Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование области хромосомы 13 человека, утрачиваемой при В-клеточном хроническом лимфолейкозе: поиск и картирование YAC, космид и кДНК клонов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование области хромосомы 13 человека, утрачиваемой при В-клеточном хроническом лимфолейкозе: поиск и картирование YAC, космид и кДНК клонов"

\ i и un

17 ОКТ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА

на правах рукописи

УДК 575.1:599.9

БРОДЯПСКИЙ Вадим Маркович

Исследование области хромосомы 13 человека, утрачиваемой при В-клеточном хроническом лимфолейкозе: поиск и картирование YAC, космид и кДНК клонов

Специальность 03.00.15- Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института Общей Генетики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Янковский Н. К. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, чл.-корр. РАН, профессор Свердлов Е. Д. доктор биологических наук Богданов Ю. Ф.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгардга

Защита состоится"_" _1996 г. в_часов на заседании

диссертационного Ученого Совета Д 002.49.01 при Институте Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул.Губкина, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Общей Генетики им.Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Полухина Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL) - наиболее распространенный вид опухолевых заболеваний крови, встречающийся, в основном, у людей старшего возраста. B-CLL связывают с делециями или транслокациями района 13ql4 хромосомы 13 человека, что предполагает наличие в этой области генома гена-супрессора развития опухоли этого типа. Было известно, что этот район хромосомы 13 содержит ген ретинобластомы, RBI, - один из наиболее хорошо изученных генов опухолевой супрессии у человека. Недавно показано, что ген RB1 у больных В-CLL не изменен, а уровень его экспрессии изменен незначительно, что указывает на существование в этом районе генома другого, пока не описанного гена или генов опухолевой супрессии. Таким образом появилась возможность картирования и последующего клонирования нового онкосупрессора - гена супрессора лимфолейкоза человека. Клонирование этого гена представляло бы интерес как для фундаментальной биологии, так и для медицины, поскольку ведет к пониманию механизмов опухолеобразования и создает основу для диагностики и терапии лимфолейкоза у человека.

Клонирование генов человека, связанных с развитием наследственных и опухолевых заболеваний, в настоящее время основано на использовании методов, материалов (клонотек) и баз данных, созданных в рамках всемирной программы "Геном человека". Эта основа сформировалась и стала доступной как раз к моменту постановки данной работы. Технология клонирования подразумевает на первом этапе картирование области генома, содержащей искомый ген. Карта области генома, утрачиваемой при B-CLL, не была известна, что и определило содержание данной работы.

Цель и задачи работы. Целью работы является картирование района 13ql4.3 хромосомы 13 человека, часто утрачиваемого при хроническом В-клеточном лимфоцитарном лейкозе. В ходе работы решались следующие задачи:

1. Поиск и создание STS-маркеров в области 13ql4.3 и определение их относительного расположения;

2. Поиск и характеристика рекомбинантных клонов (YAC и космид) в области 13ql4.3;

3. Создание набора фрагментов геномной ДНК на основе мега- и миди-YAC клонов, перекрывающих район 13ql4.3;

4. Создание подвыборки клонов космид из клонотеки хромосомы 13, соответствующих району 13ql4.3;

5. Создание наборов космидных клонов, соответствующих STS-маркерам известной локализации, для их использования при анализе делеций в геноме больных хроническим лимфолейкозом; создание частичного контига космидных клонов в области 13ql4.3;

6. Поиск кДНК клонов, соответствующих минимальной области генома человека, утрачиваемой у больных B-CLL, для выявления гена-супрессора хронического лимфолейкоза человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. Найдены и созданы 20 STS-маркеров в области 13ql4.3, определено их относительное расположение в хромосоме 13 человека.

Выявлены и охарактеризованы более 20 YAC клонов в области 13ql4.3; создан контиг фрагментов геномной ДНК на основе мега- и миди-YAC клонов, перекрывающих район 13ql4.3.

Определены расстояния между ближайшими фланговыми STS-маркерами области, часто утрачиваемой при B-CLL: к началу работы это были маркеры RBK.pt и D13S25 (расстояние около 1400 т.пш., по размеру YAC СЕРН 745еЗ), к концу работы это оказались маркеры

D13S319 и D13S25 (расстояние около 680 т.п.н., по размеру YAC ICRF 101d6).

Создана подвыборка из более 400 клонов космид, соответствующих району 13q!4.3, выявленных в хромосом-спецнфнческих клонотеках LANL (LA13NC01) и ICRF (С108 DH5 L4/FS13).

Сформированы наборы космидных клонов, соответствующих STS-чаркерам установленной памп локализации, Эти космиды использованы партнерскими лабораториями для выявления облзсга генома, утрачиваемой у больных B-CLL. Одна из найденных в данной работе космид, LANL 71а11, оказалась локализованной внутри минимальной области, делегированной у BCLL пациентов, наблюдаемых в партнерской лаборатории (Каролинский Институт, Стокгольм, Швеция). Построена ЕсоРЛ- и ЯшЛИ-ресгрнкционная карта области генома человека, перекрываемой этой космидсй. Фрагменты ДНК космиды LANL 7Iall могут являться зондами для тонкой ДНК-диагностики хронического лимфолейкоза человека.

Сформированы контиги космидных клонов, соединяющие STS-маркеры в области 13ql4.3: D13S165 с D13S1168, D13S1150 с D13S1168, D13S272 с D13S319;

Найдены 4 кДНК клона, соответствующих космиде LANL 71al 1. Эти клоны локализованы на рестрикционной карте, построенной для данной области хромосомы 13 человека. Выявленные кДНК клоны могут соответствовать ге'ну супрессору хронического лимфолейкоза человека.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы; экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение и обсуждение экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа

содержит 95 стр. машинописного текста, включает 10 рисунков, 6 таблиц.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы опубликованы в журнале "Молекулярная биология" и докладывались на 2-м Международном совещании по картированию хромосомы 13 (Терри-таун, США, октябрь 1995) и Отчетной конференции по ГНТП РФ "Геном человека" (Черноголовка, 1996), а также на семинарах

Института Общей генетики РАН .

