Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ"

На правах рукописи

Мезенцев Юрий Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ Ь-АСПАРАГИНАЗ

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□306558и

Москва 2007

003065580

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Иванов Алексей Сергеевич

Официальные оппоненты*

кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

доктор биологических наук, профессор Шумянцева Виктория Васильевна

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М В Ломоносова, химический факультет

Защита диссертации состоится «11» октября 2007 года в 14 00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001 010 01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г Москва, ул Погодинская, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « » сентября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук

Карпова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Бактериальные L-аспарагиназы (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3 5 11) используются в терапии опухолевых заболеваний и считаются одним из самых эффективных средств при лечении острого лимфобластного лейкоза Объектом действия L-аспарагиназы является периплазматический L-аспарагин, ее главный субстрат Снижение периплазматической концентрации L-аспарагина приводит в результате к снижению его количества внутри клетки В отличие от нормальных клеток в лейкозных клетках экспрессия L-аспарагинсинтетазы выражена слабо или отсутствует вовсе Поэтому опухолевые клетки не могут отреагировать адекватно на снижение внутриклеточного уровня L-аспарагина, в то время как в нормальных клетках уровень L-аспарагина своевременно восполняется В свою очередь нехватка этой аминокислоты приводит к ингибированию белкового синтеза в клетке, что в итоге вызывает ее апаптоз Более того, L-аспарагиназа действует исключительно в периплазматическом пространстве без проникновения внутрь клетки, что принципиально отличает механизм ее действия от прочих противоопухолевых препаратов (Тимаков AM и др, 2003)

Однако продолжительная терапия с использованием препаратов бактериальных L-аспарагиназ сопровождается большим количеством побочных эффектов вплоть до развития анафилактического шока С учетом токсического действия разных препаратов бактериальных L-аспарагиназ к клиническому применению в настоящее время допущены лишь две L-аспарагиназы бактериального происхождения, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coli и Erwima chrysanthemi Согласно общепринятому мнению, токсический эффект бактериальных L-аспарагиназ является следствием проявления этими ферментами глутаминазной активности Другой причиной токсического эффекта бактериальных L-аспарагиназ по мнению ряда исследователей является ß-аспартилпептидная активность этих ферментов (Kelo Е et al, 2002) Более того, считается, что белки с из-за мультисубъединичной структуры бактериальные L-аспарагиназы вызывают аллергическую реакцию у пациентов в процессе энзимотерапии их препаратами (Goodsell D S , 2005)

Большинство бактериальных L-аспарагиназ является гомотетрамером с четырьмя активными центрами Если учесть тот факт, что их активный центр формируется в области контакта между двумя субъединицами, то очевидна роль олигомеризации L-аспарагиназы в процессе формирования ее активных центров и, как следствие, в ее субстратной специфичности Димер L-аспарагиназы, имея два активных центра, не способен расщеплять L-аспарагин, и лишь только тетрамер L-аспарагиназы обладает такой активностью (Ehrman М et al, 1971, Kotzia GA et al, 2005, Kozak M et al, 2000, Kiasotkma J et al, 2004,

Lubkowski J et al, 2003, Marlborough DI et al, 1975, Shifrrn S et al, 1974) Несмотря на широкий интерес, проявляемый на протяжении многих лет к L-аспарагиназе, в литературе практически отсутствуют какие либо данные по олигомеризации этого фермента

На сегодняшний день существует множество доступных методов, с помощью которых возможно исследование белок-белковых взаимодействий и, в частности, олигомеризации мультисубъединичных белков Многие экспериментальные подходы позволяют регистрировать белок-белковые взаимодействия в широком диапазоне концентраций, однако не все дают возможность оценивать стехиометрию образующихся комплексов

Существуют также биоинформационные подходы, позволяющие предсказывать возможность белок-белковых взаимодействий, оценивать устойчивость образующихся белковых комплексов, определять специфические контактные участки в белок-белковых взаимодействиях и т д

Совместное использование экспериментальных и биоинформационных методов дает возможность более эффективно решать различные задачи, направленные на исследование белок-белковых взаимодействий и, в частности, процесса олигомеризации мультисубъединичных белков Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в определении молекулярных основ и специфичности белок-белковых взаимодействий при олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1 Построить модели пространственных структур L-аспарагиназ Erw carotovora, Helicobacter pylori J99 и Helicobacter pylori 26695, а также модели химерных тетрамеров, образующихся в экспериментах по исследованию специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

2 Выполнить сравнительный молекулярно-графический анализ области контакта между субъединицами для L-аспарагиназ из Erwima carotovora и Erw chrysanthemi и для моделей химерных тетрамеров

3 Разработать методику иммобилизации, диссоциации и восстановления олигомерной структуры бактериальных L-аспарагиназ на поверхности оптического чипа для экспериментального изучения олигомеризации данных ферментов с помощью технологии оптического биосенсора

4 Оценить специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ с помощью оптического биосенсора Biacore 3000

Научная новизна работы

Впервые был исследован процесс олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ с помощью комбинации методов молекулярного моделирования и технологии оптического биосенсора

Были построены модели тетрамеров L-аспарагиназ из Н pylori J99 и Н pylori 26695, для которых на данный момент отсутствуют кристаллографические данные

Для L-аспарагиназ из Е coli и из Erw carotovora были определены ключевые аминокислотные остатки контактных областей субъединиц, определяющие стабильность тетрамерного комплекса L-аспарагиназы Практическая значимость исследования

Результаты, полученные в работе, могут служить основой для разработки модифицированных форм L-аспарагиназ С одной стороны, тетрамеры модифицированных L-аспарагиназ могут быть более устойчивыми в плазме крови человека, что означает пролонгированное действие препарата, и, как следствие, позволяет снижать его лечебные дозы, вводимые пациентам С другой стороны, разработка новых препаратов L-аспарагиназ может идти по пути снижения молекулярного веса активной формы этого бежа, т е за счет получения активных димеров, не агрегирующих в комплексы более высокого порядка, что значительно снизит иммунную реакцию организма пациента

Разработанная методика иммобилизации и мониторинга процессов диссоциации и олигомеризации бактериальных L-аспаргиназ в дальнейщем может быть успешно использована в работах с другими олигомерными белками Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005), на V Международной конференции «Biomformatics of genome regulation and structure» (Новосибирск, 2006), на научной конференции ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН (Москва, 2007) По материалам диссертации опубликовано 3 статьи Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 4-х глав обзора литературы, главы «Материалы и методы», 11-и глав раздела «Результаты и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 202 источника Работа изложена на 113 страницах текста, содержит 31 рисунок и 20 таблиц

Исследование выполнено на базе ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке РФФИ (гранты 04-04-49085 и 07-04-00575)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть

Реагенты

1) Следующие растворы и реагенты были получены от Biacore (Швеция)

- HBS-буфер (150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактанта Р20, 10 мМ HEPES.

pH 7,4),

-10 мМ ацетатный буфер, pH 4,5,

- 10 мМ глицин-НС], pH 2,5,

- набор реагентов для ковалентной иммобилизации лигандов за первичные аминогруппы EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид), NHS (N-гидроксисукцинимид), этаноламин-НС1

2) L-аспарагиназы Erw carotovora, Н pylori J99 и Н pylon 26695 (чистоты препаратов более 95 %), любезно предоставление кбн Красоткиной ЮВ (ГУ НИИ БМХ РАМН, Москва)

3) L-аспарагиназа Е coli (Medac, Германия)

4) L-аспарагиназа Erw chrysanthemi (Sigma)

Эксперименты no изучению процесса олигомеризации L-аспарагиназы Erw carotovora

Эксперименты были выполнены на оптическом биосенсоре Biacore 3000 (Biacore, Швеция), использующем эффект поверхностного плазмонного резонанса для регистрации межмолекулярных взаимодействий (Myszka DG et al, 1997, Jonsson U et al, 1991) В работе использовали стандартные оптические чипы СМ5 с карбоксиметилдекстрановым покрытием Иммобилизация L-аспарагиназы Erw carotovora на поверхности оптического чипа CMS

Карбоксиметилированный декстран на поверхности чипа СМ5 был активирован путем инъекции смеси 0,2 М EDC /0,05 М NHS в течение 10 мин при скорости 1 мкл/мин с последующей промывкой HBS-буфером при той же скорости в течение 3 мин Затем была выполнена иммобилизация L-аспарагиназы Иммобилизация проходила по боковым аминогруппам остатков лизина и N-концевой аминокислоты, расположенных на поверхности (рис 1), путем пропускания раствора белка (5 мкг/мл) в иммобилизащионном буфере (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,5) в течение 10 мин при скорости потока 1 мкл/мин Далее через измерительную кювету пропускался раствор этаноламина (1 М) для инактивации непрореагировавших эфирных групп на поверхности чипа После иммобилизации L-аспарагиназы пропускание через измерительную кювету рабочего буфера (HBS-буфер) приводит к постепенному снижению уровня сигнала биосенсора Возможной причиной этого снижения может быть диссоциация иммобилизованных тетрамеров белка Если в процессе диссоциации тетрамеров L-аспарагиназы приостановить ток рабочего буфера, наблюдается

остановка дрейфа сигнала, что может быть обусловлено быстрым установлением равновесия (тетрамер<->димср<к>мономер), сильно смещенным в сторону тетрамеров При возобновлении тока буфера распад продолжается с уровня сигнала на момент остановки Поэтому на оптическом чипе иммобилизуются преимущественно тетрамеры белка Далее карбоксильные группы декстрана, активированные 18. но не прореагировавшие с

Ь-аспарагиназой, были блокированы путем инъекции 1 М этаноламина (рН 8,5) в течение 7 мин при скорости потока 1 мкл/мин, после чего следовала промывка рабочим буфером Количество иммобилизованного белка составило 7800 1Ш, что соответствует примерно 7,8 нг бежа/мм2 поверхности Схема иммобилизации представлена на рисунке 1

Время, с

Рисунок 1 Схема иммобилизации L-аспарагиназы Erw carotovora на карбоксиметилдекстрановой поверхности чипа СМ5 Стрелками обозначены следующие добавки 1 - 0,2 М EDC /0,05 М NHS, 2 - HBS-буфер, 3 - раствор L-аспарагиназы (5 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,5), 4 - 1 М раствор этаноламина (рН 8,5), Им - количество иммобилизованного белка

Ускорение процесса диссоциации иммобилизованной L-аспарагиназы достигалось за счет пропускания глицинового буфера (рН 2,5)

Олигомеризация L-аспарагиназы, иммобилизованной на поверхности оптического чипа, осуществлялась путем пропускания растворов L-аспарагиназы в иммобилизационном буфере

Эксперименты по изучению специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

Для оценки специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ в разных каналах были иммобилизованы L-аспарагиназы из Е coli, Н pylori J99 и Н pylori 26695 Иммобилизованные L-аспарагиназы диссоциировали на субъединицы, после чего через каналы пропускались растворы следующих L-аспарагиназ

- L-аспарагиназа из Е coli (50 мкг/мл),

- L-аспарагиназа из Н pylon J99 (250 мкг/мл),

- L-аспарагиназа из Erw chrysanthemi (50 мкг/мл),

- L-аспарагиназа из Н pylori 26695 (250 мкг/мл) Биоинформационная часть

Исходные данные для мочекучярного моделирования

• Аминокислотные последовательности L-аспарагиназ Erw carotovora (Q6Q4F4), Н pylori J99 (Q9ZLB9) и Н pylori 26695 (025424) были взяты на протеомном сервере ExPASy (Kotzia G А et al, 2005, Bell KS etal, 2004, Apweiler R et al, 2004)

