Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Диагностика черной ножки картофеля, вызываемой бактериями рода Dickeya и генетический полиморфизм штаммов возбудителей

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Диагностика черной ножки картофеля, вызываемой бактериями рода Dickeya и генетический полиморфизм штаммов возбудителей"

005003227

КАРЛОВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

ДИАГНОСТИКА ЧЕРНОЙ НОЖКИ КАРТОФЕЛЯ, ВЫЗЫВАЕМОЙ БАКТЕРИЯМИ РОДА DICKEY А И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

Специальности: 06.01.07 - защита растений 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Москва-2011

005003227

Работа выполнена в лаборатории защиты растений Российского государственного аграрного университета-МСХА имени К. А. Тимирязева

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Джалилов Февзи Сеид-Умерович доктор биологических наук Игнатов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных профессор

Сидоренко Олег Дмитриевич кандидат биологических наук Соболев Владимир Васильевич

наук,

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «£2 » ЛеКАБРЯ 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.04 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49. Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан «/5"» ЙОЯЬРД 2011 года и размещён в сети Интернет на сайте университета www.timacad.ru и направлен на сайт ВАК referat_vak@mov.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А. Н. Смирнов

Актуальность проблемы. Картофель выращивают в 130 странах, где проживает 75% населения планеты. Это пятый по значению после пшеницы, кукурузы, риса и ячменя источник калорий в рационе современного человека. В среднем в мире производится более 325 миллионов тонн картофеля в год, большая часть производства приходится на страны Европы и Азии (около 80% мирового производства картофеля) (van der Zaag, Horton, 1983).

Доля России в мировом производстве этой культуры по посевным площадям и валовому сбору составляет около 10%. Экспорт картофеля оценивается на уровне 100 тыс. т. в год, а импорт 400 - 500 тыс. т. (более 1,5 % его валового производства) (Симаков и др., 2010). Так как Россия импортирует немалое количество картофеля, в том числе и семенного, возникает опасность ввоза и распространения с посадочным материалом возбудителей новых болезней. Прежде всего, это те болезни, возбудитель которых сохраняется непосредственно в семенах и в последующем является главным источником инфекции. В нашей стране эта опасность, также может увеличиться в связи с предстоящим вступлением в ВТО и как следствие увеличением потока посадочного материала, произведенного в других странах, зачастую с другим, чем в России набором возбудителей болезней. Среди болезней картофеля, важное место принадлежит бактериозам, которые распространены повсеместно и уносят от 10 до 25 % урожая, а в некоторых районах страны во влажные годы потери урожая могут достигать 50 % (Катаева, 1972). К числу наиболее распространенных и вредоносных бактериальных болезней картофеля относится черная ножка (Лазарев, Базлеева, 1994; Лазарев, 1985). Это заболевание вызывают три самостоятельных, но близкородственных вида пектолитических бактерий из семейства Enterobacteriaceae: Pectobacterium atrosepticum, Р. carotovorum subsp. carotovorum и Erwinia chrysanthemi, которые вызывают симптомы на растениях в период вегетации и на клубнях при хранении. Однако, сравнительно недавно в 1982 году вид Е. chrysanthemi, был включен в список карантинных объектов для стран Европейского Союза и по ряду признаков выделен в новый род, который назвали Dickeya. Начиная с 2004 года, этот патоген стремительно стал распространяться по Европе, причиняя значительные экономические потери. Кроме того, появляются сведения об обнаружении нового, более агрессивного вида D. solani (Tsror et al., 2008, Slawiak et al., 2009). В Голландии в 2007 году экономический ущерб от этого заболевания составил 25 млн. евро. Многие страны закрыли свой рынок для картофеля, не имеющего сертификата на отсутствие Dickeya.

Очевидно, что патоген распространяется с посадочным материалом. Возбудитель болезни на клубнях чаще всего находится в латентной форме. Поэтому, большое значение для борьбы с этим новым заболеванием имеет

тестирование посадочного материала на зараженность. Достоверная диагностика является важным условием для предотвращения распространения заболевания. Наиболее перспективным является использование современных серологических и молекулярно - генетических методов, таких как ИФА (иммуноферментный анализ) и ПЦР (полимеразная цепная реакция). Необходимым условием для успешного применения молекулярно-генетических методов диагностики является изучение генетического полиморфизма видов и штаммов Dickeya. К началу выполнения настоящей работы отсутствовали сведения о распространении Dickeya на картофеле в Российской Федерации.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось усовершенствование методов диагностики возбудителя черной ножки картофеля из рода Dickeya и изучение генетического полиморфизма российской коллекции штаммов патогена.

Для достижения этой цели планировалось решение следующих задач:

1. Выделение возбудителей черной ножки картофеля из рода Dickeya, создание коллекции штаммов, изучение их биохимических свойств и круга растений-хозяев.

2. Усовершенствование диагностики Dickeya spp. методами ИФА, ПЦР и ПЦР в реальном времени.

3. Изучение генетического полиморфизма коллекции штаммов Dickeya, выделенных из картофеля в России.

Научная новизна. Впервые в России выделены D. dianthicola и D. solani как возбудители черной ножки картофеля. Показано, что в список известных растений-хозяев D. dianthicola и D. solani следует включить табак и ирис. Впервые определены последовательности 7 генов для D. solani, выявлено, что наибольшее генетическое расстояние между D. solani и D. dianthicola имелось для генов pelD, mdh и dnaX что указывает на возможность использования их для разработки молекулярного маркера для D. solani.

Практическая значимость. Создана коллекция российских штаммов D. solani и D. dianthicola (15 штаммов). Разработан ИФА - диагностикум, позволяющий выявлять бактерии D. dianthicola в клубневом экстракте. Показана перспективность использования Био-ИФА с целью повышения чувствительности диагностики. Подобрана флуоресцентная проба, которая вместе с парой праймеров ADE1/ADE2 выявляет присутствие бактерий рода Dickeya методом ПЦР в реальном времени.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (г. Москва, 1 - 2 июня 2011г.) и на Научно-практической конференции, посвященной 145-летию

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева «Адаптация сельского хозяйства России к меняющимся погодно климатическим условиям» (7-10 декабря 2010 г.).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, 4 глав экспериментальной части, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Обьем работы составляет 129 страниц. В диссертации содержится 24 рисунка и 28 таблиц. Список использованной литературы содержит 140 источников, в том числе 129 иностранных авторов.

Автор искренне признателен ведущему научному сотруднику ВНИИКХ им. А.Г. Jlopxa к.б.н. Варицеву Ю.А., заведующему лабораторией молекулярных методов диагностики ВНИИКР к.б.н. Мазурину Е.С., научным сотрудникам ВНИИФ к.б.н. Пехтеревой Э.Ш. и Корневу К.П., научному сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Зотову B.C.; руководителю Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, д.б.н. Карлову Г.И. и с.н.с. И.А.Фесенко за большую помощь в выполнении работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК П2380, ГК 02.740.11.0286 и «Молодежного бизнес - инкубатора CAO» по программе «Умник».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы исследования, сформулированы основная цель и задачи исследования.

Глава I. Обзор литературы

В этой главе рассмотрены биологические свойства и особенности патогенеза основных возбудителей черной ножки картофеля. Приведены сведения о видовом составе, круге растений-хозяев, распространении и вредоносности новых бактериальных патогенов картофеля Dickeya dianthicola и D. solani. Рассмотрены основные методы диагностики возбудителей.

Глава П. Методы и материалы

Работа была выполнена в 2008 - 2011 гг. в лаборатории защиты растений РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Отдельные эксперименты проводили в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА, во ВНИИ фитопатологии, ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Jlopxa, Всероссийском центре карантина растений (ВНИИКР).

s

Растительный материал для изоляции патогена был собран в различных областях РФ. Выделение бактерий проводили методом посева на картофельный агар (КА) или питательный бульон с дрожжевым экстрактом (NBY), а также использовали селективную для пектолитических бактерий среду Логана. Видовую идентификацию изолятов проводили по физиологическим признакам и с использованием ПЦР метода. Для этого, единичные колонии суточной культуры каждого изолята суспендировали в 100 мл стерильной дистиллированной воды и выделяли ДНК с использованием набора «Проба-ГС» («ДНК-Технология», Москва) согласно рекомендациям производителя. ПЦР проводили с праймерами ADE1/ADE2 специфичными к фрагменту гена pelD бактерий рода Dickeya. Стандартная реакционная смесь ПЦР содержала 75 мкМ Трис - HCl, pH 8,8; 20 мкМ (NH^SC^; 0,01% Твин 20; 200 мкМ каждого dNTP; 20 пМ каждого праймера; 2 мкМ MgCl2; 1 единицу Smar Tag ДНК полимеразы (Диалат, Москва) и 2 нг целевой ДНК. Окончательный обьем смеси составлял 25 мкл. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» (ДНК — Технология, Москва) при следующих температурно - временных параметрах: начальная денатурация (95°С, 15 мин); последующие 35 циклов денатурация (95°С, 1,5 мин), отжиг (50°С, 60 сек) и элонгация (72°С, 1 мин); завершающая элонгация (72°С, 15 мин). После окончания амплификации 10 мкл амплифицированных продуктов разделяли в 1,5 % агарозном геле с бромистым этидием в буфере TBE 0,5Х и документировали при помощи системы UVP (Великобритания). Выделенные и проанализированные штаммы Dickeya spp. хранили в 15%-ном глицерине при - 70°С и в стерильной воде при комнатной температуре в четырехкратной повторности.

