Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмиды клубеньковых бактерий люцерны: разнообразие, функции, стабильность

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Плазмиды клубеньковых бактерий люцерны: разнообразие, функции, стабильность"

« \ «Oft

су?- 1 Чч

Ч^ЙОЮЗНЫИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ \> СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

•Л^У" РАСХН

s--

На правах рукописи

РУМЯНЦЕВА Марина Львовна

ПЛАЗМИДЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ: разнообразие, функции, стабильность

Специальность 03.00.07. — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Ст.-Петербург).

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Б. В. Симаров.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник С. В. Каменева, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник А. А. Филатов.

Ведущее учреждение — кафедра микробиологии Ст.-Петербургского государственного университета.

<М5

Защита состоится « 9 » ^Э&К¿ьд^ЭЛ 1994 г. а 1.0 часов на заседании Специализированного совета К. 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Адрес: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин-8, нюссе Подбельского, Д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « &» 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Зарецкая

л%

■ » ' общая характеристика работы

Актуальность теш. Биологическая фиксация азота осуществляется клубеньковыми бактериями в симбиозе с бобовыми растениями. Для всех быстрорастущих видов ризобий показан высокий уровень разнообразия штампов в природных популяциях, в частности по плазмидноиу составу.

Гены, ответственные за становление эффективного симбиоза с бобовым растением, локализованы у ризобий преимущественно на Высокомолекулярной (до 1000 Мд) "симбиотической" плазмиде. Кроме Sym плаэмид в клетках бактерий выявляет до девяти плаз-, мид различной молекулярной массы (4,5-600 Мд>, получивших название криптических. Однако функциональная роль этих плаэмид не достаточно ясна. Для некоторых пгташов ризобий показано, что присутствие криптических плаэмид может влиять на жизнеспособность бактерий и/или определять их адаптационные способности (Hynee, HcGregor, 1990; Baldanl et al., 1992). Вместе с тем. приживаемость штампов в почве нередко зависит от их устойчивости к действию стрессовых экологических факторов (тешерату-ро~, солеустойчивость и т.д.). Кроне того, широко обсуждается роль растения-хозяина в качестве основного эколого-селективно-го фактора, влияющего на численность и структуру почвенных популяций ризобий (Young, 1S92).

Помимо вопроса о разнообразии штаммов клубеньковых бактерий всо большее внимание исследователей занимает вопрос генетической стабильности штаммов-инокулянтов и генетически модифицированных ризобий. До недавнего времени стабильность штаммов оценивали на основе учета признаков (антибиотико- и фагоустойчи-вость, серотипирование), не отражающих геномные перестройки, которые могли иметь место в процессе перевивания штаммов как в экстремальных условиях, так и при пассировании их в лабораторных условиях или через клубеньки растения-хозяина.

Успешное применение штаммов-инокулянтов требует понимания выше названных проблем. В этой связи очевидно, что оценка генетического разнообразия штаммов в природных популяциях, выявление факторов их обуславливающих, а такие анализ плазшд ризобий, ях функций и стабильности наследования становятся приоритетными.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучения

разнообразия природных штаммов К.теШои по составу ' критических плазмид, оценке стабильности их наследования и' функциональной роли. Исследования проводили по схеме, изображенной на рисунке 1.

Рис.1. Схема экспериментов, проводимых по изучению

разнообразия, стабильности и оценке функциональной роли

криптических плазмид В.теШоП.

Изучение штаммов -нполучение штаммов с измененным

"дикого типа", составом плазмид в результате: выделенных из -'

[-> длительного пассирования через клубеньки люцерны

почв: __ '

Г ~1

до выращива- посла длительная люцерны ного выращива- гативной плаз

-»температурной элиминации■

'-»введения коныо-

ния люцерны миды Я.теШои > и^еШои В задачу исследовашя входило:

1) создать коллекцию природных штаммов 11.те111о*1 различного географического происховдешя из районов выращивания люцерны. Охарактеризовать штампы по плазмидному составу, сиибиотическим свойствам и культуралыю-биохимическим признакам;

2) оценить роль географического происхождения штаммов и выращивания растения-хозяина (в изучаемом ареале) как экологических факторов, обуславливающих разнообразие й-теШо^ в природных популяциях;

3) изучить стабильность наследования штаммами плазмид и сим-биотических свойств при хранении их в лабораторных условиях и при пассировании через клубеньки люцерны в микровегетационных опытах различной длительности (30 и 120 дней);

4) изучить влияние изменений в составе криптических плазмид шташов (си. рис.1) на проявление бактериями симбиотических свойств и культурально-биохимических признаков;