******* -

Работа выполнена в рамках планов и при финансировании со стороны следующих программ: 1) ГНТП РФ "Геном человека", проект "Картирование хромосомы 13 человека"; 2) Миннауки РФ, проект по международному научно-техническому сотрудничеству с Karolinska Institute, Sweden и Groningen University, the Netherlands; 3) US Department of Energy "Human Genome Project" grant № OR00033-93CIS016

Принятые сокращения. LANL- Национальная лаборатория в JIoc-' Аламосе (США), ICRF- Королевский фонд исследований рака (Великобритания), СЕРН - Центр по изучению полиморфизма человека, FISH - флуоресцентная гибридизация in situ, т.п.н.-тысяча пар нуклеотидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общая схема работы представлена на рис. 1. На первом этапе построения физической карты района 13ql4.3 использовали два фланкирующих STS маркера для поиска YAC клонов в библиотеке генома. Затем насыщали этот район дополнительными

Общая схема фнзичеекго картирования области ^14.3 и поиска к ДНК клонов, кандндатных па роль гена супрессора хронического лимфолейкоза человека

_' 414.3

Хромосома 13 С16Г:.1ГГШ

13ql4.3

RBI RBKpt

D13S25

—з-.

<г

на—

кн

-о—

—íjJ—«W «я—

а-

- -i

ста т.

Рис. 1

Кандадатные гены BCLL-онхосупрессор

STS маркеры в I3q!4.3

® ÍÜ

космддпые клоны i. 13ql4.3

коемидяьш коктиг

кс:мидные зонды

Клонотеки

1"ЛС генома человека

YAC клоны

Новые STS маркеры t

YAC ксятвг

YAC зонды

Космидная 13 хр.

'rívVr'

кДНК мозга плода

кД1Д Склоны

YAC клонами, используя новые STS маркеры, появляющиеся в базах данных. В результате построена YAC - STS карга исследуемой области генома человека. На втором этапе для получения удобных маркеров, с помощью которых можно было бы сузить область депеции и отобрать в дальнейшем кДНК, а также для построения физической карты более высокого разрешения мы искали космиды, принадлежащие району 13ql4.3. Для этого использовал» ДНК YAC клонов, вставки которых перекрывали весь интересующий нас район, в качестве зондов при гибридизации с космидной клонотекой 13 хромосомы, а также выявляли космиды, содержащие STS маркеры исследуемой области генома. Такие космиды, равномерно расставленные по району 1 Зц 14.3, явились для партнеров, ведущих, больных лимфодейкозом, зондами для картирования делений у пациентов с BCLL. Космиды, попадающие в делению, минимальную по размеру среди выявленных в исследованной группе пациентов, использовались на последнем этапе работы для поиска кДНК клопов - претендентов на ген опухолевой супрессии лимфолеикоза.

ПЦР анализ пуло» YАС-клонов библиотеки ICRF но маркерам RBKpt, MGGI5 и D13S25. Скрининг YAC-клонотек и выявление перекрывающихся клонированных фрагментов проводили с помощью ПЦР. Исходными точками для создания коитнга были выбраны 2 STS маркера, которые фланкировали исследуемую область хромосомы 13, размер которой, оцененный но результатам генетического картирования составлял около 1,6 сМ. Это маркер RBKpt, расположенный на расстоянии 60-240 т.п.н. от З'-конца гена 11В1, н D13S25 локализованный на границе исследуемой области со стороны зеломеры. К этим двум маркерам вскоре добавился промежуточный, третий маркер - MGG15 (локус DI3S3I9) Последовательность маркеров: CBN - RB1 - RBKpí - MGG15 - D13S25 - TEL. К началу

работы сведений о других маркерах в исследуемой области не было. Доступными для анализа были пулы YAC-клонов клонотеки ICRF. В результате скрининга пулов в УАС-кдонотеке 1CRF были отобраны 10 индивидуальных YAC-клонов по веем трем маркерам (табл. 1): по маркеру D13S25 - 2 YAC- клона (102С6 и 101D6), один из которых (101D6) оказался также позитивным по маркеру MGG15; по маркеру MGG15 еще пять YAC-клонов (30D7, 32Н5, 61С1, 66а8, 113с2); по маркеру RBKpí три YAC-ююна (Ó1E12, 5SEÜ, 25G5).

Определение размеров YAC в отобранных кленах. Размер YAC молекул в отобранных индивидуальных клонах (приведены в табл.1) определяли с помощью пульс-электрофореза с последующей блот-гибридизацией. Средний размер YAC в исследованных клонах клонотеки ICRF составил 650 т.п.н., что подтверждает оценку, сделанную авторами этой клонотеки (620 т.п.н.). Приведенные размеры YAC можно считать практически рапными размеру самой вставки поскольку векторная часть молекулы (9,67 т.п.н.) пренебрежимо мала по сравнению со вставкой. При многократных пассажах отобранных YAC-клонов размеры вставок не изменялись, что указывает на стабильность структуры исследуемых YAC.

Из всех исследованных YAC, содержащих одновременно два маркера - MGG15 и D13S25, минимальный размер имел YAC ICRF 101D6, что позволяет оценить расстояние между соответствующими локусами в хромосоме 13 менее, чем в 680 т.п.н. (размер YAC 101D6).

