Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтетическая активность ксилотрофных базидиомицетов: основные особенности их адаптационная значимость

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтетическая активность ксилотрофных базидиомицетов: основные особенности их адаптационная значимость"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

РГб ОД Биологический факультет

-г: \пр -'лпо

На правах рукописи УДК 582.287.2:581.192.2:581.522.4

КАПИЧ Александр Николаевич

БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ:

ОСНОВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И ИХ АДАПТАЦИОННАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

03.00.24 — микология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва —1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии Биологического факультета Московского государственного университета »ш. М.В.Ломоносова.

Научний консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

докгор биологических наук, профессор Н.С.ЕГОРОЗ

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е.Ц.иШШОВА

докгор биологических наук, ведуций научный сотрудник Н.П.ДЕг1ИСиВА

доктор биологических наук, профессор 0.Л.03ЕРЕЦК03СКАЯ

Инсхитут ботаники им. Н.Г.Холодного АН Украины

Защита диссертации состоится " 23 " апреля

1993 г.

в 15.ЪО час. на заседании специализированного совета Д.0й3.05.65 при Мссковскоы государственном университете им. Ы.В.Ломоносова по адресу: Д?о99, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета ИГУ.

Автореферат разослан

марта

1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

С.Н.ЛЕКиЩЬВА

f

- 3 -

ОЩАЯ XAPAíCTEKÍCIKKA РШЛа

Актуальность теми. В зависимости ст среды обитания и питающих субстратов грибн клчссч BaoiUlosorcetes -разделяя? на ряд экологических групп, а именно: микоризные грибы, подстилочные и гумусовые с:']ггаотро%, ксклотрс^н, копротро-Ь,:, карбо.^илы и нк.чо-tfii.vы (Горленно я др.. 1930). Группа не.-ило?ро2«ьяс (дер-зяора.ару-¡иящих) б.тзидису.ицетов (КБ) объединяет грибк, обитаю^:» на древесине. ¡1рр",ст4вктрля это? группы гркСов осущчстчлсют расцепление лигноц^ллглозного комплекса древесинк - наиболее важн\;-;> этап в fifi Сиодеградчц'ии. Ka основании этого КБ принято рассматривать в качестве глчвнж дареворазрувителер, от деятельности которых зависит скорость разложения древесины, и которым поэтому принадлежит ключ» г,а а рель з круговороте веществ и потоке энергии в лесних экосистемах (Степанова, Пухин, 1979; Великанов, Успенская, 1580; Мухин, 1961). Значение этих грибов и природе обусловливает тот интерес, которые прз/вля»т к k¡m исследователя.

Зоькккног.ение экологических групп rpv.Sos является результатом бесчисленных адаптации к условиям существования во многих поколениях. 3 основе этих эволюционных биохимических адаптации лежат ."ехянизик, связанные с изменениям? последовательности основание ДЯЧ структурных к регулятэрных генов, в результате чего в процессе транскрипции и трансляции образуются новые ферментные система, чатчлизирукято расщепление соотаетстпуптих органических субстратов, а тахте ферментные системы, н-атализируютае синт»а иных по сгсему составу биополимеров и биологически активных веществ . При этом изменяется активность синтеза уже существующих ферментов, что меняет скорость протекания отдельных метаболических яроцр-'сог) и соотношение химических компонентов, обычно встре-чтю'л'.гхс- у грибов.

Екстжг/ческке адаптации гркбез к субстратам связаны, в первую оч?т>«дъ, с появлением кевкх адаптивных (?ерчентов, позволяющих использовать оти субстраты (Хочачка, Семеро, 1977; Дьяков, ISPD; Зэлк"чноп, Сидероза, 1ГЗЗ). Именно поэтому подавляющее большинство работ н области Лизиологии и ¿иохимни КБ поевгдено изучению их йерм?йгньгх систем, которие, как считают ( Kir* , barren , 1937; Головлева, Леонтьевски!*, 1990), осущесгзляют деградацию лигноцеллюЛозного комплекса древесины. В этой связи особы? интерес представляет разделение КБ на две основное категории спе-

циалийировг-.нных редуцентов - грибы белой и буро? гнили, различающиеся по дереворазрутющер способности (Бондарцеэ, 1953; Ри-пачек, I2G7). Это разделение обусловлено, в первую очередь, различиям:! в наборе и активности внеклеточных гидролитических и окислительных ферментов, синтезируемых грибами . обеспечивающих процессы пи тяни я С ivant! f ¡987; Фрнгел, Еегенер, 1988; Даниляк и Др., 1989 \

Вместе с тем адаптация КБ к условиям жизни на древес, ле, в той числе физио;. /"ичеекая специализация на группы грибов бело?, и буро? гнили, сопряжена, по-видимому, с появлением целого ряда генетически закрепленных $и:иолога-биохимических особенности? в белковом, липидноы и углеводном метаболизме. Преимущественное образование тех или иккх биополимеров, разнообразных биологически активных рс-щоств носит, как правило, приелоегбитольны? характер (Хочачка, Сомеро, 1977), Выгпленио фи&иолого-биохимичесних особенностей КБ, в частности особенносте?1 биоскнтстическоя активности, и разработка представления об их адаптационно!» роли имеют большое теоретическое значение, поскольку связаны с решением таких проблем, как биохимическая адаптация к поддержание гомеоста-зг. у грубо в. Однако исследования в этой направлений до егх пор практически не проводились.

Изучение особенностей биосиктегической активности КБ необходимо также в связи с разработкой научных основ их использования .1 биотехнологии.

Ц°ль и задачи исследования. Цель» настоящей работы явилось комплексное изучение биосинтетячеекоС активности КБ в глубинной культуре, включающее следующие основные аспекты:выявление особенностей биосинтетическо? активности у представителе?* оснсзных таксономических и физиологических групп КБ; разработку представлений об адаптационной значимости этих особенностей и научных основ их использования в биотехнологии.

В задачи исследования входило:

- изучение видового состава КБ Минского района и их специализации г -;есообраауг>щкм древесным породам в связи со способностью усваивать разные компонента древесины и создание на этой основе коллекции культур грибов;

- установление закономерностей роста КБ в глубинно?? культуре и образования основных классоз органических соединений, входящих

в состав их мицелия;

- сравнительное изучение биосинтетическоР активности KB в связи с их систематическим положением и физиологической " ^инаД-леяностью;

- разработка предстазлени:1 об адаптационно-Л значимости осо-беннооте;; Йиосинтетическо;' активности КБ;

- исследование механизмов регуляции перекисного окисления ли-пидов (П0Л) и его возможно!» роли в жизнедеятельности мицелия грибов;

- разработка метода определения антиокислительноП активности (АОА' в экстрактах мицели? грибов и изучение антиокспдантнкх свойств КБ;

- изучения способности ферментных систем КБ катализировать трансформаций полин-насьтщенных С^-жирных кислот в лростагландинк;

- выявление штампов - активных продуцентов белка, липидов, полисахаридов, антиокскдантов и других биологически активных веществ и разработка бкотехнологических основ получения соответствующих препаратов.

Научная новизна. Епервые проведено комплексное исследование видового состава КБ в лесах Минского раРона. Выявлено 75 видов наиболее распространенна КБ порядков '-.-hylic -oralaj t{ A/;iirica-les . Показано, что преобла," ющими по числу видов среди афилло-форовых грибов являются семейства* Polypoxacece (49,15?), ^-"О^о

chaclacea« (227а' И Gor t iciaceae (12,11%) , а среди .агарИКОВЫХ грибов - PLouro'acese (3Q%)t 3txophariaccae (30£) И »richolo-natpceae (25$). Установлена связь между специализациэй грибов к лесообразующим лрепесним породам и их способностью вызывать опре-,г ' мнш? тип разрушения древесины.

Получени новкэ сравнительные данные о культуралоно^орйологи-ческих особенностях 59 видоз КВ. .'.'егодсм электронной микроскопии показано наличие в гифах гицелик грибов буроГ- гнили активного хондриомя, включающего изсгнутые митохондрии с длинными кристами, а в гифах мицелия грибов белой гнили - сложных мембранных структур - плазыплешясом. Впервые охарактеризованы по культурально--морйологическим "Ч1ЭНЯК&И в ИДО Diplo:ni xoporus flavoscena t Ske-letocutis stellae , PlutS'Je arxicapillus . Впервые получена стадия телеоморфы в искусственных условиях у Bauaaisopaia ooaf-regosa и Lenzites botulir.a .

- б -

Установлено, что адаптация КБ к обитании на древесине связана с наличием у них ряда особенностей биоеинтетииеско;? активности, которые мокко выявить п условиях глубинного культивирозания на жидких питательных средах. К числу таких особенностей относятся высокая эффективность синтеза белка, прей: _щественное накопление углеводов при лимитировании источниками азотного питчния и неспособность к образованию з ^игольного количества липидов. Для. фосфолкпидоп (СУР мицелия характерно преобладание легкоок-оляемлс (£ракци!* фса'дтидилэтчноламина, кардиолипина и фосфатидилглицерина. Впервые жяштена способность КБ к синтезу высокоактивных липокси-генш.