5) оценить возможность получения эффективных штаммов Н.теШо-и с новыми хозяйственно-ценными признаками при внутривидовом скрещивании и изучить их генетическую стабильность,

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

- показано, что природные штаммы й.гаеШои стабильно наследовали плазмады, однако утрачивали исходам? уровень симбиоти-ческой активности в процессе адаптации бактерий к лабораторным условиям хранзния;

- показано, что предел варьирования коэффициентов гетероген-

ности штаммов по количеству плазчид составил 0,44 - 0,76 как для выборок штаммов внутри одного региона, так'я из географически отдаленных регионов; сделано заключение, что географическое происхождение штаммов (в изучаемом ареале) не является определявши d степени разнообразия ризобий;

- создана коллекция штатов R.niellloti с измененным составом криптических плазшд. Получены данные, свидетельствующе об участии этих плазшд в контроле . симбиотической активности, продукции экзополисахаридов в солеустойчивости;

- в результате внутривидового переноса Syra-плазмиды получены рекомбинантные штаммы, вступающие в эффективный симбиоз с многолетней и однолетней люцерной;

- получена конъюгативная рекомбинантная плазмида pRma58TH46a (60 Мд), содержащая nod-hsX гены, способная стабильно поддерживаться клетках It.mellloti;

- получены данные (полевые и мшсровегетациошше опыты) показывающие, что растение-хозяин влияет на генетическое разнообразие штаммов-иикросимбионтов R.meliloti. .

Практическая ценность. ...

1) В каждой выборке штампов выделен доминирующий класс, содержащий штаммы с определенным плазмидныи составом, которые могут быть использованы для генетических исследований по получении эффективных конкурентоспособных штаммов люцерны.

2) Выделена группа штаммов ,дикого типа, содержащих по одной крнптической плазшде и обладающих контрастными характеристиками по ряду культурально-биохимических признаков, что делает возможным последующий анализ функциональной роли несимбиоти-ческих плазшд у R.niellloti.

3) На основе полученной рекомбинантной плазмида pRme58TH46a, содержащей гены, контролирующие признак расширенной хозяйской специфичности, открывается возможность исследования иолекуляр-но-генетических основ хозяйской специфичности бактерий.

4) Результаты анализа генетической стабильности штаммов дикого типа и рекомбинантов дают возможность разработать подходы к получению генетически стабильных штаммоа-инокуллнтов.

Апробация работы. Материалы диссертация докладывались на Всесоюзной конференции "Молекулярная биология й генетика плазмида "Плазмида XI"), Пункно, 1936; V съейдэ В0П1С (Москва, 1987), VIII Восточно-Европейской сяглсеауко но биологической

фиксации азота (Саратов, 1992); на VIII в IX Международных конгрессах по азотфиксации (CU1A, 1990; Мехико, 1992).

Настоящая работа представляет собой часть исследований, проводимых в ВНИЙСХМ в рамках програмш "йнтербиоазот-гооо", "Российский Фонд Фундаментальных исследований", "Приоритетные направления генетики" и в райках сотрудничества с Университетом г.Билефельда (ФРГ).

Структура и оОьеи работы. Дассертадия изложена на г ¿о страницах машинописного текста a состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав экспериментальной части, заключения, выводов и приложения. В работе 29 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 293 наименования, из них 26 на русской языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы микроорганизмов. В работе использовали 193 штамма RMzoblura meliloti, выделенные из почв в различных регионах России и Украины, 23 штамма из Всероссийское коллекции клубеньковых бактерий ВНШСХМ. Шташ 1774 получен от Васюк Л.Ф. (ВШ1ИСХМ) и ДМ7 R.meliloti от Злотникова K.M. (ИВШ). Штаммы АК631, ZB121 R.rcôllloti и плазмиды pKSK5, pID1, рШО получены от д-ра Ковдорош (Венгрия). Штаммы A.tvuneíaciens и ИВ101 ' Е. coll из коллекции лаборатории генетики и селекции ВНШСХМ. Штйиш 2011 R.meliloti, S1T-1 E.coll. плазшды pSUPSOH И Йр4 -4 получены от профессора А.Пюлера (ФРГ).

Методы. Природные штаммы клубеньковых бактерий выделяли из почвенных образцов. Для зтого готовили почвенные болтушки согласно методу Young et al. (1905), которые в последующем использовали для инокуляции семян люцерны Medicago varia, сорт Эайкевича. Растения люцерны выращивали в пробирках (60 см3), согласно методике стандартного стерильного микровегетадаонного опыта (Федоров с соавт., 1983). С каждого растения был отобран один розовый клубенек для выделения бактерий R.ioellloU (Jordan, 1984). Азотфиксмрущую активность штаммов определяли по редушш ацетилена, эффективность симбиоза - по величине сухой iíacctf растений люцерны, выращенных на вермикулите.

