Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью"

На правах рукописи

ГЛАДИЛИНА Юлия Алексеевна

КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА L-АСПАРАГИНАЗЫ HELICOBACTER PYLORI С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

UÜ344 ГО 1 1

Москва - 2008

003447011

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им В Н Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Красоткина Юлия Валерьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Колесанова Екатерина Федоровна доктор биологических наук, профессор Шишкин Сергей Сергеевич

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН Защита состоится «25» октября 2008 г в /{ часов на заседании Диссертационного совета Д 001 010 01 при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу 119121, г Москва, Погодинская ул , д 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН

Автореферат разослан «(8 » ОСИ) &ЪрЗ>2008 ]

Ученый секретарь Диссертационного совета Карпова Е А

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Данная работа посвящена одной из актуальнейших проблем современной биохимии, онкологии и медицины - созданию эффективных препаратов, подавляющих рост опухолевой клетки в результате целенаправленного воздействия на ее метаболизм На сегодня единственным примером практического использования ферментов в онкотерапии является применение бактериальной аспара-гиназы в схемах комбинированной химиотерапии острых лимфобластных лейкозов, лимфо-и ретикулобластом (Narta U К , 2007)

Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза, КФ 3 5 11) катализирует гидролиз аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и иона аммония Именно это свойство аспарагиназы и определяет ее противоопухолевое действие При введении аспарагиназы в организм человека происходит снижение концентрации аспарагина в крови и тканевой жидкости В лейкозных клетках, в отличие от нормальных тканей, активность аспарагинсинтазы снижена или полностью отсутствует При уменьшении концентрации экзогенного аспарагина лейкозные клетки испытывают дефицит этой аминокислоты, происходит ин-гибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот, и, в конечном счете, гибель раковой клетки Таким образом, достигается избирательная регрессия опухолевой ткани при терапии аспарагиназой

Несмотря на большое число бактериальных аспарагиназ с установленным противоопухолевым действием, только два фермента Escherihia coli (ЕсА) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в клинической практике (Wnston J J , et al, 1995) Широкий спектр функциональных нарушений, индуцированных применением аспарагиназы, включает в себя поражения печени и поджелудочной железы, панкреатит, тромбозы и эмболии, нейротоксичность и подавление иммунной системы (Narta U К, 2007)

Основной причиной токсичности аспарагиназы принято считать снижение уровня внеклеточного глутамина вследствие частичной глутаминазной актив-

ности фермента Kafkewitz и соавт суммировали в своем обзоре результаты экспериментальных работ, которые показывают, что дефицит глутамина в организме заметно подавляет функцию иммунной системы, в то время как дефицит аспарагина такого действия не оказывает (Kafkewitz, et al, 1983) Поэтому поиск новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является актуальной задачей медицинской биохимии

Попытки сделать аспарагиназу менее токсичной традиционно предпринимаются двумя путями Первый из них предполагает снижение глутаминазной активности направленным мутагенезом аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность фермента Глутаминазная активность наиболее удачного мутанта ЕсА N248A была снижена в 2 раза по сравнению с ферментом дикого штамма (Derst С, et al, 2000) Однако аспарагиназная активность этого производного ЕсА также была снижена и при физиологических условиях составляла не более 12% от первоначальной

Второй подход, состоящий в поиске новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью, и был реализован в данной работе

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в разработке метода получения рекомбинантной аспа-рагиназы Н pylori и характеристике ее терапевтически значимых свойств

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования

1 Клонирование и экспрессия гена НрА в клетках Е coli Получение реком-бинантного штамма-продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию НрА

2 Разработка лабораторного способа выделения гомогенного препарата НрА, пригодного для создания на его основе крупномасштабного метода получения фермента

3 Характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА

4 Определение цитотоксической активности НрА по отношению к клеткам

лейкозов человека

5 Сравнение антигенности НрА и основной терапевтической аспарагиназы ЕсА

Научная новизна работы, прежде всего, состоит в выделении и характеристике новой бактериальной аспарагиназы Впервые клонирован ген периплаз-матической аспарагиназы из штамма Helicobacter pylori, получен рекомбинант-ный штамм Е coli, продуцирующий НрА Разработаны оптимальные условия экспрессии, простой и эффективный способ очистки, что позволило впервые получить гомогенный препарат НрА Проведена детальная характеристика физико-химических и каталитических свойств НрА Определены кинетические константы гидролиза основных физиологических субстратов НрА - аспарагина и глутамина Показано, что глутаминазная активность фермента не превышает 0,01% от аспарагиназной активности Установлено, что НрА обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4, лимфомы Беркитта Raji, а также хронического миелоидного лейкоза К-562 Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апопотоза Установлено, что НрА иммунохимически отлична от аспарагиназы Е coli

Практическая значимость исследования.

Результаты, полученные в данной работе, могут быть применены для разработки нового противолейкозного препарата Острый лимфобластный лейкоз является самым частым онкологическим заболеванием в педиатрии На его долю приходится более 30% всех опухолей у детей (Павлова М М, 1996) Ежегодно в России, регистрируют до 3000 новых случаев этого заболевания (Кривошеи-на Е JI, 2005) Установленные в данной работе свойства НрА обеспечат лекарственному препарату на его основе ряд существенных преимуществ перед современными терапевтическими аспарагиназами (а) низкая токсичность позволит избежать развития множества побочных эффектов, типичных для аспарагиназной терапии, (б) низкая себестоимость его производства как рекомбинантно-го фермента уменьшит стоимость лечения, (в) отличная от ЕсА антигенность

НрА, указывает на возможность использования фермента для заместительной аспарагиназной терапии Учитывая, что в нашей стране аспарагиназа никогда не производилась, результаты данной работы представляют интерес в качестве основы для создания первого отечественного препарата для лечения различных форм лейкозов

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), Международной научной конференции «Перспективы современной медицинской науки» (Винница, 2007), международном конгрессе «ПЕРСПЕКТИВА-2007» (Нальчик, 2007)

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 публикаций в сборниках докладов научных конференций

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 147 источников Работа изложена на ¡Q^f страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Клонирование и экспрессия НрА.

В работе использовались стандартные методы генетики Е coli В качестве источника гена аспарагиназы НрА была использована геномная ДНК Helicobacter pylori, любезно предоставленная К Мамонолиевым (ЗАО «ПИННИ», www pynny ru) Ген был выделен методом амплификации Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену НрА по сайтам рестрикции EcoRI и Noil, была вставлена в TA-вектор pGEM-TEasy («Promega») Для целей данной работы ген НрА был переклонирован в вектор рАСНС177 по сайтам рестрикции EcoRI и Noll, а также в вектора рЕТ22 (Ncol, Ndel и NotI) и pETll (Ndel и Noll) Манипуляции с ДНК осуществлялись в соответствии со стандартными протоколами (Маниатис Т и др , 1984)

Культивирование штамма-продуцента Е coli проводили в конических колбах Эрленмейера (объемом 250 или 1000 мл) на термостатируемой качалке «GFL» (Германия) при 37°С Объем LB-среды составлял 50 или 200 мл, в зависимости от объема колб

Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хроматографии. Все стадии очистки проводили при 4°С 10-12 г биомассы Е coli, суспендировали в 20 мМ калий-фосфатном буфере, pH 5,8 (буфер А), до общего объема смеси 85 мл Клетки разрушали ультразвуком (Дезинтегратор УЗДН-2Т, Россия) в течение 5 мин при режиме 30 с озвучивания, 30 с перерыв Разрушение клеток проводили на ледяной бане, поддерживая t=2-4°C Далее pH суспензии доводили IM NaH2P04 до 5,8 и оставляли при 4°С и непрерывном перемешивании на 30 мин для преципитации части балластных белков Растворимую фракцию клеточного экстракта получали центрифугированием при 18000 об/мин (ЗОмин) и наносили на колонку с SP-Сефарозой FF (2 5 см х 10 см), уравновешенную буфером А После нанесения белка SP-Сефарозу последовательно промывали соответствующим буфером до исчезновения следов белка в элюате Скорость нанесения образца и промывки колонки составляли от 0,5 до 3 мл/мин Элюцию проводили 100 мл буфера А с pH 7,0, при скорости 1 мл/мин Фракции, содержащие L-аспарагиназу, объединяли Объединенные фракции помещали в ячейку-концентратор Amicon объемом 12 мл, содержащую фильтр Millipore (Ultrafiltration membrane NMWL 30000) и центрифугировали (Beckman, JA-25,5 4000 об/мин) Определение концентрации белка.

