Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пектиндеполимеразы грибов: особенности регуляции биосинтеза, свойства, применение

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пектиндеполимеразы грибов: особенности регуляции биосинтеза, свойства, применение"

РГб Ой

г 1 ° АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

2 »3 ИМ» «95

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

УДК —.".77.!32:С:С0Г! 5'—™

МИХАЙЛОВА РАИСА ВЛАДИМИРОВНА

ПЕКТИНДЕПОЛИМЕРАЗЫ ГРИБОВ: ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Минск — 1995

Работа выполнена в Институте микробиологии Академии взук Беларуси

Официальные оппоненты-.

Заслужены!! деятель науки России,

доктор биологических наук, профессор А.Ы. Безбородсв

Заслуженый деятель науки Беларуси,

доктор биологических наук, профессор У.В. Запашка

Доктор химических наук, профессор Д.И. Метелица

Оппонирупцая организация - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН Украины

Защита состоится && 1995 г. в ^ ва заседании совета по защите диссертаций Д 01.34.01. в Институте микробиологии • АН Беларуси по адресу.- 220141, Минск,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Беларуси.

£о данекая, 2.

Автореферат разослан ^ ^ 1Э95 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций

t

■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность темы. Фермента - высокоспецифические катализатора белковой природы, осуществляющие регуляцию клеточного метаболизма, незаменимы в клинической практике, промышленности, сельском хозяйстве и ааутпах. исследованиях. Поиск и селекция продуцентов ферментов, оптазация условий in культивирования, рпзр'^ткя способов получения и применения ферментных препаратов яэсохоли»« дли развития современной биотехнологии. Изучение закономерностей образования ферментов микроорганизмами и механизмов, регулирующих продукцию ферментов, - ключевые вопросы клеточной биологии, основа целенаправленного и эффективного использования биосинтетического аппарата микроорганизма-продуцента.

Анализ имеющейся информации по проблеме показывает, что регу-ляторные механизмы синтеза ферментов изучены, в основном, на про-кариотических организмах. Значительно меньше данных о контроле образования секретируемых зукариотами ферментов, осуществляющих деградацию растительных полимеров.

Экзоферменты грибов являются специфическими продуктами вторичного метаболизма. В ряде обзоров (Шапошников, 1968; Bezborodov.

1978! Calem. 1979¡ Hose. 1979: ФеОфИЛОВв, 1981; Campbell. 1984)

обобщены данные по образованию микроорганизмами вторичных метаболитов. Изучение контрольных механизмов синтеза внеклеточных ферментов зукариотами - необходимый этап развития теории вторичного метаболизма. Эти исследования также важны для расширения наших представлений о роли грибов-деструкторов органического веществ« растительных остатков в биогеоценозах.

Общебиологическая значимость проблемы обусловливает необходимость проведения широкого сравнительного изучения образования эк-зодеполимераз грибами и установления механизмов, контролирующих синтез. Ценность и актуальность таких исследований подтверждается также практической значимостью данной группы ферментов. Деполиме-разы, катализирующие расщепление растительной клеточной стенки, незаменимы в технологических процессах переработки растительного сырья. Особенно важны пектиндеполимеразы - ведущие ферменты в мацерации растительной ткани. Пектиндеполимеразы обеспечивают увеличение выхода, улучшение качества продуктов пищевой промышленности. Перспективно их использование в винодельческой, легкой и фармацевтической промышленности. Препараты могут применяться в качестве биохимреактивов для выделения растительных клеток, протопластов,

г

клеточных, структур, для изучения строения растительных полимеров.

Пектиндеполимеразные ферментные препараты в республике Беларусь не производятся. Экономическая целесообразность их использования в процессах переработки растительного сырья определяет необходимость разработки отечественных препаратов для решения проблем народного хозяйства, здравоохранения и науки.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в лаборатории ферментов Института микробиологии АН Беларуси в течение 1983-1994 гг. как часть четырех плановых тем: "Изучение индуцированного и конститутивного синтеза экзодеполимераз у микроорганизмов различных таксономических груш" (1983-1985), N Госрегистрации 01.83.0006337; "Изучение биогенеза-микробных деполимераз" (1986-1988), N Госрегистрации 01.86. 0003709; "Регуляция образования полиферментных систем микроорганизмов, расщепляющих природные полимеры" (1989-1991), N Госрегистрации 01.890005269; "Исследование синтеза и характеристика ферментных белков у микромицетов и их регуляторных мутантов" (19921995), ы Госрегистрации 01.92.0004533. Ряд разделов работы выполнен в рамках КП НТП СЭВ, тема N 1 "Разработка и внедрение технологии и техники производства плодово-овощных соков с использованием мацерируюших и иммобилизованных ферментных препаратов" (1989-19Э1). '

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении закономерностей образования экзодеполимераз грибами, определении физиолого-биохимических особенностей регуляции их синтеза. В качестве основного объекта выбраны пектиндеполимеразы - ведущие ферменты в мацерации растительной ткани.

Для достижения поставленной цела предусматривалось решение следующих задач:

- изучение способности грибов различных родов продуцировать внеклеточные деполимеразы;

- отбор грибов - высокоактивных продуцентов ферментов, их морфологическая и фмзиолого-биохимическая характеристика;

- выяснение влияния факторов среды нз образование пектиндепо-лимераз;

- сравнительный кинетический анализ синтеза ферментов, регулируемого различными механизмами;

- исследование участия специализированных и неспециализированных регуляторов в механизмах контроля синтеза ферментов;

- изучение полиферментных систем пектиндеполимераз гриоов;

- получение и оценка перспективы применения ферментных препаратов мацерирующего действия.

Научная новизна полученных результатов. Показана широкая распространенность у мицелиалъных гриоов различных родов способности расселяя?*; растмтвлышо погасзхзрйда « особенно пектиновые вещества. Установлено, что для Оольктнетва иссдадовашшх грп'св г^рпн-терея индуцировэнный синтез пектингидролаз и целлюлаз, а такта индуцированный и конститутивный, частично репрессируемый глюкозой, синтез пактинлиаз и ксиланаз.

Впервые проведен сравнительный кинетический анализ индуцированного и конститутивного синтеза пектиндеполимераз с различной чувствительностью к катаболитной репрессии. Установлено, что, независимо от контрольного механизма, продуцирование пектингидролаз и пектинлиаз характеризуется общими закономерностями, присущими процессам синтеза вторичных метаболитов. Показано, что при участии в регуляции образования деполимераз двойного контроля - индукции и катаоолитной репрессии, конститутивноста и катаболитной репрессии - происходит значительное разобщение фаз роста грибов и продукции ферментов, снижение скорости синтеза, удлинение времени достижения ее максимального значения по сравнению с процессами, регулируемыми одаим контрольным механизмом.

Детально исследовала катаоолитная репрессия образования пек-тппдололкмерез грибами: установлена неспецифичность репрессии, зависимость эфрэкта от концентрации и времени действия рэпроссорэ. Впервые показано, что специализированный регулятор ц-З'.Ь'-АМФ участвует в контрольном механизме катаболитной репрессии как конститутивного, так и индуцированного синтеза пектиндеполимераз. Выявлено, что реализация катаоолитной репрессии синтеза пектингидролаз осуществляется на уровне транскрипции.

Показано, что грибные нектингидролаза и пектинлиазы представлены множественными молекулярными формами. Впервые выявлено, что молекулярные формы ферментов различаются как по способу действия, субстратной специфичности, оптимальным условиям деградации субстратов, так и по механизмам регуляции их синтеза. Контрольные механизмы синтеза, такие как конститутивность, индукция, катаоолитная репрессия, обеспечивают продукцию необходимого в данных условиях спектра множественных. молекулярных форм ферментов с определенной функциональной значимостью. Впервые выявлено, что конститутивный.

л

устойчивый к репрессии ка7таболитом контроль является обязательным, базовым механизмом регуляции образования наиболее функционально важных ферментов пектиндеполимеразных комплексов.

Можно полагать, что установленная молекулярно-функциональная гетерогенность пектиндеполимерзз грибов представляет собой эволю-ционно закрепленную экологическую вариабельность ферментного аппарата. возникшую в условиях использования гетерогенных природных биополимеров. Биологическая целесообразность существования различных контрольных механизмов образования пектиндеполимерзз у грибов заключается в обеспечении необходимого состава полифэрментных комплексов посредством дифференциального синтеза ферментов, что может рассматриваться как элемент сложной системы адаптации, высокой конкурентоспособности и экологической пластичности культур.

Впервые показана способность штаммов АврвгвШив »иисш. выделенных из различных природных источников, продуцировать пек-тиндеполимеразы и предложено использовать это свойство в качестве дополнительного таксономического критерия вида.

Полученные в работе результаты существенно дополняют и расширяют представление о синтезе и контрольных механизмах образования эукариотами внеклеточных ферментов и имеют большое значение для важнейшего раздела микробиологии - физиологии и биохимии микроорганизмов.

Практическая значимость полученных результатов. В результата проведенной работы выделены перспективные в промышленном отношении продуценты пектолитических.и ксиланолитаческих ферментов. Отселзк-тированы и защищены авторскими свидетельствами СССР высокоактивные продуценты пектиндеполимераз АярвгвШив аШасви» БШ-83, БШ-87, Реп1с1111ит а<1шпе*г11 БШ--90. |>;<ив1^ит 324,' Р.с1Лг1пи«п БИМ-91, Р.3вп«г1пвг1ит БИМ-303, р.еопчит ЛБФ-15, РЛаповит ЛБФ-3. Получены морфологически и биосинтетически стабильные мутантные' штаммы АврвгвШия аХПасена, ПрвВЫШащИв В 2-3 рЭЗВ по продуктивности ферментов пектингидролазного комплекса исходешй штамм.

Предложены и защищены авторскими свидетельствами СССР питательные среда для культивирования Рвп1е1Шит ¡ив^агит. Разработан и защищен авторским свидетельством СССР способ получения комплекса мацерирупцих ферментов, содержащего пектингадролазы и проте-азу АарегеШиз а1 Паевая. Отработаны условия получения мацериру-кгда ферментных препаратов Пектомацерин ГЗх, ПОх, Г20х, Нектал-диацин ГОх, ПОх.

