Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование космидного банка генов RHIZOBIUM MELILOTI для клонирования гена биосинтеза лейцина, участвующего в контроле развития азотфиксирующегое симбиоза с люцерной

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Использование космидного банка генов RHIZOBIUM MELILOTI для клонирования гена биосинтеза лейцина, участвующего в контроле развития азотфиксирующегое симбиоза с люцерной"

РГб ол

/ 3 Й^^эз"51 НДУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

институт микробиологии

На правах рукописи

УМА РОВ Бахтиёр Рахматович

УДК 575:576.851.155

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОСМИДНОГО БАНКА ГЕНОВ ШгОВШМ МЕЫЬОТ! ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНА БИОСИНТЕЗА ЛЕЙЦИНА, УЧАСТВУЮЩЕГО В КОНТРОЛЕ РАЗВИТИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩЕГО СИМБИОЗА С ЛЮЦЕРНОЙ

Специальность: 03.00.23 — биотехнология

авто реферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ташкент — 1993

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) и в лаборатории генетической инженерии азотфиксации Института микробиологии АН Республики Узбекистан,

Научные руководители:

кандидат биологических наук ст. н. с. А. А. АРОНШТАМ доктор биологических наук А. С. РАСУЛОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А. А. АБДУКАРИМОВ доктор биологических наук М. М. МУРАДОВ

Ведущая организация: Ташкентский Государственный университет, кафедра биотехнологии биологического факультета.

Защита диссертации состоится 22 апреля 1993 г. в » часов на

заседании специализированного совета Д.015.02.21 по присуждению ученых степеней при Институте микробиологии АН РУз (700128, Ташкент, ул. А. Коди-рий, 7 Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан « ^ » ¿¿¿¿ЛтИ ¿V ]9Эз г

Ученый секретарь

специализированного совета, ,

доктор биологических наук С&'фЧЩ^ Ж. С. САФИЯЗОЕ

ОВЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема биологической фиксации молекулярного азота является одной из актуальных в сельскохозяйственной биологии и напрямую связана с урожайностью важнейших кормовых культур - бобовых растений. Значительным резервом для повышения ее эффективности служит направленное конструирование штаммов тех микроорганизмов, которые непосредственно обеспечивают растений-хозяев фиксированным азотом. К числу таких микроорганизмов, в частности, относятся бактерии ИЫгоЫит. аеШ.о1;1 , вступающие в симбиоз с важнейшей кормовой культурой - люцерной. Однако, улучшение симбиотическях свойств этих микроорганизмов невозможно без тщательного генетического анализа всех факторов, обеспечивающих такой сложный молекулярный процесс, каким является сиибиотичесяая азотфиксздяя. ..

В последнее время подобный генетический анализ стая проводится исключительно с использованием методов гэнной яняенерии. Ключевой этап применения генно-инженерных методов в анализе,симбиотическях свойств клубеньковых бактерий - создание банка (библиотека) генов соответствующего штата этих микроорганизмов. Наиболее популярными векторами для создания таких "библиотек" стали космиды, сконструированное на основе плазмид, имеющих широкий спектр хозяев среди грамотряцательных бактерий. Использование космидннх банков позволяет достаточно быстро провести клонирование индивидуальных генов, участвующих в контроле как культуралышх, так я скм-биотических свойств клубеньковых бактерий. Такое клонирование, в свою очередь, может обеспечить возможность выяснения точной биохимической и физиологической роли соответствующих•генов в развитии симбиоза с последующим их использованием жпя направленного конструирования штаммов с повышенным азотфихсирующим потенциалом.

Пзль и задача исследования. Целью настоящей работы являлось создание банка генов кьхгоЬхиш вешыя я использование ого в генетическом анализе азотфиксирувдего симбиоза с лвцеряой. В связи с этим в задачи работы входило:

1. Создать бат генов кшаоЫит теЩоЪ! на основе космяд-ного вектора рЫ1Н5.

2. Клонировать фрагмент генома и. тенюъ! инсерция в кото-

\

У

рыЗ трансп озона Тп5 Привела к утрате азотфиксирукзщэй активности;

3. Клонировать фрагмент генома к. шеШоЪЗ., содержащего ген биосинтеза лейцина, инсерция в который транспозока привела к утрато способности формировать аз отфик сирующий симбиоз с ящерной;

4. Выяснить связь между биосинтезом лейцина я симбиотическя-ми свойствами клубеньковых бактерий люцерны.

Научная новизна. Создав космидный банк генсв штамма СИП йЫ-гоЫиш кеИ1оЪ1. Провалено клонирование "кряптического" гена, участвующего в контроле азотфяксирующей активности, локализованного на мегаплазмиде штамма СХМ1 КЫгоЫст теШой!. Проведено клонирование гена, ответственного за биосинтез лейцина е показана его роль в развитая азотфякоярующего симбиоза. Продемонстрирована сортовая и индивидуальная изменчивость растения-хозяина (люцерны) по способности вступать в симбиоз с использованным в работе аук-сотрофныы по лейцицу мутантом и. теШоЫ. Показано, что эта изменчивость не обусловлена трофичесними потребностями в лейцине у ауксотрофного мутанта, что позволило выдвинуть предположение об участии генов биосинтеза лейцина или их молекулярных продуктов в экспрессии симбиотических свойств й. шеШо^.

Практическая ценность. Полученный на основе каскадного вектора рЫШ?5 банк генов к.юе1х1о1;1 может быть успешно использован для молекулярно-генетического анализа симбиотических я культу-ральных свойств клубеньковых бактерий люцерны. Выявленная изменчивость растения-хозяина по способности вступать в симбиоз с ауксо-трофным по лейцину мутантом открывает перспективы для селекция люцерны о повышенной отзывчивостью на инокуляцию клубеньковыми бактериями я, соответственно, обладающей более высоким азотфиксярую- ' щим потенциалом и.урожайностью.

Бее положения, изложенные в подразделах "Научная новизна" я "Практическая ценность", выносятся на официальную защиту.

Апробация работы. Материалы диссертация доложены на Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент, 1989), на 1-ом Международном конгресса "Симбиоз" (Иерусалим, 1991), на ГС-ом Всесоюзном Биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на У1-ом съезде Узбекского республиканского общества генетиков я селекционеров (Ташкент,

1992). Диссертация обсуждена и одобрена на семинара лаборатории генетики и селекции Института сельскохозяйственной микробиологии (протокол № 65 от 29 апреля 1992 г.) и Ученым Советом Института микробиологии АН Узбекистана.

