Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ структуры природной популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ структуры природной популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны"

российская академия сельскохозяйственных наук

всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

на правах рукописи

РГ6 од

андронов

Евгений Евгеньевич ^ ^.7. -

молекулярно-генетический анализ структуры

природной популяции бтоктговшм меыьоп

европейско-сибирского генцентра люцерны

Специальность 03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Б.В. Симаров

кандидат биологических наук, М.Л. Румянцева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К.В. Квитко

кандидат биологических наук, Н.А. Проворов

Ведущее учреждение: Московский Государственный

Университет

Защита диссертации состоится 23 июня 2000 года

в_час_мин на заседании диссертационного совета К 020.26.01. по

защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «_» _ 2000 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А.Н. Зарецкая

Е Ж; О

введение

Уктуальпость темы. Клубеньковые бактерии (ризобии) - микроорганиз-1ы, фиксирующие молекулярный азот атмосферы в симбиозе с бобовы-ш растениями. Интерес к ризобиям вызван как их сельскохозяйственной начимостью в связи с симбиотической азотфиксацией, так и тем, что обово-ризобиальный симбиоз - это одна из наиболее широко изучае-1ых систем растительно-микробного взаимодействия. Изучение этого заимодействия может дать ответ на целый ряд вопросов, касающихся [роцессов, ответственных за формирование генетического разнообразия [риродных популяций микроорганизмов и эволюции клубеньковых бак-ерий.

Наиболее эффективным методом изучения природных популяций актерий является анализ их генетического разнообразия. При изучении лубеньковых бактерий результатом такого анализа может стать пони-гание процессов возникновения новых генотипов (мутации, генетические ерестройки, горизонтальный перенос генов) и процессов, определяющих удьбу генотипов в популяции (отбор и конкуренция, миграция штаммов, енетический дрейф). К настоящему времени большое число природных опуляций ризобий охарактеризовано с использованием изоферментного нализа. Проанализированы основные параметры популяционной струк-уры - гетерогенность популяции и неравновесие по сцеплению хромо-эмных генетических маркеров. Анализ факторов, определяющих гене-ический полиморфизм ризобий, показал, что растение-хозяин является лючевым фактором как для динамики ризобий в природных популяци-х (поддержание численности и стабильности ризобий), так и для увели-ения генетического разнообразия.

В настоящее время для характеристики ризобий широко исполь-утотся различные методы анализа ДНК. Преимущество этих методов эстоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики,

более тесно связанные с генотипом, позволяющие анализировать любые участки ризобиального генома и не зависящие от физиологического статуса микроорганизма. С помощью методов анализа ДНК могут быть проанализированы участки, содержащие симбиотические гены, изучение которых невозможно с использованием других методов. Анализ симбио-тических участков генома ризобий особенно важен для выявления роли растения-хозяина в процессах формирования генетической структуры природных популяций клубеньковых бактерий. Представляет большой интерес использовать методы анализа ДНК для изучения таких параметров, как гетерогенность популяций и неравновесие по сцеплению между генетическими маркерами. Однако работ, сочетающих использование методов анализа ДНК с эффективными методическими подходами к анализу популяционной структуры и процессов ее определяющих, очень мало.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлся молекуляр-но-генетический анализ популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны. В задачу исследований входило:

выделить природные штаммы клубеньковых бактерий люцерны на двух удаленных участках из-под растений-хозяев двух различных видов - дикорастущих люцерны и донника, входящих в группу перекрестной инокуляции люцерны;

определить видовую принадлежность штаммов с помощью рест-рикционного анализа гена 16S рРНК;

изучить генетическое разнообразие популяции с помощью RFLP-анализа 5 участков генома (leu, тес А - хромосома; nodDIABC, nodD2 — мегаплазмида-1; ехр - мегаплазмида-2), анализа плаз-мидного состава штаммов и геномного ISRm2011-2 фингерприн-тинга;

изучить влияние растения-хозяина и географического происхож-

дения штаммов на генетическое разнообразие популяции клубеньковых бактерий люцерны;

с использованием современных статистических методов оценить основные параметры генетической структуры популяции -гетерогенность и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами.

[аучная повизпа работы. В настоящей работе впервые:

изучена природная популяция клубеньковых бактерий S.meliloti, относящаяся к Европейско-Сибирскому генцентру люцерны. 56 природных штаммов S.meliloti охарактеризованы с использованием метода RFLP, анализа состава криптических плазмид и ISRm2011 -2-фингерпринтинга;

в геноме S.meliloti выявлен участок (фрагмент симбиотической плазмиды, содержащий гены nodDIABC), структура которого существенно различается у штаммов, выделенных из-под донника и люцерны;

с помощью метода RFLP определены основные параметры структуры изученной популяции: гетерогенность популяции по пяти различным участкам ризобиального генома (leu, гесА — хромосома; nodDIABC, nodD2 — мегаплазмида-1; ехр - мегаплазмида-2) и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами; показано, что хромосомные гесА RFLP-типы и Sym-плазмидные nodDIABC и nodD2 RFLP-типы ассоциированы у штаммов данной популяции случайным образом, на основании чего сделан вывод о возможности переноса симбиотических плазмид между штаммами;

показано, что в данной популяции существуют две генетически обособленные группы штаммов, контрастно различающихся по ряду молекулярно-генетических признаков: leu RFLP-типу, наличию криптических плазмид, числу копий ISRm2011-2 элемента.

Практическая значимость.

Установлено, что 13Ктп2011-2-фингерпринтинг обладает большой разрешающей способностью. Данный метод позволяет наиболее точно идентифицировать штаммы S.meliloti и может быть использован для целей идентификации и мониторинга.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1-ом Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 1st European nitrogen fixation conference (Szeged, Hungary 1994), 10th International congress on nitrogen fixation (St.Petersburg, 1995), 2nd European nitrogen fixation conference and NATO advanced research workshop (Poznan, Poland, 1996), 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация включает введение, 4 главы, состоящих из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 85 страницах текста, иллюстрирована 14 рисунками, включает 15 таблиц. Список литературы состоит из 114 источников, из них 94 - зарубежных авторов.

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

• Образцы почв отбирали в Иркутской области на двух участках А и Б, расположенных примерно в 80 км один от другого (рис. 1). На каж-

дом из участков пробы отбирали из-под растений дикорастущих форм многолетней люцерны (Medicago varia) и донника (Melilotas officinalis) на глубине 15-20 см и на расстоянии не менее 50 м друг от друга. На участке А пробы отбирали из-под люцерны (пробы NN 1-9) и донника (пробы NN 27-30); на участке Б из-под люцерны (пробы NN 10-18) и донника (пробы NN 20-26). Для выделения штаммов клубеньковых бактерий использовали 2 вида люцерны - многолетняя форма M.sativa сорт Вега и однолетняя форма M.truncatula сорт Jemalong. Всего было отобрано 56 штаммов - по 2 штамма от каждой из 28 исходных проб почвы, из которых один штамм был выделен из клубеньков M.sativa, а другой — из клубеньков M.truncatula. Все штаммы образовывали эффективные клубеньки на растениях M.sativa. Штаммы обозначили индексом SB (с SB011 по SB302). Первые две цифры после индекса соответствуют номеру пробы почвы, из которой была приготовлена почвенная суспензия. Третья цифра обозначает растение, которое инокулировали соответствующей почвенной суспензией и из клубеньков которого впоследствии был выделен штамм: 1 - M.sativa, 2 - M.truncatula.

В соответствии с источником выделения штаммы были сгруппированы в субпопуляции следующим образом: субпопуляции «А» и «Б» — это группы штаммов, выделенные из проб почв, отобранных на участках А и Б (26 и 30 штаммов, соответственно). Субпопуляции «JI» и «Д» - это группы штаммов, выделенные из-под люцерны или из-под донника (34 и

105°в.д.

20 0 20 40км

Рис. 1. Географическая карта района, где были отобраны пробы почв.

22 штамма, соответственно). Субпопуляции «Б» и «Т» - это штаммы, выделенные с использованием М.эаИьа или МЛгипсаЫ1а (по 28 штаммов в каждом случае) (рис. 2).

"А" (26 шт.) "Б" (30 шт.) ^'участок А N. Х^Участок B^N. / [Люцерна 1 111 ЛюцеРна I 1 V \ 1 Донник J / \ / 1 Донник 1 / \ "ГК; (34 шт.) / у \ "Д" (22шт.) /

"Т"(28шг)

Рис. 2. Схема разделения штаммов на субпопуляции.

В работе были использованы 3 штамма клубеньковых бактерий люцерны с известными генетическими характеристиками: Rm2011 (Casse et al., 1979) и MVII S.meliloti (Kosier et al., 1993), CC169 S.medicae (Eardly et al., 1990).