Разработан лабораторный регламент и временная технологическая инструкция на производство препарата Поктомацерин. Технология получения препарата апробирована на Московском и Вильнюсском ОПЗ ферментных препаратов, Ладыжинском заводе ферментных препаратов. Приволжском и Унгенском биохимзаводах. Препараты Пектомацерин и Пекталлиацин проверены на безвредность и разрешены для применения 5 ттулдевой прокшшшшюстл. '

Разработаны ферментативные способы нияукняя 5!<:'.*тряктов для производства безалкогольных напитков; комплексной переработки пряно-ароматического сырья; получения льняной тресты и пищевого цитрусового пектина; акспресс-определения устойчивости клубней картофеля к внутренним механическим повреждениям. Указанные способы защищены авторскими свидетельствами СССР и могут служить основой для создания новых промысленных технологий.

Перспективно использование препаратов Пектомацерин и Пектал-лиацин в технологиях получения фруктово-ягодных, плодовых и овощных пюре, нектаров, соков с мякотью. Ферментативная обработка сырья увеличивает выход продукта на 8-18%. Эффективность применения препаратов подтверждена полупроизводственными и производственными испытаниями, проведенными на Кипгиневском экспериментальном консервном заводе, Павловском пищекомбинате, консервном комбинате "Адыгейский" (Краснодарский край). Показано, что Пектомацерин эффективен при осветлении яблочных соков, обработке мандаринов и винограда сорта "Изабелла", а Пекталлиацин - при получении эфирного масла из лепестков розы.

Выявлена возможность применения препаратов мацериругадего действия как биохимреактивов в научных исследованиях для получения жизнеспособных изолированных растительных клеток и протопластов.

Препараты Пектомацерин и Пекталлиацин отмечены дипломами I и II степени на ВДНХ БССР (1987 т.), экспонировались на ВДНХ СССР (1988 г.). Международных выставках в Чехословакии (1968 г.) и Германии (1989 Г.).

Экономическая значимость полученных результатов. Штаммы грибов - . высокоактивных продуцентов пектиндеполимераз, технологии I получения ферментных препаратов, новые ферментные препараты мацерирувдего действия, разработанные на их основе ферментные способы получения из растительного сырья ценных продуктов'для пищевой, легкой, фармацевтической промышленности и научных- исследований являются коммерческими продуктами и могут быть реализованы заинтэ-

ресованнш предприятиям и организациям.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Широкая распространенность у мицелиальных грибов способности продуцировать внеклеточные деполимеразы, катализирующие расщепление растительных полимеров, участив индукшш, конститутивности, катаболитной репрессии в регуляции их образования. Характеристика катаболитной репрессии синтеза пектиндеполимераз, роль ц-3',5'-АМФ в механизме катаболитной репрессии индуцированного и конститутивного образования пектингидролаз и пектинлиаз. Конститутивный, устойчивый к репрессии катаболитом контроль - базовый механизм регуляции наиболее функционально важных ферментов иектиндеполимеразных комплексов.

Множественность молекулярных форм пектиндеполимераз, их отличие по механизмам регуляции образования, способу действия, субстратной специфичности, оптимальным условиям деградации субстратов. Молекулярно-функциональная гетерогенность пектиндеполимераз грибов как ЭВ0ЛЮШ01Ш0 закрепленная вариабельность ферментного аппарата, возникшая в условиях использования гетерогенных природных полимеров. Биологическая целесообразность различных механизмов контроля образования пектиндеполимераз, заключающаяся в формировании комплексов определенного состава посредством дифференциального синтеза ферментов. Различные контрольные механизмы'образования пектиндеполимераз как элемент сложной системы адаптации, высокой конкурентоспособности и экологической пластичности грибов.

Новые продуценты Пектиндеполимераз, отличающиеся от известных, в том числе используемых в промышленности, составом ферментных комплексов и активностью компонентов. Разработанные ферментные препараты и созданные на их основе способы выделения из растительного сырья ценных продуктов для пищевой, легкой, парфюмерной, фармацевтической промышленности и научных исследований.

Личный вклад соискателя. Михайловой Р.В. научно аргументировано направление исследований, осуществлена постановка задач, разработаны подходы их решения, получен, обобщен и обоснован экспериментальный материал диссертационной работы. Соавторами научных трудов диссертанта являются сотрудники лаборатории ферментов, участвовавшие в,выполнении экспериментов.

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены на ух и VII Съездах Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980; Алма-Ата, 1985), VIII Между-

народном микробиологическом конгрессе (Бостон, США, 1902), vu Международной конференции по прикладной микробиологии (Хельсинки, Финляндия, 1985), Советско-финском семинаре по микробиологической деградации лигно-целлюлозного сырья (Тбилиси, 1985), хх Международном симпозиуме "Непрерывное культивирование в биотехнологии и охрана окружающей среды" (Кралов-Градец, Чехия, 1987), iv Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Советско-ч&шсхгм семинэрс по йюкйаьорсиа рает««>лмта* мэ. териалов" (Зспо. Финляндия, 1990). В заверенном виде диссертационная работа доложена на расширенном заседании лаборатории ферментов и лаборатории биохимии Института микробиологии АН Беларуси, на заседании Ученого Совета Института микробиологии АН Беларуси (Минск, 1995).

Опубликованность результатов. Результаты исследований опубликованы в 2 коллективных монографиях, 34 статьях в научных журналах, 8 сборниках и 20 тезисах конференций, защищены 13 авторскими свидетельствами на изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, анализа и обобщения результатов исследований, выводов, списка использованных источников, приложений.

Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 60 таблиц, 54 рисунка, 19 приложений, список использованных источников, включающий 721 наименование.

. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

. Глава I дисссртационной работа является обзором литературы и состоит из 3 разделов. В первом разделе дана характеристика растительного сырья, описаны ферменты, "Катализирующие расщепление полимеров растительной клеточной стенки. Второй раздел посвящен анализу информации по механизмам регуляции синтеза ферментов микроорганизмами, закономерностям и контрольным механизмам образования пек-тиндеполимераз грибами. В третьем разделе детально описаны свойства поктиндеполимераз, их участие в мацерации растительной ткани в природе, показаны возможности применения ферментов в технологиях переработки растительного сырья и научных исследованиях. .

В главе -2 представлена характеристика следующих используемых в диссертации объектов и методов исследования.

Объектами изучения были грибы, полученные из музеев Института микробиологии АН Беларуси, Института экспериментальной ботаники

им. В.Ф.Купцевича АН Беларуси, Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской АН, Российского научно-исследовательского института антибиотиков. Украинского научно-исследовательского института пищевой промышленности, Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН Украины, а также выделенные нами из различных природных источников. Идентификацию выделенных грибов проводили на основании морфологических и физиолого-биохими-ческих признаков (СИюл, 19X5; Литвинов, 1967: Пидопличко, 1977).

ОСНОВНЫМИ Объектами исследований ЯВЛЯЛИСЬ АзрегвШиа вП1«-свш> БИМ-83. Реп1о1111ит А1в1Л&гит 24П, Х>.9о11гит 265, РЛапоаит ЛБФ-3. Р.ЗапгЫпвИит БИМ-303. Р.аЛатвггИ БИМ-90 И Р.о1гг1тдт БИМ-91.

В зависимости от цели эксперимента грибы культивировали поверхностным или глубинным способами в 250 мл колбах Эрленмейера в термостатных камерах, на круговой качалке, а также в ферментерах объемом 0,1, 0,25 и 3,2 м3 при температуре 24-28°. В качестве посевного материала применяли водную суспензию спор (1хЮ7 / 50 мл среды), полученных после выращивания культур в течение 14 сут при 24-28° на картофеле-глюкозном агаре.

Для культивирования грибов в качестве основной применяли питательную среду Чапека, в которой, в зависимости от задачи исследования, в качестве источников углерода использовали свекловичный жом или его экстракт, свекловичный и яблочный пектины, моно- и дисахара, спирты, сахароспирты, органические кислоты, а также различные минеральные и органические источники азотного питания.

Экстракты свекловичного' жома и солодовых ростков получали по методам (Фертман, Гире, 1969; Брунс и др., 1974).

В опытах с нерастущей культурой использовали отмытый дистиллированной водой, 0,3 М раствором кс1 и 1/15 М фосфатным буфером (рН 5,0 для пектингидролаз и рН 7,0 для пектинлиаз) до отсутствия в промывных растворах ферментативной активности 48-60-часовой мицелий грибов , в количестве 3-5 г / 100 мл реакционной среды. Модельные среды, приготовленные на 1/15 Ц фосфатном буфере, содержали (%): свекловичный или яблочный пектин, 0,2; глюкоза, 0,1, пектин, 0,1; глюкоза, 0,1, пектин, 0,1 и ингибиторы белкового синтеза; пектин, 0,1, глюкоза, 0,1 и ц-З'.б'-АМФ, ЗхЮ"4 Ы.

В качестве ингибиторов белкового синтеза применяли актиноми-цин Д (20 мкг/мл), 8-оксихинолин (150 мкг/мл) и циклогексимид (200 мхг/мл).

Активность ферментов в зависимости от целей эксперимента определяли в фильтратах культуральной жидкости, в оесклэгачных гомо-генатах, в ферментных препаратах и выражали в условных ед/мл фильтрата культуральной жидкости, ед/мг абсолютно сухой биомассы (продуцирующая способность мицэлия), ед/мл и ед/г препарата, ед/мг белка (удельная активность).

Общую пектолитическую (ПкА), пвктинэстеразную tíQ), эндо- и экэополигялактуроназную ондо- и экзоПГ) активности избрали согласно ГОСТу ¿0264.3-81.

Об активности экзопектинлиазы (экзоПЛ) судили по появлению характерных хромогенов, образуемых продуктами ферментативного расщепления 1Ж-ного раствора яблочного пектина, приготовленного на I/I5 М фосфатном буфере, с тиобарбитуровой кислотой и имеющих максимум поглощения при 647 HM (Naukom, 1960). За единицу активности принимали такое количество фермента, в результате, действия которого на субстрат в течение 2 ч при 37° плотность раствора увеличивалась на 0,1. Замер проводили"на спектрофотометре СФ-4С, используя кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя I см.

Активность эндопектинлиаз (эндоПЛ) определяли вискозиметриче-ски, принимая за единицу активности такое количество фермента, которое катализирует расщепление I г яблочного пектина со снижением вязкости раствора, регистрируемой с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда (а. = 0,82 мм), на 30% за I мин при 37°.

Активность протеиназ определяли методом Ансона в модификации Петровой и Винцюнайте (1966), а целлзолаз - модифицированным виско-зиметрическим методом (Niwa, Kawamura, 1965).

Об активности гемицеллюдаз (ксиланаз) и амилаз судйли по количеству редуцирующих Сахаров, образующихся в результате действия ферментов на субстрат за I мин при 40°.

