Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и характеристика генов, расположенных в районе q14 хромосомы 13 человека, часто утрачиваемом у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и характеристика генов, расположенных в районе q14 хромосомы 13 человека, часто утрачиваемом у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.218+578.76

БАРАНОВА АННА ВЯЧЕСЛАВОВНА

Поиск и характеристика генов, расположенных в районе ql4 хромосомы 13 человека, часто утрачиваемом у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом

Специальность 03.00.06,- вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата наук

Москва-1998

Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института Общей Генетики им. Н.И.Вавилова РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор Н.К. Янковский доктор биологических наук Ю.В. Дорохов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор В.А.Гвоздев

доктор биологических наук Ф.ЛКиселев

специализированно! О при Московском

Государственном Университете им М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится

часов на заседании

Автореферат разослан"__ сентября 1998 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

В Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. B-клеточный хронический лимфолейкоз (В-XJTJI) является самым распространенным лимфопролиферативным заболеванием европейского населения, на его долю приходится 30% всех злокачественных заболеваний крови. Частота встречаемости B-XJIJI составляет 2.3/100.000 населения [Li, F.P. et al, 1991]. О генах, вовлеченных в развитие В-ХЛЛ, к началу дданной работы было известно немного. Хромосомный маркер D13S25, расположенный в прителомерной трети длинного плеча хромосомы 13 (полоса 13ql4.3), подвержен делециям у 18 - 60 % пациентов У некоторых пациентов наблюдали делеции гена RB1 (полоса 13ql4.2), не затрагивающие локус D13S25, что указывает на присутствие гена-супрессора, специфического для В-ХЛЛ и расположенного в области между RB1 и D13S25 [Brown, A.G. et al., 1993]. С помощью метода LOH (потери гетерозиготности микросателлитных маркеров) размер области пересечения делеций был определен в 280 т. п. н. [Devilder, М.С. et al., 1995]. Наибольшая частота делеций при В-ХЛЛ падает на хромосомный маркер D13S319 [Liu, Y. et al., 1995; Corcoran, M.M. et al., 1998].

Построение физической карты, представленной в виде набора перекрывающихся последовательностей рекомбинантных ДНК, известным образом расположенных вдоль хромосомы человека, является необходимым этапом поиска гена - супрессора опухолевого роста, расположенного в исследуемом участке хромосомы и предваряет построение транскрипционной карты участка. Поэтому к началу данного исследования построение такой карты было наиболее актуальным.

До настоящей работы не существовало также ни транскрипционной карты исследуемого района хромосомы 13, ни информации об экзон-интронной структуре генов, ни информации об открытых рамках трансляции, что необходимо для выявления кандидатных генов-супрессоров. Постановка и решение таких ззадач становилась возможной и поэтому актуальной в ходе данного исследования.

Цели и задачи исследования. Целями работы являлось создание физической карты района 13ql4.3 хромосомы 13, расположенного между молекулярно-генетическими маркерами D13S1168 и D13S25, определение границ минимального участка хромосомы, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, а также поиск и клонирование генов человека, расположенных в исследуемом районе.

Для этого были поставлены следующие задачи:

Приписать STS и EST-маркеры известной локализации и расположенные в исследуемом районе к рекомбинантным космидам. Создать конгиги на основе рекомбинантных космид, соединяющих эти STS и EST-маркеры.

Используя космиды, включенные нами в контиг, построить EcoRI- и Hindlll-рестрикционную карту, перекрывающую определенный к началу данного этапа работы минимальный участок (менее 130 т.п.н.), утрачиваемый у пациентов с В-ХЛЛ.

Используя рестрикционные фрагменты установленной локализации в качестве радиоактивно меченных проб уточнить границы минимального участка, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, с помощью гибридизации по Саузерну этих проб с геномной ДНК пациентов.

Используя космиды, перекрывающие охарактеризованную нами поврежденную область хромосомы, выявить кДНК, соответствующие этой области.

Проанализировать нуклеотидную последовательность минимального участка хромосомы, утрачиваемого у больных В-ХЛЛ с помощью существующих компьютерных программ, распознающих экспрессирующиеся последовательности генома человека.

Определить экзон-интронную структуру обнаруженных генов человека, картировать экзоны относительно границ минимального утрачиваемого участка, выявить открытые рамки считывания, провести поиск схожих нуклеотидных и

аминокислотных последовательностей среди экспрессирующихся последовательностей, хранящихся в общедоступных базах данных.

Оценить возможные гены с точки зрения их пригодности для дальнейшего анализа в качестве кандидатов на роль супрессора опухолевого роста, повреждаемого • или утрачиваемого при В-клеточном хроническом лимфолейкозе.

Научная новизна и практическая значимость работы. Построен непрерывный космидный контиг, перекрывающий участок хромосомы 13, ограниченный STS-маркерами D12S1168 и D13S25. К космидам, составляющим контиг, приписаны 12 EST и STS-маркеров. "Минимальный путь" перекрывания исследуемой области хромосомы 13 составляют 19 космидных клонов. Общая длина космидного контига составляет приблизительно 620 т.п.н. Для трех космид (с32а, сЗОа, 71al 1) определен порядок следования сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRJ и Hindlll и расстояние между этими сайтами. Определены границы и размер минимального участка, утрачиваемого у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом: размер участка составляет менее 10 т.п.н., центромерная граница проходит по фрагменту рЗО.З., а теломерная - в области, расположенной на 6 т.п.н. центромернее фрагмента р30.5. Гомозиготные потери ДНК минимального участка обнаружены у 14% исследованных случаев В-ХЛЛ (в 28 образцах из 206), а гемизиготные - в 36% случаев ( в 67 образцах из 206). Обнаружено 9 новых экспрессирующихся последовательностей человека, расположенных в районе ql4 хромосомы 13 человека. Проведено тонкое физическое картирование и определена экзон-интронная структура двух новых генов человека Leul и Leu2, являющихся возможными кандидатами на роль супрессоров опухолевого роста, повреждаемых или утрачиваемых при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Клонирован новый ген человека Leu5, кодирующий белок, содержащий цинк-связывающие домены RING и В-Ьох, а также так называемый «спирально скрученный» домен, что определяет принадлежность этого белка к семейству Rip, представители которого участвуют в процессах образования злокачественных опухолей, эмбриональной закладки органов и регуляции функционирования клеток иммунной системы.

Практическая ценность работы заключается в создании основы для дальнейшего мутационного скрининга клонированных в работе генов с целью выявления супрессора, ответственного за развитие В-клеточного хронического лимфолейкоза. Охарактеризованные в данной работе ДНК-пробы пригодны для ДНК-диагностики В-клеточного хронического лимфолейкоза.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде тезисов на 4 международных конференциях и двух отчетных конференциях Российской Программы «Геном Человека» (см. список собственных публикаций). По результатам работы опубликованы статьи в международных журналах "Oncogene" и 'TEBS Letters", статья в российском журнале "Молекулярная биология». Для раздела «Обзор литературы» был переработан и значительно расширен материал, представленный в обзорной статье, опубликованной в журнале «Молекулярная биология». Диссертация апробирована на заседании межлабораторного семинара «Молекулярные и клеточные основы генетических процессов» в Институте Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН 4 июня 1998 года.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение и выводы. Список литературы, приведенный в конце диссертации, включает 308 источников. Работа содержит 19 рисунков и 4 таблицы.

Работа выполнена в рамках планов и при финансировании со стороны ФЦНТП «Геном человека;), гранта по международному сотрудничеству Миннауки РФ и гранта по международному сотрудничеству Шведской Академии наук #1450.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ПОСТРОЕНИЕ КОСМИДНОГО КОНТИГА МЕЖДУ STS-МАРКЕРАМИ D13S1168 И D13S25 ХРОМОСОМЫ 13 ЧЕЛОВЕКА.

В качестве исходного материала для построения космидного контига, перекрывающего район хромосомы 13, часто утрачиваемый у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом, использовали космидные клоны библиотек ICRF и LANL, ранее приписанные к STS-маркерам, расположенным в исследуемом участке хромосомы [Капанадзе, Б.И. и др., 1997]. Другим источником материала явилась подвыборка космид библиотеки LANL, созданная на основе YAC-клонов СЕРН 745еЗ и ICRF 61с1, соответствующих району 13ql4.3 [Бродянский, В.М. и др., 1996].