ПЦР анализ мега-YAC клонов библиотеки СЕРН по маркерам RíIKpt, MGG15 и D13S25. В ходе выполнения данной работы появилась статья о мега-YAC клонах, перекрывающих локус D13S25 (Cohen et al., Nature, 1993, 366:698-701), однако, ни один из описанных YAC не достигал использованного в статье маркера в гене RB1 (AFM58xd5). Мы исследовали пять 013525-содержащих мега-YAC клонов (СЕРН 745ЕЗ, 897G6, 922А8, 775С8, 857С6) на присутствие

Конто на основе вставок кега-YAC клонов в области 13ql4.3

Таблица 1

Ж

D-нокер локуса и название сЬответствугщего STS маркера

Кяонотека

ICRF 61Е12 ICRF 58Е11 СЕРН 917F8 ICRF 25G5 СЕРН 745ЕЗ ICRF 30d7 ICRF 32hS СЕРН 897G6 СЕРН 922А8 СЕРН 775С8 ICRF 61с1 ICRF 66а8 ICRF 113с2 ICRF 101D6 СЕРН 857С5 ICBF 102С6 СЕРН Í5S10 СЕРН356Е10 СЕРН 752Е1

раэкер тон

510 580 17« 450 1400 780 810 1420 1740 1410 370 380 1800 680 1590 150 550 350 1380

D13S153 D13S818 D13S165 D13S273 D31S319 D13S272 D13S284 D13S25 D13S262 D23S817 58xd6 RBKpt 203xal 126za5 Ш5 120xa3 203zg5 Н2-42 205vh2 745E3L И

=x=

о

о

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

o

nd

nd

o

nd

nd

=+= o =+= o nc* =+== o

o o

o

o

nd

nd

o

o

o

nc

o

nd

nd

=x= o o nd o

o

=+=

=x—x= o o o o o nd o o

o o

=+= o

nd o

o o

=+= о 745E3 o =+= =+=+= 30d7 o o =+=+= 32h5 o o •+=nc= 897GU =+= =t t—t* 92Ш f*—1= o* =+==+* 775C8 o nd o =+=f= íicl o o o =+=+= 66aS o o o =+—+= 113c2 += o o =+=nc= 10106 o — nd o nd= 857C5=+==+: nd o nc 1Q2C6 o o oo (5610 o =■ nd o nd 356E10 o =i-nd o nd 752Elnd o

nd nd

nd =+-

nd

=nd=

=XS

o o o o o

=x= o o o o

=+e nd nd

nd o =+==+=

nd nd nd nd nc o

= O O O O

"=" - Сиквоя участи ДНК содерщего каркер; 'х'пошение кархера; V - конец вставки в ÍAC; '+" - ЩР-полошельш; «о* - ЩР-отрщательши; ■nd* - нет данных,• 'пс* - даннне не чете; *

маркеров RBKpt и MGG15. Три из этих клонов (СЕРН 745E3..897G6,

922А8) содержали одновременно локусы D13S25 и MGG15, а СЕРН 745ЕЗ; содержал еще и маркер RBKpt. Таким образом, впервые, область между генами RB1 и локусом D13S25 оказалась перекрытой по крайней мере одним YAC-клоном, размер которого, согласно базе данных СЕРН, составляет 1400 т.п.н. и расстояние между RB1 и D13S25 в хромосоме 13 не превышает эту величину (при условии интактности структуры вставки в этом YAC).

Создание STS мар:;сроз я2 ¡теноре концевых учзстяоз йстзвпк в YAC. Чтобы выявить перекрывание вставок исследуемых YAC молекул друг с другом и сформировать из них контиг, мы попытались создать STS маркеры, соответствующие концам вставок в YAC. Методом IPCR были накоплены, а затем субклоиированы и секвенированы 11 концевых участков вставок из шести YAC: 101D6, 102С6, 25G5, 58Е11, 745Е5 (оба конца) и 61E12L (левый козгец). Размер субфрагментов составил 200-400 п.и.; секвенировали по одному субклону каждого из 11 концевых участков YAC. Лишь в одном случае (левый конец YAC СЕРН745ЕЗ) нам удалось создать STS маркер (745E3L, зарегистрирован как локус D13S817). Созданный нами маркер соответствовал концу вставки YAC клопа, расположенному на хромосоме 13 вне (теломернее) участка между RB1 и D13S25, как следуег из положительного результата ПЦР с YAC 102с6 (данные не приводятся), который содержит маркер D13S25 (см. табл.1) и отрицательных результатов ПЦР с YAC клонами 25g5, 58сИ и 6lei2, содержащих STS-маркер RBI (см. табл.1).

В 6 из 11 случаев секвенирование показало, что клонированный фрагмент содержал более одного сайта расщепления AM, что может указывать на "химерность" исследуемого субфрагмента. В 4 случаях (58Е1 IL, 101D6L, 102C6L, и 745E5R) секвенированный участок вставки был слишком коротким и позволял подобрать лишь один

to

олигонуклеотид уникальной структуры, пригодный, для гибридизационного анализа. Очевидно, для получения концевого фрагмента желаемого размера из YAC или векторов других типов (ВАС, РАС) необходимо выбирать достаточно большое количество часгощепящих рестриктаз и соответствующую пару праймеров для каждой или нескольких рестриктаз, чтобы получаемый ПЦР продукт был бы максимального размера (до 600 п.н.), что давало бы возможность отбросить часть вектора в нем (100 п.н. в нашем случае) и рассматривать сравнительно протяженный сиквенс для создания STS.

Определение локализации и "химерности" YAC-клонов методом ¡n süu гибридизации с метафазиыми хромосомами человека. Приведенная выше оценка расстояния между локусами в хромосоме, выведенная из их принадлежности одной молекуле YAC, корректна лишь в том случае, если структура вставки в YAC на всем протяжении совпадает со структурой соответствующего участка хромосомной ДНК. Известно однако, что, с одной стороны, до 40-60% YAC-клонов могут содержать фрагменты ДНК не смежные в геноме (так наз. "химерность"), а с другой стороны, YAC может утратить участок внутри вставки. Химерность будет завышать сделанную выше оценку расстояния между локусами, а делецин - занижать такую оценку. В частности YAC 101d6 оказался отрицательным по одному STS маркеру между локусами D13S319 и D13S25 (см. табл.1), так что расстояние межу ними может быть больше 680 т.п.н. Однако отсутствие ПЦР продукта на YAC матрице может быть связано не только с делецией, но и с полиморфизмом в последовательности на основе, которой определялась структура праймеров, по сравнению с присутствующей в самом YAC, как это показано при построении генетической и физической карты генома человека. Так что сделанная оценка размера должна быть еще раз независимо подтверждена. Одним из методов выявления химерности и, одновременно, методом определения

локализации YAC в геноме, является гибридизация меченой. YAC-

молекулы in situ с метафазными хромосомами.