Белок определяли модифицированным методом Лоури (Hartree Е ,1991), а также через коэффициент экстинкции е° 1%28о=0,61 (ProtParam, www expasy org)

Электрофорез белков в денатурирующих условиях осуществляли в соответствии с методикой (Laemmli, 1970), аспарагиназную активность определяли по методу Несслера (Wnston J , 1973), изоэлектрическое фокусирование проводили, как описано у Остерман М, 1983

Определение кинетических параметров аспарагиназы. Скорости гидролиза L-аспарагина и L-глутамина определяли спектрофото-метрически по убыванию поглощения амидной связи при 215 нм (А£2и = 102,5) с помощью спектрофотометра «Hewlett Packard» (Howard et al, 1972) Для этого 27-1350 мкМ фермента добавляли к 2 мл 12,5 мМ боратного буфера, содержа-

щего субстраты в концентрации 30-3600 мкМ Реакцию проводили при 37°С Определение цитотокеической активности аспарагиназы in vitro*. Для определения влияния аспарагиназы на пролиферацию тест-культуры и оценки силы ее прямого токсического действия на чувствительные к аспараги-назе клеточные линии К-562 (хронический миелоидный лейкоз), Raji (лимфома Беркитта), MOLT-4 и Jurkat (острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз), а так же нечувствительные к аспарагиназе фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) использовали микроколориметрический метод - МТТ-тест Метод основан на редукции тетразолевого кольца 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5-дифенилтетразолиум бромида (ММТ) дегидрогеназами митохондрий только живых клеток с образованием нерастворимых фиолетовых кристаллов форма-зана После осаждения клеток, среду осторожно и тщательно удаляли, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде и измеряли оптическую плотность при длине волны 540 нм на «Multiscan» EX («Labsystems») Результаты эксперимента выражали в % к контролю Выживаемость клеток (CS) рассчитывалась по формуле

C=ODa/ODk* 100%,

где ODa - оптическая плотность в лунках с клетками, инкубированными с аспа-рагиназой, ODk - средняя оптическая плотность в контрольных лунках с клетками, инкубированными без аспарагиназы

Для характеристики цитотоксического эффекта использовали значение LC50 - концентрация препарата, приводящая к гибели 50% клеток, которое вычисляли путем аппроксимации кривой сигмоидной формы (рис 1) данных нескольких параллельных измерений для каждой концентрации препарата аспарагиназы

CS(E) = Ai+(A2-A,)/(1+10(LC50"e)p), где Ai, А2 - нижняя и верхняя асимптоты, Е- концентрация фермента, р- параметр аппроксимации

' Работа проводилась совместно с к б н Посыпановой Г А (ММА им ИМ Сеченова) и д б н Абакумовой О Ю (ГУ НИИ БМХ РАМН)

Рис 1 Выбранная для аппроксимации выживаемости клеток кривая сигмоидной формы

Морфологические признаки апоптоза, индуцируемого в лейкозных клетках аспарагиназой НрА, выявляли методом световой микроскопии, а также путем определения конденсации хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа после окраски лейкозных клеток Hoechst 33258 (2-(4-гидроксифенил)-5-(4-метил-1 -пиперазинил)-2,5-би-1 Н-бензимидазолтригидрохлорид) (Yuste V J , 2005)

Получение специфических поликлональных антител. В эксперименте использовали беспородных белых мышей-самцов с массой тела 19-22 г Антиген вводили с помощью внутрибрюшинных инъекций в количестве 25 мкг в 0,2-0,3 мл физиологического раствора, содержащего 50% полного адъюванта Фрейнда Мышей иммунизировали на 7, 14 и 21-е сутки Забор крови проводили декапитацией мышей на 28-й день Кровь оставляли для свертывания при 37°С на 1 час Отбирали аликвоты сывороток по 50-100 мкл и хранили при -20°С

Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА использовали планшеты высокой сорбционной емкости («Nunc», марки «Polysorp») Антиген в концентрации 20 мкг/мл сорбировали в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6, в течение ночи В качестве блокирующего раствора применяли 50%-ное молоко 0,5%-ной жирности в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, pH 7,4 (PBS) Начальное разведение антисывороток варьировало от 1 2 до 1 4 в зависимости от титра специфических антител Оптимальное начальное разведение (для достижения конечной точки титрования) определяли по результатам предварительного эксперимента, проводимого в тех же условиях Коныогаты антимышиных козьих IgG с пероксидазой хрена («Stressgen») разводили 1 2000 в

PBS, содержащий 50%-ное обезжиренное молоко и 0,05% Tween 20 В качестве субстрата использовали 0,5 мг/мл ABTS в 0,1 М цитратном буфере, 1% Н2О2, pH 4,0 Непосредственно перед инкубацией добавляли Н202 до конечной концентрации 1% Реакцию останавливали внесением в лунки 100 мкл 1%-ного раствора SDS и измеряли оптическую плотность при длине волны 405 нм на плашечном фотометре «Multiscan» EX («Labsystems») За титр принимали точку перегиба сигмоидной кривой логистического регрессионного уравнения (у=А2 + (А1-А2)/(1+(х/хо)р)), аппроксимирующей данные нескольких независимых экспериментов (рис 2) (Свежова HB и др , 2008) Рис 2 Выбранная для аппроксимации оптической плотности кривая сигмоидной формы

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программных продуктов «OngmLab Origin 7 0» и «Microsoft Excel 2003» Достоверность полученных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента

Клонирование гена НрА.

Цель данной работы состояла в получении аспарагиназы с низкой глутами-назной активностью В настоящее время только один фермент из штамма Wolinella succinogens (WsA), претендует на звание аспарагиназы, свободной от глутаминазной активности (0,015 % от аспарагиназной активности) (Distasio J , et al, 1972) Однако эти данные не были подтверждены для рекомбинантного фермента, экспрессированного в Е coli (Derst С et al, 2000) Тем не менее, за отсутствием другой отправной точки, было решено получить фермент наиболее гомологичный WsA Поиск по подобию в базе белковых и транслированных нуклеотидных последовательностей GeneBank, (доступных на сервере NCBI, www nebí nlm nih gov) программой BLAST с использованием аминокислотной последовательности аспарагиназы WsA (САА61503) показал, что аспарагиназа

у=А2-

(0,А1)_-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

штамма Helicobacter pylori (NP__223379) является одним из 10 наиболее близких гомологов WsA. Степень идентичности НрА и WsA составляет 53%, а гомологии - 73%.

Бактериальные аспарагиназы 2-го типа являются периплазматическими ферментами, которые характеризуются наличием сигнального пептида. Наличие сигнального пептида в аминокислотной последовательности НрА было предсказано с вероятностью 0,98 программой SignalP 3.0 (Nielsen Н. et al, 1997, Dyrlov J., et al, 2004). Положение сайта протеолиза между Glu20 и Asn21 аминокислотными остатками было определено с вероятностью 0,965.

На основе анализа нуклеотидной последовательности mRNA аспарагиназы НрА, были подобраны праймеры для амплифицикации гена предшественника аспарагиназы и фрагмента гена, соответствующего процессированной форме фермента. Обратный праймер использовался для амплификации обеих форм. Фрагменты ожидаемого размера были амплифицированы после оптимизации параметров ПЦР (рис.3). Температура отжига, равная 54°С, обеспечивала максимальный выход ПЦР-продукта, тем не менее, эффективность амплификации полноразмерной формы гена НрА была существенно ниже, чем для его процессированной формы.

Н. pylori

jjjjj§

1 kbp —*• у*

ш ■

Рис.3. ПЦР-продукты амплификации (1) полноразмерного гена НрА и (2) его фрагмента, соответствующего процессированной форме фермента. (3) Маркер молекулярных масс (Fermentas, #SM0332)

После экстракции из 1%-ного агарозного геля фрагменты ДНК были клони-

рованы в ТА-вектор pGEM-T Easy («Promega»). Селекция клонов, предположительно содержащих целевые амплификаты, была проведена с помощью бело-синего теста (Zhou M.Y. et al, 1995, Kobs G., 1997).

Рестрикция ферментом EcoRI плазмиды pGEM-TEasy, выделенной из отобранных трансформантов, показала наличие вставки размером ~1 кб (рис. 4). Вектор, несущий полноразмерный ген НрА, был обозначен pGEM-T/HpA-P, а плазмида, содержащая фрагмент гена, соответствующий процессированной форме аспарагиназы, был назван pGEM-T/HpA-M.

Рис.4. Рестрикционный анализ плазмид pGEMT/HpA-P, pGEMT/HpA-M EcoRJ-фрагменты(А); pACYC/HpA-P, EcoRI -Notl фрагмснты(В); рЕТ22/НрА-М, Nco-Notl фрагменты; рЕТ22/НрА-Р, Ndel-Notl фрагменты; pETl 1/НрА-М, Ndel-Notl фрагменты(С); маркер молекулярных масс (Fermcntas, #SM0332) (D).

