Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств"

ии3057-БЭ8

Кучумова Анастасия Владимировна

ПЕГИЛИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ Ь-АСПАРАГИНАЗЫ ЕЯШ1МА САКОТОУОМ С ЦЕЛЬЮ УСИЛЕНИЯ ЕЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ СВОЙСТВ

' _ 1

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003057698

Работа выполнена в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Научные руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Соколов Ни колай Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Ребров Леонид Борисович

доктор биологических наук Иванов ] Орий Дмитриевич

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «^J?» /¿¿¿l^TPI/lét- 2007 го/а в Т^/часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., Д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биом( дицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Автореферат разослан » с^-с-О/О/уЛл- 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Былинкина B.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Биологические катализаторы, каковыми являются ферменты, обладают чрезвычайно высокой специфичностью и мощным каталитическим воздействием на различные стороны метаболизма в организме. Поэтому они представляют собой уникальные лекарственные средства, используемые в медицине для лечения заболеваний различной этиологии (Holcenberg J., 1982; Goldberg D., 1992).

L-аспарагиназа (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3.5.1.1), являющаяся представителем ферментов класса треониновых амидогидролаз, катализирует превращение L-аспарагина до L-аспарагиновой кислоты и аммиака. Бактериальные аспарагиназы более 30 лет применяются в онкологической практике при комбинированной химиотерапии различных видов лейкозов, меланом и миелом (Perel et al., 2002). Механизм противоопухолевого действия аспарагиназы заключается в расщеплении аминокислоты аспарагин, находящейся во внеклеточном пространстве. Для опухолевых лимфоб-ластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой в клетку извне нарушается синтез белков и клетка становится неспособной к дальнейшему делению. Таким образом, реализация цитотоксичности аспарагиназы не подразумевает контакта или проникновения активного вещества в опухолевую клетку, что принципиально отличает этот фермент по механизму действия от других цитостати-ков (Тимаков и др., 2000). Сниженная или полностью отсутствующая активность ас-парагинсинтетазы - фермента, синтезирующего L-аспарагин, является отличительной чертой не только лейкемических лимфобластов, но и миелобластов, и целого ряда клеток других опухолей. Большинство здоровых, в том числе гемопоэтических, клеток способно синтезировать собственный аспарагин. Это определяет вторую, крайне важную характеристику фермента, а именно минимальное миелотоксическое действие.

Целый ряд аспарагиназ из различных бактериальных штаммов обладает противоопухолевым действием. Однако использование препаратов аспарагиназы в противоопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами, поэтому только два наименее токсичных фермента, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coll (ЕсА2) и Erwlnia chrysanthemi (ErA), нашли применение в онкотерапии (Duval et al.,

ТС1

2002). Причем, наименее токсичными признаны препараты, пол> chrysanthemi, что указывает на важность исследования аспарагина:; не менее, даже аспарагиназы штаммов Erwinia вызывают развитие гиперчувствительности к L-аспарагиназе, проявляющееся в диапаЬ лергических реакций до анафилактического шока (Muller et al., 19 эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой довольно низкой стабильностью фермента в физиологических уело

Таким образом, представляется актуальным получение форм L-аспарагиназ штаммов Erwinia устойчивых к протеолитич! крови, обладающих низкой иммунологической активностью при о ферментативной активности.

В настоящее время существует ряд различных методов мод тически значимых ферментов. Одним из наиболее эффективных яе модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.н. пегилирован 2005). Она заключается в физико-химической трансформации, Д01 нием нативной молекулы белка с ПЭГ. Применение этого методк тельно повысить терапевтическую эффективность фармакологии пептидной структуры.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в получении модифицированной п> рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, обладающей бильностью и пониженной иммуногенностью.

Для достижения данной цели были поставлены следующие з;

1. модификация полиэтиленгликолем L-аспарагиназы Em. мизация процесса пегилирования;

2. детальная характеристика физико-химических свойст: L-аспарагиназы Erw carotovora (pl, каталитические пар; мическая стабильность);

3. определение цитотоксичности пегилированной аспарап тельных к ней клетках лейкоза человека;

4. оценка иммуногенности модифицированной полиэтилен] назы Erw. carotovora.

ченные из Еглчта рода Егм/Ма Тем иммунологической оне от слабых ал-)8). Помимо этого, :рапии ограничена Виях.

\ :одифицированных еской деградации в охранении высокой

^фикации терапев-ляется химическая •le (Veronese et al., с)тигаемой соедине-позволяет значи-еских препаратов

флиэтиленгликолем повышенной ста-

щачи:

carotovora и опти-

пегилированной аМетры, термодина-

лназы на чувстви-

I ликолем аспараги-

Научная новизна работы

Впервые в качестве объекта для получения пегилированной формы аспарагиназы использован генно-инженерный фермент Erw. carotovora, на основе которого в настоящее время в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ НИИ БМХ РАМН проводятся работы по созданию отечественного лекарственного препарата рекомбинантной аспарагиназы.

Впервые разработана и оптимизирована методика модификации полиэтилен-гликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora. Получены экспериментальные данные для пегилированной аспарагиназы о ее физико-химических и каталитических свойствах, иммуногенности и цитотоксическом действии на опухолевые клетки различных линий.

Показано, что модифицированная аспарагиназа оказывает более выраженное цитотоксическое действие на опухолевые клетки лимфобластной Т-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта по сравнению с нативным ферментом. Выявлено возрастание устойчивости ПЭГ-аспарагиназы к протеолизу и повышение термостабильности по сравнению с исходным белком. Установлено, что пегилированная форма рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora обладает пониженной иммуногенностью.

Практическая значимость исследования

В настоящее время в клинической практике используется лишь единственный пегилированный препарат бактериальной аспарагиназы - «Онкоспар», получаемый на основе фермента Е coli. Наличие нескольких препаратов аспарагиназ со сниженной иммуногенностью позволит проводить заместительную терапию различных видов лейкозов у пациентов, в особенности у детей, обладающих повышенной аллергенностью к существующим препаратам бактериальных аспарагиназ. В этом отношении не вызывает сомнения высокая практическая значимость получения пегилированной формы аспарагиназы Erw carotovora.

Результаты данной работы могут быть использованы в качестве основы для создания нового лекарственного препарата пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erw carotovora для лечения ряда форм лейкозов, и в первую очередь острого лимфобластного лейкоза.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были долояо конференциях: II научно-практической конференции «Актуальны цинской биотехнологии» (Анапа, 2005), «Фундаментальные науки медицине» (Новосибирск, 2006), Всеукраинской научно-практичеа международным участием «Молекулярные основы и клинически стентности к лекарственным средствам» (Киев, 2006). По матерр опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Апробация диссерта межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 21 декабря 2006

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литера териалов и методов исследования, полученных результатов и их обф; и списка цитируемой литературы, включающего 122 источника. Р

страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 та|блицы.

1:ны на следующих з проблемы меди- биотехнологии и :ой конференции с е проблемы рези-алам диссертации ции состоялась на года.

луры, описания ма-уждения, выводов хбота изложена на

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Культивирование штамма-продуцента и экспрессия фермента.

В работе был использован рекомбинантный штамм Е. pPACYC177_LANS, сконструированный ранее сотрудниками лабо ской биотехнологии совместно с М.А.Эльдаровым (Центр «Биоинж! доруком и В.Г.Богушем (ГосНИИгенетика). В 200 мл LB-среды мкг/мл ампициллина, вносили 3 мл ночной культуры и выращи перемешивании 150-180 об/мин до оптической плотности OD60i среду добавляли индуктор синтеза L-аспарагиназы ИПТГ в конеч 0,1 мМ и клетки инкубировали в течение 16-20 часов при тех же собирали центрифугированием (15 мин; 5000 об/мин) и хранили npip

Очистка и выделение L-аспарагиназы

Ультразвуковая дезинтеграция клеток. Все стадии очистки пров' 12 г биомассы Е. coli суспендировали в 20 мМ калий-фосфатном фер А) до общего объема смеси 85 мл. Клетки разрушали ультраз граторе УЗДН-2Т (Россия) в течение 5 минут при режиме: 30 с озв рерыв. Разрушение клеток проводили на ледяной бане, поддерж

coli BL21(DE3)/ ратории медицин-енерия», К.В. Си-содержащей 100 вали при 37°С и 1=1,5-2,0. Затем в юй концентрации условиях. Клетки -20°С.

>дили при 4°С. 10-буфере, pH 5,5 (бу-вуком на дезинте-учивания, 30 с пе-ивая температуру

+2-+4°С. После этого рН суспензии доводили до значения 5,5 с помощью 0,1 М НС1 и оставляли при 4°С и непрерывном перемешивании на 30 мин для преципитации части балластных белков.

Хроматография на колонке с SP-Сефарозой. Растворимую фракцию клеточного экстракта получали 30 минутным центрифугированием при 18000 об/мин (34 х 103 g) и наносили на колонку с SP-Сефарозой FF (2.5 см х 10 см), уравновешенную буфером А. После нанесения белка SP-Сефарозу последовательно промывали колоночным буфером с рН 5,5 до исчезновения следов белка в элюате. Скорость нанесения образца и промывки колонки составляла соответственно 1 и 2 мл/мин. Белок элюировали линейным градиентом КС1 в интервале концентраций 0-0,8 М. Также в ряде случаев элюцию проводили 100 мл буфера А с рН 7,0, при скорости потока 1 мл/мин. Фракции, содержащие L-аспарагиназу (0,3-0,35 М КС1), объединяли.