Обосновано представление о том, что влияние различшпе факторов на уровень содержания белка в мице-лиалъноя биомассе опосредовано изменениями степени гетерогенности мицелия, которая определяется соотношением числп живых и явтолилиропанних клеток, а также флук-туациями содержание белка в жии:х клетках. Впервые показано, что монэкарионк, полученные из одного пло.човиго тела, могут иметь разное содержание С'е.т.ча в мицелии.

Вперзке дчна характеристика антиоксидантнмх свогств КБ и установлен* возможность протекания в их мицелии реакциГ перекисного окисления липидов. Активация процессов ПОЯ колет приводить к снижению содержания белка в мицелии. Сформулировано представление о повышенном антиоксидактном статусе грибов бело" гнили как биохимической адаптации, обеспечивание? их вккивание в условиях окислительного стресса, связанного со свободнорадикалънкми реакциями, протекающими в процессе деструкции лигнина.

• В результате изучения параметров си с тою регуляции ЛОЛ установлено существование взаимосвязи между составом липидов мицелия КБ, АОА липидов и спиртовых экстрактов, .активностью липоксигеназ и ян-тиоксидантных ферментов, содержанием продуктов ПОЛ. Предложена гипотеза свободнорадикяльного окисления лигнина, в основе котороГ- лежит идея о его расщеплении как результате совместного действия лиг-нинолитических (ферментов и перекиеннх радикалов липидов.

Покапано, что ферментные системы КВ каталиг-ируют трансформацию полиненаск", >нн1,!х С2д-шрных кислот в простагландинн. При этом они отличаются субстратно" специфичностью по отношению к дигомо-у-ли-ноленово"! кислоте и наиболее биективно образует простагландины серии I. Установлено, что среди продуктов трансформации основную часть составляют тромбсксянк.

Показано, что физиологическая специализация КБ на группы гримов беле? и буро-? гнили связана как с появлением у них специализированных Лгрментнмх систем, так к с особенностям-/ образования я количественного содержания основных классов органических соединени" к отдельных химических веществ, входящих в состав ки-целия. В условиях глубинного к/льтявированчя грибы бело" гнчли отличаются более- »ЛТ-ективным синтезом белка, активным образованием углеводов, зкгским содержанием свободных аминокислот, а в их составе - глупкиноно? кислоты. Ососекностыо липидсв их мицелии является пеглгьенное содержание и ненасыщенных гяарньос кислот, среди которья преобладает линслевзя кислота. КБ белой гнили отличаются тчкге более высоко" активностью липоксигена.ч и антиок-сидантных виконтов. Адалтаи'юннак значимость особенностей биосин-тетическо" активности мотается в том, что они обеспечивают элективное усвоение источников питания и равновесие з система регуляции ЛОЛ, что свидетельствует об их важно15 роли в поддержании гомеостаза у грибов. Ряд выявленных "собеннссче? биосинтети-ческо? активности КБ (.гирноккслотны? и ф..акционны? состав лини-дов, состав свободных и общих аминокислот, уровень активности ли-поксиген«э, уровень АОА лкпидов и др/ мотет быть использован ; качестве дополнительных критериев при уэчнении принадлежности грибов к '¡изиологическо? группе и их видовой идентификации.

"•'••"■^ичесуа» ценность работы. Создана первая в Республике ларусь коллекция культур, которая включает 122 штамма 59 видов грибов, язляадкхсч представителями основных порядков и семейств КБ. Выявлены штаммы гр/бов - активные продуценты белка, на основе которых разработаны способы получения биомассы кормового и пи-

,вого назначения (Авт.св. В33177 , 937517, 1050474, 1192190, 1367489, 1369017". Отобран птамм ПсваиПпа уе1иаревКВ-1 - продуцент липздор с по?ьк»нним содержанием ненасщенных яирккх кислот (Ат-т.сз. !*> 1342014^. Установлено, что среди лигнинразрутаю-тглх КБ есть вкды, которые могут представлять интерес в качеств? потенциал1'ад: продуцентов липоксигеназ рогез .ГоьегиеМиз , Рапио ). Показана возможность испольг аання ферментных систем КБ для получения "«козаноидов й, а частности, тромбоксанов.

Предложен новы?' метод определения АОА в экстрактах мицелия грибов, содержали еысоконенаськценнъте липидо. Остановлено, что некоторые лигнинрасруяащие ксилотройкыэ бязидиом;г.;етн ( *'опез Го-

.ner.turiuE , Ganoderma lucidum . Panua .tigrinus И Др.) могут быть использованы для получения комплексных препаратов, обладающих высокой АОА.

Разработан способ получения препарата, обладающего радиозащитным действием, на основе экстракта мицелия Schizophyllur. сош-raune (положительное решение о выдаче Патента России по заявке № 4890224/13(118222)). Впервые продемонстрирована высокая АОА экстракта чаги, что позволило рекомендовать его в качестве средства, модифицирующего радиорезистентность животных (Положительное решение о выдаче Патента России по заявке № 4880314/14(1086121).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлена и обсуждались на совместном заседании кафедр микробиологии и микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета км.М.В.Ломоносова; на заседании Ученого совета Института микробиологии АК Беларуси; на Всесоюзной конференции "Мицелиальные грибы" СПущино, 1983); на Всесоюзном совещании "Проблемы продовольственного и кормового использования ьедревес-ных и второстепенных лесных ресурсов" (Красноярск, 1983); на Республиканском рабочем координационном совещании "Микроорганизмы в сельск. . хозяйстве" (Минск, 1983); на Всесоюзных конференциях "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ"(Рига, 1984, 1987); на П Всесоюзном совещании "Производство высших съедобных грибов" (Киев, 1985); на УП сгезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985); на X конгрессе европейских микологов (Таллинн, 1989); на 1У Всесоюзной конференции "Химия, фармакология и механизм действия противолучевых средств"(Москва, 1990); на Всесоюзной конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской ASC" (Ыинск, 1991); на 1У ~ Конференции "Биоантиоксидант" (Москва,' I9S2).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 33 печатные работы, получено 9 авторских свидетельств.

Струч'ура и об-ъем т»яботы.Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на Ч1& страницах машинописного текста, иллюстрирована 45 таблицам!;, 39 рисунками, 2 схемами и 17 фотографиями. Список литература ВКЯВСв*? 755 источников.

Автор считает своим долгом выразить благодарность за содеГ'ст-

вие в выполнения работы сотрудникам кафедр микробиологии и экологии и альгологии Московского 'государственного университета им. М.В.Ломоносова, лаборатории биохимии грибов Ботанического института им.В.Л.Комарова РАН, лаборатории физико-химических о«..«ов клеточной регуляции Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН, клинико-биохимической лаборатории Российского научно-исследова -тельскогс института сби;е? и ';уДебно? психиатрии им.3.П.Сербского, Отдела микологии Института ботаники км.Н.Г'.Холодного АН Украч! , лабораторий низтих растений и физиологии больного растения Института експериментальнсй ботаники км.В.Ф.Купревича А11 Беларуси, лаборатория биохимии Института радиобиологии ¿Н Беларуси, лаборатория технической микологии и ¿изяологии микроорганизмов Института микробиологии АН Беларуси.

ГЛАВА I. ОЩАЛ ХАРАКТЕРИСТИКА КСИЛОТРОФШХ.

ЕАЗдаОШЦБГОВ И ЕИОХЮТЕСКИХ АДНГГАЩЙ ГРИБОВ

Глава состоит из трех разделов. В перъом разделе- дается общая ' характеристика КБ, их тропического, таксономического и физиологического разнообразия. Во втором разделе в качестве эволюционной биохийкческсй адаптации первостепенной э-ачямости рассматривается способность КБ разных групп к синтезу целлю^-зо-и лигнинолити-ческих ферментов. В третьем р..¿деле дается общая характеристика других биохимических адаптация грибов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение распространения видов КБ в лесных массивах Минского г Юна проводили маршрутным методом. При определении видовой принадлежности грибов использовали данные литературы о макроморфоло-гических особенностях базидисм и их микроскопических признаках (Бондарцев, 1953; Комарова, 196-1; Сержанина, 1967, 1984; Гсрлеи-ко и др., 1980; Бондарцева, Пармастго, 193С).

Чистые мицелиальнко культуры выделяли из плодов^: т<?л гркбсо, руководствлсь методическими рекомендациям" А.С.Кухало (1932,1983). Всего в работе б»"1 использовано 59 видов \122 штамма) из 12 семейств КБ, принадлежащих порядкам АесШс-Леа(18 видов) и АрЬу1-

1ор(1оха)ез (41 вид). Материал расположен по следующим системам: пор. АрЬу11орЬого1ез. _ ц0 В.ЮлИХУ ( ЛЧасЬ, 1934!, дор. Аййг«.-

са1ез _ пз Номеру (i'=aer , 1933*. Некоторые nTaimi были получены ил к^глекци? чистых культур Института микробиологии АН Беларуси, Белорусского технологического института им.С.М.Кирова, Ботанического института им.В.Л.Комарова РАН, Института ботаники им .К.Г.Холодного АН Украины, я также из Bcev -'СИГ'СКО'Л коллекции микроорганизмов.