На первом этапе построения космидного контига олигонуклеотидные пробы, радиоактивно меченые с помощью Т4-полинуклеотидкиназы, соответствующие известным STS и EST-маркерам, расположенным в районе построения контига, гибридизовали с нейлоновыми фильтрами, содержащими иммобилизованную ДНК упорядоченно размещенных космид подвыборки. Всего использовали 9 STS-маркеров (D13S1168, D13S319, D13S272, AFM206xfl2, D13S1269, AFM301wb5, GTC16C05, D13S262, D13S25) и 3 EST-маркера (10к4, 13gl, 13g2), описанных ранее [Капанадзе, Б.И. и др., 1997]. Истинность гибридизационного ответа каждого клона была проверена с помощью гибридизации по Саузерну соответствующих олигонуклеотидных проб с нейлоновыми фильтрами, содержащими электрофоретически разделенные фрагменты ДНК космидных клонов, полученные при обработке ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII. На этом этапе образовали 12 частично перекрывающихся групп космидных клонов, приписанных к генетически и физически картированным маркерам, описание которых содержится в базе данных Института Уайтхэд в сети «Интернет» по адресу: http://www-genonie.wi.mit.edu.

Среднее расстояние между STS маркерами превышало размер вставки в космидах, и полученные «островки» космидных карт нужно было соединить между собой, что и явилось задачей второго этапа картирования. При этом в качестве гибридизационных зондов использовали «рибопробы» - меченые транскрипты, получаемые от концов вставок ДНК в рекомбинантных космидах подвыборки LANL. В качестве матрицы для транскрипции использовали в основном индивидуальные концы вставок ДНК. Транскрипцию инициировали с промоторов ТЗ или Т7, прилежащих к концам вставок. Для генерации космидного контига использовали зонды, полученные от 172 индивидуальных концов космидных клонов. В качестве гибридизационных матриц использовали нейлоновые фильтры, содержащие иммобилизованную ДНК космид из подвыборки, а также набор фильтров, соответствующих полной библиотеке космид LANL.

Полученные гибридизационные данные двух этапов были объединены. Результаты гибридизации каждого зонда относительно каждого клона заносили в базу данных и обрабатывали с помощью компьютерной программы Contig, созданной А. Григорьевым и А.Мироновым (ГосГНИИГенетика) в рамках ГНТП «Геном человека». Программа предсказывает порядок перекрывания рекомбинантных молекул и длину перекрытого контигом участка картируемого генома. Данная программа доступна через Интернет по адресу: ftp://ftp.icnet.uk/icrf-public/GenomeAnalysis/icrf_contigv2.tar.Z.

Космидный контиг, полученный в результате компьютерной обработки гибридизационных данных, перекрыл исследуемый район, однако содержал брешь между маркерами D13S272 и AFM206xfl2 (См. Рис.3), а также несколько относительно «слабых» участков. Для перекрывания бреши и верификации структуры контига использовали набор космидных клонов, полученных путем субклонирования YAC ICRF

ста

гтз: ПС: / США: Р

01381168 +

0138319 0133272 АГМ20б1П2 01351269 АРМа301«Ь5 01351353 0135262 013525 ~ +

1СКГ 61с1----------------------------- * + ----126а9------—-/

+ +...+. сс31а5аа61а6а1а1а1с1916а11а11173аЗаа172711а4791а332344112А4344111143Ь<ЗЗЗЬЗЬЬРЬЬЬЬЬЗЬРЗРЬРЬ И 61127071Ь0371633338453095137341322925402032745121е9893129Т38312223721С25454411724422123233 О 6212 а 1к2Ь 2200093113а 7706дЗа197 90с16с9д0да£6021аеда67а»1аеа£ 6068а£4Т£д6д6350 82265639197 В 86£ 9 14 4 а Ь Ь д2М ЬЬ с2д19 2 с1хМ1 513<1 616575с1Ь635551<1дс1д18 181 1 7 2 с! а а

84

ТЗ, Т7, ЭР6 еп<1: 7 3 Бг1с1:

157с4 +++ 122£4. . 105£10

50а9 . . . ,+н 67Ь4

6Ы1.....

162а4

162аЗ.....

130Ь8

133Ы2 . . . . 95Ь2 60а1 157Ы2 27119

19112 . . . . 43ь3

143д9 . . . , 170с7 71а11 150с9 176с2

109<14 . . . . 167е6 12ЬЗ 1217 74с112 47д5 176Ь5

Зе11 . . . 116<Л0 29а6

38е5 . . . . 127Ь6 43а5 49д7 41И0

126(13 . . . . 120дб 138д4 99с7

32£8 . . . . 35д11

126(32 . . . 49с6 123Ь8

109(12 . . . 154Ы1 . . . 152е5

163с4 . . . 59£5

115Ь2 . . . , 23а12 . . . 55=11

9 1 2

353

3 3 73377377

17 2 91 921 4 2 19 16 0 036342 в 1 1 С 2 . . . О 0 1 .1

3 вз 3 3 3 335 3 г 333 3 3 3 3 3

3 77 7 3 7777 77 3 3 37 73737 3 777337 3 73773373

12 2

1.0 О з з

37 7 6 7

++++++++ + +++++-++++ ++++++++-+++

-м—++++---++-++++

»-ними----+++

ММ--

> > > М 1 1 +-+++++—

++++++++—+ +-+++++-+

■м—и---++

ЬАШ, ЦШ

ишь

IA1.IL ЫШЬ

ишь ХАНЬ ХАНЬ ХАЛЬ ХСНР ХСЯГ ХАЛЬ ишь ишь

ХСИГ

хсиг ишь ишь ишь ишь ишь ишь ишь ишь ХАЛЬ

ишь ишь ишь ишь хлмь ишь ишь ишь ишь ишь ишь ишь ишь ишь ышь ишь ишь ишь ишь ЬАНЬ ишь ишь ышь

Шк

ишь ишь ишь ишь

Рис.1. Космидный контиг между ЗТБ-марксрами 01351168 и 013825. ЗТБ-маркеры, приписали космидным клонам, обозначены сверху. Под ними расположены клоны, ДНК котор использована для приготовления меченых проб, значок <«», проставленный ниже названия про( означает что нуклеотидная последовательность данной пробы определена В тех случаях, ко> для приготовления рибопробы использовали только один из промоторов, находящихся в сост. космиды, его название обозначено цифрой (3 - для промотора ТЗ, 7 - для промотора Т7, 6 - ; промотора ЭР6). Значки «+» и «-«, поставленные в строку, означают негативный либо позитивн гибридизационный сигнал. Космидные клоны, образующие минимальный перекрывающш набор, обозначены подчеркиванием гибридизационных сигналов.

++ +++•*■++ +++++-++++

61cl, ICRF 126а9, СЕРН 922а8, перекрывающих район 13ql4.3 [Corcoran, М. et al., 1998]. Восемнадцать космидных клонов из этой регион-специфической клонотеки использовали для получения РНК-зондов и их последующей гибридизации с набором нейлоновых фильтров, соответствующих полным клонотекам LANL и ICRF. Обобщенные данные всех гибридизаций прошли повторную обработку с помощью программы Contig.

Верифицированный непрерывный космидный контиг перекрывает участок хромосомы 13, ограниченный STS-маркерами D12S1168 и D13S25 (Рис. 1). К космидам, составляющим контиг, приписаны 12 EST и STS-маркеров. "Минимальный путь" перекрывания исследуемой области хромосомы 13 составляют 18 космидных клонов, отмеченных на Рис.1. Средний размер вставки в космидах известен (34.5 т.п.н. для ICRF космид и 37.1 т.п.н. для LANL космид) [Капанадзе, Б.И. и др., 1996]. Исходя из этих данных общая длина космидного контига составляет приблизительно 620 т.п.н.

Часть данных этого раздела получена совместно с Б.И.Капанадзе и А.Б.Семовым (ИОГен РАН).

Использование нескольких различных космидных библиотек создало определенные преимущества для изучения выбранного района хромосомы. Во-первых, введение дополнительного числа клонов увеличило репрезентативность. Во-вторых, нельзя исключить существование вектор-специфичных различий по клонируемости и стабильности для определенных участков генома человека. Использованные клонотеки хромосомы 13 сделаны на основе разных векторов (клонотека LANL и регион-специфическая клонотека сконструированы в векторе sCos-1, содержащим репликон ColEl, клонотека ICRF - в производном фага лямбда Lawrist 4. Так, космиды ICRF использованы для укрепления контига на участке между маркерами D13S1168 и D13S319.

Следует также отметить, что порядок следования STS-маркеров, полученный по результатам построения контиговой карты и представленный на Рис.3, отличается от представленного в базе данных Института Уайтхэд инверсией положения двух маркеров в теломерной части перекрытого контигом участка.

Данная работа:

CEN - D13S1269 - AFM301wb5 - GCT16C05 - D13S262 - D13S25 - TEL.

Данные Института Уайтхэд:

CEN -D13S1269 - GCT16C05 - AFM301wb5 -D13S262 - D13S25 - TEL.

Порядок следования маркеров, описанный в данной работе, является более вероятным, поскольку построенный космидный контиг состоит из значительно более коротких рекомбинантых молекул, чем контиг, состоящий из клонов мега-YAC, легший в основу определения порядка следования STS-маркеров, проведенного в Институте Уайтхэд (40 т.п.н. космиды по сравнению с 1000 т.п.н. мега-YAC).

ДЕТАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ РАЙОНА ХРОМОСОМЫ 13, ЧАСТО УТРАЧИВОЕМОГО ПРИ В-ХЛЛ.

По данным, полученным от партнеров по данной работе (S. Einhorn, Отделение Онкологии и Патологии Каролинского Госпиталя, Стокгольм, Швеция), минимальный размер области, утрачиваемой у пациентов с B-клеточным хроническим лимфолейкозом, составляет менее 130 т.п.н. в области между STS-маркерами D13S1168 и D13S319 [Corcoran, M.M. et al., 1998]. На момент начала данного этапа работы этот регион был полностью перекрыт шестью космидными клонами регион-специфической клонотеки и клонотеки LANL, составляющими непрерывный контиг (сба, с25а, cía, с32а, сЗОа и 71al 1).

Для трех из этих космид (с32а, сЗОа, 71а11) нами определен порядок следования сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII и расстояние между этими сайтами. Для этой цели продукты энзиматического переваривания ДНК космид (EcoRI,

CEN

ЕсоШ

Р32.3

Ьеи2ех5 Д. Ьеи2 ех4

С32а

2.3 1.2

19-21

2.5+0.8 +0.5+0.6+0.3

J_1_1

9.4

ныш

Ьеи2 ехЗ 1 ' 13

I 65 I

СЗОа

Ьеи2 ех2

Ьеи2 Ьеи! ех1 ех!

1.61.9

Нзщ

8.4 . 14.0

2.1

К.си 1 сх2

13

I40! I

19-21

1.6 1.2

1.00.5 2.4 1.5

10.0 | 6.5 ||| 6.0 | 10.0 ||||| 8.2 |

I65 III 60 I

Рз}.1 р)ь.4

Рз}.5

19-21

0.9

Л.

МIII 82 I I

ТЕЬ

ЬА1ЧЬ 71а11

4.3 11

ЕсоШ

5.0

3.7 3.9

8.2 || 8.2 || 8.6

НЫ1П

Рис. 2. Подробная карта расположения рестрикционных фрагментов ЕсоШ и НтсПП, образующихся при обработке космид, перекрывающих минимальный участок, утрачиваемый у больных с В-ХЛЛ. Указано расположение экзонов генов Lei.il и Ьеи2. Обозначены участки, соответствующие пробам, использованным для проведения гибридизационных экспериментов.

HindIII и EcoRI+Hindlll перевары) разделяли в агарозном геле, затем переносили на нейлоновый фильтр.. Полученные фильтры использовали для гибридизации с радиоактивными пробами, приготовленными из каждого отдельного EcoRI- и HindlII-фрагмента каждой из трех картируемых космид. Результаты гибридизации использовали для построения карты рестриктных фрагментов, представленной на Рис 2. Размер области генома, для которого создана карта рестрикционных фрагментов, составляет около ЮОт.п.н.

Соответствие космидных клонов нативной структуре геномной ДНК подтверждено сопоставлением размеров клонированных и неклонированных фрагментов ДНК, выявленных нами при гибридизации по Саузерну с мечеными фрагментами космиды сЗОа (EcoRI-фрагменты 3.6 т.п.н, 1.9 т.п.н., 4.0 т.п.н., 2.1 т.п.н; HindIII-фрагменты 6.5 т.п.н, 6.0 т.п.н, 2.4 т.п.н. 1.6 т.п.н., 1.2.т.п.н., 1.5 т.п.н., 8.2 т.п.н.), космиды с32а (EcoRI-фрагменты 2.3 т.п.н., 1.2 т.п.н., 5.0 т.п.н.; HindIII-фрагменты 6.3 т.п.н., 9.4 т.п.н., 6.5 т.п.н.), космиды LANL 71al 1 (EcoRI-фрагменты 0.9 т.п.н, 8.0 т.п.н., 4.3 т.п.н., HindIII-фрагменты 2.4 т.п.н., 1.6 т.п.н, 1.2 т.п.н., 3.7 т.п.н., 3.9 т.п.н.).

Работа, описанная в данном разделе, проведена мною в лаборатории С.Эйнхорна (S. Einhorn, Отделение Онкологии и Патологии Каролинского Госпиталя, Стокгольм, Швеция). Часть данных этого раздела (рестриктазная карта космиды LANL71all) получена совместно с В.М.Бродянским.

Созданная рестриктазная карта космидных клонов с32а, сЗОа и 71а11 позволила создать набор ДНК-зондов для определения положения и размеров участков хромосомы 13, утрачиваемых у пациентов с B-XJIJI.

ТОЧНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ДЕЛЕЦИЙ В ОБЛАСТИ 13ql4 В ГЕНОМЕ ПАЦИЕНТОВ С В-ХЛЛ

Для точного определения положения и размеров участка области 13ql4.3, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, в качестве меченых проб использовали фрагменты космид сба, с25а, cía, с32а, сЗОа, 71а11 и с18а. Вначале провели предварительную гибридизацию нейлоновых фильтров, содержащих электрофоретически разделенные EcoRI- и Hindin-фрагменты, образовавшиеся при расщеплении ДНК вышеперечисленных космидных клонов соответствующими эндонуклеазами рестрикции, с радиоактивно меченой пробой, приготовленной на основе геномной ДНК человека. Для дальнейших экспериментов использовали фрагменты геномной ДНК, продемонстрировавшие относительно низкий уровень гибридизационного сигнала (в отдельных случаях 24-х часовой экспозиции пленки сигнал был практически неразличим), что интерпретировали как относительно низкое содержание повторяющихся участков ДНК или их отсутствие.

Более 20 фрагментов, отобранных по результатам предварительной проверки и равномерно представляющих вышеперечисленные космидные клоны, использовали для создания радиоактивных проб в гибридизации с нейлоновыми фильтрами, содержащими электрофоретически разделенные EcoRI- и HindIII-фрагменты геномной ДНК, выделенной из В-лимфоцитов 206 больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом. Каждый фильтр содержал обработанную соответствующей рестрикционной эндонуклеазой ДНК здорового донора и ДНК лимфоцитов пациента с В-ХЛЛ, имеющего обширную делецию длинного плеча хромосомы 13. В качестве опорного маркера для измерения длины фрагментов ДНК использовали ДНК фага лямбда, подвергнутую энзиматическому перевариванию по HindIII

Наиболее информативным оказалось исследование двух опухолевых образцов -CLL2 и 183-Е95. Так, в геноме больного CLL2 присутствует одна копия участка, соответствующего зонду Leu2ex5 и следующему за ним фрагменту р32.3, в то время как хромосомные участки, расположенные теломернее (на Рис.3 - правее), делегированы (пробы рЗО. 1, р30.2, р30.4, р30.5). При этом сохранена одна из копий участка,

CEN

EcoRI- фрагмент космиды сЗОа (8.5 т.п.н.)

Н НН Р

n Р rt

Leu 2 exS

......■....... Leu2 \ / / /

..................-........._ .......ь. ~...... "ч / * A"' л— А.........

Пробы/ образцы Leu2 ех5 Р32.3 Р30.1 P30.2 P30.3 P30.4 P30.5

CLL2 1 1 • 0 ' 0 nd 0 , 0

183-95 0 0 0 nd nd 0 1

CLL4 2 nd 1+R nd 1+R' 1 , 1

CLL5 nd 1 R nd R ■ 0 1

CLL6 nd nd nd nd R • 0 1 0

Н

TEL

5 т.п.н

/\

I RI

Рис.3. Гибридизационные данные, полученные на образцах ДНК B-XJIJI CLL2, CLL4, CLL5, CLL6 и клеточной линии 183-Е95 при использовании в качестве проб различных космидных клонов и клонов кДНК.

Обозначения: 0 - гомозиготная делеция, 1 - гемизиготная делеция, 2 - присутствуют обе копии. II - участок, распознаваемый рестрикционной эндонуклеазой Hindlll, N - Notl, Р - Pstl, RI - EcoRI, nd - эксперимент не проводили, R - наличие перестроенного EcoRI-фрагмента. Фигурными скобками обозначены границы делеции.

соответствующего фрагменту космиды с18а, расположенной на расстоянии 150 т.п.н. в сторону теломеры от космиды сЗОа. Таким образом, у пациента CLL2 наблюдается обширная гемизиготная делеция 13ql4, и расположенная внутри нее гомозиготная делеция, центромерная граница которой расположена между участками р32.3 и рЗО. 1.

Исследование ДНК линии клеток В-ХЛЛ 183-Е95 позволило показать, что теломерная граница делеции расположена между хромосомными участками рЗО.5 и р30.4. Участки, расположенные центромернее этой границы - р30.1, рЗО.З, р30.4 и р32.3 - гомозиготно делегированы, а одна из копий участка рЗО.5 присутствует в хромосоме. (Рис. 3) По данным анализа ДНК пациентов можно заключить, что минимальный участок, утрачиваемый у больных В-ХЛЛ, перекрывается космидными клонами сЗОа и с32а.