Биомассу отделяли фильтрованием, промывали водой, высушивали при 105° до постоянного веса, взвешивали и выражали в мг/мл куль-туральной жидкости.

Волок определяли по метода CLowry «t ai., 1971), спектрофото-метрически" (Кочетов, 1980) ИЛИ согласно (Bradford, 1976).

Редуцирующие вещества определяли феррпцианидным методом (Kerr. »950) И С 3',5:-ДЩШТР0С2ЛИЦИЛ0В0Й КИСЛОТОЙ (Miller. 1959).

Для аналитического изоэлектрофокусирования фильтраты культу-ральной жидкости грибов концентрировали до I/IQ первоначального объема на ротационном вакуумном испарителе rvo-64 (Чехословакия),

центрифугировали и надосадки ооессоливали на колонке с Moiseieot о-25 (Reanai. Венгрия). Фракции, обладающие пектолитической активностью, объединяли и использовали для определения оелка и проведения изоэлектрофскусирования пектиндеполимераз.

Разделение полигалактурсназ (ЯГ) проводили в пластинках Ь%-ного ПААГ, включающего I0,2* глицерина, по 1,25% ам£олинов ькв 1818 (рн 3.0-5,0) и 1809 (рН 3,5-9,5) (Швеция), 0,2* тетраметил-этилендиамина и 0,08% персульфата аммония, размером 240x100x0,8 мм в течение 3-3,5 ч при 12 Вт, начальной силе тока 40 мА, напряжении 250 В. В качестве электродных буферов использовали 0,5 M н&он и 0,5 M сн3соон.

Разделение пектинлиаз (ПЛ) проводили в пластинках 5*-ного ПААГ размером 125x125 мм (Serva. Германия) в диапазоне рН 3,0-10,0 при 6° в течение 3 ч при 280 В на приборе Muitiphbr (ькв. Швеция).

После изоэлектрофокусирования гели отмывали дистиллированной водой, буфером и инкубировали, в соответствующей реакционной" смеси в течение 20-30 мин или 2 ч при 35-40°. В случае ПГ реакционная смесь содержала 1,2* свекловичного пектина и 0,02 M ацетатного буфера tpfî 5,0), а' ПЛ - I* яблочного пектина и I/I5 M фосфатного буфера (рН 7,0). Затем гели снова отмывали дистиллированной водой и проявляли в 1Ж-ном растворе цетавлона (цетилтриметиламмония бромистого)-или 0.05Ж-НОМ растворе рутениевого красного (Llsker, Retí«, 1974i Васильева и др., 1984).

Изоэлектрические точки ферментных белков определяли по замеру рН с помощью микроэлектродов непосредственно в геле.

При исследовании механизма действия ПГ, элюированных из ПААГ,, оценивали степень падения вязкости раствора пектина ' к нарастание количества редуцирующих веществ (с&и et ai., 1985).

Тонкослойную восходящую хроматографию продуктов ферментного гидролиза пектина проводили на пластинках siiufoi uv-254 (Чехословакия) размером 150x150 мм с использованием системы растворителей бутанол:муравьиная кислота:вода (2:3:1, v/v) tcoiier. Naukom. 1964) в течек.,: 1,5-2 ч при комнатной температуре. Затем пластинки высушивали, скрашивали раствором анилинфталата в этаноле (Нурадие-ва и др., i.991 ) и проявляли в течение 5 мин при 80°. Пробы наносили в количестве 1-20 мкл. стандарт - раствор a-D-галактуроновой

КИСЛОТЫ (Serva, ГершНИЯ).

Одномерный электрофорез белков в вертикальных пластинках ПААГ проводили согласно Остерман (Í977). Гистохимическое окрашивание

глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, НАД-зависимой малатде-гидрогеназы, глутаматдегидрогенаэы, неспецифической эстеразн осуществляли по общепринятым методикам (Корочкин и др., 1977).

Концентрацию эндогенного ц-3',5'~АМФ определяли изотопным методом (Sy. Riohter. 1972) со стандартным набором реактивов фирмы Àmersh.am (АНГЛИЯ).

Для проведения опытов по влиянию лимитации компонентов питательной среды на биосинтез ферменте«» жма "шчФузу.пяп'у?, каасулы" «pirn. i97ñ.'

Удельную скорость роста оз) и удельную скорость синтеза ферментов (О ВЫЧИСЛЯЛИ по формулам: и = dx.dt"1. х"1 И cŒ-dt"'. х-1 (Terul. 1973).

При получении мутантов Aspergillus вШ&овш ЕИМ-83 ВОДНУЮ суспензий спор гриба (Юб-Ю7 спор/мл > обрабатывали УФ излучением. к-метил-N-нитро-н-нитрозогуанкдином и н-нитрозометилмочевяной. Химические мутагены использовали в концентрации 500, 1000, 2000 и 4000 мг/мл при экспозиции 0,5, I, 1,5 и 2 ч. После обработки мутагенами споры промывали дистиллированной водой, ресуспендировали в прежнем объеме воды, и I мл суспензии переносили в 50 мл селективной среды. После 96 ч культивирования пеллеты высевали на агаризо-ванную среду Чапека со свекловугснш пектином. Мутанты отбирали по диаметру зон просветления пектина после проявления 13-ным раствором цетавлона.

При получении препаратов Пехтомацерин ГЗх и Пекталлиашш ГЗх фильтраты культуральшх жидкостей P.di^ltatua И A.alllaoeus KOH-цэнтрироваля в вакуум-выпарном аппарате объемного типа периодического действия при глубине вакуума 0,98 ати и температуре теплоносителя 45-50° до содержания сухих веществ (СВ) 6-7% и сушили на прямоточной распылатдльной сушилке Anhydro (Дания) в режиме I5C-160° на входе в сушилку и 60-80° - на выходе. Для получения препаратов в форме ПОх применяли 3,5-4 объема этилового спирта нз I объем концентрата культуральной жидкости с СВ 6-7% и рН 5,5-6,0 при экспозиции 10-30 мин. Образовавшиеся осадки отделяли центрифугированием и сушили в вакуумном шкафу при 30°.

При исследовании свойств ферментных препаратоз проверяли: влияние кислотности в диапазоне рН 2-12 и температуры реакционной смеси' в интервале 10-60° на активность эндо- .и экзоПГ и ПЛ, термостабильность - по остаточной активности ферментных растворов после 10- и 60-минутного прогревания при 30, 40, 50 и 60°. Для изучения

рН стабильности растворы пропаратов выдерживали в течение 24 ч при 20° в диапазоне рН 2-12, затем доводили до оптимального для действия соответствующих ферментов значения рН и счгроделяли ферментативную активность. В работе использовали универсальную буферную смесь (Лурье, 1967).

Для изучения субстратной специфичности использоезли свекловичный, лимонный, яблочный, сливовый пектины и пектовую киблоту.

Мацерируидую способность препаратов исследовала на дисках тканей овощей и фруктоз размером 1,8-2,0x0,20-0,25 мм в течение 4 ч при 24-25° и выражали в процентах потери веса.

Для выделения клеток и протопластов использовали клубни и листья пробирочных растений картофеля," полученные по описанным методам (Бутенко и др., 1984; Хромова и др., 1984). Растительные диски толщиной 0,5-1,0 см или узкие полоски помещали в растворы, содержащие ферментные препараты в концентрации 0,1-3,0%, 0,005 К сахарозы (рН 5,6-5,7), После 18 ч инкубации, отделения от остатков ткани, центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин и промывания средой и-5 (СидороЕ и др., 1985) проводили учет клеток и протопластов с помощью микроскопа 1К-35 ор*оп. Степень мацерации оценивали по 5-балльной шкале.

Устойчивость клубней картофеля к внутренним механическим повреждениям определяли по ОСТу 10.8.5-87 и методике Филина (1976).

Растительные экстракты получали обработкой сырья препаратами (1,5* к массе) при 37° в течение 4 ч. Экстракты отделяли фильтрованием, характеризовали'согласно Бейли (1965) и Петерину (1968).

Для получения льноволокна использовали льносолому N 1,23 сорта К-6, ы 1,25 сорта 0рйансхий-2. Технологические показатели льноволокна и его химический состав определяли по известным методикам (Барухсон и др., 1971; Метода биохимического исследования растений, 1972; Никитин И др., 1978).

Качество пектина определяли согласно- ГОСТу 29186-91.

При статистической обработке результатов экспериментов проводили определение средних арифметических и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95? (Рокицкий, 1972).

В главе 3 проанализирована способность 300 культур мицелиаль-ных грибов различных родов продуцировать пектолитические, целлюло-литические и ксилашлитические ферменты при выращивании на средах с субстратссдержащими веществами или глюкозой.

Полученные результаты свидетельствуют о широкой распростра-

ненности у мицелиальных грибов способности синтезировать внеклеточные деполимеразы, катализирующие расщепление растительных полисахаридов и особенно пектиновых веществ. Так, для 77% грибоЕ характерен синтез пектиндеполимераз, 32% - целлюлаз и 30% - гемицел-люлаз. По уровню накопления пектиндеполимераз исслодуемне гр:?и распределились следующим образом: 36% культур характеризуется незначительной активностью ферментов, у 41* активность варьирует от О,ОТ пп/мл по гтячвнийт сравнимых с активностью промышленных продуцентов .

Показано, что состав продуцируемых ферментных комплексов и активность компонентов специфична для видов и итаммов грибов и в значительной степени определяется условиями их культивирования. Использование в питательных средах источников азота, обеспечивающих различный характер изменения активной кислотности в процессе выращивания грибов, позволило на оольшом количестве объектов доказать зависимость образования ферментов пектиндеполимеразных комплексов от рН: для продукции ПГ необходим рН 3,0-4,0, а ПЛ - 6,08,0.

Особый интерес представляет изучение конститутивного образования ферментов грибами. Согласно условиям эксперимента, в работе была возможность выявления только конститутивного синтеза формантов, не' подверженного или частично подверженного катаболитной репрессии. Установлено, что такой синтез ПГ характерен для II, ПЛ -для 18, ксиланаз - для 19 и целлюлаз - для 3 штаммов грибов.

В процессе скрининга установлено, что образование ПЛ наиболее присуще грибам рода Репшшш, Из 88 пенициллов, выращиваемых на среде с яблочным пектином, 22 продуцируют значительные количества фермента. Необходимо отметить, что практически все исшташте грибы синтезируют экзо- и эндоПЛ, деполймеризующие пектиновые вещества в щелочных условиях.