Биохимический анализ штаммов проводили с использованием тест -системы стрип API 20Е (производство ЫоМёпеих, Франция). Для определения вирулентных свойств бактерий проводили инокуляцию 17 растений из различных семейств. Заражение растений проводили уколом в пазуху листа, в концентрации бактерий 108 кл/мл. Антибактериальную активность фитобактериомицина по отношению к штамму D9 D. dianthicola оценивали in vitro. В стерильную 96-ти луночную планшету для ИФА вносили среду D-PEM, фитобактериомицин в различных концентрациях и бактерии в концентрации 102 кл/мл. Инкубацию проводили в течение 17 часов при температуре 27°С, регистрируя каждый час оптическую плотность суспензии бактерий.

Для получения иммуноглобулинов проводили иммунизацию кроликов породы «Шиншилла» бактериальной суспензией D. dianthicola штаммов D9 и D17. Иммунизацию проводили по схеме, применяемой в отделе биотехнологии ГНУ ВНИИКХ для получения антисывороток к бактериальным антигенам. Титр полученных антисывороток определяли методом непрямого

иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием ослиных антител против глобулинов кролика, меченых пероксидазой производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея (г. Москва). Коньюгаты получали с использованием перйодатного метода. При постановке ИФА использовали методику, адаптированную для идентификации бактерий (Варицев и др., 2003). При постановке Био - ИФА перед внесением антигенов в лунки вносили селективную среду D - РЕМ, с последующим нанесением на ее поверхность 20 мкл минерального масла, с целью создания анаэробных условий. Оптическую плотность продуктов ферментативной реакции в ИФА измеряли с помощью вертикального микропланшетного фотометра (Bio-Rad, модель 680) при длине волны 450 нм. Реакцию двойной иммунодиффузии в агаре проводили по стандартной методике (Воробьева, 2006).

При проведении ПЦР в реальном времени использовали праймеры ADE1/ADE2 (Darrasse et al., 1994) и подобранную нами пробу ADE3. Реакцию проводили с использованием набора MasterMix (ООО «Диалат Лтд», Москва) и детектирующего амплификатора «iCycler iQ5» (Bio-Rad Laboratories, США). Температурно-временной профиль составлял: первый цикл: начальная денатурация - 96°С, 5 мин; последующие 35 циклов: денатурация - 95°С, 10 сек, отжиг - 57,7°С, 45 сек (анализ результатов в реальном времени на каждом цикле), элонгация 72°С - 1мин. Для повышения достоверности диагностики методом ПЦР в реальном времени, в процессе пробоподготовки использовали краситель пропидиум моноазид (РМА, Biotium Inc, Hayward, Калифорния, США, кат. номер 89139-058), способный связывать ДНК мертвых клеток бактерий после фотоактивации, тем самым препятствуя амплификации.

Для проведения анализа секвенирования и изучения генетического полиморфизма бактерий рода Dickeya была использована коллекция штаммов выделенных нами из различных областей России. Анализ штаммов методом мультилокусного секвенирования (MLST) проводили с использованием восьми различных генов. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом генетическом анализаторе DNA Analyser 3730 (фирмы Applied Biosystems) с использованием набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (фирмы Applied Biosystems), согласно рекомендациям производителя.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Straz, SPSS 15 и Statistica 5.5.

Глава Ш. Выделение и идентификация возбудителей черной ножки из рода Dickeya.

3.1. Выделение и идентификация штаммов возбудителей методом ПЦР со специфичными праймерами

Из растений, имеющих типичные симптомы черной ножки, полученных из различных областей РФ, было выделено более 500 бактериальных изолятов. На среде КА с генцианвиолетом ряд колоний имели вид сгустка бледно - белого цвета в центре с прозрачной слизистой каймой. В случае выделения на среду NBY колонии были плоскими и практически прозрачными. Имеющие такой внешний вид колонии отсевали на среду Логана с полипектатом натрия. Бактерии, образовавшие лунки в пектатном геле в основном принадлежали к роду Pectobacterium, но в результате проведения дальнейших тестов были также обнаружены колонии бактерий, принадлежавшие роду Dickeya.

В результате проведенного ПЦР анализа (рис. 1) со специфичными праймерами, было показано, что 15 изолятов, выделенных из клубней картофеля полученных из Московской, Воронежской и Нижегородской областей, принадлежат к роду Dickeya. Они были использованы для определения видовой принадлежности, а также проведения дальнейших экспериментов.

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК изолятов Dickeya spp. со специфичными праймерами ADE1; ADE2. 1-15 штаммы D9, D8, D17, D33, Dl, D9Tr, D9B, DFil, D231( D232, D233, D234, D3B,, D3B2, D3B3 соответственно, 16 - отрицательный контроль (Eca 393, Pectobacterium atrosepticum), 17 - положительный контроль (штамм 2116 D. dianthicola, коллекция Plant Research International, Нидерланды).

3.2. Биохимические свойства штаммов Dickeya spp. В результате проведенных реакций было установлено, что все используемые штаммы имели положительную реакцию на пектолитическую активность, ¡3 -галактозидазу, утилизацию цитрата, образование ацетоина. Отрицательная реакция у всех штаммов наблюдалась в реакции на окрашивание по Граму, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу, образование сероводорода, уреазу. Все штаммы имели свойство образования кислоты из D-глюкозы, D-маннита, L-рамнозы, D-сахарозы, амигдалина, L-арабинозы. При постановке

реакции на аргининдигидролазу штаммы Д. dianthicola Dl, D9B, D17, ЗВ2 D9, D9Tr, ЗВ,, D33. в том числе и штамм Д solani DFil имели отрицательную реакцию, а штаммы D. dianthicola D8 и ЗВ3 реагировали положительно. В реакции на триптофандизаминазу положительный результат был установлен со штаммом D8, реакция с остальными штаммами была отрицательной. Штаммы Д. dianthicola D17, D8, D9, ЗВ2, D9, D9Tr, ЗВ,. ЗВ3, D33 образовывали индол, а штаммы Д. solani D Fil и D. dianthicola Dl, D9B - нет. Способность к гидролизу желатина наблюдалась у всех штаммов, кроме трех штаммов D. dianthicola D17, D33 и ЗВ,. Четыре штамма D. dianthicola D9B, D17, D9Tr, D33 имели способность к образованию N02. Способностью к образованию кислоты из инозита обладали два штамма Д. dianthicola D8 и D17, из D-сорбита три штамма D. dianthicola Dl, D9B, D9Tr и штамм Д. solani D Fil. Штаммы ЗВ,, 3B2, D9 образовывали кислоту из D-мелибиозы.

Таким образом, нами изучены основные физиологические свойства российской коллекции штаммов Д dianthicola и Д. solani. Вариабельность штаммовых реакций не позволяют выделить физиологические тесты, которые можно надежно использовать для видовой идентификации. Основным методом для достижения этой цели является молекулярно-генетический метод.

3.3. Определение круга растений - хозяев D. dianthicola и D. solani

Искусственное заражение таких растений как гвоздика, георгин, ячмень, пшеница, клевер, лен, люпин, овес, вика, рапс, тритикале не дало каких либо видимых симптомов поражения как при заражении растений штаммами Д dianthicola, так и при заражении штаммом Д solani.

Растения ириса и картофеля поражались штаммами D9, D33, D Fil и Еса 393. На растениях картофеля через 4-5 дней в месте инокуляции формировалось темное расплывающееся по стеблю пятно. В случае заражения растений штаммом вида Д. solani распространение патогена происходило намного интенсивнее. Растения ириса, во всех случаях заражения, за исключением контроля, в месте введения суспензии через 2 - 3 дня чернели с образованием бактериального экссудата. Растения томата и табака не поражались штаммом Еса 393, но поражались штаммами D9, D33, D Fil. На растениях томата при заражении штаммами Д dianthicola в том месте, где производили инокуляцию, растение ломалось и увядало. При заражении штаммом Д. solani вследствие закупорки сосудов формировались воздушные корни. На растениях табака, при заражении штаммами D9, D33 и D Fil через 3 -4 дня стебель темнел и терял тургор параллельно с распространением бактерий от места укола к его верхней части.

Полученные нами результаты позволяют включить в список известных растений-хозяев для Д dianthicola и Д solani табак и ирис. Это расширяет

наши представления о циркуляции патогена и показывает целесообразность пространственной изоляции картофеля от указанных выше видов растений.

3.4. Оценка антибактериального действия фитобактериомицина по отношению к бактериям рода Шскгуа

Биопрепарат фитолавин, ВРК (действующее вещество - антибиотик фитобактериомицин, ФБМ) зарегистрирован на картофеле против черной ножки (возбудитель - Р. МгояерИсит). Представляло интерес оценить антибактериальную активность ФБМ (Бушкова, Лазарев, 1984) по отношению к Д (НапШсоЬ.

