Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Британова, Ольга Владимировна

1.Литературный обзор

1.1. Анатомический аспект развития головного мозга

1.2. Структура коры головного мозга

1.3. Ненейральные типы клеток в коре головного мозга

1.4. Формирование слоев коры ГМ

1.5. Роль митоза в детерминации клеточного фенотипа

1.6. Клеточная судьба и клетки-предшественники

1.7. Роль глиальных клеток в развитии коры

1.8. Типы миграций в коре

1.9. Модели детерминации региональной клеточной судьбы в коре головного мозга

1.10.Морфогены в определение клеточной судьбы в коре

1.11. Ешх2 и Рахб - два градиента

1.12. Молекулярные маркеры слоев коры ГМ

1.13. Нарушение развития коры головного мозга и болезни коры головного мозга

2. Результаты и их обсуждения

2.1. Подходы и модели, использованные в работе

2.1.1. Применение метода дифференциального дисплея на модели коры ГМ хорька

2.1.2. Применение вычитающей гибридизации на модели коры ГМ мыши

2.2. Анализ найденных генов

2.2.1. Клонирование гомолога гена PTTG крысы из хорька и мыши

2.2.2. Анализ экспрессии PTTG мыши в эмриогенезе

2.2.3. Идентификация гена laf4 мыши

2.2.4. Анализ экзон-интронной организации гена laf4 мыши

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих"

Кора головного мозга является одной из наиболее сложных структур переднего мозга млекопитающих. Функционирование переднего мозга и коры, в частности, ассоциировано с такими высшими функциями нервной системы как мышление, память, обработка сенсорной и двигательной информации. Многие серьезные заболевания, например, болезнь Паркинсона, лизенцефалия и шизофрения в первую очередь связаны с нарушениями в работе переднего мозга. Часто эти нарушения базируются на ошибках, произошедших в ходе развития нервной ткани.

До сих пор остается много нерешенных вопросов, связанных с процессом развития коры млекопитающих. Одной из ключевых проблем является проблема дифференцировки клеток, которая включает такие вопросы: когда и какие молекулы вовлечены в определение клеточной судьбы, как регулируется корректное распределение клеток внутри кортикальной пластины, а как регулируется формирование аксональных связей. Одним из наиболее эффективных подходов к решению этой проблемы является поиск и исследование генов, вовлеченных в подобные процессы. Целью настоящей работы была идентификация и анализ новых генов, которые могут быть вовлечены в регуляцию развития коры головного мозга (ГМ) . Для решения этой задачи мы использовали две различные стратегии, которые основывались на применении принципиально различных методов (дифференциальный дисплей и вычитающая гибридизация) на нескольких моделях развития коры ГМ (кора ГМ) . В результате были найдены более двух десятков генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе развития коры ГМ. Были проведены исследования экспрессии выявленных генов в коре ГМ. Ряд обнаруженных генов являются молекулярными маркерами, которые могут быть использованы как инструмент для изучения развития коры ГМ млекопитающих. Три из них - PTTG, laf4 и новый гомеобокс-содержащий ген Stix - были подвергнуты более детальному анализу, в том числе структурному. 4

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Анатомический аспект развития головного мозга.

Головной мозг формируется из листка нейральной эктодермы. На ранних стадиях развития образуются три первичных мозговых пузыря - прозенцефалон, мезенцефалон и ромбенцефалон, которые впоследствии преобразуются в передний, средний и задний мозг (1).

