Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК

Логашенко, Евгения Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК"

На правах рукописи

Логашенко Евгения Борисовна

Подавление экспрессии гена МОК1 с помощью малых интерферирующих РНК

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2006

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н. Черноловская Елена Леонидовна Официальные оппоненты:

д.б.н. Меркулова Татьяна Ивановна

д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация: НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина

РАМН

Защита состоится «ЛО » 2006 г. в // часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01

при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск 90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « г?

Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н.

Фёдорова О. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) злокачественных новообразований - сохранение клетками жизнеспособности под воздействием широкого спектра лекарственных препаратов - является одной из основных причин неудач при лечении раковых заболеваний. Раковые клетки, обладающие фенотипом МЛУ, становятся нечувствительными к химиотерапии независимо от комбинации применяемых лекарств. Феномен МЛУ имеет долговременный и стабильный характер, так как возникшая резистентность сохраняется в поколениях клеток. Большинство случаев проявления МЛУ связано с гиперэкспрессией гена MDR1, который кодирует трансмембранный белок Р-гликопротеин (P-gp), обеспечивающий активный АТР-зависимый транспорт из клеток цитотоксических препаратов различной структуры. На сегодняшний день используется ряд соединений, разрешенных в медицинской практике, способных ингибировать активность P-gp и, таким образом, увеличивать внутриклеточную концентрацию химиопрепаратов и, соответственно, их токсическое действие на P-gp экспрессирующие раковые клетки как in vitro, так и in vivo. Эффективность этих соединений тяжело поддается оценке вследствие сильного побочного действия, поэтому разработка эффективной и специфической стратегии для преодоления P-gp-опосредованного фенотипа МЛУ является актуальной проблемой, как молекулярной биологии, так и медицины. Одним из возможных путей преодоления МЛУ и повышения эффективности лечения неоплазий могло бы стать избирательное подавление экспрессии гена MDR1 с помощью ген-направленных биологически активных препаратов, адресованных к мРНК гена MDR1, таких как антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы, в сочетании с традиционной химиотерапией. Однако на сегодняшний день существуют лишь немногочисленные примеры успешного подавления экспрессии мРНК, присутствующей в клетках в больших количествах или транскрибируемой с амплифицированных генов, как это происходит в случае MDR1 мРНК.

В настоящее время наиболее эффективным подходом к подавлению экспрессии генов является технология, основанная на явлении РНК-интерференции (РНКи), которая уже вскоре после открытия стала широко использоваться для этих целей. Суть явления заключается в том, что малые интерферирующие РНК (siPHK), попадая в клетку, вызывают специфическую деградацию мРНК-мишени, последовательность которой комплементарна антисмысловой цепи siPHK. Показано, что siPHK действуют в наномолярных концентрациях и, таким образом, являются наиболее эффективным средством подавления экспрессии генов. siPHK нашли широкое применение в функциональной геномике, а также испытываются как перспективные терапевтические средства. К сожалению, отсутствие четких параметров выбора наиболее эффективных последовательностей siPHK и их невысокая

стабильность в биологических жидкостях, клетках и тканях организма является существенным препятствием на пути их терапевтического применения.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование процесса подавления экспрессии гена MDR1 и обращение фенотипа МЛУ под действием siPHK. В ходе исследования решались следующие задачи:

Выбор siPHK для подавления экспрессии гена MDR1, обладающих высокой биологической активностью и не вызывающих неспецифические эффекты.

Исследование биологической активности и устойчивости к действию нуклеаз siPHK, содержащих различные химические модификации.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Изученные в работе синтетические siPHK, гомологичные мРНК гена MDR1, оказались наиболее эффективными по сравнению с описанными в литературе в подавлении экспрессии этого гена и восстановлении чувствительности раковых клеток к цитостатику. При их использовании снижение уровня эндогенного P-gp в клетках составило более 80 %, а эффективность их действия мало зависела от расположения участка комплементарности в структуре мРНК гена MDR1. Впервые показано, что ограниченные модификации siPHK (защита 3'- концов siPHK с помощью З'-З' -инвертированной фосфодиэфирной связи и введение двух 2'-<9-метильных звеньев в выступающие 3'- концы siPHK) значительно увеличивают биологическую активность анти-MDR1 siPHK, позволяя в 30 раз снизить концентрацию цитостатика, необходимую для достижения полной гибели раковых клеток. Разработанные анти -MDR1 siPHK и их химически модифицированные аналоги могут рассматриваться как основа терапевтических препаратов для преодоления MDR и повышения эффективности химиотерапии при лечении неоплазий.

Публикации и апробация работы. Результаты работы представлены на II объединенной научной сессии Сибирских отделений РАН и РАМН «Новые технологии в медицине» (Новосибирск, 2002), на международных конференциях «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (Бельгия, 2002), «Chemical & Biological Problems of Proteomics» (Новосибирск, 2004), «Nuclear Structure and Dynamics» (Франция, 2005), "Физико-химическая биология", посвященной 80-летию со дня рождения академика Д. Г. Кнорре (Новосибирск, 2006), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), на междисциплинарном симпозиуме «От Экспериментальной Биологии к Превентивной и Интегративной Медицине» (Крым, Украина, 2006). По материалам диссертации опубликовано 6 статей.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов и

их обсуждения, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитированной литературы. Работа содержит 25 рисунков и 10 таблиц. Библиография включает 318 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение влияния участка мРНК-мишени на эффективность подавления экспрессии гена МИШ с помощью $1РНК

1.1 Выбор мишени

Для исследования подавления экспрессии гена МОЯ1 с помощью 81РНК и влияния на их биологическую активность структуры мРНК-мишени были синтезированы 5 $1РНК (Таблица 1), адресованных к различным областям мРНК этого гена. з1РНК I, гомологичную области первого интрона гена МИШ, использовали в качестве контроля, так как подавление экспрессии генов достигается только под действием $1РНК, соответствующей экзонам, а также 5' и У нетранслируемым областям (ШИ). $1РНК Е, $1РНК Б и $1РНК В были гомологичны участкам МИШ мРНК, взаимодействие с которыми антисмысловых олигонуклеотидов было исследовано ранее. Мишенью для $1РНК и была 3'-нетранслируемая область МЭШ мРНК, поскольку для некоторых генов показано, что именно эта область является наиболее чувствительной к действию 51РНК. $1РНК М, направленная на кодирующую область мРНК, была выбрана на основании метода, предложенного для дизайна з1РНК, описанного в литературе и основанного на ее последовательности.

Таблица 1. «¡РНК, использованные для подавления экспрессии гена МБШ (СепВапк № М14758)

Обозначение $|РНК Последовательность Участок комплементар-ности Функциональный участок в МИШ мРНК

В 5'-иОССААССАСССССАССиССС-З' 3' -ССААвСШССиСССССиССАС-5' 403-423 АиС-кодон

Е 5'-АиСАОССАОСССССиСвАСии-З' 3' -ССиАСиАССиАСССС<ЗАССиС- 5' 598-618 кодирующая область

Б 5' -СССииСАСААбииСиАЦАиСС-З' 3'-ААССвААСиСииСААСАиАиА-5' 557-577 кодирующая область

М 5'-СииСССААССбииСииОСиии-3' 3'-ииСААСССииСССААСАААСА-5' 31333143 кодирующая область

и 5'-иССА6АСииААиАСиСвиСии-3' 3' -ШАССиСиСААииАиСАССАС-5' 41414161 3' ЦТ11 район

I 5'-ОисиСАСССиииСАСАиииСС-З' 3'-ОиСАСАСиСССАААСиСОААА-5' область интрона (контроль)

Жирным шрифтом выделена последовательность, соответствующая последовательности антисмыслового олигонуклеотида.

1.2 Выбор клеточной линии

В качестве модели для исследования биологической активности siPHK была использована линия клеток эпидермоидной карциномы человека КВ-8-5, любезно предоставленная профессором М. Gottesman (NIH, США). Линия клеток КВ-8-5 является производной от линии КВ-3-1 и обладает фенотипом МЛУ вследствие повышенной экспрессии гена MDR1.

1.3 Способы тестирования внутриклеточной активности siPHK

P-gp опосредованная МЛУ представляет собой сложную мишень для селективной регуляции экспрессии, поскольку ген MDR1 относится к числу многокопийных генов, при этом мРНК и белок характеризуются высокой стабильностью и длительным временем жизни - время полужизни белка составляет от 16 до 72 часов. Поскольку ингибирование экспрессии гена MDR1 с помощью siPHK происходит за счет расщепления мРНК-мишени, эффективность действия используемых siPHK может быть оценена по снижению уровня целевой мРНК в клетках, а также по уровню снижения белка -продукта экспрессии гена.

Изменения экспрессии гена MDR1 проявляются на фенотипическом уровне в виде повышения или понижения степени устойчивости клеток к химиопрепаратам, которые могут быть оценены с помощью МТТ-теста. Функциональную активность P-gp можно тестировать по изменению накопления в клетках субстратов P-gp, например, красителя родамина-123.

1.4 Влияние анти-MDR siPHK на уровень мРНК гена MDR1

Для тестирования уровня экспрессии мРНК в клетках, обработанных siPHK, использовали метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием в качестве внутреннего стандарта гена Р~ актина. Клетки линии КВ-8-5 инкубировали с siPHK в концентрации от 1 до 100 нМ (рнс.1). В качестве контроля использовали клетки, не обработанные siPHK. Исследование кинетики процесса показало, что минимальный уровень мРНК MDR1 детектируется через 24 часа. siPHK I, не имеющая мишени в составе мРНК, в концентрациях 1-100 нМ не влияла на уровень MDR1 мРНК в клетках, что свидетельствует о специфичности действия выбранных siPHK. После инкубации клеток в присутствии 5 нМ siPHK Е (рис.1) наблюдается резкое снижение количества MDR1 мРНК, которое достигает минимума при увеличении концентрации siPHK до 20 нМ. Дальнейшее повышение концентрации siPHK до 100 нМ не увеличивает эффективности действия. Возможно, это связано с тем, что в условиях избытка siPHK выступают в качестве конкурентных ингибиторов расщепления РНК по механизму РНК-интерференции, связывая белки комплекса RISC, участвующие в этом процессе, содержащиеся в клетках в ограниченном количестве.

А)

Б)

К 1 5 10 20 50 100

^ * , Г- . I

- «¡РНК, нМ

-МБШ

- р-актин

ай

100

Рис. 1. Влияние 81РНК на уровень мРНК гена МОЫ в клетках КВ-8-5 через 24 ч. А)

Фотография 1.5% агарозного геля, окрашенного бромистым этидием, после разделения продуктов реакции ОТ-ПЦР с использованием суммарной РНК клеток, обработанных $1РНК Е. К -контрольные клетки; Б) Относительный уровень мРНК гена после добавления б1РНК Е (белые столбики) и б ¡РНК I (серые столбики). Соотношение мРНК МОШ/актин в контроле

концентрация $1РНК, нМ (черные столбики) принимали за 1, стандартное отклонение определяли по результатам трёх независимых экспериментов.

1.5 Влияние анти-Л/Х)/? в1РНК на чувствительность клеток к цитостатику

При подавлении экспрессии гена МИШ под действием б ¡РНК, количество белка Р^р в цитоплазматической мембране снижается. Так как клетки культивируются в среде, содержащей цитостатик винбластин, постепенное увеличение концентрации винбластина в цитоплазме приводит к гибели клеток. Восстановление чувствительности клеток к винбластину под воздействием з1РНК определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Клетки линии КВ-8-5 инкубировали с з1РНК в присутствии цитостатика в течение 1-5 суток, по окончании инкубации количество живых клеток определяли с помощью МТТ теста. Показано, что инкубация клеток в присутствии винбластина в течение 24 - 72 ч после обработки з1РНК приводит к снижению количества живых клеток всего на 20 % (рис. 2). Это, по-видимому, связано с продолжительным временем жизни Р-£р (16 - 72 ч). Увеличение времени инкубации клеток до 120 ч приводит к гибели всех клеток. Инкубация клеток в течение 96 ч после трансфекции $1РНК была выбрана как оптимальная для оценки действия $1РНК по восстановлению чувствительности к цитостатикам.

Двукратное снижение количества живых клеток происходило уже при концентрации 20 нМ для 81РНК Е, $1РНК М и $1РНК Б. При повышении концентрации этих $1РНК до 100 нМ количество живых клеток снижалось до 30% от контроля, а при увеличении времени инкубации клеток до 120 ч после обработки $1РНК В, $1РНК М или э^НК Р в концентрации более 100 нМ в

присутствии винбластина, также как и в случае 51РНК Е происходила гибель всех клеток (для $1РНК Е рис. 2). $1РНК I и $1РНК и не оказывали никакого влияния на жизнеспособность клеток в присутствии винбластина даже при длительной (120 ч) инкубации.

120

100 80 60 40 20

120 Врем«, ч

Рис. 2. Кинетика изменения чувствительности клеток КВ-8-5 к винбластину под действием 100 нМ $1РИК в комплексе с Олигофектамином. Клетки КВ-8-5 обрабатывали $1РНК и инкубировали в присутствии 300 нМ винбластина в течение 96 ч. За 100% принимали количество клеток в момент добавления з1РНК.

Через 96 ч инкубации в присутствии $1РНК Е, $1РНК М, $1РНК В и $1РНК Б и винбластина наблюдалось концентрационно-зависимое увеличение чувствительности клеток к винбластину и, как следствие, их гибель (рис. 3).

120 б^РНК, нМ

Рис. 3. Изменение чувствительности клеток КВ-8-5 к винбластину под действием 81РНК. Клетки КВ-8-5 инкубировали в присутствии б1РНК и 300 нМ винбластина в течение 96 ч. ( б!РНК Е, ■- Б ¡РНК М, з1РНК В, ▲ - з1РНК В, О - б1РНК и,П- 81РНК I ). За 100% принимали количество живых клеток в контроле: клетки инкубировали с Олигофектамином в отсутствие з1РНК. Ошибка эксперимента не превышала 10%. Представлены средние значения, полученные из результатов трех параллельных экспериментов.