Проводили анализ следующих культура шю-биохимических CBOÖCV.. »iioiwoa R.meliloti t устойчивс.:1-ь x 0,4-2,0 M MaCl

(Mohammad et al., 1991). к 4,0-9,0 pH (Graham,. 1992), к 39 -42°C (Llndstrora, LeUtonaki, 1988). Устойчивость штаммов к эп-таму, фундазолу, 2,4 Д, ТМТД, ТТХ (50-1000 мкг/мл) оценивали по методу разработанному Кругловын и ПаромонскоЯ (1991). Кзу-_ чяли способность штампов R.melilotl продуцировать зкзополиса-хариды (Hebbar et al., 1992), эндогенный пигмент меланин (Cubo et al., 1983), а такие утилизировать аминокислоты в качестве единственных источников С и К (Колузлл, Остин, 1984). Анализ изофермонтов эстераз проводили методами Дэвиса (1971), Лойда и Госсрау (1982).

Плазшды R.melilotl мэрзсировали Tn5-raob (pSUP5011) и проводили их мобилизацию согласно Simon, et al. (1984). Плазмидный состав ризобий изучали методом Eckhardt (1978), а молекулярные массы определят! в соответствии с рекомендациями Casee et al. (1979). Стабильность наследования плазиид клетками бактерий определяли методами Бергквист и др. (1990) a Weaver (1990). Температурную элиминацию плазиид проводили методом ZurkowsKl (1982).

Выделение и гибридизациошшй (радиоактивный

рЗЗ)

анализ

тотальной и плазмщдаоЯ ДНК проводили в соответствии с рекомендациями Маниатиса с соавт. (1984). В случае применения нерадиоактивной гибридизации (DIG-система) использовали стандартную методику Holtke et al. (1989).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода хп-квадрат и критерия t-Стыодента (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. ГО1АЗЩДНШ ГЕНОМ R.meliloti: изменчивость и связь с культурально-биохимическими свойствами у штаммов дикого типа.

Изучен плазмидный состав штаммов R.melilotl, выделенных из почз в трех географически удаленных регионах России "(Ленинградская, Иркутская области) и Украины (Херсонская область), где ведется интенсивное выращивание люцерны. В Ленинградской области анализ штаммов проводился в пяти независимых районах. Штаммы R.melilotl из коллекции ВНИИСХМ использовали в качестве группы-сравнения при исследовании природных изолятов, поскольку они находятся в лабораторных условиях не менее десяти

лет и являются изученными по составу плазмид, сиыбиотичесюш и культуралышм свойстваи. Установлено, что все штамш имели ые-гаплазмиды, а 75% штампов содержали крвптичеасие плазшды размером от 30 до 600 Мд (таблица 1). Доля штаммов, содержавших криптические плазмида, составила в Иркутской и Ленинградской

Таблица 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ Н.гооШоН ПО СОСТАВУ

КРШТИЧЕСКИХ ПЛАЗЗД

Район выделения штаммов Ис~ сле- до- вано штам мов Кол-во -шташов, содерж. крипт, плазшды в кол-ве: ~СГ1-2 3-5: % штаммов, содержащих криптич. плазшды Пределы варьиров. Мм плазмид (Мд) % плазмид, размер которых <150 Мд

Херсонская обл. 19 13 5 1 32 + 10,7 70 - 390 58 + 14,2

Иркутская обл. 24 2 21 1 92 + 5.5 50 - 250 97 ± 3,4

Ленинградская 94 18 52 24 81 + 4,0 30 - 600 93+1,9

обл., включающая райе >ны:

Духский 24 0 17 7 100 115 - 150 100

Пушкинский 27 0 16 11 100 30 - 600 90 + 3,7

Гатчинский 17 9 8 0 47 ± 12,1 50 - 180 92 + 7,8

Волосовскпй 16 5 6 5 69 - 11,6 60 - 180 87+6,1

Ломоносовский 10 4 5 1 60 ± 15,5 100 - 150 92 - 7,8

Исследовано шташов / % 137 100 33 24 78 57 26 19 - - -

Коллекц.штаммы 23 7 15 1 70 4 9,6 50 - 600 52 ± 10,9

областях 93 и &7Э6, в то время как в Херсонской облаете число таких штаммов не превысило 58%. Определены коэффициенты гетерогенности (Н) штаммов в популяция по числу идентифицированных у них криптических плазмид, согласно формуле К=1-Х2, где X -частота классов штаммов с определенным число» плазшд ■ (Уош^ ох а1., 1987). Показано, что для штаммов, выделенных в различных географических регионах, предел варьирования Н составил 0,49-0,76, а для штаммов, выделенных в пяти районах Ленинградской области, - 0,44-0,71. На этом основании было заключено, что географическое происхождение штаммов внутри изучаемого ареала (Ленинградская обл.-Иркутская обл.-Херсонская обл.) не являетсл г ли вши фактором, спредеяякнцнм степень их разнообра-зая. В каждой изучаемой выборке штаммов были определены доминирующие классы, содортатгжо штаммы с определенным плазшдныи

составом. В Иркутской и Херсонской областях 63-68% штаммов входили в доминирующий масс. В Ленинградской области было выявлено два таких класса, а итаиш, их образовавшие, составили 14 п 19Х. Установлено, что в доминирующие массы входила как правило штаммы, содержавшие одггу-две криптпческпе плазииды' размером 120-150 Мл, либо не'имевшие этих плазмяд. Штаммы, составляющие большинство в каждой анализируемой выборке, являются наиболее адаптированными к данным экологическим условиям (ВгощЬЛоп et а1,, 1987). Возможно, что выявление доминирующих груш штампов может быть использовано с целью поиска и селекции новых наиболее конкурентоспособных и эффективных штаммов-клубеньковых бактерий.

С целью изучения роли растения-хозяина в генетическом • разнообразии штаммов-микросимбионтов был проведен анализ штаммов, выделенных из почв, на которых выращивали либо люцерну, либо пшеницу (таблица 2). Установлено, что в первом случае штаммы имели более разнообразные плазмидные составы. Аналогичные результаты были получены при исследования штаммов» выделенных с одного и того же поля (Кб), но до и после трех лет выращивания на нем люцерны. Нами было выдвинуто предположение, что растение-хозяин может являться существенным зколого-биотическим фактором, обуславливающим генетическое разнообразие ризобпй.

Таблица 2. плоздный состав У штаммов й.теШои, выделений из почв различных полей ленинградской области

Источник Кс- Кол-во штаммов. предел варь-

получения след. содери. крипшч. иров.Мм кря-

штаммов штам- плазмида в кол-ве: птич.плазмид

мов 0 1 2 3-5 (в Мд>

1) поле N1 (люцерну не •

выращивали) 38 8 18 10 2 100 - 180

2) поля N2-5 (выращив.

люцерны 5-7 лет) 70 18 12 23 17 30 - 600

3) поле Кб (до выращивания люцерны) 18 0 12 6 0 120 - 140

4) поле Н6 (после 3-х 24 0 3 14 7 50 - 180

лет выращив. люцерны)

* величит X при сравнении изученных выборок составляют: (1 - 2)= 13,38 (Р0< 0,01) (1 - 3)= 1,28 (Р0> 0,1)

(3 - 4)= 15.10 (Р0< 0,01) (2 - 4>= 1,67 (Р0> 0,1)

Анализ симбиотическпх свойств природных шташлоа позволил выявить 12% шташов, превосходящих по своей активности тест-штамм СХМ1. Однако подавляющее большинство составляли штаммы, проявлявшие • среднюю или низкую симбиотическую активность (таблица 3).

Таблица 3. СИШИ0ТИЧЕС1ШЕ СВОЙСТВА ПРИРОДНЫХ ШТАШОВ й-теШои (Ленинградская обл.)

Уровень проявления признака относит, штамма СШ (в %) % шташов , проявляющих данный уровень по:

нитрогеназной активности показателям сухой массы инокулированных растений

I опыт 2 опыт I скит 2 опыт

>120 12 3 5 2

110 18 5 18 3

100 5 5 5 5

90 10 2 18 ' 3

<80 55 85 54 87

Повторный анализ штаммов через год хранения показал, что доля эффективных не превысила 2-3%. Таким образом, природные . штаммы являются нестабильный« по сиибиотическим свойствам, вместе с тем, они стабильно наследовали плазшда в процессе адаптации бактерий к лабораторным условиям. Анализ штаммов "дикого типа" позволил считать, что критические плазмиды И. шеШоН могут учартвовать в проявлении таких свойств и признаков ризобий как симбиотическая эффективность, солеустойчи-вость в активность некоторых изоферментов гидролитических ферментов.

2. Индуцированные изменения шшзмидного состава у штаммов И.гоеШои и их влияние на проявление симбиотических свойств в культуралышх признаков.