Культивирование бактерий Д сИапШсо1а (штамм Б9) в жидкой питательной среде О-РЕМ содержащей ФБМ в различных концентрациях позволило установить, что при концентрациях 160, 80 и 40 мг/л в течение всего времени инкубации (17 часов) оптическая плотность суспензии бактерий оставалась на уровне фоновых значений, то есть происходило сдерживание размножения бактериального патогена (рис. 2). При концентрациях менее 40 мг/л сдерживание роста бактерий происходило в меньшей степени, либо оптическая плотность не отличалась от контроля.

о

п

(О

о О

л" ь

о о

X I-

о с, с

к го и о 0) Т

ь с

о

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

160 мг/л

„ - - ^ -»-■ 80 мг/л

40 мг/л

20 мг/л

-*-10 мг/л

—X—X -•- 5 мг/л

"" >■—- ^ ..Щ-" ж— л -н-2,5 мг/л

--- • • *

— 1,25 мг/л

-г-1-1-1-1-1-1-1-1-■■-:-!-I-1-1-1- — 0 мг/л

5 7 9 11 13 Период инкубации, часы

15 17

Рис. 2. Рост культуры Д сЧаШЫсо1а, штамм Б9 в жидкой среде Б-РЕМ при различных концентрациях фитобактериомицина

Полученные данные позволяют предполагать, что рекомендованный для защиты картофеля от Р. Мгоэгрисит препарат фитолавин, ВРК (д.в. -

фитобактериомицин), будет также эффективен против новых патогенов черной ножки - Д <ИатЫсо\а и Д ¡о1ат. Это предположение, конечно, требует дальнейшей экспериментальной проверки в вегетационных и полевых опытах.

Глава IV. Диагностика возбудителя черной ножки Вккеуа зрр. серологическим методом.

4.1 Получение иммуноглобулинов гомологичных бактериальным штаммам 2). сИапМЫа и создание на их основе ИФА-диагностикума.

В результате проведения серии подкожных и внутримышечных инъекций кроликам нами были получены иммуноглобулины и пероксидазные конъюгаты к штаммам Д сИапЛШа Б9 и Б17. Для использования иммуноглобулинов в целях практической диагностики оценивали реакцию двух видов антител в 4 концентрациях против 4 штаммов Иккеуа в трех повторностях.

Иммуноглобулины к штамму Б9 в среднем обеспечивали большую оптическую плотность продукта ИФА (о.п. - 0,999), по сравнению с антителами к штамму Б17 (о.п. - 0,682).

В среднем оба диагностикума достоверно отделяли 4 штамма Д сИапШсо1а от двух других видов фитопатогенных бактерий С. т1^стет1в яЬзр- зерейотст и Р.сагоШогит яиЬБр. сагоШогит паразитирующих на картофеле. Между реакцией 4-х штаммов Шсквуа имелись определенные различия, так при тестировании в качестве антигена штамма Б17 оптическая плотность продукта ИФА была достоверно выше при использовании обоих видов антител, чем у трех других штаммов. Было показано, что оптимальной концентрацией иммуноглобулинов является 3 мкг/мл.

В другом эксперименте штаммы Д <ИстгЫсо1а, Р. аКоверИсит, Р. саго^огит виЬзр. сагоШогит тестировали в ИФА с диагностикумами к Д сИапШсоЬ и Р. а&ойерНсит. Результаты ИФА показали, что Д сИапШсо1а, Ра и Рсс являются серологически обособленными видами. Так, штаммы Д Б1апМсо1а и Ра реагировали лишь с гомологичными диагностикумами и не давали перекрестных реакций. Штаммы Рсс не давали положительных результатов с двумя вышеназванными антителами (табл. 1).

Таким образом, было показано, что три различных возбудителя черной ножки картофеля могут быть легко различимы с помощью ИФА.

Порог чувствительности ИФА при диагностике Д сИап1Ысо1а в буфере и в клубневом экстракте не различался и был на уровне 2х104-105 кл/мл. Это свидетельствовало о высокой специфичности иммуноглобулинов, т.е. не наблюдалось повышение «фона» реакции за счет взаимодействия иммуноглобулинов и антигенов сапротрофной микробиоты клубневого экстракта, а также об отсутствии в экстрактах клубней веществ ингибирующих

прохождение реакции. Полученные данные свидетельствуют о возможности диагностики Бккеуа Брр. методом ИФА непосредственно в клубневом экстракте не прибегая к трудоемкому процессу выделения бактерий в чистую культуру.

Таблица 1

Реакция возбудителей черной ножки картофеля с различными ИФА - диагностикумами (оптическая плотность продукта при 450 нм)

Вид Штамм ИФА - диагностакум к штамму

Л сИапМсо1а Р. аЪохерНсит

Р9 Э17 Еса 393 Еса 31а Еса 21

Д сИаыЫсо!а 09 0,832с 0,657Ь 0,026а 0,016 а 0,018 аЬс

Б8 0,871«! 0,638Ь 0,021а 0,021 а 0,015 аЪ

Б17 0,759Ь 0,662Ь 0,020а 0,015 а 0,010 аЬ

1>33 0,827с 0,650Ь 0,025а 0,028 а 0,026 аЬс

Р. а^ерИсит Еса21 0,020' 0,023а о.зооь 0,118 с 0,229(1

Еса393 0,030" 0,020а 0,841с 0,300 а 0,546 е

Еса31* 0,047» 0,017а 0,320Ь 0,128 с 0,256(1

Р. сагоШогит зиЬхр. сагоШогит Р39 0,013« 0,013а 0,008а 0,009 аЪ 0,009 а

РЗ-2 0,038' 0,023а 0,030а 0,053 а 0,010 аЬ

РЗ-З 0,030" 0,020а 0,026а 0,014 аЬ 0,015 аЬ

Отрицательный контроль -С.т.йереёогасиз Ств204 0,037а 0,019а 0,024а 0,034 аЬ 0,021 аЬс

Примечание: Между вариантами, обозначенными одинаковыми буквами при сравнении в пределах столбцов нет статистически достоверных различий по критерию Дункана при 95%- м уровне вероятности.

Качественные антигенные различия между штаммами Д сИапМсо1а и Д. 5о/аш оценивали по характеру дуг преципитации в реакции двойной иммунодиффузии в агаре. Результаты показали практически во всех комбинациях антиген-антитело реакцию полной идентичности. Антитела к Д. сИашЫсо1а давали реакцию с Д зо1ат. Таким образом, в результате

проведенных исследований наличие у патогенов серологических групп установлено не было.

4.2 Усовершенствование метода иммуноферментного анализа для диагностики клубневом инфекции Эккеуа $/>/>.

Использование БИО-ИФА показало, что, так же как и в варианте с обычным ИФА не наблюдалось различий оптической плотности продукта при внесении бактерий в буфере и клубневом экстракте. Чувствительность БИО-ИФА по сравнению с обычным вариантом «сэндвич-метода» была на 4 порядка выше (табл. 2).

Таким образом, использование БИО-ИФА позволяет значительно повысить чувствительность диагностики зараженности клубней картофеля возбудителями «черной ножки» из рода Бккеуа непосредственно в экстракте клубней без предварительного выделения на питательные среды. Так как, инфекция в семенном материале чаще всего находится в латентной форме, использование данного метода позволит повысить достоверность результатов.

Таблица 2

Тестирование D. dianthicola, штамм D9 в ИФА_

Концентрация патогена, кл/мл Оптическая плотность продукта ИФА, 450 нм

Обычный ИФА Био - ИФА

2x107 3,001х 2,932х

2x106 2,993х 2,898х

2x10S 2,987х 3,020х

2x104 0,854х 2,831х

2x103 0,343 2,819х

2x102 0,303 2,713х

2x10' 0,289 2,697х

2x10° 0,268 2,474х

Фон/Среда Отрицательный контроль 0,336 0,303

Еса21 Отрицательный контроль 0,308 0,278

Отрицательный контроль -Х.с. Dach 2 0,310 0,225

Порог достоверности положительных результатов (Хстсд. Фона ЗЕ) 0,477 0,696

Примечание: т - значения выше порога достоверности положительных результатов

Глава V. Диагностика И. ШапМсоШ методом ПЦР в реальном времени

5.1 Подбор праймеров и пробы, оптимизация условий проведения реакции

Для проведения ПЦР в реальном времени использовали праймеры АОЕ1/АПЕ2 специфичные к фрагменту гена реЮ Огскеуа $рр. и разработанную нами пробу А1ЖЗ. При оптимизации условий реакции было установлено, что оптимальной температурой отжига являлось значение, 57,7°С. Наилучшие результаты были получены при использовании концентрации пробы 5 пкмоль в расчете на одну реакцию.

В результате определения зависимости порогового значения цикла в ПЦР в реальном времени от концентрации клеток было показано, что с увеличением концентрации клеток В. <ИаЫЫсо1а происходило уменьшение пороговых значений цикла (С,). Полученные данные позволили построить калибровочную кривую зависимости С, от концентрации клеток патогена (рис. 3).

о' аГ

Ъ 1

у.= -3,37Х f 45,37 R? = 0,982

-Ж...

—J-

Log КОЕ/мл

Рис. 3. Зависимость порогового значения цикла (Ct) от исходной концентрации клеток D. dianthicola Эффективность предложенной диагностической системы ПЦР в реальном времени рассчитанная по формуле Е = 101/а, где 1/а - показывает, на сколько порядков изменится количество ДНК за один цикл реакции (Ребриков Д.В., и др., 2009) составила 1,98, что свидетельствовало об увеличении количества копий ДНК за каждый цикл в 1,98 раза. Это является достаточно высоким значением и свидетельствует о перспективности данной тест-системы для практического применения.

