Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Химические и структурные модификации анти-MDR1 малых интерферирующих РНК как факторы, определяющие нуклеазоустойчивость, биологическую активность и эффективность проникновения в клетки
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Химические и структурные модификации анти-MDR1 малых интерферирующих РНК как факторы, определяющие нуклеазоустойчивость, биологическую активность и эффективность проникновения в клетки"
На правах рукописи
ПЕТРОВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА
ХИМИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ МОДИФИКАЦИИ АНТИ-ЛЯШ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК КАК ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ НУКЛЕАЗОУСТОЙЧИВОСТЬ, БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОНИКНОВЕНИЯ В КЛЕТКИ
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Новосибирск - 2011
4844536
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН
Научный руководитель:
к.х.н. Черноловская Елена Леонидовна
Официальные оппоненты:
д.х.н., профессор Готтих Марина Борисовна к.х.н. Малыгин Алексей Аркадьевич
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
Защита состоится « 2. Ъ » 2011 г. в {0~~ часов
на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru
Автореферат разослан «о?<2 » 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Разработка терапевтических препаратов для лечения заболеваний, связанных с нарушением экспрессии определенных генов, представляет собой важную задачу фармакологии. Перспектива использования малых интерферирующих РНК (siPHK), являющихся эффекторами РНК-интерференции, в качестве терапевтических препаратов является многообещающей, поскольку на основе síPHK могут быть созданы специфические ингибиторы экспрессии любого гена-мишени. Однако широкое применение siPHK в терапии пока невозможно из-за недостаточной эффективности РНК-интерференции in vivo, связанной с неэффективной доставкой siPHK в клетки, высокой чувствительностью к действию нуклеаз, а также проблемой выбора эффективных siPHK. Химическая модификация и модификация структуры si РНК-дуплексов успешно используются для улучшения свойств siPHK, однако отсутствие универсального подхода к конструированию siPHK, объединяющего различные типы модификаций в одной молекуле, пока не позволяет получить siPHK, пригодные для биомедицинского применения. Таким образом, исследования, направленные на оптимизацию дизайна siPHK с целью получения высокоактивных ингибиторов длительного действия, направленных к любой мРНК-мишени, являются актуальными.
Целью настоящей работы являлось исследование влияния химических модификаций и модификаций структуры дуплекса siPHK, направленных к мРНК гена MDR1, на эффективность и длительность их действия, а также на способность проникать в клетки. В ходе исследования решались следующие задачи:
S исследовать влияние количества и положения 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе siPHK на ее нуклеазоустойчивость, интерферирующую активность и длительность ингибирующего действия;
S исследовать влияние нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных siPHK на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия;
■Sисследовать влияние липофильных модификаций, введенных на 5'-конец смысловой цепи siPHK, на эффективность их проникновения в раковые клетки, эффективность и длительность ингибирующего действия.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые проведено исследование влияния селективной химической модификации siPHK на ее нуклеазоустойчивость и интерферирующую активность. Показано, что анти-MDR1 siPHK, содержащие 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов, расположенные в нуклеазочувствительных сайтах дуплекса, стабильны в присутствии сыворотки и обладают более длительным действием по сравнению с немодифицированными аналогами. Мы использовали подход, основанный на селективной модификации в совокупности с модификацией структуры siPHK, заключающейся в снижении термостабильности дуплекса с 3'-конца смысловой цепи или центральной
части дуплекса путем введения нуклеотидных замен, приводящих к образованию «мисматчей». Впервые получены ттп-MDR I siPHK, содержащие 4 «мисматча» с 3'-конца смысловой цепи, стабильные в присутствии 10 % сыворотки. Длительность действия данных siPHK превышает длительность действия селективно модифицированных siPHK с «совершенной» структурой дуплекса. Мы предполагаем, что стратегия объединения химической модификации и модификации структуры дуплекса может быть использована для получения высокоактивных siPHK длительного действия, направленных к любой последовательности мРНК гена-мишени. Вторая часть работы представляет собой первое в своем роде систематическое исследование влияния длины алифатического линкера, связывающего остаток липофильной молекулы и siPHK, на эффективность проникновения данных производных в клетки в отсутствие трансфекционных агентов. Установлено, что способность липофильных производных siPHK проникать в клетки увеличивается при удлинении алифатического линкера между siPHK и липофильным остатком от 0 до 12 атомов углерода. Показано, что холестерин-содержащая siPHK с аминогексильным линкером проявляет более высокую биологическую активность по сравнению с остальными липофильными производными, а удлинение или укорочение линкера снижает биологическую активность. Таким образом, оптимизация длины линкера, связывающего липофильный остаток с siPHK является одним из ключевых аспектов дизайна липофильных производных siPHK.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы представлены на конференциях: «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007, 2008, 2010), «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009), VI Всероссийском Научном Семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международной летней школе «Supramolecular systems in chemistry and biology» (Туапсе, 2008), 4-й международной конференции «RNAÍ2009: ncRNA: Bridging Biology and Therapy» (Оксфорд, Великобритания, 2009), 3-ей международной конференции FEBS «АТР-Bindíng Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases» (Инсбрук, Австрия, 2010), первом симпозиуме «Supramolecular Chemistry for Materials and Life Sciences» (Новосибирск, 2010).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 137 страницах, содержит 37 рисунков и 8 таблиц. Библиография содержит 229 литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Алгоритм селективной модификации нуклеазочувствительных сайтов з1РНК
Химические модификации в составе з1РНК в первую очередь используются для увеличения их нуклеазоустойчивости с целью увеличения продолжительности действия з1РНК. Известно, что расщепление з1РНК в присутствии сыворотки происходит, в основном, под действием эндорибонуклеаз, и его характер соответствует типу расщепления РНКазой А, при котором 2'-ОН группа рибозы участвует в разрыве фосфодиэфирной связи по механизму трансэтерификации. Поэтому использование 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе з1РНК способствует увеличению их нуклеазоустойчивости. Однако такая модификация зачастую снижает биологическую активность з1РНК, причем наблюдается обратная зависимость ее активности от количества 2-О-метильных звеньев. Ранее в нашей лаборатории был предложен алгоритм, позволяющий минимизировать число 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе дуплекса. На первом этапе проводится картирование нуклеазочувствительных сайтов з!РНК в присутствии сыворотки (РВБ); на втором этапе выявленные сайты защищают путем введения 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов; на третьем -оценивается нуклеазоустойчивость модифицированных аналогов з1РНК в присутствии РВ8. В соответствии с предложенным алгоритмом был получен 2'-0-метильный аналог анти-МОШ з1РНК, з!Ет, содержащий И 2'-0-метильных звеньев в нуклеазочувствительных сайтах дуплекса (Таблица 1). Мы исследовали влияние селективной модификации на свойства з1Егп.
Таблица 1. Олигорибонуклеотиды и 3)'РНК использованные в работе 11
мРНК-мишень (по. М14758) з1РНК2) Последовательность 3) Тш4), °С
оц-з1Е 5'- ОиССАСССССАШОАШЛиСО -3' -
оц^Ет 5'- ОиССАОССССЛиСОЛШАиСС -3' -
598-618 н. оц-з1Ет** 5'- ОиССАОССССАиСОАШАиОО-З' -
5'- АиСАиССАивОООСиСОАСии -3' 3'- ООиАОиАООиАССССОАССШ -5' 81.5
з1Ет 5'- АиСАиССАиСССССПСОЛСии -3 3'- ООиЛСЦАОСиАССССОЛССиО -5' 84.5
598-618 н. siErm 5'-AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU-3' 3'-GGUAGUAGGUACCCCGACCUG-5' 83.5
siEm** 5'- AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 91
fsiE-lm 5'- AUCAUCCAUGGGGCUGGAGUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 83
fs¡E-2m 5'- AUÇAUCÇAUGGGGCUGGCGUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 84
fsiE-4 5- AUCAUCCAUGGGGCUl/ACGUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 75
fsiE-4m 5'- AUCAUCCAUGGGGCUÍMCGUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 76.8
fsiE-4m+ 5'- AUCAUCCAUGGGGCUÏMCGUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 77
fs¡E-4m* 5'- AUCAUCCAUGGGGCUÍMCGUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 79.8
fsiE-4m** 5'- AUCAUCCAUGGGGCUIMCGUU -3' 3 - GGUAGUAGGUACCCCGACCUG - 5' 80
fsiE-6m 5'- AUÇAUCCAUGGGG/1CUACGVU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 71
fsiE+4m 5'- CGACUCÇAUGGGGCUGGACUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 84
s¡E/3GUm 5 - AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACÍ/Í/Í/GACCUG -5' 64.5
siE/4GUm 5'- AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU -3' 3'- GGUAGUAGGUAf7í/l7l7GACCUG -5' 59
siE/3GAm 5'- AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU -3' 3'- GGUAGUAGGUAQL4AGAÇÇUG -5' 63
siE/ЗАСш 5'- AUCAUCCAUGA^ACUGGACUU -3' 3'- GGUAGUAGGUACCCCGACCUG -5' 60
598-618 н. Б1Е/4АСт 5'- АиСАиССАи/ЫА4СШОАСии -3' 3'- СбиАОиЛОСиАССССОАССиО -5' 52.5
424-444 н. 5'- АШОАисиШААООСОАСССС -3' 3'- СииАССиАОААСииССССиОО -5' 81
5'- АиСОАиСЦШААССС1/ССССС -3' 3'- СииАССиАОААСииССССиОО -5' 68.3
586-606 н. БШгп 5'- АСиЩООСШССАиСАиССАи -3' 3'- СиШАЛАССОАСССиАСиАСй -5' 80.2
Г5Ш-4т 5 - АсиииаосисссАисссссАи -3' 3'- СииОАААССОАСССиАОиЛСО -5' 72.4
652-672 н. вИт 5'- ОАиАиСиииОСАААиССАСОЛ -3' 3'- ОисилиАОАААССиииАСОиС -5' 68.4
5'- О А и А иС и иПОСЛА А и С ¡¿ОА -3' 3'- ОисиАиАОАААШиШАСОиС -5' 58
Первый интрон гена МШЦ человека оц-бПгп 5'- АААиСШАААСССШАСАСОТ -3' -
з-оисисАоосииислоАииисс-з' 3'-ииСАСАОиССОАААОисиААА-5' -
- з18СЯт 5'- САЛоисиссилисилсиссии -3' 3'- ииОииСАОАОСАЦАСАиСАСС -5' -
Все олигорибонуклеотидьг был и синтезированы в ЛХРНК ИХБФМ СО
РАН.
2) Буква «6> указывает на «вилкоподобную» («6эгк»-Нке) структуру з!РНК, буквой «ш» обозначены б!РНК, содержащие 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов в нуклеазочувствительных сайтах, «т+» - з!РНК, содержащие модификации в нуклеазочувствительных сайтах, включая дополнительные сайты, картированные для Г51Е-4ш, «ш*» - бФНК, содержащие полностью модифицированную смысловую цепь, «т**» - в1РНК, обе цепи которой полностью модифицированы. -1,-2,-3,-4 и -6 соответствуют количеству нуклеотидных замен с З'-конца смысловой цепи fsiPHK, +4 соответствует четырем заменам с 5'-конца смысловой цепи. Курсивом обозначены нуклеотидные замены в смысловой или антисмысловои цепях.
3) £ и и - 2'-0-метильные аналоги Сии соответственно.
4) Тт - температура плавления б1РНК, измерена к.ф.-м.н. Ломзовым А. А. (ИХБФМ СО РАН).