Анализ плазмидного состава штаммов, выделение общей бактериальной ДНК, обработку эндонуклеазами, электрофоретическое разделение фрагментов рестрикции, Саузерн-гибридизацию, амплификацию гена 16SpPHK и его рестрикционный анализ проводили в соответствии со стандартными методиками (Eckhardt, 1978; Laguerre et al., 1992; Ман-ниатис и др., 1984; Weisburg et al., 1991). Для приготовления гибридиза-ционных проб были использованы следующие фрагменты ДНК: 1) 4.4 тпн EcoRI-фрагмент плазмиды pSUP202::Zeu+, содержащий гены, влияющие на биосинтез лейцина штамма СХМ1 S.meliloti (Аронштам и др., 1993), 2) 3.3 тпн Bgll/EcoRI-фрагмент плазмиды pKSK5, включающий nodABC гены штамма 41 S.meliloti (Румянцева и др., 1999), 3) в качестве единой пробы были использованы 5 фрагментов ДНК, каждый из которых был

клонирован в одной из следующих плазмид: pARX::2.7 тпн, pARI::9.5 тпн, pARII/l::3.4 тпн, pARIV/l::2.9 тпн, рАВ57-1::10.9 тпн (Becker et al., 1997). Все 5 фрагментов составляют большую часть ехр-кластера (32 тпн) штамма Rm2011 S.meliloti, 4) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (223 пн) штамма Rm2011 S.meliloti, содержащий внутренний фрагмент гена nodDl (Румянцева и др., 1999), 5) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (около 1.0 тпн) штамма Rm2011 S.meliloti, содержащий ген гесА (Румянцева и др., 1999), 6) для проведения IS-фингерпринтинга использовали ПЦР амплифицированный ISRm2011-2 элемент (Selbitschka et al, 1995).

На основании результатов гибридизационного анализа для каждой из использованных проб вычисляли коэффициент гетерогенности H (Вейр Б., 1994; Bromfield et al., 1998). Чтобы определить, насколько штаммы из двух различных субпопуляций отличаются друг от друга по частотам RFLP-типов, вычисляли коэффициент различия D=l-I, где I -коэффициент идентичности М. Нея (Вейр Б., 1994). Достоверность определенных значений D оценивали по х2-критерию сходства между вариационными рядами (Лакин, 1990). Для того, чтобы определить, насколько случайно ассоциированы RFLP-типы в RFLP-генотипах, вычисляли индекс ассоциации IA= Vobs / Vexp (Maynard Smith et al., 1993; Gordon et al., 1995), где Vobs - наблюдаемая дисперсия числа несовпадений по RFLP-типам в составе RFLP-генотипов, a Vexp - ожидаемая дисперсия числа несовпадений, ожидаемая при реализации нулевой гипотезы (случайное комбинирование RFLP-типов в RFLP-генотипе). Для оценки сцепления между RFLP-типами использовали программу Arlequin 1.1. (Schneider et all., 1997), позволяющую проводить тест сцепления между локусами при вычислении точного значения критической вероятности Р. Для построения дендрограммы использовали невзвешенный парно-групповой метод кластеризации с арифметическим средним (UPGMA) (Вейр Б., 1994), при этом за меру генетического сходства между двумя

RFLP-генотипами принималось число (доля) общих RFLP-типов.

результаты исследований Определение видовой принадлежности штаммов.

Видовая принадлежность природных штаммов, образующих эффективные клубеньки на растениях М.sativa, была определена с помощью рестрикционного анализа ПЦР амплифицированной последовательности гена 16S рРНК. Установлено, что все выделенные штаммы клубеньковых бактерий люцерны представляли собой генетически однородную группу клубеньковых бактерий и принадлежали к виду S.meliloti.

Анализ плазмидного состава штаммов.

М1,М2 —

У всех 56 штаммов 5. теШоН были выявлены мегаплазмиды, электрофоретическая подвижность которых соответствовала таковой у тестерных штаммов 5. теШоИ Е.т2011 и МУН (рис.3). У 13 штаммов бы-

штаммы ли выявлены только мега-

ПЛаЗМИДЫ " " бЫЛ° °бНа"

ружено криптических плазмид. Остальные 43 штамма содержали в дополнение к мегаплазмидам от 1 до 3 криптических плазмид, размер которых варьировал от 40 до 330

тпн (рис.3). В соответствии плазмидные группы

с плазмидным профилем

Рис. 3. Электрофоретическое разде- штаммы были отнесены к

ление плазмид природных штаммов пеШоЫ.

и

11 плазмидным группам, из которых 9 были малочисленны и содержали от 1 до 4 штаммов.

11РЬР-гибридизационный анализ полиморфизма длин ДНК фрагментов рестрикции.

В зависимости от количества и размеров фрагментов ДНК, гиб-ридизующихся с определенной пробой, штаммы относили к соответствующему Ш^ЬР-типу, который обозначали буквенным индексом. Для каждого из 56 проанализированных штаммов и тестерного штамма Е1т2011 в результате проведенного гибридизационного анализа были выявлены КРЬР-типы по 5 различным участкам генома (табл. 1). По каждому из участков генома был вычислен коэффициент гетерогенности Н табл. 1). Комбинация различных ИГЬР-типов была обозначена как ;<11Р1Л?-генотип». Например, у тестерного штамма Кш2011 по всем 5 про-шализированным участкам генома был выявлен ЫЕЬР-тип «а». Соответствующий Р^ЬР-генотип обозначен индексом «А» (табл. 1). Всего было выявлено 25 различных комбинации КПР-типов, что соответствует 25 эазличным 11П|Р-генотипам, обозначенным буквенными индексами от <А» до «У» (табл. 1).

1БКт2011-2-фипгерпринтинг штаммов.

У всех 56 штаммов, кроме штамма БВ292, были выявлены £соШ-{эрагменты общей ДНК, гибридизовавшиеся с пробой на 15Кш2011-2 рис. 4). Поскольку последовательность 15Кт2011-2 не содержит ЕсоШ-:айтов рестрикции, то число ЕсоШ-фрагментов ДНК, гибридизующихся : 15Ктп2011-2-пробой, соответствует числу копий данного элемента в еноме (БеШ^сЬка е! а1., 1995). Количество копий 13Кт2011-2 у итаммов варьировало от 1 до 18, а среднее количество копий на геном

Таблица 1. 11П,Р-генотипы, выявленные у природных

штаммов Б.теШоП.

КГЪР генотип Ги-ЪР-типы, выявленные при

Штаммы гибридизации с ДНК пробами на гены

1еи гесА ехр посЮ 1 АВС пос! т

Яш2011 А а а а а а

БВ112, БВ261 В а а а а {

БВ031, БВ291 С а а а а 1

БВО11, 8В012, 8В032,

БВ061, 8В062, БВ081,

БВ082, 8В091, БВ122, 0 а а а с! с1

БВ131, БВ141, 8В142,

8В182

8В201, БВ202 Е а а а е с

БВ051, БВ052 Р а а а ё с

8В301, 8В302 в а а Ь ь Ь

8В162 н а Ь а с1 с!

БВ181 I а с! а с1 с!

БВ222 ] а е а а 1

8В092 к Ь а а а а

БВ212, 8В231, 8В232, ь Ь а а а ё

БВ251

БВ211 м Ь а а а ё

8В102, БВ111, БВ121, N ь а а Ь а

БВ151

8В101, 8В252 0 ь а а Ь f

8В041 р ь а а Г <1

БВ262 О ь а Ь И с

БВ021, 8В022, 8В241, 8В292 я ь а Ь ь с!

8В132 Б ь а Г с е

8В042, БВ152, 8В281 Т ь с ь а с!

8В071, 8В072 и ь с с Ь с1

БВ161, 8В242 V ь с с1 а ё

8В271, 8В282 ь с е а с!

8В221 X ь (1 Ь а с!

8В272 У ь е Ь а Ь

Гетерогенность, Н 0,51 0,42 0,52 0,78 0,66

ризобий составило 9,6±1,3. Всего было выявлено 42 различных 13-фингерпринта.

Использование 13-фингерпринтинга позволило различить штаммы, принадлежащие к одному и тому же ЕГЬР-генотипу (рис. 4). Для обозначения 13-фингерпринта каждого конкретного штамма использовали ту же буквенную систему, что и при обозначении соответствующего Т1ЕЬР-генотипа штамма (рис. 4).

РР1_Р-генотипы

15Кт2011-2

фингерпринты б4 б1, Ь> б* ск & о4 о'1' ^ <оч х?" ^ ^ >0- Л О"

7,2-Й-, -^н^цц^И^«

6.4 5,7

«--« Г** «ъ^

4,8- < » '*

4,3-' .;.Л.'ь .*!

3,7' * * 4 , 4 * , < /

•14,0

-5,7 тпн

2,3-тпн

с

□

n

Рис. 4. Гибридизация ДНК природных штаммов Б.теЫои, имеющих одинаковый ППР-генотип, с пробой 13Ктп2011-2.

Анализ 13Ктп2011-2-фингерпринтов у штаммов с одинаковым Е^ЬР-генотипом позволил выявить две пары штаммов, представляющих эсобый интерес: ЗВ021 и ЗВ022 (13-фингерпринты «г1» и «г2», соответственно) и ЗВ271 и ЭВ282 (13-фингерпринты «и>1» и «ю2», соответственно). В каждой паре штаммы имеют одинаковый плазмидный состав и 11И-,Р-генотип, но различаются по наличию 1 дополнительного ЕсоШ-фрагмента, гибридизующегося с пробой 13Ктп2011-2 (рис. 4). Поскольку

штаммы БВ021 и БВ022 выделены из одной и той же пробы почвы, а штаммы 5В271 и БВ282 - на одном и том же участке, то можно предположить, что эти дополнительные копии есть результат репликативной транспозиции в геноме элемента 13Кт2011-2. Можно предположить, что разнообразие К-фингерпринтов у штаммов с одинаковым ИГЬР-генотипом также является результатом генетических перестроек.