Формирование коры головного мозга происходит после так называемой стадии пяти мозговых пузырей, когда передний мозговой пузырь (прозенцефалон) разделяется с образованием конечного мозга (теленцефалон) и диэнцефалона. Латеральные пузыри теленцефалона дорзальная его часть) представляют собой будущую кору головного мозга. С образованием латеральных желудочков нейроэпителий, выстилающий их стенки, начинает продуцировать нейроны и глию. Основные этапы развития теленцефалона являются сходными для всех видов млекопитающих. Однако различными являются временные рамки, когда происходят те или иные события. Так, у грызунов развитие коры происходит быстрее, чем у приматов, а также внутри самой группы грызунов наблюдается определенный временной сдвиг. Так, например, временная разница между событиями, происходящими в развитии кортекса крысы и мыши, составляет 1.5-2 дня. У высших млекопитающих наиболее развитой является новая кора (неокортекс), которая представляет собой филогенетически новое образование. Она окружена филогенетически более древними тканями, такими как древняя кора, старая кора (архи-, палеокортекс, соответственно) и лимбическая кора (атлас либо развитие коры) . Наше внимание в дальнейшем будет сосредоточено в основном на событиях, связанных с развитием новой коры (рис . 1 ) .

Рисунок 1. А. Общий план строения конечного мозга. Левая полусфера открыта, чтобы показать позицию базального ганглия. Б. Развернутый вид сверху полусферы коры ГМ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Британова, Ольга Владимировна

БывОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ мРНК пулов различных стадий развития коры головного мозга хорька и мыши. Создана коллекция генов-маркеров развития различных зон и слоев эмбриональной коры головного мозга.

2. Идентифицирован PTTG ген хорька. Показано, что уровень экспрессии гена меняется в ходе клеточного цикла в вентрикулярной зоне коры головного мозга, достигая максимума в период перехода G2/M.

3 . Идентифицирован ранее не описанный гомеобокс-содержащий ген STIX. Проведен анализ распределения мРНК и белка STIX. Показано, что экспрессия гена STIX в развивающейся коре головного мозга имеет градиентный характер.

4. Клонирован мышиный гомолог транскрипционного фактора Laf4 человека. Проведен анализ геномной организации этого гена. Выявленно наличие различных альтернативно сплайсированных форм мРНК laf4. Показано, что в постнатальный и эмбриональный период экспрессируются разные формы мРНК laf4 в коре головного мозга мыши.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Британова, Ольга Владимировна, Москва

1. Alvarez-Bolade G, Swanson LW. (1996) Developmental brain maps. Structure of the embryonic rat brain. Elsevier, pp 4-26

2. McConnell SK. J Neurosci. (1995) Strategies for the generation of neuronal diversity in the developing central nervous system 15, 6987-98.

3. Price DJ, Willshaw D. (2000) Mechanisms of cortical development, Oxford University press, pp24-33.

4. Bruck W, Herms J, Brockmann K, Schulz-Schaeffer W, Hanefeld F. (2001) Myelinopathia centralis diffusa (vanishing white matter disease): evidence of apoptotic oligodendrocyte degeneration in early lesion development. Ann Neurol. 50, 532-6.

5. Schroeter M, Jander S, Huitinga I, Witte OW, Stoll G. (1997) Phagocytic response in photochemically induced infarction of rat cerebral cortex. The role of resident microglia. Stroke. 28, 382-6.

6. Zerlin M, Goldman JE. (1997) Interactions between glial progenitors and blood vessels during early postnatal corticogenesis: blood vessel contact represents an early stage of astrocyte differentiation. J Comp Neurol. 387, 537-46.

7. Ogawa M, Miyata T, Nakajima K, Yagyu K, Seike M, Ikenaka K, Yamamoto H, Mikoshiba K. (1995) The reeler gene-associated antigen on Cajal-Retzius neurons is a crucial molecule for laminar organization of cortical neurons. Neuron. 14, 899-912.

8. Allendoerfer KL, Shatz CJ. (1994) The subplate, a transient neocortical structure: its role in the79development of connections between thalamus and cortex. Annu Rev Neurosci. 17, 185-218.

9. Takahashi T, Nowakowski RS, Caviness VS Jr. (1995) Early ontogeny of the secondary proliferative population of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6058-68.

10. Smart, I. H. and Smart, M. (1982) Growth patterns in the lateral wall of the mouse telencephalon: I. Autoradiographic studies of the histogenesis of the isocortex and adjacent areas. J. Anat. 134, 273-298.