Концентрирование и обессоливание фермента. Объединенные фракции с SP-Сефарозы помещали в ячейку-концентратор Amicon объемом 12 мл, содержащую фильтр Millipore (Ultrafiltration membrane NMWL 30000) и центрифугировали (Beck-man, JA-25,5 4000 об/мин). Обессоливание белка проводили ультрафильтрацией на ячейке Amicon, либо с помощью гель-фильтрации на колонках PD10 с Сефадекс G-25. Лиофнлизацня препарата. Сконцентрированный материал разливали по 1 мл в био-виалы объемом 4 мл, замораживали при -80°С и лиофилизировали в течение ночи. Фермент хранили при -20°С.

Определение концентрации белка.

Белок определяли модифицированным методом Лоури (Hartree Е., 1991), а также через коэффициент экстинкции сО,1%28о=0,56 (expasy.org). Концентрацию пегилирован-ного белка определяли биуретовым методом (Элиот Д. и др, 1981), измеряя оптическую плотность растворов в 96-ти луночных планшетах при длине волны 540 нм на многоканальном спектрофотометре «Multiscan ЕХ». В качестве стандарта использовали раствор нативной аспарагиназы в интервале концентраций 1-10 мг.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях осуществляли в соответствии с методикой (Laemmli, 1970), аспарагиназную активность определяли по методу Несслера (Wriston J., 1973), изоэлектрическое фокусирование проводили, как описано (Остерман М„ 1983).

Определение кинетических параметров аспарагиназы.

Скорости гидролиза L-аспарагина и L-глутамина рекомбинантны ванным ферментом определяли спектрофотометрически по убыф] амидной связи при 215 нм (e2i5—102,5) с помощью спсктроф Packard» (Howard et al., 1972). Для этого 27-1350 мкМ фермента доф мМ боратного буфера, содержащего субстраты в концентрации 3 цию проводили при 37°С.

Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликоль-п-и

м и модифициро-мию поглощения кЬтометра «Hewllet авляли к 2 мл 12,5 )-3600 мкМ. Реак-

итрофенилкарбо-

Метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонат с молекулярн (тРЕО-рЫР) любезно предоставлен А.Ю. Суровым (Институт Би мии, РАН). Лиофилизированный препарат аспарагиназы (10 мг) 100 мМ боратного буфера, рН 9,0-9,5 и смешивали в различном м нии с тРЕС-рЫР. Реакционную смесь инкубировали при непреры 5: нии от 1 до 24 часов. По окончании реакции полученный продукт о реагировавшего тРЕС-рМ' и побочного продукта гель-фильтрацие: с Сефадекс 0-25, уравновешенной 20 мМ фосфатным буфером, р! держащие Ь-аспарагиназу, объединяли и определяли суммарную а! та. Полученный препарат фермента хранили при -20°С.

Определение цитотоксической активности аспарагиназы in vitre

В опытах использовали чувствительные к аспарагиназе клеточные ническая миелогенная лейкемия), MOLT-4 (лимфобластная Т-кле Raji (лимфома Беркитта). Культивирование проводили в течение Т. С02 инкубаторе. Для культивирования клеток использовали 96-ти планшеты (фирм «Nunc» и «Costar»), В каждую лунку помещали 0,1 и достигшие логарифмической фазы роста клетки в количестве 4i MOLT-4 и 50000 клеток/лунку (для линий К-562 и Raji). Планф; клетки, преинкубировали в течение 24 часов перед добавлением гиназы. Выживаемость опухолевых клеток, инкубировавшихся с

: раз.

ой массой 5000 юрганической хи-растворяли в 4 мл слярном соотноше-иом перемешива-гделяли от не про-\ на колонке PD10 7,0. Фракции, со-:тивность фермен-

тании К-562 (хро-точная лимфома), : часов при 37°С в (48-ми) луночные мл (0,3 мл) среды )000 клеток/лунку [еты, содержащие препаратов аспара-шичными концен-

' Работа проводилась совместно с к б н Посыпановой Г А (ММА им Сеченова) и д б н. Абакумовой О Ю (ГУ НИИ БМХ РАМН)

трациями препаратов аспарагиназы, определяли в МТТ-тесте (Hubeek et al., 2006). После 72 часов инкубации к клеткам добавляли МТТ реактив («Sigma») и инкубировали клетки еще 4 часа. После этого, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в изопропаноле и измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм. В отрицательном контроле присутствовала только культурапьная среда. Зависимость ин-гибирования роста клеток от концентрации белка выражали в % и рассчитывали следующим образом:

„. OD,тЛклетки, инкубируемые с ферементом) ...

Выживаемость % =-—---1——-—--- х 100

OD ^(контрольные клетки)

Для характеристики цитотоксического эффекта использовали значение LCS0 -концентрация препарата, приводящая к гибели 50% клеток.

Определение иммуногенности аспарагиназы.

Получение специфических политональных антител. В эксперименте использовали беспородных белых мышей-самцов с массой тела 19-22 г. Антиген вводили с помощью внутрибрюшинных инъекций в количестве 25 мкг в 0,2-0,3 мл физиологического раствора. Мышей иммунизировали ежедневно в течение 7-10 суток. В эксперименте было 3 группы животных: по 5 мышей на нативную и модифицированную аспарагиназы, и 3 мыши в контрольной группе. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Непосредственно перед введением препарата, лиофили-зированные нативную и модифицированную аспарагиназы разводили стерильным физиологическим раствором до необходимой концентрации. На 10-е сутки мышей декапитировали и получали сыворотки периферической крови. Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки планшетов высокой сорбционной емкости («Nunc», марки «Polysorp»), наносили по 100 мкл антигена в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6, в концентрации 20 мкг/мл и инкубировали в течение ночи. Жидкость из лунок стряхивали и вносили по 100 мкл блокирующего раствора (50%-ное молоко 0,5%-ной жирности в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (PBS)), и инкубировали 1 час при перемешивании, при комнатной температуре. Затем лунки промывали три раза по 200 мкл буфером для промывки - 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,4, содержащий 0,05% Твин 20 (PBST). Далее, в ряды лунок вносили по 100 мкл индивидуальной антисыворотки в серии из восьми последовательных

разведений в два раза. Начальное разведение антисывороток варьир в зависимости от титра специфических антител. Оптимальное нач

овало от 1:2 до 1:4 альное разведение

(для достижения конечной точки титрования) определяли по результатам предвари-

тельного эксперимента, проводимого в тех же условиях, начиная

Инкубацию продолжали 1,5 часа при комнатной температуре. После этого планшеты

стряхивали и промывали четырежды PBST. В каждую лунку вноси, парата меченых пероксидазой хрена антимышиных антител козы ( ведении 1:2000 в PBS с 50%-ным обезжиренным молоком и 0,05%

ш по 100 мкл пре-«Stressgen») в раз-ween 20. Планше-

ты инкубировали 1 час при перемешивании при комнатной темпер пуре. Отмывку от

несвязавшихся конъюгатов пероксидазы с антителами проводили Р тем для развития цветной реакции в лунки планшетов вносили 100 страта (0,5 мг/мл ABTS («Sigma») и 0,1% Н202 в 0,1 М цитратнс Н202 добавляли непосредственно перед инкубацией) и инкубировали 45 мин в темноте при встряхивании, при 37°С. Реакцию останавливали внесением в лунки 100 мкл 1% раствора ДСН. Результаты учитывали, измеряя оптическую пл волны 405 нм на многоканальном спектрофотометре «Multiscan» Е)

Статистическую обработку результатов проводили с помоиью программных продуктов «OriginLab Origin 7.0» и «Microsoft Excel 2003». Досто ных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia

На начальном этапе работы необходимо было получить препарат нативной ас-

парагиназы в количестве достаточном для проведения последую! фермента полиэтиленгликолем и определения стабильности и цит

с разведения 1:2.

3ST шесть раз. За-мкл раствора суб-м буфере, pH 4,0;

угность при длине

верность получен-

carotovora.

;цей модификации ^токсичности пре-

паратов пегилированного белка. Для получения бесклеточного экстракта, использова-

ли ультразвуковую обработку. Результаты очистки фермента преде Аспарагиназная активность в бесклеточном экстракте составляла 2 ответствует 7-8% активного фермента от общего количества бель щем центрифугировании, вероятно, вследствие адсорбции Ь-аспа разрушенных клеток, терялось 15-20% ферментативной активност стадии происходило и удаление почти 50% балластных белков. Так:

тавлены в табл. 1. 9,8 МЕ/мг, что со-а. При последую-рагиназы осадком л, однако, на этой ш образом, выход

фермента был достаточно высоким (более 80%). Нанесение растворимой фракции бесклеточного субстрата на 8Р-Сефарозу при рН 5,5 позволило избавиться от основной массы балластных белков. Значение р1 рекомбинантной аспарагиназы, равно 8,5, что соответствует р1 фермента дикого штамма Ег\м сагокпюга (8,5-8,7 (Соколов и др., 2000)), поэтому более 95% аспарагиназы Егл>. сагоюхюга, нанесенной на сильный ка-тионообменник БР-Сефарозу при рН 5,5, связывается с сорбентом, а большинство белков Е. соП, имеющих р1 в кислой области рН, обнаруживается в элюате (рис.1, треки 2 и 3). После промывки сорбента низкосолевым фосфатным буфером с рН 5,5 аспарагиназу элюировали линейным градиентом КС1. Хроматографическая очистка позволила получить фермент с удельной активностью 390 МЕ/мг, что в 13,1 раз превышает значение исходной активности.