Дальнейший анализ проводили с помощью меченых проб, приготовленных на основе дополнительно отобранных космидных фрагментов, расположенных внутри границ определенной выше минимальной делеции. В результате детального анализа выявлены три новых информативных случая - образцы ДНК пациентов CLL4, CLL5 и CLL6. У всех трех пациентов граница делеции проходила по хромосомному участку, соответствующему космидному фрагменту рЗО.З. Часть хромосомных участков, расположенных центромернее рЗО.З, перестроена. Так, при гибридизации опухолевого образца ДНК CLL4 с меченой пробой рЗО.З, кроме ожидаемого сигнала, соответствующего EcoRI- фрагменту размером 8.5 т.п.н, наблюдали дополнительный сигнал, соответствующий отсутствующему в норме EcoRI-фрагменту размером 17 т.п.н. Интенсивность каждого из этих сигналов равна примерно 50% интенсивности сигнала, полученного при гибридизации того же нейлонового фильтра с контрольной пробой, приготовленной из геномного фрагмента, содержащего не затрагиваемый при B-XJIJI ген BCL-1. Дополительный EcoRI-фрагмент образовался в результате слияния рестрикционных фрагментов, ограничивающих делецию в одной из хромосом, вторая хромосома 13 осталась незатронутой. Новообразованный EcoRI-фрагмент отсутствует в неопухолевом образце ДНК того же пациента, что свидетельствует о том, что делеция 13q 14.3 у данного больного не является наследственной. Более теломерный маркер, р30.4 гомо- или гемизиготно делегирован у всех трех рассматриваемых пациентов. Центромерная граница делеции у пациентов CLL4, CLL5 и CLL6 проходит по одному и тому же хромосомному участку (для всех случаев выявлены сигналы, соответствующие новообразованному рестрикционному фрагменту, возникшему при слиянии фрагментов, ограничивающих делецию), в то же время теломерная граница у пациента CLL5 должна быть отнесена к участку, расположенному центромернее, чем маркер р30.5. (Рис.3). При сопоставлении результатов гибридизационных экспериментов с картой рестриктных фрагментов, описанной в разделе 4.2. определили, что теломерная граница делеции расположена на расстоянии не более 10 т.п.н. от центромерной границы.

Таким образом, минимальный размер участка, утрачиваемого у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом, составляет 10 т.п.н. или менее. Центромерная граница этого участка проходит по фрагменту рЗО.З., а теломерная - в области, расположенной на б т.п.н. центромернее фрагмента р30.5. Гомозиготные потери ДНК этого участка обнаружены в 14% исследованных в данной работе образцов В-ХЛЛ (в 28 образцах из 206), а гемизиготные - в 36% случаев ( в 67 образцах из 206).

Работа, описанная в данном разделе, проведена мною в лаборатории С.Эйнхорна (S. Einhorn, Отделение Онкологии и Патологии Каролинского Госпиталя, Стокгольм, Швеция). Фильтры с образцами ДНК больных для гибридизации по Саузерну получены совместно с О.Расулом и И.Лю.

ПОИСК ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, НАХОДЯЩИХСЯ ВНУТРИ КРИТИЧЕСКОЙ ОБЛАСТИ ХРОМОСОМНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПРИ В-ХЛЛ.

Для поиска генов, расположенных внутри области размером 130 т.п.н., часто утрачиваемой у больных В-ХЛЛ, применяли два независимых подхода. Первый из двух подходов заключался в компьютерном анализе нуклеотидной последовательности ДНК минимального участка, затрагиваемого делениями при В-ХЛЛ. Границы и расположение этого участка описаны в разделе 4.3. Нуклеотидная последовательность участка ДНК размером 9.5 т.п.н. определена в Отделении Онкологии и Патологии Каролинского Госпиталя (Стокгольм, Швеция) и хранится в базе данных GenBank под номером Y15381. Эта последовательность содержит участок, узнаваемый редкощепящей эндонуклеазами рестрикции Notl и CpG-островок. По литературным данным, CpG-островки сопутствуют практически всем генам «домашнего хозяйства» клетки, а также 40% генов с тканеспецифичной экспрессией [Bird, А.Р. et al., 1987]. Полученная нуклеотидная последовательность была использована для анализа базы данных dbEST, в результате выявлено более 50 экспрессирующихся последовательностей, подразделяемых на пять групп EST, приведенных в Таблице. Гены, соответствующие этим группам EST, получили названия Leul, Leu2, Leu3, Leu4 и LeuX.

Второй подход сводился к поиску искомых генов был экспериментальным. Это гибридизационный скрининг двух клонотек кДНК, приготовленных на основе РНК мозга 24-недельного эмбриона человека и плаценты человека. В качестве проб для гибридизации использовали как продукты расщепления, так и нативную ДНК космид cía, с32а, сЗОа и 71а11 после блокирования повторяющейся ДНК, проводимого с помощью отжига с ДНК человека Cot-1, а также отдельные фрагменты ДНК космид, не содержащие повторяющихся участков ДНК по данным предварительной гибридизации этих космид с меченой ДНК человека.

В результате гибридизационного скрининга отобрали 7 индивидуальных рекомбинантных клонов, содержащих фрагменты экспрессирующихся последовательностей, расположенных в интересующем участке генома. Эти клоны разделены на 4 группы, предположительно соответствующие индивидуальным генам человека. Генам присвоили названия BCLL1, BCLL3, BCLL4 и Leu5. Результаты анализа нуклеотидной последовательности полученных клонов кДНК приведены в Таблице.

ДЕТАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ Leul И Leu2.

Тонкая структура генов Leul и Leu2.

Подвергнута детальному анализу интрон-экзонная структура Leul и Leu2, а также степень их затронутое™ делециями при В-ХЛЛ. Для определения числа и расположения экзонов Leul и Leu2 пробы, приготовленные на основе полноразмерных кДНК, соответствующих этим генам, гибридизовали по Саузерну с нейлоновыми фильтрами, содержащими разделенные в агарозном геле фрагменты, полученные при расщеплении ДНК космид рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и HindIII. Гибридизационные данные свидетельствовали о том, что ген Leul полностью содержится внутри космидного клона сЗО, а экзоны гена Leu2 находятся как в космидном клоне сЗО, так и в клоне с32.

На следующем этапе для гибридизации с вышеописанными нейлоновыми фильтрами в качестве проб использовали меченые PCR-фрагменты, соответствующие различным участкам генов Leul и Leu2 и полученные на основе кДНК с этих генов. При этом пробы, соответствующие первым 150 нуклеотидным парам генов Leul и Leu2 (максимально удаленным от 3'-ро1у(А)), при гибридизации выявили один и тот же рестрикционный фрагмент космидного клона сЗОа в случаях обработки ДНК этого клона

Название Космидные Размер вставки, Последовательности dbEST,

гена/ клона пробы для п.н./ размер гомологичные найденным кДНК

кДНК скрининга гена

Leul сЗОа 1002 п.н./ 1054 п.н. W05790, АА425755, АА418789, АА418735, АА196484, N70598, АА479324, АА427807, W04917, W27699, АА258715, АА196687, АА478587, АА258481, Н64329, АА328862, N75053, R08323, R93227, Н64330, R8910, АА649558,

Leu2 сЗОа 1750 п.н. N25204, N39380, D62401, АА379071, W00920, АА329515, D62413, D80838, N70090, АА830369, АА905286, HUM272607B, АА640397

Leu3 сЗОа 1746 п.н. Т18971, AI280118, АА807693

Leu4 сЗОа 1156 п.н. АА281817, АА280308, АА972402

LeuX сЗОа 330 п.н. Z21080

Leu5 67Ы1, сЗОа, cía 1256 п.н. Н87865, Н87332, Н87877, М79242, EST01390, Z19441, 28D05(+), Т35533, EST86930, Н82170, N71263, N71014, WO 1570, N26656,N39807, 6E3R, АА769439, АА827257, AI046710, АА810526, АА836267,АА704302, АА889234, АА456865,АА084830, АА084831, АА380127

BCLL1 с32а, cía 3455 п.н. состоит из 3 EcoRl-фрагментов (1800, 1175, 480 п.н.) Фрагмент 1175 -АА722661, АА705210, АА488929, АА243214, Т96766 Фрагмент 1800 - повтор MIR, Фрагмент 480 -повтор Alu (семейство Sx).

BCLL3 с32а, cía 886 п.н. АА487424, АА578890, АА487631

BCLL4 с32а, cía 1147п.н. АА235449, АА364352, АА034364, R07594, АА446932 -с участками, свободными от повторов. Повторы Alu (семейства Y и FlamC).

Таблица. Экспрессирующие последовательности, расположенные внутри области размером 130 т.п.н., часто утрачиваемой у больных В-ХЛЛ.