Секвенирование показало, что последовательности НрА-Р и НрА-М идентичны нуклеотидным последовательностям гена аспарагиназы Helicobacter pylori. Аналогично были получены плазмиды pGEM-TEasy, содержащие последовательности НрА-Р и НрА-М, которые фланкированы сайтами рестрикции Ndel или Ncol с 5'-конца.

EcoRI/Notl фрагменты pGEM-TEasy/HpA-P были клонированы в экспресси-рующий вектор pACYC177. Именно этот клон и был использован в дальнейшей работе. Полученная в результате плазмида pACYC177/НрА-Р была трансформирована в клетки E.coli 21(DE3). Однако после индукции экспрессии НрА синтеза рекомбинантного фермента не наблюдалось (рис. 5). Удельная аспарагиназ-ная активность биомассы после индукции составляла 1,2±0,4 МЕ/мг, что соот-

ветствует активности («трансформированной культуры E.coli 21(DE3).

т w*

12 3 4 5

Рис. 5.Элсктрофорсграмма клеточного экстракта E.coli 21(DE3) с плазмидой pACYCl77/НрА-Р до (I) и после индукции 1мМ (2), 0,5 мМ (3) и 0,1 мМ ИРТГ(4).

Основными возможными причинами отсутствия экспрессии могли являться:

1. Наличие «редких» кодонов в нуклеотидной последовательности НрА.

2. Неузнавание сигнального пептида НрА транспортными белками E.coli.

3. Токсичность каталитически активной формы НрА для клетки-продуцента. Первые две причины являются следствием существенной таксономической удаленности штаммов E.coli и H.pylori. Токсичность же является следствием дефицита аспарагина при экспрессии рекомбинантной аспарагиназы. Для устранения этих причин была проведена оптимизация экспрессии НрА.

Оптимизация генетической конструкции для экспрессии НрА в клетках E.coli.

Экспрессия чужеродного белка в E.coli может оказаться неэффективной, если нуклеотидная последовательность соответствующего гена содержит так называемые «редкие» кодоны, т.е. такие триплеты, для которых концентрация тРНК является очень низкой.

Поиск редких кодонов в нуклеотидной последовательности НрА выявил их наличие в гене аспарагиназы. Тем не менее, отсутствие тандемных повторов позволило предположить, что в данном случае эти триплеты не оказывают решающего влияния на экспрессию белка.

Для того, чтобы проверить это предположение НрА-М был клонирован в pETl I для его экспрессии под регуляцией сильного Т7 промотора, но в заведо-

мо неактивной форме, благодаря включению 6-ти гистидинов и сайта расщепления TEV-протеазой на N-конце. Уровень экспрессии в данном случае был ожидаемо высоким (рис. 6). Этот результат показывал, что наличие редких ко-донов не препятствует синтезу полипептидной цепи НрА в клетках E.coli. Аналогичный результат был получен при экспрессии НрА-Р с использованием плазмиды рЕТ22/ НрА-Р. В данном случае также наблюдалось постепенное накопление рекомбинантного белка в клетке-продуценте, однако фермент экс-прессировался исключительно в виде телец включения (рис. 7). Увеличения ас-парагиназной активности в культуре после внесения индуктора не наблюдалось. Синтезируемый в виде предшественника фермент не подвергался посттрансляционной модификации, т.к., по всей видимости, сигнальный пептид НрА не узнавался транспортными белками и протеазами E.coli.

66 Рис.6. Экспрессия неактивной формы НрА под контролем Т7 промотора. Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН клеточного экстракта ВЬ21(ОЕЗ)/рЕТ1-НрА-М до (А) и после (В) 24 часовой индукции 1мМ ИПТГ.

|й» Ш* 20

ABC

90

Рис.7. Экспрессия НрА-Р под контролем Т7 пром» мотора. Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН клеточ-® 1 ного экстракта BL21(DE3)/pET22-HpA-P до (С) и ИР «Mfl после 8 (А) и 24 часовой (В) индукции 1мМ 30 ИПТГ.

20

Для обеспечения правильной посттрансляционной модификации, фрагмент гена НрА, соответствующий процессированной форме фермента, был клониро-

ван в плазмиду рЕТ22 непосредственно за последовательностью реШ Полученный вектор был назван pET22b/HpApelB В результате НрА был экспрессирован в виде химерного предшественника с сигнальным пептидом на N-конце для направленной секреции рекомбинантного фермента в периплазму Е coli При использовании этой генетической конструкции после индукции синтеза белка удельная активность культуры-продуцента увеличивалась до 5-6 МЕ/мг, что соответствовало -5% активного рекомбинантного фермента от общего белка Е coli

Экспрессия рекомбинаной аспарагиназы НрА.

Единичную колонию рекомбинантного штамма инокулируют в 5 мл среды LB и выращивают в течение 18-20 часов при 37°С и непрерывном перемешивании Адаптированную культуру используют для приготовления необходимого объема посевного материала для ферментации, которую проводят при 37°С с использованием среды LB в условиях непрерывной аэрации и перемешивания Экспрессию НрА индуцируют ИПТГ конечной концентрации 0,5 мМ, который добавляют в среду при достижении культурой оптической плотности OD6oo=0,6 После этого клетки инкубируют 16-18 часов при 37°С Клетки собирают центрифугированием при 4000 g в течение 15 мин и либо сразу используют для выделения аспарагиназы НрА, либо хранят в замороженном виде при - 20°С

Выделение аспарагиназы НрА.

На начальном этапе работы необходимо было получить препарат аспарагиназы в количестве, достаточном для определения терапевтически значимых свойств фермента

Наибольшие потери фермента происходят на начальной стадии получения бесклеточного экстракта Для получения бесклеточного экстракта мы решили использовать ультразвуковую обработку Результаты очистки фермента представлены в таблице 6 Аспарагиназная активность в бесклеточном экстракте составляла 5,1 МЕ/мг, что соответствует 5-6% активного фермента от общего количества белка При последующем центрифугировании, вероятно вследствие адсорбции L-аспарагиназы осадком разрушенных клеток, терялось 15-20%

ферментативной активности, однако, на этой стадии происходило и удаление почти 50% балластных белков Таким образом, выход фермента был достаточно высоким (около 80%) Нанесение растворимой фракции бесклеточного экстракта на БР-Сефарозу при рН 5,8 позволило избавиться от основной массы балластных белков Значение ИЭТ рекомбинантной аспарагиназы равно 8,1,

Таб 1 Типичная процедура выделения НрА

Стадии очистки Объем, Белок, Активность, Удельная Выход, Степень

мл мг ME активность, МЕ/мг % очистки

Бссклеточный 75 602 3096 5,1 100 1

экстракт

Растворимая фракция бесклеточного 100 462 2900 6,2 94 1,2

экстракта, рН 7,2

Растворимая фракция бесклеточного 102 375 2443 6,5 79 1,3

экстракта, рН 5,8

Хроматография на 5Р-ссфарозе 6 21 1911 91 62 18

поэтому более 95% аспарагиназы Н pylori, нанесенной на сильный катионооб-менник SP-Сефарозу при pH 5,8, связывается с сорбентом, а большинство белков Е coli, имеющих ИЭТ в кислой области pH, обнаруживается в элюате После промывки сорбента низкосолевым фосфатным буфером с pH 5,8, аспараги-назу элюировали тем же раствором при pH 7,0 Использование однокомпонент-ного элюата вместо градиента концентрации соли исключало необходимость дальнейшего обессоливания и концентрирования белка, а также позволяло значительно облегчить процесс выделения рекомбинантной аспарагиназы После хроматографической стадии очистки удельная активность фермента составляла 91 МЕ/мг, что в 18 раз превышает значение исходной активности

При электрофорезе очищенного препарата аспарагиназы в 12%-ном полиак-риламидном геле выявляется один основной компонент с молекулярной массой 34 кДа, свидетельствующий о содержании целевого фермента в полученном препарате более 90% (рис 8) Иногда могут наблюдаться несколько минорных компонентов с Mr 15-30 кДа Аналогичные компоненты присутствуют и в препаратах аспарагиназы Erw chrysanthemi («Sigma») и аспарагиназы Е coli про-

90

66

45

1 30 5К

н>

**

изводства Медак, предназначенных для внутривенного введения {рис.9).

Л К? „

Рис.8. Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН. Очищенный препарат аспарагиназы НрА(А); клеточный экстракт BL21(DE3)pLYSE/pET22-HpA-M А В С до (С) и после (В) 24 часовой индукции 45И)а 0,5мМ ИПТГ; .,,, .

ЗОШа '"" ЙшМ

Г, П П 20кШ

Рис.У. Присутствие низкомолеку-( лярных компонентов в водных раство-20 " 5 pax аспаргиназ ЕгА(Л), ЕсА (В) и

НрА(С). Электрофорез в 12% МШ»

ПААГ/ДСН.