1.1 Исследование влияния 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов в нуклеазочувствительных сайгах дуплекса на стабильность siPHK в присутствии сыворотки
Исследование нуклеазоустойчивости siEm проводили в ростовых средах IMDM и DMEM. Было показано, что модификация нуклеазочувствительных сайтов siPHK эффективно защищает дуплекс от действия рибонуклеаз даже в присутствии в среде IMDM 50 % FBS (т1Д для siEm составило ~ 8 ч), тогда как такое же количество 2'-0-метильных звеньев в сайтах, отличных от нуклеазочувствительных, в siErm лишь незначительно увеличило его стабильность по сравнению с исходным немодифицированным дуплексом siE: т,/2 ~ 1 ч и 30 мин, соответственно (рис. 1). В среде DMEM с 10% FBS нуклеазоустойчивость siEm также значительно превышала стабильность немодифицированной siE. Таким образом, использование селективной модификации нуклеазочувствительных сайтов siPHK позволило минимизировать количество 2'-0-метильных звеньев, обеспечив при этом высокую нуклеазоустойчивость siPHK.
3 4 5 6 7 Время инкубации, ч
Рис. 1. Кинетика расщепления з1Е и ее 2'-0-метильных аналогов в ростовой среде ШГОМ с 50 % РВБ.
1.2 Исследование интерферирующей активности ттп-МВШ 51РНК в клетках НЕК 293
Исследование биологической активности э1Ет проводили методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуорометрии. Для этого в качестве компонента модельной системы была использована рекомбинантная плазмида рЕОРР/МИИ со встроенным химерным геном, кодирующим фрагмент 293 - 751 н. мРНК гена МБШ в составе единого транскрипта с мРНК гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок БОБР. Таким образом, эффективность действия з1РНК оценивали по снижению уровня флуоресценции ЕОБР. При оценке активности б1РНК методом флуоресцентной микроскопии, мы показали, что ингибирующее действие з1Ет (65 % при концентрации 100 нМ) сопоставимо с эффективностью действия немодифицированной з1Е, тогда как экспрессия гена-мишени под действием 51Егш (100 нМ) снижалась лишь на 45 % (рис. 2). Аналогичные
данные были получены методом проточной цитофлуорометрии. Таким образом, защита нуклеазочувствительных сайтов $1РНК позволяет не только значительно повысить стабильность 81РНК в присутствии сыворотки, но также избежать снижения ее интерферирующей активности.
Рис. 2. Интерферирующая активность и ее 2'-0-метильных аналогов. В качестве контроля эффективности трансфекции использовали плазмиду рЕВРР-N1, кодирующую голубой флуоресцентный белок. В качестве контроля специфичности действия - б1РНК бПгп (Таблица 1).
1.3 Исследование длительности ингибирующего действия селективно модифицированной 81Еш
Методом флуоресцентной микроскопии было показано, что через 4 суток после трансфекции уровень подавления экспрессии гена-мишени ЕОРР/ЫОЫ под действием з1Е и з1Ет был сопоставим: около 55 %. Тогда как через 6 суток с момента трансфекции уровень ингибирования экспрессии гена-мишени по действием з^Егп составлял 40 %, а эффективность действия 31Е и 31Егш снижалась до 20 % (рис. 3). Таким образом, использование алгоритма селективной модификации является перспективным подходом для создания активных нуклеазоустойчивых 2'-0-метильных аналогов з1РНК. Предположительно, данный алгоритм может быть использован для любых з1РНК вне зависимости от их нуклеотидной последовательности.
Рис. 3. Длительность действия Э1Е и ее 2'-0-метиль-ных аналогов. Клетки НЕК 293 ко-трансфициро-вали 5;РНК и плазмидами рЕОРР/МОЮ и рЕВРР-ТчП, после чего инкубировали от 1 до 6 суток. Анализ проводили методом флуоресцентной микроскопии.
Время инкубации, сутки
2. Влияние структуры в!РНК на их свойства
В роли индукторов РНК-интерференции могут выступать не только «классические» 21-звенные дуплексы з1РНК, но и э1РНК, содержащие неканонические пары или «мисматчи», а также одноцепочечные 21-звенные
олигорибонуклеотиды (оц^РНК). Мы исследовали влияние структуры анти-МВК1 б1РНК на их свойства.
2.1 Одноцепочечные аналоги з1РНК: нуклеазоустойчивость и интерферирующая активность
Известно, что эффективность действия оц-31РНК значительно ниже по сравнению с активностью дуплекса б1РНК (дц-э1РНК), направленной к той же последовательности. Одной из причин может быть более высокая чувствительность оц-олигорибонуклеотидов к действию рибонуклеаз по сравнению с дуплексами. В нашей работе было проведено исследование влияния нуклеазоустойчивости оц-81РНК типа Е (Таблица 1) на эффективность их действия. Показано, что нуклеазоустойчивость оц-б^Еш ниже нуклеазоустойчивости з1Ет, однако сопоставима с нуклеазоустойчивостью з1Е (рис. 4). При этом эффективность действия
3 4 5 Время инкубации, ч
Рис. 4. Кинетика расщепления 2'-0-метильных аналогов з1Е в ростовой среде БМЕМ с 10 % РВЭ.
оц^РНК была сопоставима с активностью дц^РНК лишь при самой высокой концентрации - 100 нМ. Более низкая активность оц^Ет по сравнению с б^Е, обладающей сходной нуклеазоустойчивостью, вероятно, связана с различием в эффективности взаимодействия оц^РНК и дц-б1РНК с белками, участвующими в РНК-интерференции. Таким образом, несмотря на более низкую стоимость синтеза оц^РНК по сравнению с дц-з1РНК, более перспективным подходом для направленного подавления экспрессии генов является использование з1РНК-дуплексов.
2.2 «Вилкоиодобные» $1РНК: активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия
Известно, что различие термостабильности концов дуплекса 51РНК (термоасимметрия) определяет потенциал ее действия. Так, наличие в структуре с 3'-конца смысловой цепи «мисматчей» приводит к усилению интерферирующей активности з1РНК, однако появление одноцепочечных участков снижает нуклеазоустойчивость таких «вилкоподобных» з1РНК. Для получения нуклеазоустойчивых 2'-0-метильных аналогов «вилкоподобных» з;РНК мы применили селективную модификацию. В работе использовали
«вилкоподобные» аналоги з1Ет: Гз1Е-1т, Гз1Е-2т, £з1Е-4т и fs¡E-6m, содержащие 1, 2, 4 и 6 неспаренных оснований с 3'-конца смысловой («пассажирской») цепи, соответственно (Таблица 1). В качестве отрицательного контроля был использован дуплекс fsiE+4m с 4 заменами с 5'-конца смысловой цепи. С помощью проточной цитофлуорометрии было показано, что данная з1РНК не проявляла интерферирующую активность (рис.5). Формирование 1 или 2 «мисматчей» с З'-конца смысловой цепи не приводило к увеличению активности 31РНК, тогда как «вилкоподобные» э1РНК с 4 и 6 «мисматчами» подавляли экспрессию гена-мишени более эффективно по сравнению с исходной з1Ет (рис. 5).
о ш
100 80 60 -40 -20 0
Е К
о </)
Е ш й
I
ш
ш
3>
Е Е ш ш
Е +
ш
Е Т
Е
I
Е
т
X
Ю50, нМ:
18.5 30 50 13.5 27.5 >100 >100 42.5 >100 100 >100 42.5
Рис. 5. Влияние изменения термоасимметрии дуплекса 2'-0-метильных аналогов 31РНК на их интерферирующую активность. з1РНК и рекомбинантную плаз-миду рЕОРР/МОШ ко-трансфицировали в клетки НЕК 293, используя Липофек-тамин 2000 (далее по тексту, Липофектамин). Через 24 ч измеряли уровень сигнала ЕОРР с помощью проточной цитофлуорометрии. В качестве контроля использовали $¡801111, не имеющую гомологии с мРНК человека, крысы или мыши.
Формирование 4 и 6 «мисматчей» в составе з1Ет способствовало значительному снижению ее Тт (Таблица 1): ДТт для Гз1Е-4т составило 7.7 °С и 13.5 °С - для 1^Е-6т. Показано, что более высокой активностью обладала fsiE-4m: концентрация, при которой наблюдалось 50 % ингибирование экспрессии гена-мишени (1С50) составила 13.5 нМ, тогда как 1С50 з1Еш - 18.5 нМ (рис. 5). Более низкая активность 5з1Е-6т (1С50 27.5 нМ) могла быть связана с неблагоприятными конформационными изменениями
или значительной дестабилизацией дуплекса, вызванными нуклеотидными заменами. Таким образом, при дизайне «вилкоподобных» siPHK необходимо учитывать конформационные «предпочтения» белков, участвующих в РНК-интерференции, а также сохранять баланс между термоасимметрией и общей термостабильностью siPHK. При сравнении биологической активности серии селективно модифицированных siPHK, направленных к другим участкам гена MDR1 (Таблица 1), с активностью их «вилкоподобных» вариантов с 4 «мисматчами» было показано, что «вилкоподобные» siPHK более активны (рис. 5). Эти данные коррелируют с нашими данными по подавлению синтеза Р-гликопротеина в клетках КВ-8-5, согласно которым, эффективность действия «вилкоподобных» siPHK в 1.2 - 1.8 раза превышала активность «классических» siPHK.
Исследование нуклеазоустойчивости siPHK показало, что в большинстве случаев стабильность «вилкоподобных» siPHK ниже, чем стабильность «классических» siPHK. Вероятно, в результате изменений контекста последовательности или дестабилизации дуплекса происходит формирование дополнительных нуклеазочувствительных сайтов либо усиление расщепления по минорным нуклеазочувствительным сайтам. Тем не менее, при сравнении стабильности немодифицированной fsiE-4 (полностью деградировала в течение 15 мин) и ее селективно модифицированного аналога fsiE-4m (превращался в стабильный более короткий продукт через 15 мин инкубации) (рис. 4), показано, что 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов защищают «вилкоподобные» siPHK от действия рибонуклеаз. Мы сравнили характер расщепления смысловых цепей siEm и fsiE-4m в присутствии сыворотки (рис. 6). При картировании нуклеазочувствительных сайтов были выявлены три дополнительных сайта расщепления в составе fsiE-4m. Один из них располагался, как и ожидалось, в одноцепочечном районе с 3'-конца смысловой цепи дуплекса, тогда как два других (С6-С7 и U5-C6) соответствовали минорным сайтам расщепления, картированным в siEm. Введение трех 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов в данные сайты позволило получить «вилкоподобную» siPHK, fsiE-4m+ (Таблица 1), стабильную при инкубации в присутствии сыворотки до 8 ч (рис. 4). Данная siPHK была несколько менее активна по сравнению с fsiE-4m: величина IC50 fsiE-4m+ составила 47 нМ.
Для определения влияния дополнительной модификации в fsiE-4m+ на продолжительность ее ингибирующего действия было проведено исследование кинетики подавления экспрессии EGFP/MDR1 (рис. 7 А). Показано, что через 2 суток с момента трансфекции эффективность действия «вилкоподобных» siPHK была сопоставима и составляла порядка 70 % (рис. 7 Б). Активность немодифицированной fsiE-4 значительно снижалась через 6 суток инкубации, тогда как ингибирующая активность селективно модифицированных аналогов проявлялась до 15 суток. В то же время, активность селективно модифицированной siEm заметно снижалась уже через 8 суток инкубации. Таким образом, комбинация модификации структуры
К 5 15 30 I 2 4 К 5 15 30 1 2 4
I Т1
Цт, ит,
Ст7 Ст.
Ст. . — Ст,
и/ .щ-'Ф^ ' и2
и и и Н нЬ
Рис. 6. Картирование нуклеазочувствительных сайтов в з1Ет (А) и Г^Е-4т (Б), содержащих 5'-[32Р]-меченые смысловые цепи. Радиоавтограф 10 % денатурирующего ПААГ. Дорожки Ь и Т1 - имидазольный леддер и леддер РНКазы Т1, соответственно; дорожка К - 81РНК после инкубации в БМЕМ без сыворотки. э1РНК (3 нМ) инкубировали в БМЕМ с 10 % РВЙ при 37°С. Маленькие и большие стрелки указывают на интенсивность расщепления в смысловой цепи 51РНК. С и Ц - 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов Сии, соответственно.
