Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие локуса биосинтеза лейцина RHIZOBIUM MELILOTI в развитии азотфиксирующего симбиоза с люцерной (Medicago sativa L.)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Участие локуса биосинтеза лейцина RHIZOBIUM MELILOTI в развитии азотфиксирующего симбиоза с люцерной (Medicago sativa L.)"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕЛІІЯ НАУК УКРАЇНІ! ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

ЄРКО Володимир Миколайович

УЧАСТЬ ЛОКУСУ БІОСИНТЕЗУ ЛЕЙЦИНУ RHIZOBIUM MEL1LOTI В РОЗВИТКУ АЗОТФІКСУЮЧОГО СИМБІОЗУ З ЛЮЦЕРНОЮ (Medicago sativa L.)

О

На правах рукопису

03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ — 1994

Робота викопана у відділі симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики Національної академії наук України м. Київ

Наукові керівники:

доктор біологічних'наук Старче її ков Юхим Полікарпович

кандидат біологічних наук А ром штам Олександр Архадійович

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, член-кореспондент Національної академії наук України, професор Мацелюх Богдан Павлович

кандидат біологічних наук Козировська Наталія Олексіївна

Провідна установа:

Київський державний університет ім. Т. Г. Шевченка.

Захист дисертації відбудеться » / fid¡994 р

о J0_ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 016.57.01 по захисту дисертацій на здобуття наукового ступеня доктора наук при Інституті фізіології рослин і генетики АН України за адресою: 252022, Київ 22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики АН України.

Автореферат розісланий « /{/ » 1994 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Труханов В. А.

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Проблема біологічної фІкса'Ш молекулярного азоту 8 однією Із найбільш складних фундаментальних проблем біології 1 надзвичайно актуальною для сільськогосподарської біології, тому що вона напряму пов'язана з врожайністю важливих кормових культур - бобових рослин. Безперечно, що майбутні перспективи на покращення азотної зкономіки вищих рослин шляхом генетичних маніпуляцій з азотфіксуючими мікроорганізмами залежать від наших фундаментальних знань генетики 1 молекулярної біології цього складного процесу. Значний резерв для підвищення ефективності симбіозу мік мікроорганізмами 1 вищими рослинами полягав в направленому конструюванні штамів мікроорганізмів, які безпосередньо забезпечують своїх рослин-господарів фіксованим із повітря азотом. Проте, покращення симбіотичішх властивостей цих мікроорганізмів неможливе без ретельного гоїш-тичлого аналізу всіх факторів, які забезпечують такий складгоШ молекулярний процес як симбіотична азотфіксація. Симбіоз між ЯНІгоЬІт теШоИ 1 вевіссщо ваИт Ь. може виступати як широко вивчений приклад комплексної взаємодії між рослішою 1 бактеріями.

Одержання у ризобій ауксотрофи* мутантів дало початок вивченню взаємозв’язку між їх первинним метаболізмом 1 симбіотичними властивостями 1 виявило, що деякі ферменти, які прийма-' ють участь у метаболізмі амінокислот конче необхідні для нормального протікання процесу азотфіксації або формування симбіозу. Зокрема, вивчення ауксоторфних по лейцину мутантів КМу.о-Ьіт теШоН показало, що вони формують на люцерн! білі, нездатні до азотфіксації бульбочки, що говорить про можливу участь ферментів біосинтезу лейцину в утворенні ефективного.симбіозу (Тгиоііеи 1980). Крім того, метаболізм лоЯципу тісно пов’язашій Із метаболізмом глютамату, важливість якого для симбіозу безперечно доведена (Евстигнеева, 1968). Але на відміну від ЩзІ 'амінокислоти, про роль лейцину у симбіозі і досі нічого невідомо. В зв'язку Із вищесказаним зрозуміла необхідність вивчення ролі лейцину 1 ферментів його метаболізму у Формуванні азотфіксуючого симбіозу Я.теїііоіі з люцерною.

ИЕГОВ даної роботе було: вивчити вплив генів біосинтезу лоШцшу бульбочкових бактерій (ЯПігоЬІш теІІІоИ) на формування азотфіксуючого симбіозу з люцерною (Нес11са£0 ваИт Ь.). В зв'язку з цим. були поставлені такі ЗАДАЧІ:

1. Використовуючи метод неспецифічного транспозонового му-

тагенезу одоржати ауксотрофи 1 за лейцином мутанти бульбочкових бактерій люцерни; /

2. Використовуючи банк генів ШІгоЬіш теІІІоИ ¡тонувати Фрагмент геному, що містить ген біосинтезу лейцину, Інсерція транспозону в який веде до втрати властивості утворювати азотфіксуючий симбіоз Із люцерною;

3. З’ясувати звязок між біосинтезом лейцину 1 симбіотичними властивостями бульбочкових бактерій люцерни. ■ .

НАУКОВА НОВИЗНА. Одержано ауксотрофний за лейцином мутант ытаму ЯМгоЫт п&ІІІоИ СХМІ, симбіотичні властивості якого відрізняються від описаних в літературі. Проведено клонування. Ідентифікацію, роклонування в різні вектори 1 фізичне картування локусу, який відповідав за біосинтез лейцину, показана його участь в формуванні азотфіксуючого симбіозу з люцерною. Продемонстрована сортова 1 індивідуальна мінливість рослини-госпо-даря по здатності вступати в симбіоз Із використаним в роботі лейцановим мутантом Я.ие2ПоГ(. Показано, що ця мінливість не обумовлена трофічними потребами в лейцині у ауксотрофного мутанти. Цой факт, а також результати комплементації лейцинової ауксотрофцості даного мутанта банками генів Я.тпеШоИ СХМІ 1 ¡1.1е$ит1пааагісп Ьу.иісеае урз9 дозволив висунути твердження про функціональну важливість локусу біосинтезу лейцину при створенні азотфіксуючого симбіозу 1 можливість існуваїшя тісно зчепленого з геном біосинтезу лейцину гену, що відповідає за симбіоз.

ТЕОРЕТИЧНЕ 1 ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ. Показана участь одного Із локусів біосинтезу лейцину д.іяеШоМ СХЫ1 у створенні симбіозу з люцерною, мутація в якому приводить до блокування виходу бульбочкових бактерій Із інфекційних шток в клітини кореню рослині. Показана можливість Існувагош тісно зчепленого з лейіишо-вим локусом гена, що відповідав за розвиток симбіозу між ризо-61 ями 1 люцерною.