Анализ штаммов в субпопуляциях.

а) Сравнение субпопуляций по наличию штаммов, содержащих крип-тические плазмиды определенного размера.

Штаммы, содержащие наиболее часто встречающуюся в данной природной популяции криптическую плазмиду размером 200 тпн, были выделены преимущественно из почв, на которых выращивали люцерну (68% штаммов). Плазмида этого размера в два раза реже встречалась у штаммов, выделенных из почв, на которых выращивали донник (29% штаммов).

Статистический анализ с использованием %2-теста подтвердил, что штаммы, выделенные из-под различных видов растений-хозяев (субпопуляции «Л» и «Д»), достоверно различаются по типу встречающихся криптических плазмид (х2=23,74; с1£=8; Р<0,01). В то же время у штаммов, выделенных на различных участках (субпопуляции «А» и «Б»), таких различий не выявлено (х2=8,07; сМ:=8; Р<0,1).

б) Сравнение субпопуляций по частотам 11РЬР-типов.

Для штаммов из каждой рассматриваемой субпопуляции (рис. 2) были определены частоты встречаемости каждого из рассматриваемых КГЬР-типов. Далее мы оценили уровень генетических различий между

субпопуляциями «А»/«Б», «Л»/«Д», «3»/«Т», применив коэффициент Б (см. Материалы и методы). Достоверность различий была оценена по тесту X (табл. 2). Наибольшие различия были выявлены по симбиотическо-му участку ризобиального генома посГО1АВС между штаммами, выделенными из-под различных растений-хозяев, и относящихся к субпопуляциям «Л»/«Д» , соответственно (табл. 2).

Таблица 2. Анализ различий между субпопуляциями штаммов З.теШоИ по частотам ЛЕЬР-типов.

Субпопуляции Численность штаммов в субпопуляциях Коэффициенты различия (О), по частотам ИРЬР типов

1еи гесА ехр посЮ1 АБС посЮ2

А/Б 26/30 0.04 0.01 0.08 0.19 0.09 0.07

л/д 34/22 0.11 0.02 0.12 СЦ2 0.07 0Л5

Б/Т 28/28 0.00 0.01 0.01 0.02 0.01 0.01

Обозначения: пунктирной, одинарной и двойной линией подчеркнуты значения Б. которые по данным теста Х~ близки к достоверным (Р<0.1), достоверны (Р<0.05 и Р<0.01), соответственно.

в) Анализ субпопуляций по результатам 1БКт2011-2-фингерпринтинга.

Во всех случаях штаммы с одинаковым фингерпринтом были вы-*елены на одном и том же участке и из-под одного и того же растения-:озяина. Исключение составляют 2 штамма, имеющих один и тот же 1Б-|зингерпринт г1, которые выделены не только на различных участках, но [ из-под различных растений-хозяев.

Статистический анализ параметров популяции.

а) Анализ штаммов с различным хромосомным RFLP-типом на наличие плазмид определенного размера.

Статистический анализ не выявил корреляции между наличием плазмид определенного размера и хромосомным RFLP-типом штамма ризобий (Р=0,319±0,001). Таким образом, хромосомные RFLP-типы и типы криптических плазмид в данной популяции комбинировались случайным образом. Это, возможно, свидетельствует об имевшем место переносе криптических плазмид между штаммами в данной популяции. Е том случае, когда при статистическом исследовании сцепления учитывали и группу бесплазмидных штаммов, значение критической вероятности свидетельствовало о строгой корреляции между хромосомным типом и наличием (отсутствием) криптических плазмид (Р=0,008±0,002). Этс объясняется тем, что большинство (12 из 13) бесплазмидных штаммоь были отнесены к leu RFLP-типу «b».

б) Анализ неравновесия по сцеплению между RFLP-типами.

В настоящей работе было проанализировано сцепление между RFLP-типами, для чего был вычислен индекс ассоциации 1А с учетом всех выделенных штаммов (табл. 3). Значения 1А , приведенные в таблице, достоверно превосходят 1, что свидетельствует о неслучайной ассоциации между RFLP-типами. Значение 1А , вычисленного как для отдельных участков, так и для отдельных растений-хозяев, не уступает таковому, вычисленному для всей совокупности штаммов. Данный результат означает, что географическая разделенность штаммов в данной популяции, а также их приуроченность к определенному растению-хозяину, не является причиной неслучайной ассоциации RFLP-типов.

С помощью теста на сцепление была оценена степень ассоциации 1ежду КГЬР-типами. Полученные значения критической вероятности Р [риведены в таблице 4. Данные теста на сцепление подтверждают налиме неслучайной ассоциации ИРЬР-типами, выявленной с помощью выделения 1А. Однако в 3 случаях из 10, а именно в сочетаниях г ее А-ю<Ш1АВС, гесА-посЮ2, а также ехр-посЮ2, значения Р свидетельству-эт о независимом комбинировании КЕЬР-типов.

Таблица 3. Анализ неравновесия по сцеплению в природной популяции Б.теШои по данным НИР-анализа.

n v„ ve U

все штаммы 56 1,64 1,15 1,42±0,04

А 26 1,94 1,18 1,64±0,09

Б 30 1,53 1,12 1,37±0,07

M.varia 34 2,15 1,16 1,85±0,07

M.officin. 22 1,55 1,17 1,32±0,10

п — число штаммов; У„ - наблюдаемая дисперсия, V. -ожидаемая дисперсия; 1А - индекс ассоциации.

Таблица 4. Анализ неравновесия по сцеплению между НП.Р-типами.

rech. exp nodDX ABC rtodD2 RFLP- тиггы

0,006 0,002 0,000 0,013 leu

0,000 0.526 0,241 recA.

0,000 0.053 exp

0,000 nodDXABC

Приведены точные значения критической вероятности Р. Нуль-гипотеза - отсутствие сцепления между КРЬР-типами, подчеркнуты значения Р, свидетельствующие о случайном комбинировании ИРЬР-типов (при 5% уровне значимости).

Анализ генетического родства штаммов.

л—п!

НЕЬР-генотип

ч-в

п-с

ч—Е |-?

- Б

- Н

- I

- J -1

- С

- О

- и

- К

- ь

- м

- р

- N

- О

- Б

- Т

- V?

- X

- У

- V

- и -1

ч

5 4 3 2 1 0 (1.0) (0.8) (0.6) (0.4) (0.2) (0)

число различий по ЕПР-типам

(относительное различие).

Рис.4. Дендрограмма родства ЕГЬР-генотипов природных штаммов Б.теШоЫ.

На рисунке 4 приве дена дендрограмма, отра жающая генетическое родст

Группа I

(26 штаммов) в0 штаммов Б.теШоН п данным 11И1|Р-анализа. Ка показал кластерный анали: популяция состоит из дву генетически обособленны: групп штаммов «I» и «II». ] группе «I» были отнесены 2 штаммов, имеющих 1е КП|Р-тип «а», к группе «II - 30 штаммов, имеющих 1е ЫПР-тип «Ь». Относитель ные различия между груп пами составляют 0,77.

Важно отметить, чт группы «I» и «II» контраста различаются по количеств; бесплазмидных штаммов копийности 13Кт2011-2-эле

Группа II (30 штаммов)

мента в геноме. Так, в группе «I» лишь 4% штаммов не содержали крип тических плазмид, в то время как в группе «II» - 40% штаммов. Средне количество копий 13Кт2011 -2-элемента составило 13,3±0,6 у штаммо! относящихся к группе «I», и 6,5±0,7 у штаммов, относящихся к групп «II». Выявленные различия по числу бесплазмидных штаммов и по чис лу копий 13Кт2011-2-элемента между штаммами, принадлежащими ; различным группам, достоверны (Р<0,001).

Анализ неравновесия по сцеплению с учетом RFLP-типов тес А, riodDIABC и nodD2 показал, что значение 1А для всей популяции свидетельствует о строгом сцеплении между RFLP-типами (2,94±0,01). В то же время, значения индекса ассоциации, вычисленного отдельно для итаммов группы «I» (1,44±0,02) и группы «II» (1,07±0,02), существенно тоже. Данные результаты подтверждают то, что в данной популяции :уществуют две генетически обособленные группы штаммов, между которыми, по всей видимости, ограничен перенос генов, в то время как знутри одной из групп такой перенос мог иметь место.

Важно отметить, что деление штаммов на группы «I» и «II» не ¡вязано ни с растением-хозяином, ни с участком выделения штаммов.

выводы

1. Проведен молекулярно-генетический анализ 56 симбиотически активных штаммов S.meliloti, выделенных в Европейско-Сибирском генцентре люцерны. По результатам RFLP-анализа по участкам leu, recA, exp, nodDIABC и nodD2 ризобиального генома выявлено 24 RFLP-генотипа. На основании анализа состава криптических плазмид выявлено 11 плазмидных типов. По результатам IS-типирования выявлено 42 ISRm2011-2-фингерпринта.

