Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Паспортизация сортов люпина методами ISSR-PCR и RAPD-PCR для биотехнологических исследований

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Паспортизация сортов люпина методами ISSR-PCR и RAPD-PCR для биотехнологических исследований"

Артюхова Анастасия Валентиновна

ПАСПОРТИЗАЦИЯ СОРТОВ ЛЮПИНА МЕТОДАМИ КвИ-РСЛ и ИАРВ-РСЙ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2011 3 1 (.'.'.? ¿0

4841873

Работа выполнена в Инновационном научно-образовательном центре биотехнологии и экологии ГОУ ВПО «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского»

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Нам Ирина Ян Гуковна

Доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

Доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Центральных районов Нечерноземной зоны (Московская область, пос. Немчиновка)

Защита состоится «15» апреля 2011г. в 14.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 69. Тел./факс (3472) 35-53-62. E-mail: ib@anrb.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайте Института биологии Уфимского научного центра http://ib.anrb.ru/sovet.html

.г

Автореферат разослан » марта 2011 г. Ученый секретарь

Объединенного диссертационного совета к.б.н., доцент

Уразгильдин Р.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последние десятилетия биотехнологические методы широко используются для проведения исследований в смежных областях науки, в частности, в селекции растений, растениеводстве и семеноводстве (Шевелуха, 2008; Харченко, Глазко, 2009). При этом особое значение имеет разработка современных методов на основе полимеразно-цепной реакции, поскольку метод ПЦР имеет высокую чувствительность, точность и воспроизводимость результатов, скорость и производительность анализа, достаточно прост в исполнении и не требует сложного дорогостоящего оборудования (Сулимова, 2004; Карлов, 2009). ПЦР широко используется в медицине для экспресс-диагностики инфекционных и генетических заболеваний, в исследованиях по филогенетическому анализу разных таксонов животных и растений (Кочиева, 2004; Лукашов, 2009), в генетике и селекции для определения генетического родства сортов разных видов растений (Зайцев, 2001; Нам, 2004), является неотъемлемой частью работ по генетической инженерии (Голденкова, 2003).

Большое значение для современных биотехнологических исследований, а также селекции хозяйственно-ценных культур и семеноводства имеет разработка методов паспортизации сортов растений на основе молекулярных маркеров. Предложенный ранее для анализа генотипов и сортов разных культур метод белковых маркеров (Созинов, 1985; Конарев, 1993) может быть сопряжен с недостаточным полиморфизмом белков, в частности, альбуминов или тлобулинов. Для сортовой идентификации некоторых видов растений, в том числе для люпина, метод белковых маркеров оказался непригоден из-за низкого уровня межсортового разнообразия.

Люпин является важной кормовой и сидеральной культурой, характеризуется высоким качеством запасных белков. Для ускорения создания высокопродуктивных и устойчивых сортов люпина актуальн

разработка биотехнологических методов для анализа растений на основе ДНК-маркеров и паспортизации сортов и гибридов.

Применение ДНК-маркеров на основе полимеразно-цепной реакции (ISSR-PCR, RAPD-PCR, AFLP, MFLP) позволило расширить возможности для разработки методов молекулярного маркирования с целью паспортизации сортов различных сельскохозяйственных культур. В частности были разработаны молекулярные маркеры хозяйственно-ценных признаков люпина узколистного (Yang, 2004,2008) и способ идентификации ряда австралийских сортов узколистного люпина (Yuan, 2005). В России подобные исследования на люпине разных видов не проводились.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка метода паспортизации сортов люпина разных видов на основе методов ISSR-PCR и RAPD-PCR.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1) выбор метода выделения ДНК из образцов люпина;

2) подбор оптимальных условий проведения ISSR-PCR и RAPD-PCR на ДНК люпина;

3) подбор праймеров, обеспечивающих достаточный полиморфизм и стабильную амплификацию полиморфных фрагментов люпина;

4) изучение генетического полиморфизма сортов, сортообразцов и гибридных форм люпина;

5) составление генетических паспортов сортов люпина узколистного, желтого и белого;

6) изучение генетического сходства сортов и сортообразцов люпина узколистного;

7) разработка схем дихотомического ключа для идентификации сортов люпина по генетическим паспортам.

Научная новизна и значимость работы. Впервые разработан метод паспортизации сортов люпина трех видов на основе ISSR-PCR. Метод

паспортизации сортов люпина включает протокол выделения ДНК, набор праймеров и условия проведения ^Я-РСИ. Составлены паспорта сортов трех видов люпина, возделываемых в России, установлено генетическое сходство сортов. Установлены уровни внутривидового разнообразия, степень генетической дифференциации сортов.

Практическая ценность исследований. Полученные в данной работе паспорта сортов люпина белого, желтого и узколистного будут использованы в селекции, а также для поиска маркеров хозяйственно-ценных признаков при разработке биотехнологических подходов для создания высокопродуктивных сортов этого ценного растения. Составленные паспорта могут бьггь использованы при передаче сортов в Госкомиссию и для контроля чистоты посевного материала.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод паспортизации сортов трех видов люпина.

2. Паспорта сортов люпина узколистного, желтого и белого.

3. Дихотомический ключ идентификации сортов люпина.

4. Генетическое сходство сортов люпина узколистного.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции молодых ученых «Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениеводстве» (Брянск, 2009), международной конференции молодых ученых «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные аспекты в биотехнологии» (Брянск, 2010), III Всероссийском с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2010» (Нижний Новгород, 2010), международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Ялта, 2010), VI международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, одна из них в издании, рекомендованном ВАК.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав - обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, и выводов. Список литературы включает 141 источник, в том числе 43 публикации отечественных авторов и 98 публикаций иностранных авторов. Диссертационная работа изложена на 144 страницах, из которых 104 страницы основного текста и 40 страниц приложений, содержит 18 рисунков и 12 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы н методы

Исследования проводили в Инновационном научно-образовательном центре биотехнологии и экологии Брянского государственного университета имена академика И.Г. Петровского в период с 2008 по 2010 гг. Анализировали семена сортов и форм люпина трех видов: белого (Lupinus albus L.), желтого (L. luteus L.), узколистного (L. cmgustifolius L.). Образцы для анализа были предоставлены сотрудниками ВНИИ люпина (пос. Мичуринский, Брянская область) и Научно-практического центра HAH Беларуси по земледелию (г. Жодино, Минская область).

1.1. Растительный материал. В работе использованы образцы люпина узколистного: 39 сортов российской, польской, белорусской и австралийской селекции, 6 гибридных, 5 диких форм и 7 образцов биологического банка генов из Белоруссии; 8 сортов люпина желтого и 6 сортов люпина белого.

1.2. Выделение ДНК. Выделение ДНК проводили из сухих семян или гипокотилей шестидневных проростков. Использовали навеску ДНК массой 200 и 400 мг соответственно. Выделение проводили фенол-хлороформенным методом с небольшими изменениями (Chomczynski, 1987) или методом СТАВ

(Генная инженерия растений, 1991). Качество и количество полученных препаратов ДНК определялось спекгрофотометрическим методом (Епринцев, 2008).

1.3. Проведение PCR. PCR проводили в четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для ISSR-PCR и RAPD-PCR использовали праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Россия), ферменты и реактивы, поставляемые фирмой «СибЭнзим» (Россия).

Температуру отжига праймеров вычисляли с помощью программы VectorNTI (Invitrogen).

Реакционная смесь для ISSR-PCR объемом 20 мкл содержала следующие компоненты: 2 ед. 7од-полимеразы Е338, 2 мкл 10-кратного SE-буфера AS, 5 мМ MgC^, 0,25 мМ каждого dNTP, 50 пмоль каждого из праймеров, 300 нг тотальной геномной ДНК. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.

RAPD-праймеры были разделены на две группы по рассчитанной температуре отжига: выше 18°С и ниже. Для второй группы с целью повышения специфичности анализа увеличили концентрацию буфера и праймеров в два раза, достигнув увеличения температуры отжига.

Реакционная смесь для RAPD-PCR объемом 20 мкл в зависимости от типа праймера содержала следующие компоненты; 1 ед. Taq-полимеразы Е338, 2 или 4 мкл 10-кратного SE-буфера AS, 5 мМ MgCl2, 0,25 мМ каждого dNTP, 100 или 200 пмоль каждого из праймеров, 100 нг тотальной геномной ДНК. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.