11. Tarabykin V, Stoykova A, Usman N, Gruss P. (2001) Cortical upper layer neurons derive from the subventricular zone as indicated by Svetl gene expression. Development. 128, 1983-93.

12. McConnell SK. (1988) Fates of visual cortical neurons in the ferret after isochronic and heterochronic transplantation. J Neurosci. 8, 945-74.

13. McConnell SK, Kaznowski CE. (1991) Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-5.

14. Cai L, Hayes NL, Nowakowski RS. (1997) Local homogeneity of cell cycle length in developing mouse cortex. J Neurosci. 17, 2079-87.

15. Polleux F, Dehay C, Moraillon B, Kennedy H. (1997) Regulation of neuroblast cell-cycle kinetics plays a crucial role in the generation of unique features of neocortical areas. J Neurosci. 17, 7763-83.

16. Morrow T, Song MR, Ghosh A. (2001) Sequential specification of neurons and glia by developmentallyregulated extracellular factors. Development. 128, 3585-94.

17. Qian X, Shen Q, Goderie SK, He W, Capela A, Davis AA, Temple S. (2000) Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80.

18. Arimatsu Y, Ishida M, Takiguchi-Hayashi K, and Uratani Y. (1999) Cerebral cortical specification by early potential restriction of progenitor cells and later phenotype control of postmitotic neurons. Development 126, 629-638.

19. Fujita, (1963) Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. J. Сотр.Neurol. 122, 311-328.

20. Chenn A, McConnell SK. (1995) Cleavage orientation and the asymmetric inheritance of Notchl immunoreactivity in mammalian neurogenesis. Cell. 82, 631-41.

21. McConnell SK, Kaznowski CE. (1991) Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254,282-5.

22. Campos LS, Duarte AJ, Branco T, Henrique D. (2001) mDlll and mDll3 expression in the developing mouse brain: role in the establishment of the early cortex. J Neurosci Res. 64, 590-8.

23. Li RY, Baba S, Kosugi I, Arai Y, Kawasaki H, Shinmura Y, Sakakibara SI, Okano H, Tsutsui Y. (2001) Activation of murine cytomegalovirus immediate early promoter in cerebral ventricular zone and glial progenitor cells in transgenic mice.Glia. 35, 41-52.

24. Grove EA, Williams BP, Li DQ, Hajihosseini M, Friedrich A, Price J. Multiple restricted lineages in81the embryonic rat cerebral cortex. Development. (1993) 117, 553-61.

25. Kornack DR, Rakic P. (1995) Radial and horizontal deployment of clonally related cells in the primate neocortex: relationship to distinct mitotic lineages. Neuron. 15, 311-21.

26. Frantz GD, McConnell SK. (1996) Restriction of late cerebral cortical progenitors to an upper-layer fate. Neuron. 17, 55-61.

27. Rakic P. (1972) Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145, 61-83.

28. Choi ВН. (1981) Radial glia of developing human fetal spinal cord: Golgi, immunohistochemical and electron microscopic study. Brain Res. 227, 249-67.

29. Honig LS, Herrmann K, Shatz CJ. (1996) Developmental changes revealed by immunohistochemical markers in human cerebral cortex. Cereb Cortex. 6, 794-806.

30. Voigt T. (1989) Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. J Comp Neurol. 289, 74-88.

31. Noctor SC, Flint AC, Weissman ТА, Wong WS, Clinton BK, Kriegstein AR. (2002) Dividing precursor cells of the embryonic cortical ventricular zone have morphological and molecular characteristics of radial glia. J Neurosci. 22, 3161-73.

32. Miyata T, Kawaguchi A, Okano H, Ogawa M. (2001) Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31, 727-41.

33. Jimenez D, Lopez-Mascaraque LM, Valverde F, De Carlos JA. (2002) Tangential migration in neocortical development. Dev Biol. 244, 155-69.

34. Nadarajah В, Brunstrom JE, Grutzendler J, Wong RO, Pearlman AL. (2001) Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, 143-50.

