li T, Fazeli A, Gardner H, Haslam SZ, Bronson RT, Elledge SJ, Weinberg RA. (1995) Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast. Cell. 82,621-30.

49. Huard JM, Forster CC, Carter ML, Sicinski P, Ross ME. (1999) Cerebellar histogenesis is disturbed in mice lacking cyclin D2. Development. 126,1927-35.

50. Miyazono, K., et al., Divergence and Convergence of TGFb/BMP Signaling J. Cell. Physiol., 2002. 187(265-276).

51. Ragsdale CW and Grove EA. Patterning the mammalian cerebral cortex. Current Opinion in Neurobiology, 2001, 11:50-58

52. Wakamatsu, N., et al., Mutations in SIP1, encoding Smad interacting protein-1, cause a form of Hirschsprung disease. Nat Genet, 2001. 27(4): p. 369-70.

53. Yamada, K., et al. Nonsense and frameshift mutations in ZFHX1B, encoding Smad-interacting protein 1, cause a complex developmental disorder with a great variety of clinical features. Am J Hum Genet, 2001.69(6): p. 1178-85.

54. Charlier C, Segers C, Karim L, Shay T, Gyapay G, Cockett N, Georges M.Mutations in SIP1, encoding Smad interacting protein-1, cause a form of Hirschsprung disease. Nature Genetics, 27, 369-370.

55. Wilson, M., Mowat D., Clayton-Smith, J., Townshend, S., Goossens M, 2003. Further delineation of the phenotype associated with heterozygous mutations in ZFHX1B. American Journal of Medical Genetics, 119A, 257-265.

56. Allendoerfer KL, Shatz С J. (1994) The subplate, a transient neocortical structure: its role in the development of connections between thalamus and cortex. Annu Rev Neurosci. 17, 185-218.

57. Tarabykin V, Stoykova A, Usman N, Gruss P. (2001) Cortical upper layer neurons derive from the subventricular zone as indicated by Svetl gene expression. Development. 128,1983-93.

58. Nadarajah B, Alifragis P, Wong RO, Parnavelas JG. (2002) Ventricle-directed migration in the developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 5, 218-24.

59. Nadarajah B, Brunstrom JE, Grutzendler J, Wong RO, Pearlman AL. (2001) Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, 143-50.

60. Menezes JR, Luskin MB. (1994) Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. J Neurosci. 14,5399-416.

61. Jimenez D, Lopez-Mascaraque LM, Valverde F, De Carlos JA. (2002) Tangential migration in neocortical development. Dev Biol. 244, 15569.

62. Marillat V, Cases O, Nguyen-Ba-Charvet KT, Tessier-Lavigne M, Sotelo C, Chedotal A. (2002) Spatiotemporal expression patterns of slit and robo genes in the rat brain. J Comp Neurol. 442,130-55.

63. Zhu Y., Li H., Zhou L., Wu J. Y. & Rao, Y. (1999) Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron 23,473-485.

64. Wu W, Wong K, Chen J, Jiang Z, Dupuis S, Wu JY, Rao Y. (1999) Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit. Nature. 400,331-6.

65. Alcantara S, Ruiz M, D'Arcangelo G, Ezan F, de Lecea L, Curran T, Sotelo C, Soriano E. (1998) Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. J Neurosci. 18, 7779-99.

66. D'Arcangelo G, Homayouni R, Keshvara L, Rice DS, Sheldon M, Curran T. (1999) Reelin is a ligand for lipoprotein. Neuron. 24,471-9.

67. Chomczynski P, Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162,156-9.

68. Luk'yanov S.A., Gurskaya N.G., Luk'yanov K.A., Tarabykin V.S., and Sverdlov E.D. (1994) Highly efficient subtractive hybridization of cDNA. Journal of Bioorganic Chemistry, 20,386-388.

69. Kamnasaran D, Muir W. J., Ferguson-Smith M. A., Cox D.W. (1996) Disruption of the neuronal PAS3 gene in a family affected with schizophrenia. J. Med. Genet. 40,325-332.

70. Brunskill EW, Witte DP, Shreiner AB, Potter SS. (1999) Characterization of npas3, a novel basic helix-loop-helix PAS gene expressed in the developing mouse nervous system. Mech Dev. 88(2), 237-41.

71. Hebert JM, Mishina Y, McConnell SK. (2002) BMP signaling is required locally to pattern the dorsal telencephalic midline. Neuron. 35(6), 1029-41.

72. Galceran J, Miyashita-Lin EM, Devaney E, Rubenstein JL, Grosschedl R. (2000) Hippocampus development and generation of dentate gyrus granule cells is regulated by LEF1. Development. 127(3), 469-82.

73. Theil T, Aydin S, Koch S, Grotewold L, Ruther U. (2002) Wnt and Bmp signalling cooperatively regulate graded Emx2 expression in the dorsal telencephalon. Development. 129(13), 3045-54.1. БЛАГОДАРНОСТИ

74. Написание этой работы было бы невозможным без поддержки множества людей.

75. Но прежде всего, я хочу выразить огромную благодарность моим родным за нескончаемую помощь и недюжинное терпение.

76. Искренне благодарю моих научных руководителей Леонида Ивановича Корочкина и Галину Павлову за бесконечную поддержку.

77. Также я хочу выразить свое признание Наталье Усман и Nora Speer за помощь в проведении экспериментов.

78. Особая благодарность Ольге Симоновой и Илье Мерцалову за ценные замечания и критику при прочтении материалов диссертации.

79. Я выражаю благодарность Любови Сергеевне Грабовской за ее снисходительность и неоценимую помощь при оформлении данной работы.

80. Выражаю благодарность Tom van den Putte, Kevin Jones Guilermo Oliver за предоставленные линии мышей.