Для YAC клонов, которые были затем использованы в качестве зондов при гибридизации с космидной клонотекой 13 хромосомы мы провели FISH (данные получены совместно с Кост М. и Федоровой Л., ИМБ РАН). YAC СЕРН 745еЗ, ICRF 61 el. ICRF 58el 1 имели строго по одному сигналу в ожидаемом участке хромосомы 13, т.е. не были химерными.

ПЦР-аналш 19 YAC-fjioHfia ш 10 STS-MspvepaM из области 13ql4.3. Исследованные нами мега-YAC клоны содержат согласно базе данных СЕРН еще пять STS-маркеров (AFM: 58xd6, 203xal, 126za5, 120хаЗ, 303zg5). Мы проверили YAC-клоны клонотеки ICRF на присутствие этих маркеров. Кроме того были проанализированы еще два мега-YAC: СЕРН 917F8, перекрывающий ген RB1, и СЕРН752Е1, который ло данным гибридизационного анализа из базы данных СЕРН, псрекрьшаегся практически со всеми исследуемыми в данной работе мега-YAC. По нашим данным 752Е1 не содержит ни одного из маркеров данной области (см. табл. i). Одновременно в работе был использован маркер MGGÍ4. Результаты анализа, представленные а табл.1, позволили построить контиг из 18 перекрывающихся YAC-клонов и установить относительное расположение 10 исследованных STS-маркеров в области 13ql4.3. Заметим, что полученные нами данные о физической карте данной области не противоречат данным СЕРН о наличии 6 AFM Маркеров в мега-YAC, однако, данный контиг выявляется только при рассмотрении четырех дополнительных маркеров использованных нами, ключевым из которых оказался RBKpt.

STS маркеры области 13ql4.3 базы данных WI. Работая в тот момент одновременно с базами данных, доступными через интернет, нами были обнаружены 10 новых STS маркеров в исследуемой

области, созданных в WI (Whitehead Institute, Бостон, США; www адрес - http://www-genome.wi.mit.edu). База данных WI содержит информацию о расположении любых STS маркеров (как полиморфных, так и неполиморфных, а также EST) на хромосомах человека в соответствии с содержанием этих маркеров в мега-YAC СЕРН, локализованных так или иначе на физической карте генома человека.

Маркеры и их порядок на апрель 1995 г. в базе WI были следующими: CEN-AFMS8xd6(D 13S153)-WI6319(D 13S915)-WI7223-WI2379(D13S810) - WI3540 - WI3224 - AFM203xal(D 13S165)-WI3%0-AFM126za5(D 13S273)-WI6333-WI9598-AFM120xa3(D 13S272)-CT16C(5 -WI5710(D 13S912)-WI3638-TEL. В базе данных не рассматривались маркеры серии mgg, а также маркер D13S25.

Мы проверили STS-содержание WI-маркеров в выявленных нами YAC клонах. Полученные нами данные приведены в виде карга в табл.2. По нашим данным, YAC клоны ICRF58el 1 и ICRF61el2 ПЦР-положительны по локусам D13S153 и RBKpt; мега-YAC нон СЕРН745еЗ соединяет маркеры RBKpt и D13S25; YAC клоны ICRF30d7 и ICRF32h5 содержат STS маркеры D13S272, D13S319 и D13S273; YAC ICRF101d6 перекрывает район от D13S319 (mggl5) до D13S25. Перечисленные YAC клоны (в особенности СЕРН 745еЗ, который содержит практически всю интересующую нас область), стали опорными при проверке заявленного порядка STS маркеров в базе данных WI.

Последовательность STS маркеров WI на карте во всех случаях, кроме одного, соответствовала установленной нами последовательности тех же маркеров на нашем контиге YAC клонов. Лишь один из маркеров, WI3638, как показал проведенный нами ПЦР-анализ, не содержался не только ни в одном YAC клоне, но и в пулах космвд клонотеки 13 хромосомы. Маркеры GCT16C05 и D13S912 мы

STS - YAC карта облает» 13ql4.3 между маркерами RB1(D13S153) н D13S25.

таблица I

»faSStób «6119 SKpt WZ379 МЗЬМ Ш22» ИТ/АО aíarntaí. ¥16333 «»93 »!ш\20хлЗ W£1S «5Í10 ЫП1$С05 U-ü «f£2ü5vhi ИКЛ iíeJOitgb

D13S153 D13S915 D13SS13 D135S10 D1JSU78 ИВ1Ш 01JS165 C13SU6S D13S273 Í13SU50 D1JS116Í 011S27Z D1JS319 0135912 — D133325 D13S262 D13S817 D13S2&4

ломатек«, «зые «J«" HMJitsxl l* {ХЖХХЯ «P *3tjecs»5*x Xltl»(lltctl n{n •ltiit(|ii(t:|:)[»iM»il»

юм» YAC п.н.

си »mi- 1740 IlIMíí* oi .id se« nd ci Dd sd 0 0 Ы od 0 :d 0 O

rar »«и 580 0 0 0 а O 0 0 0 5 0 0 0 sd 0

гаг 6i«u 510 13 ; 1 * inui * 0 0 0 0 0 0 O O OO O 0 0 aá 0 в

гаг 2ф «5« 0 0 0 0 0 a 0 0 0 [) x* 0 ¡a 0 O

an М96 519 Ы 0 cd 0 0 0 ftd >i 0 0 »i ad sd Bd

ал suai 310 Sd 0 aj ВС O 0 530cll-»*- 0 0 0 td Dd 0 0 td Cd sd sd

CD4 7i5»3 1400 0 • 0 ЗХПН0В 0 0 0 =»♦* 0 O imsttmui r*m+sx 0

гаг зон 780 Sd 0 0 0 0 0 0 0 O sd sd 0

гаг зав «10 bd a 0 , ПС 0 0 0 ti ■x-x^xxxxtxs a 0 0 ixafmac 0

lar 6ici J70 K! 0 0 О 0 0 0 0 O a 0 sd td 0

1С» 6Ш »0 Ы 0 0 0 0 O 0 0 Utnil« mta^^IgMbmjtjtn» o ' 0 0 . al sd в

-1С* изв 1800 nd sd O Dd sd Dd 0 sd 0 Dd sd 113C2"*»*"*«*«"«* s4 Dd 3 sd td жх»хх