эндонуклеазами рестрикции EcoRI или Hindlll, а пробы, соответствующие PCR-фрагментам, максимально приближенным к 3'-ро1у(А), выявили EcoRI- и HindHI-фрагменты, удаленные друг от друга на расстояние 70 т.п.н. (Рис. 2) Таким образом, можно однозначно заключить, что гены Leul и Leu2 транскрибируются в противоположных направлениях.

При сопоставлении нуклеотидных последовательностей клонов кДНК, соответствующих генам Leul и Leu2 и нуклеотидной последовательности Y15381 (минимального участка, затрагиваемого делециями при В-ХЛЛ), обнаружили, что расстояние между стартами транскрипции этих генов составляет 191 нуклеотидную пару.

Оба первых экзона расположены несколько теломернее участка распознавания редкощепящей эндонуклеазы NotI (См. Рис.3).

В качестве проб для гибридизации с геномной ДНК пациентов использовали как полноразмерные кДНК, отделенные от векторной части, так и отдельные фрагменты этих генов, полученные с помощью ПЦР. Гибридизация меченых проб, приготовленных на основе отдельных участков генов Leul и Leu2 с геномной ДНК человека выявила геномные рестрикционные фрагменты, по размеру совпадающие с соответствующими фрагментами расщепленных космидных клонов.

При сопоставлении картированных границ делеций и структурной организации генов Leul и Leu2 очевидно, что минимальный участок, утрачиваемый у пациентов с В-ХЛЛ, включает в себя первые экзоны обоих генов, в то время как остальные экзоны этих генов находятся за пределами делеции. Это ясно указывает на то, что гены Leul и Leu2 являются первостепенными кандидатами на роль гена-супрессора опухолевого роста, утрачиваемого при В-ХЛЛ.

Нуклеотидная последовательность и предполагаемые открытые рамки считывания генов Leul и Leu2.

Нуклеотидные последовательности генов Leul и Leu2 были определены и предоставлены мне в Отделении Онкологии и Патологии Каролинского института (Стокгольм, Швеция). Полный размер кДНК Leul составляет 980 п.н., кДНК Leu2 - 1735 п.н. Последовательности нуклеотидов хранятся в базе данных GenBank под номерами Y15227 (Leul) и Y15228 (Leu2).

Для определения точных экзонных границ мною проведено клонирование EcoRI-фрагментов космиды с32а (размером 6.0 т.п.н. и 5.0 т.п.н), HindIII-фрагментов космид с32а размером 6.3 т.п.н. и сЗОа размером 8.2 т.п.н, фрагментов EcoRI-Pstl космиды сЗОа размером 800 п.н. и 1500 п.н, входящих в состав EcoRI-фрагмента размером 8.5 т.п.н. Каждый из этих клонированных фрагментов использовали для частичного определения нуклеотидной последовательности, проведенного в Отделении Онкологии и Патологии аролинского Госпиталя (Стокгольм, Швеция) с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 373А (Applied Biosystems). Определение нуклеотидной последовательности проводили с внутренних стартовых праймеров, подобранных к нуклеотидной последовательности клонов кДНК, соответствующих генам Leul и Leu2. В результате проделанной работы определены нуклеотидные последовательности экзонов генов Leul и Leu2 в составе геномной ДНК клонированных фрагментов, а также прилежащие к границам экзонов участки интронов. Ген Leul состоит из двух экзонов размером 385 и 595 н.п.

Ген Leu2 состоит из пяти экзонов (экзон 1 имеет размер 156 н.п., экзон 2-97 н.п., суммарный размер экзонов 3 и 4 - 133 н.п. (прилегающие к ним интронные последовательны не определяли), размер экзона 5 составляет 1349 н.п ).

Большинство кДНК клонов, соответствующих исследуемым генам и принадлежащих dbEST, заканчиваются в одной и той же нуклеотидной позиции. Нуклеотидные последовательности генов Leul и Leu2 анализировали с помощью программы HCpolyA, распознающей сигналы полиаденилирования. З'-нетранслируемые

области генов Leul и Leu2 содержат гексануклеотид 5'-ААТААА-3', служащий сигналом для обрыва 3'-конца РНК и ее полиаденилирования. По данным, полученным в Отделении Онкологии и Патологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция) и Лаборатории Молекулярной Биологии Королевского гостгталя (Борнмут, Соединенное Королевство) как с помощью RACE-PCR, так и при сравнении длины кДНК Leul и Leu2 с размерами соответствующих транскриптов, выявляемых при Нозерн-гибридизации, кДНК Leul и Leu2 представляют собой полноразмерные копии соответствующих генов.

Как и у многих генов, экспрессирующихся в лимфоцитах, промоторный район, расположенный между первыми экзонами генов Leul и Leu2, не содержит канонической последовательности ТАТА-бокса. Анализ нуклеотидной последовательности, включающей первые экзоны обоих генов и межгенное пространство, проведенный с помощью программы Matlnspector, показал наличие нескольких участков, потенциально распознаваемых такими транскрипционными факторами как Spl, ETF, API, АР2, GCF, РЕАЗ, СР1 и CTF/NF1. Все эти участки расположены на расстоянии не более 300 н.п. от стартов транскрипции обоих генов. Наличие множества участков потенциального связывания белков-регуляторов, способных влиять на транскрипцию обоих исследуемых генов, короткое расстояние между генами, а также и расположение «голова к голове» позволяет высказать предположение, что экспрессия этих генов сопряжена и/или регулируется одними и теми же механизмами, как это показано для сходным образом организованных генов ATM и NPAT, разделенных расстоянием, равным 513 нуклеотидным парам [Imai, Т. et al., 1996].

Открытые рамки считывания (ORF) генов Leul и Leu2 соответствуют небольшим белкам, состоящим из 72 и 84 аминокислот соответственно. На основании аминокислотного состава белков предсказан молекулярный вес белков Leul (8 кДа) и Leu2 (ЮкДа). Предсказанный молекулярный вес этих белков значительно ниже среднего молекулярного веса белков человека. Однако, имеются работы, в которых показано, что сходные по размеру белки вовлечены в процессы злокачественной трансформации и контроля деления клеток [Soulier J. et al., 1994; Fu T.B. et al, 1994; Digweed M. et al., 1995; Kishida T. et al., 1995]. Поэтому гены Leul и Leu2 нельзя исключить из ряда генов-кандидатов на основании небольших размеров их белковых продуктов.

Для того, чтобы определить возможные функции генов Leul и Leu2, с помощью последних модификаций сетевых программ WU-BLASTX+BEAUTY и

BLASTX1.4+BEAUTY в существующих базах данных нуклеотидных и белковых последовательностей провели поиск известных к настоящему времени белков живых организмов, имеющих участки гомологии к белковым продуктам Leul и Leu2. Несмотря на интенсивность проведенного поиска, на сентябрь 1998 года значительных гомологий с известными белками человека и других живых организмов не выявлено.

Таким образом, проведено тонкое физическое картирование и определена экзон-интронная структура двух новых генов человека Leul и Leu2, являющихся возможными кандидатами на роль супрессоров опухолевого роста, повреждаемых или утрачиваемых при B-клеточном хроническом лимфолейкозе.

Часть данных этого раздела получено совместно с О.Расулом.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНОВ кДНК, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ГЕНУ Leu3.

При анализе нуклеотидной последовательности минимального участка, утрачиваемого при B-клеточном хроническом лимфолейкозе (Y15381), с помощью программного семейства BLAST в базе данных dbEST выявили группу экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей кДНК, получившую название предполагаемого гена Leu3. Часть гена Leu3 находится внутри интрона, разделяющего первый и второй экзоны гена Leu2 (полностью представленного в нуклеотидной последовательности Y15381), а также внутри границ минимального участка, утрачиваемого у больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом.

Гену Leu3 соответствуют три экспрессирующихся нуклеотидных последовательности, представленных в базе данных dbEST - Т18971, AI028018 и АА807693. Эти эхспрессирующиеся последовательности частично перекрываются между собой. Фрагмент последовательности клона АА807693 выходит за пределы участка с известной нуклеотидной последовательностью в сторону центромеры. Сопоставление нуклеотидных последовательностей кДНК клонов Т18971, AI028018 и АА807693, а также клона G14246, полученного Н.В.Макеевой и Д.В.Ивановым (Лаборатория Анализа Генома ИОГен, РАН) и полностью гомологичного исследуемому участку генома кДНК, позволяет заключить, что размер полного гена Leu3 равен 1746 п.н. Расположение фрагмента гена Leu3 внутри ингрона гена Leu2 означает, что эти гены транскрибируются в противоположных направлениях, поскольку к настоящему времени не известно примера человеческих генов с чередующимися экзонами, оба состоящих более чем из одного экзона и транскрибирующихся в одном направлении [М. Гельфанд, ИМБ РАН, личное сообщение]. Транскрипция гена Leu2 направлена от теломеры к центромере, следовательно, транскрипция предполагаемого гена Leu3 направлена от центромеры к теломере.