„ Получение и изучение шташов с измененным плаэмидным составом в результате температурной элиминации (I) и введения не-симбиотнческой кошлогативной плаэииды рШпеДМ7а и.пхэШои (II)

(cu, рис. 1) рассматривалось как один из возможных подходов к оценке функциональной роли криптических плазиид R.meliloti. Для исследования било выбрано три штамма, содержавших от трех до пяти криптических плазшд размером от 90 до 150 Мд. У как-, дого штамма были выявлены плазмиды, которые утрачивались либо в I, либо во II случае. Наибольший интерес для выявления фун-кхдаонально значимых криптических плазиид представляли та из них, элиминация которых наблюдалась в обоих типах экспериментов. В результате была получена коллекция штаммов с измененным составом криптических плазиид. Анализ свойств клонов, утративших одну-две критические плазмиды, показал, что у них имело место снияение симбиотической активности, продукции зкзополи-сахаридов и изменение солеустойчивости, Таким образом, крипти-ческие плазшдо R.meliloti могут влиять на уровень . проявления штаммами как симбиотических, так и некоторых культурально-био-химических признаков.

В результате анализа штаммов дикого типа и с измененным плазшдшщ составом было отобрано 10 штаммов, содержащих по одной криптической плазилде, что позволяет проводить изучеше функциональной роли несимбиотических плазмид R.meliloti".

С целью анализа влияния растения-хозяина на генетическую стабильность микрссимбионта были поставлены модельные стерильные иикроввгеташоннне эксперименты продолжительностью 30 и 120 дней (в последнем случае длительность была приближена к естественному вегетационному периоду растения-хозяина). Установлено, что все исследуемые штаммы (таблица 4) стабильно наследовали маркеры антибиотикоустойчивости и плазмидные составы как при пассировании бактерий на твердых и жидких средах (до 40-ой генерации), так и при проведении их через клубеньки люцерны в условиях иикровегетационкого опыта (30 дней). Вместе с тем, клоны штаммов, полученные после проведения иикровегетаци-онного опыта (120 дней), могли утрачивать маркеры антибиотикоустойчивости с частотой до 7,9%, в зависимости от штамма. У клонов, сохранявших исходный фенотип, исследовали стабильность наследования плазшд. У штаммов 1774 И П-108 в 12,3-14,OS случаев были обнаружены клоны, содержавшие новые кршггаческие плазшда (.для штамма П-108 приведены данные двух Независимых опытов). Анализ клубеньков, образованных итаыиоц П-108, показал, что 41 % из них содервал клоны с исходным влззшдашн сос-

Таблица 4. ПЛАЗМИДНЫЙ СОСТАВ У ШТАММОВ R.roellloti ПОСЛЕ ПАССИРОВАШЯ ИХ ЧЕРЕЗ КЛУБЕНЬКИ tt.varia

Мм ~ ~К.ол-во анализи- Клоны, выдел, из ¡слубеньков

Штаммы крипт. руемых % с изме- содержат

плаз- опы- рас- клу- все ненным криптич.

(маркеры) мид те бень- го плазмидным плазшдо

(Чд)- тов ниа ков составом с Мм (Мц£__

П-108 180 I 5 16 121 14,0 ± 3,15 110 и 170

(Rir> II 3 6 126 12,7 + 2,97

1774(ИГг) 120 I 5 13 138 12,3 ± 2,60 80 и 110

ДМ7№1Г) 158 I 5 10 53 0 -

CXMI (SicF) - I 5 15 132 0 -

СХШ-Ш&г *) - I 3 10 61 0 -

тавом, а остальные - как с исходным, так и с измененным. Определено, что доля клонов с измененным плазмидным составом во втором типе клубеньков могла составлять от 5,0 до 50%. Установлено, что клоны с измененным плазмидным составом проявляли сниженную симбиотическую активность или даже утрачивали ев (таблица 5).. Таким образом, показано, что у бактерий в результате длительного пассирования их через клубеньки растения-хо-

Таблица 5. СИМБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА П-108 И ЕГО

КЛОНОВ С ИЗМЕНЕННЫМ СОСТАВОМ КРИПТИЧЕС1ШХ ПЛАЗМИД

СимОиотичеисиа свойства

опыт I ОПЫТ2

С2Н2редуктазная сухая масса сухая масса

Штамм активность растений растений

(jjkM С2Н4/сосуд люцерны люцерны

в сутки ) (иг/сосуд) (иг /сосуд)

П-108 3,8 15,0 20,4

П-108 - 1а 2.7 * 10.8 * 13.8 *

1Ь 2.1 * 11.Э * 7.4 *

1с 1.1 * 9.9 * 8.3 «

2 2.7 * 11.8 * 11.2 *

• 3 0 * 8.1 « 6.4 *

контр.б/инокул. 0 * 7.2 * 6.9 *

НСР 0.74 2.91 2.89

* - достоверное (Ро<0.05) снижение относительно штамма П-108

зяина может иметь изсто как утрата маркеров антибиотикоустой-чивости, так и перестройки плазмид.