Условия амплификации были следующими: начальная денатурация 5 мин при 94°С; 35 циклов: денатурация при 94°С - 45 с, отжиг - 45 с и элонгация при 72 °С 90 с; заключительная элонгация 7 мин при 72°С.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с буфером TBE в присутствии бромистого этидия и визуализировали на UV-трансиллюминаторе или с использованием системы GelDocXR («BioRad»,

США) и программы для обработки электрофореграмм Quantity One. В качестве маркера размеров фрагментов ДНК использовали М27 («СибЭнзим», Россия). Полиморфными считались фрагменты, присутствующие на электрофореграммах не всех сортов. Составляли бинарную матрицу данных, в которой присутствие фрагмента отмечали «1», а отсутствие - «О».

1.4.. Построение древа генетического сходства. Генетические дистанции вычисляли на основе полученной матрицы данных, используя коэффициент несовпадения. Дендрограмму, отражающую генетическое сходство сортов люпина узколистного, строили методом кластерного анализа WPGMA в программе Statistica 6.0 («Stat Soft»).

1.5. Паспортизация сортов. По матрице данных выбрали минимальное количество праймеров, необходимых для составления генетического паспорта сорта. В паспортах праймер обозначали прописной буквой латинского алфавита, справа нижним индексом указывали размер фрагмента, а его отсутствие или присутствие - слева верхним индексом.

1.6. Составление дихотомического ключа. Дихотомический ключ идентификации 39 сортов люпина узколистного составляли на основе матрицы данных по минимальному набору фрагментов, позволяющему однозначно определить каждый из изучаемых сортов. Ключ разрабатывали по принципу составления таксономических ключей для определения видов. На каждом шаге выбирали маркер, позволяющий разделить сорта на две примерно равные части.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Выбор метода выделения ДНК из образцов люпина. Для

определения оптимальной методики выделения ДНК из растительного материала было выбрано по одному сорту каждого из трех видов люпина. По результатам электрофоретического и спекгрофотометрического анализов

ДНК, выделяемая фенол-хлороформенным методом, отличалась большей чистотой и большим выходом.

2.2. Подбор оптимальных условий проведения ISSR-PCR и RAPD-PCR на ДНК люпина. Оптимизацию условий PCR проводили на ДНК трех сорта белого, желтого и узколистного люпина. При этом варьировали концентрацию ионов Mg2+, Тдд-полимеразы, ДНК и праймеров, а также температуру отжига праймеров. Оптимальные условия PCR на ДНК люпина описаны в разделе «Материалы и методы».

2.3. Подбор праймеров, обеспечивающих достаточный полиморфизм и стабильную амплификацию полиморфных фрагментов люпина. Для проведения RAPD-анализа использовали 14 RAPD-праймеров. С тремя из них не получили ни одного фрагмента; два праймера продуцировали менее четырех фрагментов ДНК; два праймера не давали полиморфных фрагментов. С остальными RAPD-праймерами удалось получить один-два полиморфных фрагмента (таблица 1). Исключением оказался OPN14, продуцировавший 5 полиморфных фрагментов на ДНК люпина узколистного.

Уровень полиморфизма при RAPD-PCR оказался 16,9% (13 полиморфных фрагментов из 77) для узколистного, 7,3% (3 из 41) для желтого и 10,6% (5 из 47) для белого люпина. Результаты RAPD-PCR на ДНК люпина белого для праймеров ОРМ20 и OPN04 проиллюстрированы на рисунке 1. Видно, что для обоих праймеров наиболее интенсивные полосы являются мономорфными.

При RAPD-анализе полиморфизм наблюдался только среди минорных фрагментов. Специфика RAPD-PCR состоит в том, что такие ампликоны могут быть невоспроизводимыми в связи с ошибками при отжиге праймеров. Таким образом, метод RAPD-PCR показал очень низкую результативность при анализе полиморфизма люпина и его не использовали в дальнейшей работе.

Таблица 1

Характеристика праймеров, использованных в работе

Праймер Тип L .albus L. luteus L. angustifolius

А Б в А Б В А Б В

ОРС07 RAPD 14 1 7,1 14 1 7,1 9 0 0

OPN04 RAPD 13 1 7,7 16 1 6,3 15 1 6,6

C1PN07 RAPD 8 0 0 9 0 0 14 2 14,3

CIPN09 RAPD 14 0 0 8 0 0 13 2 15,4

OPNIO RAPD 10 0 0 8 0 0 11 1

OPN14 RAPD 9 1 11,1 И 1 9,1 14 5 35,7

ОРМ20 RAPD 11 2 18,2 12 0 0 10 2 20

IS1 ISSR 20 1 5 13 3 23,1 19 1 5,3

IS2 (В) ISSR 17 6 35,3 12 1 8,3 16 7 43,7

IS3I ISSR 20 1 5 19 1 5,3 22 13 59

IS4 ISSR 15 0 0 16 0 0 20 4 20

IS5 ISSR 18 1 5,5 20 0 0 18 2 11,1

IS6 (F) ISSR 22 0 0 25 4 16 29 5 17,2

UBC809 ISSR 14 2 14,3 18 2 11,1 19 5 26,3

UBC810 (I) ISSR 20 1 5 22 12 54,5 29 17 58,6

UBC824 ISSR 10 1 10 10 1 10 15 7 46,6

UBC826 ISSR 13 2 15,4 15 6 40 14 0 0

UBC840 ISSR 23 0 0 31 1 3,2 25 0 .0

К10 ISSR 15 0 0 11 0 0 15 5 33,3

KU (J) ISSR 22 3 13,6 15 1 6,6 26 0 0

Примечание: А - общее количество фрагментов; Б - количество полиморфных фрагментов; В - процент полиморфных фрагментов. В графе «Праймеры» в скобках указаны обозначения, применяемые при паспортизации сортов.

Рис. 1. ЯДРО-профиль пяти сортов люпина белого. А - праймер ОРМ20, Б - праймер (№N04. М - маркер размеров ДНК

Для КБК-анализа использовали 22 праймера, состоящих из динуклеотидных мотивов с якорными нуклеотидами на 3'-конце. При использовании трех праймеров на электрофореграммах наблюдался лишь высокомолекулярный шлейф. Остальные 19 КБЛ-праймеров стабильно воспроизводили от 9 (КЗО, ДНК люпина узколистного) до 31 (ЦВС840, ДНК люпина желтого) фрагментов ДНК длиной от 100 до 2500 п.н. Шесть из них не проявили способности продуцировать полиморфные фрагменты, полосы со слабой интенсивностью показали высокую воспроизводимость. В дальнейшей работе при анализе образцов ДНК люпина использовали 13 праймеров (таблица 1).

^Я-профили, полученные для разных сортов люпина, в основном содержали низкое количество полиморфных полос (от 1 до 6). Лишь с использованием 11ВС810 для люпина узколистного и желтого удалось получить 17 и 12 полиморфных фрагментов соответственно, и с КЗ - 13 полиморфных фрагментов для люпина узколистного.

2.4. Изучение генетического полиморфизма сортов, сортообразцов и гибридных форм люпина. Межвидовые различия образцов люпина проявлялись при использовании для ISSR-PCR всех 19 праймеров. Межвидовой полиморфизм у люпина оказался очень высок. Только семь праймеров продуцировали один или два мономорфных фрагмента. Процент мономорфных фрагментов для трех видов люпина составил 2,17% (11 из 505 фрагментов).

Например, для праймера К11 (рис. 2) мономорфным для трех видов является только фрагмент размером 505 п. н., а фрагмент размером 460 п. н. является общим для люпина узколистного и желтого. Из-за почти полного несходства спектров эти праймеры малопригодны для анализа родства видов люпина и построения филогенетических деревьев.

■ ... я«е. III II М1МГ|||Щ -ятт^т. Ш.......Ч*.:-"

А Б В

Рис. 2. Электрофореграмма сортов трех видов люпина, полученная при использовании

праймера К11:

А - люпин белый, Б - люпин желтый, В - люпин узколистный. М - маркер размеров ДНК

На рисунке 3 показаны примеры электрофореграмм узколистного (А), белого (Б), и желтого (В) люпина. В спектре имеются полосы, мономорфные для всех сортов вида, и набор полиморфных фрагментов. Внутривидовой полиморфизм, вычисленный по праймерам, синтезировавшим полиморфные фрагменты, составил 32,7% (66 полиморфных из 202 фрагментов) для узколистного люпина, 20,1% (32 из 159) для желтого и 11,7% (17 из 154) для белого.

Для 7 сортов узколистного люпина удалось найти ампликоны, присутствие или отсутствие которых является сортоспецифичным. Они могут служить маркерами этих сортов.

В целом следует отметить, что выявленная низкая степень гетерогенности сортов люпина соответствует ожиданиям, т.к. размножение люпина происходит преимущественно самоопылением. Кроме того, большинство современных сортов люпина были получены на основе небольшого числа низкоалколоидных мутантов.