iar 101« eso 0 0 O DC O 0 ВС 0 0 O O SC mimn , 0 0 0

iar Шсб 150 sd 0 O ВС 0 0 ta 0 Dd O O DC O O 0 152CÉ«««" 0

ая аьи 550 0 с 0 0 0 0 0 0 0 0 в 00 a * O 0

ten 3S6el( 350 t>4 с 0 0 0 0 al 3 Dd 0 в ad 0*0 IMS* КШШЯ MnMUHl » 0 0

ОЛ T52el isaa cid nd O Dd ai ad sd к! td nd ta ¡vi 0 0 sd ti 0

си usa 1410 sd »1 3 Sd td tó ai »í 0« Dd ai »fftxnm 11bc& cd od cd od si 0

an aics 1590 Dd ik) 0 Dd Dd ¡id ad Dd ai od Dd Dd O bd Dd

ая 1420 Dd Ы O Dd Dd Dd 0 Ed Dd Dd • ми«0>

an чал 1740 al IK) O Dd M irf cd Dd Dd tuiuniM 92248 r,d nd «

D13S1S3 B1M915 D13S813 MISMO DlSSUlg P13SU71 D13S165 013S118S 0133273 РШ150 81351168 013S2?Z РШ319 D13S912 — t!33sa P13S262 013S317 013ЯМ

Примечания: "==" - Символ участка ДНК содержащего маркер: "х" - положение маркера;"+" - ПЦР-положительныГг. "о" ПЦР-отрицательный: "псГ - нет данных: "пс" - данные не четкие: * - ПЦР-подожительный побагг данных СЕРН

поменяли на нашей карте местами, по сравнению с картой WI, согласно нашим результатам ПЦР с YAC клонами lCRF30d7 и !CRF32h5 (см табл.2).

YAC 745еЗ на своем левом фланге не содержит 5 из 6 STS маркеров, расположенных подряд на карте, и, следовательно, расстояние между крайними маркерами RBKpt и D13S817 несколько больше вставки этого YAC клона (1400 т.п.н.). Для заполнения образовавшейся "бреши" и построения полного контига миди-YAC клонов, мы скринировали доступную на этот момент миди-YAC клонотеку СЕРН по маркеру AFM203xal. Были обнаружены 2 YAC клона 58g6 и 530с11 (результат получен с группой Сулимовой Г.Е., ИОГен РАН), определены их размеры (510 и 310 т.п.н.).

После всех ПЦР экспериментов был построен окончательный кошгиг из миди-YAC и мега-YAC клонов (табл.2) между маркерами RB1 и D13S25.

YAC клоны CEPH58g6, ICRF61cl и ICRFlOldó составляют "минимальный путь" между маркерами RBKpt и D13S25. Общая длина этого "моста" не меньше суммы длин составляющих его YAC клонов, т.е. около 1560 т.п.н.

Выявление космид, принадлежащих исследуемой зоне. Из литературы известно, что предполагаемый ген-супрессор, теряемый при лимфолейкозе, находится в районе 13ql4.3 между RB1 и D13S25. Для картирования гена, необходимо было выявить минимальную область хромосомы 13, утрачиваемую у всех больных. Маркеры для такой работы отсутствовали. Потерю области 13ql4.3 у больных можно было оценивать по геномному Саузерн-блотингу ДНК пациентов с какими-нибудь уникальными зондами данного района. В качестве таких зондов удобно" использовать фрагменты космид. Чтобы найти космидные клоны в области RB1-D13S25, мы использовали два пути:

1) гибридизовали космидиую панель 13 хромосомы (LANL) с

YAC клонами, выявленными в области 13ql4.3 (в качестве зондов использовали молекулы ДНК YAC разделяемые в геле от естественных дрожжевых хромосом).

2) отбирали космиды, содержащие STS маркеры, приписанные нами ранее к зоне 13ql4.3 путем гибридизации меченых олигонуклеотидов с панелью космндных клонов.

В результате первого подхода было найдено космид: для YAC СЕРН745еЗ - 224 клона, ICRF58ell - 70, ICRF61cl - 74, CEPH58g6 - 69, CEPH530cll - 35 клонов. Из этих космид была сформирована подвыборка для последующего построения контига.

Космиды по STS маркерам находили следующим образом. Первоначально определялся фильтр, содержащий космиду/ды с STS с помощью ПЦР на пулах космид клонотеки. Каждый пул представлял собой смыв космид с фильтра, содержащего клоны из 16 планшетов (1536 клонов). После получения положительного ответа в ПЦР с соответствующим фильтром проводилась гибридизация с олигонуклеотидным зондом - праймером и выявлялся искомый космидный клон, что подтверждалось PCR или гибридизацией по Саузерну. Только на маркер AFM203xal космид в библиотехе LANL обнаружено не было. Тогда использовали для поиска клонотеку 1CRF (панель из 22000 клонов) и выявили в ней 5 космидных клонов по этому маркеру. При поиске космид, соответствующих STS маркеру WI5710 в из ПЦР пулов при первичном скрининге был получен положительный ответ, однако гибридизация клонотеки LANL с олигонуклеотидом-праймером была отрицательной. Скорее всего космидные клоны, содержащие соответствующие участки генома плохо размножаются и количества ДНК не хватает для выявления гибридизацией.

Всего выявили 15 групп космид, содержащих следующие БТБ-маркеры: АРМ58хс16, ЯВКрг, WI2379, WI3540) \VI3224, АРМ203ха1, WI3960, АРМ126га5, WI6333, WI9598, АРМ120хаЗ, МСС15, ССТ16С05, Б13825, АРМ303гё5 (табл.3).