'■■'З

Виявлена мінливість рослини-господаря по здатності встута-и п симбіоз Із ауксотрофним за лейцином мутантом відкривав пер-■поктіши для сдлвкцII люцерни з підвищеною чутлгазіст» на іноку-іяцію бульбочковими бактеріями 1, відповідно, більш високим ізотфіксуючпм потенціалом та врожайністю.

ПОЛОЖЕННЯ, ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА З АИСТ. .

. Мутація в одному з леАципових локусів Я.теШоН С ХНІ пряво-еить до ауксотрофпості за лейцином 1 блокуваїшя розвитку симбі-!3у МІЯ буЛЬОЧКОВИМИ Оактеріяш 1 рослинами люцерни {ЇЇЄйІС0£0 кіИт Ь.) за рахунок гибелі бактерій в Інфекційній нитці. Прп іьому додаваїшя екзогенного лейцину у потшіш соредопгаце. не іриводить до відновлення симбіозу.

!. Існує велика Індивідуальна мінливість люцерни в меаах сортів за здатністю утворювати бульбочки при інокуляції мутантом Т46, ю свідчить про неоднорідність сортів по бульбочкоутворенню при Інокуляції ауксотрофом Із мутацією в локусі біосинтезу лейцину. 5. Меродиплоідія 1 поліплоїдія по лейциповому локусу у стані Я.тэШоИ СХШ не приводить до змін в розвитку симбіозу, азотфіксуючої активності 1 ефективності штаму.

1. Лейцяновий локус бульбочкових бактерій люцерни функціонально важливий для формування симбіозу мія ШІгоЬІит тзШоИ ! Шейі-гсща за і І ікі 1 може утримувати регуляторний ген, що відповідав за продукцію "молекулярних сигналів", які Індукують утворення Зульбочок у рослин.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертації доповідались па 1-ому Мікнародному конгресі "Сго.5б1оз" (Єрусалим, 1991), 6-ому Всесоюзному Біохімічпому з'їзді (Санкт-Петербург,1992). 8-ому з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса,19ЭЗ).

ПУБЛІКАЦІЇ. За мятбріалшяг дисертації опубліковано 4 статті.

СТРУКТУРА І ОБ'ЄМ ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертація викладена па 127 сторінках машинописного тексту 1 в своєму складі мас 3 таблиць 1 ІЗ малюнків. Бібліографія включає 145 дарел. Дисертація складається Із вступу, огляду літератури, методів дослідження, експериментальних результатів 1 їх обговорення, заключения, -висновків, доповнення 1 списку літератури.

1-3281

ОБ'ЄКТИ І НЕГОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

ЕШ0 БАКТЕРІЙ і ПЛАЗМІДИ. В роботі були використані: штами бульбочкових бактерій люцерни Bxlzdblm meltlotl Із колекції лабораторії генетики 1 селекції мікроорганізмів Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології (м.Санкт-Петербург); штами кишкової палички Eaclxrlchla сої НВ101 (hsdS, hadli, pro, leu, thi, gal,laoY (Маниатис,Фрич,І984 S17-1 (F~. reoA, hadR-, несе модифіковану плазміду RP4, бе; маркерів Ар1", Тог, KnF (Simon, Priefer, 1983); плазміди pRK20i: (Kmr, СоіЕі реплікон, що утримує tra-гени плазміди pRK2) (Figurski, Неїineki,1979), pSUP202 (Apr, Тог, Cmr, mob-сайт RP4) (Simon, O'Connell,1986), pSUP104 (pACY0184::mob, nio, oriV, rej 13 RSF1010, To1’, Cmr) (Prieier,Siraon,I985). pSUP2021 (Apr, Cmr PBR325: :mob,Tn5) (Simon, Priefer,IS83); банки генів Bilizoblvm mlllotl Cm 1 Rhtzoblum legmlnoBarum bv, vlceae YF39, побудовані на основі космід рЬАРВД 1 pULFRl, відповідно (Умаров, ' Ивашша,І992). ■

ГЕНЕТИЧНІ І БІОХІШЧНЇ ШЩН. Їп5 цугагепез 1 аналіз мутантів Введення транспозону в штам СХШ Fhlzoblum meliloti було проведено при схрещуванні Із штамом Escherichia coll S17-1, що утримував плазміду pSUP202i, за допомогою процедури описаної в літературі (Simon, O'Connell,1986). Стійкі до неоміцнну транс-кон'вганти перевірялись на здатність рости на мінімальному середовищі. Ідентифікацію ауксотрофів проводили, використовуючи суміші різних амінокислот, азотистих основ 1 вітамінів (Davis, 1980).

Аналіз плазаідного склад? кзїодон "лізису в гелі" проводили на основі електрофорезу за Еісхардтом (Eokhardt,I978).

Для вндіяєгазя пяазнід Із штамів Б.соїі 1 R.melllotl застосовували метод Бірнбойка 1 Долі (Bimboim,I979).

Прзтрагавпз вцаїлзшш плазмід. Пропаратпвне виділення шазмід для реклонування leu фрагменту Із pLAPR5::1еи в pSUP202 1 ре-клонування leu фрагменту Із pSUP202::leu в psupi04 проводили 1с штамів E.coll за допомогою метода Бірнбойма 1 Долі (Birnboim, Doly,1979) з подальшою очисткою центрифугуванням в двохступене-

б

ому градієнті СзСі (Машатис,Фрич,І984).

¡вділений тотальпої ДШС Fhlztibliai melllotl проводили у відпо-іідності з методикой (Магаіатис,І984).

^стрзісційшіа аналіз 1 лігуваннл. Використовували ендонуклеази юстрикції EooRl, Hind.UI 1 Xhol, а такоа ДНК-лІгазу фагу Т4 ;яНП0 Фермент", м.Вільнюс). Буфори для рестрикції готували :трого по Інструїщії заводу-виробника. Рестрикцію проводили при І7°С, лігування - при І2°С. , ,

їрзготувзішя коышзтенппп клітин E.colt проводила з .використавші СаС12. трансформацію проводили у відповідності з методикою (Машіагис, врич, 1934).