• Аминокислотные последовательности L-аспарагиназ с известными кристаллическими структурами из разных источников (Е coli, Wohnella succmogenes, Pseudomonas 7A, Erw chrysanthemi, Erw carotovora) были взяты из соответствующих файлов белкового банка данных Protein Data Bank (PDB) (Berman HM et al, 2000) (PDB индексы 3ECA (Swam AL et al, 1993), 1WSA (Lubkowski J etal, 1996), 4PGA (Jakob CG etal, 1997), 107J (Lubkowski J etal, 2003), 1ZCF (Кислицын ЮАидр, 2006))

• Трехмерные координаты кристаллических структур L-аспарагиназ Erw chrysanthemi, W succmogenes, E coli были получены из банка данных PDB (PDB индексы 107J (Lubkowski J etal, 2003), 1HG1 (Aghaiypour К etal, 2001), 1HFW (AghaiypourК etal, 2001), 1HG0 (Aghaiypour К et al, 2001), 1HFJ (Jaskolski M etal, 2001), 1HFK (Jaskolski M et al, 2001), 3ECA (Swain A L et al, 1993), 1WSA (Lubkowski I etal, \ 996)) Испочьзованное программное обеспечение

• Сигнальная участок в аминокислотной последовательности фермента был определен с помощью программы SignalP 3 0 Server (Bendtsen J D et al, 2004)

• Множественное выравнивание последовательностей L-аспарагиназ из разных источников (Erw carotovora, Erw chrysanthemi, W succmogenes, Pseudomonas 7A, E coli, H pylori 399 и H pylori 26695) было выполнено с помощью программы ClustalW 1 83 (Higgins D et al, 1994)

• С целью определения аминокислотных остатков, образующих интерфейс между субъединицами в тетрамере L-аспарагиназы и выявления среди них значимых был выполнен анализ зоны контакта между мономерами с помощью виртуального аланинового сканирования на сервере Robetta (Kortemme Т et al, 2004) Для этого каждый аминокислотный остаток поочередно заменяли на аланин и оценивали изменение энергии взаимодействия между субъединицами в результате замены по уравнению, приведенному в общем виде (Kortemme Т etal, 2004)

ДЕд/в = (Ед/в - Ед - Eß) - (Е'А/В " Е'А " Е'вХ

где ДЕд/в — изменение энергии связывания между партнерами белок-белкового взаимодействия до и после замены, Ед/g - свободная энергия комплекса дикого типа, Ед -свободная энергия белка-партнера А дикого типа, Eg - свободная энергия белка-партнера В дикого типа, В'д/в ~~ свободная энергия комплекса мутантного типа, Е'д - свободная энергия белка-партнера А мутантного типа, Е'в - свободная энергия белка-партнера В мутантного типа

• Следующие процедуры были выполнены с помощью программного комплекса Sybyl 6 9 1 (Tripos Inc ) на сервере SQI 0rigin200 с использованием поля сил Tripos и расчетом зарядов по методу Gasteiger-Huckel

Моделирования трехмерной структуры L-аспарагиназ Erw carotovora, H pylori J99 и H pylori 26695

Для этого с помощью программы SignalP 3 0 Server был выполнен анализ последовательностей данных L-аспарагиназ, полученных с протеомного сервера ExPASy, после чего установленный сигнальный фрагмент был удален Далее с помощью множественного выравнивания аминокислотных последовательностей был выполнен поиск ближайших гомологов среди L-аспарагиназ с известной трехмерной структурой Выбранные для моделирования гомологи и аминокислотные последовательности моделируемых L-аспарагиназ использовались в программе Composer В белках программой определялись области близкие между собой по аминокислотной последовательности, которые позднее укладывались по аналогии с гомологичными структурами Для негомологичных фрагментов в последовательности моделируемого белка выполнялся поиск гомологичных структур по базе программы Далее полученный мономер оптимизировался путем минимизации свободной энергии В результате четыре копии построенного в Composer мономера L-аспарагиназы совмещались с соответствующими мономерами в гомологичной L-аспарагиназе

Оптимизация молекулярных моделей и моделирование молекулярной динамики структуры L-аспарагиназы

Минимизация энергии моделей L-аспарагиназы была выполнена по методу Powell с максимальным числом итераций 600 Моделирование молекулярной динамики трехмерных моделей L-аспарагиназ было выполнено в вакууме при постоянной температуре 300°К с продолжительностью 20 пс и шагом 1 фс Оценка энергии межсубъединичного взаимодействия

Энергию взаимодействия между мономерами и димерами вычисляли по формуле

Е=Вав-(Еа + Ев),

где Е - энергии взаимодействия партнера А с партнером В, Едц - энергия комплекса, Ед - энергия партнера A, Eg - энергия партнера В

Моделирование химерных тетрамеров L-аспарагиназ

Модели химерных тетрамеров были получены в результате замены субъединицы А на соответствующую субъединицу L-аспарагиназы другого вида

• Валидация полученных моделей была выполнена с помощью карт Рамачандрана, построенных в программе PROCHECK 3 4 4 (Laskowski RA et al, 1993) и сравнительного анализа структур L-аспарагиназ с помощью программы LGA (ver 03/2003) на сайте Protem Structure Prediction Center (Zemla A, 2003)

• С помощью программного пакета Amber 7 с использованием поля сил Amber выполнялась оптимизация моделей химерных тетрамеров L-аспарагиназ (Case DA et al, 2004) Для этого в программе LEaP подготавливались файлы координат и топологии для всех оптимизируемых структур Далее в программе SANDER для химерных тетрамеров выполнялись минимизация энергии и моделирование молекулярной динамики в водном боксе при постоянном объеме и температуре 300 "К с продолжительностью 20000 фс и шагом 50 фс

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Иммобилизация L-аспарагиназы из Erw. carotovora и мониторинг процессов ее диссоциации и олигомеризации

L-аспарагиназа из Erw carotovora была иммобилизована в одном из каналов оптического биосенсора по методике, описанной в разделе «Материалы и методы» В качестве контроля использовался канал с декстраном без иммобилизованного белка После иммобилизации L-аспарагиназы наблюдался процесс распада тетрамеров фермента при длительном пропускании HBS-буфера через измерительную кювету (рис 2) Через несколько дней уровень сигнала биосенсора снизился примерно в 4 раза Если учесть, что в препаратах L-аспарагиназы отсутствуют примеси протеолитических ферментов, можно предположить, что четырехкратное снижение уровня сигнала прибора свидетельствует о распаде тетрамеров до мономеров При пропускании 10 мМ раствора глицин-HCl (рН 2,5) скорость снижения сигнала резко возрастала, что указывает на увеличение интенсивности распада тетрамеров, что связано со снижением устойчивости олигомерного состояния L-аспарагиназы при данном значении рН (Sidney Shifrin et al, 1974) Восстановление тетрамеров L-аспарагиназы на поверхности оптического чипа осуществлялось путем пропускания раствора L-аспарагиназы в иммобилизационом буфере (10 мМ ацетатный буфер, рН 4,5), что приводило к резкому повышению концентрации белка на поверхности чипа за счет электростатического притяжения положительно заряженного белка с отрицательно

заряженной поверхностью чипа В растворе Ь-аспарагиназы существует равновесие тетрамер<н-димер<->мономер При пропускании раствора через измерительную кювету оптического биосенсора происходит захват иммобилизованными мономерами субъединиц Ь-аспарагиназы из раствора до полного восстановления тетрамеров, что сопровождается увеличением уровня сигнала биосенсора После промывки НВБ-буфером уровень сигнала биосенсора возрастал в 4 раза, что свидетельствует о произошедшей олигомеризации фермента с восстановлением его тетрамерной формы (рис 3) Эксперименты по разрушению тетрамеров Ь-аспарагиназы до мономеров с последующим их восстановлением удавалось многократно повторять на одном оптическом чипе

Время* часы

Рисунок 2 Самопроизвольный распад тетрамеров Ь-аспарагиназы при пропускании НВБ-буфера (скорость потока 1 мкл/мин)

10000 20000 Время с

Рисунок 3 Распад тетрамеров Ь-аспарагиназы при пропускании 10 мМ раствора ГЛИЦИН-НС1 (рН 2,5) (скорость потока 1 мкл/мин) и последующая олигомеризация фермента при пропускании раствора Ь-аспарагиназы в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,5) (скорость потока 1 мкл/мин)

Моделирование 1лфенарш нназы из Erw. earotovora.

Для того чтобы оценить ориентацию гетрамсров L-аспарагиназы на поверхности оптического чипа и характер связывания с карб окснмети л иро ванным дегсетрапом, необходимо было предварительно проанализировать поверхность белка на возможные мес та связывания. Однако на момент выполнения работы кристаллическая структура L-аспарагйназы из En с. earotovora еще была неизвестна (кристаллографические данные с разрешением 3 Ä для структуры L-аспарагиназьз из Em. earotovora были опубликованы в PDB только líj.04.06, PDB индекс 12CF (Кислицын ЮЛ. к др., 2006)), поэтому первоочередной задачей было созданий компьютерных трехмерных моделей мономера и гетрам ер а данного фермента.

Моделирование пространственной структуры L-асн apara пазы из Erw. earotovora и ее оптимизаций были выполнены по методике, описанной в разделе материалы к методы, Было установлено, чго ближайшим гомологом L-аспарапшалы из Erw. earotovora является L-зспарагнназа из Erw. Chrysanthemi. Оптимктроаакния модель тетрамера Ь-аспарагШШМ Er и', earotovora представлена на рисунке 4.

Рисунок 4. Схематичное изображение мономера L-аспарагиназы (а) и тетрамора (G) L-аспарагйназы (субьедашщы обозначены Л, В, С, D и отображены разными опенками серого),

Валидация полученных моделей L-аспарагиказ

Адекватность полученной виртуальной модели L-аспарапшазы из Erw. earotovora была проверена путем построения и анализа, карт Рамачандрана \рис. 5) в. программе PvoChcck н с помощью сравнительного анализа в программе LGA (табл. 2). Результаты Программы ProCheck представлены es таблице i. Карты Рамачандрана были построены для каждой су&ьединицы фермента. В виду идентичности полученных карт для всех четырех су&ьедиииц на рисунке 5 приведена карта Рамачандрана для субъедшшцы А. 11а картах для L-аспарагниаз из Erw. earotovora и Erw. chrysanthemi значения углов всех аминокислотных остатков укладываются в допустимых зонах, исключением является треонин 204. Однако это

исключение имеет место в обеих L-аспарагиназах. Остаток греоннна 204 для бактериальных L-аспарагиназ является консервативным. Более того, такая аномальная конфирмация этого остатка присутствует и в других бактериальных L-аспарагиназад (Swain д.ь. et id., 1993: Luhkewski J. el ul.. ! 994a; 3 994b; i 996; 2003), Треонин 204 рзслоложе.ч в самом начале линкерного участка, соединяющего между собой С-кокцевой и N-конценой домены. Данная область белка характеризуется ныеокой подвижностью в сравнении с доменной частью. Тем не менее, отклонения в значениях атомных координат для самого треонина 204 и его ближайшего окружения между мономерами не превышает 0,15 А, что подтверждает консервативность данного участка бактериальных 1,-асиарагиааз. Гришин 204 находясь лишь только в такой конформацни, способен образовывать 5 водородных связей, подобная Стабилизация может энергетически компенсировать стер«чески невыгодную ориентацию треонина 204 (Lubkowski J. el al, 2003).