3. Перенос симбиотических плазмид между штаммами R.mellloti: получение рекомбинантов и анализ их стабильности.

С целью изучения влияния переноса Sym-плазмиди R.mellloti при внутривидовом скрещивании на генетическую стабильность штаммов-реципиентов (см. рис.1) в качестве донора бил выбран штамп 1774, имеющий расширенный спектр хозяйской специфичности : он вступает в эффективный симбиоз с многолетней '(И.varia) и с однолетней (M.arabica) люцерной. На этой оснозании предполагалось, что симбиотическая плазмида (pSym1774) штамма 1774 содержит новые hsi-гены, контролирующие азотфиксирующую активность на определенных растениях-хозяевах. В качестве штаммов-реципиентов использовали невирулентные мутанты штаммов СХЩ (СХШ-46) и АК631 (ZB 121), вступающие в эффективный симбиоз с M.varia, однако, образующие в симбиозе с И.arabica белые не-фиксирующие азот клубеньки.

С целью маркирования и последующей мобилизации плазмида pSyra 1774 был проведен транспозоновый мутагенез штамма 1774 с использованием вектора pSUP5011 (Tn5~mot>). Полученные транспо-занты скрещивали индивидуально со штаммами реципиентами, В результате были получены активные рекомбинанты штаммов СШ1-45 и ZB121 (таблица 6), которые составили 14 и 61%, соответственно. Восстановление симбиотической активности у реципиентов штамма ZB121, имевшего делению по nod-Iii-генам, свидетельствовало о переносе Sym-плазмвды штамма 1774. Поскольку эти рекомбинанты наследовали такае признак расширенной хозяйской специфичности, то hsi-гены локализованы на pSyra 1774.

Была исследована стабильность наследования маркеров анти-биотикоустойчивости и симбиотических свойств рекомбинантами, наследовавшими вульгаш штамма 1774 после шести месяцев хранения их на твердых средах при 4°С. Установлено, что 30% клонов рекомбинантов штампа СХМ1-46 (обозначены как TR46) наследовали маркеры a m и он отшеоу с тойчи вое ги, а 7,5% - сохраняли азотфшссируквдю активность в симбиозе с M. varia. На этом основании рекомбинантн TR46 были охарактеризованы как генетически нестабильные. Рекоибинантн штамма ZB121 (обозначоны как

Таблица б. СИМШОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ СКРВДШАЩЯ ШТАММА 1774 С НЕВЙРУЛНШШШ МУТАНТАМИ ____R.nielllotl_•

Фенотипичес- Кол-во рекомбинантов штаммов-реципиентов,

кий класс • проявляющих данный фенотип на :

рекомбинантов M.varia h*.varia и M. arabica

. СХМ1-46 "Т ZB121 (штаммы-реципиенты) СХМ1-46 | ZB121 (штаммы-реципиенты)

Nod+Flx+ 15 18 2 5

Nod+Flx+/~ 3 82 0 11

Nod+Fiz- 13 32 0 0

Nod- 83 31 0 0

всего: 114 Г 163 2 16

TR121) сохраняли маркеры антибиотикоустойчивости в 70% случаев, а симбиотическую активность - в 43%. При пассировании рекомбинантов TR121 через клубеньки растения-хозяина (30 дней) било обнаружено, что 30% процентов клонов утрачивало маркеры антибиотикоустойчивости. Таким образом, частоты появления клонов, утративших маркеры атибиотякоустойчивости ex planta и in planta, совпали. Вместе с тем, установлено, что 57,9% клубеньков содержали клоны исходного фенотипа, тогда как в остальных клубеньках процент клонов с измененным фенотипом составил 25 -83%. Выявленная неоднородность клубеньков может быть объяснена исходя из ранее рассмотренных данных о влиянии растения-хозяина на генетическую изменчивость ризобий.

Анализ плазмид рекомбинантов TR121 показал, что у них имело место замещение делеционной pSyra MI штамма ZB121 на pSym HI штамма 1774. У рекомбинантов TR46'была выявлена криптическая плазмида pRmeTR46a (Мм 60 Дд), не идентифицируемая ранее у родительских штаммов. Функциональный анализ рекомбинантов выявил, что плазмида pRmeTR46a являются не идентичными: 67% содержали Тга+-гены, 33,5% - nod-генн, а 1,75%- heJt-гены.