Выявлено, ЧТО все исследованные штаммы ДарегвШиз аШосеш продуцируют пекпшдеполимеразы. В условиях, оптимальных для синтеза ПГ, общая пэктолитическая активность грибов находится в пределах 0,57-2,62 ед/мл. Оптимальные условия обеспечивают накопление грибами от 6,0 до 40,0 ед/мл ПЛ. Такой уровень активности характерен для продуцентов указанных ферментов. Установленная отличитель ная особенность штаммов А.аШасеиз может быть использована в качестве дополнительного таксономического признака вида.

В результате проведенных исследований отобраш высокоактив-

ныв, перспективные в промышленном отношении продуценты пектолити-ческих и ксиланолитических ферментов. Согласно приведенной в работе схеме отселвктированы АврегвШиз аШаовиа БИМ-вЗ, Реп1о1Шит айатагаи БИМ-90, Р.о1Лг1пит БИМ-91, Р.зоИЛил» ЛБФ-15, РЛапозит ЛБФ-3, р. janthi.nei.ium БИМ-303, превышающие по активности пектиназ исходные штаммы в 1,5-2 раза. Изучены морфолого-биохимимические ОСОббННОСТИ ОТСбЛеКТИрОВаННЫХ ШТаММОВ И РвпЮ1Шш <118Па1;ит. Штаммы-продуценты защищены авторскими свидетельствами СССР. Вышеуказанные грибы, отличающиеся от используемых в промышленности продуцентов пектиндеполимераз составом ферментных комплексов, активностью компонентов, могут Сыть рекомендованы для применения в производстве и отобраны для изучения закономерностей образования пектолитических ферментов и регуляторных механизмов процесса.

В главе 4 представлены материалы исследований образования ПГ грибами в зависимости от основных источников питания, температуры, рН, способа культивирования. Показано, что АзрегвШш &ш-.аоеиа и Реп1оШ1ит сИв1Лагит отличаются по температурным параметрам, оптимальным для их роста и синтеза ПГ. Определены источники азота, обеспечивающие максимальное накопление ферментов. Установлено, что способ культивирования не влияет на состав синтезируемых грибами пектиндеполимеразных комплексов.

Обстоятельное изучение продуцирования' ПГ грибами в зависимости от источника углерода позволило установить наличие у исследуемых культур различных механизмов контроля синтеза ферментов. В отличие ОТ конститутивного синтеза ПГ у Реп1с1111ит <11в1Ла1;ит заВИСИМЫЙ ОТ пектиновых веществ синтез ферментов АзрегеШиз аШа-оеиэ репрессируется глюкозой. Эффект репрессии определяется концентрацией и временем внесения глюкозы в питательную среду. Так, добавление 1,5% глюкозы в момент посева гриба снижает содержание ПГ в культуральной жидкости на 90%, уменьшая продуцирующую способность мицелия на 95%. Аналогичные результаты получены при внесении 0,5% глюкозы в питательную среду на 48-ом ч культивирования А.а1-наоеиз. В.растущей культуре и в опытах с отмытым мицелием показано, что репрессия вызывается различными соединениями - сахарами, сахароспиртами, спиртами, органическими кислотами (табл. I).

Сравнительный анализ действия ингибиторов белкового синтеза (актиномицина в, 8-оксихинолина, циклогексишда) и глюкозы на образование ПГ А.аШасвия свидетельствует о том, что катаболитная репрессия происходит на уровне транскрипции.

Таблица I

Репрессия синтеза пектингидролаз при культивировании л.аШасвия на среде с пектином

Длительность культивирования

72 ч 96 ч

Репрессор, 0,5» * ПкА, ед/мг Степень репрессии синтеза ПкА. % К КОН-ТрОЯ»! ПкА, ¡Степень репрес-ел/мг)л»!» ст'мтог?" ГЬсА, ¡"'к концхзди

Сахароза 0,05 87,2 0,05 92,4

Глюкоза 0,08 79,5 0,06 91,0

Сорбит 0,10 74,4 0,06 91,0

Этанол 0,12 69,2 0,09 86,4

Глицерин 0,13 66,7 0,08 88,0

Галактоза 0,09 77,0 0,10 85,0

Рамноза 0,16 59,0 0,14 78,8

Лактоза 0,16 59,0 0,21 68,2

Лимонная кислота 0,14 64,1 0,17 74,2

Янтарная кислота 0,17 56,4 0,25 62,1

Щавелевая кислота 0,18 54,0 0,21 68,8

Фумаровая кислота 0,18 54,0 0,14 78,8

Яблочная кислота 0,21 46,2 0,16 75,8

* Вещества вноск.-я в питательную среду на 48-ом ч культивирования гриба

Изучение влияния экзогенного ц-3',5'-АМФ на продуцирование ферментов а.аШасеця (рис. I) и- определение его эндогенной концентрации (табл. 2) доказывают участие специализированного регулятора в механизме катаболитной репрессии синтеза ПГ.

Важное значение лля определения закономерностей образования пектиндеполимераз шлеет исследование процесса в динамике роста грибов и его кинетический анализ. При использовании источников углерода, обеспечивающих различную интенсивность синтеза фэрмэнтов, установлено, что на среде с тактиком максимальная скорость роста = 0,12 ч~1) достигается к 30 ч культивирова-

ния. ЭкзоПГ выявляется с 24 ч, а зндоПГ - с 42 ч выращивания гриба. Активный синтез ферментов происходит в постэкспонешдаальной фазе развития культуры, максимальные скорости синтеза эндоПГ =

ПГ, ед/мл

о 1 2 а 4 V

Рис. I. Дерепрессия синтеза ПГ Д..а111ао«иа ЭКЗОГеННЫМ

1 - Оуфер, г - оуфер + пектин + глюкоза, э -Оуфер + пектин + глюкоза + ц-З'.б'-АМФ, * -буфер + пектин

Таблица 2

Влияние глхкозы на концентрацию ц-3-,5*-АМФ В мицелии Х.а111»овия

Концентрация ц-3',5*-АМФ в мицелии, пм/г

Источник углерода Возраст мицелия

52 ч 54 ч 57 ч

I* пектина 21,5 20,0 16,8

IX пектина +

0,6* глюкозы* 21,5 3,5 3,1

*Глюкоза добавлена в среду на 52 ч культивирования, гриба после определения содержания ц-3•.5•-А1Ю в мицелии

20 ед-мг-1. ч-') и экзоПГ («2= 2,4 ед.мг"1. ч"1) наблюдаются у 60 ч культуры (рис. 2,1). При выращивании на среде со свекловичным пектином И ГЛЮКОЗОЙ ОТМвЧаюТСЯ ДВа ПИКа СКОРОСТИ рОСТа А.в111аовиэ: в 20 ч (я, = 0,16 ч~1) и в 40 ч культивирования (иг = 0,10 ч"1). Максимальные скорости синтеза эндоПГ = 11,5 вд-мг~1-ч~1) и эк-зоПГ = 0,20 ед-мг-'. ч-1) в 1,7-2 и 10-12 раз ниже, чем на среде с пектином, что подтверждает участие катаболитной репрессии в

Р Ь ' 1г

I

0.15 А 20 3.2

0.10 А №

0 о:з / V рн !0 ! в

* II

0 . 1 0 0

О 24 48 72 Ч

Рис. 2. Кинетика роста А.аШаииа И СИНТ93Э ЭНДО-. И ОКЗОПГ на средах с пектином (I), пектином и глюкозой (ик и - удельные скорости синтеза соответственно эндо- и экзоПГ, ед.мг_,-ч'"1; » - удельная скорость роста, ч~1

регуляции синтеза ПГ А.»Шао«ш. Эффект репрессии находит отражение и ь смешении на 9-Ю ч времени достижения максимальных значений и

При использовании грибом глюкозы отмечено снижение удельно;: скорости синтеза ферментов в 30-42 раза по сравнению с синтезом ка среде с пектином и значительное разобщение фаз роста и синтеза.

Сопоставление' основных характеристик роста Рма-лш» си«1-ъа-ьит и образования ПГ показывает независимость кинетических пэра метров от источника углерода и подтверждает неподверженность синтеза ферментов катаболитной репрессии.

Полученные результате свидетельствуют о том, что как конститутивный, так и индуцированный синтез ПГ грибами характеризуется общими закономерностями, присущими процессу образования вторичных, метаболитов. При участии в регуляции образования ферментов двойного контроля происходит более значительное разобщение фаз роста грибов и продукции ферментов, снижение скорости синтеза по сравнению с процессами, регулируемыми одним контрольным механизмом.-

Наличие различных контрольных механизмов образования ПГ грибами дает основание предполагать различив в спектре продуцируемых

Рис. 3. Зимограмма ПГ, синтезируемых А..а111асеиз на средах с пектином (1), пектином и глюкозой

(2), ГЛЮКОЗОЙ (3)

комплексов. При изоэлектрофокусировании в ПААГ (градиент рН 3,59,5) установлена гетерогенность ПГ Рап1с1И"ит «ив^аиго и Аэрвг-вИ1иэ ыиасвиа, показано различие множественных молекулярных форм ферментов у грибов по числу и величине р1. Все формы ПГ Реп1-опииа появляются одновременно на ранней стадии культи-

вирования гриба, независимо от используемого источника углерода. Удлинение сроков культивирования приводит к увеличению концентрации ферментов и незначительному изменению в соотношении форм.

АэрегвШиэ аШаовш ца среде с пектином продуцирует комплекс ПГ, состоящий не менее чем из 24 форм (рис. 3,1). Только 3 формы выявляются на среде с глюкозой (рис. 3,з) и на среде • с пектином и глюкозой (рис. 3,г). Продукция этих форм в отсутствие пектиновых веществ, а также в условиях репрессии указывает на конститутивный синтез,' нэ репрессируемый глюкозой. Образование ПГ А.аШаоеиз контролируется такими механизмами как конститутив-ность, индукция, катаболитная репрессия. Изучение конститутивных, не репрессируемых глюкозой молекулярных форм ПГ А.аШасеиз показывает, что два фермента гидролизуют субстрат по экзо- и один - по эндотипу. ЭкзоПГ, (р1 5,7), экзоПГ2 (р1 6,3) и эндоПГ (р! 5,9) имеют близкую молекулярную массу, отличаются по субстратной специфичности, оптимальным условиям действия, термо- и рН-стабиль-но>'ти и мацерациошюй способности. Наличие этих молекулярных форм ПГ позволяет грибу использовать широкий спектр пектинорых

веаеств, гидролизуя их в диапазоне рН 3,8-3,0, при температуре 30-50°. Установленные различия обеспечивают различную функциональную значимость молекулярных форм фермента.