35. Goffinet AM. (1983) The embryonic development of the cortical plate in reptiles: a comparative study in Emys orbicularis and Lacerta agilis. J Comp Neurol. 215, 437-52 .

36. O'Rourke NA, Sullivan DP, Kaznowski CE, Jacobs AA, McConnell SK. (1995) Tangential migration of neurons in the developing cerebral cortex. Development. 121, 216576.

37. O'Rourke NA, Chenn A, McConnell SK. (1997) Postmitotic neurons migrate tangentially in the cortical ventricular zone. Development. 124, 997-1005.

38. Menezes JR, Luskin MB. (1994) Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. J Neurosci. 14, 5399-416.

39. Corbin JG, Nery S, Fishell G. (2001) Telencephalic cells take a tangent: non-radial migration in the mammalian forebrain. Nat Neurosci. 4 Suppl:1177-82 .

40. Nadarajah B, Alifragis P, Wong RO, Parnavelas JG. (2002) Ventricle-directed migration in the developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 5, 218-24.

41. Marillat V, Cases 0, Nguyen-Ba-Charvet KT, Tessier-Lavigne M, Sotelo C, Chedotal A. (2002) Spatiotemporal expression patterns of slit and robo genes in the rat brain. J Comp Neurol. 442, 130-55.

42. Zhu, Y., Li, H., Zhou, L., Wu, J. Y. & Rao, Y. (1999) Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron 23, 473-485.

43. Marin 0, Yaron A, Bagri A, (2001) Tessier-Lavigne M, Rubenstein JL.Sorting of striatal and cortical interneurons regulated by semaphorin-neuropilin interactions. Science. 293, 872-5.

44. Alcantara S, Ruiz M, D'Arcangelo G, Ezan F, de Lecea L, Curran T, Sotelo C, Soriano E. (1998) Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. J Neurosci. 18, 7779-99.

45. D'Arcangelo G, Homayouni R, Keshvara L, Rice DS, Sheldon M, Curran T. (1999) Reelin is a ligand for lipoprotein. Neuron. 24, 471-9.

46. Rakic P. (1988) Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-6.

47. O'Leary DD, Schlaggar BL, Tuttle R. (1994) Specification of neocortical areas and thalamocortical connections. Annu Rev Neurosci. 17, 419-39.

48. Obst K, Wahle P. (1997) Phenotype specification of cortical neurons during a period of molecular plasticity. Eur J Neurosci. 9, 2571-80.

49. Chiang C, Litingtung Y, Lee E, Young KE, Corden JL, Westphal H, Beachy PA. (1996) Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 407-13.

50. Shimamura K, Rubenstein JL. (1997) Inductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain. Development. 124, 2709-18.

51. Fukuchi-Shimogori T, Grove EA. (2 001) Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-4.

52. Furuta Y, Piston DW, Hogan BL. (1997) Bone morphogenetic proteins (BMPs) as regulators of dorsal forebrain development. Development. 124, 2203-12.84

53. Millonig JH, Millen KJ, Hatten ME. (2000) The mouse Dreher gene Lmxla controls formation of the roof plate in the vertebrate CNS. Nature. 40, 764-9.

54. Lee KJ, Dietrich P, Jessell TM. (2000) Genetic ablation reveals that the roof plate is essential for dorsal interneuron specification. Nature. 403, 734-40.

55. Monuki ES, Porter FD, Walsh CA. (2001) Patterning of the dorsal telencephalon and cerebral cortex by a roof plate-Lhx2 pathway. Neuron. 32, 591-604

56. Dou CL, Li S, Lai E. (1999) Dual role of brain factor-1 in regulating growth and patterning of the cerebral hemispheres. Cereb Cortex. 9, 543-50.

57. Lee SM, Tole S, Grove E, McMahon AP. (2000) A local Wnt-3a signal is required for development of the mammalian hippocampus. Development. 127, 457-67.