В соответствии с результатами Нозерн-гибридизации, полученными партнерами по работе в Отделении Онкологии и Патологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция), размер мРНК, соответствующей гену Leu3, равен 2.3 т.п.н. Это означает, что полученные нами клоны кДНК представляют собой только часть гена Leu3. Фрагменты открытых рамок считывания, присутствующие в имеющейся части гена Leu3, не позволяют определить характеристики белкового продукта данного гена.

Таким образом, имеющиеся в общедоступных базах данных нуклеотидные последовательности, соответствующие клонам Т18971, AI028018 и АА807693, соответствуют новому гену человека Leu3, частично расположенному внутри участка хромосомы 13, утрачиваемом при B-клеточном хроническом лимфолейкозе.

4.7. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНОВ кДНК, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ГЕНУ Leu4.

Кроме гена Leu3, нуклеотидная последовательность интрона, разделяющего первый и второй экзоны гена Leu2 соответствует еще одному кластеру экспрессирующихся последовательностей, представленных в базе данных dbEST. Этот кластер последовательностей, расположенный на 2.4 т.п.н. теломернее гена Leu3, получил название Leu4. Имеющиеся данные не позволяют однозначно утвержать, что безинтронные кДНК, образующие этот кластер, соответствуют реально существующему гену человека. Однако, мы приведем их, поскольку эти экспрессирующиеся последовательности расположены внутри минимального участка, подвергающегося делециям у пациентов с В-ХЛЛ.

Гену Leu4 соответствуют 3 экспрессирующихся нуклеотидных последовательности, представленных в базе данных dbEST - АА972402, АА281817 и АА280308. При этом нуклеотидные последовательности АА281817 и АА280308 в действительности являются двумя секвенированными концами одного и того же клона IMAGE:712744. Полный размер этого клона составляет 1156 п.н.

С целью определения размеров предполагаемого гена Leu4, в Отделении Онкологии и Патологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция) проведена Норзерн-гибридизация. Слабые гибридизационные сигналы соответствуют двум формам мРНК Leu4 с размерами 8 т.п.н. и 5.5 т.п.н. Это означает, что имеющиеся клоны кДНК не являются полноразмерными копиями гена Leu4.

Как и в случае гена Leu3, результаты компьютерной трансляции всех шести возможных рамок считывания данного гена не дают возможности сделать утверждение о направлении транскрипции данного гена и о характеристиках белкового продукта. Возможно, исследованные нуклеотидные последовательности кДНК соответствуют

нетранслируемой З'-концевой области слабоэкспрессирующегося гена. Это предположение может объяснить слабую представленность кДНК клонов, соответствующих гену Leu4 в базе данных dbEST. Однако, нельзя исключить, что кДНК клоны, соответствующие гену Leu4, образовались в результате загрязнения исходного пула мРНК, использовавшегося для приготовления клонотеки кДНК, фрагментами геномной ДНК человека. Таким образом, вопрос о соответствии кДНК Leu4 реальному гену человека остается открытым.

Так или иначе, нуклеотидная последовательность, обозначенная нами как Leu4, является частью минимального участка молекулы ДНК, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ. Поэтому последовательность Leu4 нельзя исключить из рассмотрения в качестве кандидата на роль гена-супрессора опухолевого роста.

4.8. РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МИНИМАЛЬНОГО УТРАЧИВАЕМОГО УЧАСТКА ПРИ ПОМОЩИ ПРОГРАММЫ GENEFINDER И КЛОН кДНК LeuX .

Между кластерами экспрессирующихся последовательностей Leu3 и Leu4, находящимися внутри границ минимального участка, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, расположен еще один экспрессирующийся участок размером 330 нуклеотидных пар. Этот участок соответствует нуклеотидной последовательности единичного клона кДНК Z21080 (HSAAADLXE), представленного в базе данных dbEST.

Наряду с пассивными методами поиска нуклеотидных последовательностей кДНК, гомологичных нуклеотидной последовательности минимального участка, утрачиваемого при В-клеточном хроническом лимфолейкозе, заключавшемся в скрининге базы данных dbEST, осуществлявшемся с помощью программ семейства BLAST, мы также проводили поиск экспрессирующихся участков с помощью программного пакета Genefnder, доступного в режиме он-лайн по адресу: http://dot.imgen.bcm.tmc edu:9331/. Эта программа успешно распознала первый и второй экзоны гена Leu2 и первый экзон Leul, предъявленные в составе единого фрагмента нуклеотидной последовательности размером 9.2 т.п.н., соответствующего реальной структуре геномной ДНК хромосомы 13 и правильно определила направления транскрипции этих генов. Размер предсказанного размера второго экзона Leu2 составил 100 нуклеотидов при реальном размере 97 нуклеотидов; предсказанный размер первого экзона Leu2 - 154 нуклеотида при реальном размере 157 нуклеотидов. Для первого экзона гена Leul эти показатели были ниже -предсказан экзон размером 63 нуклеотида при реальном размере 385 нуклеотидов (отношение 0.164). В дополнение к экзонам, принадлежащих генам Leul и Leu2, программа Genefinder обозначила еще один экзон размером 57 нуклеотидов, расположенный внутри участка, гомологичного клону кДНК Z21080 размером 330 нуклеотидов (отношение 0.172), и не принадлежащий генам Leul и Leu2. (Рис. 12). При этом программа Genefinder приписала этому экзону свойства первого экзона гена. Интересно, что в области генов Leu3 и Leu4 программа Genefinder смогла обнаружить только небольшие участки возможных экзонов размером 29 нуклеотидов в области Leu3 (общая длина соответствующих ему кДНК равна 1352 нуклеотидам; отношение 0.022) и 37 нуклеотидов в области Leu4 (общая длина кДНК равна 1156; отношение 0.032). Таким образом, при сравнительном компьютерном анализе физически сближенных участков ДНК, соответствующих экзонам истинных генов Leul и Leu2, а также предполагаемым генам Leu3, Leu4 и LeuX, последний приближается по значимости к реально существующим экзонам.

Другой особенностью участка, соответствующего клону кДНК Z21080 и предсказанному программой Genefinder экзону, является 21-нуклеотидный фрагмент, полностью гомологичный фрагменту, содержащемуся внутри космидного клона 063Н34, нуклеотидная последовательность которого частично определена в ходе масштабного проекта по секвенированию генома рыбы фугу {Fugu rubripes), имеющей очень

компактный геном со средним размером интронов, равным 100 нуклеотидным парам [Elgar, G. et al., 1996]. В геноме фугу отсутствуют так называемые короткие повторяющиеся элементы (SINE), к которым относятся Alu-, Крп- и MIR-повторы человека. Для некоторых консервативных генов, таких как гомеобоксные гены семейства Нох, показано, что степень гомологии между генами фугу и соответствующими генами мыши составляет 60-90% совпадений нуклеотидных пар в 100-200 нуклеотидных фрагментах. Высказана гипотеза о том, что эти участки соответствуют функционально важным участкам генов, что подтверждено в экспериментах по искусственному удалению этих участков, сопровождавшемуся полной потерей соответствующей активности как у мышей, так и у рыбы [Elgar, G. et al., 1996].

Консервативный 21-нуклеотидный участок 5' TGC AGT GTT АСА ТАС AAA САС 3', обнаруженный внутри описываемого участка LeuX, не является так называемым «участком ДНК низкой сложности», выявляемым при помощи программы Repeat Masker или при валовом автоматическом сравнении программой BLAST исследуемой нуклеотидной последовательности со всеми нуклеотидными последовательностями живых организмов, накопленными в геномных базах данных к настоящему времени. Учитывая вышеизложенное, наличие эволюционно консервативного участка внутри последовательности, соответствующей единичному клону кДНК Z21080 и экзону, предсказанному программой Genefinder, является аргументом в пользу дальнейшего изучения участка LeuX.

Стоит добавить, что кроме консервативного 21-членного участка космидный клон фугу 063Н24 содержит последовательность, гомологичную человеческому гену теплового шока HSP70, несколько тандемных псевдогенов которого локализованы на расстоянии 50150 т.п.н. в сторону теломеры от минимального участка, утрачиваемого при В-клеточном хроническом лимфолейкозе и описанного в данной работе [А.Б. Семов, ИОГен РАН, личное сообщение]. Наличие протяженной синтении между геномами фугу и человека показано для 11 различных генных кластеров [Elgar, G. et al., 1996]. Таким образом, совместная локализация гена/псевдогена HSP70 и 21-членного консервативного участка в геноме фугу является дополнительным указанием на неслучайность присутствия консервативного 21-нуклеотидного участка в LeuX.

4.9. ДЕТАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНА Leu5.

Клоны кДНК BCLL2 и BCLL5, соответствующие новому гену человека, получившему название Leu5, выявлены в результате гибридизационного скрининга клонотек кДНК, приготовленных на основе РНК мозга 24-недельного эмбриона человека и плаценты человека. В качестве проб для гибридизации использовали продукты расщепления ДНК космид cla и с32а после блокирования повторяющейся ДНК, проводимого с помощью отжига с ДНК человека Cot-1.