Эти компоненты, количество которых увеличивается при хранении раствора фермента, являются продуктами гидролиза аспарагиназы, по-видимому, вследствие присутствия следовых количеств протеаз. Мы не использовали ингибиторы протеаз в процессе выделения, т.к. они являются высокотоксичными соединениями, присутствие которых недопустимо в препарате, предназначенном для внутривенного использования.

Характеристика рекомбинантной НрА.

Физико-химические свойства НрА.

Цель физико-химической характеристики рекомбинантного фермента состояла, прежде всего, в определении терапевтически-значимых свойств аспарагиназы (табл.2), а также стабильности при денатурирующих условиях и при хранении.

Табл.2. Физико-химические свойства НрА Свойство Значение

Молекулярная масса, ПААГ/ДСН (субъединица) 34 ООО

рН-оптимум 5,0 - 9,0

Температура денатурации 65°С

р! 8,1

Зависимость удельной активности НрА определяли в диапазоне рН от 5 до 9. При этом использовали калий-фосфатный (рН 5 - 7) и Трис-НС1 (рН 7,5 - 9)

буферные растворы Рекомбинантный фермент оказался каталитически активным в широком диапазоне рН (рис 10) Температурный оптимум действия фермента определен в диапазоне температур от 37°С до 55°С Увеличение активности фермента при повышении температуры вызвано снижением энергии активации реакции (Oakley et al, 1997, Peng et al, 2003), а резкое падение активности связано с тепловой денатурацией белка

45 50 55 60 6,5 70 75 80 85 90 95

рН

Рис 10 Зависимость удельной активности НрА(») и ЕсА( )отрН Учитывая возможную перспективу создания лекарственного препарата на основе НрА, представлялось интересным исследовать стабильность рекомби-нантной аспарагиназы под воздействием различных денатурирующих факторов При этом, в тех же экспериментах измеряли и стабильность лекарственного препарата ЕсА (Медак, Германия) для того, чтобы сравнить соответствующие свойства этих двух аспарагиназ

Температуру денатурации ферментов определяли по изменению их удельной активности Можно видеть (рис 11), что инкубация при температурах до 60°С практически не изменяет активность рекомбинантного фермента При нагревании раствора НрА выше 60°С происходит его инактивация При этом ре-натурации аспарагиназы в каталитически активную форму не наблюдается Аналогичное поведение обнаруживает ЕсА, однако в данном случае снижение активности при температуре 60°С и выше не такое резкое, как для НрА

Рис 11 Термостабильность НрА(в) и ЕсА( ) Сходные данные были получены при определении стабильности аспараги-назы в растворе мочевины (рис 12)

Мочевина М

Рис 12 Стабильность НрА(») и ЕсА(а) в растворе мочевины Стабильность рекомбинантного фермента также оценивали при многократных циклах замораживания - оттаивания, как это описано у (1ашее1 Р, й а1, 1997) Как показывают результаты (рис 13), после 50 повторных циклов замораживания-оттаивания НрА сохраняет не менее 80% удельной активности от первоначального значения В этом эксперименте стабильность рекомбинантного фермента оказалась практически такой же, как и стабильность аспарагиназы ЕсА (Медак)

120 100 г? 8°

-С

8 60 т

| 40 <

20 0

Рис. 13. Стабильность аспарагиназ НрА(*) и ЕсА( ) при многократных циклах замораживания-оттаивания

Каталитические свойства аспарагиназы НрА.

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием НрА.

Для рекомбинантной аспарагиназы НрА характерна гиперболическая зависимость скорости гидролиза обоих стереоизомеров аспарагина. Соответствующие кинетические параметры НрА суммированы в табл. 3.

Как и ожидалось, глутаминазная активность НрА, измеренная при концентрации Ь-С1п 5мМ, оказалась крайне низкой, 0,0083 МЕ/мл, что составляет 0,0009% от аспарагиназной активности. Эти данные сопоставимы с каталитическими свойствами \¥хА (табл. 3) (01з1а5ю .1. й а1, 1972). Нам не удалось определить зависимость скорости гидролиза глутамина от его концентрации вследствие крайне низкой скорости реакции. До концентрации 5 мМ скорость гидролиза линейно повышается с увеличением концентрации глутамина. Мы не использовали концентрации Ь-01п больше 5 мМ, т.к. оптическая плотность такого раствора глутамина в фосфатном буфере превышает 1,5, что препятствует адекватному измерению скорости гидролиза.

0 10 20 30 40 50 Число циклов разморозки/заморозки

Табл 3 Сравнение равновесных кинетических параметров для реакций гидролиза Ь-, Б-аспарагина и Ь-глутамина аспарагиназами НрА1, УЛА^ЕсА3 и Е\уА4

Vmax, мкМоль/мг мин kcat, c Km, MKM kcat/Km, M-'c"'

L-Asp

НрА 94 103 21 5,2 106

WsA 204 n/d n/d n/d

ЕсА 220 240 15 1,6 106

EwA 560 321 98 3,3 106

D-Asp

НрА 2,6 1,5 3940 3,8 102

WsA 6,5 n/d n/d n/d

ЕсА n/d n/d n/d n/d

EwA 24 14 832 "o

L-Gln

НрА 0,0083 n/d n/d n/d

WsA 0,015 n/d n/d n/d

ЕсА 3 0,33 3500 94

EwA 15 8,6 1400 6,1 103

'-результаты данного исследования Расчет kcat был сделан в предположении одного активного центра на один мономер аспарагиназы с Mr 35 кДа, 2-скорость гидролиза определена для концентрации субстрата 40 мМ (Distasio J and Nicderman R , 1976), 3-(Derst С Et al, 2000), 4-(Krasotkina et al, 2004), 5-скорость гидролиза L-Gln определена при концентрации субстрата 5мМ

Кинетические эксперименты показывают, что введение НрА обеспечит эффективное снижение уровня аспарагина, но при этом концентрация глутамина в крови останется фактически неизменной

Цитотоксическая активность НрА.

Ингибирование роста ленкозных клеток. Исследования цитотоксической активности НрА показали, что фермент эффективно ингибирует рост клеток лейкоза человека (рис 14) Антипролиферативная активность НрА имеет выраженную концентрационную зависимость Наибольшую чувствительность показали клетки лимфомы Беркита Raji Через 72 часа инкубации с 0,6 МЕ/мл НрА количество клеток этой линии уменьшалось на 50% по сравнению с контролем Значение IC50 для клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4 составляло 1 МЕ/мл Аналогичные данные были получены для линии Jurkat Наименее чув-

ствительной к действию аспарагиназы НрА оказалась линия хронической мие-лоидной лейкемии К-562 В этом случае 50%-ное ингибирование роста клеток достигалось при концентрации фермента более 2,1 ME/мл Эти результаты находятся в хорошем соответствии с литературными данными относительно ци-тотоксичности бактериальных аспарагиназ, в частности нативной и рекомби-нантной аспарагиназ из штамма Е coli, а также коммерческого препарата аспарагиназы Erwima chrysanthemi

В тоже время аспарагиназа НрА не подавляла рост культуры фибробластов, которые не являются чувствительными к действию аспарагиназы Это показывает, что цитотоксичность в отношении лейкозных клеток является специфической и проявляется только для клеток, которые зависят от внеклеточного уровня аспарагина

0 01 0,1 05 1 2

Аспарагиназа, МЕ/мл

001 0,1 05 1 2

Аспарагиназа, МЕ/мл

Рис 14 Цитотоксичсская активность аспарагиназ НрА(в) и ЕсА(и) для лимфобластной Т-клеточной лимфомы MOLT-4(A) и лимфомы Беркигга Raji(E)

Морфологические изменения, индуцируемые аспарагиназой НрА в лейкоз-ной клетке, выявляли методом световой микроскопии, а также путем определения конденсации хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа после окраски лейкозных клеток Hoechst Результаты проведенных нами микроскопических исследований позволили установить, что аспарагиназа НрА ин-

дуцирует апоптоз лейкозной клетки Эти результаты находятся в соответствии с установленным механизмом гибели лейкозных клеток под действием аспараги-назы

Перекрестная антигенность НрА и ЕсА. На заключительном этапе работы был проведен сравнительный анализ иммуногенности аспарагиназ НрА и ЕсА Перекрестную антигенность аспарагиназ НрА и ЕсА определяли методом ИФА с использованием мышиных поликлональных антител Результаты эксперимента показали, что сыворотка, полученная, например, к одной из аспарагиназ слабо реагировала с другим, иммобилизованным на планшет, ферментом (рис 15) Так в случае, когда на планшет была нанесена НрА отношение титров антисывороток НрА/ЕсА равнялось 160, а при иммобилизации на планшет ЕсА отношение титров антисывороток ЕсА/НрА - 200 Низкая перекрестная антигенность аспарагиназ НрА и ЕсА позволяет предположить, что НрА может использоваться как препарат для заместительной терапии при развитии гиперчувствительности к ЕсА