Чувствительность и специфичность разработанной пробы ADE была оценена в тестах с ДНК бактерий различных видов рода Dickeya голландской коллекции, любезно предоставленных д-ром van der Volf (Plant Research International, Wageningen, the Netherlands) и штаммов Pectobacterium spp.

используемых в качестве отрицательного контроля (Есс 3, Есс 36 и Еса 393). Достоверное превышение фонового уровня флуоресценции происходило на 22-м цикле ПЦР реакции. При использовании ДНК 20 типовых штаммов рода Dickeya и штамма D9 D. dianthicola, наблюдалась родоспецифичная реакция.

В результате проведенного эксперимента показано, что проба ADE3 в сочетании с праймерами ADE1/ADE2 может быть использована для достоверного выявления бактерий рода Dickeya, а в дальнейшем для создания на ее основе диагностической системы для практического применения.

5.2 Изучение возможности повышения достоверности диагностики Dickeya dianthicola

При идентификации бактерий методом ПЦР, в случае положительной реакции выделение патогена в чистую культуру на питательную среду удается не всегда. Причиной таких «ложноположительных» результатов может быть ДНК мертвых клеток, которая амплифицируется в ПЦР также как и ДНК живых клеток. Это ограничивает применение ПЦР при проведении фитосанитарной экспертизы, требующей подтверждения жизнеспособности патогена.

Недавно для предотвращения амплификации ДНК мертвых клеток было предложено использование красителя пропидиум моноазида (РМА), способного к связыванию ДНК (Nocker et al., 2007). Это вещество, проникая лишь через поврежденные мембраны мертвых клеток, после обработки интенсивным светом связывает цепи ДНК ковалентной связью. Это делает затруднительным амплификацию ДНК при ПЦР в реальном времени, что выражается в увеличении значения порогового цикла Ct. Различия реакции живых и мертвых клеток в ПЦР в реальном времени выражают в ACt = Ct мертвых клеток - Ct живых клеток (Kobayashi et al., 2010). Этот подход был апробирован для разделения живых и мертвых клеток Listeria monocytogenes (Rudi et al., 2005), Salmonella enterica (Nocker, Camper, 2006).

На первом этапе исследований живые и мертвые клетки бактерий при пробоподготовке до выделения ДНК подвергали воздействию различных концентраций РМА. Наибольшие значения ACt (Ct мертвых клеток - Ct живых клеток) наблюдали при концентрациях РМА 25мМ и выше. Отсутствие достоверных различий между 25 мМ, 50 мМ и 100 мМ позволило выбрать концентрацию 25 мМ как оптимальную (табл. 3). Анализ ACt при обработке РМА живых клеток, показал, что разница количества циклов в сравнении с контролем была не существенна.

Таблица 3

Изменение значений порогового цикла (ACt) при использовании различных концентраций РМА __

Концентрация ДС, ДС, РМА жив. -

РМА (РМАмертв. - РМА (РМАмертв. - ДМСО жив.

жив.) ДМСО жив.)

5мМ 0,24 а 0а 0,4 а

ЮмМ 5,71 b 2,67 b 0,4 а

25мМ 11,11с 11,30 cd 1,07 а

50мМ 11,49 с 12,54 cd 1,94 а

ЮОмМ 11,09 с 10,20 с 0,94 а

Испытание различной продолжительности фотоактивации (табл. 4), показало, что наибольшие значения Добыли установлены при экспозиции 5 минут. Увеличение и уменьшение времени экспозиции приводило к снижению ДС(. Таким образом, экспозиция 5 минут может быть рекомендована для дальнейшего использования.

Таблица 4

Значения порогового цикла ACt в ПЦР в реальном времени при тестировании живых и термоинактивированных клеток D.dianthicola при различных экспозициях фотоактивации РМА__

Период фотоактивации РМА, мин ДС^ (РМАмертв.-ДМСО мертв.) ДС, (РМАмертв. -ДМСО жив.) ДС, (РМАмертв.-РМА жив.)

1,5 6,14а 5,58а 7,00а

5,0 9,58Ь 9,97Ь 12,06Ь

10,0 7,74а 8,94Ь 8,81а

Таким образом, показано, что при проведении ПЦР в реальном времени сравнение ACt для обработанных и необработанных РМА в процессе пробоподготовки двух частей растительного образца позволяет установить наличие жизнеспособного возбудителя черной ножки картофеля D. dianthicola. Глава VL Генетический полиморфизм видов и штаммов Dickeya В результате секвенирования были расшифрованы последовательности ДНК российской коллекции бактерий рода Dickeya по восьми изучаемым генам. Все последовательности были выровнены и проанализированы на сходство с использованием сервера BLAST.

При проведении филогенетического анализа всех штаммов Российской коллекции по изученным генам (ген аконитатгидралазы 1 (aconitate hydrase 1 -

аспА), пище ральдегидфосфатдегидрогеназы А (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase А - gap А), изоцитратдегидрогеназы (isocitrate dehydrogenase -icdA), малатдегидрогеназы (malate dehydrogenase - mdh), маннитолфосфатдегидрогеназы (mannitol-l-phosphate dehydrogenase - mtID), глюкозофосфатизомеразы (glucose-6-phosphate isomerase - pgi), ген Tay и гамма субъединиц ДНК полимеразы 3 (DNA polymerase III tau and gamma subunits -dnaX), ген пектатлиазы (pectat lyase - pelD)), было установлено, что все штаммы, кроме DsFil и Dd9L, тесно кластеризовались с представительными последовательностями известных штаммов D. dianthicola, в том числе со штаммом Ech600, ошибочно указанным в Генбанке как D. dadantii.

Анализ последовательностей фрагментов гена dnaX (рис. 4), показал, что штамм DsFil кластеризовался со штаммами группы "solani", выделенными в Европе, а по последовательностям фрагментов других генов (для которых не было доступных последовательностей "solani") - находился между D. dianthicola и D. dadantii.

Таким образом, мы впервые определили последовательности 7 генов для группы "solani", которые могут быть использованы для разработки специфичных праймеров для ПЦР диагностики этого опасного вида бактерий.

92 Л

Л

67

96

О. "solani"

D, dieffenbachiae 94

■—D. zaae

87 I ^ D. dadantii 66

- D sp. IP02130

I D. chrysanthemi -1 D. zeae

« D. paradisiaca

99

- P atrosepticum 1РОЭ98 -P atrosepticum IP0161

0.02

Рис. 4. Филогенетическое дерево для последовательностей 106 фрагментов гена с/иаЛГ показывающее все геномовиды рода Бккеуа

Эволюционная история определена с помощью метода ближнего соседа (Saitou, Nei, 1987). Процент повторяющихся деревьев с совместной группировкой таксонов указан по результатам бутстреп анализа возле соответствующих узлов дерева (Felsenstein, 1985). Эволюционные расстояния определены при помощи метода максимального сложного правдоподобия (Maximum Composite Likelihood) (Tamura, Nei, Kumar, 2004). Филогенетический анализ проведен с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura, Dudley, Nei, Kumar, 2007)

В зависимости от анализируемого гена группа"solani" с видами рода Dickeya имеет разное генетическое родство. Так, для генов icdA, mdh, mtID, pgi, pelD, группа "solani" является сестринской для одной или более групп вида D. dadantii. Для генов dnaX, апсА группа "solanC является сестринской для вида D. dianthicola. Эти данные свидетельствуют о том, что группа "solani могла появиться в результате горизонтального переноса части генов от штамма D. dianthicola к D. dadantii при совместном заражении картофеля. Наибольшее генетическое расстояние между группой "solani" и видами D. dianthicola и D. dadantii было найдено для фрагментов генов pelD (рис. 5), mdh (рис. 6) и dnaX, что указывает на эти гены, как на кандидаты для выбора молекулярного маркера группы "solani".

I- D.dianthicola D17

- D.dianthicola D1 -D.dianthicola D9b

- D.dianthicola D9L D.dianthicola D33(2)

- D.dianthicola D3b3

- D.dianthicola D3b2 D.dianthicola D3b1

- D.dianthicola D23-4

- D.dianthicola D23-3

- D.dianthicola D23-1

- D.dianthicola D8

- D.dianthicola D9

- D.dianthicola D33

- D.dianthicola D23-2

r 306526293 Dickeya dadantii 3937

- X17284.1 Erwlnia chrysanthemi

-AJ132101.1 Erwinla chrysanthemi(stral...