2. Показано, что главным фактором, определяющим генетическое разнообразие данной популяции, является растение-хозяин. Так, по результатам RFLP-анализа, различия между штаммами, выделенными из-под различных растений-хозяев, более существенны (D=0,15; Р<0,01), чем различия между штаммами, выделенными на различных участках (D=0,07; Р<0,05). Штаммы, выделенные из-под различных растений-хозяев, достоверно различаются по составу криптических плазмид (х2=23,74; df=8; Р<0,01), в

то время как между штаммами, выделенными на различных участках, не выявлено различий по данному признаку (/2=8,07; df=8; Р<0,1).

3. Штаммы, выделенные из-под донника, имеют четкие отличия от штаммов, выделенных из-под люцерны, по структуре симбиоти-ческого участка генома, на котором локализованы гены nodDIABC (D=0,52; Р<0,005).

4. Показано, что наиболее гетерогенными у штаммов S.meliloti являются симбиотические участки генома nodDIABC (Н=0,78) и nodD2 (Н=0,66), в то время как гетерогенность по участкам leu и гесА (хромосома), ехр (мегаплазмида-2) значительно меньше (Н= 0,51; 0,42 и 0,52, соответственно). Анализ неравновесия по сцеплению с учетом всех 5 участков генома показал, что популяция характеризуется высоким значением индекса ассоциации (1А=1,42±0,04), что свидетельствует о небольшом вкладе рекомби-нантных генотипов в структуру популяции. Однако RFLP-типы recA-nodDlABC и recA-nodD2 ассоциированы случайным образом (Р=0,53 и 0,24, соответственно), что может являться результатом переноса симбиотической плазмиды между штаммами.

5. Показано, что в данной популяции можно выделить две группы штаммов «I» (26 штаммов) и «II» (30 штаммов), контрастно различающихся по ряду молекулярно-генетических признаков: RFLP-типу (к группе «I» относятся штаммы leu RFLP-типа «а», к группе «И» - leu RFLP-типа «b»), наличию криптических плаз-мид (в группе «I» только один штамм из 26 (4%) не содержит криптических плазмид, в группе «II» - 12 штаммов из 30 (40%),

■ числу копий ISRm2011-2-элемента (в группе «I» среднее число копий ISRm2011-2 составило 13,3±0,6, в группе «II» - 6,5±0,7). Анализ неравновесия по сцеплению между RFLP-типами дает

основание предполагать, что перенос Sym-генов имел место только между штаммами, принадлежащими к одной группе.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

L. Аронштам А.А., Умаров Б.Р., Ерко В.Н., Андронов Е.Е., Симаров Б.В. Использование космидного банка генов Rhizobium meliloti для клонирования гена биосинтеза лейцина, участвующего в контроле развития азотфиксирующего симбиоза с люцерной. Генетика. 1993. N2. С.235-245.

!. Roumyantseva M.L., Andronov Е.Е., Yakutkina V.V., Dinh Thu Hang, Simarov B.V. Plasmid rearrangements in R.meliloti strains after passage through the nodules of alfalfa. 1st European nitrogen fixation conference. Szeged, Hungary. Sept. 2-3. 1994. P.78.

I. Андронов E.E., Румянцева M.JI., Шарыпова JI.A. Изучение полиморфизма штаммов Rhizobium meliloti, выделенных в генцентре происхождения люцерны (Средняя Азия). 1-й съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС). Саратов, 20-25 дек. 1994 г. С.53.

Simarov B.V., Roumyantseva M.L., Krol Е.А., Yakutkina V.V., Andronov E.E. Study of the structure and stability of the recombinant plasmid PRM46 which harbours nod-hsf genes of Rhizobium meliloti 1774, isolated from Medicago arabica nodules. 10th International congress on nitrogen fixation, St.Petersburg, May 28 - June 3. 1995. P. 418.

i. Roumiantseva M., Sharypova L., Damman-Kalinovsky Т., Andronov E., Simarov В., Puhler A., Keller M. Genetic diversity of Rhizobium meliloti native isolates from the Central Asia gene center of alfalfa. 2nd European nitrogen fixation conference and NATO advanced research workshop. Poznan, Poland. Sept. 8-13. 1996. P. 124.

. Андронов E.E., Румянцева M.JI., Сагуленко B.B., Симаров Б.В. Влия-

ние растения-хозяина на генетическое разнообразие природной популяции БгпогЫгоЫит теШоН. 1999. Генетика. N10. С. 1169-1177.

7. Румянцева М.Л., Андронов Е.Е., Сагуленко В.В., Онищук О.П., Сима-ров Б.В. Изучение стабильности наследования криптических плаз-мид и симбиотических свойств у штаммов клубеньковых бактерий люцерны в результате их симбиотического взаимодействия с растением-хозяином. П-й Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 1-5 февраля 2000 г. Санкт-Петербург. Тезисы докладов. Т.1. С. 299.

8. Андронов Е.Е., Румянцева М.Л., Сагуленко В.В., Симаров Б.В. Генетическое разнообразие природной популяции 5гпогЫгоЫит теШоЫ. П-й Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 1-5 февраля 2000 г. Санкт-Петербург. Тезисы докладов. Т.1. С. 275.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андронов, Евгений Евгеньевич

ВВЕДНИЕ

Глава 1. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ (Обзор литературы)

1.1. Методы, используемые при изучени разнообразия природных популяций клубеньковых бактерий а) Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ЯРЬР) б) ЛРЬР-анализ ПЦР-амплифицированных фрагментов геномной ДНК в) Использование Саузерн-гибридизации при ЯРЬР-анализе г) Методы геномного фингерпринтинга

1.2. Некоторые аспекты интерпретации результатов изучения генетического разнообразия природных популяций клубеньковых бактерий а) Установление генетической структуры природных популяций ризобий при использовании методов геномного фингерпринтинга б) Оценка генетического разнообразия природных популяций

1.3. Изучение генетических процессов в ризобиальных популяциях на основе анализа природного разнообразия изолятов а) Изучение процессов, происходящш в популяциях клубеньковых бактерий и ответственных за возникновение новых генотипов б) Роль географического фактора и растения-хозяина в формировании генетического разнообразия природных популяций ризобий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ структуры природной популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны"

Актуальность темы. Клубеньковые бактерии (ризобии) - микроорганизмы, фиксирующие в симбиозе с бобовыми растениями молекулярный азот атмосферы. В настоящее время ризобии являются одним из наиболее изученных биологических объектов. Интерес к ризобиям вызван, во-первых, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азот-фиксации, во-вторых, тем, что бобово-ризобиальный симбиоз является одним из наиболее интересных видов растительно-микробного взаимодействия. Изучение этого взаимодействия может дать ответ на целый ряд вопросов, касающихся процессов, ответственных за формирование генетического разнообразия природных популяций микроорганизмов и их эволюцию.

Одним из наиболее эффективных подходов к изучению природных популяций бактерий является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может явиться понимание процессов возникновения новых генотипов (мутации, генетические перестройки, горизонтальный перенос генов) и процессов, определяющих судьбу генотипов в популяции (отбор, конкуренция, миграция штаммов, генетический дрейф). К настоящему времени большое число природных популяций ризобий охарактеризовано с использованием изоферментного анализа. Проанализированы основные параметры популяционной структуры - гетерогенность популяции и неравновесие по сцеплению хромосомных генетических маркеров. Анализ факторов, определяющих генетический полиморфизм ризобий, показал, что растение-хозяин является ключевым фактором как для динамики ризобий в природных популяциях (поддержание численности и стабильности ризобий), так и для увеличения их генетического разнообразия.

В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные методы анализа ДНК. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма, более тесно связанные с генотипом и позволяющие анализировать любые участки ризобиального генома. С помощью методов анализа ДНК впервые стало возможным проанализировать участки генома, содержащие симбиотические гены, изучение которых было невозможно с использованием других методов. Анализ симбиотических участков генома ризобий особенно важен для выявления роли растения-хозяина в процессах формирования генетической структуры природных популяций клубеньковых бактерий. Представляет большой интерес использовать методы анализа ДНК для изучения основных параметров популяции - гетерогенности и неравновесия по сцеплению между хромосомными и плазмидными маркерами. Однако работы, сочетающие использование методов анализа ДНК с эффективными методическими подходами к анализу популяционной структуры и процессов, ее определяющих, единичны.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлся молекулярно-генетический анализ популяции S.meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны. В задачу исследований входило:

- выделить природные штаммы клубеньковых бактерий люцерны на двух удаленных участках из-под растений-хозяев двух различных видов - дикорастущих люцерны и донника, входящих в группу перекрестной инокуляции люцерны;

- определить видовую принадлежность штаммов с помощью рестрикционного анализа гена 16SpPHK;

- изучить генетическое разнообразие популяции с помощью RFLP-анализа 5 участков генома (leu, г ее А - хромосома; /íoé/DIABC, nodDl - мегаплазмида-1; ехр - ме-гаплазмида-2), анализа плазмидного состава штаммов и геномного ISi?m2011-2 фингерпринтинга;

- изучить влияние растения-хозяина и географического происхождения штаммов на генетическое разнообразие популяции клубеньковых бактерий люцерны;

- с использованием современных статистических методов оценить основные параметры генетической структуры популяции - гетерогенность и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые:

- изучена природная популяция клубеньковых бактерий S.meliloti, относящаяся к Ев-ропейско-Сибирскому генцентру люцерны. 56 природных штаммов S.meliloti охарактеризованы с использованием метода RFLP, анализа состава криптических плазмид и ISi?w2011 -2-фингерпринтинга;

- в геноме S.meliloti выявлен участок (фрагмент симбиотической плазмиды, содержащий гены лойЮ1АВС), структура которого существенно различается у штаммов, выделенных из-под донника и люцерны;

- с помощью метода RFLP определены основные параметры структуры изученной популяции: гетерогенность популяции по пяти различным участкам ризобиального генома (leu, reck. - хромосома; nodDIÁBC, nodD2 - мегаплазмида-1; ехр - мега-плазмида-2) и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами;

- показано, что хромосомные гесА. RFLP-типы и Sym-плазмидные ио<Ю1АВС и nodD2 RFLP-типы ассоциированы у штаммов данной популяции случайным образом, на основании чего сделан вывод о возможности переноса симбиотических плазмид между штаммами; показано, что в данной популяции существуют две генетически обособленные группы штаммов, контрастно различающихся по ряду молекулярно-генетических признаков: leu RJFLP-типу, наличию криптических плазмид, числу копий ISi?m2011-2-элемента.