Таблица 1. Очистка рекомбинантной Ь-аспарагиназы ЕтШа саго1о\>ога

Этап очистки Общий белок (мг) Активность аспарагиназы Выход, (%) Степень очистки (раз)

Общая, (МЕ) Удельная (МЕ/мг)

Бесклеточный экстракт 2432 72490 29,8 100 1

Растворимая фракция бесклеточного экстракта 897 59080 65,9 81,5 2,2

Хроматография на БР- Сефарозе 139 52150 375,2 71,9 12,6

Обессоливание и концентрирование 130 50700 390 69,9 13,1

Погрешность измерений составляет не более 20%

На заключительном этапе выделения препарат Ь-аспарагиназы необходимо было обессолить и сконцентрировать. Для концентрирования белка идеально подходит метод с использованием ультрафильтрационных мембран. При его применении можно не только успешно проводить процедуру концентрирования аспарагиназы, но и одновременно освобождаться от низкомолекулярных примесных белков. После концентрирования объединенных фракций фермента, аспарагиназная активность практически не изменялась. Проблема обессоливания и одновременно смены буфера для лиофилизации была успешно решена путем гель-фильтрации концентрированного образца на колонках РОЮ с Сефадекс 0-25. Электрофоретическая картина образцов, после гель-фильтрации мало отличалась от таковой после ионообменной хрома-

тографии, Электрофоретичсский анализ очищенного препарата аспаракииазы в 12,5% полиакрил а ми дном геле имеет один главный компонент с молекулярной массой 34 кДа (рис I, треки 4-6), что свидетельствует о более чем 90%-ной гомогенности выделенного фермента. Также наблюдаются минорные компоненты с Mr 15 и 30 кДа (обозначены стрелками на рис. ]), которые присутствуют и п препарате ас па ратин азы Ег-winia ф/yzanlhemi («Sigma») (рис 1, трек 7).

масса (Да

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 1, Элею рофоретичесще разделение в 12,5% ПААГ/ДСН препаратов L-аспарагиназы на разных этапах очистки. 1 - бесклеточный экстракт; 2 - растворимая фракция бес клеточного экстракта; 3 - проскок; 4, 5, 6 - очищенные препараты аспарагппачы соответственно 20 мкг, 10 мкт, 3 мкг; 7 - 1 -аспарг.гиказа Erw. Chrysanthemi 5 мкг; 8 - маркер молекулярного веса.

Ингибиторы протеаз в процессе выделения не использовали, так как спи являются пысокогокшчными соединениями и их присутствие недопустимо в препарате, предназначенном для терапевтического применения. Лиофилизацию белка проводили без каких-либо добавок и через 6 месяцев хранения при -20°С препарат сохранял 85% исходной активности. Причиной такой стабильности фермента, вероятно, является его высокая степень очистки.

Получение пегмлнреванноЙ рекомбинантнйй L-aenàpагиназы Erwinta carotovoTit и оптимизация процесса модификации,

Согласно литературным данным (Roberls el al., 2002) процесс коныогировапия белка с mPEG-pNP зависит от множества условий протекания реакции, таких как pl-1 и ионная сила реакционного буфера, молярное соотношение бело к/mPEG-pNP, темпе-

ратура и время инкубации, интенсивность перемешивания реакционной смеси и т.д. Тем не менее, за исключением работы (Хюгщ е! Ш., 2005), систематизированные данные по оптимизации пегияированйЯ белков практически отсутствуют. Известно, что реакция связывания тРРО-рЫР е протеинам протекает при р11 8,3-9,5. В связи с относительно низкой реакционной способностью тРЕО-рИР выбор рН был остановлен па значении 9,5. В щелочном диапазоне рН депротонироваппые е-аминогруппы лизино-вых остатков фермента ковалентно связываются с карбонатной группой активированного м11ЭГ с образованием конъюгата м1ГЛ'-фермент.

11а начальном этане исследования было проведено три реакции, отличавшиеся количеством активированного мПЭГ рроизводногр! Для этого к раствору аспарагипазы добавляли тР[Ю-р1ЧР в 1,5, 3,0 н 4,5 - кратных молярных избытках и проводили реакцию I) течение 24 часов при 22"С, С нелыо качественного определения степени йегилирования выполняли эне^грофорсти чески й анализ образцов реакционной смеси в 10% ПААГ/ДСП.

нпп

1

1 2 3 4 5

Рис. 2, Электрофоретический анализ в [0% ПДЛГ7ДС11 препарата ЕСАНЬАЫЗ, инкубировавшегося к течение 24 часов с тРЕО-рЫР. 1 - нагивная ЕСАЕШ-АЫ5; 2 - маркер молекулярного веса 14, 20, 30, 45, 90 кДа; 3-5 конъщгаты шРЕВ-рЫ 1'/ЕС АР!._ЬАN5 в молярном со-ЙгЫошении соответственно 1,5:1,3:1 и 4.5; 1

Результаты электрофореза, представленного па рис.2, свидетельствуют об эффективной модификации препарата аспараги и азы с помощью тРЕС-рКР. Даже при 1,5-кратйом молярном соотношении гпРЕО-рМР/ЕСАК_1«АМЗ наблюдается полная модификация рекомбииантпой аспарагиназы (рис. 2, трек 3), что подтверждается отсутствием на дагектрофореграмме полосы, соответствующей ЕС.АК I. Как шдно

из рис.3, Л, наблюдается прямая зависимость активности пеги л и рованного белка от количества модифицирующего реагента. Так при молярном Соотношений тРЕО-р^/ЕС АН-ГАМ 8 4,5/1 сохраняется почти 60% удельной активности ас параш пазы. Это, по-видимому, обусловлено стабилизацией тетрамерной структуры конъюгиро-ванного фермента, которая быстрее достигается при использований высоких концентраций ПЭГ.

В процессе эксперимента также было установлено, что помимо Прямой зависимости от соотношения количеств реагирующих веществ активность фермента находится в обратной зависимости от продолжи тельности инкубации с ПЭГ. Как видно из рис.3, Б, лаже в молярном соотношении тР ЕШурЫ Р/ ГС Л АМ й 4,5/1 при увеличении времени инкубации активность аспарагиназы снижается.

100 ^ so

¿4

В

I 60

Ё 40 <

20 0

Рис. 3. Зависимость актин поет и пегилированной аспарагиназы от (А) молярного соотношения ifiPEG-pNP/ГСAR_LANS и (Б) времени инкубации.

Чтобы повысить эффективность дегилирования, представлялось важным выяснить причину снижения активности фермента с увеличением времени реакции. Для этого исследовали, является ли деградация аспарагиназы результатом жестких условии реакции модификации, или сама по себе ECAR_LANJ> представляет собой менее стабильный белок но сравнению с коммерческими препаратами аспарагипаз. Было проведено сравнение результатов метилирования препарата ГС A R_ LANS и применяемой в клинической практике коммерческой Г-аеиарагииазы Escherichia coli (ГеА; «Medac» Германия), К растворам асларагиназ добавляй liaPEG-pNP в 4,5 кратном молярном избытке. Реакцию метилирования проводили в боратпом буфере со сниженным значением рН равным 9,0, как при 22°С, так и 4°С, варьируя при этом

0/1 №1 3/1 4,5/1

mPE(j-pN Р/ЕС A R_L ANS. М

0 5 10 15 20 25 Время инкубации с mPEG-pNP, ч

время инкубации. Параллельно определяли активность ас пара гин азы и шш квоты реакционной смеси наносили на 12% ПЛАТ/ДСП. В качестве контроля служили пробы ЕСАЯ_ЬАЫ{3 и Меч!ас, инкубировйвшисся в тех же условиях, но в отсутствии тРЕО-рКР. Как видно из рис. 4, через 4 часа инкубации при комнатной температуре степень пегилирования обеих аспарагиназ достаточно высока и вссь белок модифицирован (рис. 4, треки 6 и 7).

масса

кДа > > г ,

165

80

17

123456789

Рис, 4. Электрофоре грамма аспарагиназ £CAR_LANS и Medac в 12% 11ААГ/ДСН после 4 часов инкубации с niPEG-pNP. I - маркер молекулярного леса («Bio-Rad»}; 2,4 и 3.5 - соответственно, натнвиые Medac н KCAR I.ANS, инкубация при 22°С и 4°С; 6,7 - соответственно, пеги ли$р ванные Medac и ЕС А R_L ANS, инкубация при 22°С; 8,9 - соответственно, пе полированные Medac н ECAR_LANS, инкубация при 4°С.

При этом у пегилировшшых ЕС А R_L ANS и Medac активность сохраняется практически в равной степени 78,8% и 82,9%. соответствен^). Для реакционных проб, инкубировавшихся при 4°С, модификация проходит не так эффективно, и в смеси присутствуют следы патин нога белка (рис. 4, треки 8 и 9). В течение 16 часов при 4°С происходила полная модификация аспарагиназ и электрофорещческая картина в 11АА17ДС11 в последующие 8 часов ме изменялась. 'Эизиматическая активность в контрольных и опытных образцах снижалась примерно в одинаковой степени и сс значения пс отличались.

Таким образом, было установлено, что ECAR I..ANS не является менее стабильным ферментом по сравнению с препаратом коммерческой аспарагипазы. Кроме того, было выявлено, что время реакции можно сократить до 4 часов, получая при этом PEO-ECAR_LAN| с 78,8% активности.