Космиды содержащие БТв.

Таблица 3.

Б-номер лок] ^са и название соответствующего ЯТБ ма ркера

135153 058х<16 138818 ЯВКр1 135810 WI2379 Ш1178 \VI3540 1351171 Ш13224 135165 203ха1 1351185 \VI3960 135273 126га5

29с И 96П 116с7 152Г9 157е11 107а11 140а7 158Г5 50а8 155а4 162с9 5с10 9П бЗаЗ 124е11 130е3 130е4 165Ы0 67с8 1б7с2 гам космиды 63е10 73Ь9 133Ь4 159Ы2 1б2а2 гт 162с 12 1120

Б-номер лого (са и название соответствующего БТв ма ркера

1381150 WIбЗЗЗ 1351168 М9598 135319 МСв 15 135272 120хаЗ С5СТ16С 05 135912 \V15710 13525 Н2-42 135284 303zg5

156а5 156Ы2 105П0 122Г4 157с4 12ЬЗ 71а11 150с9 167еб 12П 27Ь9 71а11 109й4 150с8 150с9 167е6 29с4 47а 12 16(111 112с2 115а8 132с12 146Г5 154Ы1 163с4 169Ь5 173а7 173Ь6 174Н7 176с2 69Ь4 125с5

Оказалось, что часть космид содержит одновременно маркеры пщ;15 и АРМ120хаЗ, т.е. эти маркеры расположены менее чем в 40 т.п.н. друг от друга. Таким образом на 13 БТБ маркеров от RBK.pt до

D13S25 приходилось всего 53 космиды, на каждый STS маркер - от 1 до 12 космид, или в среднем - около 4. Если даже считать, что на один STS маркер приходится 1 космида, со среднем размером вставки 40 т.п.н., то 520 т.п.н. района 13ql4.3 было покрыто этими космидами. Сами по себе, такие космидные клоны представляют собой опорные маркеры для картирования делений хромосомы 13 у больных B-CLL, с помощью Саузерн-блотинга.

FISH локализация полученных космид. Чтобы создать ДНК зонды для анализа делеций у пациентов с лимфолейкозом, необходим был специфический контроль, который бы показывал, что полученные космиды лежат именно в зоне 13ql4.3 и более нигде в геноме человека. С этой целью была подготовлена ДНК из 37 космид из подвыборки, сформированной по гибридизации с YAC зондами из зоны 13ql4.3. Проведена FISH локализация этих 37 космид (данные получены совместно с Кост М. и Федоровой J1., ИМБ РАН). Как следует из таблицы 4, лить 48% космид давали сигнал только в районе 13ql4.3; 30% космид локализовались наряду с 13q 14.3 и в других областях генома; 22% космид вообще не принадлежали области I3ql4.3. Таким образом, полученная выборка космид, пригодна для построения контига, так как около 80% космид в ней относятся к области 13q 14.3.

Очевидно, что для поиска кДНК и/или ориентации контшов космид необходимо использовать FISH, возможно на самых ранних этапах такого типа экспериментов, дяя того чтобы не "вылавливать" гены из других областей генома.

Основная часть "фона" подвыборки - это космиды, которые принадлежат лишь району центромеры и/или ядрышкового организатора. Чтобы найти все такие фоновые космиды, была проведена гибридизация с зондом paRI-6, специфическим на центромерные повторы акроцентрических хромосом, любезно предоставленном

Юровым Ю. (ВНЦПЗ РАМН). В результате подвыборка была очищена от космид (20 клонов), содержащих этот повтор.

Результаты FISH локализации космид LANL.

Таблица 4.

Район 13ql4 Район 13ql4 и другие регионы Регионы генома

генома отличные от 13ql4

клон локал. клон локализация клон локализация

ЗеП 13ql4 6Ы1 13ql4 + 13cen I02b4 13q33-13q34

16d4 13ql4 20gl2 13ql4 + 13cen + chr22 105d4 13q21

23а i 2 13ql4 46а2 13ql4+ 13ql4 14h3 NOR + 22ql3

29Ы0 13qI4 47g5 13qI4 + q34 62a6 NOR

38а2 13q 14 47h8 13ql4 + 13q32-33 66gll 13cen + 21cen

38dl 13ql4 71all 13ql4 + 13ql4 + 13q33 109d2 13ql2-13

45b7 13ql4 72hl 13ql4+ 13cen 133hl2 NOR

53g3 13ql4 98a2 13ql4+ 13q32-33 167h7 NOR

55cll 13ql4 122f4 13ql4 + !3q22-31

60а 1 13ql4 127a3 13ql4 + ql2 + q33

72g6 13ql4 156e5 13ql4 + I3ql2

76П0 13ql4

82Г2 13ql4

86(111 13qJ4

115f6 13ql4

116d9 13ql4

162аЗ 13ql4

170с7 !3q!4

Примечания: NOR- район ядрышкового организатора; сеп - цетромерный район.

Построение контига на основе космцд 13ql4.3. За стартовые точки шагания выбирались космиды, содержащие STS или други?. маркеры; локализованные FISH или общие для двух YAC зондрв. Было проведено в общей сложности 120 гибридизаций с рибозондами, полученными с ТЗ- Т7-промоторов от концов космид. В результате шагания были получены островки микроконтигов космид, и соединены космидами маркеры D13S165 и D13S1158; D13S1150 и

D13S1168. При гибридизации выявлялось от 1 до 12 космид, или в среднем 5-6 космид, в одном эксперименте.

Количество клонов, выбираемых одиночным зондом (рибопроба, олигонуклеотид), показывало, что представительность подвыборки космид составляет 3 эквивалента генома и она вполне достаточна для "шагания" (данные не приводятся). Из длин YAC зондов, количества космид и эквивалентности выборки следует, что лишь около 50% отобранных при гибридизации космид, соответствуют 13ql4, остальные - другим областям генома.