2.5. Составление генетических паспортов сортов люпина узколистного, желтого и белого. На основе данных, полученных в результате ^БЯ-анализа сортов люпина, были составлены генетические формулы, отражающие полиморфизм по всем ампликонам и праймерам, использованным для каждого вида. Из этих спектров полиморфных полос были выбраны минимальные наборы праймеров, позволяющие надежно идентифицировать любые сорта и формы, изученные в настоящей работе. Примеры генетических паспортов шести сортов каждого вида представлены в таблице 2. Такие паспорта составлены для всех проанализированных сортов и форм люпина: 39 сортов, 6 гибридных, 5 диких форм и 7 образцов биологического банка генов люпина узколистного, 8 сортов люпина желтого и 6 сортов люпина белого. Минимальный набор, позволяющий идентифицировать все изученные образцы, составил 4 праймера для люпина узколистного, 2 - для люпина белого и 1 - для люпина желтого.

А

у,- С "" , 1

-- V« 1|!| .&;§> 'м--;,. 1 Щ щ Щ. ^ '11 I» м ы

»4 » » ' • - Я»Ч ' В 1 ¿9» ;

1 1 3 -А 4 5 М 1 2 I « ... •г 00 "Л

М 1 2 3 4 5 6 7 8

Н|

1 ■н V-; .<■ V V н ^ к-* 1

5 и» тт П И;

Ш

В

Рис. 3. Электрофореграммы сортов люпина: А - узколистного (КЗ), Б - белого (К10 - слева, К11 - справа), В - желтого (ШС826). Стрелками обозначены полиморфные фрагменты. М - маркер размеров ДНК

Таблица 2

Генетические паспорта некоторых сортов люпина

Название и происхождение сорта Общая формула полиморфных фрагментов

Л. angustifolius

Сидерат 38 (Россия) 'Вето 'Ввбо "Вмо 'В450 'Вз7о 'Вдю 'Biso 'С78о°Сб9о 'С670 'С590 С560 'С520 С490 C4J0 С330 С320 С290 С240 С210 F900 Fsso Рвйо F750 F440 Fí3o 'FS50 'Ьзо 'I790 °1730 '1б50 'ls20 LlSO ' Ll70 1«0 ij90 'bsO 1з70 ЬбО ЬзО Ью I300 I290 I280

СН 78-07 (Россия) 'В97о 'Bjío "Вб-м'В^о 'Вз7о 'Вгю 'Biso 'С780 'C49OuQ7OuCJ9O 'C¡salC¡2o С490 С450 С330 С320 С290 С240 С210 F900 Fsso F860 F750 Fö4o F630 F550 I930 I790 I730 1б50 I520 LtEO I470 I420 I390 I38O I370 I36O I330 I310 I300 I290 I280

Барон (Польша) B970 B860 В640 B450 В370 B210 Biso C78Ü С690 Сб70 С590 С56О С520 I,-. lr I,-. ír ln ln Op Op lp ¡p lp Op V-490 t-450 *-330 1-320 >-290 *-240 1-210 Г900 Г880 Г860 Г750 Г640 ^630 'Fj50 '¡930 'l?90 "¡730 '¡650 '¡120 ¡480 ¡470 ¡420 1390 '¡380 '¡370 ¡360 ¡330 ¡310 I300 I290 I280

Борута (Польша) B970 Bg60 Вб40 B450 B370 B210 в 180 C780 Сб90 Сб70 С590 С56О Cj20 С490 С450 С330 С320 С290 С240 С210 F900 Fsso Fgéo F750 FÍ40 F630 Fsso I930 I790 I730 1б50 I320 I48O I470 I420 I390 I38O I370 I36O I330 Ью I300 I290 I280

Геркулес (Беларусь) В970 Ввбо Вб4о B450 B370 B210 Biso С780 Q90 С^7о С590 Сш Cj2o С490 С450 С330 С320 С290 С240 С210 F900 Fsso F86o F750 Fmo F630 F550 I930 I790 I730 1б50 I520 I48O I470 I420 I390 I38O I370 i36o ЬзО 'зЮ Ьоо i290 ¡280

Каля (Австралия) 'В970 'В8бо"Вб40 'В450 'В370 'В210 'Biso 'C78O 'Сб90 'Сб70 'С590 'с56о 'С520 С490 С450 С330 С320 С290 С240 С210 F900 Fsso F860 F750 Fmo F63o Fi50 I930 I790 ¡730 ¡650 ¡520 ¡48<¡ ¡470 ¡420 ¡390 I38O 1з70 ЬбО ¡330 ¡310 I300 I290 I28O

L. luteus

Престиж (Россия) и1б50 'isoo 'Isso %30 'I4OO '1з70 %50 '^250 "hoo "ll70 'íjíO 'll50

Парис (Польша) 1б50 Ifioo I550 I430 i4oo I370 I350 I250 I200 I170 Il60 1150

Мистер (Польша) 1б50 1б00 I550 I430 I4OO I370 ¿350 I250 I200 I170 I16O liso

Дукат (Польша) ¡650 Гбоо I550 I430 I400 I370 Í350 I250 ¡200 ¡170 ¡160 ¡150

Поло (Польша) lóso 1бП0 I550 I430 i4oo I370 I350 I250 I200 1170 I16O í 150

Лорд (Польша) 1б50 1б00 '550 I430 ^400 I370 I350 1250 ¡200 Il70 Il60 Il50

L. albus

Гамма (Россия) 'Bl05O 'B710 UBf90 'Вб50 'B470 UB420 'J;50 '¡310 'Jl90

Дега (Россия) B105O B710 Вб90 Вб50 B470 B420 J550 J310 J190

Бугаи (Польша) B1050 B710 Вб90 Вб50 B470 B420 J550 J3I0 Jl90

Борос(Польша) В1050 B710 Вб90 Вб50 В470 В420 J550 ^310 Jl90

Люцамме (Франция) В1050 В710 Вб90 Вб50 В470 В420 J550 J3I0 J190

Луниверс (Франция) В1050 В710 Вб90 Вб50 В470 В420 J550 J3I0 J190

2.6. Изучение генетического сходства сортов и сортообразцов люпина узколистного. На основе генетических формул была получена дендрограмма генетического сходства сортов люпина узколистного (рис. 4). В целом она согласуется с происхождением сортов из разных селекционных центров, включает четыре кластера. Так, в единые кластеры сгруппировались сорта белорусской (кластер 1) и российской (кластер 2) селекции, а также 5 из 10 польских сортов (кластер 3).

Как и ожидалось, дикие формы из Испании (ИД) кластеризовались отдельно (кластер 4), показав максимальное генетическое расстояние от остальных групп.

Все четыре австралийских образца оказались распределены по дендрограмме по одному. Возможно, это объясняется тем, что в основу австралийской селекции люпина легли европейские сорта разного происхождения.

Равномерно распределены по древу оказались 7 форм биологического банка генов узколистного люпина (БГБ) из Белоруссии. Четырнадцать компонентов БГБ сочетают в себе все идентифицированные хозяйственно-ценные признаки (Купцов, 2006). Они также отобраны из разных источников.

2.7. Разработка схем дихотомического ключа для идентификации сортов люпина по генетическим маркерам. Дихотомический ключ (рис. 5) был составлен для 39 сортов люпина узколистного на основе генетических паспортов. Для его составления достаточным оказалось использование лишь 13 фрагментов трех праймеров (IS3, IS6 и UBC 810).

Достоинство такого способа идентификации заключается в том, что нет необходимости проверки получаемых злектрофоретических профилей по всем полиморфным фрагментам всех сортов, для которых созданы формулы. Как правило, для идентификации сорта необходимы не все полиморфные фрагменты. Достаточно определить наличие или присутствие требуемой полосы на электрофореграмме и затем перейти к следующему шагу.

Ди»ным СН 73.07 Смена Белозерный 110 Белоэерным 121 Витязь Кристалл Узколистным 53-07 Мфтан Першац»ет Цегарь Граф Барон Зеуо Эльф Неглун Радужный Снежеть Валан 2240 БГБ 6 Регент Взда-40 Халиф Вадан 2243 БГБ 5 Ьйнделап БГБ 10 БГБ 1 ИД 20-95 ИД 9.95 ИД 55-95

ИД-18-85

0.2 0J

Генетическое расстояние

Рис. 4. Дендрограмма генетического сходства сортов люпина узколистного

"ftsa 1ЛЛ,И U.L'Qp, 1.1.1.1. 1.1.1.2. 07

1.1.Z'Cro 1.1.21. 1.1.22.