1.6 Влияние анти-МШ? $1РНК на уровень Р^р

Подавление экспрессии гена МИШ с помощью в1РНК подтверждали путем определения количества продукта этого гена - белка Р-£р. Из данных, приведенных на рисунке 4 видно, что действительно, через 72 ч после обработки клеток $1РНК Е количество Р-§р снижается до 17% от количества этого белка в необработанных клетках. Трансфекция клеток $1РНК В, $1РНК Б и в1РНК М вызывает сходное снижение количества Р^р. В то же время, обработка клеток Олигофектамином, $1РНК и или б1РНК I в присутствии Олигофектамина не влияет на количество Р-§р в клетках. Количество /?-актина во всех исследованных препаратах оставалось постоянным, что говорит о

специфичности подавления экспрессии P-gp под действием siPHK.

К ол siE siD siM siB siU sil

P-gP

P-актин

Рис. 4. Снижение количества Р-гликопротеина в клетках линии КВ-8-5, трансфецированных siPHK Е (siE), siPHK D (siD), siPHK M (siM), siPHK В (siB), siPHK U (siU) и siPHK I (sil) в концентрации 20 нМ

В качестве контроля использовали интактные клетки (К) и клетки, инкубированные в присутствии Олигофектамина без добавления $1РНК (ол).

1.7 Подавление функциональной активности Р^р под действием $1РНК

Одним из способов тестирования фенотипа МЛУ и активности Р-£р является функциональный тест, определяющий накопление родамина-123 в клетке, так как этот краситель является субстратом P-gp. Клетки, в мембране которых содержится P-gp, выводят из цитоплазмы родамин-123 в межклеточное пространство, и, наоборот, подавление экспрессии гена МЛЯ1 и снижение уровня Р-£р в мембране приводит к аккумуляции родамина-123 в цитоплазме.

Клетки лекарственно-устойчивой КВ-8-5 и родительской КВ-3-1 линий трансфецировали различными $1РНК в концентрации 20 нМ и инкубировали в течение 72 ч - времени, когда наблюдается детектируемое изменение уровня белка, но еще не наблюдается гибели клеток, в присутствии 300 нМ винбластина. Затем клетки инкубировали в буфере, содержащем родамин-123 в течение 15 мин - времени, достаточного для накопления красителя в клетках, в которых уровень Р-§р не детектируется (КВ-3-1). Далее клетки помещали в буфер без родамина и инкубировали еще в течение 10 мин - времени, достаточного для «выброса» родамина из цитоплазмы клеток, содержащих P-gp (КВ-8-5). В качестве контролей использовали клетки этих же линий, не обработанные б1РНК, а также клетки КВ-3-1, в которых ген МИШ был активирован добавлением 3 нМ винбластина. Из полученных данных (рис. 5) видно, что в родительской линии КВ-3-1 (рис. 5 А) родамин-123 эффективно накапливается в цитоплазме и клетки «красные», тогда как клетки КВ-8-5 с фенотипом МЛУ остаются «синими» (рис. 5 В). б1РНК Е и б1РНК Б, под действием которых наблюдалось значительное снижение уровня Р^ (рис. 4), вызывают в клетках КВ-8-5 накопление родамина-123 и клетки становятся «красными», то есть приобретают фенотип лекарственно-чувствительных клеток (рис. 5 Г и Д). Аналогичный эффект оказывали на клетки КВ-8-5 $1РНК В и 81РНК М (данные не приведены). б1РНК и и контрольная з1РНК I, не влияющие на уровень мРНК (рис. 1) и белка (рис. 4), также не влияют и на транспорт красителя и клетки остаются «синими» (рис. 5 Е и Ж), то есть клетки сохраняют фенотип лекарственной устойчивости. На фотографиях отчетливо видно появление фенотипа МЛУ - клетки КВ-3-1 с МЛУ, активированной с помощью небольшой (3 нМ) концентрацией винбластина, занимают

промежуточное положение между отчетливо «красными» и отчетливо «синими» клетками (рис. 5 А, Б и В).

Во многих опухолях фенотип МЛУ может обеспечиваться несколькими механизмами. При этом возникает вопрос о достаточности блокирования одного из путей транспорта цитотоксических препаратов из клетки для достижения терапевтического эффекта. В клетках линии КВ-8-5, наряду с гиперэкспрессией гена MDR1, наблюдается повышенный уровень экспрессии гена MRP, продукт которого также является трансмембранным насосом со сходной субстратной специфичностью и может вызывать множественную лекарственную устойчивость. Наши данные показали, что под действием siPHK происходит подавление экспрессии P-gp, и клетки линии КВ-8-5 с фенотипом МЛУ накапливают родамин-123 в такой же концентрации, что и клетки лекарственно-чувствительной линии КВ-3-1. Экспрессии одного белка MRP оказывается недостаточно для эффективного транспорта красителя и цитостатиков и поддержания фенотипа МЛУ. Подавление экспрессии P-gp позволяет обеспечить накопление в клетках лекарств и красителей и восстановить чувствительность этих клеток к химиопрепаратам даже при наличии в клетках дополнительных путей формирования множественной лекарственной устойчивости.

КВ-3-1(-внибластин) КВ-3-1(+винбластнн)

КВ-8-5

KB-8-S после обработки siPIIK Е

КВ-8-5 после обработки siPIIK D

КВ-8-5 после обработки si РНК U

Рис. 5. Накопление родамина-123 в клетках линий КВ-8-5 после обработки $(РНК.

Фотографии клеток в поле флуоресцентного микроскопа, увеличение 400х. Синий цвет -ядра, окрашенные Хехст-33258, красный цвет - родамин-123, накапливающийся в цитоплазме. А — клетки линии КВ-3-1, культивируемые в отсутствие винбластина и з1РНК; Б - клетки линии КВ-3-1, активированные добавлением 3 нМ винбластина; В - клетки линии КВ-8-5, культивируемые в отсутствие 51РНК.

Г, Д, Е, Ж - клетки линии КВ-8-5, через 72 ч инкубации в присутствии 20 нМ з1РНК Е (Г), ^РНК Б (Д), в1РНК и (Е), з1РНК I (Ж).

Таким образом, подавление экспрессии гена MDR1, выражающееся в снижении уровня белка, восстановлении чувствительности клеток к цитостатику и обращении фенотипа МЛУ под действием в1РНК Е, б1РНК В, з1РНК М и в1РНК Б происходит со сходной эффективностью для всех четырех

КВ-8-5 после обработки si РНК I

з!РНК, в то время как эффективность действия антисмысловых олигонуклеотидов, исследованных в работе (Костенко, 2002) и направленных к тем же участкам, что и $1РНК, существенно отличается (табл. 2).

* - за эффективность подавления принимали % снижения уровня Р-гликопротеина через 72 ч после трансфекции 20 нМ б1РНК относительно контроля.

** - за эффективность подавления принимали снижение уровня экспрессии мРНК гена МйЯ1 через 24 ч после инкубации с 50 мкМ антисмысловым олигонуклеотидом (Костенко Е.В., 2002); ас ОН — антисмысловой олигонуклеотид

Несмотря на то, что максимальный уровень подавления экспрессии гена MDR1 достигал 90 % как при использовании siPHK, так и антисмыслового олигонуклеотида, направленных к области Е MDR1 мРНК, используемые концентрации ингибиторов различались на несколько порядков (20 нМ и 50 мкМ для siPHK и антисмыслового олигонуклеотида, соответственно). Эффективность действия siPHK D оказалась сравнима с эффективностью действия siPHK Е, в то время как антисмысловой олигонуклеотид D не оказывал влияния на экспрессию гена MDR1.

Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что подавление экспрессии генов с помощью siPHK менее требовательно к выбору последовательности мишени в составе мРНК и гибридизационным свойствам используемых дц-олигорибонуклеотидов, по сравнению с «антисмысловым» подходом.

1.8 Анализ специфичного действия используемых siPHK

Существуют данные, свидетельствующие о том, что siPHK, особенно при высокой концентрации, могут индуцировать определенную группу генов, вовлеченных в интерфероновый (ИФН) ответ в клетках млекопитающих. Кроме того, возникновение неспецифического подавления экспрессии гена может быть вызвано использованием трансфекционного реагента. Известно, что при развитии ИФН ответа в клетках повышается уровень экспрессии 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы (OAS) и протеинкиназы R (PKR). Уровень экспрессии этих генов под действием siPHK оценивали с помощью ОТ-ПЦР. В качестве положительного контроля использовали коммерчески доступный препарат poly (1:С), являющийся индуктором эндогенного интерферона. Клетки инкубировали

Таблица 2. Сравнение эфективности действия siPHK и антисмысловых олигонуклеотидов

siPHK и ас ОН Степень ингвбирования, %

siPHK* ас ОН**

В 75% 40%

Е 90% 90%

D 80% 0%

в течение 24, 48 и 72 ч после трансфекции, затем выделяли суммарную РНК и определяли уровень ОАБ! и РКЯ мРНК (рис. 6).

А) к Ш1 К м I 1:С Рис. 6. Влияние siPHK на уровень

'„_.г1 1..I W ¿u' f^il - PKR PKR (A) и OAS (Б) мРНК в клетках

ч ■ J КВ-8-5. Приведены фотографии

• «тт. <—»«*»«>■»] -/?- микроглобулин 1.5% агарозных гелей, окрашенных

бромистым этидием, после Б) К ол Е М I 1:С разделения продуктов реакции ОТ-

- _ qA£ ПЦР с использованием суммарной

\ ' V ' ч*П „ РНК клеток, обработанных siPHK Е

(Е), siPHK М (М), siPHK I (I) в концентрации 20 нМ или poly (1:С) (1:С) в концентрации 5 мкг/мл. К — контрольные клетки; ол — клетки, обработанные только Олигофектамином. Клетки КВ-8-5 инкубировали в присутствии siPHK и Олигофектамина в среде, содержащей 300 нМ винбластин в течение 48 ч (А) и 24 ч (Б).

Инкубация клеток как в присутствии комплекса siPHK с Олигофектамином, так и в присутствии только Олигофектамина, не приводит к изменению уровня мРНК генов OAS1 и PKR в клетках КВ-8-5 по сравнению с контролем, тогда как инкубация в присутствии препарата poly(I:C), в концентрации 5 мкг/мл, приводит к значительному кратковременному повышению уровня OAS1 мРНК (через 24 ч) и уровня PKR мРНК (через 48 ч) (рис. 6). Полученные данные показывают, что выбранные нами siPHK не вызывают неспецифических эффектов, а наблюдаемые эффекты связаны исключительно с действием siPHK по механизму РНК-интерференции.

2. Изучение влияния различных химических модификаций siPHK на ее свойства

Одним из основных факторов, влияющих на эффективность подавления экспрессии гена-мишени под действием siPHK и обеспечивающих длительность достигнутого эффекта, является сохранность siPHK в клетке и культуральной среде. Недостаточная длительность эффекта интерференции, связанная с деградацией siPHK под действием клеточных и сывороточных рибонуклеаз, является проблемой для использования siPHK в качестве ингибитора экспрессии терапевтически значимых генов.

Как правило, после однократной трансфекции клеток препаратом siPHK снижение концентрации мРНК - мишени в клетке наблюдается в течение 2-4 суток, а затем уровень этой мРНК постепенно восстанавливается. Внесение химических модификаций, направленных на увеличение устойчивости олигорибонуклеотидов к действию рибонуклеаз, может существенно повысить

стабильность б1РНК в клетке и, следовательно, может увеличиться длительность вызываемого ею эффекта.

2.1 Использованные химические модификации олигорибонуклеотидов

Для исследования влияния химических модификаций в составе з1РНК на эффективность и продолжительность её действия была синтезирована серия модифицированных бФНК, гомологичных последовательности 598-618 нт мРНК гена МИШ, в которых для защиты от эндонуклеаз рибонуклеотиды з1РНК Е заменяли разным количеством 2'-0-метильных аналогов, а для защиты от действия З'-экзонуклеаз, 3'-концы 51 РНК Е были модифицированы путем введения З'-З' инвертированной фосфодиэфирной связи (далее по тексту - З'-З'-инверсия) (Табл. 3).

Таблица 3. Последовательности $!РНК, использованных для подавления экспоессии гена \IDR1. и их химические модификации

Обозначение siPHK Последовательность

Е 5' -AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU-3' 3' -GGUAGUAGGUACCCCGACCUG-5'

Ei 5' -AUCAUCCAUGGGGCUGGACUmU'"Tinv -3' 3' -TinvG",GmUAGUAGGUACCCCGACCUG-5'

Em 5 ' -AmUnCmA1"UmCmC"A,"U'"G1"GmGI"G''C1"UlnG1°G'W'C1°UmUra-3 ' 3' -G"G"UTG"OTG,GTA,C™CmC"CmGTC'"C"U"G,-5'

Eml 5' -A'tJTWVrrA^VG'W'U'W'AW'U" Tinv-3' 3 ' - T i n v GmGmUmAmGmUmAmGmGn>UmAmCmCmCmCmGmAmCmCmUmGm- 5 '

Е/Ет 5 ' -A UCAUCCAUGGGGCUGGACU U-3' 3 » - GmGmUmA"'GmUmAmGmGmUmAmCmCmCmCmGmAmCmCmUmGm- 5 '

Ет/Е 5 ' -A'VV"AmUmCmCmA'"U'"G'°GmGmG'"CmU'"GmGmAmC',,UmUm- 3 ' 3' -G G UAGUAGGUACCCCGACCU G-5'

E/Ei 5'-AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU-3' 3 ' -TinvGmGmUAGUAGGUACCCCGACCUG-5 '

EUE 5' -AUCAUCCAUGGGGCUGGACU'"U"Tinv -3' 3'-GGUAGUAGGUACCCCGACCUG-5'

Emi/E 5' -A"Vl,CnAmUmCmC''AmUmGmG'"GmG'"C1"U'°G'"G"AmC''>U"U^ Tinv-3' 3' -G G UAGUAGGUACCCCGACCU G-5'

E/Emi 5'-A UCAUCCAUGGGGCUGGACU U-3' 3 ' -TinvGmGmUmAmG"UmAmGmG"'UmAmC'"CmCmCmGmAmCmCmUmGm-5 '

В" "W

О ОСН3

о=Р—о"

9 *

2'-0-метилрибонуклеотид

З'-З'-инвертированный

I. Т| К ]' 1Г >Г Ь к Ш

•И»**»

2.2 Исследование сохранности $1РНК в культуральной среде

Для проявления внутриклеточной активности нуклеиновые кислоты должны быть устойчивы к действию нуклеаз. Мы исследовали кинетику и характер деградации з1РНК Е и ее модифицированных аналогов в культуральной среде в отсутствие и присутствии сыворотки. Использованные б1РНК состояли из немеченой смысловой и меченой антисмысловой цепей. з!РНК инкубировали в среде, выделяли суммарную РНК и анализировали в 18%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 7).