(оз’югаціа міа штамами R.meHlott 1 E.coll проводили у спів-іідпошонні 5:1 клітин, відповідно (Simon, 1988).

Скоїла пзнтац la ауксотрофзості мутанту Т45 банкаш гонів. Для гамплемептаці1 лейцинової ауксотрофності мутанту R.те І Ilot і Т46 Зули використані банки генів R.melllott CM і R.legumlnosarwn av. vlceae VT39. Штами E.coli HB101, ідо мали в своему складі їосміди ptAPR'3 і pLAPRi з Фрагментами ДНК геному бульбочкових зактерій люцерни 1 бульбочкових б акторі її вики, відповідно, а гакоя плазміду pRK20i3 вирощували ніч на рідкому середовищі 1В, з відловідіотл антибіотиком при 200 об./хв. Штам R.melllott Т4в вирощували на рідкому середовищі ДГМ з добавкою Ки (100 мг/л) добу при 200 об./хв. Для схрещування брали 20 мої суспензії клітин E.coll НВ101 з відповідним банком генів, 20 MKJÍ - E.colt НВ101(pRK20i3) 1 100 нкл R.melllott Т46 з однаковою оптичною цільністю, перемішували їх, концентрували центрифугуванням в 20 мил стерильної води 1 кон'югаційну суміш наносили на чшяку Пет-рі з твердим середовищем LB. Схрещування проводили ніч. Готува-' ли відповідні розведення кон'югаційної суміші 1 висівали їх па мінімальне середовище, доповнене 600 мг/л Str. Клони, які виростали на цьому середовищі, пересівали на повні 1 мінімальні середовища з То (20 мг/л) 1 з №п (200 мг/л).

Ег.от-гібридизація ДНК. Блот гібридизація проводилась «а основі широко відомої методики (Маниатис, Фрич, 1984) з додаванням в гібридизаційній буфер формамІду. В реакції иік-трансляції використовували мічені t Р] дезоксінуклеотида (ІЯФ All Узбекістпну)

1Х-328»

Рекдолуваиня leu фрагменту ДНК R.melllotl СХШ. Реклонування EooRI leu фрагменту ДНК Із рокомбінантної косміди pLA.FR5::leu в ШігіЗМІДУ pSUP202 1 ІЗ pSUP202::leu В pSUP104 проводили за допомогою рестрикції EcoRi ендонуклеазою плазмідних ДІЙ pLA?R5::leu

1 pSUP202::lcU, розділення їх EooRI фрагментів електрофорезом в

0,7% агарозному гелі 1 подальшим переносом leu Фрагменту на deae-бумагу. ДЯК з DKAE-бумаги змішали розчином І U Nací в ТЕ буфері, лроінкубувавши II при СО°С І год. з подальшим осадазішяі ДНК двома об'ємами спирту, розчиненням II в н2о 1 літуванням з відповідною, лінеарізованою по EooRI сайту плазмїдою.

ВИВЧЕННЯ СИМБІОТИЧНІЙ ВЛАСТИВОСТЕЙ ШТАШВ. Оцінку симбіотичних властивостей штамів проводили в умовах мікровегетеційних 1 вегетаційних дослідів.

Иікровогетадійпі досліди. Насіння люцерни Hedí cago sativa L. стерилізували концентрованою сірчаною кислотою 2 хв., промивали стерильною дистильвано» водою 1 пророіцували добу в чашках Потрі на вологій фільтрувальній бумазі. В скляні пробірки.(20x160 їм)

О ’

Із стерильним вермікулітом (15 см ) 1 середовищем Красильшшо-ва-Короішко (Федоров,I95J) висаджували по одному проростку. Через три доби проводили Інокуляцію, використовуючи І мл добової культури бульбочкових бактерій необхідного титру в розчині МІК-рослементів (Федоров,1951). Рослини виродували при 16-годшшому фотоперіоді 1 додатковому освітленні 40 000 лк в теплиці 35 днів. Длл оцінки азотфіксуючої активності використовували метод ацетиленової редукції (Hardy,Holsten,1968). Для цього пробірки з рослинами закривали герметично ковпачками 1 вводили в них по В см3 ацетилену (10% від об'єму пробірки). Через 24 години проводам відбір проб Із кожної пробірки 1 аналізували ацатшшнре-дукці» на газовому хроматоі’рафі "Пвет-106". Ефективність симбіозу оціїашали по сухій мас 1 наростків рослин.

Вегетаційні досліди. Длл вирощування люцерни в вегетаційних дослідах використовували посудини Вагнера на 8 кг грунту (опід-золоний чорнозим, поромішаний з піском у співвідношенні 3:1, вологоємність ЗІ*) у який додавали пожившій розчин Прянішнікова (Гродзкнсклй,І904) з 0,1 норми азоту 1 мікроелементи (Федоров,

1951).Сухе насіши люцерни висадаували в посудини Ьагнера по 50

насішш/сосуд. На фазі розвитку 2-3 листки проростки проривали залишаючи по 10 рослгаї/сосуд. Повторне проривання проводили на фазі 5-6 листків, залишаючи по Є рослин/сосуд. Для визначення ацвтиленредуїсці І корені росліш відмивали від грунту, відділяли від рослин 1 по два кореня помішали в герметичні сосуди на 60 гал, з яких шприцем відбирали по б мл повітря 1 накачували по 5 т ацетилену. Редукцію ацетилену визначали через годину Інкубації при 28°С на газовому хроматограф1 "Chrom Б04". Вфоктив-ність симбіозу оцінювали по накопиченню сухої надземної маси рослин/сосуд 1 по Індивідуальній сухій масі паростків росліш. ВВДЇЛЕШЇЯ БАКТЕРІЙ Î3 БУЛЬБОЧОК. Бульбочки відділяли від коренів, стерилізували в 96% етанолі І хв. 1 промітали стерильною водою. Кожну бульбочку гомогенізували за допомого» скляної палички в 20 шиї стерильної води в пробірках "епвцдорф". Розведення одержаної суспензії висівали на повне 1 селективні середовища.