L-a^ii.ipafiiuaaa Ejiviiira cri."..' jv I.-tcm^niH.*.jft EnWju'a

'S-Jt. - п

V 1 1 Г 'il —

-180- L3 3 Jï

iE ßo

Рисунок 5. Карты Рамачандрана для L-аепарагиназы Erw. caroiovora (слева) и Erw. chrysüHthemi (справа). Пространство карты разбито на четыре основные зоны: предпочитаемая (темно-серая), разрешенная (серая), допустимая (светло-серая) и

Таблица 1 Результаты анализа структуры L-аспарагяназ из Erw. carotovoro и Em.

Зоны карты Рамачаидрама П редночитаемая Разрешенная Допустимая Запрещенная

L-аспарагиназа из Erw. cfttOtovora 86,7% 12,6% 0,4% 0,4%

L-аспарагиназа из Erw. chrysanlhemi 83,2% 15,8% 0,7% 0,4%

Поскольку позднее в белковом банке данных появилась кристаллическая

структура 1.-аспарагиыазы из £г№, сашоюга (РОЙ индекс: 1ХС? (Кислицын Ю.Л. и др.. 20 06», представлялось актуальным сравнение построенной компьютерной модели Ь-аСпарагишиь] из Егж сагоюуога с ее КрЯстзлличсской структурой. Величина КМЯО и

значения попарных расстояний между Са атомами в мономерах при наложении одной структуры на другую представлены на рисунке б Полученные результаты указывают на достоверное предсказание трехмерной структуры Ь-аспарагиназы из Епл> сагоШога, что обусловлено высокой степенью гомологии с белком-образцом (Ь-аспарагиназа из Егш сИгузаМкегт) Таким образом, использование компьютерного моделирования по гомологии является целесообразным при отсутствии трехмерных структур Ь-аспарагиназ

Таблица 2 Сравнительный анализ структур Ь-аспарагиназы из Егщ сагЫочога и Ет скгу^апЛетг____

N1 N2 DIST N RMSD Seqjd LGAJS LGA_Q

SUMMARY (LGA) 1308 1300 5,0 1300 1 0,99 78,46 96,686 119,207

Примечание Сравнительный анализ был выполнен с использованием программы LGA Все параметры программы приняты по умолчанию N1 - количество остатков аминокислот L-аспарагиназы из Erw carotovora, N2 - количество остатков аминокислот L-аспарагиназы из Erw chrysanthemi, DIST - порог отсечения, N - количество совпадающих аминокислот при заданном пороге отсечения, RMSD - среднеквадратичное отклонение, рассчитанное для совпадающих аминокислот, Seq_Id - показатель гомологичности между собой аминокислотных последовательностей, LGA_S - оценка пространственного соответствия структур L-аспарагиназы из Erw carotovora и L-аспарагиназы из Erw chrysanthemi с учетом числа аминокислотных остатков в последней, LGA_Q - качественная оценка, рассчитанная

Аминокислотная последовательность

Рисунок 6 Оценка попарных расстояний между Са атомами в субъединице А у компьютерной модели и кристаллической структуры Ь-аспарагиназы из Егт сагоипога (жирная линия), кристаллических структур Ь-асиарагиназ из Егш сагоШога и Егч/ скгуйапЛетг (тонкая линия)

Анализ поверхности для предсказания ориентации тетрамеров фермента на поверхности чипа

Структурно-графический анализ поверхности белка и визуальная оценка позволили определить наиболее доступные аминогруппы для связывания с карбоксиметилированным

декстраном Ш^-группы лизина и №-концевой аминокислоты должны быть ориентированы по отношению к поверхности связывания определенным образом и находиться в доступной области на поверхности белка, что стерически затрудняет иммобилизацию Ь-аспарагиназы сразу в нескольких местах Поэтому иммобилизация тетрамера осуществляется преимущественно за одну субъединицу

Оценка энергии взаимодействия между димерами АС и ВБ, а также между субъединицами в этих димерах (Егю. ЛгузаШкепй и Егн>. саго^уога)

С целью выявления важных элементов для олигомеризации бактериальных Ь-аспарагиназ был выполнен структурно-графический анализ полученной модели Ь-аспарагиназы из Егк> саШочога и кристаллической структуры Ь-аспарагиназы из Епч сИгуяапЛетг Главным образом внимание уделялось интерфейсу между димерами АС и ВО в тетрамерах этих Ь-аспарагиназ и между мономерами в этих димерах

Для выявления типа межмолекулярных взаимодействий, вклад которых в устойчивость тетрамерного комплекса бактериальных Ь-аспарагиназ превалирует, была выполнена оценка энергии межсубъе циничных взаимодействий между димерами АС и ВО и соответствующими мономерами А и С, В и О В таблице 3 показаны результаты оценки вклада различных видов межсубъединичного взаимодействия в общую энергию взаимодействия между димерами АС и ВО и мономерами в этих димерах для Ь-аспарагиназ из Егш саго1омога и Еглг сЬгувагйкегт Для этого были оценены значения общей энергии, энергии Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий и энергии электростатических взаимодействий тетрамера каждой Ь-аспарагиназы, а также значения соответствующих видов энергий для димеров АС и ВО После чего по формуле, приведенной в разделе «Материалы и методы», были рассчитаны величины энергетических вкладов различных видов межмолекулярного взаимодействия в образование тетрамера Ь-аспарагиназы (табл 3) Таким же образом были оценены значение общей энергии взаимодействия между мономерами, образующими димеры АС и ВО, а также вклады электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий между этими мономерами в общую энергию их взаимодействия (табл 3)

Таблица 3 Оценка значений энергии различных видов межмолекулярных взаимодействий между субъединицами и димерами в Ь-аспарагиназе

Егл> сЬгуъамЬегт Егм саго1~оуога

АС ВО А С В Т> АС ВО А С В О

Е, ккал/моль -1255 -565 -591 -1111 -583 -567

Е], ккал/моль -285 -212 -218 -275 -214 -216

Ег, ккал/моль -969 -353 -373 -837 -369 -351

Примечание Значения энергии взаимодействий были рассчитаны с помощью программного комплекса ЭуЬу1 6 91 Е - общая энергия взаимодействия, Е1 - энергия Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, Ег - энергия электростатических взаимодействий

Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между димерами АС и BD в тетрамере L-аспарагиназы Erw. carotovora.

Для оценки вклада различных аминокислот, формирующих область контакта между двумя димерами АС и BD в L-аспарагиназе из Erw carotovora было выполнено виртуальное аланиновое сканирование данного интерфейса В результате анализа были установлены аминокислотные остатки, формирующие интерфейс между димерами АС и BD и выявлены среди них значимые путем отбора по значению энергетического эффекта, вносимого ими в процесс комплексообразования За значимые авторы программы рекомендуют принимать аминокислотные остатки, AEabcd для которых больше 1 ккал/моль (Kortemme Т et al, 2004) Как было установлено контактную область между димерами АС и BD образует примерно по 41 аминокислотному остатку от каждой субъединицы Результаты виртуального аланинового сканирования показали, что в каждой субъединице в области контакта между димерами примерно 13 аминокислотных остатков играют ключевую роль во взаимодействие между димерами АС и BD, большинство из которых относится к остаткам заряженного типа аргинин (R122, R159, R198), аспартат (D158, D175) и глутамат (Е181, Е182) Эти заряженные аминокислотные остатки в интерфейсе между димерами образуют около 8 солевых мостиков, тем самым, обеспечивая высокую стабильность тетрамера L-аспарагиназы Таким образом, результаты виртуального аланинового сканирования показали, что в тетрамере L-аспарагиназы из Erw carotovora между димерами АС и BD преобладает электростатическое взаимодействие, что согласуется с данными, приведенными в таблице 3 Дополнительно для стабилизации тетрамера в контактной области между димерами АС и BD может образовываться около 67 водородных связей

Результаты, полученные в экспериментах по изучению олигомеризации L-аспарагиназы из Erw carotovora, подтверждают сделанное заключение, что наибольший вклад в стабилизацию тетрамерного комплекса L-аспарагиназы из Erw carotovora вносят электростатические взаимодействия типа «солевой мостик», а также водородные связи, образованные в контактной области между димерами АС и BD В условиях низких значений рН наблюдается быстрая диссоциация тетрамеров L-аспарагиназы на субъединицы, что связано с протонированием отрицательно заряженных групп в области контакта между субъединицами и нарушением водородных связей Быстрый распад тетрамеров L-аспарагиназы наблюдается также в диапазоне высоких значений рН, что согласуется с литературными данными (Cammack К A et al, 1972)

Экспериментальная оценка специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

Учитывая выше сказанное, а именно присутствие солевых мостиков в интерфейсе между димерами АС и BD, разумно было бы предположить обязательное наличие электростатической комплементарности между этими димерами Из чего следует, что даже небольшие смещения в расположении аминокислотных остатков интерфейса, участвующих в образовании солевых мостиков, может приводить к нарушению последних и как результат к снижению общей устойчивости тетрамеров L-аспарагиназы Таким образом, было интересно оценить специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ Для этого на оптическом биосенсоре Biacore 3000 были выполнены эксперементы, в ходе которых в разных каналах были иммобилизованы L-аспарагиназы из Е coli, Я pylori J99 и Н pylori 26695 В качестве контроля использовался канал с декстраном без иммобилизованного белка Все белки были иммобилизованы по методике, описанной в разделе «Материалы и методы» Диссоциация всех белков осуществлялась путем пропускания глицинового буфера (pH 2,5), согласно методике Специфичность олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ оценивалась по изменению сигнала биосенсора при пропускании растворов L-аспарагиназ разных видов через измерительную кювету с иммобилизованной L-аспарагиназой

При пропускании растворов бактериальных L-аспарагиназ на поверхности оптического чипа не наблюдается неспецифичного связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов, о чем свидетельствует отсутствие значительных изменений уровня сигнала биосенсора в контрольном канале

При пропускании растворов L-аспарагиназ через канал с иммобилизованной L-аспарагиназой из Е coli было зарегистрировано повышение сигнала оптического биосенсора на 5000 RU для раствора самой L-аспарагиназы из Е coli Во всех остальных случаях уровень сигнала оставался без существенных изменений, что говорит о высокой избирательности L-аспарагиназы из Е coli в процессе ее олигомеризации (рис 7) В тоже время это подтверждает предположение сделанное выше, что снижение уровня сигнала биосенсора при пропускании HBS-буфера или глицин-HCl буфера после иммобилизации L-аспарагиназы связанно с диссоциацией L-аспарагиназы на субъединицы

При пропускании растворов L-аспарагиназ через канал с иммобилизованной L-аспарагиназой из Я pylon J99 также наблюдалось повышение сигнала биосенсора, однако в данном случае связывание было зарегистрировано для двух растворов L-аспарагиназ (рис 8) При пропускании раствора L-аспарагиназы из Я pylori J99 наблюдалось повышение сигнала биосенсора примерно на 5500 RU Немного меньше примерно на 4500 RU было зарегистрировано увеличение уровня сигнала при пропускании раствора L-аспарагиназы из

Я pylori 26695 Это легко можно объяснить, если учесть, что гомология между двумя этими белками составляет 93%, и области межсубъединичного интерфейса, обеспечивающие узнавание других партнеров олигомеризации, высоко консервативны для этих L-аспарагиназ 8000 •

Изменение уровня сигнала 7000 ■ биосенсора, RU

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

ВЯЗ

Рисунок 7 Регистрация связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов на поверхности чипа в канале с иммобилизованной L-аспарагиназой из Е coli Столбцы контроля окрашены в серый цвет Номерами обозначены L-аспарагиназа из Я pylori J99 (1), L-аспарагиназа из Я pylori 26695 (2), L-аспарагиназа из Е coh (3), L-аспарагиназа из Erw Chrysanthenи (4)