Публикации. По гзме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из "Введения", "Обзора литературы", "Материалов и методов" исследования, одной главы содержащей "Результаты я обсуждение" проведенных исследований, "Заключения" и "Выводов", содержит 16 рисунков я S таблиц. Список цитируемой литературы включает 9S наименований, из которых 87 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы и плазмиды. Использовали следующие штаммы Е. colis НВ101 ( hsdS, hsdM, pro, leu, ttii, Strr, reoA) (Маниатис и др., 1982); SI7.1 (F~, Я", гесА, hs<3R~ , несет модифицированную плазмиду RM- , интегрированную в хромосому и утра-тйЕИую марьеры Арг, Х'с1-, Km1" ) (Simon et al. f 1983). В качестве векторов использовали космиду pLAFRj ( Тсг, рйкгдо::созА) ( Fridman et al. , 1982), и плазмвду FSUP202 ( pHR325:îmob ); pSUP2021 (pBK325:imob;:Tn5) (Simon et al., 1983).

Питательные средн. концентрации антибиотиков. Штаммы Е. coli выращивали на среде lb. к. oeliioti выращивали на модифицированной полной среде (дрожяевсй экстракт 0,1 г/л; триптон I г/л; ман-нит I г/л; СаС12 О,Г г/л; MgS04 0,1 г/л; КН2Р04 1,5 г/л, pH 7,2; для приготовления твердой среды добавляли.15 г/л агара). Минимальная среда содержала в качестве ссточняка азота (nh^)2S0^ (I г/л) я маянит (5 г/л) как источник углерода. Антибиотики были использованы в следующих концентрациях: неомицин - 200 мг/л; стрептомицин - 200 мг/л; тетрациклин - 20 мг/л.

Методы работы с ДНК. Плазмиднуи JHK выделяли с помощью метода щелочного лизиса из 20 мл ночной культуры S. coli ( Birnboim, Со-ly , Г979). Для препаративного выделения использовали I л ночной культуры и после проведения процедуры согласно методу Бирнбойма-Доля плазмидную ДНК очищали ультрацентрМугированлем в градиенте CsGl. Геномную ДНК R. meliloti выделял!} с помощью модифицированного метода Мармура, подвергали частичного гидролизу рестриктазой

ЪсoR1 согласно рекомендациям изготовителя (Биотех, Москва) и фракционировали по размеру в 0,6$ агарозном геле. Фрагменты ДЕК размером от 20 до 30 т.п.н. выделяли из геля методом электроэлго-ции. Выделенные фрагменты лигировали с расщепленным рестриктазой EooR1 вектором pLAJR5 в соотношении 5:1. Легированную смесь упаковывали в головки фага X с помощью упаковочной смеси, приготовленной нами из штаммов Ei.coli ВНВ2688 иВНВ2690. Штамм ъ.coli HBI0I был использован для отбора устойчивых к тетрациклину трансфектантов. Анализ плазмидного состава в клетках R.meiiloti проводили с помощью электрофореза клеточных лизатов по методу Эк-хардта ( Eckhardt , 1978). Гибридизацию по Саузерну проводили как описано в руководстве Манйатиса с использованием в качестве "зонда" выделенных из агарозного геля фрагментов ДНК, меченных по

ТП5 мутагенез. Введение транспозона в штамм СХЗЛ1 R.meiiloti было проведено при скрещивании его со штаммом в.coli S17.1, содержащим плазмиду pSvJi2021. Устойчивые к неомицину трансконъю-ганты, отобранные с частотой 10"°, проверялись по способности расти на минимальной среде. Идентификацию ауксотрофов проводили, используя смеси различных аминокислот, азотистых оснований и витаминов ( Davis, 1980).

Оценка симбиотических свойств. Проверку сямбиотических свойств штаммов R. meliloti проводили в условиях микровегетационного опыта согласно описанной ранее методике (Федоров и др., 1984), Семена люцерны (сорт ЗаЗкевита) стерилизовали концентрированной серной кислотой 2 мин., промывали дистиллированной водой, проращивали в течение суток при 28°С и высаживали в аЕтокловированные стеклянные пробирки (18x180 мм), содержащие в качестве субстрата вермикулит • и солевой питательный раствор. Проростки инокулироЕали бактериальной суспензией (обычно ТО7 клеток/мл) и через 5 недель выращивания при 22°С определяли ацетиленредуктазную активность на газовом хроматографе, сухой вес побегов, наличие в клубеньках бактерий соответствующего генотипа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Г. Создание банка генов R. meliloti

Создание банка генов является одним из перых этапов молеку-лярно-генетического анализа симбиотических свойств клубеньковых

бактерий. Для создания банка генов штамма СХМТ йЫгоЫш теШо-1:1 наш был использован космидннЧ вектор рЬАГй5 , генетическая карта которого приведена на рис. I.

I

Рис. I. Физико-генетическая карта космида pLAER5

В качестве первого шага в этом направлении мы оптимизировали условия получения большого количества фрагментов генома R. ше-lilotl размером 20-30 т.п.н. и выделяли необходимые количества для лигярованяя EooRl -расщепленной космщщ pLAER5 .Выделенные фрагменты лягяроваля с EcoRl расщеплзнным вектором в соотношении 5:1. Далее лигазатн с помошью изготовленных нами упаковочных экстрактов, включали в состав головки fara X. Полученный нами I мл суспензия фага имел титр ТО^ б.о.е. (бдяшкообразуюпшх единиц). Предварительную проверку банка осуществляли путем трансфекции штампа s. coli HB101, используя ТО мкл фаговой суспензии. При этом было получено около 1500 клонов, устойчивых к тетрациклину (маркер pLAJR5 )» которые предположительно несли рекомбинантные космеды, содержащие фрагменты генома R. meliloti.

Предварительный скрининг около ТОО таких клонов с помощью электрофореза клеточных лизатов по методу Экхарда показал, что все они содержали космиды, существенно превосходящие по размеру исход-

ный вектор рЬАРК^. Бо всех этих трансфектантах содержание космид было проверено путем выделения ДНК по методу Бирнбойна-Доли с последующ™ рестрикционным анализом клонированных фрагментов, результаты которого приведены на рис, 2.

Г 2 3 4 5 6 7 8 9 ю.....................

Рис. 2. EcoR1 -рестрикция рекомбинантных космид, выделенных .из тетрациклинустойчквых трансфектантов ..

дорожки: I. ДНК фага X ( Hind ш ); 2. ДНК фагаХ ( EcoR1 ); 3. pLAFR? ; 4. pLAFR5 (ЕссР.1); 5-21. реломбинантные космдды (£ооН1).

Используя для трансфекции 200..МКЛ фаговой суспензии, мн получили 30 ООО клонов, устойчивых к тетрациклину, которые, на основа- . нии данных анализа I0G клонов, по-видимому, все несли рекомбинант-ные космида. Эти факты позволили считать, что наш построен полный и амплифицированный банк генов Rhizoblum melilotl (т.е. одни и те же фрагменты генома присутствовали в банке в нескольких копиях). Полученный банк генов стал основой для клонирования генов, участ-вушшх в контроле азотфиксирующей активности R. melilotl.