1.1.22.1. 1.1.22.2

1-2.4-90

1.2.lacro 1.2.1.1. Чи,

1.2.1.1.L 1.2.1.1J.

5С5во-Мандслал 'Ско - Узколистый 53-

'Cs«-Регент 'С;«

Чзи-Нептун Чзи-Смена

-Барон

"Оиа-

>С520

l2.Ll.il.sC550-ifepraH 1.2.1.1.22.'QB-

Першащет

L.2.1.2. Ч3„ 1.2.1.2.1.

1-2.1.2.1.1.Ч530-Граф 1.2.1.2.1.2. Чка-Цезарь 1.2.1.2.2 'Сна

1.2.1.2.21.0Счо-Ш78-07

1.2.1.2.22.'Сиз -Калнф

1.2.2>С«-0

1.2.21. Чш 1.2.21.1. »Сан

1^.21.И.'Сяо-атьф 1.2.21.1.2.'Сно-Зеус 1.2.21.2 'Qx

1.2.21.21.°С;и-Борута 1-2.21.22.'QM-Крнстапя.

1.2.22. Ч3,о

1.2.22.1. 'F-sj-Sirmb 1.2.22.2 'F™

1.2.22.2. l.iea-

БелозернынШ 1-2.22.22. Ч«з-

Беяозернын 1Ш

2. 'Си, 2.1.1Й11 2.1.1.°Ij«o 2.1.1.1. 2.1.L2. 2.1.

2.1.

2.1.2Чао 2.1.21. 2.1.22. 2.1, 2.1.

2.2.'Ьи 2.2.1.%« 2.2.L1. 2.2. 2.2. 2.11.2. 2.2.

41«а-Кала

Ч«з

1.2.1. сОч-Валан-224S

1.2.2 'Cjij-Ba-iiH-2249

°Сяо -Гелена 'Cjjo

.22.L с1га-Вада-40 .22.2 Ч«0 2.1.22.21.41,(0 -Гузлнвгр гл.гггг.Чзи-прныа

"См 1.1.L 1.1.2

ш.

Ччга-Васнлек Чщо-Ян

Ття

2.2.1ЧЗИ 2.2.21. 2.2.

2.2.

2.2.1.2. L1.°Fj5o - Дивный 2.2L2.1.2.!Fija-Снкыть 2.2.1.2.2 Т7Ч 2.2.и.21.«13;5-Бояр| 2.2.1.2.22. Ч52о-&алько

.21.L «Сед-

Радужный .21.2 'С,;, 2.2.21.21 .'С}„-

Геркулес 2.2.21.22. iCj») -Рангош 2.2.22. !F-50

2.2.22.1. сЬ?о—Раменок 2.2.22.2 Чаи

2.2.22.2 l.^Ic,о-Сндерат 38

2.2.22.22.4,30-

Жодннскнй

Рис. 5. Дихотомический ключ идентификации сортов люпина узколистного

Выводы

I. На основе ISSR-PCR разработан метод паспортизации сортов трех видов люпина: Lupinus angustifolius, L. luteus и L. albus.

1. Показано, что межмикросателлитные последовательности люпина обладают достаточным уровнем полиморфизма для проведения идентификации сортов: уровень полиморфизма составил 32,7% для узколистного, 20,1% для желтого и 11,7% для белого люпина. Выбрано 11 праймеров, обеспечивающих стабильную амплификацию полиморфных фрагментов ДНК трех видов люпина.

3. RAPD-анализ дает недостаточное количество полиморфных фрагментов (16,9%, 7,3% и 10,6% для люпина узколистного, желтого и белого соответственно) и имеет более низкую воспроизводимость, поэтому использование его для идентификации сортов нецелесообразно.

4. Составлены генетические паспорта 57 сортов, сортообразцов, гибридных и диких форм узколистного, 6 сортов белого и 8 сортов желтого люпина.

5. Минимальный набор для однозначного определения 57 сортообразцов люпина узколистного состоит из четырех праймеров.

6. На дендрограмме генетического родства сортов и форм узколистного люпина, включающей 50 образцов, выявляется 4 кластера, которые в целом отражают селекционное происхождение и генетические связи образцов. Сорта российской, белорусской и польской селекции образуют три отдельных кластера. Дикие формы из Испании образуют четвертый кластер, удаленный от остальных образцов. Формы биологического генетического банка люпина узколистного и австралийские сорта равномерно распределены по всему древу.

7. Разработана схема дихотомического ключа для идентификации сортов люпина.

Рекомендации производству

1. Генетические паспорта сортов люпина рекомендуется учитывать при государственной регистрации сортов и использовать для контроля сортового соответствия и чистоты семенного материала.

2. Дендрограмму генетического сходства сортов люпина предлагается использовать в селекционном процессе при составлении схем гибридизации с учетом отдаленных эколого-генетических комбинаций.

3. Дихотомический ключ может быть применен для сортовой идентификации растений и семян люпина.

4. Полученный банк полиморфных ДНК-маркеров рекомендуется использовать для разработки метода молекулярного маркирования хозяйственно-ценных признаков.

5. Результаты работы предлагается использовать при составлении курсов биотехнологии, генетики и основ сельского хозяйства в вузах.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Артюхова, A.B. Разработка метода паспортизации сортов люпина / A.B. Артюхова, С.Ю. Гришин, М.И. Лукашевич, В.В. Заякин, И.Я. Нам // Вестник Брянского государственного университета. -Брянск: РИО Б ГУ, 2010. - №4. - С. 82-85.

2. Артюхова, A.B. Обнаружение генетического полиморфизма внутри различных сортов рода Lupinus Брянской области / A.B. Артюхова, М.И. Лукашевич, В.В. Заякин, И Л. Нам //Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениеводстве: материалы международной научно-практической конференции молодых ученых. Брянск, 29 июня - 8 июля 2009 г. - Брянск, 2009. - С. 47-51.

3. Артюхова, A.B. Генетический полиморфизм сортов рода Lupinus /

A.B. Артюхова // Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные аспекты в биотехнологии: материалы международной конференции молодых ученых. Брянск, 26 апреля - 8 мая 2010 г. - Брянск, 2010.-С. 7-13.

4. Гришин, С.Ю. Разработка метода генетических маркеров люпина для использования в селекционном процессе / С.Ю. Гришин, A.B. Артюхова,

B.В. Заякнн, ИЛ. Нам // Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные аспекты в биотехнологии: материалы международной конференции молодых ученых. Брянск, 26 апреля - 8 мая 2010 г. - Брянск, 2010. - С. 37-43.

5. Артюхова, A.B. Использование метода ДНК-маркеров для паспортизации сортов Lupinus angustifolius / A.B. Артюхова, С.Ю. Гришин, В.В. Заякин, И.Я. Нам // III всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород, 24-28 мая 2010. - Нижний Новгород, 2010. - С. 88-89.

6. Артюхова, A.B. Разработка генетических паспортов сортов Lupinus angustifolius / A.B. Артюхова, С.Ю. Гришин, В.В. Заякин, И.Я. Нам // Актуальные проблемы ботаники и экологии: материалы международной конференции молодых ученых. Ялта, 21-25 сентября 2010 г. - Симферополь, 2010.-С. 325-326.

7. Артюхова, A.B. Использование метода ISSR-PCR для выявления генетического полиморфизма сортов разных видов рода Lupinus / A.B. Артюхова, С.Ю. Гришин, В.В. Заякин, ИЛ. Нам // Факторы экспериментальной эволюции организмов. Т. 8. — Киев: Логос, 2010. — С. 299302.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность за предоставленный для работы селекционный материал, научные консультации и доброжелательное отношение к работе, заместителю директора по научной работе ВНИИ люпина РАСХН д.с.-х.н. Лукашевичу М.И., заведующему лабораторией селекции узколистного люпина ВНИИ люпина РАСХН, к.с.-х.н. Агеевой П.А., заведующему лабораторией селекции люпина НИЦ НАН Беларуси по земледелию, к.с.-х.н. Купцову Н.С. Автор выражает особую признательность научному руководителю, директору ИННО-центра биотехнологии и экологии Брянского государственного университета им. акад. И.Г. Петровского, д.б.н. Нам И. Я., профессору кафедры ботаники БГУ, д.б.н. Заякину В.В. за внимание к работе, помощь в планировании, проведении экспериментальной работы и написании диссертации, Гришину С.Ю. за помощь в проведении эксперимента, а также коллегам, работающим в ИННО-центре биотехнологии и экологии БГУ.