58. Dickinson ME, Krumlauf R, McMahon AP. (1994) Evidence for a mitogenic effect of Wnt-1 in the developing mammalian central nervous system. Development. 120, 1453-71.

59. Ikeya M, Lee SM, Johnson JE, McMahon AP, Takada S. (1997) Wnt signalling required for expansion of neural crest and CNS progenitors. Nature. 389, 966-70.

60. Megason SG, McMahon AP (2002)A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129, 2087-98.

61. Estivill-Torrus G, Pearson H, van Heyningen V, Price DJ, Rashbass P. (2002) Рахб is required to regulate the cell cycle and the rate of progression from symmetrical to asymmetrical division in mammalian cortical progenitors. Development. 129, 455-66.

62. Porteus MH, Brice AE, Bulfone A, Usdin ТВ, Ciaranello RD, Rubenstein JL. (1992) Isolation and characterization of a library of cDNA clones that are85preferentially expressed in the embryonic telencephalon. Mol Brain Research. 12, 7-22.

63. Usui H, Ichikawa T, Miyazaki Y, Nagai S, Kumanishi T. (1996) Isolation of cDNA clones of the rat mRNAs expressed preferentially in the prenatal stages of brain development. Brain Res Dev Brain Res. 97, 185-93.

64. Rubenstein JL, Anderson S, Shi L, Miyashita-Lin E, Bulfone A, Hevner R. (1999) Genetic control of cortical regionalization and connectivity. Cereb Cortex. 9, 52432 .

65. Toma JG, El-Bizri H, Barnabe-Heider F, Aloyz R, Miller FD. (2000) Evidence that helix-loop-helix proteins collaborate with retinoblastoma tumor suppressor protein to regulate cortical neurogenesis. J Neurosci. 20, 7648-56.

66. Weimann JM, Zhang YA, Levin ME, Devine WP, Brulet P, McConnell SK. (1999) Cortical neurons require Otxl for the refinement of exuberant axonal projections to subcortical targets. Neuron. 24, 819-31.

67. Dobyns WB, Truwit CL. (1995) Lissencephaly and other malformations of cortical development: 1995 update. Neuropediatrics. 26, 132-47.

68. Pilz DT, Macha ME, Precht KS, Smith AC, Dobyns WB, Ledbetter DH. (1998) Fluorescence in situ hybridization analysis with LIS1 specific probes reveals a high deletion mutation rate in isolated lissencephaly sequence. Genet Med., 29-33.

69. Sicinski P, Donaher JL, Parker SB, Li T, Fazeli A, Gardner H, Haslam SZ, Bronson RT, Elledge SJ, Weinberg RA. (1995) Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast. Cell. 82, 621-30.

70. Huard JM, Forster CC, Carter ML, Sicinski P, Ross ME. (1999) Cerebellar histogenesis is disturbed in mice lacking cyclin D2. Development. 126, 1927-35.

71. Hsueh YP, Wang TF, Yang FC, Sheng M. (2000) Nuclear translocation and transcription regulation by the membrane-associated guanylate kinase CASK/LIN-2. Nature. 404, 298-302.

72. Hevner RF, Shi L, Justice N, Hsueh Y, Sheng M, Smiga S, Bulfone A, Goffinet AM, Campagnoni AT, Rubenstein JL. (2001) Tbrl regulates differentiation of the preplate and layer 6. Neuron. 29, 353-66.

73. Zhang YA, Okada A, Lew CH, McConnell SK. (2002) Regulated nuclear trafficking of the homeodomain protein otxl in cortical neurons. Mol Cell Neurosci. 19, 430-46.

74. Hatanaka Y, Jones EG. (1999) Novel genes expressed in the developing medial cortex. Cereb Cortex. 9, 57785 .

75. Bishop KM, Goudreau G, 0'Leary DD. (2000) Regulation of area identity in the mammalian neocortex by Emx2 and Рахб. Science. 288, 344-9.