Исследования культурал: о-морфологических признаков мицелия KB проводили на сусло-агаре.и картофельнс-гляжозном агаре . Для изучения кчцелия j свеголом микроскопе препараты готовили в зоде или преггаравальноЯ смеси (вода:спирт:глицерин - 1:1:1'. Исследования ультра структур« мицелия проводили на электронном микроскопе ■JE'.; -ICOex-ШЯпонил -.

Выделение моноспорових культур грибов и пыячлзние тест-культур, сбл'Даюцих различными факторами несовместимости, проводили р. соответотпии с рекомендациями Н.А.Бисько и И.А.Дудки (1987^.

При изучении бпссинтетичеслог- активности КБ и пакономерносте' их роста в глубинно? культуре испольговали модифицированную нами глюкояо-пептоьную среду (Низкозская, IS72.^ следующего состава,¡5: глюкоза - 1,0; пептон - С,3; КН2И>4 - 0,С5; К^КГС.-SHgO - 0,04; ik.so^. ^'',0 - 0,05; кукурузный экстракт - 0,С2. Дт.? стимуляции биосинтеза лилидор, углеводов к рнеялето'шнх полисахаридов содержание глюкозы в среде увеличивали до 3,0$.

Глубинное культивирование грибов проводили в колбах на качалке v. п ферментерах АК-Ю и Iferutisci при температуре ?.б-28°, интенсивности яорации I л/л.мин и скорости вращения мочалки ЗООоб/мин. Выращивание грибов на твердых субстратах (свекловичном коме и картофельной мезге" осуществляли в чашках Петри.

для определения концентрации сухого мицелия (СйР использовали весовой метод.

Содержание редуцирующих веществ (РВ) в культуральк.гх фильтратах определяли с 3,5-динктросалициловоГ- кислото!» ( J-iller, 1959).

Общи? азот в мицелии и культуряльных фильтратах определяли методом Несслера (Арикупкит, 1Э70). Ка основании данных о концентрации азота в мицелии рассчитывал у. содержание сырого белка ( к х 6,£ . Содержание липидов в мицелии определяли методом Оол-ча в модификации ЪглЪь и Дайэрч (Кейтс, 1975), обцее. содержание углеводов - в реакции с фенолом (Максименко и др., 1975х.

Экономический коэффициент синтеза основных классов органических соединений, входящих в состав ь-ицелия, рассчитывали по следую-

щеЯ формуле:

У(Р, *\С) =

- II -

= A(pi? .с L . Ю<$,

dS

где У(р р с) ~ окоис,,1тег}си^ коэффициент синтеза соответствующих соединенна (Р - белков, F- липидов или С - углеводов), %\ д(Р,Р,С) - количество синтезированных соединения, г/л; &S - количество потребленного источника углерода, г/л.

Содержание истинного' белка в мицелии определяли по Барнштей-ну (Методы биохимического исследования растений, 1907).

Аминокислотный состав белка, спиртовых и водноспиртовых экстрактов мицелия исследовали на автоматическом анализаторе аминокислот AAA 881 (ЧССР). Триптофан определяли отдельно по модифицированному методу Лоренцо-Андри и Франдзена (Методы биохимического исследованчя растений, 1987).

Содержание ФЛ определяли на основании расчета суммарного содержания отдельных фракций <5Л и содержания фосфора в общих ли-пидах после их сжигания с хлорной кислотой (Хиггинс, 1990). Состав <5Л анализировали методов тонкослойно-, хроматографии на сили-кагеле Н фирмы " Sigma'", Разделение на фракции производили в системе растворителей хлороформгметанол:ледяная уксусная кислотя:во-да дистиллированная в соотношении A:25:J5:4:2 и Б:50:35:4:2.

Жирнокислотный (Ж) состав липидов исслед зали на газожидкостном хроматографе "Хром-5' (ЧССР-.

Содержание внеклеточных полисахаридов рассчитывали как раз т. • цу между общим содержанием углеводов в кульчуральнор жидкости и содержанием п ней РБ, умноженную на коэффициент 0,9 (Захарова, Косенко, 1982).

Оценку антиокислительных свойств грибов проводили на 2-х мо-злях, в которых использовали разные субстрата окисления и способы аэрации: II на модели окисления линолевоя кислоты при температуре 40° ( Knkatar.i, Xikuaaki t 1987) без перемешивания и подачи воздуха (процесс окисления идет в диффузионной области* .определяли способность еппрто:ых экстрактов мицелия грибов и водных экстрактов чаги тормозить образование продуктов, реагирующих с тиобарбитурово?. кислотой (Кяпач и др., 199Т); на мс-гилолетевд окислительно,"! модели при температуре 27° и продувании воздуха через реакционную смесь, обеспечивающем протекание процесса окисления в кинотитескоП области, определили способность липидов мицелия, плодовых тел, чаги, спиртовых экстоактое мицелия, а также

- 12 -

водных экстрактов чаги тормозить образование гидроперекисей (Шишкина, 1992).

Разделение водорастворимых веществ экстрактов мицелиг на фракции по молекулярному весу производили методом гель-фильтрации, используя жидкостной хроматограф фирмы ькь.

Общее содержание фенольных соединений в спиртовых экстрактах определяли с реактивом Фог 1на-Дениса (Запрометов, 1974). Определение гисловых соединений проводили спектрофотометричео м методом Элмана в модификации Седлака с 5,5^-дитиобис(2-нитробенпой-ной кислотой) (Sedlak , Linaeey , 1968). Концентрацию токоферола измеряли спектрофлуоркметричэски putigan t 1959), сгеринов -спектрофотометрически (spejrry , v.ehb j 1950).

Содержание гидроперекисей липидов определяли спектрофотомет-ричесии после экстракции липидов хлароформ-метанольной смесью и перерастворенмя их в гексане (Аристархова, 1983), а в некоторых случаях - после экстракции смесью гептан:иэопропаиол по методу Гаврилова и МишкорудноП (1983). Мялонош" диальдегид определяли спектрофотомртричаски по реакций с 2-тиобчрбитуровой кислото? (Гаврилов и др.» 1987).

0 способности грибов образовывать фенолоксидазы судили по результат« цветовых реакций на поверхности мицелиальньгх колоний (Stolpers , 1978).

Активность супероксиддисмутазы определяли спектрофотометри-чески по ингибировянию 02~-зависимого автоокисления кверцетина (Костюк и др., 1990\ каталазы - по рапрушенлю перекиси Еодорода ( Aebi , 1984 \

Активность липоксигеназы определяли полярографически ( der Ouderaa et el. , 1977).

Для расчета удельной активности ферментов белок определяли по методу Лоури (Lowry et el., 195I

Изучение способности бесклеточных гомогенатов мицелия катализировать образование простагландинов проводили радиохроматог-рафически (Гелинг, 1990 ^. В качестве субстратов использовали меченые по углероду арахидоновую и дигомо-^-линоленовую кислоты с удельной активностью 52,8 и 47,0 мКи/мМ фирмы " (Англия). Проводили также рчдиоиммунологическое подтверждение образования различных простагландинов с использованием стандартных наборов фирмы "Clinical assay (OUAl.

" ГЛАВА 3. ВИДОВОЙ СОСТАВ КСИОТРОФНЫХ БАЗ'ДДО-МИЦЕТОВ МИНСКОГО РАЙОНА И ИХ КУЛЫУ-РАЛЬКО-МОРгОЛОГИЧЕСНИЕ СВОЙСТВА

Видовор состав КБ Минского района изучали параллельно с созданием коллекции культур грибов. Информация о распространении перспективных видов - продуцентов биологически активных веществ-необходииа при получении исходного материала для селекции высокопродуктивных штаммов. Как показал анализ литературы (Комарова, 1964; Головко, 1968; Сержанина, 1984; Федоров, 1987), сведения о КБ разных таксонов, распространенных в Беларуси, разобщены.

Установлено, что КБ Минского района представлены, главным образом, грибами порядков Aphyllophorales и A^ericaLes (соответственно 55 и 20 видов). Преобладающими по числу видов среди грибов порядка Aphyliophora 1ез являются семейства Polyporaceae , Нугг.епо-chaetaceoe и Corticiaceee , а среди порядка A^arica les-Polyporaceae , Strophariacee<-. и Trioholooataceae (рис.1). Большинство КБ составляютлигниь^азрушающие грибы, вызывающие белую гниль древесины (83$ от общего числа видов), которые доминируют в основном на лиственных породах древесины. Грибы - возбудители бурой гнили обитают преимущественно на удойных породах (рис.2).

Из плодовых тел грибов выделено 48 культур 27 видов, являющихся представителями основн, . таксономических и физиологических групп КБ, распространенных в Минском районе. Кроме того, в исследованиях использованы и другие культуры, полученные из некоторых научных центров России и Украины.