УЛЬТРАСТРУКТУРНИЙ АНАЛІЗ БУЛЬБОЧОК. Бульбочки відділяли від 35-добових росліш люцерни 1 фіксували 2,5% глютаровому альдегіді на какодплатному буфері (0,1 М, pH 7,4) 1 дофіїссували розчином OsO^ (ISS) на такому к буфері 1 водним розчином галлової кислоти (ІЗ). Збезводнені в етанолі зростаючої концентрації 1 ацетоні бульбочки поміщали в суміш аралдітів з" подальшою полімеризацією. Зрізи, одержані на ультратомі "Reichert - Young", забарвлювали уранілацетатом 1 цитратом свинцю 1 вивчали в електронному' мікроскопі Н-ЗОО (Hitachi) при прискорюючій напрузі 70 иУ.

РЕЗУЛЬТАТИ 1 ОБГОВОРЕННЯ.

0 ДЕРЗАННЯ АУКСОТРОвНОГО ЗД ЛЕЩИНОИ ШТАНГУ Л. ml Ilot І.

В результаті неспецифічного транспозонового мутагенезу гатаму R.melllotl СХМІ одержано 3000 транспозантів, серед яких відібрано 9 ауксотрофів. Серед них, в результаті стерильного мікро-ввгетаційного досліду, були виявлені З ріх" мутанти. Рослини, Інокульовані цими мутантами, проявляли характерні ознаки азотного голодування 1 мали масу в 2-3 рази меняу у порівнянні з вихідним штамом СХМІ (Табл.І). Визначення ростових потреб яук-сотрофпих мутантів показало, що ноздатпість до росту на міні-

2-3 28к

мальному середовищі мутанта R. melllott T46 пов’язана з бло ком в синтезі амінокислоти -лойиину. Цей мутант виявився дуже стабільним 1 практично не ревортував до прототрофності навіть при висіві на чашку ІО9 клітин. Вік формував на рослинах дрібні, білі, нездатні до азотфіксації бульбочки, з яких, при висіванні вмісту бульбочок, не виділялись бульбочкові бактерії.

ВЗАЄМОДІЯ ктигу R.melllotl Т46 З ИЗШШ СОРТАІЗІ ЛЮЦЕРНИ.

Мінливість рослиш-господаря може вплішати на прояв симбіотичних властивостей ризобій, у яких виникли мутації в генах-, що контролюють синтез деяких метаболітів 1 відповідають за нормальний розвиток симбіозу. В зв.язку з цим було проведено оцінку сортової специфічності рослинп-господаря на здатність вступати у симбіоз з ауксотрофом R.melllotl 146. Для цього провели скршіїнг 4-х сортів люцерни (Зайкевича, Вахшська-233, Вега 1 Иарусинська-425; в 40-крати1й повторності) в умовах стерильного мікровегетаційного досліду в пробірках. Результати цієї оцінки приведені в табл.2, Із якої видно, що при високому титрі мутантних клітин в Інокулжмі (ІО1* клітин/рослину) від 10 до 30% рослин виявились зовсім позбавленими бульбочок. Крім цього, було виявлено по одній рослині сортів Зайкевича I Вега, які кали червоні крупні бульбочки, позбавлені, однак, азотфіксуючої активності, Із яких виділялись тільки ауксотрофні по лейцину клітини. При використанні для інокуляції суспензії мутанту T4S з • низьким титром (ІО5 клітин/рослину) більшість рослин сортів Зайкевича, Вега, Марусинська-425 (біля 70%) не шли бульбочок, тоді як для сорту Вахшська-233 таких рослин було відмічено 34,2%. Суттєво, що вихідний штам СХШ формував нормальні азотфіксуючі бульбочки при титрі бактерій в Інокулюмі ІО3 клітин на рослину. Тобто, здатність до утворення бульбочок у мутанта зни-

I Табл.І. ^Йаса сухих паросте1 в™ люцерни с.Зайкевича Інокульва-них вихідним штамом R.melllotl СХМІ та його Fiz~ транспо-зантами.

мутант маса рослини,мг

СХМІ 24,2

Т46 9,4 7,1

ТЄ8 Н,7

Т70 II ,3

Табл.2. Здатність лойцинового ауксотрофу Т46 Н.тпеїііоа утворювати бульбочки на лвдерні різких сортів. '

Сорт Титр бактерій на одну рослішу Число переві- рених рослин кількість рослин, % 2**р

без бульбо- чок з бульбочками

білими червоними

Зайкевича ІО7 40 22,5 75,0 2,Б б.І

ІО5 14 64,3 36,7 0 . 25,6

Вахшська- ю7 41 31,7 68,3 , 0 14,Б

233 ІО5 21 34,2 65,8 0 20,7

Вага ІО7 61 9,8 88,6 1.7 2,9

І0б 19 68,4 31,6 0 21,3

Марусин- ІО7 40 20,0 80,0 0 12,6

ська-426 ІО5 26 73,1 26,9 0 17,3

2*3р - довірчий Інтервал долі для 95% рівня вірогідності

жена у порівнянні із штамом СХМІ за рахунок яісоїсь специфічної участі лейцину в цьому процесі, або за рахунок того, що бактерії з низьким титром виживають гірше нік з високим.

• Одервані дані показують, що на фоні Фактичної відсутності помітиш міжсортових відмін мав місце велика внутрішньосортова. Індивідуальна мінливість рослин люцерни на інокуляцію лейцино-вим ауксотрофом. Можливо, неоднорідність сортів по даній ознаці мене бути використана в селекції сортів люцерни. .

Додавання лейцину (0,02 - 0,06 мМ кінцева концентрація) безпосередньо до середовища росту рослин, Інокульованих мутая- ’ том Т46 в мІкроЕогетацІйюму досліді, не впливало на формування симбіозу - рослини люцерни або не мали бульбочок, або розвиток бульбочок був заблокований на досить ранніх стадіях. Ці дані відрізняються від результатів одержаних групою французьких дос-

:>*-328к

лідників (Truchet, Miohel,1980), які показали, що лейциновий ауксотроф штаму R.melllotl L5-30 при додашнні єкзогєішого лейцину до рослин відновлював нормальний розвиток бульбочок, диференціювання бактероїдів-1. прояв азотфіксуючої активності.