- D.solanl DFil

Рис. 5. Филогенетическое дерево для последовательностей 19 фрагментов гена реЮ

г5

Чггтг

евЪ ввП

гС

D. dJanthlcoJe D3b2

EF650805.1 D. dadantll Ech600

eQ081884.1 D. dfanthicola CFBP:1200

D. dlanthlcola D3b3

D. dlanthicola ОЗЫ

D. dlanthlcola D23-4

D. dlanthlcola D23-3

D. dlanthlcola D23-2

D. dlanthlcola D9b

D. dlanthlcola D9TR

D. dlanthlcola D1

D. dlanthlcola D33

D. dlanthlcola D9

D. dlanthicola D8

D. dlanthlcola D17

EF6507S8.1 D. dadantii Ech3937

CP002038.1 D. dadantll 3037

GQ891978.1 D. dadantll CFBP:3855

<3Q891979.1 D. dadantll CFBP:1289

GQ144380.1 Dickeya «p. ICMP Э2ЭО

GQ891981.1 D dleffienbachla» CFBP:2051

GQ891973.1 Dickeya ap. CITA A3

EF660766.1 Brenneria luplnlcola EluW3L16

EF5607e5.1 D. dadantll Ech721

EF550763.1 D. dadantll Ech646

GQ891975.1 DicKeya вр. СГГА QS

GQ891974.1 Dickeya ap. CITA Q4

D. solanl DFil

EF550774.1 D. dadantll Ech1591 CPOQ1Û56.1 D. zeae Ech159l GQ891972.1 Dickeya ep. CFBP 7086 EF550764.1 D. dadantll ЕСП678 GQ891980.1 Dickeya ap. CFBP 2048 EF650773.1 D. dadantii Ech0862 FJ895839.1 E. chrysantheml ATCC 11663 EF550762.1 D. dadantll Ech686 GQ144382.1 Dickeya sp. ICMP 4649 49609491 E. car. aubsp. atr. SCRI1043 HM114269.1 Pactobacterlum sp. IR-KA6 HM114271.1 Pactobacterlum sp. IR-S4

Рис. 6. Филогенетическое дерево для последовательностей 40 фрагментов гена тсИг

Штаммы Д <ИапМсо1а отличались высоким внутривидовым генетическим сходством не только для Российской популяции, но и для всех последовательностей, помещенных в Генбанк. Показатель эволюционного (генетического) расстояния для данного вида находился в пределах от 0 до 0,004.

Штаммы Д сШапШ имели внутривидовое генетическое расстояние от 0,002 до 0,100, соизмеримое с межвидовым расстоянием между Д <Иап№со1а и Д сккЛапШ. Эволюционные расстояния между этими двумя видами и группой "$о1ап1" находились в тех же пределах, подтверждая, таким образом, видовой статус данной группы.

Только некоторые последовательности изученных генов показали незначительное разнообразие среди штаммов D. dianthicola выделенных в России, с высоким сходством со штаммом Ech600 из батата, выделенным проф. Дикеем (Dickey) в США. Малое разнообразие среди штаммов этого вида позволяет сделать предположение о недавней интродукции патогена как клональной группы штаммов. Вероятнее всего, они распространялись с посадочным материалом картофеля без перехода на дополнительные растения-хозяева.

Малое значение коэффициента дифференциации для всех генов (от 0,197 до 0,300), кроме реЮ (0,901) и dnaX (0,528) указывает на то, что видовая структура данного рода недостаточно определена, и в пределах одного вида, могут быть штаммы, имеющие эволюционное расстояние сопоставимое с межвидовым.

ВЫВОДЫ

1. В результате бактериологического анализа образцов картофеля пораженных черной ножкой из различных регионов нами впервые в РФ обнаружены фитопатогены D. dianthicola и D. solani.

2. Результаты искусственного заражения показали, что D. dianthicola и D. solani поражают помимо известных видов растений-хозяев (картофель, гвоздика, томат, цикорий, артишок, георгина, каланхоэ) табак и ирис. Это указывает на целесообразность пространственной изоляции картофеля от указанных выше видов растений.

3. Испытание биохимических свойств штаммов D. dianthicola и D. solani не позволило выделить тесты, пригодные для видовой идентификации.

4. Разработанный ИФА - диагностикум позволяет выявлять бактерии D. dianthicola в клубневом экстракте. Нижний порог чувствительности варьировал в случае обычного варианта ИФА в пределах от 105 до 2х104 кл/мл, а для Био-ИФА - достигал 2x10° кл/мл.

5. Подобрана флуоресцентная проба для проведения количественной оценки присутствия в анализируемом образце бактерий рода Dickeya методом ПЦР в реальном времени.

6. Использование при пробоподготовке вещества пропидиум моноазид (РМА) позволяет определять методом ПЦР в реальном времени наличие в образце жизнеспособного возбудителя D. dianthicola, что в дальнейшем может быть использовано для повышения достоверности практической ДНК-диапюстики.

7. Анализ коллекции штаммов Dickeya по восьми различным генам, показал, что штаммы D. dianthicola имеют высокое генетическое сходство, как среди российской популяции, так и среди последовательностей размещенных в

Генбанке, что позволяет предположить преимущественное распространение патогена как гомогенной клональной группы с посадочным материалом картофеля.

8. Впервые были определены последовательности 7 генов для D. solani, которые могут быть использованы для разработки специфичных праймеров для ПЦР диагностики этого опасного вида бактерий.

9. Наибольшее генетическое расстояние между группами D. solani и

D. dianthicola, D. dadantii выявлено для генов pelD, mdh и dnaX что указывает на возможность использования их для разработки молекулярного маркера «Д solani».

10. Фитобактериомицин в концентрациях свыше 40 мг/л при культивировании in vitro достоверно снижал оптическую плотность бактериальной суспензии D. dianthicola по отношению к контролю, что позволяет рекомевдовать его для дальнейших вегетационных и полевых опытов с целью защиты картофеля от черной ножки, вызванной видами Dickeya.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для оценки реальной распространенности в России возбудителей черной ножки картофеля D. solani и D. dianthicola необходим широкий мониторинг, для чего рекомендуется использовать ИФА-диагностикумы, ПЦР в реальном времени и секвенирование генов pelD, mdh и dnaX.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Игнатов А.Н. Основные направления развития методов диагностики фитопатогенных микроорганизмов / Игнатов А.Н., Корнев К.П., Лунина Н.В., Мокрякова М.В., Мазурин Е.С., Карлов А.Н. // Доклады ТСХА, Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К. А. Тимирязева. Москва, 2009. Вып. 281. - С. 22-24.

2. Карлов А. Н. Dickeya dianthicola - новый для России бактериальный патоген картофеля / Карлов А.Н., Зотов B.C., Пехтерева Э.Ш., Матвеева Е.В., Джалилов Ф.С., Фесенко И.А., Карлов Г. И., Игнатов А.Н. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2010. Вып. 3.-С.134-141.

3. Карлов А.Н. Диагностика бактериального патогена картофеля Dickeya dianthicola / Карлов А.Н., Игнатов А.Н., Карлов Г.И., Пехтерева Э.Ш., Матвеева

E.В., Шаад Н .В., Варицев Ю .А., Джалилов Ф .С. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2011. Вып. 3.-С.38-48.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х841/1б. Усл.печ.л. 1,16 Тираж 100 экз. Заказ 538.

Издательство РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул, Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карлов, Александр Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические свойства возбудителя и особенности патогенеза.

1.2. Распространенность и вредоносность.

1.3. Методы диагностики.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА III. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧЕРНОЙ НОЖКИ ИЗ РОДА DICKEYA.

3.1. Выделение из пораженного картофеля и идентификация изолятов Dickey a spp. методом ПЦР со специфичными праймерами.

3.2. Биохимические свойства штаммов Dickeya spp.

3.3. Определение круга растений - хозяев D. dianthicola и D. solani.

3.4. Оценка антибактериального действия фитобактериомицина по отношению к бактериям рода Dickeya.

ГЛАВА IV. ДИАГНОСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕРНОЙ НОЖКИ DICKEYA SPP. СЕРОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ.

4.1 Получение иммуноглобулинов гомологичных бактериальным штаммам D. dianthicola и создание на их основе ИФА -диагностикума.

4.2 Усовершенствование метода иммуноферментного анализа для диагностики клубневой инфекции Dickeya spp.

ГЛАВА V. ДИАГНОСТИКА D. DIANTHICOLA МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.

5.1 Подбор праймеров и пробы, оптимизация условий проведения реакции.

5.2 Изучение возможности повышения достоверности диагностики Dickeya dianthicola.

ГЛАВА VI. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ВИДОВ И

ШТАММОВ DICKEYA.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Диагностика черной ножки картофеля, вызываемой бактериями рода Dickeya и генетический полиморфизм штаммов возбудителей"

Картофель выращивают в 130 странах, где проживает 75% населения планеты. Это пятый по значению после пшеницы, кукурузы, риса и ячменя источник калорий в рационе современного человека. В мире 50% производимого картофеля идет в пищу, 35% - на корм скоту и около 10% оставляется как посадочный материал. В настоящее время в мире производится более 325 миллионов тонн картофеля в год, большая часть производства приходится на страны Европы и Азии (около 80% мирового производства картофеля) (van der Zaag, Horton, 1983).

Россия по валовому сбору и производству картофеля занимает одно из ведущих мест в мире. Ее доля в мировом производстве этой культуры по посевным площадям и валовому сбору составляет 10%. Культура картофеля требует высокого уровня затрат ресурсов и энергии для ее производства. Урожайность картофеля в России равна 14 т/г, однако она значительно ниже даже среднего мирового уровня составляющего 17 т/г. Среднегодовая емкость Российского рынка картофеля составляет 29-31 млн. т. Потребление его внутри страны включает использование 15-16 млн. т на продовольствие в свежем виде, 6,0 - 6,5 - на кормовые цели, 6,0 - 6,5 - на семена и 0,5 - 1,0 млн. т - на переработку. Экспорт картофеля оценивается на уровне 100 тыс. т. в год, а импорт 400 - 500 тыс. т. (более 1,5 % его валового производства) (Симаков и др., 2010).