При работе с культурами базидиалышх грибов необходим контроль их культурально-морфологических признаков. Решающее значение для • аэгрчниченип грибов по физиологическим группам имеют цветовые реакции на наличие внеклеточных оксидоредуктяз, в особенности лакказы, тирозинази и пероксидазы.. Грибы белой гнили, вне зависимости от их систематической принадлежности, как правило, образуют лакказу и пероксидазу, тогда как у грибов бурой гнили отмечается отрицательная реакция на эти ферменты. Вместе с тем наблюдаются и исключения из этого правила. Тяк, у гри^ап белой гнили' Lexitextura bicolor , SchJ'.ophyllui¡. conmur.e , Phur.oroehaelo chryaoapo -riur , а танке представителей рода Ljerkandera выявлена отрицательная реакция на некоторые из этих ферментеч, в то время как У грибов бурой гнили SkeletocuUo etüllae я fnoliota aurlvella-

А

Рис.1. Спечтр семейств грибов порпд^ов Аваг1оа1ез (А) и А.р1)у11орЬога1ез (Б) Минского района

2. Количественное распределение грибов бурой(А) и белой (Б) гнили по дрепес(гым породам Минского района

' - ель; 2 - сосна; 3 - береаа; 4 - дуб; 5 - ольха; 6 - осина; 7 - другие лиственные породы

положительная. Кроме topo, регистрировали варьирование результатов этих тестов у разных штаммов одного вида. Впервые отмечено проявление слабой положительной реакции на экстрацеллюлярные ок-сидазы У грибов бурой гнили Fomitopsis pinícola, Leucogyíophana pinaotri и laetiporua eulphureus При снижении содержания танина в среде до 0,05/2.

Важное значение при идентификации культур KB имеет описание морфологических особенностей мицелиальной колонии. В раб^-е приведены Данные о текстуре колоний, их цвете, характере краевой зоны и окраске реверзума. Впервые получена стадия телеоморфы в искусственных условиях У грибов Deed a leo pei3 corifxa;;oíja и Lenzitea betulina .

Существенной культурально;1 характеристикой вида является скорость pocva. Изученные виды грибов в зависимости от сксрости роста на сусло-агаре разделены на четыре группы. Большинство грибов бурой гнили относится к умеренно- и медленнорастущим. Грибы белой гнили.с пигментацией колония также отличаются умеренным или медленным ростом, тогда как грибы, не образующие пигмента, являются, как правило, быстро- или сверхбыстрорастущими. Впервые показано, что в качестве дополнительного критерия при идентификации грибов можно использовать скорость их роста на картофельной мезге и свекловичном жоме. Выявлены грибы (Par.ua ti(>;ri.tiUO и Trau.ei.OB hiruu -ta ) -. активные продуценты белка на средах с этими Субстратами.

Приведены сведения об основных микроскопических признаках мицелия КБ: ,-ипах гиф, наличии и расположении пряжек, а также о присутствии различных структур вегетативного и бесполого спороно-шдния. Впервые охарактеризованы по культурально-морфологическим признакам виды biplomitoporus ílaveecero , Skeialocutio stellae И Pluteus articapilluu .

Сравнительное изучение ультряструктуры мицелии грибов белой ( Panus tigrinuo f Schizophyllurj comwuir.e ) и бурой ( Piptoporue Letulinus ( leucosyrop'haim pinaatri ) гнили позволило выявить у них как ряд особенностей, свойственных базидиальным грибам в целом (отсутствие аппарата Гольджк, инвагинации плазмалеммы, многочисленные ломасомы, ламеллярная структура клеточной стенки, до-липоровые септы), так и признаки, полезные при идентификации на групповом и видовом уровне. Гифы мицелия грибоэ бурой гнили отличаются большей степенью развития хондриома. У Piptoporus tetulii.uo обнаружены изогнутые митохондрии с длинными кристами. На примере

Panus tierlnus показано, что з гифах мицелия грибов белой гнили встречаются сложные мембранные структуры - плазмалеммасому.

В результате проведенных исследования соэдвна первая в Республике Беларусь коллекция культур, которая включает более 100 штаммов 59 видов грибов, являющихся представителями основных порядков и семейств 1ÍE. Сведения о культурах стандартизированы согласно требованиям карта Всемирной федерации коллекция культур

Анализ научной литературы и результатов собственных исследований покалывает, что между грибами, вызывающими белую и бурую гниль древесины, существует комплекс различий, касающихся их распространенности, характера субстратной специфичности и культураль-но-морфологических особенностей.

ГЛАВА 4. РОСТ И Е10СИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КСИЛОТРО&НЫХ БАЗВДЮМИЦЕТОВ В ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЕ

В последнее время метод глубинного культивирования широко применяется для изучения роста базидиальных грибов в связи с перспективой использования их мицелия в качестве пищевой и кормовой до6чечи (Бухало, 1988; Лобаньк и др., 1988). Подавляющее большинство работ по глубинному культивировани.» КБ посвящено получении высокобелковой биоь-лссы на срс.дах, главным компонентом которнх являются разнообразнее отходы г.рс;.:ьшленности и сельского хозяйства. Однако в кччестпе продуцентоп белка исследовались только отдельные виды Деретюрааруг.ающих грибов. Вместе с тем метод глубинного культивирования незаменим при изучении (фиэнолого-био-хишчесяпх особенностей грибов и их биосинтетической активности.

Лроведеннке нами комплексные исследования показали, что в целом КБ характеризуются активным образованием белка. Однако в зависимости от систематического положения и физиологической специализации у грибов выявляются определенные особенности d бело'ксин-тезир1КМ("й активности.

Наиболее четко«-' представление о способности культур к образованно белка дает сравнительная оценка сод' якания белка в мицелии и эффективности г о биосинтеза. В качестве показателя эг]<|^ктив-ностп образования белка рассчитывали экономически? коэффициент синтеза сырого белка (Ур). Грибы белой гнили отличаются как более

высоким содержанием белка, так и более эффективным его образованием (в среднем в 1,5 раза) по сравнению с грибами бурой гнили. Большинство грибов бурой гнили характеризуется значениями У_ о пределах 7,0-16,0$, тогда как среди грибов белой гнили преобладают виды, у которых Ур составляет 16,0-20,5% (рис.3). Сравнительное изучение составов свободных и общих аминокислот мицелия КБ показало более высокое их соя°ржание (особенно глутаминовой кислоты) у грибов белой гнили, что подтверждает наш вывод о более активном и эффективном образовании белка этими грибами.

Исследование закономерностей накопления белка в мицелии КБ, проведенное на лигнинразрушающих грибах Рошев ¿оаегиагХиц Рашл 1.1Бг1пи0 % Оаейа1еорв1в соп^вуоза , Тгагае1ев Ыгаи1а И РЪа-пегосЬаеге с1игуоо8рог1иш , позволило обосновать представление о том, что влияние генотипа штамма-продуцента, фазы роста культуры, условий культивирования и состава среды на уровень содержания белка в мицелиальной биомассе опосредовано изменениями степени гетерогенности мицелия, которая определяется соотношением числа живых и автолизированных клеток, а также флуктуациями содержания белка в живых клетках. На примере Рошев Гоиег^агхио показано, что увеличению активности липоксигеназы - фермента, инициирующего ПОЛ ■ грибов, - сопутствует нарастание содержания продуктов ПОЛ (малонового диальдегида и гидроперекисей липидов) и уменьшение содержания белка в мицелии. Следовательно, одной из причин, приводящей к снижению содержания белка в мицелии, может быть активация процессов ПОЛ.

Впервые проведенное сравнительное изучение роста в глубинной культуре монокарионов и дикариона Рапие ицг1пие позволило установить, что монокарион этого гриба, имеющий факторы несовместимости ¿2^1» обладает более низким содержанием белка по сравнению с исходным дикарионом и остальными монокарионами.

Важным практическим результатом этих исследований стало получение активных штаммов - продуцентов белка и разработка способов производства высокобелковых биомасс кормового и пищевого назначения (Авт.св. » 883177 , 937517, Ю80474, П92190, 1367489,1369017).

На следующем этапе работы проводили сравнительный анализ углевод- и липидсинтезирующей активности КБ. Как оказалось, эти грибы не способны к накоплению значительного количества липидов. Вместе с тем грибы бурой гнили в среднем отличаются как повышенным содержанием липидов, так и их более эффективным синтезом по

43 о и

да ч с\ -з

с\

-а

I о

3 >в<

а

■С5 ^ О

• 2 Ь -

> I £ 2

и 41 а Е

а э ч

о

а> г — н

"3 с "Э 0

и аз ы

1 л сэ 13 ъ Ы

о о X О

э 3

ь М т) X

о тз

э 1 п о о

ч 3 а о

X о 01 X

-а и о ¡я

Ьэ а О

* о •в

> л 3 тз

о

■С •3«

<< << .а

1—а о 2!