Розбіжність мік нашими результатами 1 цими даними може бути обумовлена, з одній! сторони, особливостями сорту люцерни, який використали ці автори, а з Іншої сторони, можливо, що природа мутацій, які викликали потребу в лейцині, в нашому штамі СХШ 1 в штамі L5-ЗО, з яким працювали Французькі дослідники, була абсолютно різною. Природа дефекту в симбіозі, при цьому, залишалась невиясненою 1 могла мати три причини: І) "трофічну" (недостатній для розмноженій ауксотрофу Т46 рівень лейцину в бульбочках); 2) "сигнальну" (гени біосинтезу лейцину приймають специфічну участь у синтезі- молекулярних сигналів, що виробляються ризобіями на ранніх 1 пізніх стадіях симбіозу); 3) ефект зчепленості генів (Існує ген, що контролює розвиток симбіозу, тісно зчеплений з лейциновим локусом).

Крім цього залишалась можливість Існування подвійної мутації. Одна - за рахунок власних рухомих генетичних елементів бактерії, а інша - викликана вбудуваїшям Тп5. Для того, щоб відкинути це припущення лейщшова ауксотрофи і сть мутанту R.melllotl Т46 була комплементована банком генів вихідного штаму R.moltloti СХМІ.

КОШЛЕШГГЛДІЯ ЛЕЯЦЖЮВОЇ АУКСОТРОИЮСТІ ШТАНГУ R.melllotl Т46 КОСШДНШ БАНКОМ ШИВ. Для комплементації лейщшової ауксо-трофності мутанту R.melllotl Т46 було використано космідний банк генів штаму R.melllotl СХМІ, створений на основі косміди PLAFR5. Прототрофи 1 транскон’юганти, що виникали при цьому з частотою І0'8клон1в/рецип1ент були перевірені на утримування рокомбішштішх космід за допомогою електрофорезу клітинних лізатів по методу Екхирдта (Eckhardt,І978). Клони, у яких відбулось відновлення здатності рости на мінімальному середовищі, утримували додаткову Фракцію екстрахромосомної ДНК, що відповідав розміру рекомбівантних космід, які несуть генетичний матеріал, що комшшментуе потребу в лейцині у мутанту Т4Є.

Щоб в їдкішути припущення, що прототрофи1 транскон'юганти в

рзвертанташ мутанту Т46, Із транскончогантів були виділені pe-ксмбінантні космідн, які використали для трансформації штаму E.ooll S17-1, а потім перенесли за допомогою кон’югації в лай-щшовий ауксотроф T4S (частота переносу І0~3 клітин/реципіент). Всі перевірені транскон'юганти були прототрофами, І утворювали нормальні азотфіксуючі бульбочки. Це незаперечно говорить про Існування в складі космід гену, який комплементув лейшшову ауксотрофиїсть R.malllott Т46. Косміди, що утримували,ген біосинтезу лейцину, були, такон, введені у штам дикого типу П.тє-lilotl СЯНІ, для перевірки впливу дози leu генів на формування симбіозу.

СИНБІОТИЧШ ВЛАСТИВОСТІ ПРОТОТРОФНИХ ТРАШЮН'ЮГАІГГІВ ШТАНГУ R.mslllotl ”46. Перевірка одержаних в результаті комплементації космідшім банком прототрофних транскон’ югант 1 в мутанту Т46 в умовах стерильного мікровегетаційного досліду виявила, що всі воші на коренях люцерни формують крупні червоні бульбочки з

Мал.І. Азотфіксуюча активність 1 ефективність штамів R.mslllotl

І - не Інокульовані рослини; 2 - штам СШІ; 3 - лейциновий аук-

сотроф Т46; 4 - Т46(рЬАУН5::1еи) (транскон’юганти, одержані на основі мутанту Т46); 5 - СХМІ(рІЛРН5::1еи) (транскон'юганти, одержані на основі штаму СШІ).

і'.'.'І - середня маса сухих пагонів росліш (мг); НСР=І,72 Гіххії - редуїщія ацетилену (нмоль С2Н4/добу/рослину); НСР=8,І

нормальною азотфіксуючою активністю. Рослини, Інокульовані цими транакоп■ югантами, мали таку к біомасу 1 рівень азотфіксації, як 1 рослини, інокульовані вихідним штамом Я.теШоН СХШ. На нал. І приведені результати оцінки азотфіксуючої активності (редукція ацетилену) 1 ефективності (маса сухих пагонів рослин) вихідного штаму СХШ. мутанту Т46 1 прототрофних транскон’юган-тів.

Косміда [iL¿FR5 - малокопійна (1-2 коиІІ/клІтину бульбочкових бактерій). Тому при введенні рекомбінантних космід в штам "дикого" тішу СХМІ утворюються меродиплоідні по гену біосинтезу лейцину транскон'юганти. Можна було очікувати, що присутність в одній клітині двох копій leu гену буде сприяти збільшенню кіль^-кості молекулярних продуктів цих генів 1, як наслідок цього, підвищенню ефективності симбіозу. Але, як видно із мал.І, меро-дишюїдний штам по рівню азотфіксуючої активності 1 офективнос-ті на відрізнявся від вихідного штаму СХЫ1.

СТАБІЛЬНІСТЬ К0СЫ1Д, ЩО УТРШШГЬ ГЕН leu, В ТРАНСКОН'ВГАНШ ОДЕРЖАНИХ НА ОСНОВІ МУТАНТУ Т46 І ЕТАПУ СХШ. Відомо, що ризобії, розмножуючись в ризосфері або безпосередньо в бульбочках, можуть губити гетерологічну екстр&хромосомну ДНК. Зокрема, плазмі да рНК290, яка е базовим реалі коном для ріАРН5, мохо втрачатися з частотою більше 70% в ризобіях, виділених із бульбочок (ишішпо,І988). Це, в свою чергу,, створює обмеження для використання векторів при направленому конструюванні штамів. Крім цього, досить часто реєструється підвищена частота роворсій ауксотрсфних мутацій при пасируванні мутантів через рослйну (fain,1979). В зв'язку з цим, було проведено скринінг на присутність космідного маркеру (стійкість до тетрацикліну) бактерій, виділених Із бульбочок, що були утворені штамами Я.кеІІ-lotl T46(pLXPR5::leu),1 R.melllott CXMI(pLAPRSs:leu). Паралельно проводили оцінку стабільності рекомбінантних космід в транс-кон’югантах після їх довгострокового зберігання (І,Б місяця) на повних агарисованих середовищах при 6°С. Як видно Із табл.З,# _ при довгостроковому зберіганні, ‘гранскон'югшгги, одержані на ' основі вихідного штаму ОШ, значно поступались по здатності

підтримувати рекомб)нантну косміду з гэпом біосинтезу лейцину, трапскон'югантам, одержаним після комплементації лейцилового ауксотрофа Т46.

Із даних, представлених в табл. 4., можна бачити, що подібна ситуація мала місце при виділенні бактерій Із бульбочок. Тільки 7,1% бактерій, виділених Із бульбочок, утворених транс-кон'югантами Т46(ріЛРП5::1еи). втрачали рекомбінантну косміду.

В той К8 час, для транскон'югантів СХШ(pLAFR::leu), серед бактерій виділених Із бульбочок було знайдено 38,7% клонів, у яких

зідбулась елімінація реком-бінантних космід. Необхідно відмітити Індивідуальну мінливість рослини-господарл по ступени елімінації в бульбочках рекомбінанткої космі-ди 1 значні відмішюсті міа окремими бульбочка;«!.

ЦІ дані дозволяють припустити, що різниця між транс кон'гсгантами по стабільності космід, що утримують ген leu, обумовлена їх селективним значенням для розмноження клітіш мутанту Т46 як в чистій культурі , так 1 при взаимодії з розлпною-гостіодарем (тобто, зберіганням прототрофних глітіш, що монуть активно розмнсяувотись). Зрозуміло, що так, як транскон'юганти СХМІ мають дзі дози лейци-нового гену, то відсутність селекції на підтримання косміди приводить до легкої II втрати. Такі дані не підтверджують гіпотезу про Існування в бульбочках селекційних процесів, направлених проти клітин ризобій, що несуть додаткову геторологічну /ОИ. УЛЬТРЛСТРУКТУРНКП АНАЛІЗ БУЛЬБОЧОК, УТВОРЕНИХ RMzotlm melílo-íí НА КОРЕНЯХ ЛЩЕРНИ. Для визначення змін в розвитку симбіозу, що приводять до блоку в формуванні нормальних бульбочок мутантом Т46 на рослішах люцерни, було проведено електронно«1кроско-пічш дослідження бульбочок, утворених на коренях ЛЮЦерїГИ с. Зайкввпча після II Інокуляції вихідним штамом с ЯЛ, леПикнозим

Табл.З. Стабільність рекомбінант-ноі косміди, що утримує leu ген, в штамі R.mellXotl СХМІ 1 мутанті Т46 при їх зберіганні гш повному агаризовансму середовищі.

Штам Число перевірених клонів % То8 клонів 2*Sp

СХШ 100 3S 9,6

Т46 100 7 Б,І

2*Sp - довірчий Інтервал долі для 95% рівня вірогідності

ауксотрофом Т46 1 прототрофними транскон'югантами R.mellloti T4G(pLAí’R5::leu). Ультраструктурна організація бульбочок, утворених ВИХІДНИМ пт-

Табл.4. Стабільність рекомОІнаятно! косміди " що утримує leu ген, в бактеріях, виділених бульбочок, утворених транскон'югантами штаму СХМІ І мутанту Т46.

8М0М СХМІ 1 про-тотрофннми тра-нскон’юганташ дає подібна. В їх цитоплазмі спостерігаються добре розвинуті бактероїди, оточені перибактеро Ідноя мембраною, помітні стінки Інфекційних ниток. В .той ве час, для бульбочок, утворених ауксотрофи»! по лейцину мутантом Т46, відзначено руйпуванпя цитоплазми. рослинних

КЛІТИН, ПІКНОЗ

ядер 1 пластид, присутність зерен крохмалю, абсолютна’відсутність бактероїдів 1 дегенерація Інфекційних ниток. Тобто, мутантні бульбочкові бактерії, які проникли в кореневий волосок, формують Інфекційну нитку 1 починається утворення бульбочки. Але, ризобії не виходять в цитоплазму рослинних клітин 1 гинуть знаходячись в Інфекційних нитках.

КЛОНУВАННЯ ЛЕЩИНОВОГО ЛОКУСУ ЯМгоЬІит теІІШІ. Для більш детального аналізу гену біосинтезу лейцину штама СХМІ Е.теІЧоН було Ідентифіковано ВооИІ фрагмент ДНК рекомбінантної косміди рІАРИ5, що несе даний ген. .

При електрофорезі ВооИІ рестриктів декількох рокомОІнант-ндх космід, одержаних після комплементації лейцинової ауксотро-

і 1 ® і§ Кількість перевірених клонів % Тс8 клонів на рослину % Тс° клонів на варіант 2eSp

штам СХМІ

І 74 38,8

2 62 63,7 38,7 5,2

3 76 47,5

4 74 9,5

5 76 44,2

мутант Т46

І 52 4,0

2 75 8,0 7,1 2,8

3 52 11,4

4 77 8,0

Б 73 4,1

2*Sp - довірчий Інтервал долі для 95% рівня вірогідності

фиості мутанту Т46 космідшм банком R.melllotl СИП, було знай-допо "спільний" для всіх космід Еоопі фрагмент довжиною 4,5 т. п.н. Прясутність цього спільного фрагменту дозволила припустити, що сама він утримуз ген біосинтезу лейцину. В результаті реклонувашя цього фрагменту до вектору PSUP202 по EooRi сайту, по знаходиться в локусі хлорамфен1колет1Йност1, були одержані дві шіазміди pSUPS02::leu, що утримували leu фрагмент в протилежних орієнтаціях. Фізична карта даного фрагменту представлена на Мал.2. ,

Мал.2. Фізична карта лейцинового фрагменту R.melllotl СШІ.

EooRI.1 HindIII,670 HlndIII.2405 Xhol.3650 EooRI.4559

І І 1_____________________________________1___________}

Після сайту рестрикції для котоюі рестриктазп вказано місцезнаходження дапого сайту.

Для одержання доказу присутності в ¡тонованому фрагменті гону leu було проведено введення шіазміди pSUP202::1ец в мутант Т46 при кон'югації з E.coll S17-1 (psup202::leu). Яз повному середовищі, склад якого був доповнений тетрацикліном (маркер pSUP 202), Н80МІЦШЮМ І стрептоміцином (маркери транспозанту Т46) з частотою І(Г4 виростаали транскон'кганти T4o(p5UP202::leu), які при перевірці на мінімальному середовищі всі виявилися-прототрофами. В зв’язку з тим, що що плазміда psUF202 нездатна до реплікації в ризобіях, відібрані транскон'юганти являли собою 1ви/1еи::Тп5 меродиплоіди, які виникли за рахунок одного акту рекомбінації мія гомологічними фрагментами. В результаті цього вгашказ убудова всієї рекомбінантної плазміди в геном мутанту Т46, що fl забезгіечуз ріст ауксотрофу на мінімальному середовищі за рахунок присутності в ній нвпошкодаеного алоля leu.

Інший доказ присутності в реклонованому фрагменті гену leu із R.melllotl було одержано за допомогою блот-гібриднзації по Саузерну EooRI рестриктованої тотальної ДНК вихідного штаму СШІ, мутанту Т46 1 прототрофних транской'югантів R.melllotl T4G(pLAPR5: :leu) з реклоповшшм фрагментом. В результаті гібри-

дизації Суло показано, що EcoRl фрагмент розміром 4,6 т.п.н. штаму СХМІ гібридизується з радіоактивним зондом (32P-pSUP202:: leu), в той час як у мутанта Т46 слосторігазться гібридизація з фрагментом 10,5 т.п.н. Це пояснюється тим, що у мутанта Т46 у фрагмент з лейциновим геном вбудований транспозон Тп5, довиша якого складає близько 6 т.п.н. (Тп5 по маз в своєму складі EooRl сайтів). У прототрофішх транскон'вгантів мутанта Т46 гібридизуються 2 фрагменти. Верхній Із них (10,5 т.п.н.) - це leus: ТпЬ, а нижній - це leu фрагмент косміди pLAPR5: :1еи. Шсля цього мокна вважати незаперечно доведеним факт клонування гену, цо відповідає за біосинтез лейцину штаму RMzobiun mellloti СХМІ.

Насьогодні відомо, що бактерії R.meltlotl звичайно мають декілька лейцшювшс локусів на хромосомі (Klein, 1992), 3 метою перевірки цього положення для R.meltlotl СХМІ лейцинові косміди pLAFR5::leu 1 плазміду pSUP202::leu вводили в його деривати R.melilotl Т5ІІ/6 1 Т9І8/6, дефектні по сіштезу лейцину. У всіх випадках лейцішова ауксотрофність мутанту Т5ІІ/6 не була кон-плементована, тоді як введення цих плазмід у склад мутанта Т9І8/6 приводило до відновлення здатності до росту на. мінімальному середовищі без додавання екзогенного лейцину, що говорить про існування у R.meltlotl двох або більше лейцинових локусів, які кодують неідентичні гени.

Для вивчення впливу дози leu генів на симбіотичні властивості бульбочкових бактерій люцерни, leu фрагмент плазміди pSUP202::leu було реклоновано в здатну до реплікації & ризобіях багатокопійну (100-200 копій/клітину) плазміду psupi04 по EooRl сайту. Плазміда pSUPl04::leu була введена в штам СХМІ. Цей дериват використали у вегетаційному досліді. Рівень ацетиленрв-дукції У штаму СХМІ(pSUP104:: leu) виявився навіть нижчим ніе у штаму R.meltlotl 425а (штам СХМІ в Strr дериватом штаму 425а) 1 знаходився на рівні з контролем без інокуляції (бульбочки на коренях контрольних рослин були утворені спонтанними расами бульбочкових бактерій).

Достовірного підвищення.або зникання сухої маси рослин у порівнянні з штамом 425а не спостерігалось (див. Мал.З). НОШМЕШИАЩЯ ЛЕВДИШВОЇ АУКСОТРОФІЮСТ1 Rhizoblm mellloti Т46

ЕШШ ШИВ ШгоЬіит Іеітіпозагш Ьу. иіс(ае 7Т39. Відсутність комплементації розпитку симбіозу при додаванні ерогенного лейцину до середовища росту рослин, Інокульованих ауксотрофом Т46 дозволила зробити припущення про Існування поблизу лейципо-вого локусу гену, що відповідав за утворення симбіозу, з метою перевірки цього положення лейцинова ауксотрофнісгь мутанту Т4б

була коштлементована банком генів РОхІгоЬІш Іє^тіповсгш Ьу. и<с<ае УР39, побудованим на основі косміди рЬАРШ. Одержані в результаті коїлплемонтацП клони Я.ілеШоН Т46(рі,Аї’Пі: :іеи) несли космідп рЬА?йі::іеи з спільним ЕооШ фрагментом довжино»

6 т.п.н. При повторно?яу введенні даних космід в ауксотроф Т46

Мал.З. Азотфіксація (мМ С2Нд/год./рослину) 1 ефективність ( г сухої маси пагонів рослин лвдорни'с.Бороале 47) штаму СХМГ з 1Т36Д9НОП в нього багатокопІЯпов плазмідов рзшчол: :іеи у вегетаційному досліді в посудинах. •

сни - контроль без Інокуляції; - Інокуляція штамом Я.вд-llloti 425а; ГГ~~П - Інокуляція штамом R.nelilotl СХШ (рзтмсм:: leu); І - середня (.аса сухих рослин (НСР=0,32); І*- середня азотфіксація коренів (ШМ5.47); 2 - середня юса сухих рослин першого укосу (НСР«5.67); 3 - середня маса сухій, рослин другого укосу (НСР*в,Ов)

Із E.coll S17-1(pLAPR5::leu) з частотою 10“* клітин/ реципієнт виникали прототрофні транскон'юі’Шіти. Вивчення цих тралскон'і>-гантів в мікровегетаційному досліді показало, що більшість рослин не утворює бульбочки на люцерні (Табл.5), але 3,7% рослин формувало велику кількість дрібних слабо-рожевих бульбочок, які не фіксували азот. Маса їх сухих пагонів но відрізнялась від контрольних рослин. Вихідний штам R.melllotl СХШ на всіх рослинах формував нормальні, розові, азотфіксуючі бульбочки, 1 суха маса пагонів була вірогідно вище Шк у варіанті з Т46 або

Табл.Б.Здатність прототрофша транскон’югантів T46(pLAPRl: :leu) утворювати бульбочки на люцерні с.Зайкевича. .