Рис. 7. Сохранность [5'-32Р]-в1РНК в среде 1МБМ. Радиоавтограф 18%-ного ПААГ, содержащего 8М мочевину, после разделения продуктов

£ расщепления б ¡РНК Е в среде 1МБМ, не содержащей 5%- ную РВБ (А) и з1РНК Е1 в среде с. 1МБМ, содержащей 5%-ную РВБ (Б). Сверху указано время инкубации, К- исходная 51РНК Е. Слева от геля приведены сайты расщепления РНКазой Т1 [5'-Р]меченой цепи $1РНК Е в денатурирующих условиях, Ь-продукты статистического

расщепления з1РНК в

имидазольном буфере.

-«1РНК -РЧЧиео»

•и.

•С.

•т

Данные показывают, что $1РНК, не содержащая химических модификаций, сохраняется интактной в среде, не содержащей сыворотки, довольно продолжительное время. Так, даже через 24 ч инкубации сохраняется не менее 95% исходной б1РНК (рис.7 А). Однако в среде, содержащей 5% БВБ, происходит быстрая деградация з1РНК, содержащей ограниченные химические модификации ^¡РНК Е1), характерные продукты расщепления появляются уже в течение первых 3 минут (рис. 7Б). На рисунке 8 А приведены кинетики деградации различных $1РНК.

Из приведенных данных видно, что наибольшую стабильность проявляла з!РНК Еш, все рибонуклеотиды которой были заменены 2'-0-метильными звеньями: в среде, содержащей сыворотку, сохранялось 95 % этой б1РНК при инкубации в течение 24 ч (рис. 8 А, кривая 1). з!РНК Еш/Е, состоящая из полностью 2'-0-метилированной смысловой и не модифицированной антисмысловой цепей, была менее стабильна (рис. 8 А, кривая 2) - после 5 минут инкубации интактным оставалось около 64% этой $1РНК, а через 24 ч количество б1РНК Еш/Е снижалось до 24%. Более подверженными действию

сывороточных нуклеаз оказались $1РНК Е, Е1/Е и Е1 (рис. 8 А, кривые 3 - 5). Уже через 15 минут инкубации деградации подвергалось около 85% этих з1РНК, а через 4 ч наблюдалась их полная деградация. Введение в $1РНК 3'- 3' (инвертированной) фосфодиэфирной связи не приводило к увеличению их нуклеазоустойчивости. Расщепление з1РНК под действием сывороточных нуклеаз происходит неслучайным образом. Изучение характера расщепления позволяет сделать вывод о том, что деградация з1РНК происходит под действием эндо-, а не экзонуклеаз. Все сайты расщепления можно разделить на две группы: первичные, расщепление по которым начинается в первый момент и протекает с высокой эффективностью (например, С3рС4), и вторичные сайты, расщепление по которым начинается только после того, как часть з!РНК уже подверглась расщеплению (например, и2рС3) (рис. 8 Б). В $1РНК Е основными нуклеазочувствительными сайтами оказались ирв и СрА мотивы, фосфодиэфирные связи в которых с наибольшей скоростью расщепляются рибонуклеазами семейства РНКазы А. Для каждой из исследованных $1РНК наблюдался определенный набор продуктов расщепления (рис. 8 Б).

Оказалось, что модификация з!РНК может приводить к изменению характера расщепления. Так, в антисмысловой цепи 81РНК Еш/Е наблюдалось исчезновение нуклеазочувствительных сайтов С7рА8, и9рС10, что, возможно, связано с неспособностью эндорибонуклеаз эффективно связываться с дуплексом, а также "плавить" цепи с образованием одноцепочечных участков. В 81РНК Е1 основными нуклеазочувствительными сайтами оказались: С3рС4, С4рА5, С10рАи, и12рв13 (Рис. 7 Б), а также был выявлен дополнительный сайт расщепления С6рС7. Даже при длительной инкубации (24 ч) не было обнаружено продуктов расщепления по другим сайтам. Таким образом, стабильность рибодуплекса в биологических средах определяется последовательностью олигорибонуклеотидов и может существенно сказываться

Рис. 8. Стабильность |5'-32Р]-вП'НК Е и ее модифицированных аналогов в среде ИУЮМ, содержащей 5%- ную РВ8.

А) Кинетика расщепления з1РНК в среде 1МОМ, содержащей 5%- ную РВБ. Кривые 1-5 для 81РНК Ет, Ет/Е, Е, Е1/Е, Е1 соответственно. Б) Суммарная схема распределения нуклеазочувствительных сайтов з1РНК Е и ее модифицированных аналогов: стрелками указаны расщепляемые связи, величина стрелок отражает интенсивность расщепления конкретной связи; + - сайты, не подвергавшиеся расщеплению в составе $1РНК Еш/Е; • - сайт, подвергавшийся расщеплению только в составе з1РНК Еь

на вызываемых им биологических эффектах.

А)

Б)

-ж-

О 2 , „ „ м

||| | Время,ч

VIV 11 * V

5' -А-и-С-А-и-С-С* А-и* О-С-С-в-С-О^С^в-А-С-и-О-С-Сги-А-егО-А-а-О-и-АтС-С-С-Сге-Ат-СгСгО-в- 5'

Ф Л А А Афт*

+ +

2.3 Биологическая активность химически модифицированных в1РНК

Эффективность подавления экспрессии гена МБШ химически модифицированными б1РНК оценивали по восстановлению чувствительности клеток к винбластину. Клетки КВ-8-5 инкубировали с различными количествами в1РНК в комплексе с Олигофектамином (5 нМ, 20 нМ и 100 нМ) в присутствии 300 нМ винбластина. После инкубации клеток в этих условиях в течение 96 ч определяли количество живых клеток. Результаты анализа представлены на рисунке 9.

Рис. 9. Влияние химических модификаций в!РНК на эффективность увеличения

чувствительности клеток линии КВ-8-5 к винбластину. Клетки инкубировали в присутствии только Олигофектамина (черные столбики), в присутствии комплекса з1РНК / Олигофектамин в концентрациях: 5нМ (серые столбики), 20 нМ (белые столбики) и 100 нМ (заштрихованные столбики) в среде, содержащей 300 нМ винбластин в течение 96 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, которые инкубировали с Олигофектамином в отсутствие ^РНК.

в^НК Е (35%)

б1РНК Е1 ' (10%)

Еш

ЕМ

2.3.1 Влияние на биологическую активность 5¡РНК содержания в ее составе полностью 2 -О-метилированных цепей

Полностью 2'-0-метилированная б1РНК проявляла наибольшую стабильность при инкубации в среде, содержащей 5% РВЭ. Можно было предположить, что такое увеличение времени жизни б1РНК будет способствовать увеличению ее способности подавлять экспрессию гена-мишени. Результаты МТТ теста показали, что как природная б1РНК Е, так и з1РНК Еш, содержащая полностью метилированные смысловую и антисмысловую цепи вызывают концентрационно-зависимое увеличение чувствительности клеток к винбластину и их гибель (рис. 9, гистограммы 1 и 2). Однако полная замена природных рибонуклеотидов на 2'-0-метилированные аналоги в б1РНК приводит к существенному снижению эффективности ее действия по сравнению с немодифицированным аналогом (рис. 9, гистограмма 2). Инкубация клеток в течение 96 ч в присутствии винбластина и 81РНК Е в концентрации 20 нМ снижала количество живых клеток до 35% от контроля, тогда как инкубация в присутствии модифицированной з1РНК Ет такой же концентрации не влияла на их жизнеспособность, и только при повышении концентрации $1РНК Еш до 100 нМ наблюдалась гибель клеток под действием винбластина. 2 '-О-метилированная з1РНК Еш, хотя и обладает наибольшей

устойчивостью к действию нуклеаз. проявляет сниженную биологическую активность,

Таким образом, оказалось, что при низких концентрациях (5 нМ) siPHK, содержащие в своем составе полностью 2'-0-метилированную смысловую, антисмысловую или обе цепи не способны восстанавливать чувствительность клеток КВ-8-5 к винбластину. Результаты МТТ теста для siPHK Emi, также содержащей полностью модифицированные смысловую и антисмысловую цепи оказались аналогичными результатам, полученным для siPHK Em (рис. 9, гистограммы 2 и 3).

2.3.2 Влияние на биологическую активность siPHK наличия в ее составе цепей, содержащих 2'-0- метильные звенья на 3'- выступающих концах, а также 3 '-3' инверсию

Защита 3'-концов siPHK с помощью 3'- 3'- инверсии и введение двух 2'-О- метальных звеньев в 3выступающие концы siPHK (siPHK Ei) увеличивала ее биологическую активность по сравнению с немодифицированной siPHK Е (рис. 9, гистограммы 1 и 4), хотя время ее полужизни составляло лишь ~30 мин (рис. 8 А). В присутствии этой siPHK в концентрации 20 нМ выживало лишь 10% клеток, тогда как использование немодифицированной siPHK Е приводило к снижению количества живых клеток до 35%. Таким образом, эффективность действия исследованных siPHK определяется не только временем их жизни в культуральной среде.

При сравнении температур плавления siPHK Е и siPHK Ei (определение температур плавления выполнено Пышным Д.В., Лаб. химии нуклеиновых кислот, ИХБФМ СО РАН) оказалось, что Tm siPHK Е выше, чем Тт siPHK Ei на 4°С (84°С и 80°С, соостветственно). Можно предположить, что такая разница температур облегчает расхождение цепей siPHK и сборку комплекса RISC, что, в свою очередь, несмотря на низкую устойчивость к действию нуклеаз, выражается в более эффективном биологическом действии.

2.4 Продолжительность ингибирующего действия

Продолжительность ингибирующего действия siPHK исследовали путем определения количества продукта гена MDR1 - белка P-gp с помощью Вестерн-блот анализа. Для этого, клетки линии КВ-8-5 инкубировали либо в присутствии siPHK Е, либо в присутствии наиболее эффективной из химически модифицированных siPHK - siPHK Ei в течение 8 суток. Поскольку под действием этих siPHK и винбластина количество живых клеток снижалось к 5 суткам практически до нуля, для определения длительности эффекта подавления экспрессии P-gp мы инкубировали клетки с siPHK в среде, не содержащей цитостатик. Из данных, приведенных на рисунке 10 видно, что в этих условиях количество Р-гликопротеина снижается даже в клетках, не обработанных siPHK, что говорит о восстановлении клетками нормального фенотипа в отсутствие цитостатика. Однако под воздействием обеих siPHK, на 4

сутки (время, когда наблюдается гибель клеток в среде с винбластином) количество Р-£р снижалось до уровня 45% и 35% в случае $1РНК Е и б^РНК Е1, соответственно, в то время как уровень Р-£р в контрольных клетках составлял 65% от исходного.

Уровень Р-£р в клетках, инкубированных с з1РНК Е1, снижался до минимального к 6 суткам и оставался таким же до 8 суток, тогда как уровень Р-§р в клетках, инкубированных с б1РНК Е, достигал своего минимального значения на 5-е сутки, но уже на 6-е сутки начинал возрастать. Важно отметить, что снижение уровня Р-§р под воздействием 5 ¡РНК Ш происходило эффективнее по сравнению с $1РНК Е. Ни в одном случае не было достигнуто 100% снижения уровня белка, что, возможно, связано с его высоким базальным уровнем.

А)

Б)

актин

- актин

Рис. 10. Ингибирование экспрессии гена МИШ в клетках линии КВ-8-5, трансфецированных различными «¡РНК (результаты Вестерн блот-гибридизацин). В качестве контроля использовали клетки, инкубированные с Олигофектамином без добавления б1РНК. Клетки КВ-8-5 инкубировали в присутствии б1РНК и Олигофектамина в среде, не содержащей цитостатик в течении 1—8 суток. В качестве внутреннего стандарта использовали количество ^-актина в клетках. За единицу принимали отношение Р-гликопротеин / /?-актин в клетках через сутки после добавления комплекса з1РНК / Олигофектамин. А) контрольные клетки; Б) клетки, инкубированные в присутствии комплекса бШНК / Олигофектамин; В) Относительный уровень Р-гликопротеина после трансфекции $1РНК Е (Е) и б1РНК Е1 (Ел). За единицу принимали отношение Р-гликопротеин / /?-актин в клетках через сутки после добавления комплекса б ¡РНК / Олигофектамин.

11,2 я 0,8

1 0,6 о.