с \-4 о

т

• о

у

тЗ

- а

Количество видов

-а ь

^ = м

Количество видов

и О» Ч) ^ ^ ^

СО

сравнению с грибами белой гнили. Если среди первых преобладающее ыисло видов содержит 6,5-11,02 липидов в мицелии, то среди вторах наиболее многочисленна группа видов с содержанием липидов 6,0-8,5$. Грибы белое гнили, в свою очередь, характеризуются повышенным содержанием углеводов в мицелии. Большинство их содержит 37,0-40,углеводов, тогда как среди грибов <%роУ гнили модальным является класс с содержанием углеводов 25,0-32,(рис.4).Кроме того, грибы белой гнили отличаются активным синтезом внеклеточных полисахаридов.

Важную роль в адаптации различных организмов к условиям обитания играют лилиды, среди которых особое значение имеют ФЛ, являющиеся основными компонентах« клеточных мембран и во многом определяющие нефункциональные свойства (Крепе, 1981 *. Сравнительное изучение состава липидов в некоторых случаях с успехом используется для филогенетических построений. Однако из оснозных компонентов мицелия КБ липиды остаются наименее изученными.

Как показали наши исследовании, преобладающими в липидах мицелия КБ являются ненасыщенные жирные кислоты: линолевая (С^д^) и олеиновая а из насыщенных - пальмитиновая. Что касает-

ся Других жирных кислот, то они содержатся в незначительном количестве (не более от суммы жирных кислот1- Наиболее характерны!» признак липидов мицелия грибов белой гнили в период активного роста - высокое содержание (свыше 5С/0 линолевой кислоты, причем у некоторых культур оно может достигать 70-80$. Ессьма существенным является то, что эта особенность проявляется при повьшен-ном соотношении С:и в среде, т.е. в условиях, благоприятствующих преимущественному синтезу насыщенных жирных кислот. Соответственно Данным жирнскис.лотного состава, в среднем степень ненасыщенности липидов грибов бело** гнили на игле, чем липидов грибов бурое гнили.

Различия в шрнокислотном спектре липидов и степени их нена-сытаннссти у грибов двух физиологических групп взаимосвязаны с разным уровнем содержания М. Грибт1 белей гнили обладают более высоким содержанием ОЛ как в общих липидах, так и в мицелии, по сравнению с грибами буро?. гнили.Лричем, эти отличия .проявляются во всех 1*азах роста. На примере Ропив гл^гДлио показано,' что содержание К я экспоненциальной фязе у грибов белор гнили может достигать от суммы липидов. Очевидно, более высокое относи -тгльнсе содержание £Л в общих лилидах мицелия грибов белой гнили

о ч к

sr

Ж

А

tt к

25 29 3337А\ Углеводы, %

2? 29 33 .37 41 .

Углеводы, %

ti X

о о 3' s ч о ы

el я <5

ÍU

С 5

«5 У

х ч о

ь:

25 2? 33 37 41 45

Углеводы, ^

2? 2? ' 33 37 41 45 Углеводы, %

4

Рис ,4. Гистогрчммн распределения »cvwrpofHKX Са:>мдиомицетов по содержанию yr.v"олор,

Ь - пор. A.-nrlcaUi:.; В - пор. Apnyllophoralea ¡ В - бурые гнили; Г - белые гнили

Таблица I.

Состав ФЛ мицелия ксилотрофнда базидиомицетоз, % от суммы §Л

Вид гриба

ЛФХ

СМ

ФХ

:$и + $С

ФЭ

+ кл

5К

Белые гнили

?.£ошегЛаг1из Р. ■Ийг1г1из

Бурые гнили

С.еаер"и_1иа Ь.ви1рЬигеие Р. ЬеСиНпив

2,1+0,2 1,9+0,2 1,1+0,1

3,9+0,4 4,1+1,2 1,3+0,2

2,9+0,3 1,4+0,2 2,6+0,3

1,6+0,1 о,б!о,з

9,2+1,0 11,4+0,7 19,7+0,4

33,3+1,3 21,0+1,7

13,2*0,4 8,5+0,3 10,0+0,4

10,2+0,4 15,3+1,6

28,4+0,9 31,5+1,7 32,3+0,6

25,9+2,0 41,5+2,2

1,2+0,2 6,6+0,7 10,2+0,5 18,2+1,1

32,9+1,4 11,1+1,1

"45,3+1,3" 26,0+1,0 8,3+1,0

13,6+0,7 11,5+0,8 "17,6+2,2" 63,8+1,4

г\э лз

обеспечивает боле? высокую степень их ненасыщенности.

В состав ФЛ мицелия KB разных таксономических и физиологических групп входят одни и те же фракции: лизофосфатидилхолин (Л2Х), сфингомиелин (СМ), фосфатидилхолин (ЙХ), фосфатидилинозиг (5И), фосфатидилсерин (SC), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилгли-церин (ФГ), кардиолипин (О) и фосфатидная кислота (5>К) (табл.1). Обладая в основном обычным набором ФЛ, ксилотрофные базидиомице-тг отличаются от грибов других таксономических и экологических групп их количественным соотношением. Существенной особенностью ФЛ этой группы грибов является преобладание в их составе легко-окисляемых фракций ФЭ, КЛ и ФГ. Состав ФЛ у грибов бурой гг ли разных видов варьирует в широких пределах. Преобладание в мицелии грибов белой гнили легкоокисляемых фракций ФЛ, по-видимому, непосредственно связано с высокой степенью ненасмщелности суммарных липидов.

Таким обрчзом, п^ кпособление грибов к ус: виям жизни на древесине, а также физиологическая специализация КБ на группы грибов белой и бурой гнили сопряжены как с появлением у них специализированных ферментных систем, так и с особенностями образования и количественного содержания основных классов органических соединений и отдельных химических веществ, входящих в состав мицелия.

ГЛАВА 5. ПЕРЕЖСНОЕ ОКИилЕНИЕ ЛИПИДОВ И АШОКЩАНТНЬЙ СТАТУС У КЧШ-ТГОФНЫХ ЕАЗИдаСМИЦЕТОВ

Как известно i Schoernaker et al. t 1985; Harvey t 1986), больное значение в процессе деградации лигнина КБ имеют реакции сво-боднорад1;кзльнсго окисления. С другой стороны, в настоящее время установлено, что реакции свободнорадикального или перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют существенную роль в жизнедеятельности различных организмов (Владимиров, Арчакоэ, 1972; Бурлакона и др., IS75; Мерзляк, 1989). В первых двух разделах главы приведены сведения о процассах ПОЛ и механизмах их регуляции у высших эукариэтов, простейсих, грибов к бактерий.

В связи с -чыявлеь.л-ми особенностями состава липидов ксило -трефных базидиомицатов, i также принимая во внимание свободнора-дикальный характер процессов деградации лигнкна, важно" представлялась оценка актиэксидантного статус0 КБ и егс ад^пт^'^спной зна-

чимости. С этой целью нами был разработан метод определения АОА в экстрактах грибов, содержащих высоконенасыщенные липиды. Исследования, проведенные с помощью данного метода, показали, что в целом экстракты мицелия грибов белой гнили отличаются высокой АОД. Зто связано, в первую очередь, с присутствием в них низкомолекулярных водорастворимых соединений, из которых наибольшее значение имеют свободные аминокислоты, в частности цистеин и треонин, а также других веществ, обладающих АОА (эндогенных тиолои, фенольных соединений, ЗЛ). Ксилотрофные базидиомицеты белой гнили характеризуются также повышенной активностью ключевых антиок-сидантных ферментов - каталазы и супероксиддиемутазы, которые, по-видимому, участвует в элиминации активных форм кислорода, генерируемых зтйми грибами.

Вместе с тем изучение АОА липадов лигнинразруиающих базидио-мицетов на метилолеатной окислительной модели позволило еыявить их значительные прооксидантные свойства. Наряду с этим, как оказалось, эти грибы образуют липоксигенаяы, активно окисляющие лино-левуп кислоту. Таким образом, КБ располагают как механизмами, инициирующими реакции ПОЛ, так и средствами антиоксидантной защиты. Результаты наших исследований свидетельствуют, что их баланс обеспечивает протекание процессов ПОЛ на определенном стационарном уровне, который потенциально вьшэ у грибов белой гнили по сравнению с грибами бур:Я гнили.

Изучение системы регуляции ГОЛ у КБ показывает, с одной стороны, существование взаимосвязи между ее арпметрами у грибов разных физиологических групп, а с другое - согласованность изменений этих параметров в процессе роста у отдельных видов (табл.2). Наи-болыпчя активность липоксигеназы отмечается у Ранив (.^хШио в экспоненциальной фазе роста, когда в мицелии содержится максимальное количество £Л, в которых преобладают легкоокисляемые фракции С'Э, КЛ и $Г, а сами липиды характеризуются наиболее высоким содержанием линолевой кислоты. В этот же период гриб содержит максимальное количество малонового дмальпегида и гидроперекисей липи-дов, что свидетельствует об активно,.1 протекании процессов ПОЛ в мицелии. Замедление роста гриба сопровождается снижением активности липоксигеназы и количества лйнолевой кислоты в липидах, при этом изменяется состав 5Л: происходит их обогащение трудноокис-ляемой фракцие"- 4>Х, р то времг как содержание легкоакисляемых }ракций КЛ, СГ и значительно снижается. Перечисленные измене-

Таблица 2.