Резюмируя рассмотренные выше данные, следует отметить, что оптимальными

условиями пегилирования рекомбинантной L-аспарагиназы позволяющими получить полностью модифицированный фермент активности являются: инкубация при 22°С в течение 4-х часов в рее с рН 9,0.

Erw. carotovora, с 80% исходной кционном буфере

Физико-химическая и кинетическая характеристика модифицированной Ь-аспарагиназы ЕтШа сатоШога.

В результате исследования определен ряд физико-хим

пегилированного и нативного фермента и проведен сравнительный анализ

й Ь-аспарагиназы ;ше рН 4-10 и 7-9 в область кислых 5 и находится в ой точки может остатков лизина

лх эфиров для

полученных данных. При изоэлектрофокусировании пегилированнс Erw carotovora на колонке с амфолинами («Pharmacia») в интерв было установлено, что изоэлектрическая точка белка сдвигается значений рН по сравнению с pi нативного фермента равной 8 диапазоне значений рН 7,9±0,05. Уменьшение изоэлектрическ объясняться блокированием полиэтиленгликолем е-аминогрупп белковой молекулы аспарагиназы. В литературе упоминается о подобном изменении pi, например, при модификации антагониста рецептора интерлейкина-1 человека с использованием полиэтиленгликоля и метода активированн образования ковалентной связи (Мартюшин и др., 2000).

Установлено, что оптимум рН гидролиза L-аспарагина для Пегилированного и нативного фермента практически не отличается и находится в интервале значений рН от 7,5 до 9,0, что согласуется с известными из литературы дан химически модифицированной аспарагиназы Е. coli Оптимум ECAR_LANS лежит в диапазоне 37-55°С, а для PEG-ECAR_LA' несколько шире и составляет 37-60°С.

Кинетические параметры модифицированной аспарагиназй представлены в табл. 2, и сопоставлены с соответствующими характеристиками ECAR_LANS.

Таблица 2. Кинетические свойства ПЭГ-аспарагиназы.

Белок L-аспарагин L-r лутамин

Km, мкМ Ушах, МЕ/мг Km, МКМ Vmax, МЕ/мг

PEG-ECAR LANS 108±14 377±11 1456±115 11 ±0,3

ECAR LANS 106±18 467±18 1453±146 14±0,7

ических свойств

1ыми на примере температуры для NS этот диапазон

Рассчитанные значения Кт пещпировэнного и пативпого фермента для Р-аспарагипа и 1,-Глутамина практически не отличаются. Однако при этом отмечается понижение значения константы модифицированной а с пара гин азы.

При пегилироваши белковой молекулы для сохранения ее каталитической активности важно, чтобы аминокислоты, входящие в состав активного центра фермента, не участвовали в коиалентном связывании с П'ЗГ (КоЬег^ е1 а!., 2002).

В мономере аспарагипазы Епу. сагокпюга из 20 аминокислотных остатков лизина 14 расположены на поверхности и открыты для пегилирования, один остаток-Рук 30 находится в непосредственной близости от активного Центра ферме!.та (рис. 5).

Рис. 5. Мономер рекомбинантиой Р-аспарагипазы Егм'т'ю сагокл'от. I - остатки лизина* расположенные на поверхности фермента; 2 ■ остатки лизина, расположенные в области контакта субъединиц фермента.

Однако, вследствие того, что каталитический сайт РСЛК_РЛ1ч^ стерйчески ограничен размером молекулы глутамина, даже при связывании I укЗО с 11ЭI' можно исключить влияние полимера на связывание белка с субстратом. Оставшиеся 5 остатков лизина расположены в области контакта субъедипиц аспарагипазы■ Это означает, что при олигомеризации они окажутся внутри гетрамера. При пегнлированин е-аминогрупп данных лизшювых остатков фермент не способен образовывать тетра-

мерную структуру. Вероятно, этим и можно объяснить уменьшение величины Vn. для PEG-ECAR_LANS.

Важной характеристикой аспарагиназы с точки зрения ее ti ганизма, является отношение L-глутаминазной активности к L-acn зультате эксперимента по оценке активности аспарагиназы в othoi не выявлено значительных различий в субстратной специфичное™ фицированной аспарагиназ. Отношение глутаминазной активности для пегилированного фермента составляет 2-3%. Полученные дани результатами Monfardini с соавт. (1995) также не обнаружившими личий в субстратной специфичности, значениях К„, и Vmax между фицированной ПЭГ аспарагиназой из дикого штамма Erw. carotovo

Стабильность модифицированного фермента.

Известно, что пегилирование белков приводит к повышению воздействию денатурирующих агентов и биостабильности в орган? окружения создаваемого молекулами ПЭГ. Поэтому представляло вать устойчивость пегилированной аспарагиназы Erw. carotovora личных денатурирующих факторов.

Термодинамическую стабильность аспарагиназы оценива1т ферментативной активности в условиях повышенной и понижен:* первом случае для постановки опыта была выбрана середина тем мума ферментов, равная 45°С. Через 1 час инкубации активность н ставила 30,7%, в то время как пегилированная аспарагиназа сохран тивности (рис. 6, А). Более значительная разница между двумя выявилась в результате определения стабильности аспарагиназ при вания - оттаивания. Активность нативной аспарагиназы снижалась нению с пегилированным белком. После 50-го цикла ECAR_LANS тивности от исходного значения, а PEG-ECAR_LANS - более 70%

Таким образом, результаты опытов, представленные на рис. о том, что полученный пегилированный белок обладает повышений ской стабильностью благодаря стерической защите, создаваемой ными цепями полимера.

оксичности для ор-арагиназной. В ре-ении Г-глутамина нативной и моди-к аспарагиназной ые коррелируют с :ущественных раз-нативной и моди-■а.

их устойчивости к зме за счет микроинтерес исследо-; воздействию раз-

и по изменению ой температур. В пературного опти-ативного белка со-ила более 40% ак-формами фермента циклах заморажи-быстрее, по срав-сохранила 53% ак-рис. 6, Б).

свидетельствуют 1й термодинамиче-Аысоко гидрофиль-

О 10 20 30 40 50 60 Время инкубации, мин

0 10 20 30 40 50 Число циклов замораживания-оттаивания при -20С

Рис. 6. Зависимость активности нативной (■) и пегилированной (о) аспарагиназы от (А) времени инкубации при 45°С и (Б) числа циклов замораживания-оттаивания. (А) Аспараги-назу (0,5-0,75мг/мл) в 0,02М фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,0) инкубировали при 45°С, отбирали пробы, охлаждали до комнатной температуры и измеряли ферментативную активность. (Б) Аспарагиназу (1 мг/мл) замораживали при -20°С, затем оттаивали при 37°С, отбирали пробы и измеряли активность.

Устойчивость фермента к протеолитической деградации определяли по изменению активности аспарагиназы при инкубации с трипсином. Нативная аспарагиназа теряет половину своей активности уже через 12,5 минут инкубации (рис 7, А). В тех же условиях эксперимента пегилированный белок сохраняет более 80% своей актив- : ности. Через 1 час активность ЕСАЯ_ЬА№ составила около 13%, а РЕв-ЕСАЯ_ЬАЫ8 - 34,8%.

Известно, что каталитическое действие трипсина отличается высокой специфичностью: он гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина (Ленинджер А., 1985). Следовательно, высокая устойчивость модифицированной аспарагиназы к трипсину возможна благодаря ковалентно-му связыванию молекул ПЭГа с с-аминогруппами лизина, являющимися сайтами расщепления трипсином. Таким образом, можно предположить, что пегилированная аспарагиназа будет более устойчива по сравнению с нативным ферментом и к протеолитической деградации под действием трипсиноподобных протеаз плазмы. Чтобы это проверить, было исследовано изменение активности белка при его инкубации в присутствии плазмы крови человека. Как следует из (рис. 7, Б) через 48 часов инкубации РЕО-ЕСА11_1.А№ сохраняет в 3 раза более высокую активность по сравнению с исходным ферментом. Такое существенное различие в устойчивости к протеолизу между двумя формами аспарагиназы доказывает стабилизирующий белок эффект пе-

гилирования. Вследствие этого, модифицированная аспарагиназа более длительной циркуляции в кровяном русле человека, другими ладать большим временем полужизни.

10 20 30 40 50 Время, мин

Рис. 7. Протеолитическая стабильность нативной (■) и пегилированно при инкубации с (А) трипсином и (Б) плазмой крови человека. (А) Аспт инкубировали с трипсином (20 мкг) в 0,02 М фосфатно-солевом буфернс при 37°С; добавляли 10-кратное количество 8Т1-ингибитора и определял активность. (Б) Аспарагиназу (50 мкг) инкубировали в 400 мкл раствор мкл плазмы и равное количество фосфатно-солевого буфера (рН 7,4); о' меряли активность.

Таким образом, результаты опытов, представленные на рис.7 что пегилированная аспарагиназа Erw. carotovora обладает повыгш : ческой стабильностью по сравнению с нативным ферментом. Учип клинического применения препарата ПЭГ-аспарагиназы Erw. carota его терапевтическую эффективность.