Так как Россия импортирует немалое количество картофеля, в том числе и семенного, возникает опасность распространения с посадочным материалом возбудителей различных болезней. Прежде всего, это те болезни, возбудитель которых сохраняется непосредственно в семенах и в последующем является главным источником инфекции. В нашей стране эта опасность, также может увеличиться в связи с предстоящим вступлением в ВТО и как следствие увеличением потока посадочного материала, произведенного в других странах зачастую с более сложной, чем в России фитосанитарной обстановкой.

Среди болезней картофеля, важное место принадлежит бактериозам, которые распространены повсеместно и уносят от 10 до 25 % урожая, а в некоторых районах страны во влажные годы потери урожая могут достигать 50 % (Катаева, 1972). К числу наиболее распространенных и вредоносных бактериальных болезней картофеля относится черная ножка. Это заболевание вызывают близкородственные виды пектолитических бактерий из семейства ЕМегоЪа&еНасеае\ Рес1оЬас1егшт (ЕгмШа) МгозерИсит, Р. саго^огит яиЬяр. сагоЮуогит и Егмгта скгуяапЖетг, которые вызывают симптомы на растениях в период вегетации и на клубнях при хранении. Однако, вид Е. сЬгу8ап1кет1, сравнительно недавно по ряду признаков был выделен в новый род, который назвали Ожкеуа. Впервые Е. скгуБапЖетг (Июкеуа Брр.,) была обнаружена в 1970-х годах прошлого века на декоративных растениях хризантемы. При дальнейшем изучении было показано, что бактерия поражает широкий круг растений, включая картофель.

Начиная с 2004 года, этот патоген стал встречаться очень часто на картофеле в Западной Европе, причиняя значительные экономические потери. Кроме того, все чаще появляются сведения об обнаружении нового, более агрессивного вида £>. Бо1ат (Тбгог е1 а1., 2008, 81а\у1ак е! а1., 2009). В Голландии в 2007 году экономический ущерб от этого заболевания составил 25 млн евро. Учитывая эту большую потенциальную опасность страны Европейского Союза, включили Игсквуа эрр. в Список карантинных для Европы организмов. Многие страны закрыли свой рынок для картофеля, не имеющего сертификата на отсутствие Игскеуа.

Очевидно, что патоген перемещается из страны в страну с посадочным материалом. Возбудитель болезни на клубнях чаще всего находится в латентной форме. Поэтому, большое значение для борьбы с этим новым заболеванием имеет тестирование на зараженность посадочного материала.

Достоверная диагностика является важным условием для предотвращения развития заболевания. Наиболее перспективным является использование современных серологических и молекулярно - генетических методов, таких как ИФА (иммуноферментный анализ) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Необходимым условием для практического использования молекулярно-генетических методов диагностики является изучение генетического полиморфизма видов и штаммов Dickeya.

К началу выполнения настоящей работы отсутствовали сведения о присутствии и распространении Dickeya на картофеле в Российской Федерации.

Целью нашей работы являлось усовершенствование методов диагностики возбудителя черной ножки картофеля из рода Dickeya и изучение генетического полиморфизма российской коллекции штаммов патогена.

Для достижения этой цели планировалось решение следующих задач:

1. Выделение возбудителей черной ножки картофеля из рода Dickeya, создание коллекции штаммов, изучение их биохимических свойств и круга растений-хозяев.

2. Усовершенствование диагностики Dickeya spp. методами ИФА, ПЦР и ПЦР в реальном времени.

3. Изучение генетического полиморфизма коллекции штаммов Dickeya, выделенных из картофеля в России.

Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Карлов, Александр Николаевич

выводы

1. В результате бактериологического анализа образцов картофеля пораженных черной ножкой из различных регионов нами впервые в РФ обнаружены фитопатогены D. dianthicola и D. solani.

2. Результаты искусственного заражения показали, что D. dianthicola и D. solani поражают помимо известных видов растений-хозяев (картофель, гвоздика, томат, цикорий, артишок, георгина, каланхоэ) табак и ирис. Это указывает на целесообразность пространственной изоляции картофеля от указанных выше видов растений.

3. Испытание биохимических свойств штаммов D. dianthicola и D. solani не позволило выделить тесты, пригодные для видовой идентификации.

4. Разработанный ИФА - диагностикум позволяет выявлять бактерии D. dianthicola в клубневом экстракте. Нижний порог чувствительности варьировал в случае обычного варианта ИФА в пределах от 105 до 2x104 кл/мл, а для Био-ИФА - достигал 2x10° кл/мл.

5. Подобрана флуоресцентная проба для проведения количественной оценки присутствия в анализируемом образце бактерий рода Dickey а методом ПЦР в реальном времени.

6. Использование при пробоподготовке вещества пропидиум моноазид (РМА) позволяет определять методом ПЦР в реальном времени наличие в образце жизнеспособного возбудителя D. dianthicola, что в дальнейшем может быть использовано для повышения достоверности практической ДНК-диагностики.

7. Анализ коллекции штаммов Dickey а по восьми различным генам, показал, что штаммы D. dianthicola имеют высокое генетическое сходство, как среди российской популяции, так и среди последовательностей размещенных в Генбанке, что позволяет предположить преимущественное распространение патогена как гомогенной клональной группы с посадочным материалом картофеля.

8. Впервые были определены последовательности 7 генов для D. solani, которые могут быть использованы для разработки специфичных праймеров для ПЦР диагностики этого опасного вида бактерий.

9. Наибольшее генетическое расстояние между группами D. solani и D. dianthicola, D. dadantii выявлено для генов pelD, mdh и dnaX что указывает на возможность использования их для разработки молекулярного маркера «D. solani».

10. Фитобактериомицин в концентрациях свыше 40 мг/л при культивировании in vitro достоверно снижал оптическую плотность бактериальной суспензии D. dianthicola по отношению к контролю, что позволяет рекомендовать его для дальнейших вегетационных и полевых опытов с целью защиты картофеля от черной ножки, вызванной видами Dickeya.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для оценки реальной распространенности в России возбудителей черной ножки картофеля D. solani и D. dianthicola необходим широкий мониторинг, для чего рекомендуется использовать ИФА-диагностикумы, ПЦР в реальном времени и секвенирование генов pelD, mdh и dnaX.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Карлов, Александр Николаевич, Москва

1. Бушкова JI.H. Лазарев A.M. Применение ФБМ в борьбе с черной ножкой картофеля // Биологический метод защиты растений. 1984. -С. 125-126.

2. Воробьева Н. В. Иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез. М.: Научный мир. - 2006. - 80с.

3. Джалилов Ф.С. Методы изучения бактериальных болезней растений (Методические указания для научно-исследовательской работы студентов). М.: МСХА. 1989. 26 с.

4. Катаева М. М. Устойчивость сортов и сеянцев картофеля к бактериальным болезням // Сб. научн. работ НИИСХ ЦЧП. 1972. -Т.5.-С. 155 - 157.

5. Лазарев A.M. Базлеева Т.В. Черная ножка картофеля // Бактер.болезни картофеля и овощных культур и методы борьбы с ними. М., 1994. - С. 5-16.

6. Лазарев A.M. Биологические особенности возбудителя черной ножки картофеля в Северо-Западной зоне РСФСР и методы его диагностики // Автореф. дис. канд. биол. наук / ВИЗР, Л., 1985. - 18 с.

7. Матвеева Е.В., Игнатов А.Н. Бактериозы картофеля // В сборнике: Интегрированная система защиты картофеля от фитофтороза, грибных, вирусных и бактериальных болезней. Москва, 2007, -с. 16-27.

8. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир, 1984. - 264 е., ил.

9. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семёнов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР "в реальном времени". М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - С. 223.

10. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Филиппова Г.И. Стратегия развития селекции и семеноводства картофеля на период до 2020 года // Картофель и овощи. 2010. - №8. - с. 2 - 4.

11. Alan Е., Kelman A. Immunofluorescent stain procedures for detection and identification of Erwinia carotovora var. atroseptica. // Phytopathol., 1977, 67, 1305-1312.

12. Anilkumar T.B., Chakravarti B.P., Factors affecting survival of Erwinia carotovora, causal organism of stalk rot of maize in soil // Acta Phytopathologica Academiae Scientiarum Hungaricae 1970. 5. 333-40.

13. Bain R.A., Perombelon M.C.M., Tsror L., Nachmias A., Blackleg development and tuber yield in relation to numbers of Erwinia carotovora subsp. atroseptica on seed potatoes // Plant Pathology 1990. 39, 125-33.

14. Barras F., Van Gijsegem F., Chatterjee A.K., Extracellular enzymes andpathogenesis of soft rot Erwinia II Annual Review of Phytopathology -1994. 32, 201-34.

15. Bdliya B.S., Langerfeld E., A semi-selective medium for detection, isolation and enumeration of Erwinia carotovora ssp. carotovora from plant materials and soil // Tropical Science. 2005. 45, 90-96.