7000 ■

Изменение уровня сигнала qqqq . биосенсора, RU

5000

4000 3000 2000 1000 0

лтлил

Рисунок 8 Регистрация связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов на поверхности чипа в канале с иммобилизованной L-аспарагиназой из Я pylori J99 Столбцы контроля окрашены в серый цвет Номерами обозначены L-аспарагиназа из Н pylori J99 (1), L-аспарагиназа из Я pylori 26695 (2), L-аспарагиназа из Е coli (3)

Также, как в случае с иммобилизованной L-аспарагиназой из Я pylori J99, при

пропускании растворов L-аспарагиназ из Я pylori J99 и Я pylori 26695 через канал с

j j

иммобилизованной L-аспарагиназой из Я pylori 26695 было зарегестрировано повышение сигнала оптического биосенсора примерно на 4000 RU и 6000 RU, соответственно (рис 9)

При пропускании растворов L-аспарагиназы из Е coli значительных изменений в уровне сигнала биосенсора не наблюдалось

По результатам, полученным в ходе эксперимента, можно предположить, что процесс олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ высоко специфичен Взаимодействие между субъединицами разных L-аспарагиназ не приводит к образованию устойчивых комплексов Лишь L-аспарагиназы высокогомологичные по аминокислотной последовательности, и значимые аминокислотные остатки интерфейса которых высоко консервативны, способны образовывать относительно стабильные химерные комплексы

Изменение уровня сигнала биосенсора, RU

7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

т

т 1

i

Рисунок 9 Регистрация связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов на поверхности чипа в канале с иммобилизованной L-аспарагиназой из И pylori 26695 Столбцы контроля окрашены в серый цвет Номерами обозначены L-аспарагиназа из Я pylori J99 (1), L-аспарагиназа из Я pylori 26695 (2), L-аспарагиназа из Е coli (3)

Построение трехмерных моделей L-аспарагиназ из Н. pylori J99 и Н pylori 26695 и их оптимизация.

На данный момент в базе PDB отсутствуют кристаллографические данные для L-аспарагиназ из Н pylori 26695 и Я pylori J99, поэтому были построены модели пространственных структур для этих белков

Моделирование пространственной структуры L-аспарагиназ из Я pylori 26695 и Я pylori J99 и их оптимизация были выполнены по методике, описанной в разделе материалы и методы Было установлено, что ближайшим гомологом L-аспарагиназ из Я pylori 26695 и Я pylori J99 является L-аспарагиназы из Е coli и W succmogenes

Проверка качества полученных моделей L-аспарагиназ из Я pylon 26695 и Нpylori J99 была выполнена путем построения и анализа карт Рамачандрана (рис 10) в программе ProCheck и с помощью сравнительного анализа в программе LGA (табл 4) Результаты

программы ProCheck представлены в таблице 5 Карты Рамачандрана были построены для каждой субъединицы фермента В виду идентичности полученных карт для всех четырех субъединиц на рисунке 12 приведены карты Рамачандрана для субъединицы А На картах для L-аспарагиназ из Е coli, Н pylori 26695 и Я pylori J99 значения углов почти всех аминокислотных остатков укладываются в допустимых зонах Однако для L-аспарагиназы из Я pylori 26695 пять аминокислотных остатков попадают в запрещенную зону, что соответствует 1,4% от общего количества В случае L-аспарагиназы из Я pylori J99 на карте Рамачандрана 3 аминокислотных остатка находятся в запрещенной зоне, что составляет 1% от общего количества В обоих случаях подобные отклонения в структуре считаются допустимыми

Анализ в программе LGA также показал приемлемое качество моделей Обычно пространственные структуры в программе имеют оценку LGA_Q больше 2 Модели, для которых LGA_Q < 2, имеют значительные структурные отклонения Для полученных моделей L-аспарагиназ из Я pylori 26695 и Я pylori J99 эта оценка имеет значения 92,887 и 96,233, соответственно

Таблица 4 Сравнительный анализ структур L-аспарагиназ из Я pylon 26695 и Я pylori J99 с L-аспарагиназой из Е coli______

N1 N2 DIST N RMSD Seq_Id LGA_S LGAQ

L-аспарагиназа из Я pylori 26695 1224 1304 5,0 1176 1,17 48,89 86,049 92,887

L-аспарагиназа из Я pylon J99 1232 1304 5,0 1184 1,13 50,00 86,948 96,233

Примечание Сравнительный анализ был выполнен с использованием программы LGA Все параметры программы приняты по умолчанию N1 - количество остатков аминокислот L-аспарагиназы, для которой выполняется анализ, N2 - количество остатков аминокислот L-аспарагиназы из Е coli, DIST - порог отсечения, N - количество совпадающих аминокислот при заданном пороге отсечения, RMSD - среднеквадратичное отклонение, рассчитанное для совпадающих аминокислот, Seq_Id - показатель гомологичности между собой аминокислотных последовательностей, LGA_S - оценка пространственного соответствия структур L-аспарагиназ из Я pylori J99 и Я pylori 26695 структуре L-аспарагиназы из Е coli с учетом числа аминокислотных остатков в последней, LGA_Q -качественная оценка, рассчитанная по формуле Q=0,1*N/(0,1+RMSD)

Таблица 5 Распределение значений углов в структурах L-аспарагиназ из Я pylori 26695 и Я pylori J99 на карте Рамачандрана

Зоны карты Рамачандрана Предпочитаемая Разрешенная Допустимая Запрещенная

L-аспарагиназа из Я pylori 26695 77,8% 18,8% 1,7% 1,7%

L-аспарагиназа из Я pylori J99 76,7% 20,5% 1,7% 1,0%

L-flspflntginusfe coli

, 1 _j

-г г

' 4

R 5 Tji LSI

L-flspaniginasc f l.j)vlori 26695

rfi.,* 1

■ ¿Ш

■ 1ЭД Iii « +S

M

Щ 1 , . Г - »I

^tl <1 i)* ö }r Tj :» i !

о В

Рисунок 10. Карты Рамачапдрана для L-аспаратинаЗ Е. coli (а). Н. pylori 26695 (б) и И pylori J99 (в). Пространство карты разбито на четыре основные аоны: предпочитаемая (темно-серая), разрешенная (серая), допустимая (светло-серая) и запрещенная (белая).

Построение трехмерной Кодещ химерных тетрамерол L-acnapanmaj и ид оптимизация.

Чтобы оценить устойчивость химерных тетрамеров L-асзараганазы, образующихся в эксперименте но изучению сгаеЦйфячнаета прокесйа олигомертаоин бактсриалшых 1-аеттарагиназ, были получены модели этих химерных комплексов. Для этого и каждом из белке заменялась субъединица А из гсграмера одной L-аспарагивазы на соответствующую субъедищщу из тетрШера L-аспарагниазы другого вида. Получены были следующие химерные тетрамеры L-аспарагшш-.

Е. coli (А) - Erw. chrysanthetni (BCD) Е. coli (Л) ■ if. pylori J99 (ßCD) E coli (A) - U. pylori 26695 (BCDj H pylori J99 (А) - E. coli (BCD)

И. pylori J99 (А) - И. pylori 26695 (BCD) И. pylon 26695 (А) - Е. coli (BCD) И. pylori 26695 (А) - Я pylori J99 (BCD) Полученные химерные теграмеры были оптимизированы путем моделирования молекулярной динамики и минимизации энергии. Для опенки устойчивости этих химерных комплексов основное внимание уделялось интерфейсу между субъединицами А И С.

Оценка энергии взаимодействия между субьед пиццами Л и С в моделях химер пых тегграмеров.

Значение общей энергии взаимодействия между мономерами Л и С была оценено с помощью пршраммного комплекса Sybyl. Для этого были рассчитаны значении ошпей Энергии каждого химерного тетрамера, а. также значения общей энергии для мономеров Л и С. После чего но формуле, приведенной в разделе «Материалы и методы», были рассчитаны величины энергетических вкладов различных видов межмолекулярного взаимодействия в образование этих химерных тетрамеров (рис. 11).

Рисунок 11. Оценка значений энергии шаичодейстпия между субъедащщаыи н димере АС в химерных тстрачерах Ь-аспарагиназы (черные столбцы) и й их диких формах (серые столбцы).

Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между субъединицами А и С в химерных тетрамерах Ь-аспарагиназ и их диких формах.

Дня оценки вклада различных аминокислот, формирующих область контакта между мономером А и мономером С в химерных тетрамерах Ь-аспарагиназ, было выполнено виртуальное аланиновое сканирование данного интерфейса В результате анализа были установлены аминокислотные остатки, формирующие интерфейс между мономерами А и С и выявлены среди них значимые путем отбора по значению энергетического эффекта, вносимого ими в процесс комплексообразования Результаты анализа показали, что при образовании димера АС из субъединиц от разных Ь-аспарагиназ происходит уменьшение общего числа значимых аминокислотных остатков во взаимодействии между мономерами А и С, а также солевых мостиков, вносящих вклад в устойчивость димера АС (табл 6) Этот факт позволяет предполагать, что в данном случае происходит снижение стабильности химерных димеров и как следствие химерных тетрамеров относительно "диких" тетрамеров Ь-аспарагиназы Если учесть, что активные центры Ь-аспарагиназы формируются в зоне интерфейса между субъединицами, можно предположить, что в Ь-аспарагиназах имеет место строго определенное позиционирование субъединиц тетрамера относительно друг друга, поскольку даже небольшие изменения в положении субъеданиц могут привести к нарушению активного центра и как следствие к полной потери активности Ь-аспарагиназы Поэтому каждый мономер Ь-аспарагиназы в растворе других белков должен проявлять высокую специфичность по отношению к другим участникам олигомеризации бактериальных Ь-аспарагиназ

Таблица б Число возможных солевых мостиков в зоне контакта между мономерами А

иС

Ь-аспарагиназа из Е сок 6 Е соЬ (А) - Егу/ сИгувапЛегт (ВСО) 4

Ь-аспарагиназа из Егю сИгузатЛегт 10 Е сок (А) - Я ру1оп 26695 (ВСО) 4

Ь-аспарагиназа из Н ру1оп 26695 6 Я ру!оп 399 (А) - Я ру1оп 26695 (ВСО) 6

выводы

1 На примере моделирования трехмерной структуры L-аспарагиназы Erw carotovora показана высокая эффективность моделирования по гомологии структур новых L-аспарагиназ Построены и оптимизированы модели пространственной структуры L-аспарагиназ из Н pylori J99 и Я pylon 26695

2 Молекулярно-графический анализ интерфейса между димерами АС и BD в тетрамерном комплексе L-аспарагиназы из Е carotovora показал, что высокая прочность комплекса обеспечивается преимущественно электростатическими взаимодействиями типа «солевой мостик» Экспериментально на оптическом биосенсоре была подтверждена высокая прочность тетрамеров данного фермента (константа скорости диссоциации -порядка 6 10"6 с"1)

3 Методом виртуального аланинового сканирования выявлены ключевые аминокислотные остатки в интерфейсе между димерами АС и BD в тетрамере L-аспарагиназы из Erw carotovora

4 В экспериментах на оптическом биосенсоре показана высокая специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ С помощью компьютерного моделирования химерных структур тетрамеров L-аспарагиназ показана низкая устойчивость комплексов, собранных из субъединиц разных бактериальных L-аспарагиназ

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Мезенцев Ю В , Мольнар А А , Иванов А С Олигомеризация L-аспарагиназы из Erwima carotovora // Материалы Международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» -Москва, 2005 -С 38-39