2. Клонирование fix: iTn5 фрагмента Rtiizobium msliloti

Способность клубеньковых бактерий (ризобий) вступать в азот-фиксиругаций симбиоз с бобовыми ра'стениями контролируется больной группой генов этих микроорганизмов (Сямаров и др,, 1990). Для многих из них ( по<ц nif-гены) к настоящему времени достаточно хорошо изучена структурно-функциональная организация (Watson ,1989). В то же время конкретная функция целого ряда генов, участвующих р контроле азотфиксирующей активности, остается еще не выясненной.

Для таких генов предложен термин fix-гены и их изучение в последнее время привлекает все большее внимание исследователей ( Long, 1989). Выяснение их вклада в развитие симбиоза позволило бы сформировать полное представление о молекулярно-генвтических механизмах, обеспечивающих процесс азотфиксация.

В связи с этим, в специальных экспериментах мы задались целью клонировать фрагмент генома клубеньковых бактерий люцерны, содержащий один из таких "критических" fix-генов. Клонирование проводили с помощью космидного банка генов R. meiiioti , который был построен на основе геномной ДНК мутанта (ДМ1-Т505. Этот мутант был получен с помощью случайного транспозонового мутагенеза с использованием в качестве донора транспозона Тп5 плазмиды-"самоубийцы" Psra>2021 (ШарыпоЕа и др., 1987). В результате инсерции Тп5 мутант Т505 формировал на корнях люцерны клубеньки, лишенные азот-фяксирующей активности, а сами растения имели значительно меньшую массу надземной части по сравнению с растениями, инокулирсшанными исходным штаммом CXMI. Этот факт был интерпретирован нами таким образом, что транспозон встроился в один из генов, участвующих в контроле азотфиксирующей активности, тем самым маркировав его устойчивостью к несмицину, кодируемой Тп5. Утрата же способности к азотфяксащш мутанта Т505 вызвана инактивацией этого гена, вследствие яксерции в него транспозона.

Отбор рекомбинангных коемид, содержащих fixi:ïn5 фрагмент генома штамма CXf/IT R. neliloti, осуществляли путем высева трансфе-цироЕанных фаговой суспензией клеток штамма coli HBI0I на среду lb, содержащую неоглицин (100 от/мл). Параллельно проводили высев клеток на тетрациклин (20 мг/мл) для определения частоты встречаемости fix -фрагмента в полученном нами амплифицированном банке генов мутанта Т505. Эта частота оказалась равной Ю-4, т.е. среди ГО ООО клонов, устойчивых к тетрациклину, обнаруживался один нео-мицинустойчивнй клон. Из нескольких неомицинустойчивых клонов по методу Бярнбойма-Доли было проведено выделение рекомбинантных космид с последующим их гидролизом Hin-t ill -рестряхтазой, результаты которого приведены на рис. 3.

При этом приблизительный размер клонированного фрагмента по данным Hind ill-рестрикции оказался равным 18 т.п.н. Учитывая, что размер транспозона Тп5 равен приблизительно 6 т.п.н., следует полагать, что размер клонированного нами fix -фрагмента генома

1.6. ДНК фага X(EeoRI) 2.5. ДНК фага Л(НЫ»)

3-4. рекомбянантные к ос-

Дорожки:

миды

1 2 3 4 5 а

Рис. 3. Hind ill -рестрикция рекомбинантных космид, содержащих £ixj«Тп5 фрагмент

штамма СШХ R. meliloti составляет 12 т.п.н. Принимая во внимание, что геном ризобий равен приблизительно 6000 т.п.н., не трудно подсчитать, что клонированный нами фрагмент при случайном встраивании в вектор и последующей амплификации должен был бы встречаться в бзнке генов с частотой 2x10"°, т.е. в 20 раз более высокой, чем отмечено нами. Утот факт-может быть объяснен неравномерной амплификацией рекомбинантных космпд, вызванной, например, локализацией в fix-фрагменте транспозока . Прямое доказательство того факта, что наш проклонирован fix: :Та5 фрагмент генома из нефик- . сирующего азот мутанта, было получено с помощью блот-гибриди&ации по Саузерну между Hind IXl-рвстрицированной космидой и (^Р) плаз-мидой pSt3P202l, несущей Т115.

Нами также была доказана локализация этого фрагмента в гено- . ме штамма CXMI с помощью блот-гибридязации по Саузерну после электрофореза клеточных лизатов по методу Экхарда, позволяющего разделить хромосомную ДНК и мегаплазмида R. meXiioti, характерные для этого вида клубеньковых бактерий (Rosenberg et al. , 1982). При этом было показано, что клонированный нами fix-ген имеет мегаплаз-мидную локализацию.

3. Молекулярное клонирование гена, ответственного за биосинтез лейцина у Rbizobium meliioti,участвующего в генетическом контроле азотфиксиругощего симбиоза с люцерной

3.1. Комплементация ауксотрофного мутанта Т46 ( Fix-,Leu") с помощью космидного банка генов

Особенностью клубеньковых бактерий является то, что целый ряд генов, ответственных за синтез и утилизацию различных метаболитов, функционируют как в свободноживущих ризобиях, так и в процессе развития симбиотического органа (клубенька). Главная задача генетического анализа симбиотических свойств клубеньковых бактерий состоит в идентификации и структурно-функциональном анализе таких генов, что позволит, в конечном итоге, выяснить молекулярные механизмы симбиоза и наметить пути для повышения его эффективности.

Следовательно, цель этого раздела работы состояла в молекулярном клонировании гена, ответственного за биосинтез лейцина, штамма СЖГ к. meliioti. Интерес к этому гену обусловлен тем, что мутапия в нем вызвала утрату азотфиксирунщей активности. Такая мутация была получена в процессе случайного транспозонового мутагенеза с использованием в качестве донора in5 плазмиды - pSUP202i сотрудником лаборатории генетики я селекции В. Ерко. Полученный мутант (Т46) оказался неспособным к росту на агарязованной минимальной среде, содержащей в качестве источника углерода маннит, а азота - сульфат аммония. Определение ростовых потребностей этого мутанта методом ауксонографии показало, что неспособность к росту на минимальной среде связана с блоком в синтезе аминокислоты лейцина. Оценка симбиотических свойств мутанта,Т46 в условиях стерильного микровегетационного опыта показала, что инокулированные им растения люцерны имели на корнях, в основном, белые мелкие многочисленные клубеньки, которые не проявляли азотфиксирующей активности. Для самих растений были характерны все признаки азотного голодания: желтый цвет листьев, биомасса приблизительно в два раза была меньше, чем у растений инокулярованных исходным штаммом СШГ и сопоставима с контрольными неинокударованными растениями.