Таким оОразом, установлено, что механизмы регуляции синтеза ПГ определяют спектр множественных молекулярных форм ферментов.

При промышленном производстве ремонтных препаратов вглным показателем является активность продуцентов. Применение различных физических и химических мутагенов ляа^ ь ыт<>-

коактавнне втагалц-лродуценты 4«рмннтов. к розультахо отунпьча-юй селекции Aapergillus alliaoous БШ-83 С использованием УФ ОбЛучения и ы-нитрозометилмочевшш получены 9 мутантных штаммов, харак-теризухшхея повышенным в 1,6-3,0 раза уровнем синтеза ПГ. Мутант-ные штаммы морфологически и биосинтетически стабильны, продуцируемые ими ферментные комплексы отличаются по соотношению ферментов экзо- и эндодействия, что дает основание рекомендовать их для промышленного использования с целью получения Ферментных комплексов различного состава.

Материалы исследований, изложенные в главе 5, представляют основные закономерности образования грибами пектиндеполимераз тронездимин^тивного способа действия и особенности регуляции их образования.

Установлено, что используете в работе продуценты ГЛ являются мезофильными грибами с оптимальной температурой роста 20-25и. При анализе динамики роста культур и синтеза ферментов выявлены различия мевду грибами по скорости роста, последовательности и скорости образования лиаз эндо- и экзоспособа действия.

Кинетические параметры свидетельствуют о двухфазности процессов роста грибов и продукции лиаз. Синтез ПЛ аналогично синтезу ПГ происходит в -постэкспоненциальной фазе развития культур. Незначительная лаг-фаза, высокие скорости роста (м = 0,22 ч~1 ) и синтеза экзоПЛ и эндоПЛ (-с = 0,44 и 3,36 ед-мг~1- ч-1, соответственно) при использовании Pénicillium adametzii ЯбЛОЧНОГО ПеКТИНЭ - BHCOXOMO-лекулярного источника углерода - выделяют данную культуру из исследованных .

Отмечена зависимость образования ПЛ p.aigitatum от источника углерода и его концентрации. Снижение скорости синтеза ПЛ при увеличении концентрации глюкозы дает основание предполагать участие репрессии в контроле конститутивного образования лиаз грибом. Лимитация потребления глюкозы при использовании метода "диффузионных

го

капсул", а также применение непрерывного культивирования гриба при скорости разбавления среды d = 0,01 ч~1 приводит к частичной де-репрессии сштеза IUI у p.digitatum.

Анализ образования Ш1 у P.adamatzii. P.dieitatum, P.eolitum. P.oitrlnum, P.lanosum. P.expansum, P.Janthinallum ПОКЭЗЫВаеТ, ЧТО у всех грибов в регуляции синтеза ферментов участвуют различные механизмы. Только p.ianosum характеризуется независимым от источника углерода, катаболитустойчивым синтезом ферментов. У всех остальных продуцентов образование лиаз "подвержено катаболитной репрессии. Показана неспецифичность репрессии, зависимость эффекта от концентрации и времени действия репрессора, установлено участив ц-З'.б'-АМФ в механизме катаболитной репрессии. Следует отметить, что степень репрессии синтеза ПЛ и дерепрессирующее действие циклического НуКЛвОТИДа У раЗЛИЧНЫХ ГрИбОВ раЗЛИЧНЫ. У P.dlgitatu/n специализированный регулятор практически полностью снимает репрессию образования ферментов, р.janthineiium - на 85%, p.oitrinum и p.&dam^tsü - на 76 и 57%, соответственно..Установленные отличия в действии репрессора и дерепрессора предполагают наличие у грибов сложной системы регуляции, ьключающей различные контрольные механизмы синтеза компонентов.

Результаты изоэлектрофокусирования ферментных белков, секре-тируемых грибами в различных условиях культивирования, свидетельствуют о полиморфизме Ш1 комплексов (рис. 4). Спектры множественных молекулярных форм ферментов у грибов различны; они определяются контрольными механизмами биосинтеза. Конститутивный, устойчивый к репрессии катаболитом,синтез ПЛ у p.ianosum обеспечивает образование комплекса, состоящего из 7 молекулярных форм, независимо от источников углерода. У остальных грибов спектры ферментных белков, синтезируемых в условиях индукции, индукции и катаболитной репрессии, конститутивности и катаболитной репрессии, различны. Максимальное количество молекулярных форм ПЛ выявлено у всех продуцентов в условиях индукции.

Заслуживает внимания установленный факт наличия у всех без исключения грибов конститутивного, устойчивого к репрессии катаболитом, синтеза ферментов. Вклад этого механизма в регуляторные системы грибов- различен: это и контроль образования всех молекулярных форм ПЛ у P.ianosum И регуЛЯЦИЯ ОТДЭЛЬНЫХ форм у Р.adametzli, P.digitatum, P.citrinum, Р. Janthinellum. Pari ЛИЧНЫЕ) КОНТрОЛЬНЫв

механизмы образования ферментов обеспечивают необходимый продуцен-

г г з

• Рис. 4. Зимограммы ШГ, продуцируемых P.adametcli (I). P.oltrinum (II), P.jan-

thlrvällum (III), P.lano-sum (IV) JI P.digltatum

(V) на средах с пектином (1 >, пектином и глюкозой ' (г), глюкозой (з)

1 2 3

ту в данных условиях ферментный комплекс посредством дифференциального синтеза компонентов.

В главе 6 представлены результаты исследований по получению пектиндеполимеразных ферментных препаратов, изучению их свойств и разработке способов применения.

Проведенные исследования показали, что используемые в работе продуценты синтезируют полиформентные комплексы, отличающиеся по составу и механизмам регуляции образования компонентов. Эти данные явились основой разработки способов получения ферментных препаратов различного состава, необходимых для технологических процессов переработки гетерогенного растительного сырья.

Оптимизированы питательные среда и условия культивирования грибов-продуцентов деполимераз. Отработаны параметры получения ферментных препаратов Пектомацерин К и Пекталлиацин различной степени очистки (Г2х, ГЗх, ИОх) с использованием в качестве продуцентов Penioillium dieitatum И Aspergillus alllaoeua, 8 Также П6К-тинлиазных препаратов ИОх (продуценты - p.adametzii, p.oitrinum, P. Janthinellum). ОтСвЛвКТИрОВан ШТЭММ Jk.alliacfeus БИМ-87, ПрОДУЦИ-

рунций протеазу и пектингидролазы, получен комплексный препарат-Протопекталлиацин.

Разработан лабораторный регламент и временная технологическая инструкция на производство препарата Пектомацерин К. Технология получения препарата апробирована на Московском и Вильнюсском ОПЗ ферментных препаратов, Ладыжинском заводе ферментных препаратов. Приволжском и ¿'нгенском биохимзаводах. В условиях Приволжского биохимзавода оптимизированы режимы получения и наработана опытная партия препарата Пектомацерин К Г20х. На промышленной среде р.diel ta tum синтезирует комплексный препарат, содержащий ПГ, ПЯ, цел-люлэзу, протеазу, гемицеллюлазу. Культивирование гриба на среде Чапека с сахарами обеспечивает получение пектиндеполимеразных препаратов, состав которых регулируется кислотностью среды: Пектомацерин I (экзо- и эндоПГ), Пектомацерин II (экзо- и эндоПГ, экзо- и эндоПЛ), Пектомацерин III (экзо- и эндоПЛ).

Ферментные препараты, представленные в табл. 3, различаются по составу, соотношению и активности компонентов. От известных коммерческих препаратов они отличаются отсутствием ПЭ, что позволяет их широко использовать в пищевой промышленности.

Эффективность применения препаратов зависит от физико-химических СЕОЙСТВ ВХОДЯЩИХ В ИХ состав ферментов. ПГ Aspergillus allia-

Таблица

Характеристика ферментных препаратов мацерирушего действия

Препарат Ферментативная активность, ед/г препарата

ПКА эндоПГ 1 экзоПГ|экзоПЛ эндоПЛ|про- целл»~ ¡тёаза|лазэ

Пекталлиацин 600 3800 3700 0 0 л л

■

пекталлиацин 2ЬО 2180 2050 100 0 6200 0

Пектомацерин К 500 3500 4000 6500 600 220 200

Пектомацерин I 1500 13100 11800 0 0 0 0

Пектомацерин II 1000 9000 8750 1500 200 0 0

Пектомацерин III 0 0 0 4500 350 0 0

Пектинлиаза

Р-аДагеаггИ 0 0 • 0 2600 18800 0 0

Пектинлиаза

Р ,о1Ьг1пип 0 0 0 2800 Г^ЗООО 0 0

Пектинлиаза

Р. ¿апИъШвПит 0 0 0 2300 8650 0 0

овив предпочтительнее гидролизуют тактовую кислоту, проявляя мак симум активности в зоне рН 4,0-5,0.и в диапазоне температуры 4560°. ПГ релюпиш а.1«1Лаиип интенсивнее всего гидролизуют свекловичный пектин в той же зоне рН при 45-55°.

Грибные пектиилиазные препараты отличаются по опта/ ьчьним для действия значениям рН и температуры, по рН- и термостаонльно-сти. Ферменты Рмюнц« алагаегги наиболее активны при рН 8,и 8,5, Р.сЧвИаиип - рН 7,0-9,0, Р. ^аг^ЫпаНит И Г.о1Лг1пит - рН 7,0 и 6,5. ГШ р.оилплит наиболее эффективно расщепляют яблочный пектин при 45°, Р.ЗагПЫпеИит,- 35-40°, ? .ас1атеЪг11 - 60-65°, Р.д1«:^а1;ип1 - 30-40°.

Все полученные препараты мацерируют растительную ткань. Паи большей мацерирующей способностью характеризуется Пектомаперин К. Пектомацерин К и Пекталлиацин разрешены к применению в типевой промышленности.

Экспериментальные данные свидетельствуют с перспективности использования указанных препаратов. С их помощью достигается увеличение выхода овощных и фруктовых мэцератов на 12-18%. Пэктомацэ-

рин рекомендован для применения в технологии получения овощных соков и напитков, мандариновой основы, томатной пасты. Он обеспечивает осветление сока и увеличение его выхода Из различного сырья на 6,7-25$. Эффективность применения новых препаратов подтверждена полупроизводстве-ншш и производственными испытаниями.

На основе высокой мацерационной способности препаратов разработан способ получения экстрактов из пряно-ароматических трав Беларуси, значительно сокращающий длительность процесса, увеличивающий выход эскстрактивных веществ на 7-3155, улучшающий их качество.