Разведение сыворотки Разведение сыворотки

Рис 15 Перекрестная антигенность НрА и ЕсА ИФА с использованием мышиной поликло-напьной сыворотки, полученной для НрА (•) и ЕсА ( ) НрА иммобилизована на планшет (А), ЕсА иммобилизована на планшет (В)

выводы

1 Клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма Н pylori Получен рекомбинантный штамм Е coli, устойчиво продуцирующий каталитически активную НрА

2 Разработана лабораторная процедура очистки НрА, которая является пригодной для промышленного крупномасштабного получения рекомбинантной аспарагиназы и обеспечивает выход активного фермента более 60%

3 Проведена характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА Фермент имеет широкий оптимум pH и характеризуется высокой стабильностью при денатурирующих условиях Удельная аспарагиназная активность при физиологических условиях составляет 94 МЕ/мг, что значительно превышает глутаминазную активность 0,0083 МЕ/мг

4 Установлено, что НрА эффективно подавляет рост клеток острой лим-фобластной лейкемии MOLT-4, лимфомы Беркита Raji и хронического миело-идного лейкоза К562 Определены соответствующие значения LC50 Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апоптоза

5 Показано, что антигенность НрА отличается от антигенности основной терапевтической аспарагиназы из штамма Е coli

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1 Гладилина Ю А, Соколов Н Н , Красоткина Ю В Клонирование, экспрессия и выделение L-аспарагиназы Helicobacter pylori //Биомедицинская химия - 2008 -Т 54 №4- С 482-486

2 Красоткина Ю В , Посыпанова Г А, Гладилина Ю А , Борисова А А , Гер-вазиев Ю В , Занин В А, Соколов Н Н Кинетические свойства и цитотоксиче-ская активность рекомбинантной аспарагиназы Pectobacterium atrosepticum // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2008 -№3-С 18-21

3 Гладилина Ю А , Соколов Н Н , Красоткина Ю В Оптимизация экспрессии рекомбинантной L-аспарагиназы Helicobacter pylori // Материалы IV международной научно-практической конференции «Динамика исследований» - г София, Болгария -2008 - С 38-42

4 Красоткина Ю В , Леонова Ю А Выделение и очистка рекомбинантной аспарагиназы НрА // Сборник докладов научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» - г Волгоград - 2007 - С 25-26

5 Леонова Ю А, Соколов Н Н , Красоткина Ю В Клонирование рекомбинантной аспарагиназы Helicobacter pylori J99 II Сборник трудов XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» - г Казань - 2007 - С 259

6 Леонова Ю А, Кучумова Н В , Красоткина Ю В Одностадийное выделение и кинетические свойства рекомбинантной аспарагиназы Erwmia carotovora II Сборник докладов международного конгресса «ПЕРСПЕКТИВА- 2007», секция «Биология»- г Нальчик - 2007 - С 37-39

7 Леонова Ю А , Соколов Н Н , Красоткина Ю В Клонирование рекомбинантной аспарагиназы Helicobacter pylori И Материалы IV Международной научной конференции «Перспективы современной медицинской науки» - г Винница, Украина - 2007 - С 167

Заказ Jfe 136/09/08 Подписано в печать 16 09 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ■ ^ ■ www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гладилина, Юлия Алексеевна

Список сокращений

Введение

1. Аспарагиназа как противолейкозный препарат (обзор литературы)

1.1. Бактериальные аспарагиназы и история их изучения

1.2. Структурно-функциональные особенности аспарагиназы

1.3. Физико-химические свойства

1.4. Гидролиз аспарагина определяет противоопухолевое действие аспарагиназы

1.5. Глутаминазная активность - основная причина токсичности аспарагиназы

1.6. Современные терапевтические аспарагиназы

1.7. Актуальность разработки лекарственного препарата на основе аспарагиназы без глутаминазной активности

2. Материалы и методы

2.1. Генно-инженерные методы клонирования и экспрессии

2.2. Выделение рекомбинантного фермента методом 42 колоночной хроматографии

2.3. Физико-химическая характеристика аспарагиназы

2.3.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле

2.3.2. Изоэлектрофокусирование

2.3.3. Определение аспарагиназной активности 44 2.3.4.Определение концентрации белка. 45 2.3.5.0пределение температуры денатурации фермента 46 2.3.6.Определение стабильности фермента в растворе мочевины 46 2.3.7.Определение стабильности фермента при многократных циклах замораживания — оттаивания

2.4. Определение равновесных кинетических констант

2.5. Определение цитотоксической активности аспарагиназы

2.6. Определение перекрестной иммуноспецифичности аспарагиназ

2.6.1. Получение специфических поликлональных антител

2.6.2. Определение уровня выработки антител методом прямого иммуноферментного анализа (ИФА)

3. Результаты и обсуждение

3.1 Получение рекомбинантного штамма-продуцента НрА

3.1.1. Клонирование гена НрА

3.1.2. Оптимизация генетической конструкции для экспрессии НрА в клетках E.coli

3.1.3. Характеристика рекомбинантного штамма продуцента

3.1.4. Экспрессия рекомбинантной НрА

3.2. Выделение аспарагиназы НрА

3.3. Характеристика рекомбинантной НрА

3.3.1. Физико-химические свойства

3.3.2. Каталитические свойства

3.3.3. Цитотоксическая активность

3.3.4. Перектестная антигенность НрА и ЕсА 85 3.4. Возможности практического применения НрА

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью"

Данная работа посвящена одной из актуальнейших проблем современной биохимии, онкологии и медицины - созданию эффективных препаратов, подавляющих рост опухолевой клетки в результате целенаправленного воздействия на ее метаболизм. На сегодня единственным примером практического использования ферментов в онкотерапии является применение бактериальной аспарагиназы в схемах комбинированной химиотерапии острых лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулобластом (Narta U.K., 2007). В последнее время появились сообщения о попытках использования аспарагиназы для лечения острой миелобластной лейкемии (Perel Y., et al, 2002), болезни Ходжкина^ и не-Ходжкинской лимфомы (Kobrinsky N.L., et al, 2001), меланосаркомы и множественной миеломы (Wriston J.C., et al, 1985).

Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза; КФ 3.5.1.1.) катализирует гидролиз аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и иона аммония. Именно это свойство аспарагиназы и определяет ее противоопухолевое действие. При введении аспарагиназы в организм человека происходит снижение концентрации аспарагина в крови и тканевой жидкости. В лейкозных клетках, в отличие от нормальных тканей, активность аспарагинсинтазы снижена или полностью отсутствует. При снижении концентрации экзогенного аспарагина лейкозные клетки испытывают дефицит этой аминокислоты, происходит ингибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот, и, в конечном счете, гибель раковой клетки. Таким образом, достигается избирательная регрессия опухолевой ткани при аспарагиназной терапии.

Несмотря на большое число бактериальных аспарагиназ с установленным противоопухолевым действием, только два препарата аспарагиназы Escherihia coli (ЕсА) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в клинической практике (Wriston J.C., et al, 1985). Широкий спектр функциональных нарушений, индуцированных применением аспарагиназы, включает в себя поражения печени и поджелудочной железы, панкреатит, тромбозы и эмболии, нейротоксичность и подавление иммунной системы. (Narta U.K., 2007). Осложнения аспарагиназной терапии снижают эффективность лечения, особенно в развивающихся странах, где обеспечение адекватной сопроводительной терапии является невозможным (Moola Z.B., et al, 1994).

Основной причиной токсичности аспарагиназы принято считать исчерпание внеклеточного глутамина вследствие частичной глутаминазной активности фермента. Kafkewitz и соавт. суммировали в своем обзоре результаты экспериментальных работ, которые показывают, что дефицит глутамина в организме заметно подавляет функцию иммунной системы, в то время как дефицит аспарагина такого действия не оказывает (Kafkewitz D., et al, 1983). Поэтому поиск новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является актуальной задачей медицинской биологии.

Получение низкотоксичной аспарагиназы является особенно необходимым у нас' в стране. В целях уменьшения потребности в сопроводительной терапии и трансфузиях компонентов крови современные отечественные протоколы лечения лейкозов предполагают отказ от высокодозной интенсивной химиотерапии. Напротив, разработанные оригинальные протоколы, как например "Москва - Берлин 91" (ОЛЛ-МБ 91), используют длительное, в течение нескольких месяцев, применение аспарагиназы в малых дозах (von Stackelberg A., et al, 1999). В связи с этим возникают новые требования к препарату аспарагиназы, главным из которых является его низкая токсичность. Применяемые в настоящее время терапевтические аспарагиназы, которые были введены в клиническую практику более 40 лет назад, не' удовлетворяют современным требованиям к этим препаратам.

Попытки сделать аспарагиназу менее токсичной традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает снижение глутаминазной активности направленным мутагенезом аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность фермента. Глутаминазная активность наиболее удачного мутанта ЕсА N248A была снижена в 2 раза по сравнению с ферментом дикого штамма. (Derst С., et al, 2000). Однако аспарагиназная активность этого производного ЕсА также была снижена и при физиологических условиях составляла не более 12% от первоначальной. Кроме того, была нарушена термодинамическая стабильность каталитически активной конформации. В целом, довольно сложно прогнозировать терапевтический эффект этого производного, а исследование биологического действия ЕсА N248A так и не было проведено.

Второй подход, состоящий в поиске новых аспарагиназ с ^низкой глутаминазной активностью, и был реализован в данной работе.

Цель данного исследования состояла в разработке метода получения рекомбинантной аспарагиназы Helicobacter pylori и характеристике ее терапевтически значимых свойств.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Клонирование и экспрессия гена НрА в клетках E.coli. Получение рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию НрА.

2. Разработка лабораторного способа выделения гомогенного препарата НрА, пригодного для создания на его основе крупномасштабного метода получения фермента.

3. Характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА.

4. Определение цитотоксической активности НрА по отношению к клеткам лейкозов человека.

5. Сравнение антигенности НрА и основной терапевтической аспарагиназы ЕсА.

Научная новизна работы, прежде всего, состоит в выделении и характеристике новой бактериальной аспарагиназы. Впервые клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма Helicobacter pylori, получен рекомбинантный штамм E.coli, продуцирующий НрА. Разработаны оптимальные условия экспрессии, разработан простой и эффективный способ очистки, что позволило впервые получить гомогенный препарат НрА. Проведена детальная характеристика физико-химических и каталитических свойств НрА. Определены кинетические константы гидролиза основных физиологических субстратов НрА - аспарагина и глутамина. Показано, что глутаминазная активность фермента не превышает 0,01% от аспарагиназной активности. Установлено, что НрА обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4, лимфомы Беркитта Raji, а также хронического миелоидного лейкоза К-562. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апопотоза. Установлено, что НрА иммунохимически отлична от аспарагиназы E.coli.

Практическая ценность результатов данной работы главным образом состоит в их применении для разработки нового противолейкозного препарата. Острый лимфобластный лейкоз является самым частым онкологическим заболеванием в педиатрии. На его долю приходится более 30% всех опухолей у детей (Павлова М.П., 1996). Ежегодно в России регистрируют до 3000 новых случаев этого заболевания (Кривошеина E.JL, 2005). Установленные в данной работе свойства НрА обеспечат лекарственному препарату на его основе ряд существенных преимуществ перед современными терапевтическими аспарагиназами: (а) низкая токсичность позволит избежать развития множества побочных эффектов, типичных для аспарагиназной терапии; (б) низкая себестоимость его производства как рекомбинантного фермента уменьшит стоимость лечения; (в) отличная от ЕсА антигенность НрА указывает на возможность использования фермента для заместительной аспарагиназной терапии. Учитывая, что в нашей стране аспарагиназа никогда не производилась, результаты данной работы представляют интерес в качестве основы для создания первого отечественного препарата для лечения различных форм лейкозов.

Диссертационная работа построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», раздела «Результаты исследования и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 147 источников. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гладилина, Юлия Алексеевна

Выводы

1. Клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма Н. pylori. Получен рекомбинантный штамм E.coli, устойчиво продуцирующий каталитически активную НрА.

2. Разработана лабораторная процедура очистки НрА, которая является пригодной для промышленного крупномасштабного получения рекомбинантной аспарагиназы и обеспечивает выход активного фермента более 60%.

3. Проведена характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА. Фермент имеет широкий оптимум рН и характеризуется высокой стабильностью при денатурирующих условиях. Удельная аспарагиназная активность при физиологических условиях составляет 94 МЕ/мг, что значительно превышает глутаминазную активность 0,0083 МЕ/мг.

4. Установлено, что НрА эффективно подавляет рост клеток острой лимфобластной лейкемии MOLT-4, лимфомы Беркита Raji и хронического миелоидного лейкоза К562. Определены соответствующие значения LC50. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апоптоза.

5. Показано, что антигенность НрА отличается от антигенности основной терапевтической аспарагиназы из штамма Е. coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гладилина, Юлия Алексеевна, Москва

1. Aghaiypour K., Wlodawer A, Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase Biochemistry, 2001, vol. 40, pp. 5655-5664.

2. Apostolidou E., Swords R., Alvarado Y., Giles F.J., Treatment of acute lymphoblastic leukaemia: a new era. (2007) Drugs, 67, 2153-2171.

3. Arens A., Rauenbusch E., Irion E., Wagner O., Bauer K., Kaufmann W. Isolation and properties of L-asparaginases from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1970 Feb; 351(2): 197-212.

4. Aslanian A.M., Fletcher B.S., Kilberg M.S. Asparagine synthetase expression alone is sufficient to induce 1-asparaginase resistance in MOLT-4 human leukaemia cells. Biochem J. 2001 Jul 1; 357(Pt l):321-8.

5. Aung, H. P., Bocola, M., Schleper, S., and Ro"hm, K.-H. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1481, 349-359.

6. Azuma Т., Kato S., Zhou W., Yamazaki S., Yamakawa A., Ohtani M., Fujiwara S., Minoura Т., Iinuma K., Kato T. Diversity of vacA and cagA genes of Helicobacter pylori in Japanese children. Aliment Pharmacol Ther. 2004 Jul;20 Suppl 1:7-12.

7. Bendtsen J. D., Nielsen H., von Heijne G. and Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol., 340:783-795, 2004.

8. Bonekamp F. and Jensen K. F. (1988) The AGG codon is translated slowly in E.coli even at very low expression levels. Nucleic Acids Res. 16, 3013-3024.

9. Callow D.S., Capell B.J., Evans C.G. Experimental continuous culture production of the enzyme L-asparaginase by Erwinia carotovora. J Gen Microbiol. 1971 Mar; 65(3).

10. Cammack K.A., Marlborough D.I., Miller D.S. Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora // Biochem J., 1972, vol. 126(2), pp. 361-79.

11. H.Carstens C.P., Waesche A. "Codon Bias-Adjusted BL21 Derivatives for Protein Expression" Strategies Newsletters (Stratagene) May 1999; vol. 12 #2 pg. 49-51

12. Cedar H. & Schwartz J.H., (1967). Localization of the two L-asparaginases in anaerobically grown Escherichia coli. J. Biol. Chem. 242, 3753-3755.

13. Cedar H. & Schwartz J.H., (1968) Production of L-asparaginase II by Escherichia coli. J Bacteriol 96, 2043-2048.

14. Chabner B.A. Cancer Chemotherapy: Principles and practice. Chabner B.A. and Collins J.M. eds., Philadelphia, Lippincote, 1990, p. 545.

15. Clavell L.A., Gelber R.D., Cohen H.J., et al. Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. N. Engl. J. Med., 1986, vol. 315(11), pp. 657-663.

16. Derst C., Henseling J., Rohm K.H. Probing the role of threonine and serine residues of E. coli asparaginase II by site-specific mutagenesis. // Protein Eng., 1992, vol. 5, pp. 785-789.

17. Derst С., Wehner A., Specht V., Rohm K.H. States and functions of tyrosine residues in Escherichia coli asparaginase II. Eur J Biochem. 1994 Sep 1; 224(2):533-40.

18. Derst C., Henseling J., Rohm KH. Engeneering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase II. Selective reduction of glutamiase activity by amino acid replacements at position 248. Protein Science, 2000, vol. 9(10), pp. 2009-2017.

19. Distasio J.A., Niederman R.A., Kafkewitz D., and Goodman D., (1976) J. Biol. Chem. 251,6929-6933.

20. Distasio J.A., Salazar A.M., Nadji M., Durden D.L. Glutaminase-free asparaginase from vibrio succinogenes: an antilymphoma enzyme lacking hepatotoxicity. Int J Cancer. 1982 Sep 15;30(3):343-7. No abstract available. (1982) Int. J. Cancer 30, 343-347.

21. Dhar S.K., Soni R.K., Das B.K., Mukhopadhyay G. Molecular mechanism of action of major Helicobacter pylori virulence factors. Mol Cell Biochem. 2003 Nov;253(l-2):207-15.

22. Dunlop P.C., Meyer G.M., Ban R.J. Characterization of two forms of asparaginase in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem., 1978, vol. 253(4), p. 1297-1304.

23. Dunlop P.C., Meyer G.M., Roon R.J. Nitrogen catabolite repression of asparaginase II in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacterid., 1980, vol. 143(1), p. 422-426

24. Elitsur Y., Yahav J. Helicobacter pylori infection in pediatrics. Helicobacter. 2005; 10 Suppl 1:47-53.

25. Feinberg W.M., Swenson M.R., Cerebrovascular complications of L-asparaginase therapy. Neurology, 1988, vol. 38, pp. 127-133.

26. Filpula D., Nagle J.W., Pulford S., Anderson D.M. Sequence of L-asparaginase gene from Erwinia chrysanthemi NCPPB 1125. Nucleic Acids Res. 1988 Nov 11; 16(21): 10385.

27. Fine B.M., Kaspers G.J., Ho M., Loonen A.H., Boxer L.M. A genome-wide view of the in vitro response to 1-asparaginase in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 2005 Jan l;65(l):291-9.

28. Gouet P., Courcelle E., Stuart D.I. & Metoz F., (1999) ESPript: analysis of multiple sequence alignments in PostScript. Bioinformatics 15, 305-308.

29. Guo Q.L., Wu M.S., Chen Z. Comparison of antitumor effect of recombinant L-asparaginase with wild type one in vitro and in vivo. Acta Pharmacol Sin. 2002 Oct; 23(10):946-51.

30. Goward C.R., Tattersall R., Atkinson T. Bioseparation, 1992, vol. 2(6), pp. 335341.

31. Hartree E.F. Anal. Biochem. 1991, vol. 192, pp. 215-218.

32. Haskell C.M. ed. Cancer Treatment 3 rd ed. Philadelphia: W.B Saunders Co. 1980, 130 p.

33. Herrmann V., Rohm K.H., Schneider F. On the substrate specificity of L-asparaginase from E. coli. FEBS Lett. 1974 Feb 15; 39(2):214-7.

34. Ho D.H., Whitecar J.P. Jr, Luce J.K., Frei E. L-asparagine requirement and the effect of L-asparaginase on the normal and leukemic human bone marrow. Cancer Res. 1970 Feb;30(2):466-72.

35. Jameel F., Bogner R., Mauri F., Kalonia D. Investigation of physicochemical changes to L-asparaginase during freeze-thaw cycling. J Pharm Pharmacol., 1997, vol. 49 (5), pp. 472-477.

36. Jennings M.P., Beacham I.R. Analysis of the Escherichia coli gene encoding L-asparaginase II, ansB, and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins. J Bacteriol. 1990 Mar;172(3):1491-8.

37. Kafkewitz'D, Bendich A. Enzyme-induced asparagine and glutamine depletion and immune system function. (1983) Am J Clin Nutr. 37,1025-30.

38. Kane J.F., (1995) Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 494-500

39. Keefer J.F., Moraga D.A., Schuster S.M. Comparison of glycine metabolism in mouse lymphoma cells either sensitive or resistant to L-asparaginase. Biochem. Pharmacol. 1985. 34, 559-565.

40. Kitto G.B., Smith G., Theit Т.О. et al. Tumor inhibitory and non-inhibitory L-asparaginase from Ps. Geniculata. J. Bacteriol., 1979, vol. 137(1), pp. 204-212.

41. Kobs G., (1997) Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM®-T Vector Systems. Promega Notes 62, 15.

42. Rohm K.H., Schneider F. Kinetic studies on the mechanism of asparaginase from E. coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1971 Dec; 352(12):1739-43

43. Kozak M, Borek D, Janowski R, Jaskolski M. Crystallization and preliminary crystallographic studies of five crystal forms of Escherichia coli L-asparaginase II (Asp90Glu mutant).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002 Jan;58(Pt 1): 130-2

44. Kozak M, Jaskolski M, Rohm KH. Preliminary crystallographic studies of Y25F mutant of periplasmic Escherichia coli L-asparaginase.Acta Biochim Pol. 2000;47(3):807-l 4

45. Krasotkina J., Borisova A., Gervaziev Y., Sokolov N. One step purification and kinetic properties of the recombinant L-asparaginase from Erwinia carotovora.Biotechnol. Appl. Biochem., 2004, vol. 39(2), pp.215-221.

46. Kristiansen Т., Einarson M., Sundberg L., Porath J. Purification of L-asparaginase from E. coli by specific adsorption and desorbtion // FEBS Lett., 1970, vol. 7, p. 294-298.

47. Laboureur P., Langlois C., Labrousse M. et al. L-asparaginases d' Escherichia coli. 1. Proprietes des formes natives. Biochimie, 1971, vol. 53(11/12), pp. 11471156.

48. Law A.S., Wriston J. Purification and properties of Bacillus coagulans L-asparaginase // Arch. Biochem. Blophys., 1971, vol. 147(2), p. 744-752.

49. Lee S.M., Wroble M.H., Ross J.T. Large-scale recovery and purification of L-asparaginase from Erwinia carotovora. Appl. Biochem. Biotechnol., 1986, vol. 12, pp. 229-246.

50. Lee S.M., Wroble M.H., Ross J.T. L-asparaginase from Erwinia carotovora. An improved recovery and purification process using affinity chromatography. Appl. Biochem. Biotechnol. 1989, vol. l,pp. 1-11.

51. Lubkowski J., Palm G.J., Gilliland G.L., Derst C., Ro"hm K.H., Wlodawer A., (1996) Eur. J. Biochem. 241, 201-207.

52. Lubkowski J., Wlodawer A., Ammon H.L., Copeland T.D., Swain A.L. Structural characterization of Pseudomonas 7A glutaminase-asparaginase // Biochemistry, 1994, vol. 33, pp. 10257-10265, (a).

53. Magalhaes Queiroz D.M., Luzza F. Epidemiology of Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 2006 Oct; 11 Suppl 1:1-5.

54. Maita Т., Matsuda G. The primary structure of L-asparaginase from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1980;361(2):105-17

55. Manson S.D., Mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma. Semin Oncol Nurs. 2006 May; 22(2):73-9

56. Marais A., Mendz G.L., Hazell S.L., Megraud F. Metabolism and genetics of Helicobacter pylori: the genome era. Microbiol Mol Biol Rev. 1999 Sep; 63(3):642-74.

57. Mashburn L.T., Wriston J.C., Jr. Change in ribonuclease concentrations in L~ asparaginase-treated lymphosarcomata. Nature. 1966 Sep 24; 211(5056): 1403-4.

58. Mashburn L.T., Wriston J.C., Jr. Tumor inhibitory effect of L-asparaginase from Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 1964 May; 105: 450-2.

59. Meister A., Levintow L., Greenfield R.E., Abendschein P.A. Hidrolysis and transfer reaction catalyzed by omega-amidase preparation // J. Biol. Chem., 1955, vol. 215, pp. 441-447.

60. Meister, A. (1955) Methods in Enzymology II, pp. 380-385, Academic Press, New York

61. Miller M, Rao J.K.M., Wlodawer A. and Gribskov M.R., (1993) FEBS Lett. 328, 275-279.

62. Moayyedi P, Soo S, Deeks J, Delaney B, Harris A, Innes M, Oakes R, Wilson S, Roalfe A, Bennett C, Forman D. Eradication of Helicobacter pylori for non-ulcer dyspepsia. Cochrane Database Syst Rev. 2006 Apr 19;(2):CD002096.

63. Moayyedi P, Forman D, Duffett S, Mason S, Brown J, Crocombe W, Feltbower R, Axon A; Leeds HELP Study Group. Association between Helicobacter pylori infection and adult height. Eur J Epidemiol. 2005; 20(5):455-65.

64. Moola Z.B., Scawen M.D., Atkinson T. and Nicholls D.J. (1994) Erwinia chrysanthemi L-asparaginase: epitope mapping and production of antigenically modified enzymes. Biochem. J., 302, 921-927

65. Muller H.J., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 1998, vol. 28, pp. 97-113.

66. Nakamura N., Fujio Т., Tanaka M. On the productivity and properties of L-asparaginase from Escherichia coli A-1-3 // Agr. Biol. Chem., 1972, vol. 36(12), p. 2251-2253

67. Nalepka E.R., McCue B.A., Norton S.J. Regulation of L-asparaginase in Lactobacillus plantarum // Texas J. Sci., 1981, vol. 33(2/4), p. 87-101.

68. Narta U.K., Kanwar S.S., Azmi W. Pharmacological and clinical evaluation of l-asparaginase in the treatment of leukemia. (2007) Crit Rev Oncol Hematol. 61, 208-221

69. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., Gvon Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10:1-6, 1997.