Оценка цитотоксической активности ПЭГ-аспарагиназы in vitri

Увеличение стабильности пегилированной аспарагиназы nos: жить усиление ее цитотоксических свойств. Противоопухолевую определяли на нескольких клеточных линиях, чувствительных к асп В ходе экспериментов было установлено, что максимальна: тивная активность аспарагиназы Erw.carotovora проявляется на MOLT-4 и Raji. При концентрации фермента 2 ME/мл выживае клеток линии Raji составила не более 7%, а для клеток линии MOLfT была практически нулевой.

будет способна к словами будет об-

>й (о) аспарагиназы [рагиназу (150 мкг) м растворе (pH 7,4) и ферментативную î, содержащего 200 т бирали пробы и из-

указывают на то, иной протеолити-ывая перспективу vora, это повысит

:воляет предполо-^ктивность in vitro арагиназе. я антипролифера-:леточных линиях мость опухолевых -4 выживаемость

Как видно из рис. 8, пегилированная аспарагиназа обладает более выраженной противоопухолевой активностью, по сравнению с исходным белком. Значение ЬС50 для клеток 11ар составило 0,4 МЕ/мл и 0,3 МЕ/мл для нативного и модифицированного фермента, соответственно. Для клеток МОЬТ-4 величина ЬС50 оказалась равной 1,1 МЕ/мл для ЕСАЯ_ЬАЫ8 и 0,8 МЕ/мл для РЕС-ЕСАРМ^А^. Другими словами, значение ЬС50 пегилированной аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже по сравнению с ЬС50 исходного фермента.

Аспарагиназа, МЕ/мл Аспарагиназа, МЕ/мл

Рис. 8. Цитотоксическая активность нативной (■) и пегилированной (о) аспарагиназы для лимфобластной Т-клеточной лимфомы MOLT-4 (А) и лимфомы Беркигга Raji (Б).

Таким образом, пегилирование аспарагиназы привело к повышению цитоток-сической активности фермента, что можно объяснить повышением ее стабильности по отношению к действию клеточных протеаз.

Следует отметить, что полученный модифицированный белок, также как и на- ! тивный, не является токсичным для нормальных клеток. В опытах на эмбриональных фибробластах человека показано, что рост клеток в присутствии аспарагиназы практически не изменяется, выживаемость клеток не менее 90-95%.

Характеристика иммуногенности пегилированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.

На заключительном этапе работы был проведен сравнительный анализ иммуногенности препаратов исходной и модифицированной аспарагиназ Erw. carotovora. С помощью прямого твердофазного ИФА определяли титр антител в сыворотках, полученных в результате иммунизации мышей нативной и пегилированной аспарагиназой.

За титр принимали точку перегиба кривой, полученной апт роксимацией данных нескольких независимых экспериментов полиномом 5-й степени. Установлено, что титры антисывороток составляют 128 - для ЕСАЯ_ЬАЫ8 и 16 - для РЕО-ЕСАЯ_1.АШ (рис. 9).

Таким образом, пегилирование аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообразования. Подобный эффект модификации на выработку антител описан во многих работах (КаишаЫ е1 а!., 1981; Kawamura е1 а1., 19155).

4 8 16 32 64 128

1/разведение сыворотки

Рис. 9. Сравнительная оценка иммуногенности нативной (■) и пегил^рованной (о) аспарагиназы. Ж-отрицательный контроль

фор]

Можно сделать вывод о том, что применение пегилированной ной Ь-аспарагиназы Еп\> сагоЮхюга аспарагиназы будет более связи с ее в значительной степени уменьшенной иммуногенностью

мы рекомбинант-йредпочтительно в

выводы

1. Впервые получена модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинант-ная аспарагиназа Erw. carotovora Разработанный метод пегилирования с использованием в качестве модифицирующего реагента метоксиполиэти-ленгликоль-я-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой 5000 позволяет сохранить около 80% активности модифицированного фермента.

2. Установлено, что пегилированная аспарагиназа обладает более высокой ста-

I

бильностью к протеолизу под действием трипсина и трипсиноподобных j протеаз плазмы крови, а также к воздействию температуры по сравнению с \ нативным ферментом.

3. В опытах in vitro показано, что модифицированная рекомбинантная аспара- j гиназа Erw. carotovora проявляет более высокую противоопухолевую активность в отношении клеток линий MOLT-4 и Raji, по сравнению с нативным ферментом. Значение LC50 пегилированной аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже ЬС50 немодифицированного фермента.

4. В опытах на лабораторных животных установлено, что препарат пегилированной аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообра-зования по сравнению с нативным ферментом и, таким образом, обладает

I

пониженной иммуногенностью. I

5. Полученные в ходе изучения пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erwinta carotovora результаты - повышение устойчивости к протеолизу и температурному воздействию, снижение иммуногенности и высокая противоопухолевая активность позволяют рассматривать модифицированный фермент в качестве перспективной основы для создания лекарственного препарата, более эффективного по сравнению с нативной аспарагиназой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Linnea Е. К. Wikman, Julya Krasotkina, Anastasia Kuc Sokolov and Anastassios C. Papageorgiou. Crystallizat crystallographic analysis of L-asparaginase from Erwinia Crystallographies - 2005. - Vol. 61(Pt 4). - P. 407-409.

lumova, Nikolay N. on and preliminary carotovora. // Acta

2 A.B. Кучумова, Ю.В. Красоткина, П.З. Хасигов Пегилирование рекомбинантной аспарагиназы Bf полиэтиленгликолем 5000. // Биомедицинская химия С. 107-111.

H.H. Соколов. rwinia carotovora 2007. - Т. 53(1). -

3. Ю.В. Красоткина, О.Ю. Абакумова, О.В. Подобед, С Кучумова, H.H. Соколов. Цитостатическая активность аспарагиназы Erwinia carotovora. // Сборник докл практической конференции «Актуальные проблё: биотехнологии». - Анапа. - 2005. - С. 2.

VI. Медников, A.B. рекомбинантной L-адов II научно -мы медицинской

4. Ю.В. Красоткина, О.Ю. Абакумова, О.В. Подобед, С Кучумова, H.H. Соколов. Влияние стабильное^ аспарагиназы Erwinia carotovora на ее противоопухол vitro. II Сборник докладов И научно - практиче «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» С. 3.

5. A.B. Кучумова, Ю.В. Красоткина, H.H. Соколе аспарагиназы Erwinia carotovora повышает стабильн Сборник трудов международной конференции «<t>yHflai биотехнологии и медицине». - Новосибирск. - 2006. - С.

6. Ю.В. Красоткина, A.B. Кучумова, H.H. Соколов активность аспарагиназы зависит от ее глутаминазн Материалы Всеукраинской научно-практической международным участием «Молекулярные основы и кли резистентности к лекарственным средствам». - Киев. - 2

Vi. Медников, A.B. и бактериальной вую активность in ской конференции Анапа. - 2005. -

в. Пегилирование ость фермента. // [ентальные науки -21.

Цитотоксическая эй специфичности.

конференции с нические проблемы 306.-С. 31.

7. Ю.В. Красоткина, A.B. Кучумова, H.H. Соколов. Моделирование каталитических свойств рекомбинантной L-аспарагиназы Erwtnia carotovora \ с целью создания эффективного противолейкозного препарата. Сборник трудов 4-го съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова - Пущино. - 2006. - С. 23. !

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта №2828 Международного научно-технического центра (США), и гранта № 06-04-49792 Российского фонда фундаментальных исследований.

Список сокращений

ДСН - додецилсульфат натрия \

ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактониранозид ИФА - иммуноферментный анализ

мПЭГ - монометиловый эфир полиэтиленгликоля !

МТТ-3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид ;

ПААГ/ДСН - полиакриламидный гель с добавлением додецилсульфата натрия ПЭГ - полиэтиленгликоль

ABTS - 2,2-азино-бис-[3-этилбензотиазол-6-сульфонат]-аммония

ECAR_LANS - рекомбинантная L-аспарагиназа Erw carotovora

Medac - коммерческий препарат L-аспарагиназы Е coli

mPEG-pNP - метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонат

PEG-ECAR_LANS- модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинантная

L-аспарагиназа Erw carotovora i

pl - изоэлектрическая точка

Заказ № 120/02/07 Подписано в печать 21.02 2007 Тираж 80 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 \х 'Л www.cfr.ru ; е-таИ:'ш/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кучумова, Анастасия Владимировна

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Бактериальные аспарагиназы и их свойства.

1.1.1. Распространение и противоопухолевая активность.

1.1.2. Механизм ферментативной реакции.

1.1.3. Физико-химическая характеристика бактериальных L-аспарагиназ.

1.1.4. Свойства терапевтически значимых L-аспарагиназ.

1.2. Бактериальные аспарагиназы как противоопухолевые препараты, проблемы и перспективы их применения.

1.3. Модификация белков полиэтиленгликолем.

1.3.1. Пегилирование и его преимущества.

1.3.2.Структура и свойства полиэтиленгликоля.

1.3.3. Биохимия пегилирования.

1.3.4. Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков.

1.3.5. Влияние пегилирования на фармакокинетические и фармакодинамические свойства белка.

2. Материалы и методы.

2.1. Экспрессия рекомбинантной L-аспарагиназы и ее выделение.

2.1.1. Культивирование штамма-продуцента и экспрессия фермента.

2.1.2. Очистка и выделение L-аспарагиназы.

2.2. Физико-химическая и кинетическая характеристика белка.

2.2.1 .Электрофорез в ПААГ/ДСН геле.

2.2.2. Изоэлектрофокусирование.

2.2.3. Определение аспарагиназной активности.

2.2.4.0пределение концентрации белка.