76. Mallamaci A, Muzio L, Chan CH, Parnavelas J, Boncinelli E. (2000) Area identity shifts in the early cerebral cortex of Emx2-/- mutant mice. Nat Neurosci. 3, 679-86

77. Stoykova A, Treichel D, Hallonet M, Gruss P. (2000) Рахб modulates the dorsoventral patterning of the mammalian telencephalon. J Neurosci. 20, 8042-50.

78. Matz M, Usman N, Shagin D, Bogdanova E, Lukyanov S. (1997) Ordered differential display: a simple method for systematic comparison of gene expression profiles. Nucleic Acids Res. 25, 2541-2.87

79. Noctor SC, Scholnicoff NJ, Juliano SL. (1997) Histogenesis of ferret somatosensory cortex. J Comp Neurol. 387, 179-93.

80. Pei L, Melmed S. (1997) Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene (PTTG). Mol Endocrinol. 11,433-41.

81. Jiang W, Jimenez G, Wells NJ, Hope TJ, Wahl GM, Hunter T, Fukunaga R. (1998) PRC1: a human mitotic spindle-associated CDK substrate protein required for cytokinesis. Mol Cell. 2, 877-85.

82. Luk'yanov S.A., Gurskaya N.G., Luk'yanov K.A. , Tarabykin V.S., and Sverdlov E.D. (1994) Highly efficient subtractive hybridization of cDNA. Journal of Bioorganic Chemistry, 20, 386-388.

83. Zou H, McGarry TJ, Bernal T, Kirschner MW. (1999) Identification of a vertebrate sister-chromatid separation inhibitor involved in transformation and tumorigenesis. Science. 285, 418-22.

84. Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L, Chenchik A. (1999) Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res. 27, 1558-60.

85. Ma C, Staud LM. (1996) LAF4 encodes a lymphoid nuclear protein with activation potential that is homologous to AF-4, the gene fused to MLL in t(4;ll) leukemias. Blood. 87, 734-745.

86. Hillman MA, Gecz J. (2001) Fragile XE-associated familial mental retardation protein 2 (FMR2) acts as a potent transcription activator. J Hum Genet. 46, 251-9.

87. Taki T, Капо Н, Taniwaki М, Sako М, Yanagisawa М, Hayashi Y. (1999) AF5q31, a newly identified AF4-related gene, is fused to MLL in infant acute lymphoblastic leukemia with ins(5;ll)(q31;ql3q23). Proc Natl Acad Sci USA. 96, 14535-40.

88. Prasad R, Yano T, Sorio C, Nakamura T, Rallapalli R, Gu Y, Leshkowitz D, Croce CM, Canaani E. (1995) Domains with transcriptional regulatory activity within the ALL1 and AF4 proteins involved in acute leukemia. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 12160-4.

89. Gecz J, Gedeon AK, Sutherland GR, Mulley JC. (1996) Identification of the gene FMR2, associated with FRAXE mental retardation. Nat Genet. 13, 105-8.

90. Burglin TR, (2002) Cassata G. Loss and gain of domains during evolution of cut superclass homeobox genes. Int J Dev Biol. 46, 115-23.

91. Tavares AT, Tsukui T, Izpisua Belmonte JC. (20 00) Evidence that members of the Cut/Cux/CDP family may be involved in AER positioning and polarizing activity during chick limbdevelopment. Development. 127, 513344 .

92. Blochlinger K, Bodmer R, Jan LY, Jan YN. (1990) Patterns of expression of cut, a protein required for external sensory organ development in wild-type and cut mutant Drosophila embryos. Dev. 4, 1322-31.

93. Lee SK, Pfaff SL. (2001) Transcriptional networks regulating neuronal identity in the developing spinal cord. Nat Neurosci. 4 Suppl, 1183-91.

94. Jessell TM. (2000) Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat Rev Genet. 1, 20-9.

95. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor.89

96. Ludlow С, Choy R, Blochlinger K. (1996) Functional analysis of Drosophila and mammalian cut proteins in files. Dev Biol. 178, 149-59.

97. Chomczynski P, Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem.162, 156-9.