2 Мезенцев Ю В, Мольнар А А, Гнеденко О В , Красоткина Ю В , Соколов Н Н , Иванов А С Олигомеризация L-аспарагиназы из Erwima carotovora // Биомедицинская химия -2006 -Т 52, №3 - С 258-271

2а Mezentsev Yu V , Molnar А А, Gnedenko О V , Krasotkma Yu V , Sokolov N N and Ivanov A S Oligomenzation of L-Asparagmase from Erwima carotovora // Biochemistry (Moscow) Supplement Series В Biomedical Chemistry -2007 -V 1,№1 ~P 58-67

3 Ivanov A S , Gnedenko О V , Molnar A A , Mezentsev Yu V , Lisitsa A V and Archakov AI Protem-protem interactions as new targets for drug design virtual and experimental approaches // Proceedings of the fifth international conference on biomfonnatics of genome regulation and structure - Novosibirsk, 2006 -C 277-281

4 Ivanov A S , Gnedenko О V , Molnar A A Mezentsev Yu V , Lisitsa A V and Archakov AI Protem-protem mteractions as new targets for drug design virtual and experimental approaches // J Biomform Comput Biol - 2007 - V 5, № 4 - P 579-592

Список сокращений

PDB - Protein Data Bank

EDC - 1-этил-3((3-диметиламино)пропил)карбодиимид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

HEPES - №(2-гидроксиэтил)шшеразин-1Ч'-этан сульфоновая кислота

NHS - N-гидроксисукцинимид

LGA - Local-Global Alignment

RMSD - среднеквадратичное отклонение

Подписано в печать 07 09 2007 г Исполнено 10 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 676 Тираж 90 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мезенцев, Юрий Владимирович

Список сокращений

Введение

Цель и задачи исследования

Научная новизна работы

Практическая значимость исследования

Апробация работы

Структура и объем диссертации

1. Обзор литературы

1.1. Бактериальные Ь-аспарагиназы

1.1.1. Строение, активный центр, механизм действия и 12 субстратная специфичность

1.1.2. Влияние рН и температуры на кинетические 22 параметры бактериальных Ь-аспарагиназ

1.1.3. Бактериальные Ь-аспарагиназы в медицине

1.1.4. Модифицированные формы Ь-аспарагиназы

1.2. Белок-белковые взаимодействия

1.2.1. Классификация белок-белковых взаимодействий

1.2.2. Характеристика интерфейса в белок-белковом 30 комплексе

1.2.3. Методы исследования белок-белковых 35 взаимодействий

1.2.4. Белок-белковые взаимодействия как мишени для 39 разработки новых лекарственных средств

1.3. Оптический биосенсор В1асоге

1.3.1. Поверхностный плазмонный резонанс

1.3.2. Оптический биосенсор В1асоге 3000 в приложении к исследованию белок-белковых взаимодействий

1.4. Биоинформатика

1.4.1. Виртуальное аланиновое сканирование

1.4.2. Protein Data Bank

2. Материалы и методы

2.1. Экспериментальная часть

2.1.1. Реагенты

2.1.2. Эксперименты по изучению процесса олигомеризации L-аспарагиназы Erw. carotovora

2.1.3. Иммобилизация L-аспарагиназы Erw. carotovora на поверхности оптического чипа СМ

2.1.4. Эксперименты по изучению специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

2.2. Биоинформационная часть

2.2.1. Исходные данные для молекулярного моделирования

2.2.2. Использованное программное обеспечение

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Иммобилизация L-аспарагиназы из Erw. carotovora и мониторинг процессов ее диссоциации и олигомеризации

3.2. Моделирование L-аспарагиназы из Erw. carotovora

3.3. Анализ поверхности тетрамеров L-аспарагиназы для предсказания ориентации тетрамеров фермента на поверхности чипа

3.4. Оценка площади поверхности интерфейса между димерами L-аспарагиназы (Erw. chrysanthemi и Erw. carotovora)

3.5. Оценка энергии взаимодействия между димерами АС и BD, а также между субъединицами в этих димерах {Erw. chrysanthemi и Erw. carotovora)

3.6. Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между димерами АС и BD в тетрамере L-аспарагиназы Erw. carotovora

3.7. Экспериментальная оценка специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

3.8. Построение трехмерных моделей L-аспарагиназ из Н. pylori J99 и Н. pylori 26695 и их оптимизация

3.9. Построение трехмерной модели химерных тетрамеров L-аспарагиназ и их оптимизация

3.10. Оценка энергии взаимодействия между субъединицей А и тримером BCD в полученных моделях химерных тетрамеров L-аспарагиназ

3.11. Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между субъединицей А и тримером BCD в химерных тетрамерах L-аспарагиназ и их диких формах

4 Выводы

5 Литература

Список сокращений

ББВ - белок-белковые взаимодействия

ППР - поверхностный плазмонный резонанс

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

PDB - Protein Data Bank

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

VMD - Visual Molecular Dinamics

SPL - SYBYL's Programming Language

NMR - nuclear magnetic resonance

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота wwPDB - world wide Protein Data Bank

EDC - 1-этил-3[(3-диметиламино)пропил]карбодиимид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

HEPES -К-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1\Р-этан сульфоновая кислота

NHS - N-гидроксисукцинимид

LGA- Local-Global Alignment

RMSD - среднеквадратичное отклонение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ"

Бактериальные L-аспарагиназы (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3.5.1.1) используются в терапии опухолевых заболеваний и считаются одним из самых эффективных средств при лечении острого лимфобластного лейкоза. Объектом действия L-аспарагиназы является периплазматический L-аспарагин, ее главный субстрат. Снижение периплазматической концентрации L-аспарагина приводит в результате к снижению его количества внутри клетки. В отличие от нормальных клеток в лейкозных клетках экспрессия L-аспарагинсинтетазы выражена слабо или отсутствует вовсе. Поэтому опухолевые клетки не могут отреагировать адекватно на снижение внутриклеточного уровня L-аспарагина, в то время как в нормальных клетках уровень L-аспарагина своевременно восполняется. В свою очередь нехватка этой аминокислоты приводит к ингибированию белкового синтеза в клетке, что в итоге вызывает ее апаптоз. Более того, L-аспарагиназа действует исключительно в периплазматическом пространстве без проникновения внутрь клетки, что принципиально отличает механизм ее действия от прочих противоопухолевых препаратов [201].

Однако, продолжительная терапия с использованием препаратов бактериальных L-аспарагиназ сопровождается большим количеством побочных эффектов вплоть до развития анафилактического шока. С учетом токсического действия разных препаратов бактериальных L-аспарагиназ к клиническому применению в настоящий момент допущены лишь две L-аспарагиназы бактериального происхождения, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coli и Erwinia chrysanthemi. Согласно общепринятому мнению, токсический эффект бактериальных L-аспарагиназ является следствием проявления этими ферментами глутаминазной активности. Другой причиной токсического эффекта бактериальных L-аспарагиназ по мнению ряда исследователей является ß-аспартилпептидная активность этих ферментов [77]. Более того, считается, что из-за мультисубъединичной структуры бактериальные

Ь-аспарагиназы вызывают аллергическую реакцию у пациентов в процессе энзимотерапии их препаратами [52].

Большинство бактериальных Ь-аспарагиназ является гомотетрамером с четырьмя активными центрами. Если учесть тот факт, что их активный центр формируется в области контакта между двумя субъединицами, то очевидна роль олигомеризации Ь-аспарагиназы в процессе формирования ее активных центров и, как следствие, в ее субстратной специфичности. Димер Ь-аспарагиназы, имея два активных центра, не способен расщеплять Ь-аспарагин, и лишь только тетрамер Ь-аспарагиназы обладает такой активностью [45, 85, 89, 90, 99, 104 156].Несмотря на широкий интерес, проявляемый на протяжении многих лет к Ь-аспарагиназе, в литературе практически отсутствуют какие либо данные по олигомеризации этого фермента.

На сегодняшний день существует множество доступных методов, с помощью которых возможно исследование белок-белковых взаимодействий и, в частности, олигомеризации мультисубъединичных белков. Многие экспериментальные подходы позволяют регистрировать белок-белковые взаимодействия в широком диапазоне концентраций, однако не все дают возможность оценивать стехиометрию образующихся комплексов.

Существуют также биоинформационные подходы, позволяющие предсказывать возможность белок-белковых взаимодействий, оценивать устойчивость образующихся белковых комплексов, определять специфические контактные участки в белок-белковых взаимодействиях и т.д.

Совместное использование экспериментальных и биоинформационных методов дает возможность более эффективно решать различные задачи, направленные на исследование белок-белковых взаимодействий и, в частности, процесса олигомеризации мультисубъединичных белков.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в определении молекулярных основ и специфичности белок-белковых взаимодействий при олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Построить модели пространственных структур L-аспарагиназ Erw. carotovora, Helicobacter pylori J99 и Helicobacter pylori 26695, а также модели химерных тетрамеров, образующихся в экспериментах по исследованию специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

2. Выполнить сравнительный молекулярно-графический анализ области контакта между субъединицами для L-аспарагиназ из Erwinia carotovora и Erw. chrysanthemi и для моделей химерных тетрамеров.

3. Разработать методику иммобилизации, диссоциации и восстановления олигомерной структуры бактериальных L-аспарагиназ на поверхности оптического чипа для экспериментального изучения олигомеризации данных ферментов с помощью технологии оптического биосенсора.

4. Оценить специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ с помощью оптического биосенсора Biacore 3000.

Научная новизна работы

Впервые был исследован процесс олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ с помощью комбинации методов молекулярного моделирования и технологии оптического биосенсора.

Были построены модели тетрамеров L-аспарагиназ из Я. pylori J99 и Н. pylori 26695, для которых на данный момент отсутствуют кристаллографические данные.

Для L-аспарагиназ из Е. coli и из Erw. carotovora были определены ключевые аминокислотные остатки контактных областей субъединиц, определяющие стабильность тетрамерного комплекса L-аспарагиназы.

Практическая значимость исследования

Результаты, полученные в работе, могут служить основой для разработки модифицированных форм L-аспарагиназы. С одной стороны, тетрамеры модифицированных L-аспарагиназ могут быть более устойчивыми в плазме крови человека, что означает пролонгированное действие препарата, и, как следствие, позволяет снижать его лечебные дозы, вводимые пациентам. С другой стороны, разработка новых препаратов L-аспарагиназ может идти по пути снижения молекулярного веса активной формы этого белка, т.е. за счет получения активных димеров, не агрегирующих в комплексы более высокого порядка, что значительно снизит иммунную реакцию организма пациента.

Разработанная методика иммобилизации и мониторинга процессов диссоциации и олигомеризации бактериальных L-аспаргиназ в дальнейщем может быть успешно использована в работах с другими олигомерными белками.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005), на V Международной конференции «Bioinformatics of genome régulation and structure» (Новосибирск, 2006), на научной конференции ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 4-х глав обзора литературы, главы «Материалы и методы», 11-й глав раздела «Результаты и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 202 источника. Работа изложена на 131 странице текста, содержит 33 рисунка и 20 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мезенцев, Юрий Владимирович

4. Выводы

1. На примере моделирования трехмерной структуры L-аспарагиназы Erw. carotovora показана высокая эффективность моделирования по гомологии структур новых L-аспарагиназ. Построены и оптимизированы модели пространственной структуры L-аспарагиназ из Н. pylori J99 и Н. pylori 26695.

2. Молекулярно-графический анализ интерфейса между димерами АС и BD в тетрамерном комплексе L-аспарагиназы из Е. carotovora показал, что высокая прочность комплекса обеспечивается преимущественно электростатическими взаимодействиями типа «солевой мостик». Экспериментально на оптическом биосенсоре была подтверждена высокая прочность тетрамеров данного фермента (константа скорости диссоциации -порядка 6-10"6 с"1).