Изменения параметров системы регуляции перекисного окисления липидов з мицелии Рапиэ И^гд-пиз ИЕг'-131 в процессе роста

ч/аза роста

И, % от суммы ЯК

ЬТОФЛ :дг. :МДА, .

"нмоль/ ;нмсль/г .(мин.мг: см :белка) :

ХТОФЛ

ГЛ, , :А0.\ ли- :А0А СЗ- :С0Д, :Ката-нмоль/мг;пидов на:на мо- :нг/мг:лаза, липидов :М0 моде-:дели :белка:ед/мг :ли ;окисле- : :белка

:ччс.мл/г:ния ж,%: :

Экспонэкциальная 63,1 4,8 711,5 288 8,4 -2500 30,6 812,8 2928,5

Замедления роста 60,2 3,0 239,4 141 6,9 -1800 16,0 804,0 1522,8

Стационарная 37,8 2,4 419,0 121 6,4 -1000 21,2 742,0 1675,1

Примечание:

Л -Ш -ЛОФЛ-Т05Л-

лг -МДА -см • -гл -

АО А -

линолевэя кислота жирные кислоты легкоокисляемые фосфолипид-трудноокисляемые фосфолипиды липоксигеназа малоновый диальдегид сухой мицелий гидроперекиси липидов антиокислительная активность

МО - метилолеат СЭ - спиртовой экстракт ССД - супероксиддисмутаза

ния сопровождаются уменьшением содержания в мицелии малонового дияльдегида и гидроперекисей липидов. Изменениям прооксидантных свойств липидов и интенсивности протекания процессов ПОЛ в процессе роста соответствуй! компенсируете их измен лия в уровне активности антиоксидантных ферментов и величине АОА спиртораст-воримых веществ. Таким образом, результаты поведенных исследований свидетельствуют о гомеостатическом характере системы регуляции процессов ПОЛ у КВ.

Ферментные системы КБ наряду с окислением линолевой кислоты способш катализировать и окисление полиненасцщенных С20~кирных кислот, являющихся предшественниками простлгландинов. При этом, если циклсоксигеназы высших эукариотов преимущественно катализи-■ руют окисление арахидоновой кислоты с последующим образованием простагландинов серии 2, то ферментные системы КБ более активно окисляют дигомо-jj- -линоленовую кислоту до простагландинов серии I. Уникальным является и состав получаемых продуктов. Основную их часть составляют тромбоксаны В, в то время как выход простагландинов Е и i' значительно меньший. Ферментные системы грибов белой гнили Гаиио tigriuus и Готев fоделtarius обладают повышенной способностью к окислению полиненасыщенных жирных кислот и обеспечивают более высокий выход простагландинов по сравнению с ферментами грибов бурой ГНИЛИ Laetiporuo sulphuréuo и Piptopoxua be-tulinusi. Таким образом, высокая активность окислительных процессов, связанная с расщеплением лигнина, у грибов белой гнили коррелирует с наличием у них активных ферментных комплексов, катализирующих образование простагландиноЕ

В результате изучения антиоксидантиого статуса КБ установлено, что мицелий некоторых видов грибов белой гнили ( Schizophyllua coma,иго f l'ornes foiuentcriua , Canoderma lucidint , Panne tigririuá может быть использован для получения комплексных препаратов с попытанной АОА. 3 эксперимент?« на лабораторных животных показано, что такие препараты обладают радиоэащитнкм действием. Высокая АОА т.'пяленч тлкте i экстракте чаги, , торий традиционно использует-сч в народной медицине, ito позволило рекомендовать его б качестве средства, модифицирующего радиорезистентность животных. В результате исследований, пэопеденных в Институте радиобиологии АН Беларуси, установлено неизвестнее ранее свойство водно'го экстракта чьги, заключающееся в его способности нормализовать содержание нммунс ком патентных клетс; у облученных живот1.гк. На модели к окно-

-мышечных клеток эмбриона человека, инкубируемых а присутствии , показано, что экстракты мицелия КБ препятствуют накопления радионуклидов. Ценным свойством антиоксидчнтньгх nt .-пара -тоа, полученных из мицелия этих грибок, является то, что они сохраняют активность при пепор.альнсм ввеДекии и э^дктивда при применении после облучения. Производство таких препаратов особенно актуально для Республики Беларусь, где после аварии на Черно-бь..ьской АЭС слоилась неблагспрю-тнчя радиоэкологическая обе та-, новка.

ЗЛ]Ш.ЧЫЛН

Первостепенную значимость р адаптации KS к обитанию на древесине имеет их способность к синтезу внеклеточных гидролитических и окислительных ферм-чтов, катализирующих лро—сси расщепления основных компонентов древесина: лигнина и целлюлозы.^Вместе с тем проведенное нлми комплексное исследование 'биссинтзтиче :ой активности КБ в условиях глубинного культивирования позволило выявить ряд их особенностей, которые связаны с физиолегичзехой специализацией грибов н-1 группы белой и бурой гн::;.и и могут иметь вакное адаптационное значение.

Способность КБ белой гнил;: к элективному синтезу б°лка слезет рассматривать как одну из форм приспособления, обеспечивающих эффективное усвоение этими грибами источников питания при больпих энергозатратах, связанных с деструкцией лигнина. Следует отметить, что нарастание экономичности обмена веществ является тенденцией, характерной для гркбоз, имеющих стратегию жизни стресе--толэрангев, к котерьгм можно отнести и КБ.

Активный синтез грибами белой гнили углеводов в условиях повышенного соотношения С: в среде, по-видимому, способствует продуцированию перекиси водорода, в присутствии которой происходит окисление лигнина лигнинперсксидааой. Перекись водород? у этих грибов образуемся в результате реакции, катализируемой глюкозоск- ' сидазой, из глюкозы, "отопт", в свою очередь, освобождается при расщеплении внеклеточных полисахаридов ^-глаканазой ( Bt:ctola , 1 a i с о I а , 1967.1.

Разрушение лигнина древесины является 'результатом реакций СЕободнор?,л.икального окисления и сопровождается образованием активных форм кислород? ( ¡íari 1936). Б связи с этим важное значение в гизнедеятельнсстк КБ имеет физико-химическая система, ре-

гулирупщая интенсивность процессов ПОЛ и определяющая уровень юс антиоксидантного статуса. На основании изучения антиоксидянт-ных свойств ксилотрофных базидиомицетов сформулировано представление о повышенном антиоксидантном статусе грибов белой гнили как биохимической адаптации, обеспечивающей их вьй...зание в условиях окислительного стресса, связанного со свободнорадикальными реакциями, происходящими в процессе деструкци.. лигнина.

С другой стороны, сами реакции ПОЛ, о протекании которых в мицелии свидетельствуют способность ксилотрофных базидиомицетов к синтезу высокоактивных липоксигенаэ, наличие в мицелии высоконенасыщенных липидов и, наконец, продуктов ПОЛ (малонового ди.аль-дегида и гидроперекисей липвдов), могут играть ванную роль в процессе расщеплёния лигнина. На основании комплексного анализа литературы и результатов собственных экспериментальных исследований предложена гипотеза свободнорадикального окисления лигнина, в основе которой лежит идея о его расцеплении как результате совместного действия лигнинолитических ферментов и перекисных радикалов липидов. Суть этой гипотезы сводится к следующему. В процессе роста под влиянием различных факторов, например, при лимитировании источниками азотного питания, культуры грибов переходят в идиофазу, сопряженную с началом автолиза мицелия. Активному протеканию автолиза е мицелии лигнинразрушающчх грибов.должно ело -собствовать наличие у них высокоактивных протеинаэ (Денисова, 1ЭЭ1). Нарушение компартментализацли клеточных структур обеспечи-исет контакт высокоактивных липсксигеназ с лепсоокисляемыми вы-соконенасьпценкыми липидами мембран мицелия. В.результате этого, а также действия других факторов .нар: ютея регуляция процессов ПОЛ. Происходит их активация, сопровождающаяся образованием высокоактивных липидных радикалов, которые, в свою очередь, принимают участие в атаке на лигнин древесины. Таким образом, свобсд-норадикчльксе окисление лягнинз, инициируемое лигнинолитическими ферментами, может заметно активизироваться перекисными радикалами липидов.

Особенности биэсинтетической а> ¿внести КБ разных физиологических групп имеют как качественный, так и количественный характер. Таким образом,, стратегия биохимической адаптации КБ к обитание на древесине, связанная с разделением их на группы грлбо белой и буро;1 гнили, различающихся по способности расщеплять основные компоненты дрэвескны, включает, по кралней мере, два ос-1огнь."х направления: I) пгячлекие новых специализированных фермент-

ных систем; 2) количественные изменения активности образования и содержания основных классов органических соединений и отдельных химических веществ, входящих в состав мицелия. Адаптационная значимость этих особенностей заключается в том, что они обеспечивают эффективное усвоение источников питания и равновесие в системах, поддерживающих гомеостаз у грибов.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследования видового состава ксилотроф их базидиомицетов, распространенных в лесах Минского района, установлено, что они представлены 75 основными видами порядков Apliy lio phorales и Agaricales . преобладающими среди грибов порядка Aphyilophoralos являются семейства Polyporaceae (49,IJo), Hyaienochaetaoeae (22") и Coiticiaceae (12,7%' а среди порядка At¡ari^alec _ Pleurotaceae (30%), Sírophar.-iaceae (30%) и cholomtacase C¿5%). Большинство ксилотрофнах базидиомицетов составляют грибы, вызывающие белую гниль, которые обитают глазным образом на лиственных породах древесины, тогда как грибы -возбудители бурой гнили встречаются преимущественно на хвойных породах.