2.2.5. Определение кинетических параметров аспарагиназы.

2.3. Модификация аспарагиназы производными полиэтиленгликоля.

2.3.1.Модификация белка 2,4-бис (о-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-Б-триазином.

2.3.2. Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонатом.

2.3.3. Масс-спектрометрический анализ.

2.4. Определение цитотоксической активности аспарагиназы in vitro.

2.5. Определение иммуногенности аспарагиназы.

2.5.1. Получение специфических поликлональных антител.

2.5.2. Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

З.Результаты и обсуждение.

3.1. Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы

Erwinia carotovora.

3.2. Подбор модифицирующего реагента.

3.2.1. Получение 2,4-бис (О-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-Б-триазина.

3.2.2. Получение метоксиполиэтиленгликоль- п-нитрофенилкарбоната.

3.3. Получение пегилированной рекомбинантной L-аспарагиназы

Erwinia carotovora и оптимизация процесса модификации.

3.4. Физико-химическая и кинетическая характеристика модифицированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.

3.5. Стабильность модифицированного фермента.

3.7. Оценка цитотоксической активности ПЭГ-аспарагиназы in vitro.

3.6. Характеристика иммуногенности пегилированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.

4. Выводы.

5.Литератур а.

Список сокращений

АГ - аспарагиназа-глутаминаза

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОНВ - 6-диазо-5-оксо-Ь-норвалин

ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

ИФА - иммуноферментный анализ мПЭГ - монометиловый эфир полиэтиленгликоля

МТТ- 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ПАА - полиакриламид

ПААГ/ДСН - полиакриламидный гель с добавлением додецилсульфата натрия

ПЭГ - полиэтиленгликоль ТХУ - трихлоруксусная кислота

ABTS - 2,2-азино-бис-[3-этилбензотиазол-6-сульфонат]-аммония ECARJLANS - рекомбинантная L-аспарагиназа Erw. carotovora ErA - L-аспарагиназа Erw. crysanthemi EcA2 - L-аспарагиназа E.coli

Medac - коммерческий препарат L-аспарагиназы E. coli mPEG-pNP - метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонат PEG-ECARJLANS- модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинантная L-аспарагиназа Erw. carotovora pi - изоэлектрическая точка

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств"

Биологические катализаторы, каковыми являются ферменты, обладают чрезвычайно высокой специфичностью и мощным каталитическим воздействием на различные стороны метаболизма в организме. Поэтому они представляют собой уникальные лекарственные средства, используемые в медицине для лечения заболеваний различной этиологии [43,34].

Бактериальная L-аспарагиназа (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3.5.1.1), являющаяся представителем ферментов класса треониновых амидо-гидролаз, катализирует превращение L-аспарагина до L-аспарагиновой кислоты и аммиака. Длительное время бактериальные аспарагиназы применяются в онкологической практике при комбинированной химиотерапии различных видов лейкозов. В последние годы появились сообщения о положительном эффекте аспарагиназы при лечении болезни Ходжкина, хронической лимфоцитарной лейкемии и меланосаркомы [78,53,89].

Механизм противоопухолевого действия аспарагиназы заключается в расщеплении аминокислоты аспарагин, находящейся во внеклеточном пространстве. Для опухолевых лимфобластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой в клетку извне нарушается синтез белков и клетка становится неспособной к дальнейшему делению. Таким образом, реализация цитотоксичности аспарагиназы не подразумевает контакта или проникновения активного вещества в опухолевую клетку, что принципиально отличает этот фермент по механизму действия от других ци-тостатиков [121].

Сниженная или полностью отсутствующая активность аспарагинсин-тетазы - фермента, синтезирующего L-аспарагин, является отличительной чертой не только лейкемических лимфобластов, но и миелобластов, и целого ряда клеток других опухолей. Большинство здоровых, в том числе гемо-поэтических, клеток способно синтезировать собственный аспарагин. Это определяет вторую, крайне важную характеристику фермента, а именно минимальное миелотоксическое действие.

Целый ряд аспарагиназ из различных бактериальных штаммов обладает противоопухолевым действием. Так противолейкозную активность проявляют L-аспарагиназы Escherichia coli, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Vibrio succinogenes, Proteus vulgaris и некоторые другие. Однако использование препаратов аспарагиназы в противоопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами, поэтому только два наименее токсичных фермента, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coli (ЕсА2) и Erwinia chrysanthemi (ErA), нашли применение в онкотерапии [25]. Причем, наименее токсичными признаны препараты, полученные из Erwinia chrysanthemi, что указывает на важность исследования аспарагиназ рода Erwinia. Тем не менее, даже аспарагиназы штаммов Erwinia вызывают развитие иммунологической гиперчувствительности к L-аспарагиназе, проявляющееся в диапазоне от слабых аллергических реакций до анафилактического шока [72]. Помимо этого, эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена довольно низкой стабильностью фермента в физиологических условиях.

Таким образом, актуальным является получение модифицированных форм L-аспарагиназ штаммов Erwinia устойчивых к протеолитической деградации в крови, обладающих низкой иммунологической активностью при сохранении высокой ферментативной активности.

В настоящее время существует ряд различных методов модификации терапевтически значимых ферментов. Одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.н. пегилирование [97]. Она заключается в физико-химической трансформации, достигаемой соединением нативной молекулы белка с ПЭГ. Применение этого метода позволяет значительно повысить терапевтическую эффективность фармакологических препаратов пептидной структуры.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в получении модифицированной полиэтилен гликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, обладающей повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. модификация полиэтиленгликолем L-аспарагиназы Erw. carotovora и оптимизация процесса пегилирования;

2. детальная характеристика физико-химических свойств пегилированной L-аспарагиназы Erw. carotovora (pi, каталитические параметры, термодинамическая стабильность);

3. определение цитотоксичности пегилированной аспарагиназы на чувствительных к ней клетках лейкоза человека;

4. оценка иммуногенности модифицированной полиэтиленгликолем аспарагиназы Erw. carotovora.

Научная новизна работы

Впервые в качестве объекта для получения пегилированной формы аспарагиназы использован генно-инженерный фермент Erw. carotovora, на основе которого в настоящее время в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ НИИ БМХ РАМН проводятся работы по созданию отечественного лекарственного препарата рекомбинантной аспарагиназы.

В настоящем исследовании впервые разработана и оптимизирована методика модификации полиэтиленгликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora. Получены экспериментальные данные для пегилированной формы рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora о ее физико-химических и каталитических свойствах, иммуногенности и цитотоксичес-ком действии на опухолевые клетки различных линий.

Показано, что модифицированная аспарагиназа оказывает более выраженное цитотоксическое действие на опухолевые клетки лимфобластной Т-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта по сравнению с нативным ферментом. Выявлено возрастание устойчивости пегилированной аспарагиназы к протеолизу и повышение термостабильности по сравнению с исходным белком. Установлено, что пегилированная форма рекомбинантной L-acnapa-гиназы Erw. carotovora обладает пониженной иммуногенностью.

Практическая значимость исследования

В настоящее время в клинической практике используется лишь единственный пегилированный препарат бактериальной аспарагиназы - «Онкас-пар», получаемый на основе фермента Е. coli. Наличие нескольких препаратов аспарагиназ со сниженной иммуногенностью позволит проводить заместительную терапию различных видов лейкозов у пациентов, в особенности детей, обладающих повышенной аллергенностью к существующим препаратам бактериальных аспарагиназ. В этом отношении не вызывает сомнения высокая практическая значимость получения пегилированной формы аспарагиназы Erw. carotovora.

Результаты данной работы могут быть использованы в качестве основы для создания нового лекарственного препарата пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora для лечения ряда форм лейкозов, и в первую очередь острого лимфобластного лейкоза.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих конференциях: II научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярные основы и клинические проблемы резистентности к лекарственным средствам» (Киев, 2006). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 21 декабря 2006 года.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7-и глав раздела «Результаты исследования и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 122 источника. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кучумова, Анастасия Владимировна

Выводы

1. Впервые получена модифицированная полиэтиленгликолем ре-комбинантная аспарагиназа Erw. carotovora. Разработанный метод пегилирования с использованием в качестве модифицирующего реагента метоксиполиэтиленгликоль-я-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой 5000 позволяет сохранить около 80% активности модифицированного фермента.

2. Установлено, что пегилированная аспарагиназа обладает более высокой стабильностью к протеолизу под действием трипсина и трип-синоподобных протеаз плазмы крови, а также к воздействию температуры по сравнению с нативным ферментом.

3. В опытах in vitro показано, что модифицированная рекомбинантная аспарагиназа Erw.carotovora проявляет более высокую противоопухолевую активность в отношении клеток линий MOLT-4 и Raji, по сравнению с нативным ферментом. Значение LC50 пегилированной аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже LC50 немодифицированного фермента.

4. В опытах на лабораторных животных установлено, что препарат пегилированной аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообразования по сравнению с нативным ферментом и, таким образом, обладает пониженной иммуногенностью.

5. Полученные в ходе изучения пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora результаты - повышение устойчивости к протеолизу и температурному воздействию, снижение иммуногенности и высокая противоопухолевая активность позволяют рассматривать модифицированный фермент в качестве перспективной основы для создания лекарственного препарата, более эффективного по сравнению с нативной аспарагиназой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кучумова, Анастасия Владимировна, Москва

1. Abuchowski A., Palczuk N.C., Davis F. F. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - P. 3578-3581.

2. Adams G.D., Ramsay J.R. Optimizing the lyophilization cycle and the consequences of collapse on the pharmaceutical acceptability of Erwinia L-asparaginase.//J. Pharm. Sci.- 1996. V. 85 (12).-P. 1301-1305.