•Эти данные находятся в соответствии с результатами, полученными ранее группой французских исследователей, показавших, что,: ауксотрофные по лейцину мутанты штамма L5-30 R.meliioti утрачиваг

ют азотфяксирующую активность (Truchet et ai., Л980).

Для клонирования гена, в котором произошла мутация, приведшая одновременно к потребности в лейцине и утрате азотфиксирующей активности нами был использован космидный банк генов штамма CXMI-Т505 R. meiiloti. Банк генов, содержащийся в штамме Е. coli НВЮ1, вводили е мутант Т46 в трехродительском скрещивании с помощью конъ-югативноплазмщщ рН&го13. Отбор трасконъюгантов проводили на минимальной среде, содержащей неомяцян (контрселекция штамма-донора а. coli ) и тетрациклин (маркер космдды plAFR5).

Единичные клоны, возникшие на селективной среде с частотой 10~®, после дополнительной перепроверки по селективным маркерам были проверены на содержание рекомбинантных космид с помощью электрофореза клеточных лизатов по методу Икхарда, результаты которого представлены на рис. 4.

Дорожки:

1. штамм СИЯ.

2. транепозант Т46. 3-8тран ск онъюга нты, полученные после комплементации мутанта Т46 космидным банком.

Т2345678

Рис.4. Электрофорез клеточных лизатов прототрофных трансконъюгантов, полученных после комплементации лейцинов ого ауксотрофа Т46 банком генов

R. meiiloti

Из этого рисунка видно, что штамм CXMI и полученный на его основе мутант Т46 (дорокки I и 2) имеют фракцию зкстрахромосомной ДНК, соответствующую.двум гигантским мегаплазмидам сходного размера (около 1500 т.п.н.), характерным для клубеньковых бактерий люцерны ( flynes et al. , 1986). Трансконъюганты, у которых произошло восстановление способности расти на минимальной среде (дорожки 3-8), содержали дополнительную фракцию экстрахромосомной ДНК (размер около 50 т.п.н.), соответствующую рекомбинантным космидам, несущим генетический материал, комплементировавший потребность в лейцине у мутанта Т46.

3.2. Особенности симбиотических свойств лейцинового ауксотрофа Т46 и полученных на его основе прототрофных трансконъюгантов

3.2.1. Симбиотические свойства прототрофных тран ск онъюгант ов

Полученные в результате комплементации космидным банком про-тотрофные трансконъюганты были проверены в условиях стерильного микровегетационного опыта. При этом было обнаружено, что все они на корнях растений люцерны образовывали крупные красные клубеньки, проявляющие нормальную азотфиксирукяцую активность. Растения, инокулированные этими трансконъюгантами, имели такую же биомассу и уровень азотфиксашги, как и растения, инокулированные исходным штаммом СХМ1н. шеШоЪх.

Рис. 5. Азотфиксирующая активность и эффективность штаммов И. теШо-Ы I. неинокулированные растения; 2. штамм СХМ1; 3. лейциновый ауксотроф Т46; 4-8. трансконъюганты, полученные на основе мута:-.та Т46; 9-11. трансконъюганты, полученные на основе штамма СХМ1;

- вес (мг) надземной части растений

- редукция ацетилена (наномольД^^/сутки/ растение)

На рис. 5 приведены результаты наших опытов по оценке азот

.XXX]

фиксирующей активности (редукция ацетилена) и эффективности (показатель эффективности - вес высушенной надземной г:асти растений) исходного штамма ШП, мутанта Т46 и прототрофных трансконъюгантов.

Совместно с сотрудником ВВШСЗСМ В.К. Лебским нами было проведено электронномикроскопическое исследование клубеньков, образованных на корнях люцерны после инокуляпии исходным штаммом CXMI, лей-пиновым ауксотрофом Т46 и прототрофными трансконъюгантами. Результаты этого исследования показали, что ультраструктурная организация клубеньков, образованных исходным иташом CXMI и одним из прототрофных трансконъюгантов, очень сходна, В их цитоплазме отмечаются хорошо развитые бактероиды, окруженные перябактероидной мембраной, заметны также стенки инфекционных нитей. В то же время клубеньки, образованные ауксотрофным по лейцину мутантом Т46, были мелкие, белые, скорее напоминающие опухоли, которые обычно формируют мутанты, утратившие способность фиксировать азот в результате инактивации различных генов, участвующих е контроле симбиотической азотфик-сацяи ( nif-, fix-, exo- ) (Hirsch, Smith , 1987). Для этих клубеньков отмечено разрушение цитоплазмы, пикноз ядер и пластид, наличие зерен крахмала, полное отсутствие бактерий и бактероидов, дегенерания инфекционных нитей.

3.2.2. Взаимодействие мутанта Т46 с разными сортами люцерны

Известно, что проявление симбяотяческих свойств клубеньковых бактерий во многом определяется растением-хозяином. Твердо установлено, что симбкотическая эффективность и уровень азотфиксирующей активности бактерий в. meliloti может определяться генотшом макросимбионта - люцерны (Симаров и др., 1990).

В связи с этим нами проведена оценка сортовой специфичности растения-хозяина по способности вступать в симбиоз с ауксотрофным по лейцину мутантом Т46. Для этого ш провели скрининг 4-х сортов люцерны (Зайкевича, Вахшская-233, Вега, Марусинская-425, в 40-кратной повторностк) е условиях стерильного микровегетационного опыта. Результаты этой оценки приведены в табл. I, из которой видно, что пря высок ом титре адтантных клеток в инокулюме (10^ клеток-растение от 10% до 30$ растений вообще оказались лишенными клубеньков. Кроме того, было обнаружено по одному растению сортов Зайкевича и Бега, которые имели красше крупные клубеньки, лишенные, однако,

азоафиксирующей активности и из которых выделялись только ауксо-трофные по лейцину клетки. При использовании для инокуляции мутанта Т46 в низком титре (105 клеток/растение) большинство растений сортов Зайкевича, Бега, Марусинская-425 (около 70^) не имели клубеньков, тогда как для сорта Вахшская-233 таких растений было отмечено 34,2%. Существенно при этом, что исходный прототрофный штамм СХМГ образовывал нормальные азотфиксирующие клубеньки при концентрации бактерий в инокулюме 10^ клеток/растение.