Время инкубации, сутки
Посадка клеток НЕК 293
Трансфекция »1РНК
Трансфекция рЕСРР/МОШ
Проточная цитофлуорометрия
[ б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 18 17 Время инкубации, сутки
Рис. 7. Длительность подавления экспрессии гена ЕОРР/МВЮ селективно модифицированными 2'-О-метильными аналогами «вилкоподобных» $1РНК. А. Схема эксперимента. Клетки НЕК 293 трансфи-цировали з1РНК (100 нМ) и инкубировали (N-1) день (где 14: 2 - 17 дней), после чего трансфицировали рекомбинантной плазми-дой рЕОРР/МОШ. Через N дней инкубации оценивали уровень экспрессии ЕОРР методом проточной цитофлуорометрии (Б).
дуплекса и химических модификаций позволила получить нуклеазоустойчивые з1РНК, способные индуцировать РНК-интерференцию в течение 15 дней после однократной трансфекции, что превышает длительность действия всех синтетических з1РНК, описанных в литературе ранее.
2.3 з»РНК с дестабилизированной центральной частью дуплекса: биологическая активность
Известно, что активные з1РНК обладают низкой термостабильностью дуплекса в районе 9 - 14 н. с 5'-конца антисмысловой цепи. Поэтому введение нуклеотидных замен в центральную часть з1РНК, приводящих к образованию неканонических пар или «мисматчей», может способствовать увеличению активности з1РНК, однако, с другой стороны, такая модификация может привести к изменению конформационных свойств дуплекса и блокировать РНК-интерференцию. Мы исследовали влияние нуклеотидных замен в составе дуплекса селективно модифицированной з1Ет на ее интерферирующую активность. Данная з1РНК содержит 4 ОС-пары в позициях 7 - 10 н. с 5'-конца антисмысловой цепи. В работе использовали ее структурные варианты, содержащие в данном районе 3 или 4 «мисматча» или неканонических йи-пары (Таблица 1), полученные в результате нуклеотидных замен в смысловой или антисмысловой цепи дуплекса. Показано, что введение нуклеотидных замен привело к значительному снижению температуры плавления э1РНК (Таблица 1). При исследовании биологической активности обнаружено, что дестабилизация центральной части дуплекса не блокирует интерферирующую активность з1РНК (рис. 8).
Рис. 8. Интерферирующая активность селективно модифицированных 2'-0-ме-тильных аналогов анти-МОШ з1РНК с дестабилизированной центральной частью дуплекса. з1РНК и рекомбинантную плазмиду рЕОРРЛУГОШ ко-трансфи-цировали в клетки НЕК 293, через 24 ч измеряли уровень сигнала ЕОРР с помощью проточной цитофлуоромет-рии.
Более того, активность 81РНК с 3 ви-парами превышает активность 8'1РНК «классической» структуры: 90 % подавление экспрессии гена-мишени наблюдалось при использовании ее в концентрации 100 нМ (рис. 8). Аналогичные данные были получены при снижении уровня Р-гликопротеина:
активность siE/3GUm в 2 раза превышала активность siEm. Таким образом, дестабилизация центральной части дуплекса siPHK может способствовать увеличению эффективности ее действия при оптимальном соотношении между конформационными и термодинамическими свойствами дуплекса. Введение неканонических GU-nap в центральную часть дуплекса - это перспективный подход для оптимизации дизайна siPHK.
В ходе проделанной работы мы показали, что применение алгоритма селективной модификации совместно со структурной модификацией позволяет получать нуклеазоустойчивые siPHK длительного действия. Мы предполагаем, что данный подход может быть использован для получения высокоэффективных аналогов siPHK, направленных к любым последовательностям мРНК-мишеней.
3. Липофильные производные анти-MDR1 siPHK
Для применения siPHK в биомедицинских целях необходимо решить проблему доставки siPHK в клетки. Известно, что ковалентное присоединение к 5'-концу смысловой цепи siPHK липофильных остатков не снижает интерферирующую активность siPHK и способствует увеличению эффективности проникновения их в клетки в отсутствие трансфекционных агентов. Мы исследовали влияние структуры липофильных производных siPHK на эффективность их проникновения в клетки и биологическую активность. В работе использовали серию липофильных производных siDm, направленной к району 557 - 577 н. мРНК гена MDR1 (рис.- 9). Для присоединения к siPHK были выбраны следующие молекулы: холестерин, олеиловый спирт, литохолевая кислота и олеиламид литохолевой кислоты.
3.1 Определение эффективности накопления FITC-меченых липофильных производных siPHK в клетках
Для визуализации накопления липофильных производных siDm в клетках к З'-концу антисмысловой цепи дуплекса присоединяли остаток флуоресцеинизотиоцианата (Flu). Исследования проводили методом проточной цитофлуорометрии. За эффективность трансфекции siPHK (в %) принимали количество клеток, уровень флуоресценции которых превышал максимальный уровень автофлуоресценции клеток в контроле (необработанные клетки). Чтобы оценить среднюю эффективность накопления siPHK во всей популяции клеток, мы использовали также отношение средних значений интенсивности флуоресценции обработанных и контрольных клеток (RFU). На первом этапе оценивали влияние остатка холестерина в структуре Chol*-siDm-Flu на эффективность его накопления в клетках НЕК 293, HepG2, SCI и КВ-8-5. Оказалось, что в отсутствие трансфекционных агентов данная siPHK и ее производное с холестерином практически не проникали в клетки, тогда как при использовании трансфекционных агентов (Липофектамина и Олигофектамина) наличие остатка холестерина повышало эффективность трансфекции только в клетки
5'- К—р—0-
0—в й С иур А С А А Си1ЮиАиА.иСС- 3' Смысловая цепь 3' - ААСССААСиСииСААСАидиА- 5' Антисмысловая цепь
Я: СИо!*-
В.
Я: СЬоЮ-
И: 01еу1-В: 01еу1-|_К-0-
К: 01еу1-1ЛЫ-01еу1-Ш-6-
Е.
Рис. 9. Структура липофильных производных Я-вЮт (А), где Я - остатки липофильных молекул, введенные с 5'-конца смысловой цепи; и и С - 2'-0-ме-тильные аналоги нуклеотидов и и С, соответственно. Б. Остаток холестерина, присоединенный к 51РНК через фосфамидную связь. В. - Е. Липофильные остатки, присоединенные к 51?НК через фосфодиэфирную связь. В. Остатки холестерина без аминолинкера и с алифатическим аминолинкером, число ме-тиленовых звеньев (п) составляло: 3, 6, 12. Г. Остаток олеилового спирта. Д. Остатки олеиламида литохолевой кислоты без аминолинкера и с алифатическим аминолинкером, п = 3, 6. Е. Остаток литохолевой кислоты, связанный с алифатическим аминолинкером, п = 3, 6. Модифицированные олигорибо-нуклеотиды были синтезированы в ЛХРНК ИХБФМ СО РАН.
определенных линий (Таблица 2), что, скорее всего, связано с образованием липоплексов оптимального размера и формы за счет участия холестерина во взаимодействии между олигонуклеотидом и трансфекционным агентом. Мы предполагаем, что необходимость оптимизации структуры комплекса з!РНК / трансфекционный агент в каждом конкретном случае связана с зависимостью эффективности трансфекции от свойств клеточной мембраны. Таким образом, введение остатка холестерина в состав эФНК является перспективным подходом, позволяющим увеличить эффективность
Таблица 2. Накопление 510гп-Р1и и СЬо1*-510т-Р1и в клетках различных
типов
Клетки Условия %2> лги3)
Трансфектант Концентрация э1РНК, нМ СЬо1 "
НЕК 293 Липофектамин 50 + 35 15.1
- 21 7.6
Липофектамин 50 + 35 1.4
- 27 1.3
КВ-8-5 Олигофектамин 50 + 29 5.0
- 20 4.0
100 + 52 13.6
- 29 6.0
200 + 81 18.9
- 57 8.6
>) _ наличие/отсутствие остатка холестерина в составе з1РНК.
2) Эффективность трансфекции (%). Величина стандартного отклонения < 10%.
3) Отношение среднего значения интенсивности флуоресценции всей популяции клеток, обработанной з1РНК, к среднему значению интенсивности флуоресценции контрольной популяции клеток.
трансфекции з1РНК в клетки в комплексе с трансфекционными агентами.
На втором этапе мы исследовали влияние длины линкера, а также типа липофильного остатка на эффективность проникновения производных серии Я^От (рис. 9 А, В, Г, Д, Е), при этом диапазон исследуемых концентраций был увеличен. С помощью метода проточной цитофлуорометрии мы сравнили эффективность накопления липофильных производных б1РНК в клетках НЕК293, Нер02 и КВ-8-5. Обнаружено, что холестерин-модифицированные з]РНК, а также производные з1РНК, содержащие остаток олеиламида литохолевой кислоты, способны эффективно накапливаться в клетках всех типов в отсутствие трансфекционных агентов (рис. 10), при этом эффективность накопления липофильных производных зависит от типа клеток. В свою очередь, немодифицированная з1РНК, а также производные с литохолевой кислотой и олеиловым спиртом не проникали в клетки. Кроме того, в ходе исследования была выявлена тенденция увеличения эффективности трансфекции от длины линкера, соединяющего остаток липофильной молекулы с э1РНК (рис. 10). Сравнение средних значений
А.
100 80 60 40
■В-•8-о
Ж
<<Ч -С4
□ 5 мкМ ЕЗ 2 мкМ 0 1 мкМ О 0.2 мкМ
70 60 50 ■ 40 30 -20 10
<Г г ^ ф ^
•У # & в .V
г «г г ^ ^ ^ .<
' у у У
ЕЗ 5 мкМ И 2 мкМ 0 1 мкМ □ 0.2 мкМ
ч*>
Г
Рис. 10. Эффективность накопления Р1ТС-меченых липофильных производных б1РНК 11-з1Вт-Р1и в клетках КВ-8-5 в среде без сыворотки. А. Эффективность трансфекции (%). Б. Соотношение среднего уровня флуоресценции (ЯШ) популяции клеток в образце, обработанном производным з1РНК, к среднему уровню автофлуоресценции клеток в необработанном контроле.
интенсивности флуоресценции клеток показало, что производные б1РНК и холестерина, связанные аминогексильным и аминододецильным линкерами, лучше всех накапливаются в клетках (рис. 10 Б). Точный механизм проникновения липофильных производных з!РНК в клетки неизвестен, поэтому мы предположили, что длинный алифатический линкер (гексильный или додецильный) в их структуре может обеспечивать оптимальную дистанцию между клеточной мембраной и полианионом з1РНК, а также увеличивать гидрофобность. Таким образом, введение остатков молекул
липофильной природы, в частности, холестерина, в состав 51РНК может быть эффективно использовано для оптимизации их дизайна.
Исследование локализации холестерин-содержащих й1РНК в клетках КВ-8-5 с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии проводили через период времени, соответствующий уровню максимального накопления производных в клетках (8 ч). Мы подтвердили, что холестерин-содержащие 81РНК действительно проникают в клетки без использования трансфекционных агентов. При этом наблюдается дисперсное распределение производных в цитоплазме, которое достигает наибольшей плотности с наружной стороны ядра (рис. 11).
А. Б. В.
Рис. 11. Локализация 81РНК (2 мкМ) в клетках КВ-8-5 через 8 ч инкубации. Ортогональные проекции, полученные при сканировании препаратов клеток, обработанных вШт-Р1и (А), С1ю1-6-8Ют-Р1и (Б) и СЬо1-12-5Ют-Р1и (В), с помощью конфокального микроскопа. Наложение трех изображений: зеленый фильтр (Р1ТС-меченые 81РНК); синий фильтр (окрашивание ядер с помощью ОАР1); красный фильтр (окрашивание актиновых филаментов с помощью Родамина-Фаллоидина).