Практическая значимость.

- Установлено, что методом, позволяющим наиболее точно идентифицировать штаммы S.meliloti, является ISi?m2011-2-фингерпринтинг, обладающий большой разрешающей способностью. Данный метод может быть использован для идентификации и мониторинга штаммов 5. meliloti.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1-ом Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 1st European nitrogen fixation conference (Szeged, Hungary 1994), 10th International congress on nitrogen fixation (St.Petersburg, 1995), 2nd European nitrogen fixation conference and NATO advanced research workshop (Poznan, Poland, 1996), 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Андронов, Евгений Евгеньевич

ВЫВОДЫ

- Проведен молекулярно-генетический анализ 56 симбиотически активных штаммов S.meliloti, выделенных в Европейско-Сибирском генцентре люцерны. По результатам RFLP-анализа по участкам leu, гесА, ехр, шсЮ1АВС и посЮ2 ризобиального генома выявлено 24 RFLP-генотипа. На основании анализа состава криптических плазмид выявлено 11 плазмидных типов. По результатам IS-типирования выявлено 42 ISi?m2011-2-фингерпринта.

- Показано, что главным фактором, определяющим генетическое разнообразие данной популяции, является растение-хозяин. Различия между штаммами, выделенными из-под различных растений-хозяев (D=0,15; Р<0,01), по результатам RFLP-анализа, более существенны, чем различия между штаммами, выделенными на различных участках (D=0,07; Р<0,05). Штаммы, выделенные из-под различных растений-хозяев, достоверно различаются по составу крип-тических плазмид (х2=23,74; df=8; Р<0,01), в то время как между штаммами, выделенными на различных участках, не выявлено различий по данному признаку (%2=8,07; df=8; РОД).

Штаммы, выделенные из-под донника, имеют четкие отличия от штаммов, выделенных из-под люцерны, по структуре симбиотического участка генома, на котором локализованы гены nodDl ABC (D-0,52; Р<0,005).

Показано, что у штаммов S.meliloti наиболее гетерогенными являются сим-биотические участки генома nodD 1АВС (Н=0,78) и nodDl (Н=0,66), в то время как гетерогенность по участкам leu, гесА (хромосома) и ехр (мегаплазми-да-2) значительно меньше (Н= 0,51; 0,42 и 0,52, соответственно). Анализ неравновесия по сцеплению с учетом всех 5 участков генома показал, что популяция характеризуется высоким значением индекса ассоциации (1д=1,42±0,04), что свидетельствует о небольшом вкладе рекомбинантных генотипов в структуру популяции. Однако поскольку RFLP-типы в парах гесА-nodDXABC и recA-nodD2 ассоциациированы случайным образом (Р=0,53 и 0,24, соответственно), это указывает на то, что имел место перенос симбиоти-ческой плазмиды между штаммами.

Показано, что в данной популяции имеется две группы штаммов «I» (26 штаммов) и «II» (30 штаммов), контрастно различающихся по ряду молеку-лярно-генетических признаков: RFLP-типу (в первой группе представлены штаммы leu RFLP-типа «а», во второй - leu RFLP-типа «b»); наличию крип-тических плазмид (в первой группе только один штамм (4%) не содержит криптических плазмид, во второй - 12 штаммов (40%)); числу копий ISi\!w2011-2-элемента (в первой группе среднее число копий ISi?w2011-2 составило 13,3±0,6, во второй - 6,5±0,7). Анализ неравновесия по сцеплению между RFLP-типами свидетельствует о том, что перенос Sym-генов имел место только между штаммами, принадлежащими к одной группе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заключая настоящий обзор, отметим, что молекулярные методы дают уникальную возможность всестороннего анализа природных популяций клубеньковых бактерий - генетической структуры и основных ее параметров; факторов, определяющих генетический состав популяции; процессов, обуславливающих возникновение новых генотипов и их судьбу в популяции. К преимуществам молекулярных методов необходимо отнести их универсальность - с их помощью может быть охарактеризован как небольшой участок генома, так и геном в целом. Что особенно важно, молекулярные методы дают возможность проанализировать любые участки генома -не только хромосомные, но и симбиотические. Такие преимущества уже реализуются в современных исследованиях. Так, при использовании изоферментного анализа было показано, что природные популяции ризобий гетерогенны, однако оставалась неизвестной гетерогенность популяций по симбиотическим участкам генома. Последние исследования показали, что симбиотические участки, по всей видимости, более гетерогенны, чем хромосомные - и этот факт весьма важен для понимания механизмов эволюции клубеньковых бактерий. Ранее на основании результатов изоферментного анализа было показано, что структура природных популяций клубеньковых бактерий в основном клональна. Однако теперь появилась возможность проанализировать неравновесие по сцеплению не только между хромосомными, но и Sym-плазмидными маркерами. Такие исследования показали, что симбиотические маркеры гораздо более подвижны, чем хромосомные. Наконец, целый ряд ранее полученных результатов, указывал на то, что растение-хозяин является важнейшим фактором, определяющим генетический состав популяций ризобий. Молекулярные методы дают возможность проанализировать влияние растения-хозяина, изучая разнообразие популяции по симбиотическим участкам генома - именно там, где и следовало бы искать наиболее ясные свидетельства такого влияния. Однако работ по изучению генетического разнообразия ризобий, использующих все преимущества молекулярных методов все еще крайне мало и данные работы, как правило, затрагивают только один из аспектов изучения генетического разнообразия.

Таким образом, необходимы комплексные исследования природных популяций ризобий, использующих все преимущества молекулярных методов и отвечающих на следующие вопросы: какова генетическая структура природных популяций клубеньковых бактерий, каковы ее основные параметры (гетерогенность, неравновесие посцеплению), каковы основные факторы, влияющие на формирование генетической структуры популяции.

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Отбор проб почв

Рис. 4. Географическая карта района, где были отобраны пробы почвы.

Образцы почв отбирали летом 1996 года в Иркутской области на двух участках А и Б, расположенных примерно в 80 км один от другого (рис. 4). На каждом из участков пробы отбирали из-под растений дикорастущих форм многолетней люцерны (Medicago varia) и донника (Melilotus officinalis) на глубине 15-20 см и на расстоянии не менее 50 м друг от друга. На участке А пробы отбирали из-под люцерны (пробы №1-9) и донника (пробы №2730); на участке Б из-под люцерны (пробы № 10-18) и донника (пробы №20-26). Пробы хранили при +4°С в течение 14 дней.

2.2. Выделение клубеньковых бактерий из почв

Из каждой пробы была приготовлена почвенная суспензия, содержащая 1 г почвы на 10 мл воды (Young et al., 1987), которой были инокулированы стерильные двухдневные проростки люцерны. Для выделения штаммов клубеньковых бактерий использовали 2 вида люцерны - многолетняя форма М. sativa сорт Вега и однолетняя форма M.truncatula сорт Jemalong. Растения выращивали в условиях стерильного микровегетационного опыта в течение 6 недель (Федоров и др., 1983). На корнях всех растений, кроме контрольных растений, инокуляция которых не проводилась, а также растений, инокулированных суспензией пробы №17, были обнаружены розовые клубеньки. Выделение бактерий из клубеньков проводили в соответствии с обычной методикой (Young et al., 1987). Бактерии рассевали истощающим штрихом на твердой среде TY (Beringer, 1974) и выращивали при 28°С в течение 3 суток. Затем отдельные колонии повторно рассевали истощающим штрихом до образования отдельных колоний. Далее, после второго рассева, отбирали по одной колонии из каждого варианта для последующего анализа. Симбиотические свойства отобранных штаммов повторно проверяли в стерильном микровегетационном опыте с люцерной. Всего было отобрано 56 штаммов, образующих эффективные клубеньки на растениях М. sativa, т.е. по 2 штамма от каждой из 28 исходных проб почв, из которых один штамм был выделен из клубеньков М. sativa, а другой - из клубеньков M.truncatula. В дальнейшем штаммы хранили как на косяках с агаризованной средой TY (Beringer, 1974) при +4°С, так и в жидкой среде TY, содержащей глицерин в концентрации 15%, при -70°С (Маниатис и др., 1984).

