Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ РЕМОНТАНТНОЙ МАЛИНЫ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ РЕМОНТАНТНОЙ МАЛИНЫ"

На правах рукописи

СОБОЛЕВ Владимир Васильевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ

ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ РЕМОНТАНТНОЙ МАЛИНЫ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в таборатории биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор В В Заякин

Официальные оппоненты —

Доктор биологических наук Загоскина Н В Кандидат биологических наук Данилова Т В

Ведущая организация —

Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства

Защита состоится ' * и <' > >' 2004 г в / / часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

МСХА

Автореферат разослан « ; » <«<

2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

Карлов Г И

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Род Rubus, подрод Ideaobatus, в настоящий момент является одним из самых наименее изученных, как в филогенетическом, так и в физиологическом плане. Эта ситуация отчасти объясняется тем, что для изучения малины крайне редко прибегали к использованию молекулярно-генетических методов . и пользовались ограниченным набором других методов. При создании современных культурных сортов малины широко использовалась межвидовая гибридизация с вовлечением геноплазмы таких видов как Rubus ideaus L, Rubus crataegifolius Bunge, Rubus odoratus L., Rubus occidentalis L., Rubus arcticus sfellarcticus G. Larson. В то же время из-за применения в селекции метода свободного опыления и опыления смесью пыльцы родительские формы многих сортов неизвестны. Это создает трудности при планировании дальнейшей селекции, составлении схем скрещиваний и т.д. Поэтому проведение генетического анализа является актуальным, как с научной точки зрения, так и с точки зрения практической селекции.

Молекулярно-генетические методы анализа, основанные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), за последние 20 лет стали одними из самых популярных и используются в настоящее время для изучения многих видов организмов. Они отличаются высокой эффективностью, производительностью, хорошей воспроизводимостью и относительной экономичностью. Позволяют выявлять молекулярные маркеры на морфофизиологические, в том числе хозяйственно ценные признаки.

Все вышеперечисленные достоинства в полной мере относятся к методу ISSR-PCR, основанному на амплификации межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК с помощью праймеров, созданных на основе того или иного миксросателлита.

1.2. Цель и задачи. Целью данной работы было изучение генетических взаимоотношений современных сортов малины обычного и ремонтантного типов и видов малины, использованных в селекции, а также «пастортизация», молекулярная идентификация этих сортов.

В ходе работы решались следующие задачи:

• подбор оптимальных условий выделения ДНК из листьев малины;

• выбор метода для молекулярно-генетического анализа малины; .

• изучении полиморфизма ампликонов и подбор наиболее эффективных праймеров;

• изучение генетического родства различных сортов, форм, и видов

малины;

цнб мсха

• идентификация и «паспортизация» сортов малины с помощью молекулярных маркеров,

• поиск молекулярных маркеров на хозяйственно-ценные признаки

13. Научная новизна. 1 Впервые проводился молекулярно-

генетический анализ ремонтантных сортов малины сечекции чл корр РАСХН ИВ Казакова, обладающих уникальными хозяйственно - биологическими признаками

2. Впервые для молекулярно-генетического анализа малины применен метод ГБвИ-РСК, позволивший у пяти видов и двадцати семи сортов малины изучить широкий спектр межмикросатедлитных постедоватетьностей, находящихся между различными типами микросателлитов Выявлен высокий уровень, как межвидивого так и межсортового полиморфизма межмикросатедлитных последовательностей малины. На основании данных о полиморфизме построены дендрограммы генетического родства исследованных видов и сортов малины

3. Впервые обнаружен молекулярный маркер на хозяйственно-пенный признак ремонтантности у малины

4 Впервые проведена генетическая паспортизация сортов малины на основании данных о полиморфизме, полученных с помощью 158Я-РСК метода

1.4. Практическая значимость. Показана возможность применения межмикросатедлитных маркеров для филогенетических исс"снований малины Предложен набор праймеров для анализа межмикросатетлитных последовательностей для маркирования генотипов малины и создания на их основе генетических формул сортов малины