Подписано в печать 14.03.11 Формат 60*80 1/16 Печать офсетная Бумага офсетная Усл. п.л. 1,37 Тираж 100 экз. Заказ 54. Отпечатано в ООО «Ладомир» 241000 г. Брянск, ул. Калинина, 81

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Артюхова, Анастасия Валентиновна

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Характеристика объекта исследования

1.2. Современные методы исследования генетического полиморфизма растений

1.2.1. Молекулярно-генетический анализ ДНК с помощью RAPD-маркеров

1.2.2. Молекулярно-генетический анализ ДНК с помощью

ISSR- и SSR маркеров

1.2.3. Другие молекулярно-генетические мультилокусные методы анализа полиморфизма растений

1.3. Методы паспортизации сортов растений

1.4. Маркирование видов и сортов люпина

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Исходный материал

2.2. Выделение геномной ДНК люпина

2.3. Определение качества и количества ДНК '

2.4. Полимеразная цепная реакция

2.5. Электрофоретический анализ ДНК

2.6. Обработка результатов генетического анализа

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Выбор метода выделения ДНК люпина

3.2. Оптимизация условий PCR

3.3. Характеристика праймеров для RAPD-и ISSR-PCR

3.4. Характеристика полиморфных фрагментов, амплифицируемых при

ISSR-PCR

3.4.1. Межвидовой полиморфизм

3.4.2. Внутривидовой полиморфизм

3.5. Генетическое сходство сортов люпина по 188Ы-маркерам

3.6. Разработка системы паспортизации сортов люпина

3.7. Дихотомический ключ определения сортов люпина 84 Выводы 88 Рекомендации производству 89 Список использованной литературы 90 Приложения

СОКРАЩЕНИЯ

БГБ - белорусский генетический банк ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота НК - нуклеиновая кислота

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов п.н. — пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism

СТАВ - Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DArT - Diversity Array Technology

HRM - High-Resolution Melt analysis

IRAP - Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphysm

ITAP - Intron-Target Amplified Polimorphism,

ISSR - Inter-Simple Sequence Repeat

LP-RAPD - Long Primer Random Amplified Polymorphic DNA MAS - Marker Assisted Selection

MFLP - Microsatellite-anchored Fragment Length Polymorphisms

PCR - Polymerase Chain Reaction

QTL - Quantitative Trait Loci

RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA

RAMP - Randomly Amplified Microsatellite Polymorphism

REMAP - Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism

RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

SAMPL - Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci

SCAR - Sequence Characterized Amplified Region

SNP - Single Nucleotide Polymorphism

SSLP - Simple Sequence Length Polymorphism

SSR - Simple Sequence Repeats

STR - Short Tandem Repeats

UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean

VNTR - Variable Number Tandem Repeat

WPGMA - Weighted Pair Group Method with Arithmetic mean

Введение Диссертация по биологии, на тему "Паспортизация сортов люпина методами ISSR-PCR и RAPD-PCR для биотехнологических исследований"

В современной мировой науке биотехнология является одной из наиболее динамично развивающихся дисциплин биологического профиля. На развитие исследований по биотехнологии в мире выделяются сотни миллиардов долларов, а валовой доход мирового биотехнологического производства составляет триллионы долларов США. В России разработана программа развития биотехнологии, она входит в число приоритетных направлений развития науки.

Биотехнология возникла на стыке таких фундаментальных дисциплин, как генетика, физиология, молекулярная биология, микробиология. В 80-х годах прошлого столетия она была выделена в отдельную дисциплину и продолжает активно развиваться. Например, недавно появилось новое направление - бионанотехнология.

В настоящее время биотехнологические методы широко используются для проведения исследований в смежных областях науки, в частности в селекции растений, растениеводстве и семеноводстве (Харченко, 2006; Сельскохозяйственная биотехнология, 2008). Сегодня невозможно представить успешное развитие селекционных работ без применения методов генетической и клеточной инженерии, культивирования органов и тканей растений in vitro, молекулярных белковых или ДНК-маркеров, ПЦР-диагностики фитопатогенов.

Особое значение в современной биотехнологии имеет разработка современных методов анализа сортов и видов растений на основе полимеразноцепной реакции, поскольку метод ПЦР имеет высокую чувствительность, точность, воспроизводимость результатов и производительность анализа, достаточно прост в исполнении и не требует сложного дорогостоящего оборудования (Сулимова, 2004; Карлов, 2009). ПЦР широко используется в медицине для экспресс-диагностики инфекционных и генетических заболеваний, в исследованиях по эволюционному и филогенетическому анализу разных таксонов животных и растений (Kochieva, 2004; Лукашов, б

2009), в генетике и селекции для определения генетического родства сортов разных видов' растений- (Зайцев, 2001; Нам, 2004), является неотъемлемой частью работ по генетической инженерии.

Большое значение для- селекции хозяйственно-ценных культур и семеноводства имеет разработка методов паспортизации сортов растений на основе молекулярных маркеров. Ранее для анализа генотиповш' сортов разных культур использовался метод белковых маркеров,- который позволял по спектрам альбуминов, глобулинов, пролактинов и различных, изоферментных систем разных культур определять сортовую принадлежность таких важных злаковых культур, как рожь, пшеница и др. (Созинов, 1985; Конарев, 1993). Полученные результаты использовали в селекции, для составления схем гибридизации, анализа, гибридных образцов, контроля сортовой чистоты различных партий элитных семян.

Однако метод белковых маркеров был часто сопряжен с недостаточным полиморфизмом белков, в частности альбуминов или глобулинов. Для некоторых видов* растений применение метода белковых маркеров в сортовой идентификации был непригоден из-за низкого уровня межсортового разнообразия. Метод белковых маркеров отражает лишь ту часть генома, экспрессия которой проявляется в синтезе белковых молекул: Однако- более половины генома, растений представлена сателлитной и микросателлитной ДНК, функции которой не* связаны с биосинтезом белков, и эта часть генома никак не может быть выявлена методами белковых маркеров. В то же время доказана высокая вариабельность этих последовательностей ДНК, что в последние 20 лет активно используется в биотехнологических исследованиях для изучения происхождения и генетического родства представителей разных таксонов.

Развитие методов ДНК-маркеров на основе полимеразно-цепной реакции с использованием случайных праймеров (ИАРО-РСК., АРЬР), а также микросателлитных последовательностей (ЗБЯ-РСЯ, ^БЯ-РСЫ, МРЪР) позволило расширить возможности для разработки методов молекулярного 7 маркирования с целью изучения филогенетических связей, генетического родства внутри разных семейств и родов растений:

ДНК-маркеры используются для паспортизации сортов и в семеноводстве различных сельскохозяйственных культур, в частности, были разработаны молекулярные, маркеры, хозяйственно-ценных^ признаков ; люпина : узколистного (Yang, 2004» 2008) и. способ идентификации« ряда, австралийских; сортов узколистного: люпина (Yuan, 2005). В России подобные исследования; на люпине разных видов не проводились.

Люпин является важной для России зернобобовой культурой кормового й сидерального направления, семена- которой характеризуются: высоким качеством'запасных белков. Люпин называют «северной соей», но в отличие от сои люпин неприхотлив, к: плодородию почв, он относится к пионерским культурам и может произрастать, на бедных почвах - например, на песчаниках или, лавовых потоках после извержений вулканов. Для созревания семян люпина не требуется высокой суммы активных температур, он приспособлен к произрастанию В; условиях средней полосы России, в Белоруссии, Украине и Польше. .

В нашей стране проводятся селекционные работы; по созданию высокопродуктивных и устойчивых сортов;трех видов люпина: белого, желтого и узколистного. Поскольку зачастую: исходным- материалом- для селекции являются.'формы белорусской, польской», украинской" селекции, а также в связи с постоянным обменом селекционными образцами между селекционерами и генетиками этих, стран, логично ожидать,, что сорта российской: селекции должны быть близки по генетической природе сортам, завезенным из этих стран.

В: связи с вышесказанным, разработка биотехнологических высокопроизводительных методов на основе ПЦР, позволяющих провести экспресс-анализ для паспортизации сортов люпина разных видов, подбора родительских пар при скрещивании с целью ускорения селекции- люпина, определения, сорта или анализа сортовой чистоты элитной партии семян, 8 является актуальным направлением биотехнологии применительно к, данной культуре.