Во всех случаях гибридизации YAC зондов на космидную клонотеку 13 хромосомы, выявили, в том числе космиды, содержащие те STS маркеры, по которым YAC зонд был положительным. Даже в случае, когда YAC клоны (СЕРН 530с11, СЕРН 58g6) были ПЦР отрицательными по внутреннему маркеру D13S1185, эти YAC зонды выявили космиды, содержащие данный STS (LANL 21f2, LANL 162е12). Это доказывает с одной стороны корректность установленной последовательности STS маркеров, а с другой наличие в YAC делеций и/или полиморфизма в участках праймирования STS.

В результате упорядочивания космидных клонов по STS маркерам и шагания были построены контиги и выявлены минимальные "пути" между соседними STS маркерами. В частности между D13S165 и D13S118S: TEL-133h4(ICRF)- 2g5(LANL)-19a3(LANL)-21f2(LANL)-CEN; длина перекрытого участка около 100150 т.п.н. Между маркерами D13S1150 и D13S1168 длина минимального пути 80-120 т.п.н.: TEL- 156hl2-131d7-122f4-CEN (все космиды LANL). Маркеры D13S272 и D13S319 находятся в космидах (7lall, 150с9, 167е6), или на расстоянии менее 40 т.п.н. Схема перекрывания космид в контигах, установленная по совокупности гибридизаций приведена на рис.2

Схема контигов космид между парами маркеров: 01381650 -1381185, и 01381150-01381168.

0133X65 01331185

133114 2д5 19аЗ 21Г2 162е12 87е8 5===+= ооо о

2д5 =+===+=====+===

21£2 О О О ==+====х====+==

162е12 О О =+====+==х====+=

//

15ба5

1561И2

19С11

50а9

116С1

ио<11

131(37

122£4

157С4

105Г10

105с14

121(13

121(1X1

143а4

Рис. 2 Слева в столбцах указаны космвды, прогибридизовавшисся с зондами, которые расположены в верхних строках. "—" - участок хромосомы 13; "+" и "о" -соответственно, положительный и отрицательный результаты гибридизаций с рибозондаыи; "==="- ДНК космвд;."х" - локализация БТБ маркера. .

Поиск кДНК. На этапе шагания по хромосоме, описанном в предыдущем разделе, появилась информация от наших шведских партнеров (З.ПтЬогп Каролинский институт, Стокгольм, Швеция), что ген ВСЬЬ находится в непосредственной близости от БТБ маркера п^15. Этот маркер представлен в составе одного из полученных нами космидных контигов, содержащих, в частности космиду ЬАЫЬ 71а! 1. В лаборатории Б-ЕтИот была исследована ДНК одного из больных ВСЩ у которого деления имела минимальный размер по результатам анализа с зондами полученными не из нашей лаборатории. Оказалось, что фрагмент ДНК из коемнды 71а 11 утрачен у этого пациента.

С целью поиска кДНК гена супрессора ВСЬЬ мы провели скрининг с космидой 71а11 в качестве зонда на коммерчески доступной библиотеке кДНК, сконструированной на векторе ^11, производном фага лямбда. Было найдено 4 индивидуальных кДНК клона: №1, №6, №7, №8 (работа выполнялась совместно с В.Кашубой в группе под руководством Е.Забаровского, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция). Вставки кДНК в рекомбинаитных фагах фланкированы сайтами ЕсоШ. Эта рестриктаза была использована для вырезания фрагментов кДНК и их клонирования в плазмиду риС18 по тому же сайту. В результате было получено 5 плазмидных клонов кДНК соответствующих каждому из ЕсоШ-фрагментов от 4 исходных фаговых клонов (фаговый клон №6 содержал один внутренний ЕсоШ-сайт).

Чтобы избежать возможных артефактов карты, связанных с использованием единичной космиды, мы отобрали и картировали еще две космиды (143g9 и 176с2), перекрывающиеся по нашим данным с космидой 71а11. Размер вставки в космиде 71а 11 составил около 37.9 т.п.н. При построении карты сравнивали рестрикционные портреты всех трех космид, полученные при расщеплении каждой из двух

рестриктаз, £соШ и НтсПИ, и выявляли общие для них фрагменты ДНК. Мы провели также серию гибридизаций по Саузерну, используя ЕсоШ фрагменты космиды 71а11 (5 т.п.н., 4,3 т.п.н., 8 т.п.н., 0,9 т.п.нм 19,1 т.п.н.) и каждую из клонированных кДНК как зонды. Пример проведенного анализа приведен на рисунке 3. Вставки трех исследованных космид в области перекрывания имеют одинаковую последовательность сайтов рестрикции и одинаковый размер рестрикционных фрагментов ДНК, и, вероятно, соответствуют по структуре нативной хромосоме 13 в данном районе. На основе полученных данных, нами была построена ресгрикционная карта генома человека по НтсйП и £соШ сайтам, в части области часто утрачиваемой при хроническом лимфолейкозе (рис. 4). В результате чего мы локализовали на этой карте все 5 ¿хоШ-фрагментов, соответствующих 4 исходным кДНК клонам (рис.4). Как видно из построенной нами карты фрагментов кДНК, 4 исходных кДНК клона соответствуют, вероятно, 3 различным генам, являющимся кандидатами на роль гена-супрессора хронического лимфоцитарного лейкоза человека.

í 2 i 4 7. 7 X 4 |l> II 1МЧ4 1 í \ 4 ». 7 S •> 10 К Ii П 14

j

- Ait l.u.lí.

--3,7 т.н. ii.

- 1,8 т.п.«.