3. Aghaiypour K., Wlodawer A, Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase. // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 5655-5664

4. Aslanian A.M., Fletcher B.S., Kilberg M.S. // J. Biochem. 2001. - V. 357. -P. 321-328.

5. Bagert U., Rohm K.H. On the role of histidine and tyrosine residues in E. coli asparaginase. Chemical modification and lH-nuclear magnetic resonance studies. // Biochem. Biophys. Acta. 1989. - V. 999. - P. 36-41.

6. Barbara M., Martins A.F., Cruz M. Biochemical characterization of an L-asparaginase bioconjugate. // Bioconjugate Chem. 1995. - V. 7. -P. 430-435.

7. Billett A.L., Carls A., Gelber R.D. et al. Allergic reactions to Erwinia asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia who had previous allergic reactions to Escherichia coli asparaginase. // Cancer. 1992. - V. 70.-P. 201-206.

8. Burnham N.L. Polymers for delivering peptides and proteins. // Am. J.Hosp.Pharm. 1994. - V .51 (2). - P. 210-218.

9. Cammack K.A., Marlborough D.I., Miller D.S. Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora // Biochem J. 1972. - V. 126 (2). - P. 361-79.

10. Cao L. Immobilised enzymes: science or art? // Current Opinion in Chemical Biology. 2005. - V. 9. - P. 217-226.

11. Carter M.C., Meyerhoff M.E. Instability of succinyl ester linkages in 02-monosuccinyl cyclic AMP-protein conjugates at neutral pH. // J. Immunol. Methods. 1985. - V. 81. - P. 245-257.

12. Carlsson, H., Stockelberg, D., Tengborn, L., Braide, I., Carneskog, J. and Kutti, J. // Eur. J. Haematol. 1995. - V. 55. - P. 289-293.

13. Chabner B.A. Cancer Chemotherapy: Principles and practice. // Chabner B.A. and Collins J.M. eds. Philadelphia. Lippincote. - 1990. - P. 545.

14. Clavell L.A., Gelber R.D., Cohen H.J. et al. Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. // N. Engl. J. Med. 1986. - V. 315 (11). - P. 657-663.

15. Clark R. et al. Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 21969-21977.

16. Davis F.F. The origin of pegnology. // Advanced Drug Delivery Reviews. -2002.-V. 54.-P. 457-458.

17. Derst C., Henseling J., Rohm K.H. Probing the role of threonine and serine residues of E. coli asparaginase II by site-specific mutagenesis. // Protein Eng. 1992.-V. 5.-P. 785-789.

18. Derst C., Henseling J., Rohm KH. Engeneering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase II. Selective reduction of glutamiase activity by amino acid replacements at position 248. // Protein Science. 2000. - V. 9 (10).-P. 2009-2017.

19. DeSantis G., Jones J.B. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality. // Current Opinion in Biotechnology. 1999. - V. 10. -P. 324-330.

20. DoIence E.K., Tsang C. Hu, R, Sanders C.G., Osaki S. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces. // 1997. US Patent 5,650,234.

21. Duval M., Suciu S., Ferster A., Rialland X., Nelken В., Lutz P., Benoit Y., Robert A., Manel A.M., Vilmer E., Otten J., Philippe N. // Blood. 2002. -V. 99.-P. 2734-2739.

22. Eden O.B., Shaw M.P., Lilleyman J.S., Richards S. Non-randomised study comparing toxicity of Escherichia coli and Erwinia asparaginase in children with leukaemia. // Med Pediatr Oncol. 1990. - V. 18 (6). - P. 497-502.

23. Esposito P., Barbero L., Caccia P., Caliceti P., D'Antonio M., Piquet G, Veronese F.M. PEGylation of growth hormone-releasing hormone (GRF) analogues. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. - V. 55. - P. 1279— 1291.

24. Feinberg W.M., Swenson M.R. Cerebrovascular complications of L-asparaginase therapy. // Neurology. 1988. - V. 38. - P. 127-133.

25. Fernandes A., G. Gregoriadis. The effect of polysialation on the immunogencity of asparaginase. // Int. J. Pharm. 2001. - V. 217 (1-2). - P. 215-224.

26. Fiere D., Danaila C. Treatment of acute lymphoid leukemia in adults // Rev. Prat.- 1996.-V. 46.-P. 55-61.

27. Frokjaer S., Otzen D.E. Protein drug stability: a formulation challenge. // Nature Reviews / Drug Discovery. 2005. - V. 4. - P 298-306.|

28. Froncois J., Fortier G. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. - V. 23. - P. 221-226.

29. Goldberg D.M. Enzymes as agents for the treatment of disease. // Clin. Chim. Acta. 1992. - V. 206. - P. 45-76.

30. Goodson R.J., Katre N.V. Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site. // Biotechnology. 1990. - V. 8. - P. 343-346.

31. Goward C.R., Tattersall R., Atkinson T. Bioseparation. 1992. V. 2 (6). P. 335-341.

32. Graham M.L. Pegaspargase: a review of clinical studies. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. - V. 55. - P. 1293-1302.

33. Gregoriadis G., Fernandes A., Mital M., McCormack B. Polysialic acids. // Cell. Mol. Life. Sci. 2000. - V. 57. - P. 1964-1969.

34. Haskell C.M. // ed. Cancer Treatment 3 rd ed. Philadelphia: W.B Saunders Co. 1980.-P. 130.

35. Harris J.M., Chess R.B. Effect of pegylation on pharmaceuticals. // Nature Reviews / Drug Discovery. 2003. - V. 2. - P. 214-221.

36. Harris J.M., Martin N.E., Modi M. Pegylation. // Clin Pharmacokinet. -2001.-V. 40 (7). P. 539-551.

37. Hartree E.F. // Anal. Biochem. 1991. - V. 192. - P. 215-218.

38. Holcenberg J.S. Enzyme therapy: problems and solutions. // Ann. Rev. Biochem. 1982. - V. 51. - P. 795-812.

39. Howard J.B., Carpenter F.H. L-asparaginase from Erwinia carotovora. Substrate specificity and enzymatic properties. // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247.-P. 1020-1030.

40. Hubeek et al. In vitro sensitivity and cross-resistance to deoxynucleoside analogs in childhood acute leukemia. // Haematologica / the hematology journal.-2006.-V. 91 (l).-P. 17-23.

41. Jameel F, Bogner R, Mauri F, Kalonia D. Investigation of physicochemical changes to L-asparaginase during freeze-thaw cycling. // J Pharm Pharmacol. 1997. - V. 49 (5). - P. 472-477.

42. Kamisaki Y., Wada H., InadaY. Reduction in immunogenicity and clearance rate of Escherichia coli L-Asparaginase by modification with monomethoxypolyethylene glycol. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1981. - V. 216. - P. 410-414.

43. Kawamura K., et al. // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1985. - V. 764. -P. 324-330.

44. Kantarjian H.M. Adult acute lymphocytic leukemia: critical review of current knowledge // Am. J. Med. 1994. - V. 97. - P. 176-184.

45. Kitto G.B., Smith G., Theit Т.О. et al. Tumor inhibitory and non-inhibitory L-asparaginase from Ps. Geniculata. // J. Bacteriol. 1979. - V. 137 (1). - P. 204-212.

46. Kodera Y., Sekine Т., Inada Y. Stabilization of L-asparaginase modified with comb-shaped poly (ethylene glycol) derivatives, in vivo and in vitro. // Bioconjugate Chem. 1994. - V. 5 (4). - P. 283-286.

47. Kodera Y., Tanaka H., Matsushima A., Inada Y. Chemical modification of L-asparaginase with a comb-shaped polyethylene glycol derivative and maleic anhydride. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 184. -P. 144-148.

48. Kogan T.P. The synthesis of substituted methoxy-poly(ethylene glycol) derivatives suitable for selective protein modification. // Synth. Commun. -1992.-V. 22.-P. 2417-2424.

49. Krasotkina J., Borisova A., Gervaziev Y., Sokolov N. One step purification and kinetic properties of the recombinant L-asparaginase from Erwinia carotovora. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2004. - V. 39 (2). - P.215-221.

50. Laboureur P., Langlois C., Labrousse M. et al. L-asparaginases d' Escherichia coli. 1. Proprietes des formes natives. // Biochimie. 1971. - V. 53 (11/12).-P. 1147-1156.

51. Lubkowski J., Wlodawer A., Ammon H.L., Copeland T.D., Swain A.L. Structural characterization of Pseudomonas 7 A glutaminase-asparaginase // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 10257-10265.

52. Lee S.M., Wroble М.Н., Ross J.T. Large-scale recovery and purification of L-asparaginase from Erwinia carotovora. II Appl. Biochem. Biotechnol. -1986.-V. 12.-P. 229-246.

53. Lee S.M., Wroble M.H., Ross J.T. L-asparaginase from Erwinia carotovora. An improved recovery and purification process using affinity chromatography. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1989. - V. 1. - P. 1-11.

54. Martins M., Jorge J., Cruz M. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. // Biochimie. 1990. - V.72. - P. 671-675.

55. Mateo, C. et al. Removal of amphipathic epitopes from genetically-engineered antibodies: production of modified immmunoglobulins with reduced immunogenicity. // Hybridoma. 2000. - V. 19. - P. 436-471.