3. Методом виртуального аланинового сканирования выявлены ключевые аминокислотные остатки в интерфейсе между димерами АС и BD в тетрамере L-аспарагиназы из Erw. carotovora.

4. В экспериментах на оптическом биосенсоре показана высокая специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ. С помощью компьютерного моделирования химерных структур тетрамеров L-аспарагиназ показана низкая устойчивость комплексов, собранных из субъединиц разных бактериальных L-аспарагиназ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мезенцев, Юрий Владимирович, Москва

1. Abola Е.Е., Manning N.O., Prilusky J., Stampf D.R. and Sussman J.L. The Protein Data Bank: Current Status and Future Challenges // J. Res. Natl. 1.st. Stand. Technol. - 1996. - V. 101, № 3. - P. 231-241.

2. Aghaiypour K., Wlodawer A. and Lubkowski J. Structural Basis for the Activity and Substrate Specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 5655-5664.

3. Aghaiypour K., Wlodawer A., Lubkowski J. Do bacterial L-asparaginases utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu? // Biochimica et Biophysica Acta. -2001.-V. 1550.-P. 117-128.

4. Apweiler R., Bairoch A., Wu C.H. Protein sequence databases // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004. - V. 8. - P. 76-80.

5. Arnstein H.R.V., Barwick C.W., Lange J.D. and Thomas H.D.J. Control of protein synthesis by amino acid supply. The effect of asparagine deprivation on the translation of messenger RNA in reticulocyte lysates // FEBS. 1986. -V. 194, № l.-P. 146-150.

6. Asthagiri D., Paliwal A., Abras D., Lenhoff A.M., Paulaitis M.E. A consistent experimental and modeling approach to light-scattering studies of protein-protein interactions in solution // Biophys. J. 2005. - V. 88, № 5. -P. 3300-3309.

7. Athanassiadou F., Kourti M., Papageorgiou Т., Stamou M., Makedou A. and Boufidou A. Severe hyperlipidemia in a child with acute lymphoblastic leukemia treated with L-asparaginase and prednisone // Pediatrics International. 2004. - V. 46. - P. 743-744.

8. Atkins C.A., Pate S.J. and Sharkey PJ. Asparaginase metabolism key to the nitro-gen nutrition of developing legume seeds // Plant. Physiol. - 1975. - V. 56.-P. 807-812.

9. Aung H.-P., Bocola M., Schleper S.N, Rohm K.-H. Dynamics of a mobile loop at the active site of Escherichia coli asparaginase // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1481 - P. 349-359.

10. Austin D.J., Crabtree G.R., Schreiber S.L. Proximity versus allostery: the role of regulated protein dimerization in biology // Chem. Biol. 1994. - V. 1, № 3.-P. 131-136.

11. Balbo A., Minor K.H., Velikovsky C.A., Mariuzza R.A., Peterson C.B., Schuck P. Studying multiprotein complexes by multisignal sedimentation velocity analytical ultracentrifugation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. -V. 102, № 1,-P. 81-86.

12. Bendtsen J.D., Nielsen H, Von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004. - V. 340. - P. 783-795.

13. Berman H., Henrick K., Nakamura H. and Markley J.L. The worldwide Protein Data Bank , № wwPDB): ensuring a single, uniform archive of PDB data // Nucleic Acids Research. 2007. - V. 35. - P. D301-D303.

14. Berman H.M., Henrick K. and Nakamura H. Announcing the worldwide Protein Data Bank // Nature Struct. Biol. 2003. - V. 10. - P. 980.

15. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. -2000. V. 28. - P. 235-242.

16. Bernstein F.C., Koetzle T.F., Williams G.J.B. Meyer E.F., Brice M.D., Rodgers J.R., Kennard O., Shimanouchi T. and Tasumi M. Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures // J. Mol. Biol. 1977. - V. 112. - P. 535-542.

17. Betts M.J., Sternberg M.J. An analysis of conformational changes on protein-protein association: implications for predictive docking // Protein Eng. 1999. - V. 12, № 4. - P. 271-283.

18. Borek D. and Jaskolski M. Sequence analysis of enzymes with asparaginase activity // Acta Biochimica Polonica. 2001. - V. 48, № 4. - P. 893-902.

19. Bourne P.E., Westbrook J. and Berman H.M. The Protein Data Bank and lessons in data management // Briefings in Bioinformatics. 2004. - V. 5, № l.-P. 23-30.

20. Brandts J.F., Lin L.N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry // Biochemistry. 1990. - V. 29, № 29. - P. 6927-6940.

21. Bright F.V. Bioanalytical applications of fluorescence spectroscopy // Anal. Chem. 1988. - V. 60, № 18. - P. 1031A-1039A.

22. Bussolati 0., Belletti S., Uggeri J., Gatti R., Orlandini G., Dall'asta V. and Gazzola G.C. Characterization of apoptotic phenomena induced by treatment with L-asparaginase in NIH3T3 cells // Experimental Cell Research. 1995. -V. 220.-P. 283-291.

23. Cammack K.A., Marlborough D.I. and Miller D.S. Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora II Biochem. J. 1972. - V. 126. - P. 361-379.

24. Campbell H.A., Mashburn L.T. L-Asparaginase EC-2 from Escherichia coli. Some substrate specificity characteristics // Biochemistry. 1969. - V. 8, № 9.-P. 3768-3775.

25. Campbell H.A., Mashburn L.T., Boyse E.A., Old L.J. Two L-asparaginases from Escherichia coli B. Their separation, purification and antitumor activity // Biochemistry. 1967. - V. 6, № 3. - P. 721-730.

26. Case D.A., Cheatham T.E., Darden T., Gohlke H., Luo R., Merz K.M., Onufriev A., Simmerling C., Wang B., Woods R. The Amber biomolecular simulation programs // J. Comput. Chem. 2005. - V. 26, № 16. - P. 1668-1688.

27. Case D.A., Darden T.A., Cheatham T.E. Ill, Simmerling C.L., Wang J., Duke R.E., Luo R., Merz K.M., Wang B., Pearlman D.A., Crowley M., Brozell S., Tsui V., Gohlke H., Mongan J., Hornak V., Cui G., Beroza P., Schafmeister

28. C., Caldwell J.W., Ross W.S. and Kollman P.A. AMBER 8 // University of California San Francisco, 2004 .

29. Chothia C. Hydrophobic bonding and accessible surface area in proteins // Nature. 1974. - V. 248, № 446. - P. 338-339.

30. Clemons P.A. Design and discovery of protein dimerizers // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999.-V. 3, № l.-P. 112-115.

31. Cochran A.G. Protein-protein interfaces: mimics and inhibitors // Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. - V. 5, № 6. - P. 654-659.

32. Coleman J.E. and Handschumacher R.E. Asparaginase. Stereochemistry of the active center as determined by circular dichroism of substrates // The Journal of Biological Chemistiy. 1973. - V. 248, № 5. - P. 1741-1745.

33. Cooper M.A. Label-free screening of bio-molecular interactions // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - V. 377. - P. 834-842.

34. Davidson L., Brear D.R., Wingard P., Hawkins J. and Kitto G.B. Purification and properties of an L-glutaminase-L-asparaginase from Pseudomonas acidovorans II Journal of Bacteriology. 1977. - V. 129, № 3. - P. 1379-1386.

35. Davies D.R., Cohen G.H. Interactions of protein antigens with antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93, № 1. - P. 7-12.

36. Derst C., Henseling J. and Rohm K.-H. Engineering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase II. Selective reduction of glutaminase activity by amino acid replacements at position 248 // Protein Science. -2000.-V. 9.-P. 2009-2017.

37. Derst C., Wehner A., Specht V. and Rohm K.-H. States and functions of tyrosine residues in Escherichia coli asparaginase II // Eur. J. Biochem. -1994.-V. 224.-P. 533-540.

38. Distasio J.A., Niederman R.A., Kafkewitz D. and Good-Man D. Purification and characterization of L-asparaginase with anti-lymphoma activity from Vibrio succinogenes II J. Biol. Chem. 1976. - V. 251. - P. 6929-6933.

39. Dolowy W.C., Henson D., Cornet J., Sellin H. Toxic and antineoplastic effects of L-asparaginase. Study of mice with lymphoma and normal monkeys and report on a child with leukemia // Cancer. 1966. - V. 19. - P. 1813-1819.

40. Ehrman M., Cedar H. and Schwartz J.H. L-asparaginase II of Escherichia coli. Studies of the enzymatic mechanism of action // The Journal of Biological Chemistry. 1971. - V. 246, № 1. - P. 88-94.

41. Eisenhaber F., Argos P. Hydrophobic regions on protein surfaces: definition based on hydration shell structure and a quick method for their computation // Protein Eng.- 1996.-V. 9,№ 12.-P. 1121-1133.

42. Frank B.H., Pekar A.H., Veros A.J. and Ho P.P.K. Crystalline L-asparaginase from Escherichia coli B. II. Physical properties, subunits and reconstitution behavior // The Journal of Biological Chemistry. 1970. - V. 245, № 14. - P. 3716-3724.

43. Gilbert D. Bioinformatics software resources // Briefings in Bioinformatics. -2004.-V. 5, № 3. P. 300-304.

44. Golovin A., Oldfield T.J., Tate J.G., Velankar S., Barton G.J., Boutselakis H., Dimitropoulos D., Fillon J., Hussain A., Ionides J.M. E-MSD: an integrated data resource for bioinformatics // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. D211-D216.

45. Gomes M.A.F. and Sodek L. Allantoinase and asparaginase activities in maturing fruits of nodulated and non-nodulated soybeans // Physiol. Plant. -1984.-V. 62.-P. 105-109.

46. Goodsell D.S. The molecular perspective: L-asparaginase // Stem Cells. -2005.-V. 23.-P. 710-711.

47. Hahnefeld C., Drewianka S. and Herberg F.W. Determination of kinetic data using surface plasmon resonance biosensors // Methods in Molecular Medicine. 2004. - V. 94. - P. 299-320.

48. Harms E., Wehner A., Aung H.-P. and Rohm K.H. A catalytic role for threonine-12 of E. coli asparaginase II as established by site-directed mutagenesis // FEBS. 1991. - V. 285, № 1. - P. 55-58.

49. Hellman K., Miller D.S. and Cammack K.A. The effect of freeze-drying on the quaternary structure of l-asparaginase from Erwinia carotovora II Biochimica et Biophysica Acta. 1983. - V. 749. - P. 133-142.

50. Herrmann V., Rohm K.H. and Schneider F. On the substrate specificity of L-asparaginase from E. coli II FEBS Letters. 1974. - V. 39. - P. 214-217.

51. Hill J.M., Roberts J., Loeb E., Khan A., Maclellan A., Hill R.W. L-asparaginase therapy for leukemia and other malignant neoplasms // JAMA. 1967. - V. 202. - P. 882-888.

52. Ho P.P.K., Milikin E.B. Multiple forms of L-asparaginase // Biochimica et Biophysica Acta. 1970. - V. 206. - P. 196-198.

53. Hoelzer D., Gokbuget N., Ottmann O., Pui C.-H., Relling M.V., Appelbaum F.R., Van Dongen J.J.M. and Szczepanski T. Acute Lymphoblastic Leukemia // ASH Education Book 2002. 2002. - P. 162-192.