Vue. i

Гаи.-тектрофорсч (я) н один из ncpcuotoi» au Сму^-яу W ¿MI, ¡ 7*>..'. И

...,.(,•>„.. .-. i.,în :îfR^,-vwaiia кДНК № fin. На дорожках 7-9 - ылмидо 7Ы1, !■! »!•• £.<i;í. /•',<>((С i //-«ЛИ, п WVШ; 13. Í4- космвда 176с2,

H-'' /¿"PI И //WIH. .•IH.liVH-IHCfB«. Hi> «!. ДЛр-". ГЛЯК 1*413

космнды из данного района хромосомы, .шик чьи дгю «»»чтм« -S. t-iiihons

Схема области 13ql4.3 хромосомы 13 в районе перекрывания ее космндами LANL 71all, 143g9 и 176с2

CEN

TEL

176с2

143g9

gfe

бьби 7

71 al 1

£coRI 5 1 4,3 | 8 Jt , 19,1

Hindlll 4,i ! w 1 8,2 1 W | 8,2 1 1 1

I_I

5 тлл.

Рве. 4

Карга рестрикции участка хромосомы 13, содержащегося в косм идах LANL: 71а11, I43g9, 176с2. кДНК клоны показаны в виде заштрихованных прямоугольников. Первичный фаговый кДНК клон №6 содержал внутренний .EcoRI сайг, и при персклонировашш в pUC18 получилось два субклона - легкий (6l) и тяжелый (6н). При обратной гибридизации кДНК клонов на косыиды 7Ial 1, 143g9, 176с2,- оказалось, что клоп 6l гибридазуется с двумя ЕсоМ фрагментами. Этот клон также гибридизовался и с кДНК Ш

Выводы.

1) Найдены 20 STS-маркеров в области 13ql4.3, определено их относительное расположение в хромосоме 13 человека.

2) Выявлены и охарактеризованы более 20 YAC клонов в области 13ql4.3; получен набор смежных фрагментов геномной ДНК на основе мега- и миди-YAC клонов, перекрывающих район 13ql4.3.

3) Определены расстояния между ближайшими фланговыми STS-маркерами области, часто утрачиваемой при B-CLL: к началу работы это были маркеры RBKpt и D13S25 (расстояние около 1400 т.п.п., по размеру YAC СЕРН 745еЗ), к концу работы это оказались маркеры D13S319 и D13S25 (расстояние около 680 т.п.н., по размеру YAC ICRF 101d6).

4) Создана подвыборка из 452 клонов космид, соответствующих району 13ql4.3, выявленных в хромосомспецифических клонотеках

LANL (LA13NC0I) и ICRF (СЮ8 DH5 L4/FS13).

5) Найдены группы космидных клонов, соответствующих 15 STS-маркерам, установленной нами локализации. Сформированы наборы космидных клонов в известном порядке, соединяющие STS-маркеры в области 13ql 4.3: D13S165 с DI 3S И68, D13S1150 с D13S1168, D13S272 с D13S319;

6) Построена £coRI- и Hindl 11 -рестрикционная карта области генома человека, перекрываемой космидой LANL 71а11, расположенной в минимальной общей области, утрачиваемой у больных BCLL. Фрагменты ДНК этой космиды являются зондами для тонкой ДНК-диагностики хронического лимфолейкоза человека.

7) Найдены 4 кДНК клона, соответствующих космидс LANL 71а11. Эти клоны локализованы на рестрикционной карте, построенной дая данной области хромосомы 13 человека. Найденные кДНК клоны могут соответствовать гену супрессору хронического лимфолейкоза человека.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Бродянский В.М., Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Аитова С.С., Шайхаев Г.О., Шарикова О.А., Захарьев В.М., Федорова Л.И., Зеленин А.В., Эйнхорн С., Бауш Ч., Лаланд М., Росс М., Янковский Н.К. Скрининг YAC-клонов и создание контига, перекрывающего область хромосомы 13 человека, часто утрачиваемую при В-клеточном хроническом лимфоцитарном лейкозе. Молекулярная биология, 1995 T.29.N5, с.1126-1136.

2. Капанадзе Б.И., Бродянский В.М., Баранова А.В., Севастьянов С.Ю., Федорова Н.Д., Курское М.М., Костина М.А., Миронов А.А., Синеокий С.П., Захарьев В.М., Графодатский А.С., Модянов Н.Н., Янковский Н.К.. (1996). Исследование космидных библиотек, содержащих ДНК хромосомы 13 человека. Генетика, т.32,3:331-340.

3. Бродянский В.М., Капанадзе Б.И., Баранова А.И., Щеминов М.А., Добрынин И.Н., Сулимова Г.Е., Забаровский Е.Р., Янковский Н.К. Создание панелей клонов и формирование энциклопедии генов хромосомы 13 человека. Сб. трудов 4-й. конф. "Геном человека-94" , Черноголовка, март 1994 г.

4. N.K. Yankovsky, B.I. Kapanadze, V.M. Brodjansky, G.E. Sulimova A chromosome 13 mapping project based on the Los Alamos cosmid library. 1994-95 DOE humane genome programm report.

5. V.M.Brodjansky, G.E.Sulimova, I.G.Udina, S.S.Aitova, A.V.Baranova, B.LKapanadze, L.I.Fedorova, M.V.Kost-Alimova, A.V.Zelenin, V.M.Zakhariev, O.A.Serpinsky, Ch.Buys, E.R.Zabarovsky, S. Einhorn, N.K.Yankovsky. Making YAC and cosmid contig spanning 13ql4.3 region frequently lost in chronic lymphocytic leukemia. Abstr of the 3d Human chromosome 13 workshop. Tarrytown NJ USA, 30 Oct- I Nov 1995

»г******

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору Янковскому Николаю Казимиропичу. Без его ценных советов и многосторонней поддержки работа бы не "появилась на свет".

Часть результатов была получена я кооперации с партнерами: Захарьевым В.М., Федоровой Л., Кост-Ллнмовой ¡VI. (ММ Б РАН), Сулимовой Г.Е., Аитовой С.С., Удиной И.В. (ИОГен РАН), группами Забаровского Е. и Ейнхорн С. (Каролинский институт, Стокгольм, Швеция). Искренняя благодарность им за всяческое содействие и помощь в работе.

Душевность и теплое отношение между членами лаборатории анализа генома: Савиной Л.Г., Капанадзе Б.И., Нащскиной О.О., Коптевым Д.И., и др. - помогали автору на всем этапе работы.