2.3. Нумерация штаммов

Все отобранные штаммы обозначили индексом SB (с SB011 по SB302). Первые две цифры после индекса соответствуют номеру пробы почвы, из которой была приготовлена почвенная суспензия. Третья цифра обозначает растение, которое ино-кулировали соответствующей почвенной суспензией и из клубеньков которого впоследствии был выделен штамм: 1 - M.sativa, 2 - M.truncatula.

2.4. Тестерные штаммы

В работе использованы три тестерных штамма: Rm2011 S.meliloti (Casse et al., 1979), MVII S.meliloti (Kosier et al., 1993) и CC169 S.medicae (Eardly et al., 1990).

2.5. Методы работы с ДНК

Общую ДНК клубеньковых бактерий выделяли по следующей методике. 1,5 мл ночной культуры клеток ризобий, выращенных в жидкой среде TY при 28°С на качалке (180 об/мин), центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Надоса-дочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ (10 ммоль TRIS-HC1, 5 ммоль ЭДТА, рН-8,0). К суспензии добавляли лизоцим (1мг/мл) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли SDS до концентрации 0,5% и протеиназу К до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Для уменьшения вязкости, образовавшийся прозрачный лизат замораживали при -20°С, и после этого замороженный лизат размораживали. Дважды экстрагировали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:24:2). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок осторожно промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды. Концентрация ДНК в каждой из проб составляла примерно 0,5 - 1 мкг/мл.

Рестрикцию общей ДНК клубеньковых бактерий проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). 2 мкг ДНК обрабатывали 10 ед. ЕсоШ-эндонуклеазы в 20 мкл соответствующего буфера в течение 15-20 ч. Электрофорети-ческое разделение и перенос фрагментов рестрикции ДНК на нейлоновую мембрану проводили обычным способом (Маниатис и др., 1984). При этом на одну дорожку 1% агарозного геля наносили 0,5-1 мкг рестрицированной ДНК. Электрофоретиче-ское разделение фрагментов рестрикции проводили в течение 5 часов при 5 в/см.

Для проведения блоттинг-гибридизации по Саузерну использовали пробы, меченные дигоксигенином, в соответствии с рекомендациями изготовителя (Boehringer Mannheim GmBH). Для приготовления гибридизационных проб были использованы следующие фрагменты ДНК: 1) 4.4 тпн ücoRI-фрагмент плазмиды pSUP202::/eM+, содержащий гены, влияющие на биосинтез лейцина штамма СХМ1 S.meliloti (Аронштам и др., 1993); 2) 3.3 тпн jBg/I/EcoRI-фрагмент плазмиды pKSK5, включающий nodABC гены штамма 41 S.meliloti (Румянцева и др., 1999); 3) в качестве единой пробы были использованы 5 фрагментов ДНК, каждый из которых был клонирован в одной из следующих плазмид: pARX::2.7 тпн, pARI::9.5 тпн, pARII/l::3.4 тпн, pARIV/l::2.9 тпн, рАВ57-1::10.9 тпн. Все 5 фрагментов составляют большую часть ехр-кластера (32 тпн) штамма Rm2011 S.meliloti (Becker et al., 1997); 4) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (223 пн) штамма Rm2011 S.meliloti, содержащий внутренний фрагмент гена nodD 1 (Румянцева и др., 1999); 5) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (около 1.0 тпн) штамма Rm2011 S.meliloti, содержащий ген гесА (Румянцева и др., 1999); 6) ПЦР-амплифицированный ISRm2011-2 элемент (Selbitschka et al., 1995).

Размеры гибридизующихся фрагментов определяли относительно электрофо-ретической подвижности Hindill- или Äy/EII-фрагментов ДНК фага X, используя линейную регрессию (logM от электрофоретической подвижности).

2.6. Рестрикционный анализ ПЦР-амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК

Фрагмент общей ДНК размером 1.5 тпн, содержащий последовательность гена 16S рРНК, был амплифицирован методом ПЦР с помощью праймеров Ю1 (5-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rDl (5'-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3'), содержащих последовательности гена 16S рРНК E.coli 8-27 и 1541-1525, соответственно, а также линкер-ные последовательности для клонирования (Weisburg et al., 1991). Аликвоты ам-плифицированной ДНК переваривали с помощью эндонуклеазы Rsal. Реакцию ПЦР и электрофоретическое разделение полученных фрагментов ДНК проводили в соответствии со стандартной методикой (Terefework et al., 1998).

2.7. Определение плазмидного состава штаммов

Плазмидный состав природных штаммов S.meliloti определяли по модифицированному методу Экхардта (Eckhardt, 1978). Примерно 50 |il ночной культуры штамма, выращенной в жидкой среде TY при 28°С на качалке (180 rpm), добавляли к 2 ml свежей жидкой среды TY и инкубировали при 2 8° С на качалке еще 2 часа. После этого полученную культуру инкубировали 30 мин при 4°С в холодильнике. Затем ее центрифугировали при 14000 rpm в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 30 лизирующего буфера IxTBE (Манниатис и др., 1984): 20% (w/v) сахароза; 1 mg/ml лизоцим; 0,1 mg/ml РНК-за. Суспензию немедленно вносили в лунку геля (IxTBE; 0,6% агароза; 0,4% SDS). Электрофорез проводили в IxTBE буфере: префорез в течение 30 мин при напряжении 0,5 v/cm; далее плазмидную ДНК разделяли в течение 10-14 часов при напряжении 3 v/cm. Гель окрашивали бромистым этидием, отмывали в воде и фотографировали. Размер плазмид определяли относительно электрофоретической подвижности плазмид тес-терного штамма МУП, используя линейную регрессию (^М от электрофоретической подвижности).

2.8. Статистическая обработка данных

На основании результатов гибридизационного анализа для каждой из использованных проб вычисляли коэффициент гетерогенности Н (генное разнообразие): где р~ частота Ш^ЬР типа в популяции, А - число М^ЪР-типов, а п - число штаммов (Вейр Б., 1994; ВготйеИ <* а1., 1998).

Чтобы определить, насколько штаммы из двух различных субпопуляций отличаются друг от друга по частотам Ю^ЪР-типов, вычисляли коэффициент различия /)=1-/, где 1- коэффициент идентичности М. Нея (Вейр Б., 1994): где а, и ¿>, - частоты 1УРЬР типов в сравниваемых субпопуляциях А и Б, к — число Ш^Р-типов (Вейр Б., 1994). Коэффициенты £> определяли как для каждого из изучаемых генетических районов, так и для всех пяти районов в совокупности (Д?), исходя из значения Значения Б могут варьировать от 0 (частоты всех ЫГЬР-типов одинаковы в субпопуляциях) до 1 (субпопуляции не имеют общих ИРЬГ-типов). к =

Достоверность определенных значений И оценивали по ^-критерию сходства между вариационными рядами (Лакин, 1990): к к где щ и hi - частоты RFLP типов в сравниваемых субпопуляциях А и Б, к - число RFLP-типов, щ- число штаммов с г-тым RFLP-типом.

Для того, чтобы определить, насколько случайно ассоциированы RFLP-типы в RFLP-генотипах, вычисляли индекс ассоциации Ia (Maynard Smith et al., 1993; Gordon et al., 1995). Для каждой пары штаммов определяли число несовпадений (mismatches) в составе RFLP-генотипов по RFLP-типам. Затем для всей популяции вычисляли дисперсии: а) для наблюдаемого числа несовпадений (Vo) и б) для числа несовпадений, распределенного по нормальному (гауссовому) закону (Ve), что ожидается при полной панмиктичности популяции. Показателем (индексом) неравновесия по сцеплению (linkage disequilibrium) является величина Ia=Vo /Ve , при этом нулевая гипотеза о панмиктической структуре популяции отвергается при Ia> 1.

Vexp и ее стандартная ошибку вычисляли следующим образом: где pi - частота /-того RFLP-типа по /-тому локусу; т - число локусов; к - число RFLP-типов по данному локусу. т к

К,Р= где hj = 1 - J] Р? i ' сту=1/и \hj0--hj)2

Для оценки сцепления между локусами использовали программу Arlequin 1.1. (Schneider et al., 1997), позволяющую проводить точный тест сцепления между локусами при вычислении точного значения критической вероятности Р.

Для построения дендрограммы родства использовали невзвешенный парно-групповой метод кластеризации с арифметическим средним (UPGMA) (Вейр Б., 1994), при этом за меру генетического сходства между двумя RFLP-генотипами принималось число (доля) общих RFLP-типов.

Глава 3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андронов, Евгений Евгеньевич, Санкт-Петербург

1. Вавилов Н.И. Центры происхождения культурных растений. Труды по прикл. бот., ген., и сел. 1926. Т. 16. вып. 2. С. 7-26.

2. Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир. 1995. 400 с.

3. Доросинский JI.M. Клубеньковые бактерии и нитрагин. JL: Колос. 1970. 191 с.

4. Доросинский JI.M. Конкурентная способность клубеньковых бактерий. Биологический азот в сельском хозяйстве СССР. М.: Наука. 1989. С.27-34.

5. Иванов А.И. Люцерна. М.: Колос. 1980. 350 с.

6. Израильский В.П., Рунов Е.В., Бернард В.В. Клубеньковые бактерии и нитрагин. М.: Сельхозгиз. 1933. 232 с.