Ферментативный способ комплексной переработки пряно-ароматических трав позволяет получать экстрактивные вещества и эфирные масла, обеспечивая более полное и экономичное использование сырья.

Перспективны ферментные способы получения тресты из льносоло-мы, а также пектина из отходов переработки цитрусовых.

Показана возможность использования Пектомацерина для получения жизнеспособных растительных клеток. Совместная обработка растительной ткани препаратами Пектомоцерин и Пекталлиацин обеспечивает получение перфорированных клеток, необходимых в фитоиммуноло-гии для исследования механизмов взаимодействия клеток с фитопато-генами и их метаболитами. В сочетании с целлюлазами препараты можно применять для выделения растительных протопластов, заменяя им-' портные ферменты-ро активы.

Установленная корреляция между мацерационной способностью препарата Пекталлиацин и степенью устойчивостью клубней картофеля к внутренним, механическим повреждениям стала основой метода ускоренного определения этого свойства растений. Экспресс-метод может использоваться на ранних этапах селекции для оценки устойчивости исходного материала, .гибридов и сомаклонов картофеля.

Разработанные ферментные препараты различаются по- составу, субстратной специфичности, оптимальным условиям действия, мацери-рунцей способности. Препараты могут использоваться в качестве био-химреактивов, в традиционных и перспективных технологиях переработки растительного сырья.

В заключительной части работы дан анализ и обобщены результа- . та выполненных исследований.

ВИВОДЫ

I. В результате сравнительного анализа полисахаридазкой активности 300 культур мицелиальных грибов различных родов установ-

лею, что 77% из них продуцируют пектиндеполимеразы, 32% - целлю-лазн, 30% - гемицеллюлазн. Для большинства грибов характерен индуцированный синтез пектингидролаз и целлюлаз, а также индуцированный и конститутивный, частично репрессируемый глюкозой синтез пек-тинлиаз и ксиланаз. Впервые выявленная способность штаммов Аэраг-tiniu aiiiaceua, выделенных из различных природных источников, продуцировать пектиндеполимеразы предложена для использования в ¿шЧеСтай ¿¿оиоллит&лыил'У ькть%

Отобранныо, отсолектирсватше и охарактеризованные п;<одуцентн пектиндеполимераз Aspereillus alllaoeua БИМ-83, БИМ-87. Pénicillium dlgltatum 324, P.adametsll БИМ-90. P.solltum ЛЕФ-15, P.lanoaum ЛБФ-3, V.Janthlnellum БИМ-303. P.oitrlnum ЕИМ-91 ОТЛИЧЗЮТСЯ ОТ применяемых в промышленности грибов составом синтезируемых ферментных комплексов-, активностью компонентов и могут быть рекомендованы для производственного использования.

2. Кинетические параметры индуцированного и конститутивного образования пектиндеполимераз грибов с различной чувствительностью к катаболитной репрессии показывают, что, независимо от механизма регуляции, синтез ферментов характеризуется общими закономерностями, присупагли процессу образования вторичных метаболитов. При участии в регуляции образования деполимераз двойного контроля - индукции и катаболитной репрессии, конститутивности и катаболитной репрессии - происходит значительное разобщение фаз роста грибов и продукции ферментов, снижение скорости синтеза, удлинение времени достижения ее максимального значения по сравнению с процессами, регулируемыми одним контрольным механизмом.

3. Детальное исследование катаболитной репрессии конститутивного и индуцированного образования пектиндеполимераз грдсами свидетельствует о ее неспецифичности, зависимости от времени действия и концентрации репрессора, опосредованности ц-3- ,5'-АМФ. Реализация катаболитной репрессии синтеза некктнгидролаз осуществляется на уровне транскрипции. Впервые обнаруженное участие в регулятор-ных системах всех гриоов конститутивного, устойчивого к репрессии катаболитом контроля, вероятно, показывает его значимость как базового механизма регуляции наиболее функционально важных ферментов пектиндеполимеразных комплексов.

4. Выязленные множественные молекулярные формы пектиндеполимераз отличаются как по способу действия, субстратной специфичности, оптимальным условиям деградации субстратов, так и по механиз-

мам регуляции их синтеза.

5. Можно полагать, что молекулярно-функциональная гетерогенность пектиндеполимераз гриоов представляет собой эволюшаонно закрепленную экологическую вариабельность ферментного аппарата, возникну» в условиях использования гетерогенных природных полимеров. Биологическая целесообразность различных механизмов контроля образования пектиндеполимераз заключается в формировании комплекса определенного состава посредством дифференциального синтеза ферментов. Различные контрольные механизмы образования пектиндеполимераз могут рассматриваться как элемент сложной системы адаптации, высокой конкурентоспособности и экологической пластичности грибов.

6. Полученные 9 мутантных штаммов АарвгвШиз аШаовиз характеризуются повышенным В 1,5-3 раза по сравнению С А.аШаоеив ЕШ-83 уровнем синтеза пектингидролаз и отличаются по соотношению ферментов эндо- и экзоспособа действия, что может быть использовано,., при получении препаратов различного состава.

7. На основании оптимизированных питательных сред, условий культивирования продуцентов пектиндеполимераз, отработанных параметров выделения ферментов получены препараты различной степени очистки, изучены их физико-химические свойства и мацерируицая способность.

Разработан лабораторный регламент и временная технологическая инструкция на производство ферментного препарата Пектомаце-рин. Технология получения препарата апробирована на Московском и Вильнюсском 0113 ферментных препаратов, Ладыжинском заводе ферментных препаратов. Приволжском и Унгенском биохимзаводах. •

8. разработанные на основе препаратов Пектомацерин и Пектал-лизцин ферментные способы, получения экстрактов трав для безалкогольных напитков, комплексной переработки пряно-ароматического сырья, приготовления льняной тресты, получения пищевого цитрусового пектина, определения устойчивости клубней картофеля к внутренним механическим повреждениям заношены авторскими свидетельствами на изобретения и могут служить основой для создания новых промышленных технологий. .'••'.

Препараты эффективны в процессах осветления соков, получения фруктово-ягодных и овощных шоре, соков с мякотью. Возможно применение препаратов как оиохймреактивов для получения жизнеспособных изолированных клеток и протопластов.

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЭАЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Гемицеллюлози и их ферментативное расщеплеш'.е // СО. Биологически активные вещества микроорганизмов.- Минск, 1975.- С. 3-17.

2. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Рогацевич Л.И. Конститутивный синтез эндополигалактуроназы микроскопическим грибом Рег.юи-llura sp. 24П // БИОЛ. науки.- 1976.- H 6.- С. II2-II5.

3. Лобянок А.Р., Михайлова Р.В,, Гогацошп Л. И. Консхихутиышй синтез пектолитических ферментов Penioilllum dleltutum 24П // Биол. науки.- 1977.- N 2.-- С. 99-103.

4. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. Кинетика конститутивного СИНТеЗа ПОЛИМеТИЛГалаКТУрОНаЗ Penloilllum dlgltatum в зависимости от источника углерода и pH // Микробиология.-1977,- Т. 46, N 5.- С. 920-925.

5. A.c. 591498 СССР, МКИ2 о 12 в з/оо. с 12 d 13/ю. Питательная среда ДЛЯ выращивания Penloilllum dlgltatum 24П - продуцента мацерирупцих ферментов / Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Стахеев И.В., Латышева С.1'. (СССР).- n 2400761/28-13; Заявлено 23.08.76; Опубл. 05.02.78; Бюл. N 5.- 2 с.

6. Действие культуральннх жидкостей некоторых грибов на мезофиль-ную ткань листьев картофеля / А.С.Вечер, Т.М.Фоменко, Г.М.Дзл-бик, Михайлова F.B., Реиетников В.Н., 'Лобанок А.Г. // Доклады АН БССР.- 1978.- Т. 22, н II,- С. 1033-1035.

7. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В. Некоторые вопросы физиологической регуляции синтеза экзсферментов у микроорганизмов // Матер. II Есос. Ссвещ. по форментам микроорганизмов.- М., 1979.- Ч.Г.-С. 23-39.

8. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова л.и. Влияние компонентов питательной среда на конститутивный синтез пектолитических ферментов Penicllllum dlgltatum 24П // МИКОЛ. И фИТОПЗТОЛ.-1979.- Т. 13, N 3.- С. 213-216.

9. A.C. 722946 СССР, МКИ2 С 12 К 1/00. Штамм Aspergillus alllaoe-us БИМ-83 - продуцент полиметилгалактуроназ / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, А.А.Опарина (СССР).- н 2595345/28-13; Заявлено 24.03.78; Опубл. 25.03.80; Бил. Ii II.- 3 с.

10. A.c. 834271 СССР, МКИ3 d oi с 1/04. Способ получения льнотресты / Е.А.Никулина, Е.В.Калугина, Л.А.Зарецкая, В.Т.Татаренксв, А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, А.А.Опарина, И.В.Стахеев, С.Г.Латышева (СССР).- N 2854076/28-05; Заявлено 01.10.70; Опубл.

30.05.81, Бш. N 20.- 5 С.

11. Лабанок А.Г., М1хайлава Р.У., Сапунова Л.1. Уплыу пасяунога матэрыялу на б1ЯС1.нтэз пекталпичных ферментау penioinium di^itatum 24Г1 // Вест АН БССР. Сер. б1ял. навук.- 1981.- и А.- С. 53-61.

12. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. Влияние температуры на рост Fenlollllum digltatum 24П и синтвз пвктолитичвских ферментов // Школ, и фятопатол.- 1981.- Т. 15, и 6.- С. 491496.

13. Мацерирущая способность отдельных ферментов пектолитического комплекса микроскопических грибов / Е.А.Никулина, Е.В.Калугина, Л.А.Зарецкая, Р.В.Михайлова, С.Г.Латышева, Т.В.Романовская // Сб. Совершенствование техники и технологии промышленности первичной обработки лубяных волокон.- ШШИТЭИлегпром, 1981.' С. 25-31.

14. Стахеев И.В., Здор H.A., Михайлова Р.В. Влияние условий культивирования на синтез пектолитических ферментов Penioinium digltatum 24П // МИКрОбИОЛ. ПрОМЫШЛвННОСТЬ.- 1981,- N 4.-С. 17-19.

15. Образование внеклеточных экзодеполимераз возбудителями фузари-озных гнилей картофеля / Н.А.Дорожкин, Р.В.Михайлова, А.Г.Лобанок , Л.И.Новикова // Микол. и фитопатол.- 1982.- Т. 16, N 2.- С. 143-148.