Таблица I

Способность лейцинового ауксотрофа к.теШо-Ы Т46 формировать симбиоз с различными сортами люцерны

Сорт Титр бактерий на I расте-| ние, ( г Число проверенных растений Количество растений {%) без клубе-} с клубеньками ньков ;-1- белыми красны | ми

Зайкевича Ю5 14 64,3+12 35,7+12 0

та7 40 22,5*6,6 75,0+6,8 2,5

Вахшская-233 10 5 21 34,2+10 65,8+10 0

га7 41 31,7+7,8 68,3+7,2 0

Бега то5 19 68,4+10 31,6±Ю 0

то7 61 9,8+3,8 88,5+4 I

Марусинс- 10 5 26 73,1+8,6 26,9+8,6 оО

кая-425 га7 40 20,0+6,3 80,0+6,3 0

Различия статистически достоверны при - Ро^0,01

Полученные нами данные показывают, что на фоне отсутствия заметных межсортовых различий имеет место индивидуальная изменчивость растений.люцерны по характеру ответа на инокуляцию лейциновым аук-сотрофом. Одно из объяснений этих данных может состоять в том, что растения люцерны различаются по способности поддерживать рост ауксотрофа в ризосфере и внутри корневой системы за счет различий в содержании и выделении лейцина е составе корневых эксудатов. Это предположение было проверено путем добавления лейцина (0,2-0,6 М) непосредственно к растениям, инокулированным мутантом Т46. Данные

микровегетационного опыта, однако, показали, что добавление экзогенного лейцина на влияло на формирование симбиоза: растения люцерны либо не имели клубеньков, либо их развитие было блокировано на достаточно ранних стадиях. Эти результаты отличаются от фактов, выявленных группой французских исследователей (Truohet et al., 1980), показавших, что лейциновый ауксотроф, полученный на штамме 15-30 R. meliloti, также как и в наших экспериментах, формировал нефиксируидие азот клубеньки, лишенные по данным электрон-номикроскопического анализа бактерий и бактероидов. Однако при добавлении экзогенного лейцина авторы наблюдали нормальное развитие клубеньков, дифференцировку бактероидов и проявление азотфиксируга-щей активности. Расхождение между нашими результатами и этими данными может быть обусловлено, с одной стороны, особенностями сорта люцерны, который эти авторы использовали. С другой стороны, возможно, что природа мутаций, вызвавших потребность в лейцине, в нашем штамме. СИЯ и в штамме L5-30 , с которым работали французские исследователи, была совершенно различной.

3.2.3. Реклонирование гена 1еи+ в векторе pSUP2o2

Для более детального анализа гена биосинтеза лейцина штамма СИЯ R. me\iloti, участвующего в контроле развития симбиоза, нами проведено его реклонировавде из рекомбинантной космвды, комплемен-тировавшей потребность в лейцине у мутанта Т46. Для этого мы выделяли из .3-х прототрофных г ран ск онъюгакт ов рекомбинантные коемиды, содержащие ген leu+ , трансформировали их в штамм е. coli hbioi. Трансформанты, содержавшие рекомбинантные коемиды, использовали в качестве доноров в трехродительском скрещивании (при помощи PRK2013) с мутантом Т46. При этом оказалось, что частота появления прототрофов на минимальной среде и тетрациклин/неомицин-устойчивых клонов на полной среде была одинакова (10~^). Эти факты послужили дополнительшал подтверждением того, что выделенные в результате первого скрещивания рекомбинантные коемиды несли гены, комплемен-тируицие потребность в лейцине у мутанта Т46. Полученные прототроф-ные трансконъюганты были проверены нами в стерильном микровегетационном опыте. При этом все они образовывали на корнях люцерны нормальные клубеньки и проявляли азотфиксирующую активность (определенную методом ацетиленовой редукции) и эффективность (определенную по массе надземной части высушенных растений), сходные со штам-

мом дикого типа СИЛ.

Из транс^ормантов, которые в этом скрещивании выступали как доноры, были выделены рекомбинантные космиды и проведен их рес-яршшионный анализ..Результаты bcoRl- и Hind ш -рестрикции представлены на рис. 8 (А). Из этого рисунка видно, что 2 из 3-х

EcoRl -рестрицированных космид оказались идентичными и имели "общи*"!" фрагмент размером около 4 т.п.н. с третьей космцдой. Наличие этого "общего" фрагмента позволило предположить, что именно он содержит ген биосинтеза лейцина. Поэтому нами было проведено рекло-нирование этого Фрагмента в составе мобилизуемого вектора pSUP202, Клонирование проводили по содержащему EcoRl -сайт гену хлорамфе-николустойчивости. Полученная рекомбинантная плазмида pSUP202:s4 т.п.н. представлена на рис. 8 (Б).

12 34 5 678 .12

Рис. 8. EcoRI-и Hind III -рестрикция рекомбинант-

ных космид, содержащих гены биосинтеза лейцина

Доротеи: Гель А. I. ДНК фага X ( Hind III); 2-4. рекомбинантные космиды, выделенные из трех прото-трофных трансконъюгантов ( EcoRl); 5. ДНК фага Л ( Hind III); 6-8. рекомбинантные космиды, выделенные из грех прототрофных трансконъюгантов ( Hind III). Гель Б. I. рекомбинантная плазмида pSUP202::leu+ ( EcdR1 ); 2. ДНК фага Л ( Hind III)

Доказательство наличия в клонированном фрагменте гена leu+

было получено двумя способами, tío-первых, было проведено введение рекомбинантной плазмиды pSUP202s:4 т.п.н. в исходный ауксотроф-ннй мутант Т46 при конъюгации с 'использованием в качестве плазмиды - "помощницы" рНК2013.На минимальной среде, содержащей тетрациклин (маркер pSOT202 ) и неомшуш (маркер транспозанта Т46), были отобраны с частотой ТО-® прототрофные трансконъюганты, которые представляли собой leu+/leu" меродиплоиды, возникшие за счет одного акта крэссинговера между гомологичными фрагментами. Б результате такой рекомбинации произошла встройка всей рекомбинантной плазмидн в геном мутанта Т46, обеспечившей за счет наличия в ней leu+ аллеля рост ауксотрофа на минимальной среде.

Другое доказательство наличия в реклонированном фрагменте гена 1ва+ было получено с помощью блот-гибридизации по Саузерну ЕсоШ -рестрицированной тотальной ДНК исходного штамма CXMI, мутанта Т46 и прототрофных трансконъюгантов, содержащих рекомбинант-ную космиду, о меченным по (^Р) реклонированным фрагментом.

A S

1.П.Н.