Штам бульбочкових бактерій Кількість перевірених рослин Кількість рослин, % 2*Sp

без бульбочок з оульоочкамк

01ЛИМИ рожевими

T46(pLA?Rl: :leu) 108 67,6 28,7 3,7. 3,7

Т46 36 25,0 75,0 0 . 14,4

СХШ 36 0 0 100

2*Sp - довірчий інторвал долі для 95% рівня вірогідності

його прототрофюши транскон’югантами. Тобто, банк генів R.legu-mlnoaarvm ъv.viceas VP39 кошлементув леЯцішову ауксотрофність мутанта Т46, але це не приводить до відновлення симбіотичних властивостей його прототрофша транскон’югаитів.

Пояснення одержаних результатів може бути різним: І. Вбу-дова транспозону в локус одного з генів біосинтезу лейцину приводить (за рахунок полярного ефокту) до Інактивації якогось симбіотичного гену, що знаходиться в безпосередній близькості . до leu гену. Це пояснення найбільш вірогідне 1 задовольняв всім вицеприведеним фактам} Z, Фермент, який бере участь в біосинтезі лейцину 1 в ІііактивованиМ у мутанті R.mllloti Т46 мав подвійну функцію, 1 Mole сюітезуваїіі На тільки один Із попередників лейцину¿ але й якийсь фактор, Що необхідний для утворення симбіозу; Цей фермент Mas структурні відмінності у порівнянні з

шалогічнш« ферментом бульбочкових бактерій вики. Тему, при по-іеносешзі "лойшшового" ферменту бульбочкових бактерій вики в ¡уталт Т46 бульбочкових бактерій люцерни (в результаті компле-юнгації лейцикової ауксотрофності Д.даШоП Т45 банком генів І.іе^итіпозапіт Ьу. иісеае 7Р36) він не має здатності сштезу-інтії якийсь фактор, необхідний для утворошш симбіозу; 3. ЦІ ;труктурн1 відмінності приводять до зниження синтезу лейцину ірототрофними транскон'югантами. Рівень лейцину при цьому зали-іаеться достатнім для росту на мінімальному серодотвці, але нештатнім для відновлетш симбіотичних властивостей.

‘ ВИСНОВКИ.

1. Мутація, вшуіикана вбудуванням транспозону Тп5 в локус

Яосинтезу лейцину штама ШхігоЬІїт melllotl СХІЯ приводить до іуксотрофності за лейцином 1 блокування розвитку азотфіксуючого ¡имбіозу з люцерною [Иейіссщо тИш). Мутантні бульбочкові іактері! ЕНІгоЬіїт теІПоИ Т46 нездатні виходити Із Інфокцій-шх ниток в клітини кореню рослин 1 гинуть знаходячись в Інфок-Цйних нитках. '

2. Коїяілементація лейцинової ауксотрофності мутанта Кіїїго-Нш теїііогі Т46 банком генів вихідного штаму приводить до Лдновлення здатності створювати нормальні бульбочки на росли-іах люцерни.

3. Комплементація лейциново! ауксотрофності мутанта Иіхіго-)іші теШоН Т46 банком генів ЮіІгоЬІит Іе^іпозапт Ъч. VI-'.еае 1ГРЭ9 не приводить до відновленій симбіозу, що може вказу---тти на Існувашя тісно зчепленого а лойциновим локусом гену, ікий "відповідає" за симбіоз.

4. Штам НМгоЬіит твШоИ СХМІ мав два незчешіаних лойци -ювих локуси.

5. Існує велика Індивідуальна мінливість рослин лщорші ь ієнах сортів Зайкевича, Вахшська 233, Вега 1 Марусинсыш 425 за >датн1стю утворювати бульбочки при Інокуляції ауксотрофшм за іойцином мутантом Т46.

Є. Створення меродшхлоідних 1 поліплоідних по лойцшювому юкусу итамів не приводить до підвищення азотфіксуючої актив-юсті 1 ефоктивності. При цьому рокомбінантні косміди з лейци-

новим локусом в штамі СХМІ проявляють значно знижену стабільність як у вільноісивучих бактеріях, так 1 в бульбочках у порів нянні з прототрофними транскон'гігантами, одержаними на основі лейцннового ауксотрофу.

f. Експериментально доведено, що лейциновий локус бульбоч-нових бактерій люцерни функціонально важливий для формування симбіозу Bhtzoblvm mlllotl - Medlcago oativa.

список статей, опублікованих по темі дисертації.

і Лебский В.K., Аронштам A.A., Умаров Б.Р., Ерко В.H., Расулої A.C., Халмурадов А.Г. Молекулярно-генетический анализ симбиотических свойств Wilzöblm melllotl// Доклада АЛ СССР.-1992.-324, N1. -С.224-226. ..

2. Умаров Б.Р., Ерко В.H., Аронштам A.A., Расулов A.C., Халму-радов А.Г. Молекулярное клонирование гена биосинтеза лейцина у Rhtzoblm meltlotl, участвующего в контроле развития азотфикси-рующэго симбиоза с люцерной// Доклада АН СССР.-1992.-324,М2.- • С.469-470.

3 Аронштам A.A., Умаров Б.Р., Ерко В.H., Андронов Е.Е. Симаров Б.В. Использование космидного балка генов Rhlzoblvm melllotl для клонирования гена биосинтеза лейцина, участвующего в контроле развития азотфиксирующего симбиоза с люцерной// Генетика.-1993.-29.N2.-С.235-245.

4. Ерко В.Н., Старченков Е.П. Комплементация лейциновой ауксо-трофности Rhtzoblm melllotl банком генов RMzobtm legumtnoaa-rum bv. vlceae VP39// Физиология и биохимия культурных растений. -1994.-26.N3.-С.240-245.

Підписано по пруку 29.03.94. Формат 00x84 1/16. Папір офсетний. Ум. ару*- арс; Тираж 100 пріям. Зам. 32вк. '

ДБПП ДКНТ,”252171 КиГ» 171, вул. Горького, 180. ...... — '