1 0,4

? 0,2 вц

1 23 4567 8 1 23 4567 8

123 4567 8 Врем*, сутки

2.5 Восстановление чувствительности клеток к сниженной концентрации винбластина

В клинической практике даже двукратное или трехкратное уменьшение устойчивости раковых клеток к действию препарата уже повышает эффективность противораковой терапии. Таким образом, даже временный эффект от применения анти- МИШ б1РНК может оказаться важным для

обращения лекарственной устойчивости при лечении раковых больных. Полученные в работе результаты показывают, что временное подавление экспрессии гена МОЮ обеспечивает накопление химиопрепаратов в клетках в концентрации, необходимой для их гибели. Для выяснения биологической значимости эффектов мы исследовали кинетику снижения количества живых клеток КВ-8-5 при инкубации в присутствии $1РНК и винбластина. Клетки КВ-8-5 инкубировали с з!РНК в концентрации 20 нМ в присутствии винбластина в концентрации 10 нМ, 100 нМ и 300 нМ. Количество живых клеток определяли с интервалом в одни сутки, начиная с первых. Результаты эксперимента (рис. 11) показали, что 2'-0-метилированные з!РНК Еш и Егш вызывают небольшое снижение количества живых клеток через 3 суток после трансфекции в присутствии 300 нМ винбластина, однако выжившие клетки сохраняют способность к делению, и через 5 суток после трансфекции их популяция восстанавливается, и количество живых клеток не отличается от контроля (рис. 11 А).

А)

| 200 5 150

конт рол

100 -50

Б)

В) «г

113451214« 11143

250 200 -150 100 50 О

1114 3 12143

Время, сутки

Е Е1

£ ««0

I 200

| 150 ■ 100 Б 50

1 °

1 21451 214 5 1 21431 2145 1 2145

Время, сутки

Рис. 11. Изменение чувствительности клеток линнн КВ-8-5 к вннбластину после инкубации в присутствии 20 нМ $1РНК, содержащих химические модификации. А), Б) и В) - среда содержала 300, 100 и 10 нМ вр.м.. сут.и винбластина, соответственно.

Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. В качестве контроля использовали клетки, обработанные только Олигофектамином. За 100% принимали количество живых клеток в первые сутки после обработки $1РНК.

1 2 1 4 3 1 1 1 4 3 1 2 1 4 3 1 1 1 4 3 1 1 14 3

При более низких концентрациях винбластина - 100 нМ и 10 нМ - эти 51РНК не вызывали гибели клеток (рис. 11 Б и В). $1РНК Е эффективно восстанавливала чувствительность клеток к винбластину и вызывала их гибель как при высоких (100 и 300 нМ) концентрациях винбластина, так и при концентрации винбластина 10 нМ: доля погибших клеток составляла 70 и 30% при концентрации винбластина 300 и 10 нМ, соответственно, тогда как количество клеток в контроле за это же время удваивалось (рис. 11 А и В, гистограмма Е). На 5 сутки после инкубации клеток с $1РНК Е наблюдалось незначительное увеличение количества живых клеток. Наиболее эффективно

восстанавливала чувствительность клеток к винбластину siPHK Ei: за 4 суток их количество сокращалось на 90, 70 и 60% от исходного при концентрациях винбластина 300, 100 и 10 нМ, соответственно (рис. 11, гистограмма Ei). На 5 сутки после трансфекции количество живых клеток продолжало сокращаться даже при концентрации винбластина 10 нМ.

Полученные в настоящей работе результаты показывают, что временное подавление экспрессии гена MDR1 является достаточным для преодоления синдрома множественной лекарственной устойчивости и обеспечивает накопление химиопрепаратов в клетках в концентрации, необходимой для их гибели (рис. 11). Исследование кинетики снижения количества живых клеток КВ-8-5 при инкубации в присутствии siPHK и винбластина показало, что даже однократная обработка клеток siPHK Ei приводила к гибели клеток в течение 5 суток при минимальной, из использовавшихся концентраций винбластина (10 нМ), несмотря на то, что полного подавления экспрессии гена (рис. 10) достигнуто не было. Таким образом, siPHK Ei эффективно и длительно ингибирует экспрессию гена MDR1 и увеличивает чувствительность раковых клеток человека к винбластину, что делает ее перспективной для испытания in vivo. Исследования показали, что эффективное биологическое действие siPHK не всегда напрямую коррелирует с ее устойчивостью к действию нуклеаз. Синтезированная нами химически модифицированная siPHK Ei, несмотря на относительно низкую устойчивостью к действию нуклеаз, позволяет после однократного введения вызывать длительное (до 5 суток) снижение уровня экспрессии гена MDR1 и эффективное обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости, что позволяет рассматривать ее в качестве основы терапевтических препаратов для комбинированной химиотерапии раковых заболеваний.

выводы

1. Исследовано подавление экспрессии гена МИШ и восстановление

чувствительности раковых клеток человека к цитостатикам с помощью б1РНК, направленных на различные участки мРНК МйЯ1

Показано, что четыре из шести исследованных б1РНК вызывают подавление экспрессии гена МИЮ: при использовании этих з1РНК в концентрации 20 нМ уровень Р-гликопротеина снижается до 28 — 12% по сравнению с контролем, при этом эффективность их действия не коррелирует с эффективностью действия антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на те же участки мРНК. Доказана специфичность ингибирующего действия исследованных б1РНК на экспрессию гена МИШ', их действие не сопровождается активацией генов-маркеров интерферонового ответа РКЕ и ОЛЯ!, а в1РНК I, не гомологичная последовательности мРНК гена МОЮ не влияет на уровень этой мРНК и кодируемого ею белка. Показано, что ингибирование экспрессии гена МИЯ! под действием $1РНК приводит к восстановлению чувствительности клеток к цитостатикам за счет снижения их транспорта из клетки: через 96 ч после добавления $1РНК в концентрации 100 нМ наблюдается гибель 70 % клеток в присутствии ранее переносимой концентрации цитостатика.

2. Исследовано влияние химических модификаций разного типа в составе $1РНК

на ее биологическую активность и устойчивость к действию нуклеаз сыворотки.

Показано, что замена всех рибонуклеотидов в одной или в обеих цепях $1РНК повышает нуклеазоустойчивость, однако снижает ее биологическую активность.

Показано, что в присутствии сыворотки, расщепление б^НК происходит под действием эндонуклеаз, в основном по ирв и СрА сайтам. Введение химических модификаций в б!РНК приводит к изменению не только нуклеазоустойчивости $1РНК, но и характера ее расщепления.

Показано, что защита 3'-концов б1РНК с помощью 3'- 3'-(инвертированной) фосфодиэфирной связи и введение двух 2'-0-метильных звеньев в ее 3'- выступающие концы увеличивает биологическую активность и длительность действия $1РНК, по сравнению с ее немодифицированным аналогом.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Логашенко Е. Б., Черноловская Е. Л., Владимирова А. В., Репкова М. Н., Венъяминова А. Г., Власов В. В. Подавление экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости в опухолевых клетках с помощью короткой двуцепочечной РНК.// Докл. АН. 2002. Т. 386. № 2. С. 274-276.

2. Logashenko Е. В., Vladimirova А. V., Chernolovskaya Е, L., Repkova М. N., Venyaminova A. G., Vlassov V. V. Silencing of MDR 1 gene in cancer cells by si RNA.// Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 2004. V. 23. № 6 & 7. P. 861-866.

3. Логашенко E. Б., Кабилова Т. О., Владимирова А. В., Власов В. В., Черноловская Е. Л. Подавление экспрессии генов с-тус и mdr 1 в линиях опухолевых клеток человека короткими двуцепочечными РНК (siRNA).// Вестник НОЦ. 2004. № 5-6. С. 22-26.

4. Логашенко Е. Б., Владимирова А. В., Зенков А. Н., Репкова М. Н., Венъяминова А. Г., Черноловская Е. Л., Власов В. В. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с помощью малых интерферирующих РНК.// Изв. АН. Серия химическая. 2005. № 5. С. 12601268.

5. Логашенко Е. Б., Владимирова А. В., Волков А. А, Репкова М. Н., Венъяминова А. Г., Зенкова М. А., Черноловская Е. Л., Власов В. В. Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью химически модифицированных аналогов siPHK.// Изв. АН. Серия химическая. 2006. № 7. С. 1227-1235.

6. Логашенко Е. Б., Волков А. А., Черноловская Е. Л., Зенкова М. А., Власов В. В. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости раковых клеток с помощью siPHK.// ВОГиС. 2006. Т. 10. № 2. С. 342-351.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Логашенко, Евгения Борисовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Механизм РНК-интерференции и перспективы применения интерферирующих РНК в биомедицине (обзор литературы).

1.1 Механизм РНК-интерференции.

1.1.1 Фаза инициации.

1.1.1.1 Белок Дайсер.

1.1.1.2 Процессинг дцРНК.

1.1.1.3 Влияние структуры дцРНК на эффективность ее расщепления белком Дайсер.

1.1.2 Эффекторная фаза.

1.1.2.1 Сборка комплекса RLC.

1.1.2.2 Белок Адо2.

1.1.2.3 Сборка комплекса RISC.

1.1.2.4 Расщепление мРНК-мишени.

1.1.3 Особенности протекания РНКи у различных организмов.

1.2 Свойства и структура siPHK.

1.2.1 Нуклеотидный состав siPHK.

1.2.1.1 Влияние мисматчей на эффективность действия siPHK.

1.2.2 Термодинамические параметры дуплекса.

1.2.3 Влияние вторичной структуры мРНК-мишени на активность siPHK.

1.2.4 Влияние длины siPHK на её активность.

1.2.5 Химически модифицированные siPHK.

1.2.5.1 Влияние химических модификаций 3'- и 5'- концов siPHK на ее биологическую активность.

1.2.5.2 Влияние химических модификаций нуклеотидов и фосфатных групп в составе siPHK на ее биологическую активность.

Модификация фосфата.

Модификации рибозы.

Модификации азотистых оснований.

1.2.6 Специфичность действия siPHK.

1.2.6.1 Индукция интерферонового ответа.

1.2.6.2 Действие siPHK на экспрессию частично гомологичных генов.

1.2.6.3 Конкуренция siPHK за компоненты комплекса RISC.

1.3 Использование siPHK in vivo

1.3.1 Локальное применение.

1.3.2 Системное применение.

1.3.2.1 Гидродинамическая доставка.

1.3.2.2 Рецептор- опосредованная доставка.

1.4 Испытание siPHK на мышиных моделях заболеваний человека.

1.4.1 Воспалительные заболевания.

1.4.2 Онкологические заболевания.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК"

На сегодняшний день используется ряд соединений, разрешенных в медицинской практике, способных ингибировать активность Р-др и, таким образом, увеличивать внутриклеточную концентрацию химиопрепаратов и, соответственно, их токсическое действие на Р-др экспрессирующие раковые клетки как in vitro, так и in vivo [4-8]. Эффективность этих соединений тяжело поддается оценке вследствие сильного побочного действия, поэтому разработка эффективной и специфической стратегии для преодоления Р-др-опосредованного фенотипа МЛУ является актуальной проблемой как молекулярной биологии, так и медицины. Одним из возможных путей преодоления МЛУ и повышения эффективности лечения неоплазий могло бы стать избирательное подавление экспрессии гена MDR1 с помощью ген-направленных биологически активных препаратов, адресованных к мРНК гена MDR1, таких как антисмысловые олигонукпеотиды [9] и рибозимы [10], в сочетании с традиционной химиотерапией. Однако, на сегодняшний день существуют лишь немногочисленные примеры успешного подавления экспрессии мРНК, присутствующей в клетках в больших количествах или транскрибируемой с амплифицированных генов, как это происходит в случае MDR1 мРНК [11-13].

В настоящее время наиболее эффективным подходом к подавлению экспрессии генов является технология, основанная на явлении РНК-интерференции (РНКи), которая уже вскоре после открытия [14, 15] стала широко использоваться для этих целей [16, 17]. Суть явления заключается в том, что малые интерферирующие РНК (siPHK), попадая в клетку, вызывают специфическую деградацию мРНК-мишени, последовательность которой комплементарна антисмысловой цепи siPHK [18]. Показано, что siPHK действуют в наномолярных концентрациях и, таким образом, являются наиболее эффективным средством подавления экспрессии генов. siPHK нашли широкое применение в функциональной геномике [19-25], а также испытываются как перспективные терапевтические средства [26-30]. К сожалению, отсутствие четких параметров выбора наиболее эффективных последовательностей siPHK и их невысокая стабильность в биологических жидкостях, клетках и тканях организма является существенным препятствием на пути их терапевтического применения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование процесса подавления экспрессии гена MDR1 и обращение фенотипа МЛУ под действием siPHK. В ходе исследования решались следующие задачи:

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Логашенко, Евгения Борисовна

выводы

1. Исследовано подавление экспрессии гена MDR1 и восстановление чувствительности раковых клеток человека к цитастатикам с помощью siPHK, направленных на различные участки мРНК MDR1

- Показано, что четыре из шести исследованных siPHK вызывают подавление экспрессии гена MDR1: при использовании этих siPHK в концентрации 20 нМ уровень Р-гликопротеина снижается до 28 - 17% по сравнению с контролем, при этом эффективность их действия не коррелирует с эффективностью действия антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на те же участки мРНК.

- Доказана специфичность ингибирующего действия исследованных siPHK на экспрессию гена MDR1: их действие не сопровождается активацией генов-маркеров интерферонового ответа PKR и OAS1, a siPHK I, не гомологичная последовательности мРНК гена MDR1 не влияет на уровень этой мРНК и кодируемого ею белка,

- Показано, что ингибирование экспрессии гена MDR1 под действием siPHK приводит к восстановлению чувствительности клеток к цитостатикам за счет снижения их транспорта из клетки: через 96 ч после добавления siPHK в концентрации 100 нМ наблюдается гибель 70 % клеток в присутствии ранее переносимой концентрации цитостатика.

2. Исследовано влияние химических модификаций разного типа в составе siPHK на ее биологическую активность и устойчивость к действию нуклеаз сыворотки.

- Показано, что замена всех рибонуклеотидов в одной или в обеих цепях siPHK повышает нукпеазоустойчивость, однако снижает ее биологическую активность.

- Показано, что защита З'-концов siPHK с помощью 3'- 3'- (инвертированной) фосфодиэфирной связи и введение двух 2'-0- метильных звеньев в ее 3'-выступающие концы увеличивает биологическую активность и длительность действия siPHK, по сравнению с ее немодифицированным аналогом.