23,1

9,4 6,6

4,4 <■»

•2.3 2.0

•»8 3 4 5 1 2 3 4

Рис. 9. Блот-гибридизация по Саузерну EcoRl -рестрици-рованной геномной ДНК R. meliloti с плазмидс® pSUP202ss4 т.п.н. (33Р) содержащей ген ieu+

Дорожки: А - ЕсоТ1 рестрикция; Б - блат-гибридизация;

I. Штамм CXMI; 2. Мутант Т46; 3-4. прототрофные трансконъюганты; 5. ДНК фага %( Hind ill)

На рис. 9 представлены результаты этой гибридизации, из которого можно видеть, что фрагмент размером около 10 т.п.н. генома мутанта Т46, гибридизующийся с радиоактивным зондом, приблизительно на 6 т.п.н. больше гябридизующегося фрагмента генома исходного штам-

ма CXMI, что соответствует размеру транспозона Тп5 . Это означает, что.янсерция Tn5 у мутанта Т46 произошла во фрагмент размером 4 т.п.н., содержащий, соответственно, ген биосинтеза лейцина. Геномная ДНК прототрофных трансконыогантов, являющихся меродиплои-дами, Дает 2 зоны гибридизации, поскольку они имеют две копии гена leu. Одна из этих копий ( leu+ ) в составе фрагмента размером 4 т.п.н. находится на рекомбянантной космяде, а другая (leu- )_ в составе фрагмента размером 10 т.п.н. в хромосомной ДНК исходного мутанта Т46. Этот вывод основывается на данных Саузерн-гибридиза-цяи (ряс. 9) показавшей, что меченная изотопом фосфора плазмида pSUï2021 дает положительный сигнал только с высокомолекулярной ДНК (нефрагментированной хромосомой) вдтанта Т46.

3.2.4. Стабильность рекомбянантных космид, содержащих ген leu*

Известно, что ризобии, размножающиеся при взаимодействии с растением-хозяином в ризосфере или непосредственно в клубеньках, могут терять гетерологячную экстрахромосомную ДНК. В частности, плазмида pRK290 являющаяся базовым репликоном для pLAïR5, может утрачиваться с частотой свыше 70% в ризобиях, выделенных из клубеньков ( Williams et al. , 1988). Кроме того, достаточно часто в бактериях, выделенных из клубеньков, отмечается повышение частоты реверсий мутаций ауксотрофяостя ( Pain, 1979).

В связи с этим мы провели скрянинг на наличие космидного маркера (устойчивость к тетрациклину) бактерий, выделенных из клубеньков, образованных прототрофнымя трансконъюгантами, возникшими после комплементации мутанта Т46, а также трансконъгогантами, полученными после введения космяды с генами биосинтеза лейцина в штамм СИЛ. Такое введение было проведено з трехродительском скрещивании штамма CXMI с траноформантом е. coli содержащим рекомбинантную космиду, с использованием плазмида - "помощницы" pRK2013. Это скрещивание также имело свое"; целью получение в клетках ризобий двух "диких" копий генов, контролирующих биосинтез лейцина. При этом мы исходили из того факта, что эти гены принимают участие в контроле азотфиксирующей активности. Соответственно, можно- было ожидать, что наличие в одной клетке двух копий генов leu* будет способствовать увеличению количества их молекулярных продуктов, и, как следствие этого, повышению эффективности азотфяксация.

Для оценки стабильности рекомбинантных космид в мутанте Т46 и штамме СИП после проведения микровегетационного опыта от 5-ти растений, инокулированных соответствующими трансконъюгантами, отделяли по 3 клубенька, из каждого отдельного клубенька, готовили экстракт и из него проводили высев бактерий на полную среду без антибиотиков. Выросшие клоны проверяли на устойчивость к тетрациклину (шркер pLASR5).

Таблица 2

Стабильность рекомбинантной космиды, содержащей ген leu+ в штамме CXMI R. meliloti и мутанте Т46 при их хранении на полной агаризованной среде

Штамм J Число проверенных

I клонов

•р

Число клоков

СХМ1 100 36+4,8

Т46 100 7±2,6

Вероятность досто.еерного различия по статистическим данным =(5,34; Р0 < 0,001)

Параллельно проводили оценку стабильности рекомбинантных космид в трансконъюгантах после их длительного хранения (1,5 мзояца) на полных агаризованных средах при +6°С путем определения в "штрихе" содержания тетрациклинустойчивых клонов. При этом оказалось, что в случае длительного хранения на агаризованных средах 36$ клеток трансконъюганта, полученного на основе исходного штамма СХМ1, утрачивали рекомбинантную космяду с генами биосинтеза лейцина. Для трансконъюганта, полученного после комплементации лейцинового аук-сотрофа Т46, число таких клеток составляло лишь 7% (табл. 2). •Из данных, представленных в табл. 3, можно видеть, что сходная ситуация имела место при выделении бактерий из клубеньков, образованных соответствующими трансконъюгантами. Только 1% бактерий, выделенных из клубеньков, образованных трансконъюгантами, полученными на основе мутанта Т46, утрачивали рекомбинантную космдду. В • то же время для трансконъюгантоз штамма СШ1 среди бактерий, выделенных из клубеньков, было обнаружено 37% клонов, у которых произошла элиминация рекомбкндитных космид. Следует, однако, отметить

Таблица 3

Стабильность рекомбинантной космвды, содержащей ген leu+, в бактериях, выделенных из клубеньков,, образованных трансконъго-гантами штамма СПЯ и мутанта Т46 R. meliioti

Растение ¡Клубе- ¡Число прове- ¡Число Тс ¡^ 'Го кло- \% То клонов ; нек ¡ренных кло- ; клонов ¡нов в клу- ¡на растенло I I нов I (беньке (

Штамм СИЯ

I I 25 25 100

2 24 4 16,6 38,8

3 25 0 0

п 1 2 27 25 2 25 7,4 100 53,7

Т 24 25 100

ш 2 3 25 27 6 5 24 18,5 47,5

I 25 0 0

17 2 24 3 12,5 9,5

3 25 4 • 16

I 27 27 100

У 2 25 4 16 44,2

3 24 4 16,6

Мутант Т46

I Г 25 2 8 4

2 27 0 0 '

I 25 I 4

гг 2 25 2 8 8

3 25 3 12

I 27 4 14,8 11,4

ш 2 25 2 8

I 25 4 16

г/ 2 25 2 8 8

3 27 0 0

У 1 2 25 48 1 2 4 4,2 4,1 общее: 7,1%

индивидуальную изменит ость растения-хозяина по степени элиминации в клубеньках рекомбинантной космиды и существенные различия кежду отдельными клубеньками.