2. Создана первая з Республике ^зжащ'сь коллехщн культур, включающая 122 штамма 59 видов грибов, представителей основных порядков и семейств ксилотро^ных базидиомицетов. Полученные сравнительные данные о культурально-морфологических и физиолого--биохимических особенностях,этих грибов могут быть использованы в качестве дополнительных критериев при их идентификации. Методом электронной микроскопии на примере PipUporun tetulinua выявлено наличие в гифах мицелия грибов бурой гнили активного хокд-риома, включающего изогнутые митохондрии с длинными кристами. На примере Рапиы tigrinua показано, что в гифах мицелия грибов белой гнили встречаются сложные мембранные структуры - плазмалем-масомы. '

3. Адаптация ксиг^трофных базидиомицетов к обитания на древесине связана с наличием у них ряда особенностей биосинтетической активности, которые можно выявить з условиях глубинного куяь-тивировани." на жидких питательных средах. К числу таких особенностей относятся высокая эффективность синтеза белка, преку-дост-венное накопление углеводов ри лимитировании источниками азотного питания и неспособность к образованию значительного ko.t/wct-

-ЗОва липидов. Для фосфолипидов мицелия характерно преобладание лег-коскисляемых фракций фосфатидилзтаноламика, кардиолипина и фос-йптидилглицетна. Впервые выявлена способность ксилотро^ных базидиомицетов к синтезу высокоактивных липоксигеназ

4. Разработан новый метод определения антиокислительной активности в екстрактах мицелия грибов, содертаггих вьгсоконенасы -ценные липиды. Впервые изучены антиоксидантные свойства ксилот-рофных базидиомицетов. Сформулировано представление о повыяенном антиоксидантном статусе грибов белой гнили как биохимкчзской адаптации, обеспечивающем их выливание в условиях окислительного стресса, связанного со свобсднорадикальньм: реакциями, протекающими в процессе деструкции лигнина.

Ь. В результате изучения параметров системы регуляции пере-кисного окисления липидоь установлено существование взаимосвязи между составом липидов мицелия ксилотрсфншс базидиомицетов, антиокислительной активностью липидэз и спиртов'.'х экстрактов, активностью липоксигеназ и антиоксидантннх ферментов, содержанием продуктов перекисного окисления липидов. На основании комплексного анализа данных литературы и результатов собственных экспериментальных исследований предложена гипотеза свобсднорадикально-го окисления лигнина, в сенояе которой лекит идея о его расщеплении как результате совместного действия лигнинолитических-ферментов и перекисных радикалов липидов.

6. Ферментные системы ксилотро^ных базидиомицетов могут катализировать трансформаци'о пэлинекасьгуенньгх С^д-жирных кислот в простагландины. Три этом, в отличие с ферментных систем других организмов, они обладают субстратной, специфичностью п > отношению к дигомо-у -лкнолеыовой кислоте и наиболее эффективно катализируют образование простагландкнов серии I. Среди продуктов трансформации основную часть составляют тромбоксаны.

7. Установлены общие закономерности регуляции содержания белка в мицелкалъной биомассе ксилотрофных базидиомицетов. Обосновано представление о том, что влияние "'енотипа итамма-продуцснта, фазы роста культуры, услов*" культивирования и состава среды на уровень содерчани«- белка г мчцелиальной биомассе опосредовано изменениями степеии гетерогенности мицелия, которая определяв-ся соотношением числа кквах и автолизированнкх клеток, а также ц4ук-туацияни содержания белка з живых клетках. Впервые обнаружено, чго монокаркоггы, пзлученныз из одного плодового тела, могут иметь разное подержание бе,те?. в мицелии.

8. Выявлены штаммы грибов - чктивные продуценты белка, на основа которых разработаны способы получения биомассы ксрмппого и пищевого назначения. Мицелия Рогг.оз ГотюигьМия , Си шспаа Тисх^ИП , Рипио ЬЬдХпив Ц других видов лигнинразрушаюиих ксилотроф:п.:х базидиомицетое может ..мть использован для получения комплексных препаратов, обладающих повышенной антиокислительной активностью. Разработан способ получения препарата, обладающего радиояащитннм действием, на основе экстракта мицелия БсЫхорЬу!-

1ит сомипе, Установлена внсокяя антиокислительная активность экстракта чаги, что позволило рекомендовать его в качестве средства, модифицирующего радиорезистентность животных.

9. Специализации ксилотроФных базидиомицетоп на группы грибов белой и бурой гнили связана как с наличием у них специализированна ферментных систем, так и с особенностей образования и количественного содержания основных классов г панических соединений и отдельна химических нпцеств, входящих в состав мицелия.

В условиях глубинного роста грмбц белой гнили отличатся' более элективным синтезом белка (п средне:.! в 1,Ь оаза), активным об-разопадаем углеводов, высоким содержанием свободных аминокислот, а в составе последних - глутаминово?» кислоты (от 11,7 до 19,9$ от сум:.:ы). Особенностью липидов их мицелич явлгетгя повышенное содержание ^оофэлипидсв (до 60/"? в экспоненциально? фазе) и нена-сдаенннх жирных кислот, среди кптошх преобладает линолевая кислота и:пья» Г>0% от с умял жирных кислот). Ксилотрофные бчяидиочи-цетм бело." гнили отличаются также более высокой активностью лк-поксигеназ и чнтиоксидантннх ферментов. Адаптационная значимость этих особенностей заключается в том, что они обеспечивают эффективнее усроение источников питания и равновесие в системе регуляции перетасногс окисления липидов, нтг» свидетельствует об их важной роли в поддержании гшеостаяа у грибов.

СПАССЯ Р'БОТ, О.ТУВЛ!КОЗ.ШШХ ПО ТШ Л?ССЕРТА1?М:

Капич А.Н., Бабицкая З.Г., Стахеев И.В. Вазидиомицеты -продуцента белка на отх картоФялслерерабатппаю'Д'э'*' промкшленнос-ти // Тез. докл. научно" конференции Б^О "Микроорганизмы в про-мшленноси, сельском хозяйстве к медицине", Минск, 1979. С.33.

'Ьпич 1.Н., Бабицкая В.Г., Стахеев И.В. Возможность накоплен:!." Сиосаеек балидиомнцет-ми на отходах промышленности в глубинно"- культуре // Р.есц! БССР. Сеп.бЬл.навгк. 1900. О 1.С.88--92.

Капич А.Н. Изучение физиологических потребностей съедобного дереворазрутающего гриба Fanue tifiriiiusfFr.) Sing. ИЖ—131 при глубинном культивировании на полусинтеткческих средах // Тез. докл. конференции "Микроорганизмы - продуценты би^чогически .активных веществ". Рига, 1981. С.60-61.

Капич А.Н., Бухало Л.С., Стахеев-И.В. Изучение роста и синтеза протеина СЬвДобМ-М грибом rar.ua xicrinufj ( Vi.) siiif;. ИЕ{-131 на средах с. сельскохозяйственными отходами // Михробиол. пром-еть. IS83. № I. С.2-3.

Капич А.Н., Стахеев И .В. Вь-рлщивание мицелия дереворазрупчй-щих базидиомицетов на мелочной сыворотке // Тез.докл.Есесоюзч. конференции "Мицелиальнне грибы (физиология, биохимия, биотехнология)". Пущйно, 1983. С.98-99.

Капич А.Н. Глубинное культивирование дереворазрупающих базп-диоккцетов // Тез.докл.Есесоюзн. совещания "Проблемы продовольственного и кормового использования недревесных и второстепенных лесных ресурсов". Красноярск, 1983. С.134.

Стчхеев И.В., Бабицкая В.Г., Капич А.Н., Головко А.И. Био -трансформация твердых целлшозосодержащнх отходов в кормовоя белок дереворазрушающими баэидиомицетами // Тез. докл. В^есоюзн. совещания "Проблемы продовольственного и кормового использования недревесных и второстепенных лесных ресурсов". Красноярск, -1983. С.134.

Чапич А.Н. Глубинное культивирование дереворазрузающих бази-диомицетсп на средах с еоломой // Материалы Республ.рабочего координационного совещания "Микроорган' мы в сельском хозяйстве". Минск, 1933. С.60-61.

Стахеев И.В., Капич А.Н., Бабицкая В.Г. Выращивание мицелия дереворззрушающих базидяомицетов на стчодах переработки картофеля // Еесц! АН БССР. Сер.б1ял.навук. 1984. S3. С.55-59.