16. Атрыманне розных па саставу пектал1тычных ферментных прэпара-тау Peiiioiiiium digitatuir. 24П / Р.У.МгхаЙлава, А.Г.Лабанок, ЛЛ.Сапунова, А.А.Апарына // Вест АН БССР. Сер. б1ял. навук.-1982.- н I.- С. 57-61.

17. Свойства пекттшдеполимераз penioiiiium dieitatua и использование препаратов различного состава для мацерации тканей картофеля / Р.В.Михайлова, А.Г.Лобанок, Т.И.Фоменко, А.С.Вечер, Л.И.Сапунова, А.А.Опарина // Прикл. биохим. . и микробиол.-1982.- Т. 18, Я 3.- С. 367-375. • '

18. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В. Физиологическая регуляция биосинтеза катаболических ферментов у микроорганизмов // Теоретиче-

' ские и прикладные аспекты синтеза ферментов микроорганизмами (Под ред. М.В.Зрашко). Минск: Наука и техника, 1982.- Гл. 3.. С. 77-106.

19. Способы сокращения длительности процесса ферментативной обработки льносоломы / Е.А.Никулина, Л.Г.Воскресенскря, Л.А.Зарец-

кая, Р.В.Михайлова, С.Г.Латшева, Н.Ю.Селиванова // СО. Исследования в области промышленного приготовления и обработки лубяного сырья.- М.:ЩШТЭИлегпром, 1382.- С. 19-22.

20. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Катаболитная репрессия конститутивного синтеза пектинтрансэлиминази у Penioii-lium digitatum И МШфОбИОЛОГИЯ.- 1983,- Т. 52, N 2.- С. Х97-201.

ОТ •.•.««т.ЛПШпмП.Ч ______Л "I "» .. „ . 1 1 J " -_____ О ОС.1П1Р1,—

Ul . Lii'J t, t. . —: * - --... _ --------

мости от состояния и количества ясэтпного MSTериял? / л.!'.Лобанок, Л.И.Сапунова, А.А.Опарина, Р.В.Михайлова // Прикл. био-хим. и микробиол.- 1983.- Т. 19, н 6.- С. 738-743.

22. Влияние методов хранения Aspergillus аШаоеия на изменение морфологии и способности к синтезу пектиндеполимераз / А.Г.Ло-банок, Л.И.Сапунова, А.А.Опарина, Р.В.Михайлова, М.С.Идельчик // Прикл. Окохим. и микробиол.- 1984.- Т. 20, м 4.- С. 5II-5I7.

23. Образование ферментов игнорирующего действия микромицетами / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, А.А.Опарина, Л.Г.Воскресенская, Е.А.Никулина, Н.Ю.Селиванова, Я.И.Пинчук // Прикл. биохим. и микробиол.- 1985.- Т. 21, и 2.- С. 219-223.

24. Lobanok A.G., Uikhailova R.V. Uaoeratinjg snzymos of microorganisms // VII International Conference of Global Imp&ota of Appl. Microbiol.- Helsinki. 1985.- P. 12-16.

25. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Саге/нова Л.Я. Биосинтез пектоли-таческих ферментов Aspergillus alliaceus Thorn et Church // Ыикол. и фитопатол,- 1985,- Т. 19, н. £.- С. 407-4X3.

26. Получение к мацерируюиие свойства ферментного препарата Пекто-мацерин Г2х / Р.В.Михайлова, Н.Ю.Селиванова, Л.И.Сапуног.а, Л-.Г.Воскресенская, Е.А.Никулина // Биотехнология,- 1985.- v 4.- С. 91-95.

27. Lobanok А.О.. Kikh&llova R.V., Ualaroene В.A. Macerating enzymes of bacteria and fungi // Siviet-Tlnnish Seminar of Microbial Degradation of lignocellulose raw materials.- Pushchino. 1986.- P. 82-94.

28. A.c. I20465I А СССР, МКИ4 в oi с 1/04. Способ получения льняной тресты / Л.Г.Воскресенская, Е.А.Никулина, Л.А.Зароцкая, А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, Н.Ю.Селиванова (СССР).- n 3741404/28-05; Заявлено 16.05.84; Опубл. 15.01.86; Бюл. N 2.2 с.

29. Регуляция образования пектолитаческих и целлюлолитических фэр-

ментов у микроорганизмов / А.Г.Лобанок, Н.И.Астапович, Р.В.Михайлова, Ж.И.Павловская // Сб. Проблемы биоконверсии растительного сырья.- М.: Наука, 1986.- С. 192-314.

30. A.c. 1332808 AI СССР, МКИ4 с 12 N i/u, 1/зг. Питательная среда для культивирования Penioiiiium dieitatum 24П - продуцента пектолитических ферментов / Р.В.Михайлова, Н.Ю.Селиванова, Л.И.Сапунова, С.С.Колесникова (СССР).- n 4029635/31-13; Заявлено 29.12.85; Опубл. 1987; Бюл. N 8.- 4 с.

31. Условия сушки ферментного препарата Пектомацерин ГЗх / Р.В.Михайлова, А.Г.Лобанок, Е.С.Романовен, Л.И.Сапунова, С.С.Колесникова, Н.Ю.Селиванова, Г.А.Василевский // Биотехнология.-

1987.- Т. 3, N 4.- С. 473-477.

32. Полигалактуроназы Aspergillus alllaceus И Penlollllum dieitatum / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, Л.И.Сапунова, Н.Ю.Селиванова, Г.Л.Шапошников, К.В.Васильева, Т.А.Гладких // Доклады АН БССР.- 1987.- Т. 31, N 10.- С. 941-944.

33. A.c. I4C5I40 AI СССР, МКИ4 а 23 L г/00. Способ получения экстрактов для производства безалкогольных напитков / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, Л.И.Сапунова, С.С.Колесникова, Н.Ю.Селиванова, С.И.Василькевич, Г.Г.Адамчик, Е.Н.Личко, Е.А.Шакуро,. Л.И.вро-лова, В.И.Талапин, М.И.Апцешко (СССР).- ы 4088700/31-13; Заявлено 10.07.86; Опубл. 1.06.1988; Бюл. N 6.- 6 с.

34. A.c. 1445187 СССР, МКИ4 с 12 N 9/10. Штамм гриба Penioiiiium janthineiium - продуцент пектинтрансэлиминазы / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, В.В.Смирнов, .С.Р.Резник, Л.И.Сапунова, С.С.Ко-лесникова, Н.Ю.Селиванова (СССР).- N 4155797/31-13;- Заявлено 02.12.86; Опубл. I.12.1988; Бюл. ы 12.- 5с.

35. М1хайлава Р.У., Сапунова Л.1., Шыманвц С.С. Аптым1зацыя пажыу-нага асяроддзя ДЛЯ культывавання Aspergillus alllaoeus - пра-дуцэнта пекщнпдралаз // Вест АН БССР. Сер. б1ял. навук.-

1988.- ы 2.- С. 51-55.

36. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Получение пектин-гидролазного ферментного препарата ИЗ Aspergillus alllaoeus // Сб. Ферменты микроорганизмов.- М.: ВНИИСЭНТИ, 1989.- Ч.1.-С. 169-174.

37. A.C. I5I7357 AI СССР, МКИ4 с 12 ы 9/14. Способ получения комплекса ферментов мацериругадего действия / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, Л.И.Сапунова, Н.Ю.Селиванова (СССР).- и 4375740/3113; Заявлено 18.12.87; Опубл. 1.10.1989; Бюл. ы 10.- 6 с. "

38. Михайлова P.B. Пектолитические фврментц мицелиалькых грибов // Биотехнология микробных ферментов (Под ред. А.М.Еезборсдова).-Минск: Наука и техника, 1989.- Гл. I.- С. 5-34.

39. Даследаванне умоу атрымання ферментнага препарату Aspergillus aiiiaoöus метадам распыляльнай сушк1 / Р.У.М1хайлава, А.Г.Ла-банок, Л.Б.Сапунова, Н.Ю.Сел1ванава // Вест АН БССР. Сер. бгял. навук.- 1989.- ы 6.- С. 62-65.

40. A.c. 1565028 AI СССР. МКИ^ с 12 Н 9/1 о, 1/14. Штамм гриба р<-,-

ntoilliiim lanoaum - продуцент / Г.Г',

хайлова, Л.И.Сапунова, АЛ'.Лобанок, Н.Ю.Селиванова (СССР).- и 4472019/30-13; Заявлено 03.03.88: Опубл. 1.05.1990; Еюл. н 5,4 с.

41. Мисайлава Р.У., Сел1ванава Н.Ю., Сапунова Л.1. Аптшгзацыя умоу атрымання ферментнага комплексу грыба penioinium di«ita-tum // Вест АН БССР. Сер. б1ял. навук.- 1990.- н 2.- С.60-63.

42. Выкарыстанне М1кробных ферментных прэпаратау для атрымання экстрактау з расллннай сьфав1ны / C.I.Васхлькев1Ч, P.y.Mixaft-лава, Г.Г.Адамчик, Л.I.Сапунова, Н.Ю.Селлванава // Вест АН БССР. Сер. 61ЯЛ. навук.- 1990.- н 3.- С. ¿0-32.

43. Конститутивный и индуцированный синтез экзогидролаз микромиие-тами / Р.В.Михайлова, А.Г.Лобанок, Л.И.Сапунова, С.С.Шиманец, Н.Ю.Селиванова // Биол. науки.- 1990.- м 4.- С. 107-ИЗ.

44. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Изучение биосинтеза внеклеточных пектинлиаз микромицетами // Биол. науки.-1990.- N 10.- С. 144-149.

45. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Репрессия г.тнтеза пектингидролаз Aspergillus alliaoeus // ПрИКЛ. бИОХИМ. И Ml'K-робиол." 1990.- Т. 26, н 6.- С. 748-753.

46. A.c. 1656708 AI. СССР, МКИ5 i гз 1 г/оо. Способ переработки пряно-ароматического сырья / С. И. Васильевич, Г.Г.Адамчик, Р.В.Михайлова, А.Г.Лобанок, ' Л.И.Сапунова, Н.Ю.Селиванова, Е.Г.Кяижина, Н.С.Машановз (СССР).- ы 4772412/13; Заявлено 25.12.89; Опубл. I.04.1991; Бюл. 4.- б с.

47. Lotanok А.О., Mikhailova H.Y. Peotindepolymerases from mycelial fungi in Moconversion of plant raw materials // Biooonvsr-sion of plant raw materials - biotechnology fcdv&noesir.nt. VXI Symposium 122.-Espoo. 1991.- P. 110-135.