Отобрано два рекоибинанта 53TR46 (pRme53TR46a) и 58TR46 (pRme58TR46a), наследовавших селективные маркеры KitF, Тсги hsf-гены. Молекулярно-генетический анализ рекомбинантов позволил установить, что плазмида pRmeTR46a - это коныогативные ко-интеграты плазмид pSUP5011 (Тп5-вдЬ; КгагСптг) и РР4-4 (Тсг Тга+), которые включили еут-гены штамма 1774. Анализ клонов

рекоибанантов 53ТН46 в 58ТЙ46 показал, что до 15 - 25% из них, соответственно, утрачивали устойчивость к неселективному маркеру. хлораифениколу. Установлено, что такие клоны были неспособны вступать в симбиоз с обоими растениями-хозяевами, а клетки бактерий содержали плазииды рйтеТН46а, размер которых был меньше на 20 Мд. Таким образом, было выявлено, что маркер (^-устойчивости сцеплен с пой-генаии. Гибридизациошшй анализ нативных плазмид СтРи Си8 клонов рекомбинанта 50ТН46 и рест-риктов их тотальной ДНК с пойАВС-зондом выявил, что стабильные рекомбинанты ТЯ46 содержали две копии пой-генов. Полученные данные позволяют считать, что фрагмент ДНК размером 20 т.п.н. имеет локализацию на р8угоСГШ1-46, а фрагмент в 15 т.п.н. - на плазмиде рНтеТН4ба (рис.2). Одновременное присутствие у реком-

Рисунок 2. Гибридизационный анализ тотальной ДНК (рестрикция Есой1) штаммов 1774, СХМ1-46 и клонов рекомбинанта 58ТИ46 с ПОйАВС- зовдои (8,4 т.п.н. ЕсоК! фрагмент рК£К5).

1 2 3 4 L___Л 5 L.

Ubji

hv

V 6 \i7 8 9

и

ь

ю:

■{ 8,5т.п.н. 1 7,2

дорожки: 1,4 - клоны рекомбинанта 58ТН46 (Nod+Fix+) и 2,3 -(Nod-); 5,8 - штаии СХМ1-46; 7 - штамм 1774; 9 - штамм СХМ1; 6,10 - ДНК фага 3l (рестрикция-SetI).

бинантов 58ТН46 двух копий вут-генов является основной причиной, обуславливающей их генетическую нестабильность. Таким образом, в результате внутривидового переноса Буга-плазмиды Н. гоеШоИ были получены эффективные рекомбинанты с расширенной хозяйской специфичностью, содержащие конъюгативную плазшду рКтеТЯ46а (60 Мд), включающую пой-Ьв! гены.

ВЫВОДЫ

1. Било аыделено из почв различных географических регионов России (Ленинградская и Иркутская обл-ти) а Украины (Херсонская обл.) н изучено 193 штамм.') Н.гпеШоН, а также 23 эффек-

тивных штамма из коллекции ВНШСХМ. Показано, что исследуемые штаммы R.meliloti могли содержать до пяти криптических плаз-мид. Количество штаммов в популяции, содержавших одну-две }фиптические плазмиды, размером не более 150 Мд, могло составлять от 32 до 92%.

2. Определено, что коэффициенты гетерогенности штаммов R. meliloti (по количеству криптических плазмид) в природных популяциях имеют равные пределы варьирования как внутри одного региона (Ленинградская обл. - 0,44-0,76), так и между географически отдаленными регионами - 0,49-0,76.

3. Был определен доминирующий класс штаммов в каждой исследованной выборке (Ленинградская, Иркутская и Херсонская обл.), клетки которых содержали либо одну-две крсштические плазшды размером 120-150 Мд. либо вовсе их не содержали. Предполагается, что эти штаммы являются наиболее адаптированными к условиям окружающей среды в данной популяции, а поиск штаммов, перспективных для селекции, в этой группе мокот быть наиболее успешным.

4. Анализ симбиотическоЯ активности 94 штаммов (Ленинградская обл.) выявил, что до 12% из них превосходили производственный штамм CXMI по нитрогеназной активности, а 3% по симбио-тической эффективности. Установлено, что 88,5% природных изо-лятов были нестабильны в проявлении симбиотических свойств в процессе их адаптации к лабораторном условиям культивирования. Вместе с тем, все анализируемые штаммы стабильно наследовали плазмиды при культивирбвании бактерий в жидкой среде (при пассировании на твердых средах в течение 5-7 лет) и при проведении их через клубеньки растений люцерны в условиях стандартного микровегетационного опыта.