- Показано, что в присутствии сыворотки, расщепление siPHK происходит под действием эндонуклеаз, в основном по UpG и СрА сайтам. Введение химических модификаций в siPHK приводит к изменению не только нуклеазоустойчивости siPHK, но и характера ее расщепления.

1.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ siPHK технология уже стала необходимым инструментом функциональной геномики. С помощью новых подходов геномного скрининга [278, 279] на основе явления РНКи были открыты новые биохимические процессы, а также обнаружены детали уже известных клеточных процессов [280, 281]. Однако РНКи и siPHK представляют интерес не только для фундаментальных исследований, но и имеют большое практическое значение. Скорость и относительная легкость, с которой можно идентифицировать потенциальные терапевтические мишени, используя технологию РНКи, может существенно ускорить разработку новых лекарственных препаратов. Уже продемонстрирована возможность использования грамотно подобранных siPHK в клинической практике при различных болезнях, включая вирусные инфекции, онкологические заболевания и нейродегенеративные расстройства, хотя проблема доставки siPHK в определенные кпетки-мишени в организме еще окончательно не решена.

В заключение можно сказать, что на сегодняшний день технология siPHK является одной из самых перспективных и быстро развивающихся областей в молекулярной биологии. Уже в ближайшем будущем ожидается появление первых лекарственных препаратов для широкого применения в клинике и развитие технологических мощностей для промышленного получения siPHK.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 МАТЕРИАЛЫ

2.1.1 Реактивы, препараты и оборудование

В работе использовали ДНК-полимеразу Taq, ревертазу M-MuLV (ЛБХФ, ИХБФМ СО РАН), Т4-полинуклеотидкиназу ("Fermentas», Литва), акриламид, N,N' -метиленбисакриламид, ТЕМЕД, трис, EDTA, Na2EDTA, DMSO, ацетат натрия, бромфеноловый синий, ксиленцианол, среду IMDM, винбластин, FBS, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин, трипсин, препарат poly(l:C) ("Sigma", США), МТТ, Хекст-33258, родамин-123, антитела мыши к Р-гликопротеину и /3-актину человека, р-кумаровую кислоту, люминол, p-меркаптоэтанол, SDS ("Sigma", США), флуоресцеин, глицерин ("Serva", Германия), Олигофектамин ("Invitrogen", США), у-32Р-АТР с удельной активностью более 1 ПБк/моль ("Биосан», Россия).

В работе использовали амплификатор OMN-E ("Hybaid", США); прибор для полусухого электропереноса ("Hoefer", США); многоканальный спектрофотометр Multiscan RC ("Labsystems", Финляндия); спектрофотометр BioMate 3 ("Thermo", США); флуоресцентный микроскоп Axioskop 2 Plus (увеличение 400х), оснащенный CCD камерой ("ZEISS", Германия); вакуумную сушку для акриламидных гелей ("LABCONCO", США); рН-метр "Orion 41 OA", счетчик радиоактивности; центрифуга "Eppendorf 5415" (Германия). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "РЕНЕКС" (Россия). В работе использовали культуральный пластик фирмы "Costar" (США).

Все растворы готовили с использованием воды, очищенной на установке MilliQ фирмы MilliPore (США).

2.1.2 Линии клеток

В экспериментах были использованы клетки эпидермоидной карциномы человека линии КВ-3-1 (Институт цитологии РАН, Санкт- Петербург) и клетки линии КВ-8-5, обладающие фенотипом множественной лекарственной устойчивости [282, 283], любезно предоставленные профессором М. Gottesman (NIH, США). Клетки линии КВ-3-1 культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную FBS, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного С02 при 37°С. Клетки линии КВ-8-5 культивировали в тех же условиях в присутствии 300 нМ винбластина. За день до трансфекции клетки высаживали в 96-луночный планшет (3000 клеток в 100 мкл среды на лунку) или на покровные стекла в 24-луночный планшет (10000 клеток в 500 мкл среды на лунку).

2.1.3 Олигонуклеотиды

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы в технологической лаборатории ИХБФМ СО РАН с помощью стандартного фосфитамидного метода и выделены с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ.

21-Звенные олигорибонуклеотиды (таблица 5) были синтезированы в группе химии олигорибонуклеотидов (ИХБФМ СО РАН) твердофазным фосфитамидным методом [284] на автоматическом синтезаторе ASM-102U ("Биоссет", Россия) и очищены с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях с последующим обессоливанием на картридже Sep-Pak С18 ("Millipore", США) и осаждением этанолом в присутствии 0.3 М ацетата натрия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Логашенко, Евгения Борисовна, Новосибирск

1. Ambudkar S. V., Dey S., Hrycyna C. A., Ramachandra M., Pastan I., Gottesman M. M. Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter.// Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1999. V.39. № P. 361-398.

2. Scotto К. IN. Transcriptional regulation of ABC drug transporters.// Oncogene. 2003. V.22. №47. P. 7496-7511.

3. Stavrovskaya A. A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells.// Biochemistry (Mosc). 2000. V.65. № 1. P. 95-106.

4. Tan В., Piwnica-Worms D., Ratner L. Multidrug resistance transporters and modulation.// Curr Opin Oncol. 2000. V.12. № 5. P. 450-458.

5. Fu L, Liang Y., Deng L, Ding Y., Chen L, Ye Y., Yang X., Pan Q. Characterization of tetrandrine, a potent inhibitor of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance.// Cancer Chemother Pharmacol. 2004. V.53. № 4. P. 349-356.

6. Chen L. M„ Liang Y. J., Ruan J. W.; Ding Y., Wang X. W., ShiZ., Gu L Q., Yang X. P., Fu L. W. Reversal of Р-gp mediated multidrug resistance in-vitro and in-vivo by FG020318.// J Pharm Pharmacol. 2004. V.56. № 8. P. 1061-1066.

7. Chen L M„ Wu X. P., Ruan J. W., Liang Y. J., Ding Y., Shi Z„ WangX. W., Gu L. Q„ Fu L. IN. Screening novel, potent multidrug-resistant modulators from imidazole derivatives.// Oncol Res. 2004. V.14. № 7-8. P. 355-362.

8. Ramachandran C., Wellham L. L. Effect of MDR1 phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in multidrug-resistant human tumor cell lines and xenografts.// Anticancer Res. 2003. V.23. № 3B. P. 2681-2690.

9. Knecht D. A., Loomis W. F. Antisense RNA inactivation of myosin heavy chain gene expression in Dictyostelium discoideum.// Science. 1987. V.236. № 4805. P. 1081-1086.

10. Vaughn J. P., IglehartJ. D., DemirdjiS., Davis P., BabissL. E., Caruthers M. H., Marks J. R. Antisense DNA downregulation of the ERBB2 oncogene measured by a flow cytometric assay.// Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V.92. № 18. P. 8338-8342.

11. Caplen N. J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.// Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.98. № 17. P. 9742-9747.

12. Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.// Nature. 2001. V.411. № 6836. P. 494-498.

13. Bargmann С. I. High-throughput reverse genetics: RNAi screens in Caenorhabditis elegans.// Genome Biol. 2001. V.2. № 2. P. REVIEWS'!005.

14. Piano F., SchetterA. J., Mangone M., Stein L, Kemphues K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.// Curr Biol. 2000. V.10. № 24. P. 16191622.

15. Caplen N. J. A new approach to the inhibition of gene expression.// Trends Biotechnol. 2002. V.20. №2. P. 49-51.

16. Elbashir S. M., Harborth J., Weber K., Tuschl T. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.// Methods. 2002. V.26. № 2. P. 199-213.

17. Hudson D. P., Morrison C., Ruchaud S., Earnshaw W. C. Reverse genetics of essential genes in tissue-culture cells: 'dead cells talking'.// Trends Cell Biol. 2002. V.12. № 6. P. 281287.

18. Parrish J. Z., Xue D. Functional genomic analysis of apoptotic DNA degradation in C. elegans.//Mol Cell. 2003. V.11. № 4. P. 987-996.

19. Wang X., Khadpe J., Ни В., Iliakis G., Wang Y. An overactivated ATR/CHK1 pathway is responsible for the prolonged G2 accumulation in irradiated AT cells.// J Biol Chem. 2003. V.278. № 33. P. 30869-30874.

20. Carter D. A. Comprehensive strategies to study neuronal function in transgenic animal models.// Biol Psychiatry. 2004. V.55. № 8. P. 785-788.

21. Cheng IN. H., von Kobbe C., Opresko P. L, Arthur L. M., Komatsu K., Seidman M. M., Carney J. P., Bohr V. A. Linkage between Werner syndrome protein and the Mre11 complex via Nbs1.// J Biol Chem. 2004. V.279. № 20. P. 21169-21176.

22. Ge Q., Filip L., Bai A., Nguyen Т., Eisen H. N., Chen J. Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference.// Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. № 23. P. 8676-8681.

23. Tompkins S. M., Lo C. Y., Tumpey Т. M., Epstein S. L. Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo.// Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. № 23. P. 8682-8686.

24. RytherR. C., FlyntA. S„ Phillips J. A., 3rd, Patton J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs.// GeneTher. 2005. V.12. № 1. P. 5-11.

25. Uprichard S. L, Boyd В., Althage A., Chlsari F. V. Clearance of hepatitis В virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs.// Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V.102. № 3. P. 773-778.

26. Tong A. W., Zhang Y. A., Nemunaitis J. Small interfering RNA for experimental cancer therapy.// Curr Opin Mol Ther. 2005. V.7. № 2. P. 114-124.

27. Sharp P. A. RNAi and double-strand RNA.// Genes Dev. 1999. V.13. № 2. P. 139-141.

28. Hannon G. J. RNA interference.// Nature. 2002. V.418. № 6894. P. 244-251.

29. Parish S., Fleenor J., Xu S., Mello C., Fire A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.// Mol Cell. 2000. V.6. № 5. P. 1077-1087.

30. Clemens M. J. PKR--a protein kinase regulated by double-stranded RNA.// Int J Biochem Cell Biol. 1997. V.29. № 7. P. 945-949.

31. Stark G. R„ Kerr I. M„ Williams B. R., Silverman R. H„ Schreiber R. D. How cells respond to interferons.//Annu Rev Biochem. 1998. V.67. № P. 227-264.

32. Geiss G., Jin G., Guo J., Bumgarner R., Katze M. G., Sen G. C. A comprehensive view of regulation of gene expression by double-stranded RNA-mediated cell signaling.// J Biol Chem. 2001. V.276. № 32. P. 30178-30182.

33. Aigner A. Gene silencing through RNA interference (RNAi) in vivo: strategies based on the direct application of siRNAs.// J Biotechnol. 2006. V.124. № 1. P. 12-25.

34. Hammond S. M., Bernstein £, Beach D., Hannon G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.// Nature. 2000. V.404. № 6775. P. 293-296.

35. Aravin A. A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder В., Gaasterland Т., Meyer J., Tuschl T. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development.// Dev Cell. 2003. V.5. № 2. P. 337-350.

36. Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M., Hannon G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference.// Nature. 2001. V.409. № 6818. P. 363-366.

37. Billy £, Brondani V., Zhang H., Muller U., Filipowicz W. Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines.// Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.98. № 25. P. 14428-14433.

38. Meister G., Landthaler M., Patkaniowska A., Dorsett Y., Teng G., Tuschl T. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs.// Mol Cell. 2004. V.15. № 2. P. 185-197.

39. Collins R. E„ Cheng X. Structural domains in RNAi.// FEBS Lett. 2005. V.579. № 26. P. 5841-5849.

40. Liu J., Carmell M. A., Rivas F. V., Marsden C. G., Thomson J. M., Song J. J., Hammond S. M., Joshua-Tor L., Hannon G. J. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi.// Science. 2004. V.305. № 5689. P. 1437-1441.

41. Hammond S. M. Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway.// FEBS Lett. 2005. V.579. № 26. P. 5822-5829.

42. Zhang H., Kolb F. A., Jaskiewicz L, Westhof £., Filipowicz W. Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III.//Cell. 2004. V.118. № 1. P. 57-68.

43. Tahbaz N., Kolb F. A., Zhang H., Jaronczyk K., Filipowicz W., Hobman Т. C. Characterization of the interactions between mammalian PAZ PIWI domain proteins and Dicer.// EMBO Rep. 2004. V.5. № 2. P. 189-194.

44. Elbashir S. M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs.// Genes Dev. 2001. V.15. № 2. P. 188-200.

45. Zamore P. D„ Tuschl Т., Sharp P. A., Bartel D. P. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.// Cell. 2000. V.101. № 1. P. 25-33.

46. Nykarten A., Haley В., Zamore P. D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.// Cell. 2001. V.107. № 3. P. 309-321.

47. Ketting R. F., Fischer S. E., Bernstein E., Sijen Т., Hannon G. J., Piasterk R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans.//Genes Dev. 2001. V.15. № 20. P. 2654-2659.

48. Hutvagner G., Zamore P. D. RNAi: nature abhors a double-strand.// Curr Opin Genet Dev. 2002. V.12. № 2. P. 225-232.

49. Zhang H., Kolb F. A., Brondani V., Billy E., Filipowicz W. Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP.// Embo J. 2002. V.21. № 21. P. 5875-5885.

50. Provost P., Dishart D., Doucet J., Frendewey D., Samuelsson В., Radmark O. Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer.// Embo J. 2002. V.21. №21. P. 5864-5874.

51. Myers J. W., Jones J. Т., Meyer Т., Ferrell J. E, Jr. Recombinant Dicer efficiently converts large dsRNAs into siRNAs suitable for gene silencing.// Nat Biotechnol. 2003. V.21. № 3. P. 324-328.

52. Morse D. P., Aruscavage P. J., Bass B. L. RNA hairpins in noncoding regions of human brain and Caenorhabditis elegans mRNA are edited by adenosine deaminases that act on RNA.// Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V.99. № 12. P. 7906-7911.

53. Vermeulen A., Behlen L, Reynolds A., Wolf son A., Marshall W. S., KarpilowJ., Khvorova A. The contributions of dsRNA structure to Dicer specificity and efficiency.// Rna. 2005. V. 11. № 5. P. 674-682.

54. Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W. S., Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference.// Nat Biotechnol. 2004. V.22. № 3. P. 326-330.

55. Hammond S. M., Boettcher S„ Caudy A. A., Kobayashi R., Hannon G. J. Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi.// Science. 2001. V.293. № 5532. P. 1146-1150.

56. Martinez J., Tuschl T. RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease.// Genes Dev. 2004. V.18. № 9. P. 975-980.

57. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi.// Cell. 2002. V.110. № 5. P. 563-574.

58. Pham J. W„ Pellino J. L, Lee Y. S., Carthew R. I<V„ Sontheimer E. J. A Dicers-dependent 80s complex cleaves targeted mRNAs during RNAi in Drosophila.// Cell. 2004. V.117. № 1. P. 83-94.

59. Tomari Y., Du Т., Haley В., Schwarz D. S„ Bennett R., Cook H. A., Koppetsch B. S„ Theurkauf W. E., Zamore P. D. RISC assembly defects in the Drosophila RNAi mutant armitage.//Cell. 2004. V.116. № 6. P. 831-841.

60. Schwarz D. S., Hutvagner G., Haley В., Zamore P. D. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways.// Mol Cell. 2002. V.10. № 3. P. 537-548.

61. Liu Q., Rand T. A., Kaiidas S., Du F., Kim H. E., Smith D. P., Wang X. R2D2, a bridge between the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi pathway.// Science. 2003. V.301. № 5641. P. 1921-1925.

62. Tabara H., Yigit £., Siomi H., Meiio С. C. The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans.// Cell. 2002. V.109. № 7. P. 861-871.

63. Lee Y. S„ Nakahara K, Pham J. W., Kim K, He Z„ Sontheimer E. J., Carthew R. W. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.// Cell. 2004. V.117. № 1. P. 69-81.

64. Okamura K, ishizuka A., Siomi H., Siomi M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways.// Genes Dev. 2004. V.18. № 14. P. 1655-1666.

65. Rand T. A., Petersen S., Du F., Wang X. Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation.// Cell. 2005. V.123. № 4. P. 621-629.

66. Rand T. A., Ginaiski K., Grishin N. V., Wang X. Biochemical identification of Argonaute 2 as the sole protein required for RNA-induced silencing complex activity.// Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. № 40. P. 14385-14389.

67. Caudy A. A., Myers M., Hannon G. J., Hammond S. M. Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery.// Genes Dev. 2002. V.16. № 19. P. 24912496.

68. Caudy A. A., Ketting R. F„ Hammond S. M„ Denii A. M., Bathoorn A. M„ Tops В. В., Siiva J. M., Myers M. M., Hannon G. J., Plasterk R. H. A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes.// Nature. 2003. V.425. № 6956. P. 411-414.

69. Chendrimada T. P., Gregory R. I., Kumaraswamy E., Norman J., Cooch N., Nishikura K„ Shiekhattar R. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing.// Nature. 2005. V.436. № 7051. P. 740-744.

70. Tomari Y., Matranga C., Haley В., Martinez N., Zamore P. D. A protein sensor for siRNA asymmetry.// Science. 2004. V.306. № 5700. P. 1377-1380.

71. Ma J. В., Ye K, Patei D. J. Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain.// Nature. 2004. V.429. № 6989. P. 318-322.

72. Lingei A., Simon В., izaurraide E., Sattier M. Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain.// Nature. 2003. V.426. № 6965. P. 465-469.

73. Piiiai R. S., Artus C. G„ Fiiipowicz W. Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis.// Rna. 2004. V.10. № 10. P. 15181525.

74. Lund E, Guttinger S., Caiado A., Dahiberg J. E, Kutay U. Nuclear export of microRNA precursors.// Science. 2004. V.303. № 5654. P. 95-98.

75. Parker J. S., Roe S. M., Barford D. Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity.// Embo J. 2004. V.23. № 24. P. 47274737.

76. Parker J. S., Roe S. M., Barford D. Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex.// Nature. 2005. V.434. № 7033. P. 663-666.

77. Song J. J., Smith S. K., Hannon G. J., Joshua-Tor L. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity.// Science. 2004. V.305. № 5689. P. 1434-1437.

78. Schwarz D. S., Tomari Y., Zamore P. D. The RNA-induced silencing complex is a Mg2+-dependent endonuclease.// Curr Biol. 2004. V.14. № 9. P. 787-791.

79. Ishizuka A, Siomi M. C., Siomi H. A Drosophila fragile X protein interacts with components of RNAi and ribosomal proteins.// Genes Dev. 2002. V.16. № 19. P. 2497-2508.

80. Bartel D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.//Cell. 2004. V.116. №2. P. 281-297.

81. Sontheimer E. J. Assembly and function of RNA silencing complexes.// Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. V.6. №2. P. 127-138.

82. Tomari Y., Zamore P. D. Perspective: machines for RNAi.// Genes Dev. 2005. V.19. № 5. P. 517-529.

83. Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D. P., Zamore P. D. Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes.// Cell. 2005. V.123. №4. P. 607-620.

84. Ma J. В., Yuan Y. R„ MeisterG., Pei Y„ Tuschl Т., Patei D. J. Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein.// Nature. 2005. V.434. № 7033. P. 666-670.

85. Rivas F. V., Tolia N. H., Song J. J., Aragon J. P., Liu J., Hannon G. J., Joshua-Tor L. Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC.11 Nat Struct Mol Biol. 2005. V.12. № 4. P. 340-349.

86. Schwarz D. S., Hutvagner G., Du Т., Xu Z., Aronin N., Zamore P. D. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex.// Ceil. 2003. V.115. № 2. P. 199-208.

87. Lingel A., Simon В., Izaurralde £., Sattler M. Nucleic acid З'-end recognition by the Argonaute2 PAZ domain.// Nat Struct Mol Biol. 2004. V.11. № 6. P. 576-577.

88. Yan K. S., Yan S., Farooq A., Han A., Zeng L, Zhou M. M. Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain.// Nature. 2003. V.426. № 6965. P. 468-474.

89. Hutvagner G., Zamore P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.// Science. 2002. V.297. № 5589. P. 2056-2060.

90. Elbashir S. M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.// Embo J. 2001. V.20. № 23. P. 6877-6888.

91. Haley В., Zamore P. D. Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex.// Nat Struct Mol Biol. 2004. V.11. № 7. P. 599-606.

92. Lipardi C., Wei Q., Paterson В. M. RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs.// Cell. 2001. V.107. № 3. P. 297-307.

93. Sijen Т., FleenorJ., Simmer F., Thijssen K. L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R. H., Fire A. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing.// Cell. 2001. V.107. №4. P. 465-476.

94. Vaistij F. E., Jones L., Bauicombe D. C. Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase.// Plant Cell. 2002. V.14. № 4. P. 857-867.

95. Cogoni C., Macino G. Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase.// Nature. 1999. V.399. № 6732. P. 166169.

96. Daimay Т., Hamilton A., Rudd S., Angeii S., Bauicombe D. C. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus.// Cell. 2000. V.101. № 5. P. 543-553.

97. Smardon A., Spoerke J. M„ Stacey S. C„ Klein M. E., Mackin N„ Maine E. M. EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C. elegans.// Curr Biol. 2000. V.10. № 4. P. 169-178.

98. Martens H., Novotny J., Oberstrass J., Steck T. L, Postlethwait P., Neilen W. RNAi in Dictyostelium: the role of RNA-directed RNA polymerases and double-stranded RNase.// Mol Biol Cell. 2002. V.13. № 2. P. 445-453.

99. Palauqui J. C., Elmayan Т., Pollien J. M., Vaucheret H. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions.// Embo J. 1997. V.16. № 15. P. 4738-4745.

100. Fire A., Xu S„ Montgomery M. K, Kostas S. A., Driver S. E., Mello С. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.// Nature. 1998. V.391. № 6669. P. 806-811.

101. Voinnet O., Vain P., Angeii S., Bauicombe D. C. Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA.// Cell. 1998. V.95. № 2. P. 177-187.

102. Winston W. M., Molodowitch C., Hunter C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.// Science. 2002. V.295. № 5564. P. 2456-2459.

103. Roignant J. Y., Carre C., Mugat В., Szymczak D., Lepesant J. A., Antoniewski C. Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoform-specific RNAi in Drosophila.// Rna. 2003. V.9. № 3. P. 299-308.

104. Timmons L, Fire A. Specific interference by ingested dsRNA.// Nature. 1998. V.395. № 6705. P. 854.

105. Mello С. С., Conte D., Jr. Revealing the world of RNA interference.// Nature. 2004. V.431. № 7006. P. 338-342.

106. Zheng L, Liu J., Bataiov S., Zhou D., Orth A., Ding S., Schuitz P. G. An approach to genomewide screens of expressed small interfering RNAs in mammalian cells.// Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. № 1. P. 135-140.

107. Yang D., Lu H., Erickson J. W. Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila embryos.// Curr Biol. 2000. V.10. № 19. P. 1191-1200.

108. Hoien Т., Amarzguioui M., Wiiger M. Т., Babaie E., Prydz H. Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor.// Nucleic Acids Res. 2002. V.30. № 8. P. 1757-1766.

109. Lee N. S., Dohjima Т., Bauer G., Li H., Li M. J., Ehsani A., Saivaterra P., Rossi J. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.// Nat Biotechnol. 2002. V.20. № 5. P. 500-505.

110. Yu J. V., DeRuiter S. L., Turner D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.// Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V.99. № 9. P. 6047-6052.

111. Brown К. M., Chu C. Y., Rana Т. M. Target accessibility dictates the potency of human RISC.// Nat Struct Mol Biol. 2005. V.12. № 5. P. 469-470.

112. OverhoffM., Aiken M., Far R. K., Lemaitre M., Lebieu В., Sczakiei G., Robbins I. Local RNA target structure influences siRNA efficacy: a systematic global analysis.// J Mol Biol. 2005. V.348. № 4. P. 871-881.

113. Brazas R. M., Hagstrom J. E. Delivery of small interfering RNA to mammalian cells in culture by using cationic lipid/polymer-based transfection reagents.// Methods Enzymol. 2005. V.392. № P. 112-124.

114. Muratovska A., Eccles M. R. Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells.// FEBS Lett. 2004. V.558. № 1-3. P. 63-68.

115. Dykxhoorn D. M., Novina C. D., Sharp P. A. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression.// Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. V.4. № 6. P. 457-467.

116. Dykxhoorn D. M., Lieberman J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.//Annu Rev Med. 2005. V.56. № P. 401-423.

117. Novina C. D., Murray M. F„ Dykxhoorn D. M., Beresford P. J., Riess J., Lee S. K., Collman R. G., Lieberman J., Shankar P., Sharp P. A. siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection.// Nat Med. 2002. V.8. № 7. P. 681-686.

118. Kumar R., Conklin D. S„ Mittal I/. High-throughput selection of effective RNAi probes for gene silencing.// Genome Res. 2003. V.13. № 10. P. 2333-2340.

119. RitterU., Damm-Welk C., Fuchs U., Bohle R. M., BorkhardtA., Woessmann W. Design and evaluation of chemically synthesized siRNA targeting the NPM-ALK fusion site in anaplastic large cell lymphoma (ALCL).// Oligonucleotides. 2003. V.13. № 5. P. 365-373.

120. Amarzguioui M., Prydz H. An algorithm for selection of functional siRNA sequences.// Biochem Biophys Res Commun. 2004. V.316. № 4. P. 1050-1058.

121. Chalk A. M., Wahlestedt C., Sonnhammer E. L. Improved and automated prediction of effective siRNA.// Biochem Biophys Res Commun. 2004. V.319. № 1. P. 264-274.

122. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi Т., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R., Saigo K. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № 3. P. 936-948.

123. Leung R. K., Whittaker P. A. RNA interference: from gene silencing to gene-specific therapeutics.// Pharmacol Ther. 2005. V.107. № 2. P. 222-239.

124. Jacque J. M., Triques K., Stevenson M. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference.// Nature. 2002. V.418. № 6896. P. 435-438.

125. Czauderna F., Fechtner M., Dames S., Aygun H., Klippel A., Pronk G. J., Giese K., Kaufmann J. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells.// Nucleic Acids Res. 2003. V.31. № 11. P. 2705-2716.

126. Pusch O., Boden D., Silbermann R., Lee F., Tucker L, Ramratnam B. Nucleotide sequence homology requirements of HIV-1-specific short hairpin RNA.// Nucleic Acids Res. 2003. V.31. № 22. P. 6444-6449.

127. Vickers T. A., Koo S„ Bennett C. F., Crooke S. Т., Dean N. M., Baker B. F. Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. A comparative analysis.// J Biol Chem. 2003. V.278. № 9. P. 7108-7118.

128. Saxena S., Jonsson Z. O., Dutta A. Small RNAs with imperfect match to endogenous mRNA repress translation. Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells.// J Biol Chem. 2003. V.278. № 45. P. 44312-44319.

129. Amarzguioui M., Ho/en Т., Babaie £., Prydz H. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA.// Nucleic Acids Res. 2003. V.31. № 2. P. 589-595.

130. Gitlin L, Karelsky S., Andino R. Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells.// Nature. 2002. V.418. № 6896. P. 430-434.

131. Das А. Т., Brummelkamp T. R., Westerhout E. M., Vink M., Madiredjo M„ Bernards R., Berkhout B. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition.// J Virol. 2004. V.78. № 5. P. 2601-2605.

132. Boden D., Pusch 0., Lee F., Tucker L, Ramratnam B. Human immunodeficiency virus type 1 escape from RNA interference.//J Viroi. 2003. V.77. №21. P. 11531-11535.

133. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S. D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias.// Cell. 2003. V.115. № 2. P. 209-216.

134. Grunweller A., Hartmann R. K. RNA interference as a gene-specific approach for molecular medicine.// Curr Med Chem. 2005. V.12. № 26. P. 3143-3161.