54. Holcesberg J.S., Teller D.C., Roberts J. and Dolowy W.C. Physical properties of Acinetobacter glutaminase-asparaginase with antitumor activity // Tne Journal of Biological Chemistry. 1972. - V. 247, № 23. - P. 7750-7758.

55. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - V. 377. - P. 528-539.

56. Homola J., Yee S., Myszka D. Surface Plasmon Resonance Biosensors // Optical Biosensors. 2002. - P. 207-251.

57. Howard J.B. and Carpenter F.H. L-Asparaginase from Erwinia carotovora. Substrate specificity and enzymatic properties // The Journal of Biological Chemistry. 1972. - V. 247, № 4. - P. 1020-1030.

58. Hubbard S.J., Argos P. Cavities and packing at protein interfaces // Protein Sci. 1994. - V. 3, № 12. - P. 2194-2206.

59. Huber W., Mueller F. Biomolecular interaction analysis in drug discovery using surface plasmon resonance technology // Curr Pharm Des. 2006. - V. 12,№31.-P. 3999-4021.

60. Iiboshi Y., Papst P.J., Hunger S.P. and Terada N. L-asparaginase inhibits the rapamycin-targeted signaling pathway // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. - V. 260. - P. 534-539.

61. Ivanov A.S., Veselovsky A.V., Dubanov A.V., Skvortsov V.S. Bioinformatics platform development: from gene to lead compound, // Methods. Mol. Biol. 2006. - V. 316. - P. 389-431.

62. Janin J. Wet and dry interfaces: the role of solvent in protein-protein and protein-DNA recognition // Structure. 1999. - V. 7, № 12. - P. 277-279.

63. Jaskolski M., Kozak M., Lubkowski J., Palm G. and Wlodawer A. Structures of two highly homologous bacterial L-asparaginases: a case of enantiomorphic space groups // Acta Crystallographica Section D. 2001. -V. 57.-P. 369-377.

64. Jones S. and Thornton J.M. Principles of protein-protein interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 13-20.

65. Kelo E., Noronkoski T., Stoineva I.B., Petkov D.D., Mononen I. Beta-Aspartylpeptides as substrates of L-asparaginases from Escherichia coli and Envinia chrysanthemi IIFEBS Letters. 2002. - V. 528. - P. 130-132.

66. Keskin O., Ma B. and Nussinov R. Hot regions in protein-protein interactions: the organization and contribution of structurally conserved hot spot residues // J. Mol. Biol. 2005. - V. 345, № 5. - P. 1281-1294.

67. Kessel D. and Bosmann H.B. Effects of L-asparaginase on protein and glycoprotein synthesis // FEBS Letters. 1970. - V. 10, № 2. - P. 85-88.

68. Keusgen M. Biosensors: new approaches in drug discovery // Naturwissenschaften. 2002. - V. 89, № 10. - P. 433-444.

69. Kim D.E., Chivian D. and Baker D. Protein structure prediction and analysis using the Robetta server // Nucleic Acids Research. 2004. - V. 32. - P. 526-531.

70. Kortemme T. and Baker D. A simple physical model for binding energy hot spots in protein-protein complexes // PNAS. 2002. - V. 99, № 22. - P. 14117-14121.

71. Kortemme T. and Baker D. Computational design of protein-protein interactions // Current Opinion in Chemical Biology. 2004. - V. 8. - P. 91-97.

72. Kortemme T., Kim D.E., Baker D. Computational alanine scanning of protein-protein interfaces // Sei. STKE. 2004. - V. 2004, № 219. - P. pl2.

73. Kotzia G.A., Labrou N.E. Cloning, expression and characterisation of Erwinia carotovora L-asparaginase // Journal of Biotechnology. 2005. - V. 119.-P. 309-323.

74. Kozak M. and Jaskolski M. Crystallization and preliminary crystallographic studies of a new crystal form of Escherichia coli L-asparaginase II (Ser58Ala mutant) // Acta Crystallographica Section D. 2000. - V. 56. - P. 509-511.

75. Kozak M. and Jurga S. A comparison between the crystal and solution structures of Escherichia coli asparaginase II // Acta Biochimica Polonica. -2002.-V. 49, №2.-P. 509-513.

76. Kozak M., Borek D., Janowski R. and Jaskolski M. Crystallization and preliminary crystallographic studies of five crystal forms of Escherichia coli L-asparaginase II (Asp90Glu mutant) // Acta Crystallographica Section D. -2002. V. 58. - P. 130-132.

77. Kozak M., Jaskolski M., Rohm K.H. Preliminary crystallographic studies of Y25F mutant of periplasmic Escherichia coli L-asparaginase // Acta Biochim. Pol. 2000. - V. 47, № 3. - P. 807-814.

78. Krasotkina J., Borisova A.A., Gervaziev Y.V. and Sokolov N.N. One-step purification and kinetic properties of the recombinant L-asparaginase from Erwinia carotovora // Biotechnol. Appl. Biochem. 2004. - V. 39. - P. 215-221.

79. Larsen T.A., Olson A.J., Goodsell D.S. Morphology of protein-protein interfaces // Structure. 1998. - V. 6, № 4. - P. 421 -427.

80. Laskowski R.A., Macarthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures // J. Appl. Cryst. 1993. - V. 26. - P. 283-291.

81. Lauinger C. and Ressler C. (3-cyanoalanine as a substrate for asparaginase. Stoichiometry, kinetics and inhibition // Biochimica et Biophysica Acta. -1970.-V. 198.-P. 316-323.

82. Lawrence M.C., Colman P.M. Shape complementarity at protein/protein interfaces // J. Mol. Biol. 1993. - V. 234, № 4. - P. 946-950.

83. Leatherbarrow R.J. and Edwards P.R. Analysis of molecular recognition using optical biosensors // Current Opinion in Chemical Biology. 1999. -V.3.-P. 544-547.

84. Lebowitz J., Lewis M.S., Schuck P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review // Protein Sci. 2002. - V. 11, № 9. - P. 2067-2079.

85. Liedberg B., Nylander C, and Lunstrom I. Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing // Sensors and Actuators. 1983 - V. 4. - P. 299-304.

86. Lijnzaad P., Argos P. Hydrophobic patches on protein subunit interfaces: characteristics and prediction // Proteins. 1997. - V. 28, № 3. - P. 333-343.

87. Lubkowski J., Dauter M., Aghaiypour K., Wlodawer A. and Dauter Z. Atomic resolution structure of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase // Biological Crystallography. 2003. - V. D59. - P. 84-92.

88. Lubkowski J., Julius Palm G., Gilliland G.L., Derst C., Rohm K.-H. and Wlodawer A. Crystal structure and amino acid sequence of Wolinella succinogenes L-asparaginase // Eur. J. Biochem. 1996. - V. 241. - P. 201-207.

89. Lubkowski J., Wlodawer A., Ammon H.L., Copeland T.D. and Swain A.L. Structural characterization of Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase // Biochemistry. 1994,-V. 33.-P. 10257-10265.

90. Lubkowski J., Wlodawer A., Housset D., Weber I.T., Ammon H.L., Murphy K.C. and Swain A.L. Refined crystal structure of Acinetobacter glutaminasificans glutaminase-asparaginase // Acta Crystallogr. 1994. - V. D50.-P. 826-832.

91. Ma B., Nussinov R. Trp/Met/Phe hot spots in protein-protein interactions: potential targets in drug design // Curr. Top Med. Chem. 2007. - V. 7, № 10.-P. 1007-1013.

92. Marlborough D.I., Miller D.S., Cammack K.A. Comparative study on conformational stability and subunit interactions of two bacterial asparaginases // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 386. - P. 576-589.

93. McCoy A.J., Chandana Epa V., Colman P.M. Electrostatic complementarity at protein/protein interfaces // J. Mol. Biol. 1997. - V. 268, № 2. - P. 570-584.

94. McDonnell J.M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition // Current Opinion in Chemical Biology. 2001. - V. 5. - P. 572-577.

95. Michnick S.W. Chemical biology beyond binary codes // Chem. Biol. 2000. -V. 7,№12.-P. 217-221.

96. Millar D.P. Time-resolved fluorescence spectroscopy // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. - V. 6, № 5. - P. 637-642.

97. Miller M., Mohana Rao J.K., Wlodawer A. and Gribskov M.R. A left-handed crossover involved in amidohydrolase catalysis. Crystal structure of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase with bound L-aspartate // FEBS Letters. 1993. -V. 328, №3,-P. 275-279.

98. Morris A.L., Macarthur M.W., Hutchinson E.G. and Thornton J.M. Stereochemical quality of protein structure coordinates // Proteins. 1992. -V. 12.-P. 345-364.

99. Muegge I., Schweins T., Warshel A. Electrostatic contributions to protein-protein binding affinities: application to Rap/Raf interaction // Proteins. 1998. - V. 30, № 4. - P. 407-423.

100. Muller H.J., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL // Critical Reviews in Oncology/Hematology. 1998. - V. 28. - P. 97-113.

101. Myszka D.G. Kinetic analysis of macromolecular interactions using surface plasmon resonance biosensors // Curr. Opin. Biotechnol. 1997. - V. 8. - P. 50-57.

102. Nagata, K. Real-time analysis of biomolecular interactions / K. Nagata, H. Handa. Springer, 2000. -256 p.

103. Nemova G. and Kashyap R. Theoretical model of a planar integrated refractive index sensor based on surface plasmon-polariton excitation // Optics Communications. 2007. - V. 275, № 1. - P. 76-82.

104. Nishimura Y., Makino H., Takenaka O. and Inada Y. Amino acid residues in asparaginase (Escherichia coli hap) associated with its enzymic activity // Biochimicaet Biophysica Acta. 1971.-V. 227.-P. 171-179.

105. Novak E.K. and Phillips A.W. L-glutamine as a substrate for L-asparaginase from Serratia marcescens II Journal of Bacteriology. 1974. - V. 117, № 2. -P. 593-600.

106. Oettgen H.F., Old L.J., Boyse E.A., Campbell H.A., Philips F.S., Clarkson B.D., Tallal L, Leeper R.D., Schwartz M.K., Kim J.H. Inhibition of leukemias in man by L-asparaginase // Cancer Res. 1967. - V. 27. - P. 2619-2631.

107. O'leary M.H., Mattes S.L. pH dependence of the kinetic parameters of L-asparaginase // Biochimica et Biophysica Acta. 1978. - V. 522, № 1. - P. 238-242.

108. Ollenschloger G., Roth E., Linkesch W., Jansen S., Simmel A., Modder B. Asparaginase-induced derangements of glutamine metabolism: the pathogenetic basis for some drug-related side-effects // Eur. J. Clin. Invest. -1988.-V. 18.-P. 512-516.

109. Ott J.L. Asparaginase from Mycobacteria II J. Bacteriol. 1960. - V. 80. - P. 350-361.

110. Ouzounis C.A. and Valencia A. Early bioinformatics: the birth of a discipline -a personal view//Bioinformatics.-2003.-V. 19, № 17.-P. 2176-2190.

111. Paliwal A, Asthagiri D., Abras D., Lenhoff A.M., Paulaitis M.E. Light-scattering studies of protein solutions: role of hydration in weak protein-protein interactions // Biophys. J. 2005. - V. 89, № 3. - P. 1564-1573.

112. Palm G.J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Rohm K.-H., Wlodawer A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: Crystal structure of a Thr-89-Val mutant // FEBS Letters. 1996. - V. 390. -P. 211-216.

113. Pardanani A., Gambacurta A., Ascoli F., Royer W.E. Mutational destabilization of the critical interface water cluster in Scapharca dimeric hemoglobin: structural basis for altered allosteric activity // J. Mol. Biol. -1998. V. 284, № 3. - P. 729-739.

114. Perutz M.F. Structure and mechanism of haemoglobin // Br. Med. Bull. -1976.-V. 32, №3.-P. 195-208.

115. Peterson R.G., Handschumacher R.E. and Mitchell M.S. Immunological responses to L-asparaginase // The Journal of Clinical Investigation. 1971. -V.50.-P. 1080-1090.

116. Phizicky E.M. and Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis // Microbiological Reviews. 1995. - V. 59, № 1. - P. 94-123.

117. Pierce M.M., Raman C.S., Nail B.T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions // Methods. 1999. - V. 19, № 2. - P. 213-221.

118. Pinheiro J.P.V., Boos J. The best way to use asparaginase in childhood acute lymphatic leukaemia still to be defined? // British Journal of Haematology. - 2004. - V. 125.-P. 117-127.

119. Powell M.J.D. Restart procedures for the conjugate gradient method // Mathematical Programming. 1977. - V. 12. - P. 241-254.

120. Pritsa A.A. and Kyriakidis D.A. L-asparaginase of Thermus thermophilus: Purification, properties and identification of essential amino acids for its catalytic activity // Molecular and Cellular Biochemistry. 2001. - V. 216. -P. 93-101.

121. Pui C.-H. and Evans W.E. Acute lymphoblastic leukemia // Drug Therapy. -2005. V. 339, № 9. - P. 605-615.

122. Rich R.L. and Myszka D.G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis // Current Opinion in Biotechnology. 2000. - V. 11. - P. 54-61.

123. Richardson J.S. The anatomy and taxonomy of protein structure // Advances in Protein Chemistry. 1981. - V. 34. - P. 167-339.

124. Roberts J., Holcenberg J.S. and Dolowy W.C. Isolation, crystallization and properties of Achromobacteraceae glutaminase-asparaginase with antitumor activity // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 84-90.

125. Rohm K.H. and Schneider F. Kinetic studies on the mechanism of asparaginase from E. coli II Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1971. - V. 352.-P. 1739-1743.

126. Rohm K.H. and Van Etten R.L. The 180 isotope effect in 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy: mechanistic studies on asparaginase from Escherichia coli II Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 244. - P. 128-136.

127. Rohm K.H., Schneider F. Kinetic studies on the mechanism of asparaginase fromE. coliIIPhysiol. Chem.- 1971.- V. 352,№ 12.-P. 1739-1743.

128. Royer C.A. Fluorescence spectroscopy // Methods Mol. Biol. V. 40, 1995. -P. 65-89.

129. Savchenko A., Kashuba E., Kashuba V., Snopok B. Imaging technique for the screening of protein-protein interactions using scattered light under surface plasmon resonance conditions // Anal. Chem. 2007. - V. 79, № 4. -P. 1349-1355.

130. Saviola A., Luppi M., Potenza L., Morselli M., Bresciani P., Ferrari A., Riva G., Torelli G. Myocardial ischemia in a patient with acute lymphoblastic leukemia during 1-asparaginase therapy // Eur. J. Haematol. 2004. - V. 72. -P. 71-72.

131. Schuck P. Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. - V. 26. - P. 541-566.

132. Schwartz J.H., Reevesi J.Y. and Broome J.D. Two L-asparaginases from E. coli and their action against tumors // Biochemistry. 1966. - V. 56, - P. 1516-1519.

133. Sheinerman F.B., Norel R., Honig B. Electrostatic aspects of protein-protein interactions // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. - V. 10, № 2. - P. 153-159.

134. Shifrin S. and Grochowski BJ. L-asparaginase from Escherichia coli B. Succinylation and subunit interactions // The Journal of Biological Chemistry. 1972. - V. 247, № 4. - P. 1048-1054.

135. Shifrin S. and Parrott C.L. In Vitro Assembly of L-Asparaginase Subunits // The Journal of Biological Chemistry. 1974. - V. 249, № 13. - P. 4175-4180.

136. Shifrin S. and Solis B.G. L-Asparaginase from Escherichia coli B. Chemical niodificatiows of tyrosyl residues // The Journal of Biological Chemistry. -1972. V. 247, № 13. - P. 4121-4125.

137. Shifrin S., Luborsky S.W. and Grochowski B.J. L-Asparaginase from Escherichia coli B. Physicochemical studies of the dissociation process // The Journal of Biological Chemistry. 1971. - V. 246, № 24. - P. 7708-7714.

138. Shifrin S., Parrott C.L. and Luborsky S.W. Substrate binding and intersubunit interactions in L-asparaginase // The Journal of Biological Chemistry. -1974.-V. 249, №5.-P. 1335-1340.

139. Shifrin S., Solis B.G. and Chaiken I.M. L-Asparaginase from Erwinia carotovora. Physicochemical properties of the native and succinylated enzyme // The Journal of Biological Chemistry. 1973. - V. 248, № 10. - P. 3464-3469.

140. Sieciechowicz K.A., Joy K.W. and Ireland RJ. The metabolism of asparagine in plants // Phytochemistry. 1988. - V. 27. - P. 663-671.

141. Sokolov N.N., Zanin V.A., Aleksandrova S.S. Bacterial L-asparaginase and glutamine(asparagin)ase: some properties, structure and anti-tumor activity // Vopr. Med. Khim. 2000. - V. 46, № 6. - P. 513-548.

142. Stecher A.L., Morgantetti De Deus P., Polikarpov I., Abrahao-Neto J. Stability of L-asparaginase: an enzyme used in leukemia treatment // Pharmaceutica Acta Helvetiae. 1999. - V. 74. - P. 1-9.

143. Stevens J.M., Armstrong R.N., Dirr H.W. Electrostatic interactions affecting the active site of class sigma glutathione S-transferase // Biochem. J. 2000. -V. 347.-P. 193-197.

144. Stites W.E. Protein-Protein Interactions: Interface Structure, Binding Thermodynamics, and Mutational Analysis // Chem Rev. 1997. - V. 97, № 5.-P. 1233-1250.

145. Sussman J.L., Abola E.E., Lin D., Jiang J., Manning N.O. and Prilusky J. The protein data bank. Bridging the gap between the sequence and 3D structure world // Genetica. 1999. - V. 106. - P. 149-158.

146. Swain A.L., Jaskolski M., Housset D., Rao J.K., Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 1474-1478.

147. Sybyl 6.9, Tripos Inc., (1699) South Hanley Road, St Louis, Missouri.

148. Thorn K.S. and Bogan A.A. ASEdb: a database of alanine mutations and their effects on the free energy of binding in protein interactions // Bioinformatics. 2001. - V. 17, № 3. - P. 284-285.

149. Torreri P., Ceccarini M., Macioce P., Petrucci T.C. Biomolecular interactions by Surface Plasmon Resonance technology // Ann. 1st. Super Sanita. 2005. - V. 41,№4.-P. 437-441.

150. Tosa T., Sano R., Yamamoto K., Nakamura M., Ando K. and Chibata I. L-asparaginase from Proteus vulgaris II Apuped Microbiology. 1971. - V. 22, №3.-P. 387-392.

151. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of the hydrophobic effect // Protein Sci. -1997.-V. 6, № 1. P. 53-64.

152. Ulrich E.L., Markley J.L. and Kyogoku Y. Creation of a nuclear magnetic resonance data repository and literature database // Protein Seq. Data Anal. -1989.- V. 2.-P. 23-37.

153. Ung T., Liz-Marzon L.M. and Mulvaney P. Gold nanoparticle thin films // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2002. -V. 202.-P. 119-126.

154. Vakser I.A., Aflalo C. Hydrophobic docking: a proposed enhancement to molecular recognition techniques // Proteins. 1994. - V. 20, № 4. - P. 320-329.

155. Veselovsky A.V. and Ivanov A.S. Strategy of computer-aided drug design // Current Drug Targets -Infectious Disorders. 2003. - V. 3. - P. 33-40.

156. Veselovsky A.V., Ivanov Yu.D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P. and Janssen P. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs // Journal of Molecular Recognition. 2002. - V. 15. - P. 405-422.

157. Villa P., Corada M. and Bartosek I. L-asparaginase effects on inhibition of protein synthesis and lowering of the glutamine content in cultured rat hepatocytes // Toxicology Letters. 1986. - V. 32. - P. 235-241.

158. Wall M.A., Posner B.A., Sprang S.R. Structural basis of activity and subunit recognition in G protein heterotrimers // Structure. 1998. - V. 6, № 9. - P. 1169-1183.

159. Way J.C. Covalent modification as a strategy to block protein-protein interactions with small-molecule drugs // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. -V. 4, № 1.-P. 40-46.

160. Weiss S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules // Science. -1999. V. 283, № 5408. - P. 1676-1683.

161. Wells J.A. Binding in the growth hormone receptor complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.-V. 93, № l.-P. 1-6.

162. Wikman L.E.K., Krasotkina J., Kuchumova A., Sokolov N.N. and Papageorgiou A.C. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of L-asparaginase from Erwinia carotovora II Acta Crystallographica Section F.-2005.- V. 61.-P. 407-409.

163. Wileman T.E. Properties of asparaginase-dextran conjugates. Advanced Drug Delivery Reviews. 1991. - V. 6. - P. 167-180.

164. Wlodawer A., Vondrasek J. Inhibitors of HIV-l protease: a major success of structure-assisted drug design // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1998. -V. 27.-P. 249-284.

165. Wriston J.C. Asparaginase. Methods in Enzymology. 1985. - V. 113. - P. 608-618.

166. Xu D., Lin S.L., Nussinov R. Protein binding versus protein folding: the role of hydrophilic bridges in protein associations // J. Mol. Biol. 1997. - V. 265, № l.-P. 68-84.

167. Xu D., Tsai C.J., Nussinov R. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces // Protein Eng. 1997. - V. 10, № 9. - P. 999-1012.

168. Zemla A. LGA: A method for finding 3D similarities in protein structures // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 3370-3374.

169. Zhang J.-F., Shi L.-Y. and Wei D.-Z. Chemical modification of L-asparaginase from Escherichia coli with a modified polyethyleneglycol under substrate protection conditions // Biotechnology Letters. 2004. - V. 26.-P. 753-756.

170. Zhu J. Theoretical study of the light scattering from gold nanotubes: Effects of wall thickness // Materials Science and Engineering: A. 2007. - V. 454. -P. 685-689.

171. Zimmermann В., Hahnefeld C. and Herberg F.W. Applications of biomolecular interaction analysis in drug development // Targets. 2002. -V. 1, № 2. - P. 66-73.

172. Zutshi R., Brickner M., Chmielewski J. Inhibiting the assembly of protein-protein interfaces // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. - V. 2, № l.-P. 62-66.

173. Кислицын Ю.А., Кравченко О.В., Никонов C.B., Куранова И.П. Кристаллическая структура L-аспарагиназы из Erwinia carotovora // Кристаллография. 2006. - T. 51. - С. 811-816.

174. Либинсон Г.С. и Михалев A.B. Зависимость величины Km от pH для L-аспарагиназы // Биохимия. 1976. - Т. 41, № 1. - С. 149-152.

175. Тимаков A.M., Кондратчик К.Д., Хондкарян Г.Ш., Муторова О.Ю., Ковалева O.JI. Препараты L-аспарагиназы в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии. 2003. - Т. 2, № 3. - С. 90-93.

176. Юлаев М.Ф., Ивницкий Д.М., Кашкин А.П., Богданова Т.Я., Корсакова A.C. и Вина И.А. Иммунохимическое изучение модифицированных форм L-аспарагиназы // Антибиотики и медицинская биотехнология. -1987.-Т. 32, № 11.-С. 846-849.