7. Красильников H.A., Мелкумова Т.А. Изменчивость клубеньковых бактерий внутри клубеньков бобовых растений. Изв. Акад. Наук СССР. 1963. №5. С.693-706.

8. Жуковский П.М. Новые очаги происхождения и генцентры культурных растений и узкоэндемичные микроцентры родственных видов. Ботанич. журн. 1968. Т.53, №4, С.430-460.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352 с.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480 с.

11. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М.: Наука. 1973. 288 с.

12. Проворов H.A. Эволюция генетических систем симбиоза у клубеньковых бактерий. Генетика. 1996. Т.32. №8. С. 1029-1040.

13. Проворов H.A., Воробьев Н.И. (а) Популяционная генетика клубеньковых бактерий: моделирование циклических процессов в микробно-растительных системах. Генетика. 1998. Т.34.№ 12. С.1704-1711.

14. Проворов H.A., Воробьев Н.И. (б) Роль межштаммовой конкуренции в эволюции генетически полиморфных популяций клубеньковых бактерий. Генетика. 1998. Т.34. № 12. С.1712-1719.

15. Проворов H.A., Воробьев Н.И. Роль частотозависимого отбора в эволюции клубеньковых бактерий. Исследования по генетике. 1999. Вып.12. С.24-33.

16. Румянцева М.Л., Андронов Е.Е., Сагуленко В.В., Онищук О.П., Симаров

17. Федоров С.Н., Бутвина О.Ю., Симаров Б.В. Мутагенное действие УФ-излучения на клубеньковые бактерии люцерны и анализ симбиотических свойств полученных ауксотрофных мутантов. Генетика. 1983. Т.19. №5. С. 727 -736.

18. Bazzicalupo М. 1998. Личное сообщение.

19. Bergersen F.J., Brockwell J., Gibson A.H., Schwinghamer E.A. Studies of natural populations and mutants of Rhizobium in the improvement of the legume inoculation. Plant and Soil. 1971. Spec. Vol. P. 3-16.

20. Beringer J.E. R1 transfer in Rhizobium leguminosarum. J.Gen.Microbiol. 1974.V.84. P.188-198.

21. Bromfield E.S.P., Sinha I.B., Wolynetz M.S. Influence of location, host cultivar, and inoculation on the composition of naturalized populations of Rhizobium meliloti in Medicago sativa nodules. Appl.Environ.Microbiol. 1986. V.51. №5. P. 1077-1084.

22. Bromfield E.S.P., Behara A.M.P., Singh R.S., Barran L.R. Genetic variation in local populations of Sinorhizobium meliloti. Soil.Biol.Biochem. 1998. V.30. №13. P.1707-1716.

23. Broughton W.J., Heycke N., Priefer U., Schneider G.-M., Stanley J. Ecological genetics of Rhizobium meliloti: diversity and competitive dominance. FEMS Microbiol. Ecol. Lett. 1987. V.40. P.245-249.

24. Brown A.H.D., Felaman M.W. Population structure of multilocus associations. Proc. natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P.5913-5916.

25. Brunei B., Rome S., Cleyet-Marel J.C. Comparison of nucleotide diversity and symbiotic properties of Rhizobium meliloti population from annual Medicago species. FEMS Microb.Ecol. 1996. V.19. P.71-82.

26. Campbell A. Evolutionary significance of accessory DNA elements in bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 1981. V.35. P.55-83.

27. Casse F., Boucher C., Julliot J.S., Denarie J. Identification and characterization of large plasmids in Rhizobium meliloti using agarose gel electrophoresis. J. Gen. Microbiol. 1979. V.113. P.229-242.

28. Coutinho H.L.C., Handley B.A., Kay H.E., Stevenson L., Beringer J.E. The effect of colony age on PCR fingerprinting. Lett. Appl. Microbiol. 1993. V.17. P. 282-284.

29. Dadarwal K.R., Prabha S., Tauro P., Subba Rao N.S. Serology and host range in-fectivity of «cowpea group» rhizobia. Indian J. Exper. Biol. 1977. V.15. P.462-465.

30. Demezas D.H., Reardon T.B., Watson J.M., Gibson A.H. Genetic diversity among Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strains revealed by allozyme and restriction fragment length polymorphism analyses. Appl. Environ. Microb. 1991. V.52. №12. P.3489-3495.

31. Denarie J., Debelle F., Truchet G., Prome J.-K. Rhizobium and Legume nodulation: a molecular dialogue. New horizons in nitrogen fixation./Eds. Palacios R., Mora J., Newton W.E. 1993. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. P.19-30.

32. Eardly B.D., Materon L.A., Smith N.H., Johnson D.A, Rumbaugh M.D., Se-lander R.K. Genetic structure of natural populations of the nitrogen fixing bacterium Rhizobium meliloti. Appl. Environ. Microb. 1990. V.56, № 1. P. 187-194.

33. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid. 1978. V.l. P.584-588.

34. Fred E.B., Baldwin I.L., McCoy E. Root nodule bacteria and leguminous plants. Madison: Univ.Wiscon. Stud. Sci., 1932. 343 P.

35. Freiberg C., Fellay R., Bairoch A., Broughton W., Rosental A., Perret X. Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. Nature. 1997. V.387. №22. P.394-401.

36. Selenska-Pobell S., Evguenieva-Hackenberg E., Radeva G., Squartini A. Characterization of Rhizobium 'hedysari' by RFLP analysis of PCR amplified rDNA and by genomic PCR fingerprinting. J. Appl. Bacteriol. 1996. V. 80. N5. P. 517-28.

37. Givaudan A., Bally R. Similarities between large plasmids of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol Lett. 1991. V.78. P.245-251.

38. Glinn P., Higgins P., Squartini A., O'Gara F. Strain identification in Rhizobium tri-folii using DNA restriction analysis, plasmid DNA profiles and intrinsic antibiotic resistances. FEMS Microb. Lett. 1985. V.30. P. 177-182.

39. Gordon D.M., Wexler M., Reardon T.B., Murphy P.J. The genetic structure of Rhizobium populations. Soil. Biol. Biochem. 1995. V.27. №4/5. P.491-499.

40. Graham P.H. Antibiotic sensitivities of root nodule bacteria. Austral. J. Biol. Sci. 1963. V.16. P.557-559.

41. Graham P.H. Serological studies with Agrobacterium radiobacter, A.tumefaciens and Rhizobium strains. Arch. Microbiol. 1971. V.78. P. 70-75.

42. Hallet B., Sherratt D.J. Transposition and site-specific recombination: adapting DNA cut-and-paste mechanisms to a variety of genetic rearrangements. FEMS Microbiol. Rev. 1997. V.21. P.157-178.

43. Harrison S.P., Young J.P.W., Jones D.G. Rhizobium population genetics: effect of clover variety and inoculum dilution on the genetic diversity sampled from natural populations. 1987. Plant and Soil. V.103. P.147

44. Harrison S.P., Jones D.G., Schunman P.H.D., Forster J.W., Young P.W. Variation in Rhizobium leguminosarum biovar trifolii Sym plasmid and the association with effectiveness of nitrogen fixation. J.Gen.Microbiol. 1988. V.134. №10, P. 2721-2730.

45. Harrison S.P., Jones D.G., Young J.P.W. Rhizobium population genetics: genetic variation within and between population from diverse locations. J. Gen. Microbiol. 1989. V.135. P. 1061

46. Harrison S.P., Mytton L.R., Scat L., Dye M., Cresswell A. Characterization of Rhizobium isolates by amplification of DNA polymorphisms using random primers. Can. J. Microbiol. 1992. V.38. P.1009-1015.

47. Hartmann A., Amarger N. Genotypic diversity of an indigenous Rhizobium meliloti population assessed by plasmid profiles, DNA fingerprinting and insertion sequence typing. Can. J. Microbiol. 1991. V.37. P.600-608.

48. Hartman A., Giraud J.J., Catroux G. Genotypic diversity of Sinorhizobium (formerly Rhizobium) meliloti strains isolated directly from a soil and from nodules of alfalfa (Medicago sativa) grown in the same soil. FEMS Microb.Ecol. 1998. V.25. P.107-116.

49. Hirsh P.R. Population dinamics of indigenous and genetically modified rhizobia in the field. New. Phitol. 1996. V.133. P.159-171.

50. Honma M.A., Ausubel F.M. Rhizobium meliloti has three functional copies of the nodD symbiotic regulatory gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V.84. №23.1. P.8558-8662.

51. Honma A.M., Asomaning ML, Ausubel F.M. Rhizobium meliloti nodD genes mediate host-specific activation of nodABC. J. Bacteriol. 1990. V.172. №2. P.901-911

52. Hynes M.F., Simon R., Müller P., Niehaus K., Labes M., Pühler A. The twomegaplasmids of Rhizobium meliloti are involved in the effective nodulation of alfalfa. Mol. Gen. Genet. 1986. V.202. N3. P. 356-362.

53. Huber I., Selenska-Pobel S. Characterization of Rhizobium galegae by REP-PCR, PFGE and 16S rRNA sequencing. 1994. In. Symiotic nitrogen fixation. Eds. Graham P.H., Sadovsky M.J., Vance C.P. Kluver Academic Publishers. Netherland. P.153-158.