Настоящее исследование посвящено разработке метода паспортизации сортов трех видов люпина на основе 18811- и КАРО-РСЫ, что необходимо для ускорения селекционной работы, идентификации сортов разных видов люпина, а также контроля чистоты разных партий семян в семеноводстве этой культуры.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка метода паспортизации сортов люпина разных видов на основе методов 18811-РСК и КАРБ-РСЯ.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1) выбор метода выделения ДНК из образцов люпина;

2) подбор оптимальных условий проведения 18811- и КАРО-РСЫ на ДНК люпина;

3) подбор праймеров, обеспечивающих достаточный полиморфизм и стабильную амплификацию полиморфных фрагментов люпина;

4) изучение генетического полиморфизма сортов, сортообразцов и гибридных форм люпина;

5) составление генетических паспортов сортов люпина узколистного, желтого и белого;

6) изучение генетического сходства сортов и сортообразцов люпина узколистного;

7) разработка схем дихотомического ключа для идентификации сортов люпина по генетическим паспортам.

Научная новизна и значимость работы. Впервые в России разработан метод паспортизации сортов люпина трех видов на основе 188Я-РСК. Метод паспортизации сортов люпина включает протокол выделения ДНК, набор праймеров и условия проведения 188К-РСК. Составлены паспорта сортов трех видов люпина, возделываемых в России, установлено генетическое сходство сортов люпина узколистного. Установлены уровни внутривидового разнообразия, степень генетической дифференциации сортов.

Практическая ценность исследований. Полученные в данной работе паспорта сортов люпина белого, желтого и узколистного будут использованы в селекции люпина, а также для поиска маркеров хозяйственно-ценных признаков при разработке биотехнологий получения высокопродуктивных сортов этого ценного растения. Составленные паспорта могут быть использованы при передаче сортов в Госкомиссию и для контроля чистоты посевного материала.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод паспортизации сортов трех видов люпина.

2. Паспорта сортов люпина узколистного, желтого и белого.

3. Дихотомический ключ идентификации сортов люпина.

4. Генетическое сходство сортов люпина узколистного.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Артюхова, Анастасия Валентиновна

5. Результаты работы предлагается использовать при составлении курсов биотехнологии, генетики и основ сельского хозяйства в вузах.

Р9 ол

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Артюхова, Анастасия Валентиновна, Уфа

1. Артюкова, Е.В. Анализ генетической изменчивости редкого эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceaé) на основе RAPD маркеров / Е.В.Артюкова, А.Б. Холина, М.М. Козыренко, Ю.Н. Журавлев // Генетика. -2004. Т. 40. - № 7. - С. 877-884.

2. Боронникова, C.B. Генетическая паспортизация популяций редких видов растений рода Adonis с использованием ISSR- и RAPD-маркеров / C.B. Боронникова II Известия ТХСА. 2009. - Вып. 1. - С. 82-88.

3. Вишнякова, М.А. RAPD анализ видового полиморфизма рода чина1.thyrus L. семейства Fabaceae Lindl. / М.А. Вишнякова, М.О. Бурляева,i

4. Н.В. Алпатьева, Ю.В. Чесноков // Информационный вестник ВОГиС. — 2008. -Т. 12.-№4.-С. 595-607.

5. Волосевич, H.H. Молекулярное маркирование признака устойчивости к коккомикозу у вишни с использованием RAPD-PCR / H.H. Волосевич, А.Л. Лагоненко, Н.В. Кухарчик // Плодоводство. 2007. - Т. 19. - С. 117-123.

6. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: пер с англ. / [под. ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена]. М.: Мир, 1991.-408 с.

7. Генофонд и селекция зернобобовых культур (люпин, вика, соя, фасоль) / под ред. Курловича Б.С., Репьева С.И.. СПб, 1995. 430 с.

8. Глазко, Т.Т. Молекулярно-генетические подходы в селекции зерновых / Т.Т. Глазко, В.И.Глазко // Известия ТСХА. 2006. - Вып. 4. - С. 100-107.

9. Глазко, В.И. Оценка полиморфизма различных генетических элементов в контроле разнообразия генофондов культурных растений / В.И. Глазко // Вестник ВОГиС. 2008. - Т. 12. - №4. - С. 590-594.

10. Гостимский, С.А. Использование молекулярный маркеров для анализа генома растений / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, В.К. Боброва // Генетика. -1999. Т. 35.-№ И.-С. 1538-1549.

11. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / под ред. Ю.П. Алтухова. М. : Наука, 2004. - 619 с.1. ПГ1

12. Домблидес, Е.А. Оценка генетической изменчивости позднеспелых сортов капусты белокочанной с использованием RAPD-маркеров / Е.А. Домблидес, A.C. Домблидес, Е.Г. Добруцкая, Е.В. Шевцова // Овоч1вництво i баштанництво. — 2007. Вип. 53. - С. 3-9.

13. Еленевский, А.Г. Ботаника: систематика высших, или наземных растений: Учеб. для студентов высших пед. учебных заведений / А.Г. Еленевский, М.П. Соловьева, В.Н. Тихомиров. М. : Академия, 2004. -432 с.

14. Епринцев, А.Т. Идентификация и исследование экспрессии генов: учебно-методическое пособие для вузов / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин. Воронеж : ИПЦ ВГУ, 2008. - 64 с.

15. Журавлев, Ю.Н. ПЦР-генотипирование женьшеня с использованием произвольных праймеров / Ю.Н. Журавлев и др. // Докл. Академии наук. -1996.-Т. 349.-№ 1.-С. 111-114.

16. Зайцев, B.C. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа* рассеянных повторов последовательностей R173 / B.C. Зайцев, Э.Е. Хавкин // Докл. РАСХН. 2001. - №3. - С. 3-5.

17. Календарь, Р.Н. Типы молекулярно-генетических маркеров w их применение / Р.Н. Календарь, В.И. Глазко // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. - Т. 34. - № 4. - С. 279-296.

18. Карлов, Г.И. Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами : автореф. дис. . д-ра.биол. наук / Г.И. Карлов. М., 2009. - 50 с.

19. Конарев, В.Г. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции (Теор. осн. селекции Т. 1) / В.Г. Конарев, И.П. Гаврилюк, Н.К. Губарева. -М.:Колосс, 1993. 447 с.

20. Кочиева, Е.З. Идентификация видового и сортового полиморфизма у томатов / Е.З. Кочиева, Т.П.Супрунова // Генетика. 1999а. - Т. 35. - № 10. -С. 1386-1389.1. П1

21. Кочиева, Е.З. Использование RAPD-анализа для идентификации сортов баклажанов {Solamum melongena L.) / Е.З. Кочиева, Т.П. Супрунова, С.К. Семенова // Генетика. 1999b. - Т. 35, - № 8. - С. 1165-1168.

22. Купцов, Н.С. Люпин. Генетика, селекция, гетерогенные посевы. / Н.С. Купцов, И.П. Такунов. Клинцы: Клинцовская городская типография., 2006. - 576 с.

23. Лукашов, В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ / В.В. Лукашов. М.: БИНОМ, 2009. - 256 с.

24. Майсурян, H.A. Люпин. / H.A. Майсурян, А.И. Атабекова. М., 1974. -199 с.

25. Малышев, C.B. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений / C.B. Малышев, H.A. Картель // Молекулярная биология. 1997. -Т. 3. -№ 62. - С. 197-208.

26. Мироненко, A.B. Биохимия люпина. / A.B. Мироненко. Минск: Наука и техника, 1975. - 312 с.

27. Нам, И .Я. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro : автореферат дис. . доктора биологических наук : 03.00.23 / И.Я. Нам. М., 2004. - 42 с.

28. Ней, М. Молекулярная эволюция и филогенетика / М. Ней, С. Кумар пер. с англ.. Киев: КВ1Ц, 2004. - 418 с.

29. Оганисян, A.C. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR / A.C. Оганисян.С., Е.З. Кочиева, А.П. Рысков // Генетика. 1996. Т. 32. - № 3. - С. 448-451.

30. Патрушев, Л.И. Искусственные генетические системы / Л.И. Патрушев. -М.: Наука, 2004.-526 с.

31. Рамазанова, С.А. Идентификация сортов сои с использованием молекулярно-генетических методов: автореф. дис. . канд.биол. наук — Краснодар, 2008. 26 с.

32. Сельскохозяйственная биотехнология / под ред. B.C. Шевелухи. 2-е издание перераб. и доп. - М.: Высшая школа, 2008. - 710 с.

33. Сиволап, Ю.М. Генетический полиморфизм злаковых растений, при помощи ПЦР с произвольными праймерами / Ю.М. Сиволап, Р.Н. Календарь, C.B. Чеботарь // Цитология и генетика. 1994. - Т. 28. - № 6. - С. 54-61.

34. Соболев, В.В. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины / В.В. Соболевой др. // Сельскохозяйственная биология. 2006. - №5. - С. 48-52.

35. Созинов, A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции /A.A. Созинов. -М.: Наука, 1985.-217 с.

36. Сорта селекции всероссийского научно-исследовательского института люпина / П.А. Агеева и др.. Брянск: Читай-город, 2005. — 48 с.

37. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е. Сулимова // Успехи современной биологии. 2004. - Т. 124. - № 3. - С.260-271.

38. Урбанович, О.Ю. Идентификация сортов яблони с использованием SSR-анализа в Беларуси / О.Ю. Урбанович, З.А. Козловская, H.A. Картель // Плодоводство. 2007. - Т. 19. - С. 32-39.

39. Халяфян, A.A. Statistica 6. Статистический анализ данных. Учебник. / A.A. Халяфян. 3-е изд. - М.: Бином-Пресс, 2007. - 512 с.

40. Харченко, П.Н. ДНК-технологии в развитии агробиологии / П.Н. Харченко, В.И. Глазко. М.: Воскресение, 2006. - 480 с.

41. Цветков^ И.А. Генетическая дифференциация сортов риса по1 IRAP-маркерам / И.А. Цветков, А.Н. Иванов, В.И. Глазко // Известия ТСХА. 2006. -№4.-С. 155-159:

42. Чекалин, Н.М. Генетические основы селекции зернобобовых культур на устойчивость к патогенам / Н.М. Чекалин. Полтава: 1нтерграфжа., 2003.- 186 с.

43. Чекалин, Н.М. Селекция зернобобовых культур / Н.М. Чекалин. М.: Колос, 1981.-335 с.

44. Aïnouche, A.K. Phylogenetic relationships in Lupinus (Fabaceae: Papilionoideae) based on internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear9b

45. Akkaya, M.S. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean / M.S. Akkaya, A.A. Bhagwat, P.B. Cregan // Genetics. 1992. - Vol. 132. -P. 1132-1139.

46. Ammiraju, J.S.S. Identification of inter simple sequence repeat (ISSR) marker associated with seed size in wheat / J.S.S. Ammiraju et al. // Theoretical and applied genetics. 2001 - Vol. 102. - P. 726-733.

47. Arcade, A. Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese larch / A. Arcade et al. // Theoretical and applied genetics. 2000. - Vol. 100. - P. 299-307.

48. Astarini, I.A. Fingerprinting of cauliflower cultivars using RAPD markers / I.A. Astarini, J.A. Plummer, R.A. Lancaster, G. Yan // Australian journal of agricultural research. 2004. - Vol. 55. - P. 117-124.

49. Badr, A. Chloroplast DNA restriction polymorphismin Genistae (Legumninosae) suggests a common origin for European and American lupines / A. Badr, W. Martin U. Jensen // plant systematic and evolution. 1994. -P.95-106

50. Badr, A. Systematic relationships in Lathyrus sect. Lethyrus (Fabaceae) based on ampliphied fragment polymorphism (AFLP) data / A. Badr, H. el Shazly, H. el Rabey, L.E. Watson // Canadian, journal of botany. 2002. - Vol. 80. -P. 962-969.9Yn/l

51. Becker, J. Combined mapping of AFLP and RFLP markers an barley / J. Becker, P. Vos, M. Kuiper, F. Salamini, M. Heun // Molecular genetics and genomics. 1995. - Vol. 249. - P. 65-73.

52. Boersma, J.G. Development of a PCR marker tightly linked to mollis, the gene-that controls seed dormancy in Lupinus angusifolius L. / J.G. Boersma, B.J. Buirchell, K. Sivasithamparam, H. Yang // Plant breeding. 2007a. - Vol. 126. -P. 612-616.

53. Boersma, J.G Contribution of the molecular genetics of the narrow-leafed lupin {Lupinus angustifolius L.) — mapping, marker development and QTL analusis / J.G. Boersma. The University of Wester Australia, 2007d. - P. 216.

54. Brien, S.J. A molecular marker for early maturity {Ku) and marker-assisted breeding of Lupinnus angustifolius / S.J. Brien et al. // Proc. 11th aust. plant breeding conf. (Adelaide). 1999. - P. 204-205.r»r

55. Garlier, J.D. Genetic maps of RAPD, AFLP and ISSR; markers in Ananas bractealus and A. comosus using the pseudo-testcross; strategy / J.D: Carlier et al. //

56. Plant-breeding, -2004. Vol; 123. - P: 186-192.

57. Chomczynski, P.' Single-step 'method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Analytical biochemistry:.- 1987. Vol- 162; - P. 156-159?

58. Croft;,ÄiM'; Molecular«'analysisoi--Lethyeusf sativüs:B. (grass pea); and related species / A.M; Croft, E.C.K.Pang, P.W J;Taylor // Euphytica. - 1999; - Vol. 107. - P. 167-176.

59. Dangi,.R.S. Assessment of genetic diversity in Trigonellafoenum-graecum and Trigonella caerulea using ISSR and RAPD markers / R.S. Dangi et al. // BMC Plant biology. 2004. - P. 4-13.

60. Dulson, J. Efficacy of bulked DNA samples for RAPD DNA fingerprinting of 1 genetically complex Brassica napus.xultivars / J. Dulson, L.S. Kott, V.L. Ripley //

61. Euphitica. 1998. - Vol. 102. - P. 65-70.

62. Ferreira, A.R. Soybean genetic map of RAPD markers assigned to an existing scaffold RPLP map / A.R. Ferreira, K.R. Foutz, P. Keim // Journal of heredity. -2000; Vol. 91. - P. 392-396.

63. Gillings, M: Amplification of anonymous DNA fragments usingi pairs ? of long primers generates reproducible DNA fingerprints that are sensitive to genetic variation / M. Gillings, M; Holley // Electrophoresis. 1997. - Vol. 18. - P; 15121518.

64. Gladstones, J.S. A historical view of lupins in Australia // Proceedings of the First Australian Lupin Technical Symposium Eds. Dracup M;, Palta J.J. 1994. -P. 1-38.

65. Gupta, S. Interspecific reproductive barriers and genomic similarity among the rough-seeded Lupinus species / S. Gupta, B.J. Buirchell, W.A. Cowling // Plant breeding. 1996. - Vol. 115. - P. 123-127.

66. Gupta, S. Molecular markers and their application in wheat breading / S. Gupta, R.K. Varshney, P.C. Sharma, B. Ramesh // Plant breeding. 1999. - Vol. 118.-P. 369-390.

67. Harrison, J.E.M: General control of alkaloids in Lupinus albus / J.E.M. Harrison, W. Williams // Euphytica. 1982. - Vol. 31. - P. 357-364.

68. He, Q. Effects of thermocyclers and primers an the reproducibility of banding patterns in randomly amplified polymorphic DNA analysis / Q. He, M.K. Viljanen, J. Mertsola // Molecular and cellular probes. 1994. - Vol. 8. -P. 155-160.

69. Hu, J. Generation of DNA-based markers in specific genome regions by two primer RAPD reactions / J. Hu, J. van Eysden, C.F. Quiros // PGR methods and appl. 1995. - Vol. 4. - № 6. - P. 346-351.

70. Janssen, P. Evaluation of the DNA fingerprinting method' AFLP as a new tool in bacterial taxonomy / P. Janssen et al. // Microbiology. 1996. - Vol. 142.-P. 1881-1893.

71. Jones, C.J. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories / C.J. Jones et al. // Molecular breeding. -1997.-Vol. 3.-P. 381-390.

72. Joshi, S.P. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza / S.P. Joshi et al. // Theoretical and applied genetics. 2000. - Vol. 100. - № 8. - P. 1311-1320.

73. Kalendar R. IRAP and REMAPA two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques / R. Kalendar et al. // Theoretical and applied genetics. -1999.-Vol. 98.-P. 701-711.

74. Kass, E. Molecular phylogeny and phylogeography of Lupinus (Leguminosae) inferred from nucleotide sequences of the rbcL gene and ITS 1+2 regions of rDNA /nr»"7

75. E. Kass., M. Wink // Plant systematics and evolution. 1997. -Vol. 208. - P. 139-167.

76. Kenicer, G J. Systematics and biogeography of Lathyrus (Leguminosae) based on internal transcribed spacer and cpDNA sequence data / G.J. Kenicer, T. Kajita, R.T. Pennington, J. Murata // American journal of. botany. 2005. - Vol. 97.-P. 1199-1209.

77. Kennedy, G.C. The minisatellite an the diabetes susceptibility locus IDDM2 regulates insulin transcription / G.C. Kennedy, M.S. German, W.J. Rutter // Nature genetics. 1995. - №9. - P. 293-298.

78. Kim, D.H. Genetic relationships of sesame germplasm collection as revealed by inter-simple sequence repeats / D.H. Kim et al. // Plant breeding. 2002. -Vol. 121.-P. 259-262.

79. Kochieva E.Z. Assessment of genetic relationships in the genus Capsicum using different DNA marker systems / E.Z. Kochieva, N.N. Ryzhova, W. van Dooijeweert, I.W. Boukema, P. Arens .// Eucarpia. 2004. - P. 44-50.

80. Koreth, J. Microsatellites and PCR genome analysis / J. Koreth, J.J. O'Leary, J.O. McGee // The journal of pathology. 1996. - Vol. 178. -P. 239-248.

81. Kruszka, K. Linkage maps of morphological and molecular markers in lupin / K. Kruszka, B. Wolko II Proc. 9th Int. Lupin conf. Klink/Muritz, Germany. International Lupin Association. 1999. - P. 100-105.

82. Lagercrantz U. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates / U. Lagercrantz, H. Ellegren, L. Andersson // Nucleic acids research. 1993. - Vol. 21. - № 5. - P. 1111-1115.

83. Li, Y.-Ch. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review / Y.-Ch. Li et al. // Molecular ecology. 2002. -Vol. 11.-P. 2453-2465.

84. Liebhard, R. Development and characterization of 140 new microsatellites an apple {Malus x domestica Borkh.) / R. Liebhard et al. // Molecular breeding. —2002. -Vol. 10.-P. 217-241.

85. Lin, J.-J. Identification of molecular markers in soybean comparing RFLP, RAPD and AFLP DNA mapping techniques / J.-J. Lin et al. // Plant molecular biology reporter.-1996.-Vol. 14.-P. 156-159.

86. Lin, R. Development of a sequence-specific PCR marker linked to the gene "pauper" conferring low-alkaloids in white lupin (Lupinus albus L.) for marker assisted selection / R. Lin et al. // Molecular breeding. 2009. - Vol. 23. -P. 153-161.

87. Lin, R. Characterisation of genetic diversity and DNA fingerprinting of Australian chickpea (Cicer arietmum L.) cultivars using MFLP markers / R. Lin et al. // Australian journal of agricultural research. 2008. - Vol. 59. — P.707-713.

88. Lupins as crop plants: biology, production and utilization / Gladstones J.S., Atkins C.A., Hamblin J., eds. 1998. - P. 192.

89. MacPherson, J.M. Variability of the random amplified polymorphic DNA assay among thermal cyclers, and effects of primer and DNA concentration / J.M. MacPherson, P.E. Eckstein, A.A. Gajadhar // Molecular and cellular probes. -1993.-Vol. 7.-P. 293-299.

90. Meuneir, J.R. Factors affecting reproducibility of random amplified polymorphic DNA fingerprinting / J.R. Meuneir, P.A. Grimont // Research in microbiology. 1993. - Vol. 144. - P. 373-379.

91. Nelson, M.N. The first gene-based map of Lupinus angustifalius L.location of domestication genes and conserved synteny with Medicago truncatula 7 M:N. Nelson et al. // TAG Theoretical and applied genetics. 2006. - Vol. 113. - P 225238.

92. Pearl, H.M. Construction of a genetic map for Arabica coffee / H.M. Pearl et al. // Theoretical and applied genetics. 2004. - Vol. 108: - P. 829-835.

93. Penner, G.A. Reproducibiliy of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis among laboratories / G.A. Penner et al.'// PCR methods and applications. -1993a.-Vol. 2.-P. 341-345.1. WO

94. Penner, G.A. Identification of a RAPD marker linked to the oat stem rust gene Pg3 / G.A. Penner et al. // TAG Theoretical and applied genetics. 1993b. - Vol. 85.-P. 702-705.

95. Pradhan, A. Development of DNA fingerprinting keys for the identification of radish cultivars / A. Pradhan, G. Yan, J.A. Plummer // Australian journal of experimental agriculture. 2004. - Vol. 44. - P. 95-102.

96. Prevost, A. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars / A. Prevost, M.J. Wilkinson // TAG Theoretical and applied genetics. 1999. - Vol. 98. - P. 107-112.

97. Qiu, J. Evaluating genetic diversity of white lupin using polymerase chain reaction based RAPD technology / J. Qiu, E. van Santen, S. Tuzun // VII International Lupin Conference, April 18-23, 1993. Evora, Portugal. P. 51-53.

98. Rafalski, J.A. Genetic diagnostics in plant breeding: RAPDs, microsatellites and machines / J.A. Rafalski, S.V. Tingey // Trends in genetics. 1993. - Vol. 9. - P. 275-280.

99. Rakoczy-Trojanowska, M. Characteristics and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants / M. Rakoczy-Trojanowska, H. Bolibok // Cellular and molecular biology letters. 2004. - Vol. 9. -№2.-P. 221-238.

100. Reiter, R.S. Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and random amplified polymorphic DNAs / R.S. Reiter et al. // Proceedings of the national academy science. 1992. - Vol. 89. -P. 1477-1481.

101. Roy, A. Evaluation of genetic diversity in jute {Corchorus species) using STMS, ISSR and RAPD markers / A. Roy et al. // Plant breeding. 2006. - Vol. 125.-P. 292-297.

102. Saliba-Colombani, V. Efficiency of PFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome / V. Saliba-Colombani, M. Causse, L. Gervais., J. Philouse // Genome. 2000. - Vol. 43. - P. 29-40.

103. Shan X. Convertion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and weat / X. Shan, T.K. Blake, L.E. Talbert // TAG Theoretical and applied genetic. 1999. - Vol. 98. - P. 1072-1078.

104. Sica, M. ISSR markers show differentiation among Italian populations of Asparagus acutifolius L. / M. Sica et al. // BMC Genetics. 2005. - Vol. 6. - P. 6-17.

105. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis / E.M., Southern // Journal of molecular biology. 1975. Vol. 98 -№. 3. - P. 503-517.

106. Steele, K.P. Phylogenetic analysis of tribes Trifolieae and Vicieae, based on sequences of the plastid gene matK (Papilionoideae: Leguminosae) / K.P. Steele, M.F. Wojciechowski // Advances in Legume Systematics / Eds K. KHtgaard, A.

107. Bruneau. Part 10, High Level Systematics. Royal Botanic Garden, Kew. 2003. P. 355-370.

108. Talhinhas, P. AFLP, ISSR, RAPD markers reveal high levels of genetic diversity among Lupinus spp. / P. Talhinhas, J. Neves-Martins, J. Leitao // Plant breeding. 2003. - Vol. 122. - P. 507-510.

109. Tautz, D. Hypervariability af simple sequences as a general source for polymorphic DNA / D. Tautz // Nucleic acids research. 1989. - Vol. 17. — P. 6463-6471.

110. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos et al. // Nucleic acids research. 1995. - Vol. 23. - P. 4407-4414.

111. Waldron, J. Randomly amplified DNA fingerprinting: a culmination of DNA marker technologies based on arbitrarily-primed PCR amplification / J. Waldron et al. // Journal of biomedicine and biotechnology. 2002. - Vol. 2. - № 3. -P. 141-150.

112. Weber, J.L. Abundant class of human DNA polymorphism wich can be typed using the polymerase chain reaction / J.L. Weber, P.E. May // American journal of human-genetic. 1989. - Vol. 44. - P. 388-396.

113. Williams, J.G.K. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams et al. // Nucleic acids research. 1990. - Vol. 18.-P. 6531-6535.

114. Wolko, B. Molecular markers in genetic studies of Lupinus genus / B. Wolko // Hodowla rolin aklimatizacia i nasiennictwo. 1995. - Vol. 39. - P. 3-64.

115. Wu, K. Detection of microsatellite polymorphisms without cloning / K. Wu, R. Jones, L. Dannederger, P.A. Scolnik // Nucleic acids research. 1994. - Vol. 22. -P. 3257-3258.

116. Yaish, M.W.F. Isolation of (GA)n microsatellite sequences and description of a predicted MADS-box sequence isolated from common bean / M.W.F. Yaish, M. Perez de la Vega // Genetics, molecular, biology. 2003. - Vol. 26. — P. 337-342.

117. You, M. A PCR-based molecular marker applicable for marker-assisted selection for anthracnose disease resistance in lupin breeding / M. You et al. // Cellular and molecular biology letters. 2005. - Vol. 10. - P. 123-134.

118. Yu, K. Optimization of PCR program for RAPD analysis / K. Yu., K.P. Pauls // Nucleic acids research. 1992. - Vol. 20. - P. 2606.