Полученные данные позволяют предполагать, что эти различия ме-эду трансконъюгантамя обусловлены селективным значением космид, содержащих ген Хеи+ для размножения клеток мутанта Т46 как в чисто"' культуре, так и при взаимодействии с растением-хозяином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные показывают, что ауксотрофность по лейцину у штамма СИЛ R.meliloti приводит к утрате способности формировать азотфиксирующий симбиоз.с люцерной. Участие генов биосинтеза ле":цина в развитии симбиоза, в частности, доказано путем комплементации потребности я это*! аминокислоте у мутанта Т46 косшдным банком генов, которая сопровотдалась восстановлением одновременно прототро^ности и симбиотических свойств. Вместе с тем, остается не ясной природа связи между биосинтезом лейцина и способностью R. meliloti к азотфиксярувщему симбиозу. Ранее было показано, что ле'Ьщновый ауксотроф штамма 15-30 R. meliloti , также как в нашем случае, образовывал на корнях люцерны белые нефиксиругадие . азот клубеньки, в которых отсутствовали клетки микросимбионта (Truotiet et al. , 1980). Однако по данным этих авторов, добавление лейцина непосредственно к инокулированным растениям позволяло ризобиям размножаться внутри клубенька, дифференцироваться в бактероиды и, в конечном итоге, проявлять азотфиксирующую активность. Било Еьгсказано предположение, что утрата азотфиксирущей активности этим мутантом обусловлена чисто трофической ролью лейцина, которым растение-хозяин неспособно в достаточной степени снабжать му-тантные клетки, что приводит к их гибели внутри клубенька и, соответственно, к блоку в развитии этого органа. По нашим же данным, лейциновыА ауксотроф Т46 мог формировать достаточно зрелые клубеньки на некоторых растениях люцерны. Большинство растений при высоком титре бактерий в инокулюме тлели белые нефиксирующие азот клубеньки, а часть растений били лишена клубеньков полностью. Такая изменчивость могла бы быть объяснена различным содержанием в растениях лейцина, который в той или иной степени способен поддерживать рост бактерий, позволяя им индуцировать развитие клубеньков. Однако, добавление лейцина и даже полной синтетической среды (ТУ) /

к ин окулярованным проросткам люцерны на приводило к восстановлению у мутанта Т46 способности к развитию азотфиксиругацего симбиоза. В этой связи трофическая роль лейцина в экспрессии симбиоти-ческих свойств ризобяй представляется маловероятной. Об этом же могут свидетельствовать результаты ряда исследований, в которых показано, что мутации в двух картированных генах биосинтеза лейцина штамма 2011 R. meliloti не влияют на его симбиотические свойства (Meade, Signer , 1977), а из трех "лейциновых" генов штамма 41 R. meliloti мутация только в одном из них оказалась, по данным картирования, тесно сцепленной с мутацией, вызвавшей утрату азотфиксирующей активности ( Foxrai et ai. , 1983). Показано также, что ауксотрофность по лейцину не оказывала влияния на симбиотические свойства бактерий R. trifolii , которые также как R. meliloti , вступают в симбиоз с мелкосемянным, очевидно небогатым этой аминокислотой бобовым растением - клевером ( Johnston, Beringer , 1977). Поэтому более адекватным представляется объяснение полученных нами результатов, согласно которому промежуточные метаболиты биосинтеза лейцина или ферменты, катализирующие их образование, участвуют в синтезе "молекулярных сигналов", вырабатываемых, мякросямбионтом я необходимых для нормального развития симбиоза. Можно предполагать также, что у полученного нами мутанта, вследствие блока в.биосинтезе лейцина, выработка таких "сигналов" резко ослаблена. Однако, из-за того, что растения люцерны, > различаясь, по-ввдямому, по чувствительности к их действию, неспособны к полноценной активации соответствующих генов и выработке продуктов (нодулинов), необходимых для нормального развития симбиоза, морфогенез клубенька может быть блокирован на ранних или поздних стадиях. Альтернативное объяснение может состоять в том, что у мутанта Т46 встройка Тп5 произошла в сайт, тесно сцепленный с генами биосинтеза лейцина, участвующий в контроле развития симбиоза, а ауксотрофность по этой аминокислоте является проявлением "полярного эффекта" янсерции транспозона (Хесин, 1985). При этом возможна и обратная ситуация, когда янсерцяя Тп5 может быть локализована непосредственно в одном кз генов биосинтеза лейцина, а утрата азотфиксирующей активности обусловлена инактивацией расположенного поблизости fix-гена, конкретная функция которого не известна.

Таким образом, представленные данные создают предпосылки для

более детального изучения связи между биосинтезом лейцина у r. meliloti и экспрессией их симбиотических свойств. В частности, одно из приведенных выше объяснений этой связи может получить подтверждение в результате проведения картирования реклонированного фрагмента, содержащего ген leu+ , с помощью "насыщающего" транс-,iU.;v,noporo мутагенеза. С одной стороны, такое картирование позволит выяеить дополнительные гены, участвующие в биосинтезе лейцина, и оценить их роль в развитии симбиоза. С другой стороны, в этом фрагменте может быть идентифицирован сцепленный с геном биосинтеза лейцина ген, контролирующий размножение и дифференцировку ризо-бий в корневой системе люцерны.

ВЫВОДЫ

Г. На основе космидного вектора pL¿PR5 построен банк генов Rhizobium meliloti. •

2. Из банка генов R. meliloti выделен фрагмент гонома штамма CXMI, содержащий "криптический" fix-ген, инсерция в который транспозона привела я утрате азотфиксирующей активности. Показано, что этот ген имеет мегаплазмидную локализацию.

3. С использованием космидного банка генов R.meliloti и плаз-мидн "помощницы" pRK2013 в конъюгационном скрещивании проведена комплементация ауксотрофного по лейцину транспозонового мутанта, утратившего способность формировать азотфиксирующиЭ симбиоз с люцерной. Получены трансконъюганты, способные к росту на минимальной среде и к образованию нормальных азотфиксирующих клубеньков, которые по данным ультраструктурного анализа, проведенного с помощью электронной микроскопии, оказались сходными с клубеньками, индуцированными исходным штаммом CXMI.

4. Выделены рекомбинантные космиды, содержащие гены биосинтеза лейцина, необходимые для нормального развития симбиоза R.meliloti с люцерной. Проведен рестрякционный анализ этих к осмид,' идентифицирован и реклонирован в векторе psüP202 EcgR1 -фрагмент размером 4 т.п.н., в котором выявлены гены биосинтеза лейцина.

5. Показана сортовая и индивидуальная изменчивость люцерны по способности образовывать клубеньки при инокуляции ауксотрофным по лейцину мутантом Т46. При этом добавление лейцина непосредственно к инокулированным растениям не приводило к развитию азотфиксирую-щего симбиоза.

6. Показано, что введение дополнительной копии генов биосинтеза лейцина в составе рекомбинантяой космиды в штамм CXMI не приводит к повышению его эффективности и азотфиксирующей активности. При этом рекомбянантная космида с генами leu+ в штамме CMI проявляет существенно пониженную стабильность кал в свободноживу-щих бактериях, так и в клубеньках по сравнению с прототрофными трансконъюгантами, полученными на основе мутанта Т46.