5. В результате температурной обработки (40,5°С) двух штаммов R.meliloti, содержащих три, и одного штамма с пятью крип-тическими плазмидами, а также при введении в них кокыоготивноЯ плазмиды pRme,QM7a, было получено 40 клонов с извднешшм. плаз-мидным составом (утрата отдельных криптических плаэмид или их структурные перестройки).

'6. Анализ штаммов R.meliloti, содержащих исходный и экспериментально измененный состав криптических плазнид,. позволил установить связь между плазмидным составом и уровнем проявления симбиотичоской эффективности, солеустойчивости и продук-

щей экзополисахаридов.

7. в результате внутривидового переноса Syra-плазшды штамма 1774.B.melllotl в невирулентный мутант СХМ1-46, получены эффективные рекомбинантные штаммы, наследующие признак расширенной хозяйской специфичности: вступают в эффективный симбиоз с многолетней (11.varia) и. с однолетней (M.arabica) люцерной. Установлено, что гены, детерииинирующие признак азотфиксирую-щей активности на определенных растениях-хозяевах (hBÎ-гены), локализованы на pSym штамма-донора 1774.

8. Изучена нестабильность рекомбинантов штамма СХМ1-46, которая, возиокно, обусловлена присутствием у них двух копий sym-генов. Установлено, что одна из копий генов локализована на Sym-плазшде ыташш СХМ1-46, а вторая - на образованной in vivo конъюгативной рекомбанантной плазмиде рНгаеТН4йа (::Тп5--raob, 60 ад.

9. Результаты полевых и микровегетационных опытов показала, что растение-хозяин способствует увеличению генетического разнообразия штаммов микросимбионтов, выявляемого по изменению состава криптических плазмид ризобий люцерны. ,

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Румянцева М.Л. Генетико-бдохимический анализ гетерогенности природных популяций клубеньковых бактерий люцерны. -труды BHLQimi, Л., 1985, т.55, с.-97.

2. Злотников K.M., Румянцева М.Л., Аронштамм A.A. Анализ плазмид у штаммов RMzobim melilQtl различного географического происхождения. - Молекулярная генет., микробиол.. вирусол., 1985, т.в, с.13 - 15.

3. Румянцева М.Л., Аронштам A.A. Использование изоферментов эстераз для идентификации штаммов клубеньковых бактерий люцерны. - Прикладн. биохии., микробиол., 1987, т.23, N2, с. 158 -162.

4. Новикова Н.И., Фокина Й.Г., Румянцева М.Л. , Чернова Т.А. Перенос Sym-плазмид между представителями семейства Rhlzoblaceas. - Тезисы докл. V Съезда ВОГИС., М., 1987, с. 59 - 60.

5. Румянцева М.Л,, Проворов H.A. Изменение симбиотических и культурально-бяохимических свойств у щташов íUiiaobiwa isejilo-ti при нарушениях состава пдгмид. - Бюллетень HHKCXU, Л., т.

61, 1988, С. 3 - 6,

6. Румянцева М.Л., Проворов H.A., Симаров Б.В. Сравнительный анализ состава плазмид у штаммов Rliizoblum melllotl, выделенных из почв до в после выращивания люцерны. - В сб. "Молекулярная биология и генетика плазмид" (XI Всвсоюэ. совещ. "Плазмида"), М., 1986, с. 47-48.

7. Ruroayntseva M.L., Provorov N.A., Simarov B.V. Generation of eelf-transmiesible nodulation plaamids differing in host specificity from the crossing of Rhizobium meliloti вtrains. - AbBtr, 8-th Intern.Congr.Nitrog.Fixat. - Knoxville, USA, May 20-26, 1990, p.574.

8. Rumaynteeva V.L., Provoroy (i.A., Siroarov B.V. Role of host plant in formation of population structure in Rhizobium meliloti as determined by plaemid content. - Abetr. 8-th Eastern Europe Symp.Biol.NItrog.Flxat., Saratov, September 22-26, 1992, p. 53.

9. Rumayntseva M.L., Provoroy H.A., Siroarov B.V. Rolo of geographical diversity and presence of host plant in formation of population structure in Rhizobium meliloti ав determined by plasroid content. - Abetr. 9-th Intern.Congr.Nitrog.Fixat. -CanCun/MEXICO, December 6-11, 1992, N 725.

РТП.Тжп.ВКР.3ак„381. ТирJCJO. ie.IQ.9i.