Обратная гибридизация полученных клонов кДНК, при которой эти клоны использовали в качестве меченой пробы и гибридизовали на нейлоновый фильтр, содержащий электрофоретически разделенные фрагменты космидных клонов, показала, что клоны кДНК BCLL2 и BCLL5 соответствуют космидным клонам cla, 67Ь4, 6Ы1 и 98Н9, компактно расположенным на расстоянии 80 т.п.н. от маркера D13S319 в сторону центромеры.

Оба клона кДНК, соответствующих гену Leu5, перекрестно гибридизуются между собой и содержат внутренние участки, распознаваемые рестрикционной эндонуклеазой EcoRI. Клон BCLL2 содержит единичный цельный экзон Leu5 размером 1256 п.н., внутри экзона находятся инициирующий кодон ATG и открытая рамка считывания, кодирующая протеин, состоящий из 407 аминокислот. Клон BCLL5 содержит также часть интрона, расположенного перед выявленным экзоном. На границе между интроном и экзоном находится акцепторный участок сайта сплайсинга с канонической последовательностью 5' tAGgat5'. Изображенная на Рис.16 структура гена Leu5 подтверждена определением

нуклеотидной последовательности соответствующих участков геномной ДНК космидного клона 67Ь4.

Ген Leu5 кодирует белок, состоящий из 407 аминокислот. Этот белок содержит цинк-связывающие домены RING и В-box, а также так называемый «спирально скрученный» домен. Такое сочетание доменов называется Rip-подобным трехчастным доменом, по названию белка Rip (Ret finger protein). Белок Rfp приобретает онкогенные свойства, когда его трехчастный домен в результате транслокации состыковается с содержащим тирозин-киназный домен протоонкогеном Ret [Сао, Т. et al., 1997]. Белок Rft пособен мультимеризоваться за счет взаимодействия «спирально скрученных» доменов, В-box также вносит вклад в белок-белковое взаимодействие, хотя и не участвует в нем непосредственно. Белок Rip способен взаимодействовать с другим членом того же семейства - белком PML, кодируемым геном, ответственным за развитие острой промиелоцитарной лейкемии. Он локализован в тех же самых ядерных тельцах и участвует в процессах клеточного роста и дифференциации [Сао, Т. et al., 1998]. Степень гомологии (P-value) аминокислотных последовательностей Leu5 и Rip, определяемая вероятностью случайного совпадения, составляет 3.7е~15, согласно анализу, проведенному с помощью программы WU-BLASTX+BEAUTY, доступной в режиме он-лайн по адресу: http://dot.imgen bcm.tmc.edu:9331/seq-search.

Не менее интересны и другие белки, в высокой степени гомологичные Leu5 и выявляемые той же программой анализа при анализе баз данных аминокислотных последоваетельной. Так, наибольшую степень гомологии (P-value = 6.9е"24) к Leu5 имеет белок XPRF, продукт гена МШ1, ответственного за развитие синдрома Опитца (G/BBB) -наследственного нарушения морфогенеза средней линии у человека. Белок XPRF вовлечен в такие фундаментальные процессы, как закладка органов эмбриона и контроль пролиферации клеток [Quaderi, N.A. et al., 1997; Gaudenz, К. et al., 1998]. Другой белок, гомологичный Leu5, Rpt-1 (P-value = 5.1e"ls) - это внутриклеточный протеин, обнаруженный в покоящихся Т-хелперах. Он связывает промотор и регулирует экспрессию гена а-цепи рецептора интерлейкина-2, а также связывает длинные концевые повторы вируса иммунодефицита человека HTV-1 [Patarka, R. et al., 1988]. Человеческий белок Staf-50 (stimulated trans-acting factor of 50 kDa) (P-value = 1.9e"13) похож по своему действию на Rpt-1 [Tissot, С. and Mechti, N., 1995]. Он индуцируется интерферонами I и И и регулирует транскрипцию других генов. Имеет аминокислотное сходство с Leu5 (P-value = 8.1е12) и так называемый Ro SS/A белок, антитела к которому присутствуют в крови пациентов такими аутоиммунными заболеваниями, как синдром Шогрена, системная красная волчанка и волчанка новорожденных [Chan, E.K. et al., 1991; Sibilia, J., 1998]. Патогенное действие Ro SS/A антител приводит к повреждениям кожи у взрослых людей и остановке сердца у новорожденных. Белок Ro SS/A входит в состав рибонуклеопротеиновых комплексов, находящихся в большинстве человеческих тканей и клеток, в том числе клетках крови. Качественный и количественный состав этих комплексов варьирует в зависимости от тканевой принадлежности клетки и стадии эмбрионального развития. Облучение УФ и вирусные инфекции приводят к перемещению Ro SS/A-содержащих комплексов из ядра в цитоплазму и даже к мембране клетки, что приводит к усилению аутоиммунных реакций у пациентов.

Белковое семейство Rfp, к которому принадлежит белок Leu5, эволюционно консервативно. Белки, в высокой степени гомологичные Leu5, обнаружены у гребенчатого тритона Pleurodeles waltii, шпорцевой лягушки Xenopus. laevis, и даже у нематоды Cenorhabditis elegans. Белок гребенчатого тритона АЗЗ (P-value = 1 .бе"20) - это ядерный белок, расположенный на петлях "ламповых щеток" хромосом [Bellini, М., 1993]. Он связан с новосинтезированными транскриптами, что предполагает его участие в прецессе синтеза пре-мРНК либо процессинга. Белок шпорцевой лягушки XNF7 (P-value = 2.8е'16) способен связываться с двуцепочечной ДНК [Reddy, В.А. et al., 1991]. Этот белок сохраняется в цитоплазме ооцита лягушки со времени его созревания и вплоть до эмбриональной стадии средней бластулы. На стадии средней бластулы он перемещается

из цитоплазмы в ядро, что приводит к запуску генетической программы определения дорсально-вентральной симметрии и закладке мезодермы [El-Hodiri, Н.М. et al., 1997]. Миграция XNF7 между ядром и цитоплазмой регулируется его фосфорилированием митоген-активируемыми киназами и циклином B/cdc2 [El-Hodiri, Н.М. et al., 1997а]. Функциональные свойства белка F54G8.4 (P-value = 4.4е"п), обнаруженного в ходе масштабного проекта по определению нуклеотидной последовательности генома C.elegans, пока не определены.

Суммировав вышеизложенные данные, следует отнести белок Leu к семейству Rfp-подобных белков, содержащих трехчастный домен, и предположить, что, подобно другим описанным членам этого семейства, белок Leu5 способен связывать нуклеиновые кислоты и образовывать белковые комплексы. Интересно, что все ближайшие гомологи белка Leu5 вовлечены в те или иные процессы, связанные с клеточной дифференциацией или регуляцией раннего развития эмбриона. Следует предположить, что и Leu5 принимает участие в одном из этих процессов.

Клонированный в данной работе экзон гена Leu5 расположен на расстоянии 80 т.п.н. от маркера D13S319 в сторону центромеры, что означает, что он находится вне границ участка, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ. Однако, до сих пор неизвестно расположение 5'- и 3'- нетранслируемых областей этого гена (кДНК BCLL2 не содержит сигнала полиаденилирования, причем открытая рамка считывания заканчивается стоп-кодоном на расстоянии нескольких нуклеогидов от конца клона). По предварительным данным ПЦР-анализа транскрипция гена Leu5 направлена в сторону теломеры, 5'-неггранслируемая область гена соответствует дистальной части космид 122f4 и Ю5П0. Таким образом, промоторная область гена Leu5 не должна быть повреждена по крайней мере у части пациентов с В-ХЛЛ, имеющих делеции в районе 13ql4.3, чего нельзя сказать о до сих по не обнаруженной З'-нетранслируемой области этого гена. Ведется работа по поиску точечных мутаций гена Leu5 у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом.

Итак, несмотря на то, клонированный в данной работе экзон гена Leu5 расположен вне минимиального участка, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, Leu5 следует считать одним из кандидатов на роль супрессора, утрата или повреждение которого приводят к развитию В-клеточного хронического лимфолейкоза.

4.10. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛОНОВ кДНК BCLL1, BCLL3 И BCLL4.

Клоны кДНК BCLL1, BCLL3 и BCLL5 были выявлены в результате того же гибридизационного скрининга клонотек кДНК, что и клоны BCLL2 и BCLL5, соответствующие гену Leu5.

Обратная гибридизация полученных клонов кДНК, схема которой описана в разделе 4.9 для клона BCLL2, показала, что клоны кДНК BCLL1, BCLL3 и BCLL5 соответствуют космидным клонам cía и с32а. Нуклеотидная последовательность всех трех клонов полностью определена в Центре Микробиологии и Биологии Опухолей Каролинского Института (Стокгольм, Швеция).