Капич А.Н., Стахеев 'И.В., Бабицкая В.Г. Дереворазрушакише баяидиомицеты - продуценты белка. !'инскИнститут микробиологии АН ЕССР, 1934. 69 с.

Капич А.Н., Стахеев Г.В., Бабицкая В.Г. Глубинное культивирование дерееорчзрушамгци:: бэзидиальных грибов на молочной сызо-ротге // Минол. и т!Итола-ол. 1984. Т.18. № 6. С.479-483.

Капич А.Н. Твердофазное культивирование дереворяэрушающих базидеальных грибов // Тез.докл. конфоренци. "Микроорганизмы -продуценты биологически -ктивных веществ". Рига, 1984. С. 115.

Стахеев И.В.iiДорожи» H.A., ¡Сапич А.Н., Голсвко А.П., Ече-ва C.B. Твердофазна« ферментация картофельной мезги дереворазру-латецими базидиоыицетами // ДШ БССР. 1985. Т.29. 12. ~.П29-—I132.

.Чапич А.Н. Получение биомассы дероворазрушающих бааидпомицетов в глубинной культуре // Тез.дохл. УП съезда ЕА'.О "Достижения микроба логии - практике". Т.4. Биотехнологический основы микробиологических синтезов. Алма-Ата, 1985. С.53.

Капич А.Н., Стахеев И.З., Бакинская И.С. Рост мицелия Panun tit'/'ir.uu ( null. :?г. ) sing. ИК-С-131 в глубинной культут на полусинтетической среде // Тез. докл. П Всессмк. совещания "Производство высаих съедоб^тх грибов в СССР". Киев, 1085. С.128-129.

Кчпич А.Н., Стахеев W.B., Ваяниская И.О. Рост баяидиоу.ицетоп Гаг.из tii',r.'.nue ( buxi. :.-'г. ) Sir,';.' ИБК-IoI И lÄedüloo;u,ii.> confia,;олп (Vilt.:'. . } Sohroet. Г-Ц5 глуб'.ШНОП Культуре и :.!',!кол. и фитопатол. I98G. Т.20. р 3. С.199-204.

Кпп::ч \.Н., 'Серба В.В., CTixeen И.Е. Утилизация углеводов и органических кислот мелочно;' сыворотки багидчошцетом baconieop-olr or.ïzarnca ( bolt.iPa. ) Sc.iOct. Г-П5 // ЛрИКЛ. биОХИМ. и микробиол. 1987. Т.23. I. С.25-23.

Капич А.Н., Романсяг.ц Е.С., Во-"-' С.П. Мицелиальные грибы -продуценты б с лко п о-л'л ni""H о ■"• биомпссь! на гидролипатах древесины // Теп.докл. конференции "Современные проблемы б: технологии микроорганизмов". Рига, 1937. С.44.

."'алкч А.!!,, Романовен Е.С., Вапт С.П. Получение мицелия дере-аоразрушаяп^х базидиомицетов на гидролизатах древесин»,г // Весц! АН БССР. Сер.бХял.папук. 1988. .«i 3. С.5-1-53.

Капич А.Н., Романовец Е.С., Войт С.П. 0 'составе липидов мицелия Flaiiiii.ulir.a veluti^ea ( Cut .¿r'r. ) Sing. // ПоиКЛ.биохим. и микробиол. 1989, Т.25. № 3. C.3&Ï-372.

КярЛгсп л.V.. Lio.ayjitheuis of tiopolycern ну wood-rOtting Ln-oidio.Tyoex.e'] ir. iw'-i.,ertT/:à culturc // J'euth сог.;;геаа oX ¿iuropean iiycolocitat:. Tallinn, I^Gy. P.^1.

Капич A.H., Рома. >вец E.C., Войт С.П. Содержание липидов в мицелии дереворазрупчющих Сазидиемицетов и их жирнокислотныЯ состав// Микол. и ^итопатол. I9S0. Т.24. ;; I. С.50-56.

Капкч А.Н. Биосинтетическая активность деревсразруяаящих ба-зидиомвцотоя при глубинном ""льтипированни И 1'наоп. и фитолатол. IQ90. Т.24. ,Т» 5 С.377-284.

-34 -

Леонтьев К).Г-!., Борткевич Л.Г., Капич А.Н., Стреж &.А., Масловская А.М. Кнмунокоррегируюшця активность препарата БРМ-Ч, полученного кл дереворазрушающого гриба // Тез.докл. 1У Всесоюзн. конференции "Химия, Фармакология и механизм действ'"" противолучевых средств". М., 1990. С.07-98.

Капич А.;-]. Изучение роста в глубинной культуре монокарионоп и дикариона №пив ( 1. :г'г. ) и накопления ими

белка // Биол.науки. 1991. У б. С.131-136.

К'апич Л.Н., Леонтьев У.М., Конопля Е.5. Антиокислктольн-аг активность окс-тряктов мицелия настоящего трутовика // Песц1 АН БССР. Сер.б1?л.лявуг. 1991. № 5. С.58-62.

Кагмч А.Н., Леонтьев Ю.М. Бис-антиоксидянты грибного происхождения - кодификатору радиоустойчивости // Тез.докл.Рсесоюзн.конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской КС". Минск, 1291. С.50.

Капич Д.Н., Гелинг И.Г., Картелилев А.В., Лобанок Л.Г. Биосинтез простегляндинов, катализируемый ферментами дереворазрукающих базидиомицетов // ДАН СССР. 1992. Т.322. 3. С.604-606.

'Капич А.Н., Головко А.И. Дереворазрушающие базидиомицеты в лесах Минского рчйона // Весц1 АН БССР. Сер.б1ял.навук. 1992. Р 2, С.41-44.

Капич А.Н., Шишкина Л.Н. Изменения содержания и состава -липн-дор дереворазрушающих базидиомиц^тсв в процессе роста // Биол.науки. 1992. V-. 6. С.89-95.

Лэонтьев Ю.М., 1-Гапич А.Н., Коирпл? Е.5. Кзуч"кие влияния экстрактов мицелия грибов на накопление ^'со п клетках эмбриона человека // Радиобиология. 1992. Г.32. № 6. С.£92-595.

Капич А.К., Шишкина Л.Н. Антнскислитрльная активность экстрак тов дереворазрушающих базидиальпчх грибов // Тез.докл.ТУ Конференции "Биоактисксвд'шт ". 1992. Т.1. С.13-14.

Клпич А .11., 1Еишкина .".И. Ан?;;скеидантные свойства дереворазру ваших базидиоыицетов // Уйкол. и (Титоп-атол. 1992. Т.£5. у б. С.

Авторское свидетельств 2 83317? "¡¡.ткмм ¿'аг-и0 ашв ( '¡?'г.

'/!3ч-131 - предуцен" биомасса" '."Бухало А.С., Бабицкая Б.Г., Стахеев И.В., К'апич А.Н. и др.). - 1281.

"втсрское свидетельство Л' 937о17 "Способ получения биомассы, обладающей грибным аромат'.-м" (лалич А.Н., Бабицкая В.Г., Стахеев 'Л .В.). - 1982.

Авторское съидетельстг о № 1С80474 "Способ получение белкового

ксрмового продукта" (Сгахееэ И,В., Бабицкая Е.Г., Костина A.M., Капич А.Н.Л- IS34.

Авт:ргкор свидетельство '!■ II92ISC "Етамм гриба Ccxiolus nir-autus CI3 F - продуцент белка" (Стахоеэ И.В., Капич А.Н., Батурина Т.Я. и др.). - 1935.

Аятсрсксе свидетельство № I3420I4 "1тамм соматических структур "млкрсмицета Flan-nulire velutipea ( Curt.: Fx. ) Sing. K3-I - продуцент липидсзТ-С"ПВч А.Н., Романовен Е.С., Зо?т С.П.). - 1987.

Авторское свидетельство 1- 1267489 " Способ получения белксво--•Терменткого комплекса" (Стахеев И.Э., Бабицкая В.Г., Серба Е.З., Иванов А.Т., Капич А.Н. др.\ - 1968.

Авторское свидетельство I5G5CI7 "Итамм соматических структур макромицет-а Pat.us .tii;rinU3 ( bull.:Fr. ) uir.i;. Ц^Т.! V -241-продуцент белка" (Стахеев И.В., Капич А.Н., Головко А.Я., Еаева С.В.). - 1988.

Положительное реиенир на выдачу Патента России по заявке № 4880314/14(108612) от 18.II.91 "Средство, нормализующее содержание иммунонсмпетентных клетск у сблучеиных животных" (Борткевич Л.Г., Масловская A.M., Леонтьев У.М., Конопля Е.Ф., Капич А.Н.).

Положительное репенке на выдачу Патента России по заявке •f 4890224/13(118322) от 30.10.91 "Способ получения средства, обладающего ради о защитит-гм действием" (Капич А.Н., Лееитьеп С.;.!., Конопля Е.О.).

Подписана к nrara 12. С } Oij. Форчат 60XIU 1/16

Усл.п«.л. <,SC Тираж J СО эк», ttvaurao.Jaw» 0/36.

КПП Гоокоионптапэ Prcrj^uiiibit Ееnpjeu