48. Характеристика пектингидрслазного препарата Aspergillus aiiia-овиз / P.В.Михайлова, Л.И.Сапунова, А.Г.Лобанок, Г.В.Рассадина

// Прикл. биохим. и микробиол.- 1991.- Т. 27, N 5.- С.646-650.

49. A.C. I74844I AI СССР, МКИ5 О 12 N 1/14. 9/14. 9/38. Штамм гри-Оа Penlolllluro dlgitatum - ПрОДуЦОНТ КОМПЛвНСЭ МЭЦерируШИХ

ферментов / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, Н.Ю.Селиванова, Л./.Сапулова (СССР).- n 4880621/13; Заявлено 25.09.90; Опубл. 1.07.1992; н 7.- 3 с.

50. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Изучение полига-лактуроназ, секретируемых грибом Aspergillus alllaoeuo в условиях репрессии синтеза // Доклады АН БССР.- 1991,- Т. 35, н 6.- С. 545-548.

51. М1хайлава Р.У., Сапунова Л.1., Сел1ванава Н.Ю. Уплыу г-апра-менъвання на м1крафлору i актыунасць ферментных прэпаратау э

Aspergillus alllaoeus И Penioilllum dlgltatum // ВвСЩ АН БССР. Сер. б1ял. навук.- 1992.- N I.- С. 3-6.

52. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Регуляция образования ферментов пектингидролазного комплекса Aspergillus alllaoeus // ПриКЛ. бИОХИМ. И МИКр0бИ0Л.- 1992,- Т. 28, >1 2.-С. 249-255.

53. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Образование внеклеточных пектинлиазных комплексов грибами рода Penioiiiium // Микол. и фгеопатол.- 1992.- Т. 26, N 4.- С. 273-278. .

54. A.C. I79I455 AI СССР, МКИ5 С 12 N 9/00. А 23 1 1/05. С 08 в' 37/06. Способ получения пектина / А.Г.Лобанок, Р.В.Михайлова, Л.И.Сапунова, Н.Ю.Селиванова, Е.Г.Симхович, П.Н.Носачевский, Р.Е.Морозова (СССР).- н 4929784/13; Заявлено 22.04.91; Опубл. 30.01.93; Бюл. » 4.- 6 с.

55. A.c. I8I7277 AI СССР, МКИ5 a oí о 7/оо. Способ определения устойчивости клубней картофеля к внутренним механическим повреждениям / Г.В.Рассадина, Р.В.Михайлова, Л.И.Сапунова, А.Г.Лобанок, Н.Н.Мамичева, Л.М.Хромова (СССР).- N 4905679/13; Заявлено 20.12.90; Опубл. 1993; Бюл. N 5.- 5 с.

56. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Изучение пектинлиазных комплексов грибов Penlolllium adametz 11. P.oitrlnum И P.Janthlnellum // МИКОЛ. И фИТОПЭТОЛ.- 1994.- Т. 28, N I.- С. 64-69.

57. Mifchallova R.V., Sapunova L.I., Lobanok A.О. Biosynthesis of peotlnlyases in Penlolllium adametzll, P.oitrlnum and P.Janthlnellum // World J. Microbiol. Biotechriol.- 1994.- Yol. 10. N 4.- P. 457-461.

20 тезисов Республиканских, Всесоюзных, Международных конференций.

РЭЗШЗ

лиевртацыйнай працы М1ХАИЛАВАИ Paicu Уладзиирауны "Пвкц1НДэпол1мвразц грыбоу: асабЛ1васщ рэгулящи б1яс1нтэзу, уластваст, выкарыстанне"

Ключавия слови: грыбы, прадупэнты, ферменты, пекгиндэполше-разы, пектшчдралазы, пекциииязы, б1яс1нтэз, мехаызмы. рэгуля-ц«1, шаукшя, капституг.'^нэсцъ, кзтмагитная рэпрэС1Я, мацэраиыя, препараты

Паказана широкая распэусюдканасць у грыбоу здольнаст С1нтэзаваць пазаклетачныя пекщндэполшеразы, як1я каталгзуюць расшчапленне раслшных полтукрыдау. Установлены асноуныя закана-мернасц! утварэння пекшндэполвлеразау гры0ам1. Выяулены удзел íh-дукцы1, канстытутыунасщ i катабалинай рэпрэси у рэгуляцы1 С1ВТЭЗУ фермента^. Вызначаны К1нетычныя параметры росту грыбоу i С1нтэзу фермента?, рзгулюемых розшмх механ1змам1. Ахарактарызава-на катабал1тная рэпрэс1я тдуцыраванага i канстытутыунага С1нтэзу пекц1НД&пол1меразау. Упершыню устаноулена знзчнасць канстытутыунага, устойл!вага да рэпрэси катабал1там кантролю утварэння фермен-тау. Упершыню выяулена, што множныя малекулярныя формы пекщндэпо-Л1меразау адрознгваюцца як па спосаОу уздзеяння, субстратнай спе-цыф1чнасщ, аптымальным умовам дэградаши субстратау, так i па механ1змам рэгулящи ix сштэзу. Сфармулявана палахэнне аб малеку-лярна-функцыянальнай гетэрагеннаст пектндэполшерязау грыбоу як аб экалапчнай варыябельнаст ферментнага апарату, узнишай ва умовах выкарыстання гетэрагенннх природных пол1мерау i фар;ируемай розным1 кантрольным1 механ1змам1 пры дапамозе дыферэнцыяльнага С1нтэзу ферментау. Рэгуляторныя механ1змы утварэння пекшндэпол1-меразау разглядавдца як элемент складанай сютэмы адапташи, высокая ханкурэнтаздольнаст i экалапчнай пластычнаст грыбоу. Вылу-чаны i адселектаваны новая прадуцэнты пекщндэполшеразау, як1я адрозн1ваюцца ад вядомых, у тым Л1ку выкарыстоуваемых у прамысло-васт, саставам ферментных комплекса} i актыунаспю кампанентау, Алтьанзаваны пахыуныя асяроддз1 i умовы культывавання прадуцэнтау, адпрацаваны спосабы атрымання прэпаратау мацэруючага дзеяння, вы-вучаны IX *уласщвасщ. Створаны фермэнтныя спосабы вылучзнкя з расл1ннай сырав1ны бмлапчна актыуных рэчывау. Паказана эфектыу-насць выкарыстання прэпартау у харчовай, легкай, фармацэутычнай прамысловаст i навуковых даследаваннях.

РЕЗШЕ

диссертационной работы МИХАЙЛОВОЙ Раисы Владимировны "Пектиндеполимеразы грибов: особенности регуляции образования, свойства, применение"

Ключевые слова: грибы, продуценты, ферменты, пектиндеполимеразы, пектингидролазы, пектинлиазы, биосинтез, механизмы регуляции, индукция, конститутивность, катаболитная репрессия, мацерация, препараты

Показана широкая распространенность у грибов способности продуцировать внеклеточные деполимеразы, катализирующие расщепление растительных полисахаридов. Установлены основные закономерности образования пектиндеполимераз грибами. Выявлено участие индукции, конститутивности и катаболитной репрессии в регуляции синтеза ферментов. Определены кинетические параметры роста грибов и синтеза ферментов, регулируемого различными механизмами. Охарактеризована катаболитная репрессия индуцированного и конститутивного синтеза пектиндеполимераз. Впервые установлена значимость конститутивного, устойчивого к репрессии катаболитом контроля образования ферментов. Впервые выявлено, что множественные молекулярные формы пектиндеполимераз отличаются как по способу действия, субстратной специфичности, оптимальным условиям деградации субстратов, так и-по механизмам регуляции их синтеза. Сформулировано положение о мо;;екулярно-функциональной гетерогенное™ пектиндеполимераз грибов как об экологической вариабельности ферментного аппарата, возникшей в условиях использования гетерогенных природных полимеров и формируемой различными контрольными механизмами посредством дифференциального синтеза ферментов. Регуляторные механизмы образования пектиндеполимераз рассматриваются как элемент сложной системы адаптации, высокой конкурентоспособности и экологической пластичности грибов. Выделены и отселектированы новые продуценты пектиндеполимераз, отличающиеся от известных, в том числе используемых в промышленности, составом ферментных комплексов и активностью компонентов. Оптимизированы питательные среды и условия культивирования продуцентов, отработаны способы получения препаратов мацериру-ющего действия, изучены их свойства. Созданы ферментные способы выделения из растительного сырья биологически активных веществ. Показана эффективность использования препаратов в пищевой,.легкой, фармацевтической промышленности и научных исследованиях.

SUMMARY

of the doc toral thesis by M1KHA1L0VA Kalaa Vladlmlrovna "Fungal pectindepolymerases: some regulatory aspects of biosynthesis, characteristics and applications"

Key words: fungi, producers, -anzym^y, pect indepoiymern;?es . peotlnhydrolases, peotlnlyases. biosynthesis, control mechanisitu. induction, cons tituli * ~r . + M te repression. maceration, preparation

The ability to produce extracellular depolym^i-ases catalyzing oleavage of plant polysaccharides was shown to be widely distributed among fungi. Major correlations governing peotindepolymerase synthesis In fungi have been established. The role of induoible and constitutive mechanlam3, oatabollte repression In control of enzyme biosynthesis have been revealed. Kinetic parameters of fungal growth and enzyme production oontrolled by various mechanisms were defined. Cat&bolite repression of inducible and constitutive peotindepolymerase formation was characterized. S lgriif icanoe constitutive, resistant to catabollte repression oontrol of *jiizym * biosynthesis was demonstrated. It was originally found that mul -tlple molecular forms of pectlndepolyrnerases are distinguished ir. mode of action, substrate specificity, degradation optlmas and mechanisms of blosynthetlo control. The concept of molecular-fur.ctional heterogeneity of fungal pectlndepolyrr,erases as ecological variability of enzytoo. systems emerged due to consumption of heterogenous natural polymers and formed by diverse control mechanisms via differential enzyme synthesis was postulated. mechajilsms of pectindepolymerase formation ai-e regarded as a i<art of complex system ensuring adaptation, high competitiveness and ecological flexibility of fungi. Novel cultures-souroes of peotln-depolymerases distinguished from known industrial strains .in composition of enzyme complexes and activity of the 'jonstituents wer« isolated and selected. Nutrient media and culture conditions optimized, biotechnologies for producing maoerating enzyu.e preparations were elaborated, tii-5 end products were subsequently 'ji.a racterized. Enzymatic methods of isolating biologically ectlv*-. compounds from plant materials were developed. Efficient applications for the preparations In food, light Industries, pharmac->u-tics and research have been demonstrated.