3.2 Исследование биологической активности липофильных производных §1РНК
Влияние липофильных остатков в составе б1РНК на их интерферирующую активность оценивали на лекарственно-устойчивой линии клеток КВ-8-5, способных расти в присутствии винбластина (300 нМ). С помощью МТТ-теста было показано, что при трансфекции СЬо1*-51Вт (20 -200 нМ) в комплексе с Олигофектамином эффективность действия з1РНК в 1.3 - 1.4 раза превышала активность вШт, что согласуется с результатами, полученными при оценке эффективности накопления ,81РНК в клетках (Таблица 2). При исследовании биологической активности холестерин-содержащих анти-МОР/ «¡РНК без использования трансфекционных агентов было обнаружено, что эффективность подавления экспрессии Р-гликопротеина увеличивается при увеличении длины алифатического аминолинкера от 0 до 6 углеродных атомов (рис. 12), что коррелирует с данными по накоплению (рис. 10). Максимальный уровень подавления синтеза Р-гликопротеина в клетках (до 30 %) СМ-б^От наблюдался через 5
суток инкубации. Следует отметить, что при использовании трансфектанта 35 % уровень Р-гликопротеина наблюдался уже через 3 дня с момента трансфекции (рис. 12). Мы предполагаем, что причиной задержки
проявления биологической активности может быть неэффективное высвобождение липофильных производных из эндосом. В пользу этого говорит тот факт, что СЬо1-12-з1Вш, которая наиболее эффективно накапливалась в клетках, была менее активна по сравнению с СЬо1-3-зЮт и Ою1-6-з1Вт. Таким образом, при оптимизации структуры липофильных производных 31РНК установление баланса между длиной аминолинкера, эффективностью проникновения и биологической активностью является принципиально важным.
-Контроль
♦ зЮт I Липофектамин О 5|5СИт / Лилофектамин -*-»И5т
—С|1о]-0-810т —©— СЬо|-3-«!От -»— СЫ>1-6-310т -Э-СЬоиб-ЫБСРич
-А-СЛоМг-зЮСНт
Время инкубации, сутки
Рис. 12. Кинетика подавления синтеза Р-гликопротеина в клетках КВ-8-5 холестериновыми производными атя-МЭШ Э1РНК (5 мкМ) и з1Вт (0.1 мкМ) в комплексе с Липофектамином. Данные получены методом Вестерн блота с последующим количественным анализом уровня белка. Р-Актин был использован в качестве внутреннего стандарта. Необработанные клетки были использованы в качестве контроля.
Способность холестерин-содержащих з1РНК обращать фенотип МЛУ (множественной лекарственной устойчивости) клеток КВ-8-5 была исследована методом МТТ-теста через 4-6 дней инкубации в присутствии 300 нМ винбластина. Было показано, что максимальный эффект для всех производных наблюдается через 6 суток инкубации (рис. 13), что согласуется с результатами, полученными при исследовании кинетики подавления синтеза Р-гликопротеина (рис. 12). СЬо1-6-510га обладает максимальной способностью восстанавливать чувствительность раковых клеток к цитостатику, снижая количество живых клеток до 45 %. При этом наличие остатка холестерина в составе з)РНК не увеличивает ее токсичность (рис. 13).
Таким образом, путем варьирования типа липофильного остатка и длины линкера, связывающего его с з1РНК, нам удалось оптимизировать структуру липофильных производных з1РНК. Анти-М£>Л7 з1РНК, в состав которой с помощью аминогексильного линкера был введен остаток холестерина, эффективно проникала в раковые клетки, восстанавливала уровень Р-гликопротеина и обращала фенотип лекарственной устойчивости данных клеток. На основании полученных данных можно сделать вывод, что холестерин-содержащие з!РНК являются перспективными агентами для
Рис. 13. Количество живых клеток КВ-8-5 в присутствии 300 нМ винбла-стина по данным МТТ-теста, проведенного через 6 суток после обработки з1РНК (1-5 мкМ) без использования трансфекци-онных агентов. Моек -необработанные клетки.
Выводы
Исследованы способы оптимизации структуры малых интерферирующих РНК (з1РНК), направленных к мРНК гена МОЛ/, за счет введения в их состав 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов, остатков липофильных молекул, а также нуклеотидных замен, приводящих к образованию неканонических пар или неспаренных оснований.
1. Показано, что 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов, расположенные в нуклеазочувствительных сайтах дуплекса $1РНК, не изменяют ее интерферирующую активность, защищают от деградации нуклеазами эмбриональной бычьей сыворотки и увеличивают длительность ингибирования экспрессии гена-мишени по сравнению с немодифицированной з1РНК такой же последовательности с 4 до 6 дней.
2. Исследовано влияние количества и расположения нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных з1РНК на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия и показано, что:
- замена четырех нуклеотидов на 3'-конце смысловой цепи б1РНК, приводящая к образованию «мисматчей», увеличивает эффективность подавления экспрессии гена-мишени до 3 раз и снижает уровень Р-гликопротеина (продукта гена МОЯ!) до 1.8 раза;
создания на их основе лекарственных препаратов.
□ 1 мкМ 02 мкМ И5 мкМ
- введение трех нуклеотидных замен в центральную часть дуплекса, приводящее к образованию GU-nap, способствует двукратному увеличению эффективности подавления экспрессии гена-мишени и снижению уровня Р-гликопротеина;
- селективная модификация нуклеазочувствительных сайтов в составе siPHK, имеющих структуру «вилки», существенно увеличивает длительность их ингибирующего действия, что позволило впервые получить siPHK, способные снижать экспрессию гена-мишени в клетках в течение 15 суток после однократной трансфекции.
3. Выполнен анализ способности липофильных производных селективно модифицированных siPHK проникать в клетки без использования трансфектанта и подавлять экспрессию гена MDR1. Показано, что:
- эффективность накопления липофильных производных siPHK в клетках уменьшается в зависимости от типа липофильной молекулы в ряду холестерин > олеиламид литохолевой кислоты > литохолевая кислота > олеиловый спирт и значительно увеличивается при удлинении алифатического линкера между siPHK и липофильным остатком от 0 до 12 атомов углерода;
- холестерин-содержащая siPHK с аминогексильным линкером эффективно проникает в клетки без использования трансфектанта, ингибирует экспрессию гена-мишени, снижая количество Р-гликопротеина на 4-6 сутки инкубации в 2 - 3 раза, и восстанавливает чувствительность раковых клеток к ранее переносимой концентрации цитостатика.
Результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Круглова Н. С.. Мещанинова М. И., Веньяминова А. Г., Власов В. В., Черноловская Е. Л. 2'-0-Метильные аналоги одноцепочечных и двуцепочечных малых интерферирующих РНК: нуклеазоустойчивость и биологическая активность // Фундаментальные науки-медицине: сб. трудов конференции. - Новосибирск: Арта. - 2008. - С. 129-133.
2. Volkov A. A., Kruelova N. S.. Meschaninova М. I., Venyaminova A. G., Zenkova М. A., Vlassov V. V., Chernolovskaya Е. L. Selective protection of nuclease-sensitive sites in siRNA prolongs silencing effect // Oligonucleotides. -2009.-V. 19.-P. 191-202.
3. Круглова H. С., Мещанинова M. И., Веньяминова А. Г., Зенкова M. A., Власов В. В., Черноловская Е. Л. Холестерин-модифицированные малые интерферирующие РНК, .направленные на мРНК гена MDR1: внутриклеточная доставка и биологическая активность//Молекулярная биология. - 2010. - Т. 44. - С. 284-293.
4. Petrova (Kruglova) N. S., Meschaninova M. I., Venyaminova A. G., Zenkova M. A., Vlassov V. V., Chernolovskaya E. L. 2'-0-methyl modified anti-MDRl fork-siRNA duplexes exhibiting high nuclease resistance and prolonged silencing activity // Oligonucleotides. - 2010. - V. 20. - P. 297-308.
Подписано к печати 17 февраля 2011г.
Тираж 140 экз. Заказ № 018. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Петрова, Наталья Сергеевна
Список сокращений.
Введение.
ГЛАВА 1. Структура, термодинамика и химия как факторы, определяющие биологическую активность э1РНК (Обзор литературы).
1.1 Введение.
1.2 Влияние химических модификаций на эффективность РНК-интерференции.
1.2.1 Химические модификации нуклеотидов.
1.2.1.1 Модификации рибозы.
1.2.1.1.1 Введение заместителей в фуранозу.
1.2.1.1.2 Структурные модификации фуранозного цикла.
1.2.1.2 Модификации фосфатного остова.
1.2.1.3 Химические модификации азотистых оснований.
1.2.2 Химические модификации по концам б1РНК.
1.2.2.1 Биоконъюгаты з1РНК.
1.2.3 Комбинации химических модификаций.
1.3 Влияние модификаций структуры дуплекса на эффективность РНК-интерференции.
1.3.1 Влияние нуклеотидных замен в структуре э1РНК на ее интерферирующую активность.
1.3.2 Влияние выступающих нуклеотидов по концам э1РНК на эффективность РНК-интерференции.
1.3.3 Антисмысловые аналоги в1РНК (оц^РНК).
1.3.4 дц-РНК (27-30-меры) как субстраты Дайсера.
1.3.5 Малые сегментированные РНК.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Химические и структурные модификации анти-MDR1 малых интерферирующих РНК как факторы, определяющие нуклеазоустойчивость, биологическую активность и эффективность проникновения в клетки"
Актуальность разработки терапевтических препаратов для лечения заболеваний, связанных с нарушением экспрессии определенных генов, вызвала огромный интерес со стороны научной общественности к явлению РНК-интерференции. Это явление, открытое в 1998 г. A. Fire и С. Mello [1], повлекло за собой развитие нового перспективного направления в области регуляции экспрессии генов. Особая роль в этих исследованиях отводится коротким (19 - 23 п.н.) дц-РНК (siPHK - small interfering РНК или малые интерферирующие РНК), являющимся эффекторами РНК-интерференции [2-4]. siPHK вызывают специфичную по последовательности деградацию мРНК гомологичных им генов, поэтому широко применяются в функциональной геномике для поиска генов, вовлеченных в такие основополагающие клеточные процессы, как дифференцировка, апоптоз, физиологические процессы (метаболизм жиров), а также генов, определяющих клеточную морфологию [5]. Любой ген может выступать в роли потенциальной мишени, поэтому перспектива использования siPHK в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых [6], нейродегенеративных заболеваний [7, 8], вирусных инфекций [9] является многообещающей. В настоящее время проводятся клинические испытания ряда препаратов на основе siPHK [10, 11], однако широкое применение siPHK в терапии не представляется возможным из-за низкой эффективности РНК-интерференции in vivo, связанной с неэффективной доставкой siPHK в клетки, высокой чувствительностью к действию нуклеаз, а также недостаточно эффективным действием самих siPHK. Химическая модификация и модификация структуры siPHK-дуплексов позволяет улучшить интерферирующие свойства siPHK, однако использование данных подходов ограничено зависимостью активности siPHK от числа, расположения и типа модификаций в ее структуре. Таким образом, исследования, направленные на оптимизацию дизайна siPHK с помощью подходов химической и структурной модификаций, являются актуальными.
Целью настоящей работы являлось исследование влияния химических модификаций и модификаций структуры дуплекса siPHK, направленных к мРНК гена MDR1, на эффективность и длительность их действия, а также на способность проникать в клетки. В ходе исследования решались следующие задачи:
1. Исследовать влияние количества и положения 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов в составе siPHK на ее нуклеазоустойчивость, интерферирующую активность и длительность ингибирующего действия.