Клон кДНК BCLL1 содержит два внутренних участка, узнаваемых эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Таким образом, вставка фагового клона BCLL1 может быть представлена тремя EcoRI-фрагментами размером 1800, 1175 и 480 н.п. соответственно. Поскольку скринированная клонотека кДНК состояла из клонированных EcoRI-фрагментов ДНК, нельзя исключить, что клон BCLL1 имеет химерную природу, будучи составленным из неродственных экспрессирующихся участков. Это предположение подкреплено даннымы BLAST-анализа нуклеотидной последовательности: клон BCLL1 состоит из двух разнородных частей. Фрагменты 1800 и 480 содержат повторы MIR и Alu-Sx и не соответствуют никаким клонов кДНК, представленных нуклеотидыми последовательностями, находящимися в dbEST. Фрагмент 1175 не содержит повторов и соответствует пяти экспрессирующимся последовательностям, имеющимся в dbEST -

АА722661, АА705210, АА488929, АА243214, Т96766. Аминокислотные последовательности, соответствующие фрагментам открытых рамок считывания этих клонов не имеют протяженных гомологий с известными белками человека и других живых организмов.

Клон BCLL3 имеет размер 886 п.н. и соответствует трем известным экспрессирующимся последовательностям - АА487424, АА578890, АА487631. Клон BCLL4 имеет размер 1147 п.н., содержит два Alu-повтора, принадлежащих к семействам Y и FlamC, и, в свободных от повторов участках, соответствует пяти известным экспрессирующимся последовательностям, содержащимся в базе данных dbEST -АА235449, АА364352, АА034364, R07594, АА446932.

Все три клона кДНК, описанных в данном разделе, расположены за пределами минимального участка, утрачиваемого у пациентов с B-клеточным хроническим лимфолейкозом, и не являются кандидатами на роль гена-супрессора, ответственного за развитие B-XJIJI.

6. ВЫВОДЫ

1. Построен контиг космидных клонов в области 13ql4.3, перекрывающий 620 т.п.н. между маркерами D13S1168 и D13S25 хромосомы 13 человека. Для построения космидного контига использованы рибопродукты 172 индивидуальных концов космидных клонов. К космидам, составляющим контиг, приписаны 12 EST и STS-маркеров. Минимальный путь перекрывания картированного участка составляют 18 космидных клонов. Описанный космидный контиг является основой для масштабного определения нуклеотидной последовательности ДНК данного участка хромосомы 13 человека.

2. Определен порядок следования сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Hindlll и расстояние между этими сайтами в области генома человека размером около 100 т.п.н. Для этого построена рестриктазная карта космидных клонов с32а, сЗОа и 71al 1. Фрагменты этих космид являются зондами для определения границ перестроек хромосомы 13 у пациентов с В-ХЛЛ и позволили выявить минимальный затрагиваемый перестройками участок.

3. Минимальный участок, утрачиваемый у больных В-ХЛЛ, представлен космидными клонами сЗОа и с32а и составляет менее 10 т.п.н. Центромерная граница этого участка проходит по фрагменту рЗО.З., а теломерная - в области, расположенной на 6 т.п.н. центромернее фрагмента рЗО.5. Гомозиготные потери ДНК этого участка обнаружены у 14% исследованных случаев В-ХЛЛ (в 28 образцах из 206), а гемизиготные -г в 36% случаев ( в 67 образцах из 206).

4. Для поиска генов, расположенных внутри области размером 130 т.п.н., часто утрачиваемой у больных В-ХЛЛ, применены два независимых подхода - анализ нуклеотидной последовательности ДНК минимального участка, затрагиваемого делениями при В-ХЛЛ и гибридизационный скрининг. В результате получено более 15 клонов кДНК, разбивающихся на 9 независимых групп.

5. Клонированы два новых гена человека, первые эзноны которых расположены в пределах минимального участка, утрачиваемого при В-ХЛЛ. Ген Leul полностью содержится внутри космидного клона сЗО, аэкзоны гена Leu2 находятся как в космидном клоне сЗО, так и в клоне с32. При этом первые экзоны обоих генов и старты транскрипции находятся внутри одних и тех же EcoRI и Hind III- фрагментов. Расстояние между стартами транскрипции составляет менее 300 нуклеотидных пар. Ген Leul состоит из двух экзонов размером 385 и 595 н.п. Имеется два дополнительных экзона размером 39 и 13 нуклеотидов соответственно. Дополнительные экзоны, получившие названия 1а и 16, соотвествуют альтернативно сплайсированой четырехзкзонной форме гена Leul. Ген Leu2 состоит из пяти экзонов (экзон 1 имеет размер 156 н.п., экзон 2-97 н.п., суммарный размер экзонов 3 и 4 - 133 н.п., размер экзона 5 составляет 1349 н.п.). Предполагаемые открытые рамки считывания (ORF) соответствуют белкам, состоящим из 72 и 84

аминокислот соответственно. Значительных гомологий с известными генами человека и других живых организмов не вьивлено.

6. В первом интроне гена Leu2 обнаружено три неперекрывающихся экспрессирующихся последовательности, соответствующих разным клонам кДНК - Leu3, Leu4 и LeuX. Эти последовательности расположены в пределах минимального участка, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ.

7. В результате гибридизационного скрининга выявлен новый ген человека Leu5. Ген картирован на расстоянии 80 т.п.н. от маркера D13S319 в сторону центромеры. Ген Leu5 кодирует белок, состоящий из 407 аминокислот. Белок Leu5 содержит цинк-связывающие домены RING и В-box, а также так называемый «спирально скрученный» домен. Белок Leu5 эволюционно консервативен, принадлежит к семейству Rfp и имеет высокую степень гомологии с белками, вовлеченным в процессы клеточной дифференциации и регуляции раннего развития эмбриона.

8. Гены Leul, Leu2 и Leu5 являются наиболее вероятными кандидатами на роль гена-супрессора опухолевого роста, повреждаемого при В-ХЛЛ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1). Капанадзе Б.И., Бродянский В.М., Семов А.Б., Баранова А.В., Сулимова Г.Е., АитоваС.С., Удина И.Г., Птицина С.Н., Сальникова Л.Е., Чудинов О.С., Борбиев Т.Э., Кашуба В., Гизатуллин Р., Забаровская В., Забаровский Е.Р., Федорова ЛИ., Зеленин

A.В., Лью И, Расул О., Грандер Д., Эйнхорн С., ван Эвердинк В., Бауш Ч., Коркоран М., Чапмен Б., Янковский Н.К. "Космидный контиг и карта кДНК в области 13ql4 часто утрачиваемой при В-клеточном хроническом лимфолейкозе у человека". Молекулярная Биология, 1997, N3 с.515-519

2). Yie Liu, Martin Corcoran, Omid Rasool, Ganka Ivanova, Rachel Ibbotson, Dan Grander, Arati Iyengar, Anna Baranova, Vladimir Kashuba, Mats Merup, Xiushan Wu, Anne Gardiner, Roman Mullenbach, Andrew Poltaraus, Anna Linda Hultstrom, Gunnar Julisson, Robert Chapman, Mary Tiller, Gosta Gahrton, Nick Yankovsky, Eugene Zabarovsky, Stefan Einhom, David Oscier. Cloning of two candidate tumor suppressor genes within a 10 kb region on chromosome 13ql4, frequently deleted in chronic lymphocytic leukemia. Oncogene 1997 15, 2463-2473

3). Баранова A.B., Янковский H.K. "Гены-супрессоры опухолевого роста" Молекулярная биология 1998, том 32, с. 206 - 218.

4). Kapanadze В, Kashuba V, Baranova A, Rasool О, van Everdink W, Liu Y, Syomov A, Corcoran M, Poltaraus A, Brodyansky V, Syomova N, Kazakov A, Ibbotson R, van den Berg A, Gizatullin R, Fedorova L, Sulimova G, Zelenin A, Deaven L, Lehrach H, Grander D, Buys C, Oscier D, Zabarovsky ER, Yankovsky N. A cosmid and cDNA fine physical map of a human chromosome 13ql4 region frequently lost in B-cell chronic lymphocytic leukemia and identification of a new putative tumor suppressor gene, Leu5. FEBS Lett 1998 Apr 17;426(2):266-270

5). V.M.Brodjansky, G.E.Sulimova, I.G.Udina, S.S.Aitova, A.V.Baranova,

B.I.Kapanadze, L.I.Fedorova, M.V.Kost-Alimova, A.V.Zelenin, V.M.Zakhariev, O.A.Serpinsky, Ch.Buys, E.R.Zabarovsky, S. Einhorn, N.K.Yankovsky. Making YAC and cosmid contig spanning 13ql4.3 region frequently lost in chronic lymphocytic leukemia. Abstr of the 3d Human chromosome 13 workshop. TarrytownNJ USA, 30 Oct-1 Nov 1995