56. Meister A., Levintow L., Greenfield R.E., Abendschein P.A. Hidrolysis and transfer reaction catalyzed by omega-amidase preparation // J. Biol. Chem. -1955.-V. 215.-P. 441-447.

57. Mehvar R. Modulation of the pharmacokinetics and pharmacodynamics pf proteins by polyethylene glycol conjugation. // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. -2000.-V. 3(1).-P. 125-136.

58. Miron Т., Wilchek M. A simplified method for the preparation of succinimidyl carbonates polyethylene glycol for coupling to proteins. // Bioconjug. Chem. 1993. - V. 4. - P. 568-569.

59. Molineux G. Pegylation: Engineering improved biopharmaceuticals for oncology. // Pharmacotherapy. 2003. - V. 23 (8 Pt 2). - P. 3S-8S.

60. Monfardini С, Harris J.M., Veronese F.M. A branched monomethoxypoly(ethylene glycol) for protein modification. // Bioconjugate Chem. 1995. - V. 6. - P. 62-69.

61. Moreadith R.W., Collen D. Clinical development of PEGylated recombinant staphylokinase (PEG-Sak) for bolus thrombolytic treatment of patients with acute myocardial infarction. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. -V. 55.-P. 1337-1345.

62. Morpurgo M., Veronese F.M., Kachensky D., Harris J.M. Preparation and characterization of poIy(ethylene glycol) vinyl sulfone. // Bioconjug. Chem. 1996. -V. 7.-P. 363-368.

63. Muller H.J., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1998. - V. 28. - P. 97-113.

64. Nektar Catalog. 2005-2006. - P. 30.

65. Palm G.J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Rohm K.H., Wlodawer A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: crystal structure of a Thr-89-Val mutant // FEBS Lett. 1996. - V. 390. - P. 211-216.

66. Pasut G., Guiotto A., Veronese F.M. Protein, peptid and non-peptide drug PEGylation for therapeutic application. // Expert Opin. Ther. Patents. -2004.-V. 14 (6).-P. 859-894.

67. Pritsa A.A., Papazisis K.T., Kortsaris A.H., Geromichalos G.D., Kyriakidis D.A. Antitumor activity of L-asparaginase from Thermus thermophilus. // Anti-Cancer Drugs.-2001.-V. 12.-P. 137-142.

68. Qian G., Zhou J., Binglin H. The chemical modification of E. coli L-asparaginase by N,0 carboxymethyl chitosan. // Art.Cells, Blood Subs., and Immob. Biotech. - 1996. - V. 24 (6). - P. 567-577.

69. Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. Chemistry for peptide and protein PEGylation. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2002. - V. 54. - P. 459476.

70. Sebeni, J. The interaction of liposomes with the complement system. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998. - V. 15. - P. 57-88.

71. Soares A.L., Guimaraes G.M., Abrahao-Neto J. Effects of polyethylene glycol attachment on physicochemical and biological stability of E.coli L-asparaginase. // Int. J. Pharm. 2002. - V. 237. - P. 163-170.

72. Schmid F.A., Roberts J. Antineoplastic and toxic effects of Acinetobacter and Pseudomonas glutaminase-asparaginases. // Cancer Chemother. Repp. -1974.-V. 58.-P. 829-840.

73. Shearwater Corporation Catolog. 2001.

74. Story M.D., Voehringer D.W., Stephens L.C., Meyn R.E. L-asparaginase kills lymphoma cells by apoptosis. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1993. -V. 32.-P. 129-133.

75. Swain A.L., Jaskolski M., Housset D., Rao J.K.M., Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 1474-1478.

76. Taguchi T. Recent advances in L-asparaginase studies. // Gan To Kagaku Ryoho. 1988.-V. 15.-P. 1815-1825.

77. Taylor C.W., Dorr R.T., Fanta P., Hersh E.M., Salmon S.E. A phase I and pharmacodynamic evaluation of polyethylene glycol-conjugated L-asparaginase in patients with advanced solid tumors. // Cancer Chemother. Pharmacol. 2001. - V. 47 (1). - P. 83-88.

78. Thomas D.A. New agents in the treatment of acute lymphocytic leukaemia. // Best practice and research clinical haematology. 2003. - V.15 (4). - P. 771-790.

79. Ton G.N., Fineb J.P., Kwonc G.S. Methoxypoly(ethylene glycol-conjugated carboxypeptidase A for solid tumor targeting Part I: Synthesis and characterization. // Journal of Controlled Release. 2005. - V. 104. - P. 129-139.

80. Ueno Т., Ohtawa K., Mitsui K., Kodera Y., Hiroto M., Matsushima A., Inada Y., Nishimura H. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. //Leukemia. 1997.-V. 11.-P. 1858-1861.

81. Uren J.R., Hargis B.J., Beardsley P. Immunological and pharmacological characteristics of poly-DL-alanyl-modified Erwinia carotovora L-asparaginase. // Cancer Research. 1982. - V. 42 (10). - P. 4068-4071.

82. Veronese F.M., Largajolli R., Boccu E., Benasssi C.A., Schiavon O. Activation of monomethoxy poly(ethylene glycol) by phenylchloroformate and modification of ribonuclease and superoxide dismutase. // Appl. Biochem. Biotechnol.- 1985.-V. 11.-P. 141-152.

83. Veronese F.M. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. // Biomaterials. -2001. V. 22. - P. 405-417.

84. Veronese F.M., Caliceti P. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly (ethyleneglycol) protein conjugates. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2003. - V. 55. - P. 1261-1277.

85. Veronese F.M., Pasut G. PEGylation, successful approach to drug delivery. //Drugdiscovery today.-2005. -V. 10.-P. 1451-1458.

86. Walsh S, Shah A., Mond J. Improved pharmacokinetics and reduced antibody reactivity of lysostaphin conjugated to polyethylene glycol. // Aantimicrobial agents and chemotherapy. 2003. - V.47 (2). - P. 554-558.

87. Woghiren C., Sharma В., Stein S., Protected thiol-polyethylene glycol: a new activated polymer for reversible protein modification. // Bioconjug. Chem. 1993. - V .4. - P. 314-318.

88. Wolf B.A. Overview of therapeutic drug monitoring biotechnologic drugs. // Ther. Drug Monit. 1996. - V. 18 (4). - P. 402-404.

89. Wriston J.C., Yellin Т.О. L-Asparaginase. // Adv. Enzymol. 1973. -V. 39.-P. 185-248.

90. Wriston J.G. Asparaginase. // Methods Enzymol. 1985. - V. 113. -P. 608-618.

91. Xiong M.P., Kwon G.S. PEGylation of Yeast Cytosine Deaminase for Pretargeting. // Journal of Pharmaceutical Sciences. 2005. - V. 94. - P. 1249-1258.

92. Zalipsky S., Seltzer R., Menon-Rudolph S. Evaluation of a new reagent for covalent attachment of polyethylene glycol to proteins. // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1992.- V. 15.-P. 100-114.

93. Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules. // Advanced Drug Delivery Reviews. 1995. -V. 16.-P. 157-182.

94. Zalipsky S. Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates. // Bioconjugate Chem. 1995. - V. 6. - P. 150-165.

95. Zhang Y.Q. et al. Chemical modification of L-asparaginase from E.coli. II Biotechnology Letters. 2004. - V. 26. - P. 753-756.

96. Zhang Y. Q. et al. Immobilization of l-asparaginase on the microparticles of the natural silk sericin protein and its characters. // Biomaterials. 2004. - V. 24. - P. 3751-3759.

97. Борисова А. А. Рекомбинантная L-аспарагиназа Erwinia carotovora: разработка способа выделения гомогенного препарата фермента и его свойства. // Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук : 03.00.04.-М., 2003.-С. 127.

98. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. // Справочник биохимика. Пер. с англ. -М.: Мир, 1981. С. 465-466.

99. Ивашкин В.Т., Маевская М.В. Новый шанс победить гепатит С. // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2002. №2.-С. 25-28.

100. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. Пер. с англ. М.: Мир, 1979. - 280 С.

101. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Соколов Н.Н., Козлов Е.А., Куцман М.Е Выделение и свойства гомогенного препарата L-аспарагиназы из Pseudomonas fluorescens АГ // Биохимия. 1975. - Т. 40 (5).-С. 984-989.

102. Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние, проблемы и перспективы. www.medi.ru. // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. Инф. Бюллетень.-2003.

103. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - С. 233-235.

104. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М : Наука, 1983. С. 304

105. Рассказова Е.А., Плешакова О.В., Садовников В.Б. Изучение роли окислительной модификации белков в нарушении иммунологической толерантности при старении организма. // сб. тезисов 9-й Пущинской конф.

106. Соколов Н.Н., Занин В.А., Александрова С.С. Бактериальные L-аспарагиназы и глутамин(аспарагин)азы: некоторые свойства, строение и противоопухолевая активность. // Вопр. мед. химии. 2000. - Т. 46 (6).-С. 531-548.

107. Тимаков A.M., Кондратчик К Л., Тиганова О. А. Пегилированная форма аспарагиназы альтернатива нативной Е. coli аспарагиназы? // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии. -2003.-Т. 2. (4).-С. 92-96.

108. Тимаков A.M., Кондратчик К.Л., Хондкарян Г.Ш., Муторова О.Ю., Ковалева O.JI. Препараты L-аспарагиназы в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии. 2003. - Т. 2. (3). - С. 90-93.