16. Bradbury J.F., Guide to Plant Pathogenic Bacteria // Wallingford, UK: CAB International. 1986.

17. Cahill G., Fraser K., Kowalewska M.J., Kenyon D.M., Saddler G.S., Recent findings from the Dickey a survey and monitoring programme // In: Proceedings Crop Protection in Northern Britain 2010, Dundee, UK, 171-6.

18. Charkowsky A., The soft rot Erwinia II In. Plant-Associated Bacteria. -2006. 423-505.

19. Cother E.J., Bacterial seed tuber decay in irrigated sandy soils of New South Wales // Potato Research. 1980. 23, 75-84.

20. Cuppels D., Kelman A., Evaluation of selective media for isolation of soft-rot bacteria from soil and plant tissue // Phytopathology. 1974. 64, 46875.

21. Czajkowski, R., de Boer W. J., Velvis H., van der Wolf J. M. Systemic colonization of potato plants by a soilborne, green fluorescent protein-tagged strain of Dickeya sp. biovar 3 // Phytopathology. 2010. 100:134-142.

22. Czajkowski R., van Veen J.A., van der Wolf J.M. New biovar 3 Dickeya spp. strain (syn. Erwinia chrysanthemi) as a causative agent of blackleg in seed potato in Europe // Phytopathology. 2009b. 99, S27.

23. Darrasse A., Priou S., Kotoujansky A., Bertheau Y. PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gene as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases // Appl. Environ.Microbioology, 1994. V.60.P. 1437- 1443.

24. De Boer S.H., Mc Naughton M.E. Monoclonal antibodies to the lipopolisacharide of Eca serogroup I. // Phytopathology 1987.V.77. P. 828 -832.

25. De Lindo L., French E.R. Erwinia species attacking potato in the humid tropics of Peru // Fitopatología. 1981. 16, 69-74.

26. De Lindo L., French E.R., Kelman A. Erwinia spp. pathogenic to potatoes in Peru // American Potato Journal. 1978. 55, 383.

27. Dickey R.S. Erwinia chrysanthemi: a comparative study of phenotypic properties of strains from several hosts and other Erwinia species // Phytopathology. 1979. 69, 324-9.

28. Dickey R.S. Erwinia chrysanthemi: reaction of eight plants to strains from several hosts and to strains of other Erwinia species. // Phytopathology -1981. 71,23-29.

29. Dickey R.S., Victoria J.I. Taxonomy and emended description of strains of Erwinia isolated from Musa paradisiaca Linnaeus. // International Journal of Systematic Bacteriology 1980. 30, 129-134.

30. Duarte V., De Boer S.H., Ward L.J., Oliveira A.M.R. Characterisation of atypical Erwinia carotovora strains causing blackleg of potato in Brazil. // Journal of Applied Microbiology 2004. 96: 535-545.

31. Dye D.W. A taxonomic study of the genus Erwinia . II. The "carotovora" group // New Zealand Journal of Science. 1969. 12, 81-97.

32. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap II Evolution. 1985. 39:783-791.

33. Fre.chon D., Exbrayat P., Helias V. et al. Evaluation of a PCR kit for the detection of Erwinia carotovora subsp. atroseptica on potato tubers // Potato Research. 1998. 41, 163-73.

34. Fuqua C., Parsek M.R., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cellto- cell communication: acyl homoserine lactone quorum sensing // Annual Review of Genetics. 2001. 35, 439-68.

35. Garibaldi A. Research on carnation bacterial wilt diseases. IV. Survival in soil of Erwinia chrysanthemi, agent of slow wilt // In: Actas do III Congresso da Uniao Fitopatologica Mediterranea, Oerias, Portugal. 1972. 29-32.

36. Graham D. Reinfection by Erwinia carotovora (Jones) Bergey et al. in potato stocks derived from stem cuttings // EPPO Bulletin. 1976. 6, 2435.

37. Harrison M.D., Franc G.D., Maddox D.A., Michaud J.E., Mccarter-Zorner N.J. Presence of Erwinia carotovora in surface water in North America // Journal of Applied Microbiology. 1987. 62, 565-70.

38. Hauben L., Moore E.R.B., Vauterin L, et al. Phylogenetic position of phytopathogens within the Enterobacteriaceae // Systematic and Applied Microbiology. 1998. 21, 384-97.

39. Haygood R.A., Strider D.L., Echandi E. Survival of Erwinia chrysanthemi in association with Philodendron selloum, other greenhouse ornamentals, and in potting media // Phytopathology. 1982. 72, 853-9.

40. Hugh R., Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various Gram-negative bacteria. // Journal of Bacteriology 1953. 66: 24-26.

41. Hyman L.J., Sullivan L., Toth I.K., Pe.rombelon M.C.M. Modified crystal violet pectate medium (CVP) based on a new polypectate source (Slendid) for the detection and isolation of soft rot erwinias // Potato Research. 2001. 44, 265-70.

42. Janse J.D., Ruissen M.A. Characterization and classification of Erwinia chrysanthemi strains from several hosts in the Netherlands // Phytopathology. 1988. 78, 800-8.

43. Janse J.D., Spit B.E. A note on the limitations of identifying soft rot erwinias by temperature tolerances and sensitivity to erythromycin on a pectate medium // Journal of Phytopathology. 1989. 125, 265-8.

44. Kwon S.W., Go S.J., Kang H.W., Ryu J.C., Jo J.K. Phylogenetic analysis of erwinia species based on 16S rRNA gene sequences. // International Journal of Systematic Bacteriology- 1997. 47: 1061-1067.

45. Laboratory guide for identification of plant-pathogenic bacteria /Schaad N.W., Jones J.B., Chun W. eds. 3rd ed. American Phytopathological Society Press. St. Paul. Mn., 2001.

46. Laurila J., Ahola V., Lehtinen A. et al. Characterisation of Dickeya strains isolated from potato and river water samples in Finland // European Journal of Plant Pathology. 2008. 122, 213-25.

47. Laurila J., Hannukkala A., Nykyri J. et al. Symptoms and yield reduction caused by Dickeya spp. strains isolated from potato and river water in Finland // European Journal of Plant Pathology. 2010. 126, 249-62.

48. Lee Y-A, Chen K-P, Chang Y-C. First report of bacterial soft rot of white flowered calla lily caused by Erwinia chrysanthemi in Taiwan // Plant Disease. 2002. 86, 1273.

49. Lee Y-A, Yu C-P. A differential medium for the isolation and rapid identification of a plant soft rot pathogen, Erwinia chrysanthemi // Journal of Microbiological Methods. 2006. 64, 200- 6.

50. Lelliott R.A. Slow wilt of carnation caused by a species of Erwinia. II Plant Pathology- 1956. 5,9-23.

51. Lelliott R.A., Stead D.E. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. In: Preece TF, ed. Methods in Plant Pathology Volume 2 // Oxford, UK: Blackwell. 1987. 215 pp.

52. LimW.H., The survival of Erwinia chrysanthemi in peat and mineral soil // Mardi Research Bulletin. 1975. 3. 20-23.

53. Lumb V.M., Pe.rombelon M.C.M., Zutra D. Studies of a wilt disease of the potato plant in Israel caused by Erwinia chrysanthemi // Plant Pathology. -1986. 35, 196-202.

54. Maas Geesteranus H.P. Natrot en zwartbenigheid bij aardappelen // Bedrijfsontwikkeling. 1972. 3, 941-5.

55. Maki-Valkama T., Karjalainen R. Differentiation of Erwinia carotovora subsp. atroseptica and carotovora by RAPD-PCR. // Annals of Applied Biology 1994. 125: 301-309.

56. Mc Carter-Zorner N.J., Franc G., Harrison M., et al. Soft rot Erwinia bacteria in surface and underground waters in southern Scotland and in Colorado, United States // Journal of Applied Microbiology. 1984. 57, 95105.

57. Nakane P.K. New developments in tissue enzyme-labeled immunoassays // Immunoassays: clinical laboratory techniques for the 1980s, Alan R., Liss Inc., New York, 157-169.

58. Ngadze E., Coutinho T.A., van derWaals J.E., First report of soft rot potatoes caused by Dickeya dadantii in Zimbabwe // Plant Disease. 2010. 94, 1263.

59. Nocker, A., Cheung, C.Y., Camper, A.K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells // Journal of Microbiological Methods. 2006. 67, 310-320.

60. Nocker A., Sossa K.E., Camper, A.K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR // Journal of Microbiological Methods. 2007. 70, 252-260.

61. Norman D.J., Yuen J.M.F, Resendiz R., Boswell J., Characterization of Erwinia populations from nursery retention ponds and lakes infecting ornamental plants in Florida // Plant Disease. 2003. 87, 193-6.

62. Palacio-Bielsa A., Cambra M.A., Lopez M.M. Characterisation of potato isolates of Dickeya chrysanthemi in Spain by a microtitre system for biovar determination // Annals of Applied Biology. 2006. 148, 157-64.

63. Palacio-Bielsa A., Mosquera M.E.R., Alvarez M.A.C., Rodriguez I.M.B., Lopez-Solanilla E., Rodriguez-Palenzuela P. Phenotypic diversity, hostrange and molecular phylogeny of Dickeya isolates from Spain. Eur. J. // Plant Pathology. 2010. 127:311-324

64. Parkinson N., Stead D., Bew J., Heeney J., Tsror L., Elphinstone J. Dickeya species relatedness and clade structure determined by comparison of recA sequences // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2009. 59, 2388-93.