2. Исследовать влияние нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных siPHK на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия.
3. Исследовать влияние липофильных модификаций, введенных на 5'-конец смысловой цепи э^НК, на эффективность их проникновения в раковые клетки, эффективность и длительность ингибирующего действия.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Петрова, Наталья Сергеевна
Выводы
Исследованы способы оптимизации структуры малых интерферирующих РНК ^¡РНК), направленных к мРНК гена МОт, за счет введения в их состав 2'-0-метильных аналогов нуклеотидов, остатков липофильных молекул, а также нуклеотидных замен, приводящих к образованию неканонических пар или неспаренных оснований.
1. Показано, что 2-О-метильные аналоги нуклеотидов, расположенные в нуклеазочувствительных сайтах дуплекса э!РНК, не изменяют ее интерферирующую активность, защищают от деградации нуклеазами эмбриональной бычьей сыворотки и увеличивают длительность ингибирования экспрессии гена-мишени по сравнению с немодифицированной в!РНК такой же последовательности с 4 до 6 дней.
2. Исследовано влияние количества и расположения нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных э1РНК на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия и показано, что:
- замена четырех нуклеотидов на З'-конце смысловой цепи 51РНК, приводящая к образованию «мисматчей», увеличивает эффективность подавления экспрессии гена-мишени до 3 раз и снижает уровень Р-гликопротеина (продукта гена МйШ) до 1.8 раза;
- введение трех нуклеотидных замен в центральную часть дуплекса, приводящее к образованию С1)-пар, способствует двукратному увеличению эффективности подавления экспрессии гена-мишени и снижению уровня Р-гликопротеина;
- селективная модификация нуклеазочувствительных сайтов в составе эРИК, имеющих структуру «вилки», существенно увеличивает длительность их ингибирующего действия, что позволило впервые получить эРИК, способные снижать экспрессию гена-мишени в клетках в течение 15 суток после однократной трансфекции.
3. Выполнен анализ способности липофильных производных селективно модифицированных э1РНК проникать в клетки без использования трансфектанта и подавлять экспрессию гена МОИ1. Показано, что:
- эффективность накопления липофильных производных э1РНК в клетках уменьшается в зависимости от типа липофильной молекулы в ряду холестерин > олеиламид литохолевой кислоты > литохолевая кислота ^ олеиловый спирт и значительно увеличивается при удлинении алифатического линкера между эРНК и липофильным остатком от 0 до 12 атомов углерода;
- холестерин-содержащая э1РНК с аминогексильным линкером эффективно проникает в клетки без использования трансфектанта, ингибирует экспрессию гена-мишени, снижая количество Р-гликопротеина на 4 - 6 сутки инкубации в 2 - 3 раза, и восстанавливает чувствительность раковых клеток к ранее переносимой концентрации 'цитостатика.
1.4 Заключение
Малые интерферирующие РНК не обладают оптимальными свойствами для использования их в качестве терапевтических препаратов в условиях in vivo, поэтому разработка и оптимизация подходов, направленных на улучшение свойств siPHK, актуальна. Одним из широко используемых подходов является введение химических модификаций в структуру дуплекса. Данный подход изначально был предложен для решения проблемы высокой чувствительности siPHK к рибонуклеазам сыворотки и клеток [68], что приводит к снижению эффективности и времени действия препарата [67].
Поскольку активность siPHK зависит от числа, типа и расположения модификаций в составе дуплекса [74, 80, 144, 191], то увеличение их нуклеазоустойчивости с помощью химических модификаций, не приводящее к снижению интерферирующей активности, является сложной задачей. Несмотря на множество работ, выполненных в данной области, универсальный алгоритм, позволяющий получать активные нуклеазоустойчивые аналоги siPHK, пока не разработан.
Подход химической модификации siPHK также может быть использован при разработке систем доставки малых интерферирующих РНК в клетки. Как известно, молекула siPHK в «свободном» виде не способна эффективно проникать через мембрану клеток. Кроме того, небольшой размер молекулы способствует ее быстрому выведению из кровотока [62, 63]. То есть, системы доставки в условиях ¡n vivo должны обеспечивать: эффективность, специфичность доставки, длительность действия siPHK после введения, а также, безопасность доставки, возможность системного введения и масштабной наработки. На сегодняшний день не существует систем доставки, сочетающих в себе все перечисленные характеристики.
С другой стороны, низкая эффективность РНК-интерференции также может быть связана с «неблагоприятным» контекстом ее последовательности, определяющим термодинамические свойства, а также с наличием вторичных структур на участке связывания с мРНК-мишенью [44, 45, 57, 58, 60]. Существует множество алгоритмов отбора высокоэффективных siPHK-дуплексов [176, 192-196], однако однозначно определить, будет ли данная siPHK проявлять высокую интерферирующую активность в условиях in vivo, зачастую, невозможно. Кроме того, при ингибировании химерных или мутантных генов ограниченность выбора участка последовательности-мишени, не позволяет воспользоваться данными алгоритмами для выбора последовательности siPHK. С этой точки зрения интерес представляют структурные модификации siPHK, позволяющие улучшить их термодинамические свойства. Использование «вилкоподобных» siPHK [166, 167, 175], способных более эффективно ингибировать экспрессию гена-мишени по сравнению с вариантами «классической» структуры, является перспективным подходом для создания высокоэффективных siPHK, направленных к любой последовательности гена-мишени. Несмотря на это, количество работ в данной области ничтожно мало, поэтому дальнейшие исследования свойств и потенциала структурных модификаций siPHK являются актуальными.
Для получения высокоэффективных siPHK зачастую требуется оптимизация нескольких параметров дуплекса, поэтому использование модификаций структуры siPHK в совокупности с химическими модификациями является перспективным подходом. Таким образом, дальнейшие исследования в сфере использования химически и / или структурно модифицированных siPHK, а также разработка и оптимизация алгоритмов для модификации являются актуальными.
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы
В работе использовали: агарозу, акриламид, ксиленцианол («Serva», Германия); N-N'-метиленбисакриламид, мочевину, персульфат аммония, ТЕМЕД, ЭДТА, «Stains-all», винбластин, имидазол, борную кислоту фирмы «MP Biomedicals» (CUJA); перхлорат лития, формамид, Трис, цианборгидрид натрия («Fluka», Швейцария); флуоресцеинизотиоцианат изомер I (FITC I), формальдегид, этилендиамин, МТТ, бромфенол и бромистый этидий, сапонин, SDS, буфер для лизиса («Sigma», США); ацетонитрил («Криохим», Россия), перегнанные ацетон, этанол и ДМСО («Реахим», Россия); красители: «DAPI/Antifade» и Родамин-Фаллоидин («Millipore», США); культуральные среды DMEM, IMDM, Opti-Mem; трипсин, эмбриональную бычью сыворотку (FBS), антибиотики, PBS; трансфекционные агенты Липофектамин 2000 (далее по тексту, Липофектамин) и Олигофектамин, обезжиренное сухое молоко, моноклональные антитела мыши к Р-гликопротеину и ß-актину человека, поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные' со щелочной фосфатазой и антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуоресцеином («Invitrogen», США); субстрат для щелочной фосфатазы («Promega», США);, набор для выделения плазмид ' «Gene Elute™ Plasmid Maxiprep Kit» («Sigma», США); LB среду и LB агар готовили из таблетированного концентрата фирмы «Sigma» (США) и стерилизовали автоклавированием.
Ферменты Т4 полинуклеотид-киназа, РНКаза Т1, рестрикгаза Mboll («Fermentas», Литва); буфер для рестрикции, маркер молекулярного веса ДНК 100 - 1000 п.н. фирмы «СибЭнзим» (Россия).
В работе была использованы плазмида pEBFP-N1 фирмы «Clontech» (США), а также плазмида pEGFP/MDR1, сконструированная ранее в Лаборатории Биохимии Нуклеиновых Кислот ИХБФМ СО РАН. [у32Р]АТР был синтезирован в Лаборатории Биотехнологии ИХБФМ СО РАН.
2.1.2 Оборудование
ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе «Alliance» фирмы «Waters» (США), используя колонку «Nova-Pak С - 18 4 мкм» 3.9x150 мм. В работе использовали флуоресцентный микроскоп «Axioskop 2 Plus», оснащенный CCD-камерой, и конфокальный микроскоп "LSM 510 Meta" фирмы «Carl Zeiss» (Германия); инвертированный микроскоп Биолам П2-1 фирмы "ЛОМО" (Россия); проточный цитофлуориметр «Cytomics FC500» («Beckman Coulter», США); прибор для полусухого электропереноса ("Hoefer", США); многоканальный спектрофотометр «Multiscan RC» фирмы "Thermo LabSystems" (Финляндия); спектрофотометр «BioMate 3» фирмы "Thermo" (США). Также использовали вакуумную сушку для гелей фирмы «Labconco» (США), вакуумный концентратор Concentrator 5301 фирмы «Eppendorf» (Германия), качалку термостатированную KT 104 «Медиген» (Россия),'термостат «Бис» фирмы «ООО Бис-Н» (Россия), центрифуги "MiniSpin Plus Eppendorf" 5453 R и 5810 R ("Eppendorf", Германия), а также "Contron Т42К" ("Centricon Instruments", Италия); рН-метр фирмы "Orion 41 OA" (США). Фотографии гелей были сделаны с помощью системы для документации гелей «Bio-Vision» («Vilber Lourmat», Франция). Для работы с радиоактивно-мечеными олигонуклеотидами использовали счетчик радиоактивности ("Canberra Packard", США) и фосфороимаджер "Molecular Imager FX" ("Bio-Rad", США). Все растворы готовили с использованием воды, очищенной на установке MilliQ фирмы «MilliPore» (США). В работе использовали культуральный пластик фирмы "Costar" (США).
2.1.3 Клеточные линии
Клетки линий НЕК 293 (эмбриональные клетки почки человека), HepG2 (карцинома печени человека) и SC-1 (фибробласты мыши) были получены из банка клеточных культур Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки линии КВ-8-5 (цервикальная карцинома человека - производное линии HeLa), обладающие фенотипом множественной лекарственной устойчивости [Fojo, 1987 #194;Fojo, 1985 #195] и способные расти в присутствии 300 нМ винбластина, были любезно предоставлены профессором М. Gottesman (NIH, США). Клетки культивировали в среде DMEM или IMDM, содержащей 10%-ную FBS, антибиотики (100 ед./мл пенициллина, 0.1 мкг/мл стрептомицина) и антимикотик (0.25 мкг/мл амфотерицина), в атмосфере 5 %-ного С02 при 37 °С. Клетки пересевали раз в 3 - 4 дня для поддержания экспоненциального роста. Для наблюдения за клетками использовали инвертированный микроскоп.
Клетки Escerichia coli штамм DH5a были любезно предоставлены д.б.н. С.Н. Ходыревой.
2.1.4 Олигорибонуклеотиды и siPHK, использованные в работе
Олигорибонуклеотиды (смысловые и антисмысловые цепи siPHK) были синтезированы в Лаборатории Химии РНК (ЛХР) ИХБФМ СО РАН фосфитамидным методом [401] на автоматическом синтезаторе. Для синтеза антисмысловых цепей siPHK, содержащих З'-аминогексильный линкер, использовали З'-PT-amino-modifier С6 CPG (GlenResearch, США). Выделение целевых продуктов проводили с помощью препаративного гель-электрофореза в 20 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, с последующей элюцией продуктов 0.3 М раствором NaCI04. Выделенные продукты обессоливали на картридже «Tet-Pac С18» фирмы «Waters» и осаждали 2 %-ным раствором NaCI04 в ацетоне. Введение липофильный остатков проводили Н-фосфонатным методом, используя полимер-связанный олигонуклеотид и Н-фосфонаты липофильных соединений [197]. В отдельной серии экспериментов 5'-холестериновые производные смысловых цепей з1РНК были синтезировали в растворе, исходя из 5'-фосфатсодержащего олигонуклеотида и (3-аланинового эфира холестерина по аналогии с [198]. Выделение проводили методом гель-электрофореза в 20 %-ном ПААГ в денатурирующих условиях, олигонуклеотиды элюировали 0.3 М раствором ЫаОАс (рН 4.8) с добавлением 0.1 %-ного ЭРБ и осаждали этанолом. Синтез и выделение проведено к.х.н. Мещаниновой М.И. Последовательности в1РНК приведены в таблице 6.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Петрова, Наталья Сергеевна, Новосибирск
1. Fire A., Xu S„ Montgomery M. К., Kostas S. A., Driver S. E. and Mello С. C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811.
2. Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K. and Tuschl T. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411,494-498.
3. Hammond S. M., Bernstein E., Beach D. and Hannon G. J. (2000) An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404, 293-296.
4. Zamore P. D., Tuschl Т., Sharp P. A. and Bartel D. P. (2000) RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 101, 25-33.
5. Dorsett Y. and Tuschl T. (2004) siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329.
6. Izquierdo M. (2005) Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 12, 217-227.
7. Liu B. W., Goto J., Wang Y. L., Murata M., Wada K. and Kanazawa I. (2003) Specific inhibition of Huntington's disease gene expression by siRNAs in cultured cells. Proc. Japan Acad. 79, 293-298.
8. Исламов P. P., Ризванов А. А., Гусева Д. С. and Киясов А. П. (2007) Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2, 29-37.
9. Morris К. V. and Rossi J. J. (2006) Antiviral applications of RNAi. Curr Opin Mol Ther. 8, 115-121.
10. Chen S. H. and Zhaori G. (2010) Potential clinical applications of siRNA technique: benefits and limitations. Eur J Clin Invest
11. Lares M. R., Rossi J. J. and Ouellet D. L. (2010) RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications. Trends Biotechnol. 28, 570-579.
12. Bosher J. M. and Labouesse M. (2000) RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol. 2, E31-36.
13. Sharp P. A. (1999) RNAi and double-strand RNA. Genes Dev. 13, 139-141.
14. Vaucheret H. and Fagard M. (2001) Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators. Trends Genet. 17, 29-35.
15. Aigner A. (2006) Gene silencing through RNA interference (RNAi) in vivo: strategies based on the direct application of siRNAs. J Biotechnol. 124, 12-25.
16. Aronin N. (2006) Target selectivity in mRNA silencing. Gene Ther. 13, 509-516.
17. Hannon G. J. (2002) RNA interference. Nature. 418, 244-251.
18. Hutvagner G. (2005) Small RNA asymmetry in RNAi: function in RISC assembly and gene regulation. FEBS Lett. 579, 5850-5857.
19. Rana T. M. (2007) Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 23-36.
20. Hohjoh H. (2002) RNA interference (RNA(i)) induction with various types of synthetic oligonucleotide duplexes in cultured human cells. FEBS Lett. 521, 195-199.
21. Manche L., Green S. R., Schmedt C. and Mathews M. B. (1992) Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol Cell Biol. 12, 5238-5248.
22. Chiu Y. L., Ali A., Chu C. Y., Cao H. and Rana T. M. (2004) Visualizing a correlation between siRNA localization, cellular uptake, and RNAi in living cells. Chem Biol. 11, 1165-1175.
23. Elbashir S. M., Harborth J., Weber K. and Tuschl T. (2002) Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods. 26, 199-213.
24. Paddison P. J., Caudy A. A. and Hannon G. J. (2002) Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1443-1448.
25. Preall J. B. and Sontheimer E. J. (2005) RNAi: RISC gets loaded. Cell. 123, 543-545.
26. Chendrimada T. P., Gregory R. I., Kumaraswamy E., Norman J., Cooch N., Nishikura K. and Shiekhattar R. (2005) TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature. 436, 740-744.
27. Tomari Y., Matranga C., Haley B., Martinez N. and Zamore P. D. (2004) A protein sensor for siRNA asymmetry. Science. 306, 1377-1380.
28. Ma J. B., Ye K. and Patel D. J. (2004) Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature. 429, 318-322.
29. Zhang H., Kolb F. A., Brondani V., Billy E. and Filipowicz W. (2002) Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP. Embo J. 21, 58755885.
30. Grunweller A. and Hartmann R. K. (2005) RNA interference as a gene-specific approach for molecular medicine. Curr Med Chem. 12, 3143-3161.
31. Kini H. K. and Walton S. P. (2009) Effect of siRNA terminal mismatches on TRBP and Dicer binding and silencing efficacy. FEBS J. 276, 6576-6585.
32. Liu X., Jiang F., Kalidas S., Smith D. and Liu Q. (2006) Dicer-2 and R2D2 coordinately bind siRNA to promote assembly of the siRISC complexes. Rna. 12, 1514-1520.
33. Hutvagner G. and Simard M. J. (2008) Argonaute proteins: key players in RNA silencing. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 22-32.
34. Song J. J., Smith S. K., Hannon G. J. and Joshua-Tor L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science. 305, 1434-1437.
35. Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M. and Hannon G. J. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409, 363-366.
36. Ma J. B., Yuan Y. R., Meister G., Pei Y., Tuschl T. and Patel D. J. (2005) Structural basis for 5-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein. Nature. 434, 666670.
37. Parker J. S., Roe S. M. and Barford D. (2005) Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature. 434, 663-666.
38. Rivas F. V., Tolia N. H., Song J. J., Aragon J. P., Liu J., Hannon G. J. and Joshua-Tor L. (2005) Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol. 12, 340-349.
39. Meister G. and Tuschl T. (2004) Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349.
40. Nykanen A., Haley B. and Zamore P. D. (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell. 107, 309-321.
41. Leuschner P. J., Ameres S. L., Kueng S. and Martinez J. (2006) Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells. EMBO Rep. 7, 314-320.
42. Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D. P. and Zamore P. D. (2005) Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell. 123, 607-620.
43. Khvorova A., Reynolds A. and Jayasena S. D. (2003) Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 115, 209-216.
44. Schwarz D. S., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N. and Zamore P. D. (2003) Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell. 115, 199-208.
45. Haley B. and Zamore P. D. (2004) Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol. 11, 599-606.
46. Elbashir S. M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W. and Tuschl T. (2001) Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Embo J. 20, 6877-6888.
47. Liu J., Carmell M. A., Rivas F. V., Marsden C. G., Thomson J. M., Song J. J., Hammond S. M., Joshua-Tor L. and Hannon G. J. (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science. 305, 1437-1441.
48. Braasch D. A. and Corey D. R. (2002) Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry. 41, 4503-4510.
49. Bertrand J. R., Pottier M., Vekris A., Opolon P., Maksimenko A. and Malvy C. (2002) Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 296, 1000-1004.
50. Elbashir S. M., Lendeckel W. and Tuschl T. (2001) RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188-200.
51. Chu C. Y. and Rana T. M. (2006) Translation repression in human cells by microRNA-induced gene silencing requires RCK/p54. PLoS Biol. 4, e210.
52. Jakymiw A., Pauley K. M., Li S., Ikeda K., Lian S., Eystathioy T., Satoh M., Fritzier M. J. and Chan E. K. (2007) The role of GW/P-bodies in RNA processing and silencing. J Cell Sci. 120, 1317-1323.
53. Chalk A. M., Wahlestedt C. and Sonnhammer E. L. (2004) Improved and automated prediction of effective siRNA. Biochem Biophys Res Commun. 319, 264-274.
54. Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W. S. and Khvorova A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 22, 326-330.
55. Brown K. M., Chu C. Y. and Rana T. M. (2005) Target accessibility dictates the potency of human RISC. Nat Struct Mol Biol. 12, 469-470.
56. Gredell J. A., Berger A. K. and Walton S. P. (2008) Impact of target mRNA structure on siRNA silencing efficiency: A large-scale study. Biotechnol Bioeng. 100, 744-755.
57. Holen T., Amarzguioui M., Wiiger M. T., Babaie E. and Prydz H. (2002) Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res. 30, 1757-1766.
58. Westerhout E. M. and Berkhout B. (2007) A systematic analysis of the effect of target RNA structure on RNA interference. Nucleic Acids Res. 35, 4322-4330.
59. Amarzguioui M., Brede G., Babaie E., Grotli M., Sproat B. and Prydz H. (2000) Secondary structure prediction and in vitro accessibility of mRNA as tools in the selection of target sites for ribozymes. Nucleic Acids Res. 28, 4113-4124.
60. Braasch D. A., Paroo Z., Constantinescu A., Ren G., Oz O. K., Mason R. P. and Corey D. R. (2004) Biodistribution of phosphodiester and phosphorothioate siRNA. Bioorg Med Chem Lett. 14, 1139-1143.
61. Chiu Y. L. and Rana T. M. (2003) siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis. Rna. 9, 1034-1048.
62. Czauderna F., Fechtner M., Dames S., Aygun H., Klippel A., Pronk G. J., Giese K. and Kaufmann J. (2003) Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31, 2705-2716.
63. Haupenthal J., Baehr C., Kiermayer S., Zeuzem S. and Piiper A. (2006) Inhibition of RNAse A family enzymes prevents degradation and loss of silencing activity of siRNAs in serum. Biochem Pharmacol. 71, 702-710.
64. Turner J. J., Jones S. W., Moschos S. A., Lindsay M. A. and Gait M. J. (2007) MALDI-TOF mass spectral analysis of siRNA degradation in serum confirms an RNAse A-like activity. Mol Biosyst. 3, 43-50.
65. White P. J. (2008) Barriers to successful delivery of short interfering RNA after systemic administration. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 1371-1376.
66. Raemdonck K., Remaut K., Lucas B., Sanders N. N., Demeester J. and De Smedt S. C. (2006) In situ analysis of single-stranded and duplex siRNA integrity in living cells. Biochemistry. 45, 10614-10623.
67. Kim D. H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E. and Rossi J. J. (2004) Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase. Nat Biotechnol. 22, 321325.
68. Corey D. R. (2007) Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? J Clin Invest. 117, 3615-3622.
69. Watts J. K., Deleavey G. F. and Damha M. J. (2008) Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today. 13, 842-855.
70. Bartlett D. W. and Davis M. E. (2006) Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34, 322-333.
71. Bartlett D. W. and Davis M. E. (2007) Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnol Bioeng. 97, 909-921.
72. Layzer J. M., McCaffrey A. P., Tanner A. K„ Huang Z., Kay M. A. and Sullenger B. A. (2004) In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. RNA. 10, 766-771.
73. Parrish S., Fleenor J., Xu S., Mello C. and Fire A. (2000) Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Mol Cell. 6, 1077-1087.
74. Manoharan M. (2004) RNA interference and chemically modified small interfering RNAs. Curr Opin Chem Biol. 8, 570-579.
75. Choung S., Kim Y. J., Kim S„ Park H. O. and Choi Y. C. (2006) Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy. Biochem Biophys Res Commun. 342, 919-927.
76. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R. and Tuschl T. (2002) Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110, 563-574.
77. Schwarz D. S., Hutvagner G., Haley B. and Zamore P. D. (2002) Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol Cell. 10, 537548.
78. Findlay D., Herries D. G., Mathias A. P., Rabin B. R. and Ross C. A. (1962) The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease. 7. The catalytic mechanism. Biochem J. 85, 152-153.
79. Judge A. D., Bola G., Lee A. C. and MacLachlan I. (2006) Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo. Mol Ther. 13, 494-505.
80. Robbins M., Judge A., Liang L., McClintock K., Yaworski E. and MacLachlan I. (2007) 2'-O-methyl-modified RNAs act as TLR7 antagonists. Mol Ther. 15, 1663-1669.
81. Judge A. and MacLachlan I. (2008) Overcoming the innate immune response to small interfering RNA. Hum Gene Ther. 19, 111-124.