Показана возможность использования межмикросатедлитных последовательностей для маркирования на хозяйственно-ценные признаки, в частности на ремонтантность

1.5. Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на Конференции молодых ученых «Биотехнология -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001), на международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» (Брянск, 2002), на V съезде общества физиологов растений России и на Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнолоши» (Пенза, 2003), на 2-й международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Украина, Харьков, 2003)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных

работ

1.6. Структура и объем работы. Диссертация состоит из _глав,

выводов, списка литературы, включающего _ наименований, в т.ч._

иностранных авторов. Материалы диссертации изложены на_ страницах

машинописного текста, содержат_таблиц,_рисунков и фотографий.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования поводились в лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА.

Был использован следующий растительный материал: 5 видов малины-

1. Rubits ideaus L. («Новость Кузьмина»),

2. Rubus crataegifolius Bunge,

3. Rubus odoratus L.,

4. Rubus occidentalis L., («Кумберленд»)

5. Rubus arcticus sfellarcticus G. Larson («Sofia» из коллекции ВИРа),

15 сортов ремонтантной малины сложного межвидового происхождения — Геракл, Бабье лето, Бабье лето-2, Абрикосовая, Заря вечерняя, Августина, Надежная, Элегантная, Снегирек, Autumn Bliss, Heritage, Брянская юбилейная, Золотые купола, Сентябрьская, Журавлик;

12 сортов малины с обычным типом плодоношения - Гусар, Беглянка, Спутница, Кокинская, Незнакомка, Бригантина, Ньюбург, Вольница, Бальзам, Брянская, Рубин брянский, Пересвет.

Все сорта предоставлены Кокинским опорным пунктом ВСТИСП.

ДНК выделяли по методике Дорохова и др (1997) и Van der Beek et al., (1991).

ISSR — и RAPD — праймеры подбирали после анализа литературных данных по эффективности их использования на других видах растений. Все Праймеры были синтезированы на ЗАО «Синтол», Москва.

Для проведения ISSR-PCR на видах и сортах малины было использовано 15 праймеров, последовательности ISSR-праймеров приведены в таблице 3.

Для проведения RAPD-PCR использовали б праймеров (таблица 1).

ISSR-PCR поводили по модифицированной методике Prévost и Wilkinson (1999). ISSR-PCR проводили по методике Williams et al., (1990).

Продукты PCR разделяли в 2 %-м агарозном геле с буфером ТБЕ 0,5 при напряжении 6 V/cm. После окрашивания бромистым этидием продукты PCR были визуализированы с помощью источника УФ света и фотографировались фотокамерой «Зенит-Е» на фотопленку микрат-300.

Электрофоретические профили продуктов ISSR-PCR и RAPD-PCR анализировали с покощью программы ONE-Dscan 1.3, CSP Inc.

Таблица 1

RAPD - праймеры

№ Код праймера Праймер

1 LUN-1 GCC ССТ CGTC

2 LUN-2 CGC CGC ТСС Т

3 LUN-3 GCG CGG САС Т

4 LUN-4 GGT GAT CAG G

5 LUN-5 GTG ССТ ААС С

6 LUN-6 CTGACGTCAC

Филогенетическая модеть родства видов и сортов малины была построена путем обработки данных ISSR-PCR с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего — UPGMA (Nei et al, 1983)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оптимизация условии выделения ДНК малины

Для проведения своих исследований мы выбрали два, наибочее часто встречающихся в литературе, экспресс метода выдетения ДНК Первый метод предложен Van der Beek et al, 1991, а второй - Дороховым и др , 1997

Однако данные методы оказались непригодными для выделения препаратов ДНК высокой частоты из растительного материала малины, отличающегося большим содержанием фенотьных соединений и полисахаридов В результате плохое качество препаратов ДНК мешало проведению PCR.