135. Tang G., Reinhart B. J., Bartel D. P., Zamore P. D. A biochemical framework for RNA silencing in plants.// Genes Dev. 2003. V.17. № 1. P. 49-63.

136. Heale B. S., Soifer H. S., Bowers C., Rossi J. J. siRNA target site secondary structure predictions using local stable substructures.// Nucleic Acids Res. 2005. V.33. № 3. P. e30.

137. Ding Y„ Chan C. Y., Lawrence С. E. Sfold web server for statistical folding and rational design of nucleic acids.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № Web Server issue. P. W135-141.

138. Ding Y., Lawrence С. E. Statistical prediction of single-stranded regions in RNA secondary structure and application to predicting effective antisense target sites and beyond.// Nucleic Acids Res. 2001. V.29. № 5. P. 1034-1046.

139. Schubert S., Grunweller A., Erdmann V. A., Kurreck J. Local RNA target structure influences siRNA efficacy: systematic analysis of intentionally designed binding regions.// J Mol Biol. 2005. V.348. № 4. P. 883-893.

140. Siolas D., Lerner C., Burchard J., Ge W., Linsley P. S., Paddison P. J., Hannon G. J., deary M. A. Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers.// Nat Biotechnol. 2005. V.23. № 2. P. 227-231.

141. Kim D. H., Behike M. A., Rose S. D., Chang M. S„ Choi S., Rossi J. J. Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy.// Nat Biotechnol. 2005. V.23. № 2. P. 222-226.

142. Bertrand J. R., Pottier M., Vekris A., Opolon P., Maksimenko A., Malvy C. Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo.// Biochem Biophys Res Commun. 2002. V.296. № 4. P. 1000-1004.

143. Layzer J. M„ McCaffrey A. P., Tanner A. K, Huang Z., Kay M. A,, Sullenger B. A. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.// Rna. 2004. V.10. № 5. P. 766-771.

144. Chiu Y. L, Rana Т. M. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis.// RNA. 2003. V.9. № 9. P. 1034-1048.

145. Braasch D. A., Jensen S., Liu Y., Kaur K., Arar K., White M. A., Corey D. R. RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA.// Biochemistry. 2003. V.42. № 26. P. 7967-7975.

146. KurreckJ. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications.// Eur J Biochem. 2003. V.270. № 8. P. 1628-1644.

147. Dorsett Y., Tuschl T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics.// Nat Rev Drug Discov. 2004. V.3. № 4. P. 318-329.

148. Lorenz C., Hadwiger P., John M., Vornlocher H. P., Unverzagt C. Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells.// Bioorg Med Chem Lett. 2004. V.14. № 19. P. 4975-4977.

149. Hall A. H., Wan J., Shaughnessy E. E., Ramsay Shaw В., Alexander K. A. RNA interference using boranophosphate siRNAs: structure-activity relationships.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № 20. P. 5991-6000.

150. Chiu Y. L, Rana Т. M. RNAi in human cells: basic structural and functional features of small interfering RNA.// Mol Cell. 2002. V.10. № 3. P. 549-561.

151. Manoharan M. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs.// Curr Opin Chem Biol. 2004. V.8. № 6. P. 570-579.

152. Chiu Y. L, Ali A., Chu C. Y., Cao H., Rana Т. M. Visualizing a correlation between siRNA localization, cellular uptake, and RNAi in living cells.// Chem Biol. 2004. V.11. № 8. P. 1165-1175.

153. Urban-Klein В., Werth S., Abuharbeid S., Czubayko P., AignerA. RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo.// Gene Ther. 2005. V.12. № 5. P. 461-466.

154. Eckstein F. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: what is their origin and what is unique about them?//Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000. V.10. № 2. P. 117-121.

155. Eckstein F. Developments in RNA chemistry, a personal view.// Biochimie. 2002. V.84. № 9. P. 841-848.

156. Geary R. S., Yu R. Z, Levin A. A. Pharmacokinetics of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides.// Curr Opin Investig Drugs. 2001. V.2. № 4. P. 562-573.

157. Krieg A. M., Stein C. A. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: antisense or anti-protein?// Antisense Res Dev. 1995. V.5. № 4. P. 241.

158. Hall A. H., Wan J., Spesock A., Sergueeva Z, Shaw B. R., Alexander K. A. High potency silencing by single-stranded boranophosphate siRNA.// Nucleic Acids Res. 2006. V.34. №9. P. 2773-2781.

159. Shaw B. R., Sergueev D., He K., Porter K., Summers J., Sergueeva Z, Rait V. Boranophosphate backbone: a mimic of phosphodiesters, phosphorothioates, and methyl phosphonates.// Methods Enzymol. 2000. V.313. № P. 226-257.

160. Findlay D., Herries D. G., Mathias A. P., Rabin B. R., Ross C. A. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease.// Nature. 1961. V.190. № P, 781784.

161. Henschel A., Buchholz P., Habermann B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № Web Server issue. P. W113-120.

162. Capodici J., Kariko K., Weissman D. Inhibition of HIV-1 infection by small interfering RNA-mediated RNA interference.// J Immunol. 2002. V. 169. № 9. P. 5196-5201. .

163. Manoharan M. 2'-carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation.// Biochim Biophys Acta. 1999. V.1489. № 1. P. 117-130.

164. Hoshika S., Minakawa N., Matsuda A. Synthesis and physical and physiological properties of 4'-thioRNA: application to post-modification of RNA aptamer toward NF-kappaB.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № 13. P. 3815-3825.

165. Hoshika S., Minakawa N., Kamiya H., Harashima H., Matsuda A. RNA interference induced by siRNAs modified with 4'-thioribonucleosides in cultured mammalian cells.// FEBS Lett. 2005. V.579. № 14. P. 3115-3118.

166. Hoshika S., Minakawa N., Kamiya H., Harashima H., Matsuda A. RNA interference in mammalian cells by modified siRNA with 4-thioRNA.// IS3NA XVI International Roundtable, Minneapolis, MN. 2004. № P.

167. Jackson A. L, Linsley P. S. Noise amidst the silence: off-target effects of siRNAs?// Trends Genet. 2004. V.20. № 11. P. 521-524.

168. Brummelkamp T. R., Bernards R., Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.// Cancer Cell. 2002. V.2. № 3. P. 243-247.

169. Ding H., Schwarz D. S., Keene A., Affar el В., Fenton L, Xia X., Shi Y„ Zamore P. D., Xu Z. Selective silencing by RNAi of a dominant allele that causes amyotrophic lateral sclerosis.// Aging Cell. 2003. V.2. № 4. P. 209-217.

170. Miller V. M., Gouvion С. M., Davidson B. L, Paulson H. L. Targeting Alzheimer's disease genes with RNA interference: an efficient strategy for silencing mutant alleles.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № 2. P. 661-668.

171. Snove O., Jr., Holen T. Many commonly used siRNAs risk off-target activity.// Biochem Biophys Res Commun. 2004. V.319. № 1. P. 256-263.

172. ChiJ. Т., Chang H. Y., Wang N. N., Chang D. S„ Dunphy N„ Brown P. O. Genomewide view of gene silencing by small interfering RNAs.// Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V.100. № 11. P. 6343-6346.i.

173. Semizarov D., Kroeger P., Fesik S. siRNA-mediated gene silencing: a global genome view.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № 13. P. 3836-3845.

174. Jackson A. L, Bartz S. R„ Schelter J., Kobayashi S. V., Burchard J., Mao M„ Li В., Cavet G., Linsley P. S. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.// Nat Biotechnol. 2003. V.21. № 6. P. 635-637.

175. Persengiev S. P., Zhu X., Green M. R. Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs).// Rna. 2004. V.10. № 1. P. 12-18.

176. Sledz C. A., Holko M., de Veer M. J., Silverman R. H., Williams B. R. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.// Nat Cell Biol. 2003. V.5. № 9. P. 834-839.

177. Bridge A. J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A. L, Iggo R. Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.// Nat Genet. 2003. V.34. № 3. P. 263-264.

178. Kariko K., Bhuyan P., Capodici J., Ni H., Lubinski J., Friedman H., Weissman D. Exogenous siRNA mediates sequence-independent gene suppression by signaling through toll-like receptor 3.// Cells Tissues Organs. 2004. V.177. № 3. P. 132-138.

179. Hornung V., Guenthner-Biller M., Bourquin C., Ablasser A., Schlee M., Uematsu S.,

180. Noronha A., Manoharan M., Akira S., de Fougerolles A., Endres S., Hartmann G. Sequencespecific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7.// Nat Med. 2005. V.11. № 3. P. 263-270.

181. Sioud M. Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single-stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization.// J Mol Biol. 2005. V.348. № 5. P. 1079-1090.

182. Judge A. D., Sood V., Shaw J. R., Fang D., McClintock K, MacLachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA,// Nat Biotechnol. 2005. V.23. № 4. P. 457-462.

183. Heidel J. D., Ни S., Liu X. F., Triche T. J., Davis M. E. Lack of interferon response in animals to naked siRNAs.// Nat Biotechnol. 2004. V.22. № 12. P. 1579-1582.

184. Stojdi D. F„ Lichty В., Knowles S., Marius R., Atkins H„ Sonenberg N., Bell J. C. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus.// Nat Med. 2000. V.6. № 7. P. 821-825.

185. Marques J. Т., Williams B. R. Activation of the mammalian immune system by siRNAs.// Nat Biotechnol. 2005. V.23. № 11. P. 1399-1405.

186. Fedorov Y., King A., Anderson £., Karpilow J., Ilsley D., Marshall W., Khvorova A. Different delivery methods-different expression profiles.// Nat Methods. 2005. V.2. № 4. P. 241.

187. Judge A. D., Boia G., Lee A. C., MacLachlan I. Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo.// Mol Ther. 2006. V.13. № 3. P. 494-505.

188. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA.// Nat Med. 2005. V. 11. № 1. P. 50-55.

189. Lu S., Cullen B. R. Adenovirus VA1 noncoding RNA can inhibit small interfering RNA and MicroRNA biogenesis.// J Virol. 2004. V.78. № 23. P. 12868-12876.

190. Dykxhoorn D. M., Lieberman J. Running Interference: Prospects and Obstacles to Using Small Interfering RNAs as Small Molecule Drugs.//Annu Rev Biomed Eng. 2006. № P.

191. Pailiser D„ Chowdhury D., Wang Q. Y., Lee S. J., Bronson R. Т., Knipe D. M„ Lieberman J. An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection.// Nature. 2006. V.439. № 7072. P. 89-94.

192. Li B. J., Tang Q., Cheng D„ Qin C., Xie F. Y., Wei Q„ Xu J., Liu Y„ Zheng B. J„ Woodle M. C., Zhong N., Lu P. Y. Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque.// Nat Med. 2005. V.11. № 9. P. 944-951.

193. Reich S. J., Fosnot J., Kuroki A., Tang W., Yang X., Maguire A. M., Bennett J., Tolentino M. J. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model.// Mol Vis. 2003. V.9. № P. 210-216.

194. Liu F., Song Y., Liu D, Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.// Gene Ther. 1999. V.6. № 7. P. 1258-1266.

195. Zhang G., Budker V., Wolff J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.// Hum Gene Ther. 1999. V.10. № 10. P. 1735-1737.

196. Crespo A., Peydro A., Dasi F., Benet M., Calvete J. J., Revert F., Alino S. F. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.// Gene Ther. 2005. V.12. № 11. P. 927-935.

197. Merl S., Michaelis C., Jaschke В., Vorpahl M., Seidl S., Wessely R. Targeting 2A protease by RNA interference attenuates coxsackieviral cytopathogenicity and promotes survival in highly susceptible mice.// Circulation. 2005. V.111. № 13. P. 1583-1592.

198. Hamar P., Song E., Kokeny G., Chen A., Ouyang N., Lieberman J. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.// Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. № 41. P. 14883-14888.

199. Wadia J. S., Dowdy S. F. Protein transduction technology.// Curr Opin Biotechnol. 2002. V.13. № 1. P. 52-56.

200. Truant R., Cullen B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.// Mol Cell Biol. 1999. V.19. №2. P. 1210-1217.

201. Simeoni F., Morris M. C., Heitz P., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells.// Nucleic Acids Res. 2003. V.31. № 11. P. 2717-2724.

202. Simeoni F., Morris M. C., Heitz F., Divita G. Peptide-based strategy for siRNA delivery into mammalian cells.// Methods Mol Biol. 2005. V.309. № P. 251-260.

203. RittnerK., Benavente A., Bompard-Sorlet A., Heitz F., Divita G., Brasseur R., Jacobs E. New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo.// Mol Ther. 2002. V.5. № 2. P. 104-114.

204. Dorn G., Patel S., Wotherspoon G., Hemmings-Mieszczak M., Barclay J., Natt F. J., Martin P., Bevan S., Fox A., Ganju P., Wishart W., Hall J. siRNA relieves chronic neuropathic pain.// Nucleic Acids Res. 2004. V.32. № 5. P. e49. . .

205. Nakamura H., Siddiqui S. S., Shen X., Malik А. В., Pulido J. S„ Kumar N. M„ Yue B. Y. RNA interference targeting transforming growth factor-beta type II receptor suppresses ocular inflammation and fibrosis.//Mol Vis. 2004. V.10. № P. 703-711.

206. Schiffelers R. M„ Xu JStorm G„ Woodle M. C„ Scaria P. \J. Effects of treatment with small interfering RNA on joint inflammation in mice with collagen-induced arthritis.// Arthritis Rheum. 2005. V.52. № 4. P. 1314-1318.

207. Sorensen D. R., Leirdal M., Sioud M. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice.// J Mol Biol. 2003. V.327. № 4. P. 761-766.

208. Song E., Lee S. K, Wang J., Ince N., Ouyang N., Min J., Chen J., Shankar P., Lieberman J. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis.// Nat Med. 2003. V.9. № 3. P. 347-351.