70. North A.C., Wade H.E., Cammack K.A. Physicochemical studies of L-asparaginase from Erwinia carotovora. Nature. 1969 Nov 8; 224(5219):594-5.

71. Palm G.J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Rohm K.H., Wlodawer A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: crystal structure of a Thr-89-Val mutant // FEBS Lett., 1996, vol. 390, pp. 211-216.

72. Pastan I., Perlman R. Cyclic adenosine monophosphate in bacteria. Science. 1970 Jul 24; 169(943):339-44.

73. Peek R.M. Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Springer Semin Immunopathol. 2005 Sep; 27(2): 197-215.

74. Peterkofsky A., Gazdar C. Glucose inhibition of adenylate cyclase in intact cells of Escherichia coli B. Proc Natl Acad Sci USA. 1974 Jun; 71(6):2324-8.

75. Pritsa A.A., Papazisis K.T., Kortsaris A.H., Geromichalos G.D., Kyriakidis. Antitumor activity of L-asparaginase from Thermus thermophilus. Anticancer Drugs. 2001 Feb; 12(2): 137-42.

76. Rieder G, Fischer W, Haas R. Interaction of Helicobacter pylori with host cells: function of secreted and translocated molecules. Curr Opin Microbiol. 2005 Feb; 8(l):67-73.

77. Roberts J., Schmid F.A., Rosenfeld H.J. Biologic and antineoplastic effects of enzyme-mediated in vivo depletion of L-glutamine, L-tryptophan, and L-histidine. Cancer Treat Rep. 1979 Jun;63(6):l 045

78. Roberts J., Holcenberg J.S., and Dolowy W.C., (1972) J. Biol. Chem. 247, 8490.

79. Rohm K.H., and Van Etten, R. L. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 244, 128136.

80. Schmid F.A., Roberts J. Antineoplastic and toxic effects of Acinetobacter and Pseudomonas glutaminase-asparaginases. Cancer Chemother. Repp., 1974, vol. 58, pp. 829-840.

81. Schwartz J.H., Reeves J.Y., Broome J.D. Two L-asparaginases from E. coli and their action against tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 1966 Nov; 56(5): 15169.

82. Schwartz J.H. Asparaginase II of Escherichia coli: Bacterial physiology and enzymatic mechanism of action // In: Intern, symp. L-asparaginase. Paris, 1970, N 197, p. 79-85.

83. Shifrin S., Parrott C.L., Luborsky S.W. Substrate binding and intersubunit interactions in L-asparaginase. J Biol Chem. 1974 Mar 10; 249(5): 1335-40.

84. Spring K.J., Jerlstrom P.G., Burns D.M. & Beacham I.R. (1986). L-Asparaginase genes in Escherichia coli: isolation of mutants and characterization of the ansA gene and its protein product. J. Bacteriol. 166, 135-142

85. Stingl K., De Reuse H. Staying alive overdosed: how does Helicobacter pylori control urease activity? Int J Med Microbiol. 2005 Sep; 295(5):307-l 5.

86. Story M.D., Voehringer D.W., Stephens L.C., Meyn R.E. L-asparaginase kills lymphoma cells by apoptosis. Cancer Chemother. Pharmacol., 1993, vol. 32, pp. 129-133.

87. Swain A.L., Jaskolski M., Housset D., Rao J.K.M., Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, pp. 1474-1478.

88. Taguchi T. Recent advances in L-asparaginase studies. Gan To Kagaku Ryoho., 1988, vol. 15, pp. 1815-1825.

89. Taylor C.W., Dorr R.T., Fanta P., Hersh E.M., Salmon S.E. A phase I and pharmacodynamic evaluation of polyethylene glycol-conjugated L-asparaginase in patients with advanced solid tumors. Cancer Chemother. Pharmacol., 2001. vol. 47(1), pp. 83-88.

90. Tytgat G.N., Rauws E.A., De Koster E. Campylobacter pylori. Scand J Gastroenterol Suppl. 1988; 155:68-81.

91. Ueno Т., Ohtawa K., Mitsui K., Kodera Y., Hiroto M., Matsushima A., Inada Y., Nishimura H. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. Leukemia, 1997, vol. 11, pp. 1858-1861.

92. Wade H.E. Synthesis and functions of microbial asparaginases and glutaminases. // In Payne, J.W. (Ed.), Microorganisms and Nitrogen Sources, Wiley, Chichester, 1980, p. 563-575.

93. Warrell R.P. Jr, Arlin Z.A., Gee T.S., Chou T.C., Roberts J., Young C.W., Clinical evaluation of succinylated Acinetobacter glutaminase-asparaginase in adult leukemia.Cancer Treat Rep. 1982 Jul;66(7): 1479-85.

94. Willis R.C. & Woolfolk C.A. (1974) Asparagine utilization in Escherichia coli. J Bacteriol 118, 231-241.

95. Wriston J.C. Asparaginase. Methods Enzymol., 1985. 113, 608-618.

96. Yun M.K., Nourse A., White S.W., Rock C.O. & Heath R.J. (2007) Crystal structure and allosteric regulation of the cytoplasmic Escherichia coli L-asparaginase I. J Mol Biol 369, 794-811

97. Zhou M.-Y., Clark S.E. and Gomez-Sanchez C.E., (1995) Universal cloning method by ТА strategy. BioTechniques 19, 34.

98. Борисова A.A. Рекомбинантная L-аспарагиназа Erwinia carotovora: разработка способа выделения гомогенного препарата фермента и его свойства. Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. М., 2003, 127с.

99. Гершанович В.Н. Репрессия катаболитами в бактериальной клетке // Успехи совр. Биологии, 1970, т. 69(1), с. 49-71.

100. Гершанович В.Н. Роль циклического аденозин-3',5'-монофосфата в регуляции транкрибирования бактериальных генов // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1977, № 3, с. 429-439.

101. Доман Н.Г., Феденко Е.П. Биологическая роль АМФ // Успехи биол. химии., 1976, т. 17, с. 63-101.

102. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. // Справочник биохимика, с. 465-466. Пер. с англ. М.: Мир, 1991.

103. Красоткина Ю.В., Соколов Н.Н. Структура и функции бактериальной аспарагиназы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. В печати. 2008

104. Кривошеина Е.Л., Бельченко Д.И. Особенности некоторых клинико-лабораторных показателей в зависимости от течения и исходов острого лимфобластного лейкоза у детей. // Педиатрия, 2005, №3 С.40-43.

105. Ленинджер А. Основы биохимии. М., Мир, 1985, с. 233-235.

106. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Соколов Н.Н., Козлов Е.А., Куцман М.Е Выделение и свойства гомогенного препарата L-аспарагиназы из Pseudomonas fluorescens АГ // Биохимия, 1975, т. 40(5), с. 984-989.

107. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. //Экспериментальная биология. Пер. с англ. М.: Мир, 1967.

108. Озолинь Р.К., Гривиня П.П., Савенкова Л.Ф. и др. Аспарагиназа и сериндегидратаза микроорганизмов: Продуценты, регуляция и свойства // Рига, Зинатне, 1985, 150 с.

109. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами, М. «Наука», 1983. с. 304

110. Павлова М.П. Гематологические болезни у детей, п/ред. М.П. Павловой. (1996), Учебн. Пособие, Минск, 440с.

111. Свежова Н.В., Шаркова В.Е., Громов Д.Б., Головаченко В.А., Полынцев Д.Г. Методы математической обработки данных в иммуноферментном анализе. // Клиническая лабораторная диагностика, 2008, №1, С.3-17.

112. Соколов Н.Н., Занин В.А., Александрова С.С. Бактериальные L-аспарагиназы и глутамин(аспарагин)азы: некоторые свойства, строение и противоопухолевая активность // Вопр. мед. химии., 2000, т. 46(6), с. 531-548.

113. Соколов Н.Н., Эльдаров М.А., Сидорук К.В., Жгун А.А., Борисова А.А., Александрова С.С., Омельянюк Н.М., Богуш В.Г., Красоткина Ю.В., Гервазиев Ю. В., Покровская М.В., Соков Б.Н., Березов Т.Т., Скрябин К.Г.,

114. Арчаков А.И. Разработка противоопухолевого препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora. // Молекулярная медицина №1 2005 С. 4553.

115. Тимаков A.M., Кондратчик K.JL, Тиганова О.А. Пегилированная форма аспарагиназы альтернатива нативной Е. coli аспарагиназы? // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии, 2003, т.2, №4, с. 9296.

116. Тимаков A.M., Кондратчик K.JL, Хондкарян Г.Ш., Муторова О.Ю., Ковалева O.JI. Препараты L-аспарагиназы в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии, 2003,т.2, №3, с. 90-93.