Дополнитечьные обработки фенол/хлороформом не привели к положительным изменениям, и мы ввели следующие модификации в методику Дорохова-

1) внесение нерастворимого поливинилпирролидона (поликар AT) при растирании образцов и дополнительных антиоксидантов в экстракционный буфер (2-меркаптоэтанол - 0,1 % и о-третбутилоксианизол — 50 мг/л),

2) замена спиртового осаждения ДНК на осаждение 20 % ПЭГ-6000,

3) доочистка сильнозагрязненной ДНК ЮМ LiCl,

Изменения метода Van der Beek et al, (1991) не принесли желаемого результата, а модификация метода Дорохова и др , (1996) позволила получить

препараты ДНК малины высокого качества, однородные по концентрации и не деградированные (рис. 1).

По результатам спектрофотометрического анализа была построена спектрограмма, на которой наблюдается только один четко выращенный пик с максимумом при 260 нм и соотношением экстинкций 260 нм/ 280 нм, равным в среднем 1,76, что свидетельствует о высокой чистоте препаратов ДНК.

Для сравнения влияния способа выделения растительной ДНК на характер ISSR-PCR спектров нами была проведена амплификация препаратов ДНК, выделенных тремя методами. Как видно из рисунка 2, ISSR-PCR спектры в ряде случаев различаются в зависимости от способа выделения. Так, например, спектры препаратов, выделенных методом Дорохова и методом модифицированном нами, в большинстве случаев дают сходные наборы полос.

ISSR-PCR анализ ДНК, выделенной разными методами, проводился в трехкратном повторении. Каждая повторность состояла из 12 образцов ДНК одного и того же сорта малины, то есть всего для каждого из сравниваемых методов проводилось выделение ДНК из 36 проб. Беря отношение треков, идентичных друг другу, по количеству и молекулярным весам бэндов, к общему числу треков мы подсчитали процент совпадения для каждого метода по повгорностям. В среднем процент совпадения для метода по Van der Beek составил 19, 41 %, для метода по Дорохову - 97, 23 % и для модифицированного метода - 100 %.

Рис. 1 Электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле препаратов ДНК, выделенных разными методами из разных образцов малины. 1,5,9 - Rubus odoratus L, 2,6,10 - Rubus occidentalis L., 3,7,11 - Rubus crataegifolius Bunge, 4,8,12 - Rubus ideaus L.

А - ДНК выделенная модифицированным нами методом, В — ДНК выделенная методом Van der Веек, С - ДНК выделенная по методу Дорохова.

(AG)8YG (GA)8C (GA)8YC (CA)8RC

Рис. 2 ISSR-PCR профили малины генотипа 14-205-27 на ДНК, выделенной разными методами 1 - метод по Van der Beek, 2 - метод Дорохова, 3 - метод, модифицированный нами М - маркер размеров (ДНК pUC-19/MspI) 501,489, 404, 331, 242, 1«0, 147, 111,110, 67

3.2. Выбор метода молекулярно-генетического анализа

При выборе метода для молекулярно-генетического анализа малины мы, прежде всего, исходили из того, что структура и организация генома малины пока очень плохо изучены и, следоватечьно, необходимо опираться на те методы, которые не требуют предваритечьного знания о последовательности анализируемой ДНК Также необходимыми условиями при выборе метода для нас были: простота использования, скорость проведения анализа и дешевизна

Исходя из вышеперечисленного, мы остановили свой выбор на двух методах, в основе которых лежит принцип полимеразной цепной реакции, это RAPD метод (Randomly Amplified Polymorphic DNA) и ISSR метод (Inter simple sequence repeat) Оба этих метода основаны на применении праймеров с произвольной последовательностью и отличаются быстротой проведения реакции и относительной дешивизной

Сравнительный анализ двух методов проводился на десяти сортах ремонтантной малины Геракл, Бабье лето-2, Абрикосовая, Элегантная, Заря вечерняя, Августина, Надежная, Снегирек, Золотые купола, Брянская юбилейная, десяти сортов малины с обычным типом плодоношения Беглянка,

Гусар, Бригантина, Незнакомка, Брянская, Спутница, Кокинская, Ньюбург, Вольница, Бальзам; четырех видах: Rubus idaeus L. («Новость Куцзьмина»), Rubus crataegifolius Bunge, Rubus odoratus L., Rubus occidentalis L.

В работе использовались: 6 ISSR-праймеров — NAM-1, NAM-2, NAM-3, NAM-4, NAM-5, NAM-6, NAM-7, NAM-8, NAM-9, (Таблица 1); и 6 RAPD-праймеров - LUN-1, LUN-2, LUN-3, LUN-4, LUN-5, LUN-6 (таблица 2). Все проанализированные праймеры как ISSR, так и RAPD амштефицировали полиморфные бэнды. ISSR-PCR и RAPD-PCR проводили в трех повторностях, с трехкратным повторением.

Все праймеры как RAPD, так и ISSR дали четкие электрофоретические профили для каждого из генотипов малины. Однако при каждом последующем повторении опыта в RAPD спектрах наблюдалось несовпадение многих как минорных, так и мажорных фрагментов. А в ISSR спектрах подобные отклонения наблюдались в редких случаях, и, в основном, это происходило за счет вариации минорных низкомолекулярных фрагментов. В связи с этим приходилось учитывать только те бэнды, которые воспроизводились во всех трех повторностях.

Всего с помощью шести RAPD - праймеров был получен 171 ампликон, из которых полиморфными оказались лишь 98, что составило 57,3 %, а с помощью ISSR — праймеров было выявлено 159 ампликонов, из которых 144 полиморфные, что составило - 90,5 %. Как видно из представленных данных, несмотря на то, что общее число бэндов, полученных при проведении RAPD-PCR, значительно превышает число бэндов ISSR-PCR, количество детектируемых полиморфных полос RAPD-PCR намного ниже, чем у ISSR-PCR.

Таблица 2

Сравнение эффективности методов RAPD- и ISSR-PCR по проценту

метод Общее число бэндов Число полиморфных бэндов, шт Процент полиморфизма. %

ремонтантных обычных видов Всех образцов ремонтантных обычных видов Всех образцов ремонтантных | обычных видов 1 Всех образцов

RAPD 105 107 138 171 30 26 72 98 28,6 24,3 52,2 57,3

ISSR 116 113 114 159 86 84 91 144 74 74,3 79,8 90,5

Поэтому, учитывая тот факт, что процент детектируемого полиморфизма при проведении RAPD-PCR лежит в интервале 24,3 - 57,3 %, а минимальный процент полиморфизма ISSR-PCR составил 74 %, а также беря во внимание плохую воспроизводимость результатов, мы решили отказаться от применения RAPD-PCR и в качестве основного метода исследований выбрали ISSR-PCR ввиду его высокой информативности и надежности

3.3. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК малины на межвидовом уровне

Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов и сортов малины было использовано 15 ISSR - праймеров NAM-1 -NAM-15 каждый из 15 праймеров был использован для проведения ISSR-PCR геномной ДНК каждого генотипа малины в грех повторностях, с трехкратным повторением

Продукты амплификации были получены для одиннадцати из пятнадцати протестированных праймеров Десять праймеров обеспечили амплификацию почиморфных фрагментов Пример полученных профилей с использованием праймеров NAM-4 и NAM-5 представлен на рисунке 3, где молекулярная масса исследуемых фрагментов варьировала в диапазоне от 150 до 1400 пни был четко выражен ряд мажорных ампликонов, характерных для всех образцов

В цетом эффективными оказались точько 8 из 15 ISSR- праймеров NAM-1, NAM-2, NAM-3, NAM-4, NAM-5, NAM-6, NAM-7, VAM-8 С помощью этих восьми праймеров были получены четкие этектрофоретические профили для каждого из генотипов малины

При сравнении ISSR-профилей образцов малины был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последоватепьностей ДНК (таблица 3) При этом анализировали как мажорные фрагменты, так и минорные, ввиду высокой воспроизводимости последних

С помощью восьми выбранных праймеров оценивали генетическое разнообразие видов и сортов малины Было проанализировано 223 ампликона, из которых полиморфными оказались 202, что составило 90,6 % В цетом наблюдалось широкое варьирование генетического полиморфизма в зависимости от праймера и группы анализируемых образцов Всего учитывалось 4 группы образцов виды малины, ремонтантные сорта, обычные сорта и общая группа, объединяющая все сорта и виды Самый высокий уровень полиморфизма наблюдался в объединенной группе сортов и видов, где он варьировал от 71,4 до 96,8 %, и в среднем составил 89,2, что вполне логично

можно объяснить тем, что в данной группе наряду с сортами учитывались данные по отдельным видам, которые имеют большое количество уникальных фрагментов, специфичных только для данного вида и повышающий общий уровень полиморфизма. Межвидовой полиморфизм колебался в пределах от 66,7 до 94,7 % и в среднем по восьми праймерам составил 82,75 %. Наименьший же уровень полиморфизма наблюдался в группе неремонтантных сортов, где он составил 45,4 % однако, в среднем он составил 74,6 % и был очень близок к среднему уровню полиморфизма ремонтантных сортов — 74,1 %. В целом, как видно из полученных результатов, геном малины отличается высокой степенью полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК.

Таблица 3

Полиморфизм длин межмикросателлитных последовательностей выявленный при сравнении электрофоретических КБЛ-профилей тридцати двух образцов малины

№ Код праймера Праймер Число фрагментов

общее полиморфных

1 ИАМ-1 (АС)8УА 32 31

2 ЫАМ-2 (АОвУй 14 10

3 КАМ-3 (А 32 30

4 ЫАМ-4 (ОА)8С 31 28

5 ЫАМ-5 (ОА)8УС 30 26

6 ЫАМ-6 (СА)8ИС 27 23

7 ИАМ-7 (СА)8А 30 29

8 ИАМ-8 (АС)8УТ 27 25

9 ЫАМ-9 (вТ)8Т 2 2

10 ЫАМ-Ю (АС)8УО 3 0

11 ИАМ-И (стугг 0 0

12 КАМ-12 (СТ)8а шлейф

13 ЫАМ-13 (АО)8С 0 0

14 МАМ-14 Сга)8а 1 1

15 : ЫАМ-15 (СА)8СТ шлейф

12345678 Ml 1234 5678M2

< ? •

(GA)sAC (GA)jYC

Рис 3. ISSR профили видов и сортов малины, полученные путем раздетения продуктов ПЦР в 2% агарозном reie 1 - Брянская юбилейная (р), 2 - Зочотые купола (р) , 3 - Журавлик(р) , 4 - Кокинская, 5 - Спутница, 6 -Снегирек (р) , 7 - Беглянка, 8 - Rubus ideaus L (Новость Кузьмина) *(р) -ремонтантные сорта, М1 - маркер размеров (АДНК/EcoRI т- Hmd III), М2 -маркер размеров (1216, 1045, 926, 632, 313, 241)

3.4. Использование ISSR - маркеров для изучения филогенетических связей сортов и видов ремонтантной малины

Данные, потученные при анализе электрофоретических профилей, были использованы дтя построения дендрограмм генетического родства тридцати двух исследованных образцов малины, а именно пятнадцати сортов ремонтантного типа, двенадцати сортов с обычным типом плодоношения и пяти диких видов Для этого данные ISSR-PCR были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков присутствие фрагмента принималось за 1, отсутствие фрагмента принималось за 0 Приведенные в такой вид данные были проанализированы с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Nei et al, 1983) с помощью пакета программ STATISTICA 5 0 ("Microsoft Со USA)

В дендрограмме, построенной на основании результатов, полученных при использовании всех восьми праймеров, наблюдалась четкая кластеризация по группам исследуемых образцов В частности, разделились все ремонтантные сорта и сорта с летним типом плодоношения, образовав отдельные кластеры В кластер неремонтантных сортов также попал стародавний сорт Новость Кузьмина, который в наших исследованиях являлся представителем вида малины красной Rubus idaeus L

Данные, полученные с использованием каждого праймера в отдельности, были использованы для построения дендрограмм, в которых не наблюдалось четкого разделения анализируемых групп на кластеры, однако, при этом можно было наблюдать связь некоторых видов с отдельными сортами При этом выявляются отдельные ампликоны общие для некоторых сортов и диких видов малины. Это подтверждает наличие генетического материала диких видов в геномах современных сортов Например на рисунке 5 показано, что при амплификации с праймером 5 малины Боярышниколистная оказывается связана с сортами Бабье лето2. Золотые купола и Сентябрьская

Unweighted pair-group average Euclidean distances

Геракл

Заря вечерняя Августина Снегирек Отом Блисс Брянская юбилейная Надежная Элегантная Сентябрьская Журавлик Золотые купола Бабье лето-2 Бабье лето-1 Абрикосовая Херитидж

Гусар Бригантина Беглянка Спутница Незнакомка Вольница Брянская Бальзам Рубин брянский Кокинская Ньюбург Перес вот

Л (~Нояогь Кузлиптя")

Я. оссМтМаЯа Л. *7

Я. «АпйпЬ Я. сга&шдМоОия Випдл Я. тгсНсия яЛНягсЫсияв. Випдт

4 5 6 7 8 9

Linkage Distance

Рис 4. Дендрограмма генетических взаимоотношений видов и сортов малины, построенная на основании результатов, полученных при испочьзовании всех восьми ШБЯ - праймеров

Херитидж- ремонтантные сорта. Спутница -неремонтантные сорта, Я. <м1ошю £ - дикие виды

—1 -1

н

>-

При амплификации праймерами выявляется также некоторое родство сорта Ньюбург с малиной боярышниколистной, а малины душистой с сортами Пересвет, Надежная, Сентябрьская. Наибольшая связь с поленикой проявляется у сорта Сентябрьская, Бабье лето1, Журавлик и Снегирек. Вообще, сорт Сентябрьская является одной из важнейших исходных форм для селекции и проявляет родство сразу с четырьмя дикими видами малины: Боярышниколистной, Душистой, Поленикой и малиной черной.

Unweighted pair-group average Euclidean distances

„ Бабье ле(гю% Зодотыекупола Сентябрьская

Я. сгшЬюдНо/Ш Випдв Кокинская Бальзам

КМип1/МмеяфаштЛ

Бабье лето-7 Заоя вечерняя Элегантная Авгуоспина Отом ьписс _ П№ар Брянская к&меиная

Щдежная

БоигантЛна* Вольница Брянская Пересвет Беглянка ..Спутница Нвзшкомка

Рубин брянс^ А оАтСш L

Абрикосовая Херитиож Л акИст & Шшвв

Я. вчШвЬМ Ё^рчгмвврпщщ}

1,0 1,5 2,0 Linkage Distance ,

Рис. 5. Дендрограмма генетических взаимоотношений видов и сортов малины, построенная на основании результатов, полученных при использовании праймера ИАМ-5

Херитидж- ремонтантные сорта, Спутница -неремонтантные сорта, А оЛотиз Ь — дикие виды.

3.5. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации в паспортизации сортов малины

Для паспортизации мы использовали 8 ISSR-праймеров, которые были выделены, как наиболее результативные, на предыдущих этапах работы Критерием отбора фрагментов амплификации фрагментов ДНК стужила частота встречаемости ампликона у исследуемой группы сортов, так чтобы она находилась в пределах 0,4-0,6 Однако у праймеров NAM-2 и NAM-7 частота встречаемости ампликонов была в пределах 0,7 - 0,9 и 0,1- 0,3, что делало их применение мало эффективным в паспортизации сортов

Данные по всем полиморфным локусам, с встречаемостью, укладывающейся в вышеуказанный интервал, записывали в виде матрицы 1-присутствие полосы, 0- отсутствие

Далее каждому амгпикону данного праймера, начиная с самого высокомолекулярного, присваивалась буква латинского алфавита (таблица 6) На основании данного шабюна была записана формула или так называемый паспорт сорта, где буква - это код или наименование бэнда, а нижний индекс -код праймера, детектирующего данный бэнд (таблица 7)

Таблица 6

Характеристика фрагментов выбранных дтя паспортизации образцов

малины

Код праймера Праймер Количество Размер PCR КодPCR

полиморфных чокуса, пн локуса

PCR j'iokvcob

NAM-1 (AC)8YA 3 959 А

454 В

272 С

NAM-3 (AC)sG 2 1048 А

704 В

NAM-4 (GA)8C 3 842 А

744 В

358 С

NAM-5 (GA)gYC 2 762 А

562 В

NAM-6 (CA)8RC *> 1132 А

380 В

NAM-8 (AG)8YT 779 А

305 В

Таблица 7

№ п.п. Сорт Паспорт сорта

1 Геракл a^ciajbsatb^aajaeagbg

2 Бабье лето а,в]с,азвзв4с4в5аба8в8

3 Бабье лето-2 aibiciajbiasbjaiasb,

4 Абрикосовая в1с1а4в4с4в8

5 Заря вечерняя aibic^atbiciajbjbg

б Августина б1с,вза4в4с4а5в5а4а8в8

7 Надежная babjbicibjaeasbg

8 Элегантная babsbiasbjafasbs

9 Снегирек bicib3b4c4asbsa«asb8

10 Autumn Bliss aib,cib3a4b4c4a3b5a6b6a8b8

11 Heritage в 1с,вза4в4с4а5в5абв6а8в8

12 Брянская юбилейная с,вза4в4а5а8в8

13 Золотые купола bicib4c4a5a6b6b8

14 Сентябрьская в1с,а4в4с4а5абв6в8

15 Журавлик а,в ,с ,в3а4в4с4 а5абв8

16 Гусар aiasbjaiasb^sbg

17 Беглянка aiasbabjasbeas

18 Спутница аза4абвба8в8

19 Кокинская а1в3а5в5а«вб

20 Незнакомка В1АЗС4В8

21 Бригантина albiaabjbsbeaa

22 Ньюбург адаевба,

23 Вольница а1а3в3а4в5а8

24 Бальзам bibjaiajbjaibias

25 Брянская а,аза4в5

26 Рубин брянский в1а3в3а4в6

27 Пересвет АдА«В6

28 Новость Кузьмина в5а«в6

3.6. Молекулярное маркирование рпизнака ремонтантное™ у малины с использованием ISSR-PCR

При использовании праймера (AQ8YA был обнаружен специфический маркерный фрагмент длиной около 270 п н, присутствующий во всех 15 иссчедуемых сортах ремонтантной малины Можно предположить, что данный фрагмент является маркером признака ремонтантности малины, так как при проведении PCR анализа сортов малины с обычным неремонтантным типом плодоношения он не амплифицировался (рисунок 6)

I

fe^f

3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14

t * • - л

„ «я*. я#

«Wir tтрт-

^ цч1-

^НР4 тТОж

270

П.Н

Рис 6 Молекулярное маркирование ремонтантных сортов малины Неремонтартные сорта' 1-Новость Кузьмина, 2-Пересвет, 3- Рубин брянский, 4-Брянская, 5- Бальзам, 6- Вольница, Ремонтантные сорта 7-Элегантная, 8-Надежная, 9-Августина, 10- Заря вечерняя, 11- Абрикосовая, 12-Бабье лето1, 13-Бабье лето2, 14-Геракл, М-маркер размеров (1216,1045, 926,632,313,241)

Маркерный фрагмнт бьш вырезан из геля и клонирован в плазмиду с целью дальнейшего его изучения

выводы

1. Выявлен высокий полиморфизм по межмикросателлитным последовательностям ДНК у тридцати двух образцов малины. Межвидовой полиморфизм в среднем составил 82,75%, полиморфизм между ремонтантными сортами- 74,1% и полиморфизм между неремонтантными сортами - 74,6%.

2. На основании КВЯ-маркеров впервые построены дендрограммы генетического родства, включающие пятнадцать ремонтантных сортов, двенадцать сортов с обычным типом плодоношения и пять видов малины. Получено четкое разделение исследуемых образцов на два кластера: -ремонтантных сортов и сортов с летним типом плодоношения.

3. Выявлено присутствие гермаплазмы диких видов малины в геномах сортов современной селекции на основании результатов, полученных при использовании в качестве праймеров (ОА)8УС, (СА)8ЯС, (СА)8А, (АС)8в — межмикросателлитных последовательностей.

4. По данным 188]1-РСК были составлены генетические «формулы» 28 сортов малины. Все «формулы» оказались уникальными, что подтверждает высокую эффективность использования 185Р1-маркеров для паспортизации сортов малины.

5. Выявлен специфический межмикросателлитный маркерный фрагмент на признак ремонтантности у малины, длиной около 270 п.н.

6. Установлено, что использование метода КБИ-РСЯ для молекулярно-генетического исследования малины намного эффективнее метода КАРВ-РСЯ по проценту выявляемого полиморфизма, как межвидового (на 27,6%), так и внутривидового (на 50%), и по воспроизводимости результатов.

7. Создана модификация метода выделения ДНК по Дорохову, заключающаяся в внесение поликлар АТ и дополнительных антиоксидантов (2-меркаптоэтанол - 0,1 % и о-третбутилоксианизол — 50 мг/л)в экстракционный буфер, а также в замене спиртового осаждения ДНК на осаждение 20% ПЭГ - 6000.

Подобранные условия позволяют получать препараты ДНК высокого качества из тканей малины, которая отличается высоким содержанием фенольных соединений.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Соболев В В , Заякин В В , Нам ИЛ Молекулярное маркирование видов, сортов и гибридов малины с помощью ИБЯ- и ИАРБ-РСК Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии», 3-6 декабря 2002 года, Брянск

2 Соболев В В , Заякин В В , Нам И Я Использование [БЭЯ- и ЯАРБ-РСЯ для молекулярного маркирования малины Сборник тезисов 2-й международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», 19-23 мая 2003 года, Харьков

3. Соболев В В , Заякин В В , Нам И Я Характеристика полиморфизма межвидовых ремонтантных гибридных форм малины по физиологическим признакам и ^БЯ-РСЯ молекутярным маркерам Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России и международной конференции «Физиочогия растений - основа фитобиотехнологии», 15-21 сентября 2003 года, Пенза

4 Соболева А Г, Собочев В В Использование ИАРО-РСЯ для молеку ирного маркирования сортов и видов малины Сборник научных работ молодых ученых - аграриев центрального федерального округа «Молодые ученые - аграрной науке и производству», 2003, Брянск

5 Ощепков А В , Соболев В В Оптимизация условий выделения ДНК малины Сборник научных работ молодых ученых - аграриев центрального федерального округа «Молодые ученые - аграрной науке и производству», 2003, Брянск

Автор выражает глубокую признательность своему науному руководителю, профессору кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии д.б.н. В.В. Заякину и зав. лабораторией биотехнологии, к.б.н. И-Я. Нам за огромную помощ при проведении исследований, обсуждении результатов изложенных в диссертационной работе при ее подготовке.

Автор признателен заведующему кафедрой плодоовощеводства Брянской ГСХА, член.корр. РАСХН И. В. Казакову за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор благодарит д.б.н. Голденкову И.В., к.б.н. Ралдугину Г. Н. за ценные советы и участие при подготовке

Автор благодарен заведующему кафедрой с.-х. биотехнологии МСХА им. К. А, Тимирязева, академику РАСХН В. С. Шевелухе за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор сердечно благодарит зав. лабораторией регуляторов роста МСХА, к.б.н. Г.И. Карлова за неоценимую помощь оказанную им при проведении исследований, а также выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку сотрудникам кафедры с.-х. биотехнологии МСХА Г.Н. Андреевой, А. Н, Сахаровой, ИА. Фесенко и М.Ю. Куклеву.

Автор благодарит сотрудников лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА А. Г. Соболеву, Е.Л. Зуеву, А. В. Озеровского, В. В. Ефименко за подднржку и дружеское отношение.

Усл. пл. 1,16 Зак. 258 Тираж 100 экз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44