65. Perombelon M.C.M. A semi-selective medium for estimating population densities of pectolytic Erwinia spp. In soil and in plant material. // Potato Research 1971. 14: 158-160.

66. Perombelon M.C.M. Factors affecting the accuracy of the tuber incubation test for the detection of contamination of potato stocks by Erwinia carotovora II PotatoResearch. 1979. 22, 63-8.

67. Perombelon M.C.M., Hyman L.J. A rapid method for identifying and quantifying soft rot erwinias directly from plant material based on their temperature tolerance and sensitivity toerythromycin // Journal of Applied Bacteriology. 1986. 60, 61-6.

68. Perombelon M.C.M., Kelman A. Blackleg and other potato diseases caused by soft rot erwinias: proposal for revision of terminology. // Plant Disease -1987. 71,283-285.

69. Perombelon M.C.M., Kelman A. Ecology of the soft rot Erwinias II AnnualReview of Phytopathology. 1980. 18, 361-87.

70. Perombelon M.C.M., Lumb V.M. Hyman L.J., A rapid method to identify and quantify soft rot erwinias on seed potato tubers. // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 1987. 17, 25-36.

71. Perombelon M.C.M. Potato blackleg: Epidemiology, host-pathogen interaction and control // Netherlands Journal of Plant Pathology. 1992. 98, 135-46.

72. Perombelon MCM, Salmond G, P, C, eds. Bacterial soft rots. 1995.

73. Perombelon M.C.M. The extent and survival of contamination of potato stocks in Scotland by Erwinia carotovora var. carotovora and Erwinia carotovora var atroseptica. II Annals of Applied Biology 1972. 71: 111117.

74. Perombelon M.C.M. The role of the seed tuber in the contamination by Erwinia carotovora of potato crops in Scotland // Potato Research. 1974. 17, 187-99

75. Perombelon M.C.M., M. L.V., Zutra D., Hyman L.J., Burnett E.M. Factors affecting potato blackelg development. Cape Sounion, Greece: Spriner-Verlag, Berlin. 1989.

76. Persson P., Janse J.D. Ring rot-like symptoms in Solanum melongena caused by Erwinia chrysanthemi (potato strain) after artificial inoculation. // •Bulletin OEPP/EPPOBulletin- 1988. 18, 575-578.

77. Persson P., Sletten A. Fatty acids analysis for the identification of Erwinia carotovora subsp. atroseptica and Erwinia carotovora subsp. carotovora. II Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 1995. 25: 151-156.

78. Prins H., Breukers A. In de Puree De Gevolgen van Aantasting door Erwinia voor de Pootaardappelsector in Kaart Gebracht. DenHaag, theNetherlands: LEI. 2008.

79. Rademaker J.L.W., de Bruijn F.J. Characterization and classification of microbes by rep-PCR genomic fingerprinting and computer-assisted pattern analysis. // Applied and Environmental Microbiology 1999. 64: 20962104.

80. Rangarajan M., Chakravarti B.P. Studies on the survival of corn stalk rot bacteria // Plant and Soil. 1970. 33, 140-4.

81. Roozen N.J.M. Besmetting van Erwinia-vrij Pootgoed Vanuit Divese Bronnen. Een Literatuuroverzicht. Lelystad, the Netherlands: PAGV. -1990.

82. Saitou N. & Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. -1987. 4:406-425.

83. Samson R., Nassan-Agha N. Biovars and serovars among 129 strains of Erwinia chrysanthemi. In: Ride. M, ed. Proceedings of the 4th International Conference on Plant- Pathogenic Bacteria // Angers, France: INRA. 1978. 547-53.

84. Samson R., Ngwira N., Rivera N. Biochemical and serological diversity of Erwinia chrysanthemi. In: Klement Z, ed. // Proceedings of the Seventh International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Budapest, Hungary. 1990. 895-900.

85. Samson R., Poutier F., Sailly M., Jouan B. Caracterisation des Erwinia chrysanthemi isolees de Solanum tuberosum et d'autres plantes-ho'tes selon les biovars et se.rogroupes. EPPO Bulletin. 1987. 17, 11-6.

86. Plant Pathology 2003. 52: 140-146.

87. Singh U., Trevors C.M., Boer S.H., de Janse J.D. Fimbrialspecificj monoclonal antibody-based ELISA for European potato strains of Erwiniachrysanthemi and comparison to PCR // Plant Disease. 2000. 84, 443-8.

88. Slawiak M., Lojkowska E., van derWolf J.M. First report of bacterial soft rot on potato caused by Dickeya sp. (syn. Erwinia chrysanthemi) in Poland // Plant Pathology. 2009a. 58, 794.i

89. Sledz W., Jafra S., Waleron M., Lojkowska E. Genetic diversity of Erwiniaj carotovora strains isolated from infected plants grown in Poland. // Bulletin1.i

90. OEPP/EPPO Bulletin 2000. 30: 403-407.

91. Smith C., Bartz J.A. Variation in the pathogenicity and aggressiveness of j strains of Erwinia carotovora subsp. carotovora isolated from differenthosts. // Plant Disease 1990. 74: 505-509.

92. Smid E.J., Jansen A.H.J., Gorris L.G.M. Detection of Erwinia carotovora ; subsp. atroseptica and Erwinia chrysanthemi in potato tubers using ! polymerase chain reaction // Plant Pathology. 1995. 44, 1058-69.

93. Sneath P. H. A. & Sokal R. R. Numerical Taxonomy: the Principles of1 ! f

94. Numerical Classification. San Francisco: Freeman. 1973.

95. Tamura K., Dudley J., Nei M. & Kumar S., MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. 10.1093 - 092.

96. Tamura K, Nei M. & Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. PNAS. 2004. 101:11030-11035.

97. Thomson S. V., Hildebrand D. C. & Schroth M. N. Identification and nutritional differentiation of the Erwinia sugar beet pathogen from members of Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi. // Phytopathology 1981. 71, 1037-1042.

98. Toth I.K., Bell K.S., Holeva M.C., Birch P.R.J. Soft rot erwiniae: from genes to genomes // Molecular Plant Pathology. 2003. 4, 17-30.

99. Toth I.K., Van Der Wolf J.M, Saddler G., Lojkowska E, Helias V., Pirhonenx M., Tsror L., Elphinstone J.G. Dickeya species: an emerging problem for potato production in Europe // Plant Pathology. 2011. 60, 385-99.

100. Tsror L., Aharon M., Erlich O. Survey of bacterial and fungal seedborne diseases in imported and domestic potato seed tubers // Phytoparasitica 27 // 1999.215-26.

101. Tsror L., Nachimias A., Livescu L., Perombelon M.C.M., Barak Z. Erwinia carotovora subsp. atroseptica infection promotes verticullium wilt development in potato in Israel // Potato Research. 1990. 33, 3-11.

102. Underberg H. Ecological Model Studies on the Colonization Patterns and Population Dynamics of Erwinia chrysanthemi in the Rhizosphere of Potato // Tu.bingen, Germany: Universita.t Tu.bingen, Dissertation. 1992.

103. Van Der Wolf J.M., De Boer S.H. Bacterial pathogens of potato. Elsevier. -2007.

104. Van Vuurde J.W.L., de Vries P.M. Detectie van Pathogene Erwinia spp. van Aardappel in Oppervlaktewater in de Periode 1988-1991.Wageningen,

105. Netherlands: IPO-DLO, IPO-DLO report no. 92-01. 1992.

106. Research, Agrifood Research Working Papers no. 142, 30. 2007.

107. Van Vuurde J.W.L., De Vries P.M. Population dynamics of Erwiniaj carotovora subsp. atroseptica on the surface of intact and wounded seedfi1 potatoes during storage // Journal of Applied Microbiology. 1994. 76, 56875.

108. Van Der Zaag D., Horton D., Potato production and utilization in world perspective with special reference to the tropics and sub-tropics // Potato Research. 1983. 26, 323-62.

109. Velvis H., Van Der Wolf J. Bacterievrije pootgoedteelt, een uitdaging -eindrapportage 2005 2008. In.: HZPC, PRI. - 2009.

110. Verdonck L., Mergaert J., Rijckaert C., Swings J., Kersters K. & De Ley J. Genus Erwinia: numerical analysis of phenotypic features. // Int J Systj Bacteriol- 1987. 37,4-18.5

111. Waldee E. L. Comparative studies of some peritrichous phytopathogenic1. ,i bacteria. // Iowa State J Sei 1945. 19, 435-484i 137. Waleron M.,Waleron K., Lojkowska E., Genotypic characterisation of the

112. Erwinia genus by PCR-RFLP analysis of rpoS gene // Plant Protection; Science. 2002b. 38, 288-90.t.

113. Waleron M., Waleron K., Podhajska A.J., Lojkowska E. Genotyping of bacteria belonging to the former Erwinia genus by PCR-RFLP analysis of a recA gene fragment // Microbiology. 2002a. 148, 583-95.

114. Yahiaoui R., Jouan B., Andrivon D. Biochemical and molecular diversity among Erwinia isolates from potato in Algeria. // Plant Pathology 2003. 52: 28-40.

115. Yakrus M. & Schaad N. W. Serological relationships among strains of Erwinia chrysanthemi. // Phytopathology 1979. 69, 517-522.