82. Takeda K. and Akira S. (2005) Toll-like receptors in innate immunity. Int Immunol. 17, 114.
83. Braasch D. A., Jensen S., Liu Y., Kaur K., Arar K., White M. A. and Corey D. R. (2003) RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA. Biochemistry. 42, 79677975.
84. Kraynack B. A. and Baker B. F. (2006) Small interfering RNAs containing full 2-0-methylribonucleotide-modified sense strands display Argonaute2/elF2C2-dependent activity. RNA. 12, 163-176.
85. Muhonen P., Tennila T., Azhayeva E., Parthasarathy R. N., Janckila A. J., Vaananen H. K., Azhayev A. and Laitala-Leinonen T. (2007) RNA interference tolerates 2'-fluoro modifications at the Argonaute2 cleavage site. Chem Biodivers. 4, 858-873.
86. Amarzguioui M., Holen T., Babaie E. and Prydz H. (2003) Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA. Nucleic Acids Res. 31, 589-595.
87. Dorn G., Patel S., Wotherspoon G., Hemmings-Mieszczak M., Barclay J., Natt F. J., Martin P., Bevan S., Fox A., Ganju P., Wishart W. and Hall J. (2004) siRNA relieves chronic neuropathic pain. Nucleic Acids Res. 32, e49.
88. Chen X., Shen L. and Wang J. H. (2004) Poly-2'-DNP-RNAs with enhanced efficacy for inhibiting cancer cell growth. Oligonucleotides. 14, 90-99.
89. Liao H. and Wang J. H. (2005) Biomembrane-permeable and Ribonuclease-resistant siRNA with enhanced activity. Oligonucleotides. 15, 196-205.
90. Ashun M. A., Hu Y., Kang I., Li C. C. and Wang J. H. (1996) Inhibition of murine leukemia virus with poly-2'-0-(2,4-dinitrophenyl)polyA., Antimicrob Agents Chemother. 40, 2311-2317.
91. De Mesmaeker A., Altmann K. H., Waldner A. and Wendeborn S. (1995) Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems. Curr Opin Struct Biol. 5, 343-355.
92. Inoue H., Hayase Y., Imura A., Iwal S., Miura K. and Ohtsuka E. (1987) Synthesis and hybridization studies on two complementary nona(2'-0-methyl)ribonucleotides. Nucleic Acids Res. 15, 6131-6148.
93. Hoshika S., Minakawa N., Kamiya H., Harashima H. and Matsuda A. (2005) RNA interference induced by siRNAs modified with 4'-thioribonucleosides in cultured mammalian cells. FEBS Lett. 579, 3115-3118.
94. Hoshika S., Minakawa N., Shionoya A., Imada K., Ogawa N. and Matsuda A. (2007) Study of modification pattern-RNAi activity relationships by using siRNAs modified with 4'-thioribonucleosides. Chembiochem. 8, 2133-2138.
95. Braasch D. A. and Corey D. R. (2001) Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7.
96. Hornung V., Guenthner-Biller M., Bourquin C., Ablasser A., Schlee M., Uematsu S., Noronha A., Manoharan M., Akira S., de Fougerolles A., Endres S. and Hartmann G. (2005)
97. Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Med. 11, 263-270.
98. Mook O. R., Baas F., de Wissel M. B. and Fluiter K. (2007) Evaluation of locked nucleic acid-modified small interfering RNA in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 6, 833-843.
99. Bramsen J. B., Laursen M. B., Damgaard C. K., Lena S. W., Babu B. R., Wengel J. and Kjems J. (2007) Improved silencing properties using small internally segmented interfering RNAs. Nucleic Acids Res. 35, 5886-5897.
100. Kozlov I. A., Zielinski M., Allart B., Kerremans L., Van Aerschot A., Busson R., Herdewijn P. and Orgel L. E. (2000) Nonenzymatic template-directed reactions on altritol oligomers, preorganized analogues of oligonucleotides. Chemistry. 6, 151-155.
101. Fisher M., Abramov M., Van Aerschot A., Xu D., Juliano R. L. and Herdewijn P. (2007) Inhibition of MDR1 expression with altritol-modified siRNAs. Nucleic Acids Res. 35, 1064-1074.
102. Langkjaer N., Pasternak A. and Wengel J. (2009) UNA (unlocked nucleic acid): a flexible RNA mimic that allows engineering of nucleic acid duplex stability. Bioorg Med Chem. 17, 54205425.
103. Werk D., Wengel J., Wengel S. L., Grunert H. P., Zeichhardt H. and Kurreck J. (2010) Application of small interfering RNAs modified by unlocked nucleic acid (UNA) to inhibit the heart-pathogenic coxsackievirus B3. FEBS Lett. 584, 591-598.
104. Brown S. C., Thomson S. A., Veal J. M. and Davis D. G. (1994) NMR solution structure of a peptide nucleic acid complexed with RNA. Science. 265, 777-780.
105. Demidov V. V., Potaman V. N., Frank-Kamenetskii M. D., Egholm M., Buchard O., Sonnichsen S. H. and Nielsen P. E. (1994) Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. Biochem Pharmacol. 48, ,1310-1313.
106. Potenza N., Moggio L., Milano G., Salvatore V., Di Blasio B., Russo A. and Messere A. (2008) RNA interference in mammalia cells by RNA-3'-PNA chimeras. Int J Mol Sci. 9, 299-315.
107. Hall A. H., Wan J., Shaughnessy E. E., Ramsay Shaw B. and Alexander K. A. (2004) RNA interference using boranophosphate siRNAs: structure-activity relationships. Nucleic Acids Res. 32, 5991-6000.
108. Schwarz D. S., Tomari Y. and Zamore P. D. (2004) The RNA-induced silencing complex is a Mg2+-dependent endonuclease. Curr Biol. 14, 787-791.
109. Lee M., Simon A. D., Stein C. A. and Rabbani L. E. (1999) Antisense strategies to inhibit restenosis. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9, 487-492.
110. Prakash T. P., Kraynack B., Baker B. F., Swayze E. E. and Bhat B. (2006) RNA interference by 2',5'-linked nucleic acid duplexes in mammalian cells. Bioorg Med Chem Lett. 16, 3238-3240.
111. Iwase R., Toyama T. and Nishimori K. (2007) Solid-phase synthesis of modified RNAs containing amide-linked oligoribonucleosides at their 3'-end and their application to siRNA. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 26, 1451-1454.
112. Saenger W. (1984) Forces stabilizing association between bases: Hydrogen bonding and base stacking. In Principle of nucleic acids structure. Springer-Verlag, New York
113. Agris P. F., Sierzputowska-Gracz H., Smith W., Malkiewicz A., Sochacka E. and Nawrot B. (1992) Thiolation of uridine carbon-2 restricts the motional dynamics of the transfer RNA wobble position nucleoside. J. Am. Chem. Soc. 114, 2652-2656.
114. Davis D. R., Veltri C. A. and Nielsen L. (1998) An RNA model system for investigation of pseudouridine stabilization of the codon-anticodon interaction in tRNALys, tRNAHis and tRNATyr. J Biomol Struct Dyn. 15, 1121-1132.
115. Sipa K., Sochacka E., Kazmierczak-Baranska J., Maszewska M., Janicka M., Nowak G. and Nawrot B. (2007) Effect of base modifications on structure, thermodynamic stability, and gene silencing activity of short interfering RNA. RNA. 13, 1301-1316.
116. Chen P. Y., Weinmann L., Gaidatzis D., Pei Y., Zavolan M., Tuschl T. and Meister G. (2008) Strand-specific 5'-0-methylation of siRNA duplexes controls guide strand selection and targeting specificity. RNA. 14, 263-274.
117. Lorenz C., Hadwiger P., John M., Vornlocher H. P. and Unverzagt C. (2004) Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells. Bioorg Med Chem Lett. 14, 4975-4977.
118. Thomas M., Kularatne S. A., Qi L., Kleindl P., Leamon C. P., Hansen M. J. and Low P. S. (2009) Ligand-targeted delivery of small interfering RNAs to malignant cells and tissues. Ann N Y Acad Sei. 1175, 32-39.
119. Muratovska A. and Eccles M. R. (2004) Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells. FEBS Lett. 558, 63-68.
120. McNamara J. O., 2nd, Andrechek E. R., Wang Y., Viles K. D„ Rempel R. E., Gilboa E., Sullenger B. A. and Giangrande P. H. (2006) Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015.
121. Chiu Y. L. and Rana T. M. (2002) RNAi in human cells: basic structural and functional features of small interfering RNA. Mol Cell. 10, 549-561.
122. De Paula D., Bentley M. V. and Mahato R. I. (2007) Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting. Rna. 13, 431-456.
123. Gaglione M. and Messere A. (2010) Recent progress in chemically modified siRNAs. Mini Rev Med Chem. 10, 578-595.
124. Burnett J. R. and Barrett P. H. (2002) Apolipoprotein B metabolism: tracer kinetics, models, and metabolic studies. Crit Rev Clin Lab Sci. 39, 89-137.
125. Feinberg E. H. and Hunter C. P. (2003) Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science. 301, 1545-1547.
126. Potocky T. B., Menon A. K. and Gellman S. H. (2003) Cytoplasmic and nuclear delivery of a TAT-derived peptide and a beta-peptide after endocytic uptake into HeLa cells. J Biol Chem. 278, 50188-50194.
127. Richard J. P., Melikov K., Vives E., Ramos C., Verbeure B., Gait M. J., Chernomordik L. V. and Lebleu B. (2003) Cell-penetrating peptides. A réévaluation of the mechanism of cellular uptake. J Biol Chem. 278, 585-590.
128. Hicke B. J. and Stephens A. W. (2000) Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy. J Clin Invest. 106, 923-928.
129. Xia C. F., Boado R. J. and Pardridge W. M. (2009) Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology. Mol Pharm. 6, 747-751.
130. Xia C. F., Zhang Y., Boado R. J. and Pardridge W. M. (2007) Intravenous siRNA of brain cancer with receptor targeting and avidin-biotin technology. Pharm Res. 24, 2309-2316.
131. Xia W. and Low P. S. Folate-targeted therapies for cancer. (2010) J Med Chem. 53, 6811-6824.
132. Zhang K., Wang Q., Xie Y., Mor G., Sega E., Low P. S. and Huang Y. (2008) Receptor-mediated delivery of siRNAs by tethered nucleic acid base-paired interactions. RNA. 14, 577583.
133. Jeong J. H., Mok H„ Oh Y. K. and Park T. G. (2009) siRNA conjugate delivery systems. Bioconjug Chem. 20, 5-14.
134. Kawakami S. and Hashida M. (2007) Targeted delivery systems of small interfering RNA by systemic administration. Drug Metab Pharmacokinet. 22, 142-151.
135. Leng Q., Woodle M. C., Lu P. Y. and Mixson A. J. (2009) Advances in Systemic siRNA Delivery. Drugs Future. 34, 721.
136. Lv H., Zhang S., Wang B., Cui S. and Yan J. (2006) Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release. 114, 100-109.
137. Blidner R. A., Hammer R. P., Lopez M. J., Robinson S. O. and Monroe W. T. (2007) Fully 2'-deoxy-2'-fluoro substituted nucleic acids induce RNA interference in mammalian cell culture. Chem Biol Drug Des. 70, 113-122.
138. Macrae I. J., Zhou K., Li F., Repic A., Brooks A. N., Cande W. Z„ Adams P. D. and Doudna J. A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science. 311, 195-198.
139. Myers J. W., Jones J. T., Meyer T. and Ferrell J. E., Jr. (2003) Recombinant Dicer efficiently converts large dsRNAs into siRNAs suitable for gene silencing. Nat Biotechnol. 21, 324-328.