54. Jensen H.L. Nitrogen fixation in leguminous plants. 1. General characteristics of root nodule bacteria isolated from species of Medicago and Trifolium in Australia. Proc. Linn. Soc. N.S.W. 1942. V.67. P.98-108.

55. Johnston A.W.B., Hombrecher G., Brewin N.J., Cooper M.C. Two transmissible plasmids in Rhizobium leguminosarum strain 300. J. Gen. Microbiol. 1982. V.128. №1. P.85-93.

56. Jordan, D.S. Family III. Rhizobiaceae. Bergey's manual of systematic bacteriology/Eds. Krieg N.R. and Holt J.G. Baltimor: Williams & Wilkins. 1984. Vol.1. P.234-256.

57. Kamberger W. An ouchterlony double diffusion study on the interaction between legume lectins and rhizobial cells surface antigens. Arch. Microbiology. 1979. 121. P. 83-90.

58. Kosier B., Ptihler A., Simon R. Monitoring the diversity of Rhizobium meliloti field and microcosm isolates with a novel rapid genotyping method using insertion elements. Molec. Ecol. 1993. V.12. P.35-46.

59. Laberge S., Middleton A.T., Wheatcroft R. Characterization, nucleotide sequence and conserved genomic locations of insertion sequence ISRmS in Rhizobium meliloti. J. Bact. 1995. V.177. №11. P.3133-3142.

60. Laguerre G., Masurier S.I., Amarger N. Plasmid profiles and restriction fragment length polymorphism of Rhizobium leguminosarum bv. viciae in field populations. FEMS Microb. Ecol. 1992. V.101. P. 17-26.

61. Laguerre G., Allard M.R., Revoy F., Amarger N. Rapid identification of Rhizobia by restriction fragment lenght polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes. Appl. Environ. Microb. 1994. V.60. №1. P.56-63.

62. Lenski R.E. Assessing the genetic structure of microbial populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P. 4334-4336.

63. Lindstrom K., Lipsanen P., Kaijalainen S. Stability of markers used for identification of two Rhizobium galegae inoculant strains after five years in the field. Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. № 2. P.444-450.

64. Lindstrom K. International Committee on Systematic Bacteriology Subcommittee on Taxonomy of Agrobacterium and Rhizobium. Minutes of the Meeting, 2 June 1995, St.Petersburg, Russia. Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V.46. P.623.

65. Louvrier P., Laguerre G., Amarger N. Distribution of symbiotic genotypes in Rhizobium leguminosarum biovar viceae populations isolated directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. № 11. P.4202-4205.

66. Martinez E., Romero D., Palacios R. The Rhizobium genome. Crit. Rev. Plant Sci. 1990. V.131.P.1779.

67. Mazurier S.-I., Rigotter-Gois L., Amarger N. Characterisation, distribution, and localization of ISR12, an insertion sequence element isolated from Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.685-693.

68. Mercado-Blanco J. and Toro N. Plasmids in Rhizobia: The role of nonsymbiotic plasmids. MPMI. 1996. V.9. №7. P.535-545.

69. Milkman R., Electrophoretic variation in Esherichia coli from natural sources. Science. 1973. 182, 1024-1026.

70. Nelson K., Whittam T.S., Selander R.K. Nucleotide polymorphism and evolution in the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gapA) in natural populations of Salmonella and Esherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.88. P.6667.

71. Nick G. Polyphastic taxonomy of Rhizobia isolated from tropical tree legumes. Academic dissertation in microbiology. 1998. University of Helsinki.

72. Nieman S., PUhler A., Tichy H.-V., Selbitschka W. Evaluation of the resolving power of three different DNA fingerprinting methods to discriminate among isolates of a natural Rhizobium meliloti population. J. Appl. Microbiol. 1997. V.82. P. 477484.

73. Nour S.N., Cleyet-Marel J.-C., Beck D., Effosse A., Fernandez M. Genotypic and phenotypic diversity of Rhizobium isolated from chickpea. Can. J. Microbiol. 1994. V.40. P. 345-354.

74. Pafetti D., Scotti C., Gnocchi S., Fancelli S., Bazzicalupo M. Genetic diversity of an Italian Rhizobium meliloti population from different Medicago sativa varieties. Appl. Environ. Microb. 1996. V.62. №7. P. 2279-2285.

75. Plazanet C., Refregier G., Demont N., Truchet G., Rosenberg C. The Rhizobium meliloti region located downstream of the nod box n6 is involved in the specific nodu-lation of Medicago lupulina. FEMS Microbiol. Lett. 1995. V.133. P.285-291.

76. Prakash R.K., Atherly A.G. Plasmids of Rhizobium and their role in symbiotic nitrogen fixation. Int.Rev.Cyto!. 1986. V.104. P. 1-24.

77. Rome S., Fernandez M.P., Brunei B., Normand P., Cleyet-Marel J.-C. Sinorhizo-bium medicae sp. nov., isolated from annual Medicago spp. Int. J. Syst. Bact.1996. V.46. № 4. P. 972-980.

78. Van Rossum D., Schuurmans F.P., Gillis M., Muyotcha A., Verseveld H.W., Stouthhammer A.H., Boogerd F. Genetic and phenetic analyses of Bradirhizobium strains nodulating peanut. Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. № 4. P. 1599-1609.

79. Schofield P.R., Gibson A.H., Dudman W.F., Watson J.M. Evidence for genetic exchange and recombination of Rhizobium symbiotic plasmids in a soil population. Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53. №12. P. 2942-2947.

80. Selander R.K., Levin B.R. Genetic structure in Esherichia coli populations. Science. 1980. V.210,№31,P. 545-547

81. Selbitschka W., Arnold W., Jording D., Kosier B., Toro N., Piihler A. The insertion sequence element lSRm2011-2 belongs to the IS<530-Tcl family of transposable elements and is abundant in Rhizobium meliloti. Gene. 1995. V. 163. P. 59-64.

82. Selenska-Pobel S., Gigova L., Petrova N. Strain-specific fingerprints of Rhizobium galegae generated by PCR with arbitrary and repetitive primers. J. Appl. Bact. 1995. V.79. P. 425-431.

83. Shishido M., Pepper L. Identification of dominant indigenous Rhizobium meliloti by plasmid profiles and antibiotic resistance. Soil. Biol. Biochem. 1990. V.2 2. №1. P. 11-16.

84. Shneider S., Kueffer J.-M., Roessli D., Excoffier L. Arlequin ver. 1.1: A software for population genetic data analysis. 1997. Genetics and Biometry Laboratory, Univer sity of Geneva, Switzerland.

85. Simon R., Hotte B., Klauke B., Kosier B. Isolation and haracterization of insertion sequence elements from Gram-negative bacteria by using new broad-host-range, positive selection vectors. J. Bacteriol. 1991. V. 173. №4. P. 1502-1508.

86. Smith J.M., Smith N.H., O'Rourke M., Spratt B.G. How clonal are bacteria? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. № 5. P. 4384-4388.

87. Sobral B.W.S., Honeycutt R.J., Atherly A.G., McClelland M. Electrophoretic separation of the three Rhizobium meliloti replicons. J. Bact. 1991. V. 173. №16. P. 51735180.

88. Souza V., Nguyen T.T., Hudson R.R., Pinero, Lenski R.E. Hierarchical analysis of linkage desequilibrium in Rhizobium populations: evidence for sex?

89. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1992. V. 89. P. 8389-8393.

90. Spoerke J.M., Wilkinson H.H., Parker M.A. Nonrandom genotypic associations in alegumQ-Bradyrhizobium mutualism. Evolution. 1996. V. 50. №1. P. 146-154.

91. Stern M.J., Ames G.F.-L., Smith N.H., Robinson E.C., Higgins C.F. Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome. Cell. 1984. V. 37. P.1015-1026.

92. Terefework Z., Nick G., Suomalainen S., Paulin L., Lindstrom. Philogeny of Rhizobium galegae with respect to other rhizobia and agrobacteria. Int. J. Syst. Bact. 1998. V. 48. P. 349-356.

93. VaIdes A.M., Pinero D. Philogenetic estimation of plasmid exchange in bacteria. Evolution. 1992. V. 46. №3. P. 641-656.

94. Vos P., Hogers R., Beeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acid Research. 1995. V. 23. P. 4407-4414.

95. Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, D.J. 16S ribosomal DNA amplification for philogenetic study. J. Bacteriol. 1991. V. 173. №2. P. 697-703.

96. Wernegreen J.J., Harding E.E., Riley M.A. Rhizobium gone native: unexpected plasmid stability of indigenous Rhizobium leguminosarum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.V. 94. P. 5483-5488.

97. Wexler M., Gordon D.M., Murphy P.J. Genetic relationships among rhizopine-producing Rhizobium strains. Microbiology. 1996. V. 142. P. 1059-1066.

98. Young J.P.W. The population genetics of bacteria. Genetics of bacterial diversity. /Eds. Hopwood D.A., Chater K.F. 1989. Academic press. London.

99. Young J.P.V., Demetriou L., Apte R.G. Rhizobium population genetics: enzyme polymorphism in Rhizobium leguminosarum from plants and soil in a Pea Crop. Appl. Anviron. Microb. 1987. V. 53. №2. P. 397-402.

100. Young J.P.V.and Wexler M. Sym-plasmid and chromosomal genotypes are corre lated in field populations of Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 2731-2739.1. БЛАГОДАРНОСТИ