7. Предполагается, что гены бносинтеза лейцина либо непосредственно участвуют в контроле развития симбиоза, либо тесно сцеплены с регуляторным геном, ответственным за продукцию "молекулярных сигналов", индуцирующих образование клубеньков у растений люцерны, которые могут проявлять индивидуальную изменчивость по восприимчивости этих сигналов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Мебуке Н.Ш., Буряханов Ш.С., Умаров Б.Р., Аронштам A.A., Симаров Б .В. Клонирование in vivo фрагментов экстрахромосомной ДНК клубеньковых бактерий люцерны // В сб.: Всесоюзная конференция "Микроорганизмы - стимуляторы я ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент, 3-5 октября Г989 г.). Тезисы докладов, 1989, С. 128-129. .

2. Умаров Б.Р., Аронштам A.A., Расулов A.C., Симаров Б.В. Локализация в геноме клубеньковых бактерий люцерны генов, контролирующих а'зотфикоирующую активность // Узб. биол. журнал. - T99I,

6. - u. I3-Í6.

3. Умаров Б.Р., Ивашина Т.В., Аронштам A.A., Расулов A.C., Халмурадов А.Г. Создание банка генов- "Rbizoblum meliloti" //ДАП России. - 19Э2. - Т. 324, № I. - С. 227-228.

4. Умаров Б.Р., Ерко В.Н., Аронштам A.A., Расулов A.C., Халмурадов А.Г. Молекулярное клонирование гена биосинтеза лейцина у

R. meliloti, участвующего в контроле развития азотфяксярующего симбиоза с люцерной //ДАН России. - 1992. - Т. 324, I? 2. - U.46S-470.

5. Лебский В.К., Аронштам A.A., Умаров Б.Р., Ерко В.Н., Расулов A.C., Халмурадов А.Г. Молекулярно-генетяческяй анализ симбир-тических свойств Rbizobium meliloti // ДАН России. - 1992. -

Т. 324, К Г. - С. 224-226.

6. Умаров Б.Р., Ивашина Т.В., Аронштам A.A., Расулов A.C.,

Халмурадов А.Г. Молекулярное клонирование фрагмента генома Rbi-zobium meliloti , участвующего в контроле симбиотической азотфик-сации с люцерной // ДАН России. - 1992. - Т.324, 1 4. - С. 890892. .

7. Умаров Б .Р., Расулов А.и,, Халму радов АД1. Конструирова- -ние банка-генов- "Rhizobium meliloti" // В сб.: 6 съезда Узбекского республиканского общества генетиков и селекционер® (Ташкент, 16-18 сентября 1992 г.). Тезисы докладов, 1992. - С. 132.

8. Умаров БJP., Расулов A.C., Халмурадов А.Г. Молекулярное клонирование гена, ответственного за биосинтез лейцина у Rhizobium meliloti участвующего в генетическом контроле развития азот-фиксирующего симбиоза с лщерной // В сб.: 6 съезда Узбекского республиканского общества генетиков и селекционеров (Ташкент, 1618 сентября 1992 г.). Тезисы докладов, I9S2. - С. 132-133.

УЗЕЕКИСТОН ФАЕДА? АКАДЕМШЖ

шкрсбишогш ммгохи

УМАРОВ ЕАХТИЕР РАЖАТОВШ

Биология фанлари номзоди илмяй унвонини олиш учун

АВТОРЕФЕРАТ

"АЗОТНИ ТШ7НЛЖГИРШ БУЙИЧА БЕДА БШАН ЕАКТЕРИШ1АРНИ

БИРБИРЩАН Ф0ЩЩ1АНИБ РИВ01ЛАНИЩЦА ЭДТНАШАДИГАН ЛЕЙЦИННИ

ШОСИНТШСВЧИ ГЕННИ КЛОШШ ЩСАДЦЦА RHIZOBIUM MELILOTI ШТАМИНИ КОСЭДЦА БАБКВДАН ФО!ЙАЛАНИШ"

ипнинг умумий мазмш

Тп5 одтагенез методи билан агмосферадан эркин азотни з?злаш-тирувчи беда ялдизвдагя туганахля бактерия Rhizobium meliloti CXMI штамида лейцин аминокислотасини биосинтез к^шаолмайдиган ва бир йула азот Узлаштириш цобилиятини хам йуцотган мутант формаси олинди (Т46).

pLAPR5 вектор ёрдамида худди шундай туганакли бактерия Rhizobium meliloti CXMI-T505 штамидан фойдаланиб генлар банки яра-телди, шу генлар банки ва ёрдамчя плазмяда pRK 2СПЗ иштирокида Т46 мутант туйинтирилди. Лейцинни биосинтез кдладиган ген утка-

зилди ва бу штаада (Т46) лейцян гени утгандан кейин уни Тк46 деб белгяладяк. Тк46 штаглини беда устллиги билан зарарладта. Беда усимлигини шу штам Тк46 билан симбяоз халда атмосферадан азотни ^злаптириш ^обилиятя пайдо булганляги кузатилди- Хосил булган ту-ганакля бакториялар электрон микроскоп ёрцамида урганиб чшуиди, лейцинни биосинтез 1\иладиган ген plAFRj космидасидан 4 т.п.н. узунлигида pSUP202 плазмидасига ^айтадан тикиб купайтирилдя ва уни азотни узлаштяриш роли, унинг ирсияти мукаммал урганилди. Ген-лар банкидан ирсиятни урганишдаги мав^еини курсатиш учун генлар банкидан номалум fix: :Тп5 ген акратиб олинди. Бу ген Тп5 билан нишонланган булиб уни '"зонд" сифатида ишлатилиши мумкинлиги кур-сатилди.

INSTITUTE OF MICROBIOLOGY ACADEMY OF SCIENCE OF UZBEK REPUBLIC. TASHKENT, UZBEKISTAN

UMAROV BAKHTIAR

THE USE OF COSMID GENE BANK OF RHIZOBIUM MELILOTI FOR MOLECULAR CLONING OF LEUCINE BIOSYNTHESIS GENE, INVOLVED IN GENETIC CONTROL OF NITROGEN FIXING SYMBIOSIS WITH ALFALFA

SUMMARY

Using random Tn^-mutagenesia we have obtained the leucine-, auxotrophic mutant of strain Rhizobium meliloti CXM1, which formed on alfalfa the nodules uncapable of nitrogen fixation. We have constructed the сosmid gene bank of R. meliloti on the vector pLAFR5. Using this bank and the helper plasmid pRK2013 we coapleeented the leucine - requiring mutant T46 and selected prototrophic exconjugants which formed normal nitrogen fixing nodules- However, the analysis of rbizobia, isolated from nodules, revealed, that the loss of recombinant cosmid with leu+ gene, could take place during the bacterial proliferation inside a root tissue and in free living state. These data indicate that the leucine biosynthesis genes of Rhizobium reliloti are involved in the symbiotic development.