140. Hohjoh H. (2004) Enhancement of RNAi activity by improved siRNA duplexes. FEBS Lett. 557, 193-198.
141. Kubo Т., Zhelev Z., Ohba H. and Bakalova R. (2007) Modified 27-nt dsRNAs with dramatically enhanced stability in serum and long-term RNAi activity. Oligonucleotides. 17, 445464.
142. Rose S. D., Kim D. H., Amarzguioui M., Heidel J. D., Collingwood M. A., Davis M. E., Rossi J. J. and Behlke M. A. (2005) Functional polarity is introduced by Dicer processing of short substrate RNAs. Nucleic Acids Res. 33, 4140-4156.
143. Sano M., Sierant M., Miyagishi M., Nakanishi M., Takagi Y. and Sutou S. (2008) Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res. 36, 5812-5821.
144. Masquida B. and Westhof E. (2000) On the wobble GoU and related pairs. RNA. 6, 9-15.
145. Ding H., Liao G., Wang H. and Zhou Y. (2007) Asymmetrically designed siRNAs and shRNAs enhance the strand specificity and efficacy in RNAi. J RNAi Gene Silencing. 4, 269280.
146. Patzel V., Rutz S., Dietrich I., Koberle C., Scheffold A. and Kaufmann S. H. (2005) Design of siRNAs producing unstructured guide-RNAs results in improved RNA interference efficiency. Nat Biotechnol. 23, 1440-1444.
147. Ни X., Hipolito S., Lynn R., Abraham V., Ramos S. and Wong-Staal F. (2004) Relative gene-silencing efficiencies of small interfering RNAs targeting sense and antisense transcripts from the same genetic locus. Nucleic Acids Res. 32, 4609-4617.
148. Ohnishi Y., Tamura Y., Yoshida M., Tokunaga K. and Hohjoh H. (2008) Enhancement of allele discrimination by introduction of nucleotide mismatches into siRNA in allele-specific gene silencing by RNAi. PLoS One. 3, e2248.
149. Patzel V. (2007) In silico selection of active siRNA. Drug Discov Today. 12, 139-148. .
150. Lingel A., Simon В., Izaurralde E. and Sattler M. (2004) Nucleic acid З'-end recognition by the Argonaute2 PAZ domain. Nat Struct Mol Biol. 11, 576-577.
151. O'Toole A. S., Miller S., Haines N., Zink M. C. and Serra M. J. (2006) Comprehensive thermodynamic analysis of 3' double-nucleotide overhangs neighboring Watson-Crick terminal base pairs. Nucleic Acids Res. 34, 3338-3344.
152. Guo S. and Kemphues K. J. (1995) par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 81, 611-620.
153. Tijsterman M., Ketting R. F., Okihara K. L., Sijen T. and Plasterk R. H. (2002) RNA helicase MUT-14-dependent gene silencing triggered in C. elegans by short antisense RNAs. Science. 295, 694-697.
154. Amarzguioui M., Rossi J. J. and Kim D. (2005) Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981.
155. Kim D. H„ Behlke M. A., Rose S. D., Chang M. S., Choi S. and Rossi J. J. (2005) Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat Biotechnol. 23, 222226.
156. Reynolds A., Anderson E. M., Vermeulen A., Fedorov Y., Robinson K., Leake D., Karpilow J., Marshall W. S. and Khvorova A. (2006) Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. RNA. 12, 988-993.
157. Bridge A. J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A. L. and Iggo R. (2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet. 34, 263-264.
158. Persengiev S. P., Zhu X. and Green M. R. (2004) Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). Rna. 10, 12-18.
159. Sledz C. A., Holko M„ de Veer M. J., Silverman R. H. and Williams B. R. (2003) Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol. 5, 834-839.
160. Hornung V., Ellegast J., Kim S., Brzozka K., Jung A., Kato H., Poeck H., Akira S., Conzelmann K. K., Schlee M., Endres S. and Hartmann G. (2006) 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314, 994-997.
161. Judge A. D., Sood V., Shaw J. R., Fang D„ McClintock K. and MacLachlan I. (2005) Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotechnol. 23, 457-462.
162. Shukla S., Sumaria C. S. and Pradeepkumar P. I. (2010) Exploring chemical modifications for siRNA therapeutics: a structural and functional outlook. ChemMedChem. 5, 328-349.
163. Amarzguioui M. and Prydz H. (2004) An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun. 316, 1050-1058.
164. Matveeva O., Nechipurenko Y., Rossi L., Moore B., Saetrom P., Ogurtsov A. Y., Atkins J. F. and Shabalina S. A. (2007) Comparison of approaches for rational siRNA design leading to a new efficient and transparent method. Nucleic Acids Res. 35, e63.
165. Shabalina S. A., Spiridonov A. N. and Ogurtsov A. Y. (2006) Computational models with thermodynamic and composition features improve siRNA design. BMC Bioinformatics. 7, 65.
166. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi T., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R. and Saigo K. (2004) Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Res. 32, 936-948.
167. Walton S. P., Wu M., Gredell J. A. and Chan C. (2010) Designing highly active siRNAs for therapeutic applications. FEBS J. 277, 4806-4813.
168. Iglina A. A., Meschaninova M. I. and Venyaminova A. G. (2009) 5-Lipophilic conjugates of oligonucleotides as components of cell delivery systems. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 121122.
169. Пышный Д.В. П. И. А., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. (1995) Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. Биоорг. химия. 21, 709-716.
170. Volkov A. A., Kruglova N. S., Meschaninova М. I., Venyaminova A. G., Zenkova М. А., Vlassov V. V. and Chernolovskaya Е. L. (2009) Selective protection of nuclease-sensitive sites in siRNA prolongs silencing effect. Oligonucleotides. 19, 191-202.
171. Anthony V. and Skach W. R. (2002) Molecular mechanism of P-glycoprotein assembly into cellular membranes. Curr Protein Pept Sci. 3, 485-501.
172. Juliano R. L. and Ling V. (1976) A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta. 455, 152-162.
173. Gottesman M. M. and Pastan I. (1989) Clinical trials of agents that reverse multidrug-resistance. J Clin Oncol. 7, 409-411.
174. Зубова С.Г., Данилов А. О., Мышков А.И., Быкова Т.В., Зарицкий А.Ю. и Окулов В.Б. (2000) Ген mdr-1 и чувствительность клеток к различным воздействиям. Вопросы онкологии. 46, 199-201.
175. Logashenko Е. В., Vladimirova А. V., Repkova М. N., Venyaminova A. G., Chernolovskaya Е. L. and Vlassov V. V. (2004) Silencing of MDR 1 gene in cancer cells by siRNA. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 23, 861-866.
176. A. Volkov M. M., A. Venyaminova, E. Chernolovskaya, V. Vlassov (28 february 3 march 2006) Smart algorithm for chemical modified siRNAs. In Nucleic acids as targets and tools ed.)Aeds.). p. 21, Novosibirsk
177. Logashenko E. В., Vladimirova A. V. and Volkov A. A. (2006) Suppression of MDR1 gene expression by chemically modified siRNAs. Russian Chemical Bulletin, International Edition. 55 1275—1283.
178. Richert N. D„ Aldwin L., Nitecki D., Gottesman M. M. and Pastan I. (1988) Stability and covalent modification of P-glycoprotein in multidrug-resistant KB cells. Biochemistry. 27, 76077613.
179. Petriz J., Gottesman M. M. and Aran J. M. (2004) An MDR-EGFP gene fusion allows for direct cellular localization, function and stability assessment of P-glycoprotein. Curr Drug Deliv. 1,43-56.
180. Zenkov A. N., Scvortsova N. V., Chernolovskaya E. L., Pospelova Т. I. and Vlassov V. V. (2004) Expression of the MDR1 and MRP genes in patients with lymphoma with primary bone marrow involvement. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 23, 843-847.
181. Miller V. M., Xia H., Marrs G. L., Gouvion С. M., Lee G., Davidson B. L. and Paulson H. L. (2003) Allele-specific silencing of dominant disease genes. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7195-7200.
182. Vickers T. A., Koo S., Bennett C. F., Crooke S. Т., Dean N. M. and Baker B. F. (2003) Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. A comparative analysis. J Biol Chem. 278, 7108-7118.
183. Somoza A., Chelliserrykattil J. and Kool E. T. (2006) The roles of hydrogen bonding and sterics in RNA interference. Angew Chem Int Ed Engl. 45, 4994-4997.
184. Pan Y., Priyakumar U. D. and MacKerell A. D., Jr. (2005) Conformational determinants of tandem GU mismatches in RNA: insights from molecular dynamics simulations and quantum mechanical calculations. Biochemistry. 44, 1433-1443.
185. Varani G. and McClain W. H. (2000) The G x U wobble base pair. A fundamental building block of RNA structure crucial to RNA function in diverse biological systems. EMBO Rep. 1, 18-23.
186. Goldstein J. L„ Brown M. S., Anderson R. G., Russell D. W. and Schneider W. J. (1985) Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system. Annu Rev Cell Biol. 1, 1-39.
187. Duxbury M. S., Ashley S. W. and Whang E. E. (2005) RNA interference: a mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells. Biochem Biophys Res Commun. 331, 459-463.
188. Logashenko E. В., Chernolovskaya E. L., Vladimirova A. V., Repkova M. N., Ven'yaminova A. G. and Vlasov V. V. (2002) Short double-stranded RNA suppresses multiple drug resistance gene expression in tumor cells. Dokl Biochem Biophys. 386, 296-297.
189. Красовицкий Б.М. Б. Б. M. (1984) Органические люминофоры. М.: Химия.
190. Proudnikov D. and Mirzabekov А. (1996) Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. Nucleic Acids Res. 24, 4535-4542.
191. Havekes L. M„ De Wit E. С. M., HMG P. and (1987) Cellular free cholesterol in Hep G2 cells is only partially available for down-regulation of low-density-lipoprotein receptor activity. Biochem J 247, 739-746.
192. Hayashi K., Nimpf J. and Schneider W. J. (1989) Chicken oocytes and fibroblasts express different apolipoproteins-B-specific receptors. J Biol Chem. 264, 3131-3139.
193. Kambouris A. M., Roach P. D., Calvert G. D. and Nestel P. J. (1990) Retroendocytosis of high density lipoproteins by the human hepatoma cell line, HepG2. Arteriosclerosis. 10, 582590.
194. Neufeld E. F. and Fratantoni J. C. (1970) Inborn errors of mucopolysaccharide metabolism. Science. 169, 141-146.
195. Marsche G„ Frank S., Raynes J. G„ Kozarsky K. F., Sattler W. and Malle E. (2007) The lipidation status of acute-phase protein serum amyloid A determines cholesterol mobilization via scavenger receptor class B, type I. Biochem J. 402, 117-124.
196. Celis J. E., ed. (2006) Cell biology: a laboratory handbook. Elsevier Academic Press
197. Zabner J., Fasbender A. J., Moninger T., Poellinger K. A. and Welsh M. J. (1995) Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J Biol Chem. 270, 1899719007.
198. Kabilova T. O., Chernolovskaya E. L., Vladimirova A. V. and Vlassov V. V. (2006) Inhibition of Human Carcinoma and Neuroblastoma Cell Proliferation by Anti-c-myc siRNA. Oligonucleotides 16, 15-25.
199. Dominska M. and Dykxhoorn D. M. (2010) Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. J Cell Sci. 123, 1183-1189.
-
Петрова, Наталья Сергеевна
-
кандидата химических наук
-
Новосибирск, 2011
-
ВАК 03.01.04
- Влияние аналогов малых ядрышковых РНК на экспрессию генов человека
- Использование псевдовирусных векторов для поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов
- Изучение разнообразия и эволюции генов TAS3, кодирующих предшественники ta-siРНК у нецветковых наземных растений и особенности их экспрессии у некоторых покрытосеменных
- Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии
- Трансляционная активация генома некоторых фитовирусов в составе вириона или вирусного транспортного рибонуклеопротеида