209. Contreras J. L., Vilatoba M., Eckstein C., Bilbao G., Anthony Thompson J., Eckhoff D. E. Caspase-8 and caspase-3 small interfering RNA decreases ischemia/reperfusion injury to the liver in mice.// Surgery. 2004. V.136. № 2. P. 390-400.

210. Zhang X., Shan P., Jiang D, Noble P. W„ Abraham N. G„ Kappas A., Lee P. J. Small interfering RNA targeting heme oxygenase-1 enhances ischemia-reperfusion-induced lung apoptosis.//J Biol Chem. 2004. V.279. № 11. P. 10677-10684.

211. Makimura H., Mizuno Т. M., Mastaitis J. W., Agami R., Mobbs С. V. Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake.// BMC Neurosci. 2002. V.3. № P. 18.

212. Kondo Т., Suda Т., Fukuyama H., Adachi M., Nagata S. Essential roles of the Fas ligand in the development of hepatitis.// Nat Med. 1997. V.3. № 4. P. 409-413.

213. Rust C., Gores G. J. Apoptosis and liver disease.// Am J Med. 2000. V.108. № 7. P. 567-574.

214. Siegel R. M., Fleisher T. A. The role of Fas and related death receptors in autoimmune and other disease states.//J Allergy Clin Immunol. 1999. V.103. № 5 Pt 1. P. 729-738.

215. Yin J. Q., Gao J., Shao R., Tian W. N., Wang J., Wan Y. siRNA agents inhibit oncogene expression and attenuate human tumor cell growth.// J Exp Ther Oncol. 2003. V.3. № 4. P. 194-204.

216. Futami Т., Miyagishi M., Seki M., Taira К. Induction of apoptosis in HeLa cells with siRNA expression vector targeted against bcl-2.// Nucleic Acids Res Suppl. 2002. № 2. P. 251-252.

217. Duxbury M. S„ Ito H., Benoit E., Zinner M. J., Ashley S. W., Whang E. E. RNA interfere nee targeting focal adhesion kinase enhances pancreatic adenocarcinoma gemcitabine chemosensitivity.// Biochem Biophys Res Commun. 2003. V.311. № 3. P. 786792.

218. Sanceau J., Truchet S., Bauvois B. Matrix metalloproteinase-9 silencing by RNA interference triggers the migratory-adhesive switch in Ewing's sarcoma cells.// J Biol Chem. 2003. V.278. № 38. P. 36537-36546.

219. Zhang L, Yang N., Mohamed-Hadley A., Rubin S. C., Coukos G. Vector-based RNAi, a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer.11 Biochem Biophys Res Commun. 2003. V.303. № 4. P. 1169-1178.

220. Nieth C., PriebschA., Stege A., Lage H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi).// FEBS Lett. 2003. V.545. № 2-3. P. 144-150.

221. Lois C., Refaeli Y., Qin X. F., Van Parijs L. Retroviruses as tools to study the immune system.// Curr Opin Immunol. 2001. V. 13. № 4. P. 496-504.

222. Spankuch-Schmitt В., Bereiter-Hahn J., Kaufmann M., Strebhardt K. Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1 (PLK1) on apoptosis and spindle formation in human cancer cells.// J Natl Cancer Inst. 2002. V.94. № 24. P. 1863-1877.

223. Konnikova L, Kotecki M., Kruger M. M., Cochran В. H. Knockdown of STAT3 expression by RNAi induces apoptosis in astrocytoma cells.// BMC Cancer. 2003. V.3. № P. 23.

224. Nagy P., Arndt-Jovin D. J., Jovin Т. M. Small interfering RNAs suppress the expression of endogenous and GFP-fused epidermal growth factor receptor (erbB1) and induce apoptosis in erbB1-overexpressing cells.// Exp Cell Res. 2003. V.285. № 1. P. 39-49.

225. Zhang M., Zhang X., Bai С. X., Chen J., Wei M. Q. Inhibition of epidermal growth factor receptor expression by RNA interference in A549 cells.// Acta Pharmacol Sin. 2004. V.25. № 1. P. 61-67.

226. Butz K., Ristriani Т., Hengstermann A., Denk C., Scheffner M., Hoppe-Seyler F. siRNA targeting of the viral E6 oncogene efficiently kills human papillomavirus-positive cancer cells.// Oncogene. 2003. V.22. № 38. P. 5938-5945.

227. Wohlbold L, van der Kuip H„ Miething C., Vornlocher H. P., Knabbe C., Duyster J., Aulitzky IN. E. Inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA sensitizes for imatinib mesylate (STI571).// Blood. 2003. V.102. № 6. P. 2236-2239.

228. Wilda M,, Fuchs U., Wossmann W., Borkhardt A. Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference (RNAi).// Oncogene. 2002. V.21. № 37. P. 57165724.

229. Kosciolek B. A,, Kalantidis K., TablerM., Rowley P. T. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference.// Mol Cancer Ther. 2003. V.2. № 3. P. 209-216.

230. Fuchs U., Damm-Welk C, Borkhardt A. Silencing of disease-related genes by small interfering RNAs.// Curr Mol Med. 2004. V.4. № 5. P. 507-517.

231. Yang G., Thompson J. A., Fang В., Liu J. Silencing of H-ras gene expression by retrovirus-mediated siRNA decreases transformation efficiency and tumorgrowth in a model of human ovarian cancer.// Oncogene. 2003. V.22. № 36. P. 5694-5701.

232. Cioca D. P., Aoki Y., Kiyosawa K. RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines.// Cancer Gene Ther. 2003. V.10. №2. P. 125-133.

233. Zangemeister-Wittke U. Antisense to apoptosis inhibitors facilitates chemotherapy and TRAIL-induced death signaling.// Ann N Y Acad Sci. 2003. V.1002. № P. 90-94.

234. Collis S. J., Swartz M. J., Nelson IN. G., DeWeese T. L. Enhanced radiation and chemotherapy-mediated cell killing of human cancer cells by small inhibitory RNA silencing of DNA repair factors.// Cancer Res. 2003. V.63. № 7. P. 1550-1554.

235. Tsuruo Т., Naito M., TomidaA., Fujita N., Mashima Т., Sakamoto H., Haga N. Molecular targeting therapy of cancer: drug resistance, apoptosis and survival signal.// Cancer Sci. 2003. V.94. № 1. P. 15-21.

236. Yague E., Higgins C. F., Raguz S. Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1.// Gene Ther. 2004. V.11. № 14. P. 1170-1174.

237. Wu H., Hait IN. N., Yang J. M. Small interfering RNA-induced suppression of MDR1 (P-glycoprotein) restores sensitivity to multidrug-resistant cancer cells.// Cancer Res. 2003. V.63. № 7. P. 1515-1519.

238. Stierle V., Laigle A., Jolles B. Modulation of MDR1 gene expression in multidrug resistant MCF7 cells by low concentrations of small interfering RNAs.// Biochem Pharmacol. 2005. V.70. № 10. P. 1424-1430.

239. Lapteva N„ Yang A. G„ Sanders D. E„ Strube R. W„ Chen S. Y. CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo.// Cancer Gene Ther. 2005. V.12. № 1. P. 84-89.

240. Liang Z, Yoon Y., Votaw J., Goodman M. M., Williams L, Shim H. Silencing of CXCR4 blocks breast cancer metastasis.// Cancer Res. 2005. V.65. № 3. P. 967-971.

241. Chen Y., Stamatoyannopoulos G., Song C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.// Cancer Res. 2003. V.63. № 16. P. 4801-4804.

242. Brummelkamp T. R., Bernards R. New tools for functional mammalian cancer genetics.// Nat Rev Cancer. 2003. V.3. № 10. P. 781-789.

243. Wheeler D. В., Bailey S. N., Guertin D. A., Carpenter A. E., Higgins С. O., Sabatini D. M. RNAi living-cell microarrays for loss-of-function screens in Drosophila melanogaster cells.// Nat Methods. 2004. V. 1. № 2. P. 127-132.

244. MacKeigan J. P., Murphy L. O., Blenis J. Sensitized RNAi screen of human kinases and phosphatases identifies new regulators of apoptosis and chemoresistance,// Nat Cell Biol. 2005. V.7. №6. P. 591-600.

245. Willingham А. Т., Deveraux Q. L, Hampton G. M., Aza-Blanc P. RNAi and HTS: exploring cancer by systematic loss-of-function.// Oncogene. 2004. V.23. № 51. P. 83928400.

246. Fojo А. Т., Ueda K, Slamon D. J., Poplack D. G., Gottesman M. M., Pastan I. Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues.// Proc Natl Acad Sci USA. 1987. V.84. № 1. P. 265-269.

247. Fojo А. Т., Whang-Peng J., Gottesman M. M., Pastan I. Amplification of DNA sequences in human multidrug-resistant KB carcinoma cells.// Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V.82, № 22. P. 7661-7665.

248. Damha M. J., Ogilvie К. K. Oligoribonucleotide synthesis. The silyl-phosphoramidite method.// Methods Mol Biol. 1993. V.20. № P. 81-114.

249. Silberklang M., Prochiantz A., Haenni A. L., Rajbhandary U. L. Studies on the sequence of the З'-terminal region of turnip-yellow-mosaic-virus RNA.// Eur J Biochem. 1977. V.72. № 3. P. 465-478.

250. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.// Nucleic Acids Res. 1996. V.24. № 22. P. 4535-4542.

251. Власов А. В., Власов В. В., Жьеже Р. Катализируемый имидазолом гидролиз РНК как реакция для исследования вторичной структуры РНК и комплексов РНК с олигонуклеотидами.//Докл. Акад. Наук. 1996. № 349. Р. 411-413.

252. Donis-Keller Н., Махат А. М., Gilbert IN. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA.// Nucleic Acids Res. 1977. V.4. № 8. P. 2527-2538.

253. Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissues.// Biotechniques. 1993. V.15. № 1. P. 24-26.

254. Laemmli U. К Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. 1970. V.227. № 5259. P. 680-685.

255. Demeterco С., Itkin-Ansari P., Tyrberg В., Ford L. P., Jarvis R, A., Levine F. c-Myc controls proliferation versus differentiation in human pancreatic endocrine cells.// J Clin Endocrinol Metab. 2002. V.87. № 7. P. 3475-3485.

256. Harborth J., Elbashir S. M., Bechert K., Tuschl Т., Weber K. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs.// J Cell Sci. 2001. V.114. № Pt 24. P. 4557-4565.

257. Callen D. F., Baker E., Simmers R. N., Seshadri R., Roninson I. B. Localization of the human multiple drug resistance gene, MDR1, to 7q21.1.// Hum Genet. 1987. V.77. № 2. P. 142-144.

258. Chaudhary P. M., Roninson I. B. Activation of MDR1 (P-glycoprotein) gene expression in human cells by protein kinase С agonists.// Oncol Res. 1992. V.4. № 7. P. 281-290.

259. Chaudhary P. M., Roninson I. B. Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs.// J Natl Cancer Inst. 1993. V.85. № 8. P. 632-639.

260. Cohen D., Yang C. P., Horwitz S. B. The products of the mdrla and mdrlb genes from multidrug resistant murine cells have similar degradation rates.// Life Sci. 1990. V.46. № 7. P. 489-495.

261. Richert N. D., Aidwin L, Nitecki D., Gottesman M. M., Pastan I. Stability and covalent modification of P-glycoprotein in multidrug-resistant KB cells.// Biochemistry. 1988. V.27. № 20. P. 7607-7613.

262. Muller C., Laurent G., Ling V. P-glycoprotein stability is affected by serum deprivation and high cell density in multidrug-resistant cells.// J Cell Physiol. 1995. V.163. № 3. P. 538544.

263. Carmichael J., DeGraffW. G„ Gazdar A. F., Minna J. D.> Mitchell J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.// Cancer Res. 1987. V.47. № 4. P. 936-942.

264. Krishan A., Fitz С. M., Andritsch I. Drug retention, efflux, and resistance in tumor cells.// Cytometry. 1997. V.29. № 4. P. 279-285.

265. Bioch W. A biochemical perspective of the polymerase chain reaction.// Biochemistry. 1991. V.30. № 11. P. 2735-2747.

266. Siebert P. D„ Larrick J. W. Competitive PCR.// Nature. 1992. V.359. № 6395. P. 557558.

267. Kretschmer-Kazemi Far R., Sczakie! G. The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: a comparison with antisense oligonucleotides.// Nucleic Acids Res. 2003. V.31. № 15. P. 4417-4424.

268. Vickers T. A., Wyatt J. R., Freier S. M. Effects of RNA secondary structure on cellular antisense activity.// Nucleic Acids Res. 2000. V.28. № 6. P. 1340-1347.

269. Christians U., Spiekermann K, BaderA., Schottmann R., Linck A., Wonigeit K., Sewing K. P., Link H. Cyclosporine metabolite pattern in blood from patients with acute GVHD after BMT.// Bone Marrow Transplant. 1993. V.12. № 1. P. 27-33.

270. Holm P. S., Dietei M., Krupp G. Similar cleavage efficiencies of an oligoribonucleotide substrate and an mdrl mRNA segment by a hammerhead ribozyme.ll Gene. 1995. V.167. № 1-2. P. 221-225.

271. Holm P. S,, Scanlon K. J., Dietei M. Reversion of multidrug resistance in the P-glycoprotein-positive human pancreatic cell line (EPP85-181RDB) by introduction of a hammerhead ribozyme.// Br J Cancer. 1994. V.70. № 2. P. 239-243.

272. Tuschl T. Expanding small RNA interference.// Nat Biotechnol. 2002. V.20. № 5. P. 446448.

273. Tuschl Т., Borkhardt A. Small interfering RNAs: a revolutionary tool for the analysis of gene function and gene therapy.// Mol Interv. 2002. V.2. № 3. P. 158-167.

274. Amarzguioui M., Brede G., Babaie E., Grotli M., Sproat В., Prydz H. Secondary structure prediction and in vitro accessibility of mRNA as tools in the selection of target sites for ribozymes.// Nucleic Acids Res. 2000. V.28. № 21. P. 4113-4124.

Информация о работе

Логашенко, Евгения Борисовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы