Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование метода полимеразной цепной реакции для генетического маркирования ремонтантной малины

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Использование метода полимеразной цепной реакции для генетического маркирования ремонтантной малины"

На правахрукописи

СОБОЛЕВ Владимир Васильевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ

ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ РЕМОНТАНТНОЙ МАЛИНЫ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии.

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор В. В. Заякин

Официальные оппоненты -

Доктор биологических наук Загоскина Н.В. Кандидат биологических наук Данилова Т.В.

Ведущая организация -

Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства

Защита состоится ¿>С> Ш/ОИЛ 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

МСХА.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Род Rubus, подрод Ideaobatus, в настоящий момент является одним из самых наименее изученных, как в филогенетическом, так и в физиологическом плане. Эта ситуация отчасти объясняется тем, что для изучения малины крайне редко прибегали к использованию молекулярно-генетических методов и пользовались ограниченным набором других методов. При создании современных культурных сортов малины широко использовалась межвидовая гибридизация с вовлечением геноплазмы таких видов как

Bunge, Rubus odoratus L., Rubus occidentalis L., Rubus arcticus sfellarcticus G. Larson. В то же время из-за применения в селекции • метода свободного опыления и опыления смесью пыльцы родительские формы многих сортов неизвестны. Это создает трудности при планировании дальнейшей селекции, составлении схем скрещиваний и т.д. Поэтому проведение генетического анализа является актуальным, как с научной точки зрения, так и с точки зрения практической селекции.

Молекулярно-генетические методы анализа, основанные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), за последние 20 лет стали одними из самых популярных и используются в настоящее время для изучения многих видов организмов. Они отличаются высокой эффективностью, производительностью, хорошей воспроизводимостью и относительной экономичностью. Позволяют выявлять молекулярные маркеры на морфофизиологические, в том числе хозяйственно ценные признаки.

Все вышеперечисленные достоинства в полной мере относятся к методу ISSR-PCR, основанному на амплификации межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК с помощью праймеров, созданных на основе того или иного миксросателлита.

1.2. Цель и задачи. Целью данной работы было изучение генетических взаимоотношений современных сортов малины обычного и ремонтантного типов и видов малины, использованных в селекции, а также «пастортизация», молекулярная идентификация этих сортов.

В ходе работы решались следующие задачи:

• подбор оптимальных условий выделения ДНК из листьев малины;

• выбор метода для молекулярно-генетического анализа малины;

• изучении полиморфизма ампликонов и подбор наиболее эффективных праймеров;

• изучение генетического родства различных сортов, форм, и видов малины;

рос национальная i библиотека |

ClltTtpty

03 Ю0>

• идентификация и «паспортизация» сортов малины с помощью молекулярных маркеров;

• поиск молекулярных маркеров на хозяйственно-ценные признаки.

13. Научная новизна. 1. Впервые проводился молекулярно-

генетический анализ ремонтантных сортов малины селекции чл. корр. РАСХН И.В. Казакова, обладающих уникальными хозяйственно — биологическими признаками.

2. Впервые для молекулярно-генетического анализа малины применен метод В8Я-РСЯ, позволивший у пяти видов и двадцати семи сортов малины изучить широкий спектр межмикросателлитных последовательностей, находящихся между различными типами микросателлитов. Выявлен высокий уровень, как межвидивого так и межсортового полиморфизма межмикросателлитных последовательностей малины. На основании данных о полиморфизме построены дендрограммы генетического родства исследованных видов и сортов малины.

3. Впервые обнаружен молекулярный маркер на хозяйственно-ценный признак ремонтантности у малины.

4. Впервые проведена генетическая паспортизация сортов малины на основании данных о полиморфизме, полученных с помощью В8Я-РСЯ метода.

1.4. Практическая значимость. Показана возможность применения межмикросателлитных маркеров для филогенетических исследований малины. Предложен набор праймеров для анализа межмикросателлитных последовательностей для маркирования генотипов малины и создания на их основе генетических формул сортов малины.

Показана возможность использования межмикросателлитных последовательностей для маркирования на хозяйственно-ценные признаки, в частности на ремонтантность.

1.5. Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на Конференции молодых ученых «Биотехнология -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001), на международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» (Брянск, 2002), на V съезде общества физиологов растений России и на Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на 2-й международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Украина, Харьков, 2003)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

1.6. Структура и объем работы. Диссертация состоит из_глав,

выводов, списка литературы, включающего_наименований, в т.ч._

иностранных авторов. Материалы диссертации изложены на_страницах

машинописного текста, содержат таблиц,_рисунков и фотографий.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования поводились в лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА.

1. Rubus ideaus L. («Новость Кузьмина»), >1_

2. Rubus crataegifolius Bunge,

3. Rubus odoratus L.,

4. Rubus occidentalis ¿..(«Кумберленд»)

5. Rubus arcticus sfellarcticus G. Larson («Sofia» из коллекции ВИРа),

15 сортов ремонтантной малины сложного межвидового происхождения -Геракл, Бабье лето, Бабье лето-2, Абрикосовая, Заря вечерняя, Августина, Надежная, Элегантная, Снегирек, Autumn Bliss, Heritage, Брянская юбилейная, Золотые купола, Сентябрьская, Журавлик;

12 сортов малины с обычным типом плодоношения - Гусар, Беглянка, Спутница, Кокинская, Незнакомка, Бригантина, Ньюбург, Вольница, Бальзам, Брянская, Рубин брянский, Пересвет.

Все сорта предоставлены Кокинским опорным пунктом ВСТИСП.

ДНК выделяли по методике Дорохова и др (1997) и Van der Beek et al., (1991).

ISSR - и RAPD - праймеры подбирали после анализа литературных данных по эффективности их использования на других видах растений. Все Праймеры были синтезированы на ЗАО «Синтол», Москва.

Для проведения ISSR-PCR на видах и сортах малины было использовано 15 праймеров, последовательности ISSR-праймеров приведены в таблице 3.

Для проведения RAPD-PCR использовали 6 праймеров (таблица 1).

ISSR-PCR поводили по модифицированной методике Prevost и Wilkinson (1999). ISSR-PCR проводили по методике Williams et al., (1990).

Продукты PCR разделяли в 2 %-м агарозном геле с буфером ТБЕ 0,5 при напряжении 6 V/см. После окрашивания бромистым этидием продукты PCR были визуализированы с помощью источника УФ света и фотографировались фотокамерой «Зенит-Е» на фотопленку микрат-300.

Электрофоретические профили продуктов ISSR-PCR и RAPD-PCR анализировали с помощью программы ONE-Dscan 1.3, CSP Inc.

Таблица 1

RAPD - праймеры

Код праймера Праймер

1 LUN-1 GCCCCTCGTC

2 LUN-2 CGCCGCTCCT

3 LUN-3 GCGCGGCACT

4 LUN-4 GGTGATCAGG

5 LUN-5 GTGCCTAACC

6 LUN-6 CTGACGTCAC

Филогенетическая модель родства видов и сортов малины была построена путем обработки данных ISSR-PCR с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего - UPGMA (Nei et al., 1983).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оптимизация условий выделения ДНК малины

Для проведения своих исследований мы выбрали два, наиболее часто встречающихся в литературе, экспресс метода выделения ДНК. Первый метод предложен Van der Beek et al., 1991, а второй - Дороховым и др., 1997.

Однако данные методы оказались непригодными для выделения препаратов ДНК высокой частоты из растительного материала малины, отличающегося большим содержанием фенольных соединений и полисахаридов. В результате плохое качество препаратов ДНК мешало проведению PCR.

Дополнительные обработки фенол/хлороформом не привели к положительным изменениям, и мы ввели следующие модификации в методику Дорохова:

1) внесение нерастворимого поливинилпирролидона (поликар AT) при растирании образцов и дополнительных антиоксидантов в экстракционный буфер (2-меркаптоэтанол - 0,1 % и о-третбутилоксианизол - 50 мг/л);

2) замена спиртового осаждения ДНК на осаждение 20 % ПЭГ-6000;

3) доочистка сильнозагрязненной ДНК ЮМ LiCl;

Изменения метода Van der Beek et al., (1991) не принесли желаемого результата, а модификация метода Дорохова и др., (1996) позволила получить

препараты ДНК малины высокого качества, однородные по концентрации и не деградированные (рис.1).

По результатам спектрофотометрического анализа была построена спектрограмма, на которой наблюдается только один четко выращенный пик с максимумом при 260 нм и соотношением экстинкций 260 нм/ 280 нм, равным в среднем 1,76, что свидетельствует о высокой чистоте препаратов ДНК.

Для сравнения влияния способа выделения растительной ДНК на характер ISSR-PCR спектров нами была проведена амплификация препаратов ДНК, выделенных тремя методами. Как видно из рисунка 2, ISSR-PCR спектры в ряде случаев различаются в зависимости от способа выделения. Так, например, спектры препаратов, выделенных методом Дорохова и методом модифицированном нами, в большинстве случаев дают сходные наборы полос.

ISSR-PCR анализ ДНК, выделенной разными методами, проводился в трехкратном повторении. Каждая повторность состояла из 12 образцов ДНК одного и того же сорта малины, то есть всего для каждого из сравниваемых методов проводилось выделение ДНК из 36 проб. Беря отношение треков, идентичных друг другу, по количеству и молекулярным весам бэндов, к общему числу треков мы подсчитали процент совпадения для каждого метода по повторностям. В среднем процент совпадения для метода по Van der Beek составил 19, 41 %, для метода по Дорохову - 97, 23 % и для модифицированного метода - 100 %.

Рис. 1 Электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле препаратов ДНК, выделенных разными методами из разных образцов малины. 1,5,9 - Rubits odoratus L., 2,6,10 - Rubus occidentalis L., 3,7,11 - Rubus crataegifolius Bunge, 4,8,12 - Rubits ideaus L.

А - ДНК выделенная модифицированным нами методом; В - ДНК выделенная методом Van der Веек; С - ДНК выделенная по методу Дорохова.

Рис. 2. ISSR-PCR профили малины генотипа 14-205-27 на ДНК, выделенной разными методами: 1 - метод по Van der Веек, 2 - метод Дорохова, 3 - метод, модифицированный нами. М — маркер размеров (ДНК pUC-19/MspI). 501, 489, 404, 331,242,190,147, 111, 110,67.

3.2. Выбор метода молекулярно-генетического анализа

При выборе метода для молекулярно-генетического анализа малины мы, прежде всего, исходили из того, что структура и организация генома малины пока очень плохо изучены и, следовательно, необходимо опираться на те методы, которые не требуют предварительного знания о последовательности анализируемой ДНК. Также необходимыми условиями при выборе метода для нас были: простота использования, скорость проведения анализа и дешевизна.

Исходя из вышеперечисленного, мы остановили свой выбор на двух методах, в основе которых лежит принцип полимеразной цепной реакции, это RAPD метод (Randomly Amplified Polymorphic DNA) и IS SR метод (Inter simple sequence repeat). Оба этих метода основаны на применении праймеров с произвольной последовательностью и отличаются быстротой проведения реакции и относительной дешивизной.

Сравнительный анализ двух методов проводился на десяти сортах ремонтантной малины: Геракл, Бабье лето-2, Абрикосовая, Элегантная, Заря вечерняя, Августина, Надежная, Снегирек, Золотые купола, Брянская юбилейная; десяти сортов малины с обычным типом плодоношения: Беглянка,

Гусар, Бригантина, Незнакомка, Брянская, Спутница, Кокинская, Ньюбург, Вольница, Бальзам; четырех видах: Rubus idaeus L. («Новость Куцзьмина»), Rubus crataegifolius Bunge, Rubus odoratus L., Rubus occidentalis L.

В работе использовались: 6 ISSR-праймеров - NAM-1, NAM-2, NAM-3, NAM-4, NAM-5, NAM-6, NAM-7, NAM-8, NAM-9, (Таблица 1); и 6 RAPD-праймеров - LUN-1, LUN-2, LUN-3, LUN-4, LUN-5, LUN-6 (таблица 2). Все проанализированные праймеры как ISSR, так и RAPD амплифицировали полиморфные бэнды. ISSR-PCR и RAPD-PCR проводили в трех повторностях, с трехкратным повторением.

Все праймеры как RAPD, так и ISSR дали четкие электрофоретические профили для каждого из генотипов малины. Однако при каждом последующем повторении опыта в RAPD спектрах наблюдалось несовпадение многих как минорных, так и мажорных фрагментов. А в ISSR спектрах подобные отклонения наблюдались в редких случаях, и, в основном, это происходило за счет вариации минорных низкомолекулярных фрагментов. В связи с этим приходилось учитывать только те бэнды, которые воспроизводились во всех трех повторностях.

Всего с помощью шести RAPD - праймеров был получен 171 ампликон, из которых полиморфными оказались лишь 98, что составило 57,3 %, а с помощью ISSR - праймеров было выявлено 159 ампликонов, из которых 144 полиморфные, что составило - 90,5 %. Как видно из представленных данных, несмотря на то, что общее число бэндов, полученных при проведении RAPD-PCR, значительно превышает число бэндов ISSR-PCR, количество детектируемых полиморфных полос RAPD-PCR намного ниже, чем у ISSR-PCR.

Таблица 2

Сравнение эффективности методов RAPD- и ISSR-PCR по проценту

выявляемого полиморфизма _

Общее число бэндов Число полиморфных бэндов, пгг Процент полиморфизма, %

метод § £ § а Всех образцов р ж X « я о я Я а Б X X § а о a 13

Э Ё о S к а. В" Я Ю о § т о 5 и о. § ю о 1 « & о Й о я а о s и О. 3 ю о § со ю-о X и о СП

RAPD 105 107 138 171 30 26 72 98 28,6 24,3 52,2 57,3

ISSR 116 113 114 159 86 84 91 144 74 74,3 79,8 90,5

Поэтому, учитывая тот факт, что процент детектируемого полиморфизма при проведении ЯЛРБ-РСЯ лежит в интервале 24,3 - 57,3 %, а минимальный процент полиморфизма К8Я-РСЯ составил 74 %, а также беря во внимание плохую воспроизводимость результатов, мы решили отказаться от применения ЯЛРБ-РСЯ и в качестве основного метода исследований выбрали К8Я-РСЯ ввиду его высокой информативности и надежности.

3 3. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК малины на межвидовом уровне

Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов и сортов малины было использовано 15188Я- праймеров: КЛМ-1 -КЛМ-15. каждый из 15 праймеров был использован для проведения К8Я-РСЯ геномной ДНК каждого генотипа малины в трех повторностях, с трехкратным повторением.

Продукты амплификации были получены для одиннадцати из пятнадцати протестированных праймеров. Десять праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов. Пример полученных профилей с использованием праймеров КЛМ-4 и КЛМ-5 представлен на рисунке 3, где молекулярная масса исследуемых фрагментов варьировала в диапазоне от 150 до 1400 л.н. и был четко выражен ряд мажорных ампликонов, характерных для всех образцов.

В целом эффективными оказались только 8 из 15 К8Я- праймеров: КЛМ-1, КЛМ-2, КЛМ-3, КЛМ-4, КЛМ-5, КЛМ-6, КЛМ-7, КЛМ-8. С помощью этих восьми праймеров были получены четкие электрофоретические профили для каждого из генотипов малины.

При сравнении К8Я-профилей образцов малины был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (таблица 3). При этом анализировали как мажорные фрагменты, так и минорные, ввиду высокой воспроизводимости последних.

С помощью восьми выбранных праймеров оценивали генетическое разнообразие видов и сортов малины. Было проанализировано 223 ампликона, из которых полиморфными оказались 202, что составило 90,6 %. В целом наблюдалось широкое варьирование генетического полиморфизма в зависимости от праймера и группы анализируемых образцов. Всего учитывалось 4 группы образцов: виды малины, ремонтантные сорта, обычные сорта и общая группа, объединяющая все сорта и виды. Самый высокий уровень полиморфизма наблюдался в объединенной группе сортов и видов, где он варьировал от 71,4 до 96,8 %, ив среднем составил 89,2, что вполне логично

можно объяснить тем, что в данной группе наряду с сортами учитывались данные по отдельным видам, которые имеют большое количество уникальных фрагментов, специфичных только для данного вида и повышающий общий уровень полиморфизма. Межвидовой полиморфизм колебался в пределах от 66,7 до 94,7 % и в среднем по восьми праймерам составил 82,75 %. Наименьший же уровень полиморфизма наблюдался в группе неремонтантных сортов, где он составил 45,4 % однако, в среднем он составил 74,6 % и был очень близок к среднему уровню полиморфизма ремонтантных сортов - 74,1 %. В целом, как видно из полученных результатов, геном малины отличается высокой степенью полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК.

Таблица 3

Полиморфизм длин межмикросателлитных последовательностей выявленный при сравнении электрофоретических ISSR-профилей тридцати двух образцов малины

Число фрагментов

№ Код праймера Праймер общее полиморфных

1 КАМ-1 (АС)»УА 32 31

2 ИАМ-2 (Ав)^ 14 10

3 ЫАМ-3 (АС)& 32 30

4 ИАМ-4 (ОА)8С 31 28

5 ЫАМ-5 (ОА)8УС 30 26

6 МАМ-6 (СА)гЯС 27 23

7 КАМ-7 (СА),А 30 29

8 ЫАМ-8 (Ав^ГГ 27 25

9 ЫАМ-9 (СТ)8Т 2 2

10 МАМ-10 (АС)8УО 3 0

11 ЫАМ-И (СТ)8УТ 0 0

12 КАМ-12 (СТ)80 шлейф

13 КАМ-13 (А08с 0 0

14 МАМ-14 (ТС)80 1 1

15 ЫАМ-15 (СА)8СТ шлейф

12345678 Ml 1234 S678M2

Um

S * 4 '•'•i.Tv

(GA)jAC

(GA),YC

Рис. 3. ISSR профили видов и сортов малины, полученные путем разделения продуктов ПЦР в 2% агарозном геле. 1 - Брянская юбилейная (р); 2 - Золотые купола (р) ; 3 - Журавлик(р) ; 4 - Кокинская; 5 - Спутница; 6 -Снегирек (р) ; 7 - Беглянка; 8 - Rubus ideaus L. (Новость Кузьмина). *(р) -ремонтантные сорта; Ml - маркер размеров (Х.ДНК/ЕсоК1 + Hind III); М2 -маркер размеров (1216,1045, 926,632,313,241).

3.4. Использование ISSR - маркеров для изучения филогенетических

Данные, полученные при анализе электрофоретических профилей, были использованы для построения дендрограмм генетического родства тридцати двух исследованных образцов малины, а именно: пятнадцати сортов ремонтантного типа, двенадцати сортов с обычным типом плодоношения и пяти диких видов Для этого данные ISSR-PCR были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков: присутствие фрагмента принималось за 1, отсутствие фрагмента принималось за 0. Приведенные в такой вид данные были проанализированы с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Nei et al.f 1983) с помощью пакета программ STATISTICA 5.0 ("Microsoft Co.", USA).

В дендрограмме, построенной на основании результатов, полученных при использовании всех восьми праймеров, наблюдалась четкая кластеризация по группам исследуемых образцов. В частности, разделились все ремонтантные сорта и сорта с летним типом плодоношения, образовав отдельные кластеры. В кластер неремонтантных сортов также попал стародавний сорт Новость Кузьмина, который в наших исследованиях являлся представителем вида малины красной

связей сортов и видов ремонтантной малины

Данные, полученные с использованием каждого праймера в отдельности, были использованы для построения дендрограмм, в которых не наблюдалось четкого разделения анализируемых групп на кластеры, однако, при этом можно было наблюдать связь некоторых видов с отдельными сортами. При этом выявляются отдельные ампликоны общие для некоторых сортов и диких видов малины. Это подтверждает наличие генетического материала диких видов в геномах современных сортов. Например на рисунке 5 показано, что при амплификации с праймером 5 малины Боярышниколистная оказывается связана с сортами Бабье лето2, Золотые купола и Сентябрьская.

Unweighted pair-group average Euclidean distances

Геракл

Заря вечерняя Августина Снегирек Отом Блисс Брянская юбилейная Надежная Элегантная Сентябрьская Журавлик Золотые купола Бабье лето-2 Бабье лето-1 Абрикосовая Херитидж

ГУсар Бригантина Беглянка Спутница Незнакомка Вольница Брянская Бальзам Рубин брянский Кокинская Ньюбург Пересеет

Я UamuaUfVoaem, Кузьмин**) А амМиМ> 1~(Кумворл»нд~) Я. odormtus L.

Л oiwtaeglfottue Bunge К. arcticv* tMtoreOcuaO. Bunge

4 5 6 7 8 9

Linkage Distance

Рис. 4. Дендрограмма генетических взаимоотношений видов и сортов малины, построенная на основании результатов, полученных при использовании всех восьми - праймеров.

Херитидж- ремонтантные сорта, Спутница -неремонтантные сорта, Д. ойоШш Ь - дикие виды.

При амплификации праймерами выявляется также некоторое родство сорта Ньюбург с малиной боярышниколистной, а малины душистой с сортами Пересвет, Надежная, Сентябрьская. Наибольшая связь с поленикой проявляется у сорта Сентябрьская, Бабье лето 1, Журавлик и Снегирек. Вообще, сорт Сентябрьская является одной из важнейших исходных форм для селекции и проявляет родство сразу с четырьмя дикими видами малины: Боярышниколистной, Душистой, Поленикой и малиной черной.

Рис. 5. Дендрограмма генетических взаимоотношений видов и сортов малины, построенная на основании результатов, полученных при использовании праймера МАМ-5

Херитидж- ремонтантные сорта, Спутница -неремонтантные сорта, Я. ойогаХш Ь — дикие виды.

3.5. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины

Для паспортизации мы использовали 8 ISSR-праймеров, которые были выделены, как наиболее результативные, на предыдущих этапах работы. Критерием отбора фрагментов амплификации фрагментов ДНК служила частота встречаемости ампликона у исследуемой группы сортов, так чтобы она находилась в пределах 0,4-0,6. Однако у праймеров NAM-2 и NAM-7 частота встречаемости ампликонов была в пределах 0,7 - 0,9 и 0,1- 0,3, что делало их применение мало эффективным в паспортизации сортов.

Данные по всем полиморфным локусам, с встречаемостью, укладывающейся в вышеуказанный интервал, записывали в виде матрицы: 1-присутствие полосы, 0- отсутствие.

Далее каждому ампликону данного праймера, начиная с самого высокомолекулярного, присваивалась буква латинского алфавита (таблица 6). На основании данного шаблона была записана формула или так называемый паспорт сорта, где буква - это код или наименование бэнда, а нижний индекс -код праймера, детектирующего данный бэнд (таблица 7).

Таблица 6

Характеристика фрагментов, выбранных для паспортизации образцов

малины

Код праймера Праймер Количество Размер PCR КодPCR

полиморфных локуса, пн локуса

PCR локусов

NAM-1 (AC)8YA 3 959 А

454 в .

272 С

NAM-3 (ac)8g 2 1048 А

704 в

NAM-4 (GA)sC 3 842 А

744 в.

358 С

NAM-5 (GA)8YC 2 762 А

562 в

NAM-6 (CA)8RC 2 1132 А

380 в

NAM-8 (AG)8YT 2 779 А

305 в

Таблица 7

№ п.п. Сорт Паспорт сорта

1 Геракл А1В1С|АзВзА,В4С4А5А6А8В8

2 Бабье лето AiBAAaBaBiCAAiAjBe

3 Бабье лето-2 AIBICIA3B4A3B5A6AsBJ

4 Абрикосовая B^A^CiB,

5 Заря вечерняя A1B1C1B3A4B4C4A5B5BS

6 Августина В1С1ВЗА4В4С4А5В5А6А(!В8

7 Надежная В 1С 1B3B4C4B5 A^AgBj

8 Элегантная BICIBJB^AsBJA^SBJ

9 Снегирек В|С1ВЗВ4С4А5В5А6А8В8

10 Autumn Bliss A,BiCiB3A4B4C4A5B5AiB6AgB8

И Heritage В1С,ВЗА4В4С4А5В5А6В6А8В8

12 Брянская юбилейная QBjA^+AjAgBj

13 Золотые купола B,C,B4C4AjA6B6Bs

14 Сентябрьская B,C,A4B4C4AJA6B6B8

15 Журавлик А1В,С1ВЗА4В4С4А,А6В8

16 Гусар A1A3B3A4AJB6A8BS

17 Беглянка А1АЗВЗВ5А6В6А8

18 Спутница AaAiAeBsAgBg

19 Кокинская A^aAsBsAiBs

20 Незнакомка BlA3C4Bg

21 Бригантана А,В,АзВзВ5ВбА8

22 Ньюбург A4A«B6A8

23 Вольница A,A3B3A4BJA8

24 Бальзам BiBjA^sBjAiBsAs

25 Брянская A1A3A4B3

26 Рубин брянский В,АЗВЗА4В6

27 Пересвет А^АвВб

28 Новость Кузьмина В$А«Вб

3.6. Молекулярное маркирование рпизнака ремонтантности у малины с использованием ISSR-PCR

При использовании праймера (АС)8УЛ был обнаружен специфический маркерный фрагмент длиной около 270 п.н.,. присутствующий; во всех 15 исследуемых сортах ремонтантной малины. Можно предположить, что данный фрагмент является маркером признака ремонтантности малины, так как при проведении PCR анализа сортов малины с обычным неремонтантным типом плодоношения он не амплифицировался (рисунок 6).

Рис. 6. Молекулярное маркирование ремонтантных сортов малины. Неремонтартные сорта: 1-Новость Кузьмина, 2-Пересвет, 3- Рубин брянский, 4-Брянская, 5- Бальзам, 6- Вольница; Ремонтантные сорта: 7-Элегантная, 8-Надежная, 9-Августина, 10- Заря вечерняя, 11- Абрикосовая, 12-Бабье лето1, 13-Бабье лето2,14-Геракл, М-маркер размеров (1216,1045,926,632,313,241).

Маркерный фрагмнт был вырезан из геля и клонирован в плазмиду с целью дальнейшего его изучения.

выводы

1. Выявлен высокий полиморфизм по межмикросателлитным последовательностям ДНК у тридцати двух образцов малины. Межвидовой полиморфизм в среднем составил 82,75%, полиморфизм между ремонтантными сортами- 74,1% и полиморфизм между неремонтантными сортами - 74,6%.

2. На основании 188К-маркеров впервые построены дендрограммы генетического родства, включающие пятнадцать ремонтантных сортов, двенадцать сортов с обычным типом плодоношения и пять видов малины. Получено четкое разделение исследуемых образцов на два кластера: -ремонтантных сортов и сортов с летним типом плодоношения.

3. Выявлено присутствие гермаплазмы диких видов малины в геномах сортов современной селекции на основании результатов, полученных при использовании в качестве праймеров (ОЛ)8УС, (СЛ)8КС, (СЛ)8Л, (ЛС)80 - межмикросателлитных последовательностей.

4. По данным 188К-РСК были составлены генетические «формулы» 28 сортов малины. Все «формулы» оказались уникальными, что подтверждает высокую эффективность использования 188Я-маркеров для паспортизации сортов малины.

5. Выявлен специфический межмикросателлитный маркерный фрагмент на признак ремонтантности у малины, длиной около 270 п.н.

6. Установлено, что использование метода 188К-РСЯ для молекулярно-генетического исследования малины намного эффективнее метода ИЛРБ-РСК по проценту выявляемого полиморфизма, как межвидового (на 27,6%), так и внутривидового (на 50%), и по воспроизводимости результатов.

7. Создана модификация метода выделения ДНК по Дорохову, заключающаяся в внесение поликлар ЛТ и дополнительных антиоксидантов (2-меркаптоэтанол - 0,1 % и о-третбутилоксианизол -50 мг/л)в экстракционный буфер, а также в замене спиртового осаждения ДНК на осаждение 20% ПЭГ - 6000.

Подобранные условия позволяют получать препараты ДНК высокого качества из тканей малины, которая отличается высоким содержанием фенольных соединений.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соболев В.В., Заякин В.В., Нам ИЛ. Молекулярное маркирование видов, сортов и гибридов малины с помощью и ИАРБ-РСК. Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии», 3-6 декабря 2002 года, Брянск.

2. Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Использование ^Я- и ИАРБ-РСИ для молекулярного маркирования малины. Сборник тезисов 2-й международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», 19-23 мая 2003 года, Харьков.

3. Соболев В.В., Заякин В.В., Нам ИЛ. Характеристика полиморфизма межвидовых ремонтантных гибридных форм малины по физиологическим признакам и 188К-РСЯ молекулярным маркерам. Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России и международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии», 15-21 сентября 2003 года, Пенза.

4. Соболева А.Г., Соболев В.В. Использование ИАРБ-РСК для молекулярного маркирования сортов и видов малины. Сборник научных работ молодых ученых - аграриев центрального федерального округа «Молодые ученые - аграрной науке и производству», 2003, Брянск.

5. Ощепков А.В., Соболев В.В. Оптимизация условий выделения ДНК малины. Сборник научных работ молодых ученых - аграриев центрального федерального округа «Молодые ученые - аграрной науке и производству», 2003, Брянск.

Автор выражает глубокую признательность своему науному руководителю, профессору кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии д.б.н. В.В. Заякину и зав. лабораторией биотехнологии, к.б.н. ИЛ. Нам за огромную помощ при проведении исследований, обсуждении результатов изложенных в диссертационной работе при ее подготовке.

Автор признателен заведующему кафедрой плодоовощеводства Брянской ГСХА, член.корр. РАСХН И. В. Казакову за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор благодарит д.б.н. Голденкову И.В., к.б.н. Ралдугину Г. Н. за ценные советы и участие при подготовке

Автор благодарен заведующему кафедрой с.-х. биотехнологии МСХА им. К. А, Тимирязева, академику РАСХН В. С. Шевелухе за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор сердечно благодарит зав. лабораторией регуляторов роста МСХА, к.б.н. Г.И. Карлова за неоценимую помощь оказанную им при проведении исследований, а также выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку сотрудникам кафедры с.-х. биотехнологии МСХА Г.Н. Андреевой, А. Н, Сахаровой, И.А. Фесенко и М.Ю. Куклеву.

Автор благодарит сотрудников лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА А. Г. Соболеву, Е.Л. Зуеву, А. В. Озеровского, В. В. Ефименко за подднржку и дружеское отношение.

Усл. п.л 1,16_Зак. 258_Тираж 100 экз

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

* 12 8 31

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соболев, Владимир Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Род Rubus, подрод Idaeobatus.

1.1.2. Биологические особенности малины.

1.1.3. Генетические аспекты ремонтантности.

1.2. Современные методы исследования генома растений.

1.2.1. Морфо-фенотипические и биохимические методы.

1.2.2. Молекулярно- генетические методы исследования генома растений

1.2.2.1. Подход основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов.

1.2.2.2. Использование метода ПЦР для молекулярно- генетического исследования генома растений.

1.2.2.3. RAPD-анализ.

1.3. Микросателлиты и их типы.

1.3.1. Методы исследования генома с помощью микросателлитных последовательностей.

1.4. Использование молекулярных маркеров в изучении генома и селекции малины.

1.4.1. Биохимические маркеры.

1.4.2. Изоферментные маркеры.

1.4.3. RFLP-маркеры.

1.4.4. RAPD - маркеры.

1.4.5. SCAR - маркеры.

1.4.6. ДНК секвенирование.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение геномной ДНК.

2.2.2. ISSR-PCR.

2.2.3. RAPD-PCR.

2.2.4. M13-PCR.

2.2.5. Создание филогенетического дерева на основе ISSR-маркеров.

2.2.6. Приготовление компетентных клеток.

2.2.7. Лигирование.

2.2.8. Трансформация.

2.2.9. Выделение ДНК из агарозных гелей.

2.3. Материалы и оборудование.

2.3.1. Оборудование.

2.3.2. Реактивы, среды и ферменты.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Выделение ДНК малины.

3.2. Выбор метода для молекулярно-генетического анализа малины.

3.3. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК на межвидовом уровне.

3.4. Использоание ISSR-маркеров для изучения филогенетических связей сортов и видов ремонтантной малины.

3.5. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификация и паспортизация сортов малины.

3.6. Молекулярное маркирование признака ремонтантности у малины с использованием ISSR-PCR.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Соболев, Владимир Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Выявлен высокий полиморфизм по межмикросателлитным последовательностям ДНК у тридцати двух образцов малины. Межвидовой полиморфизм в среднем составил 82,75%, полиморфизм между ремонтантными сортами- 74,1% и полиморфизм между неремонтантными сортами - 74,6%.

2. На основании ISSR-маркеров впервые построены дендрограммы генетического родства, включающие пятнадцать ремонтантных сортов, двенадцать сортов с обычным типом плодоношения и пять видов малины. Получено четкое разделение исследуемых образцов на два кластера: -ремонтантных сортов и сортов с летним типом плодоношения.

3. Выявлено присутствие генетического материала диких видов малины в геномах сортов современной селекции на основании результатов анализа межмикросателлитных последовательностей с использованием в качестве праймеров (GA)8YC, (CA)8RC, (СА)8А, (AC)8G.

4. По данным ISSR-PCR были составлены генетические «формулы» 28 сортов малины. Все «формулы» оказались уникальными, что подтверждает высокую эффективность использования ISSR-маркеров для паспортизации сортов малины.

5. Выявлен специфический межмикросателлитный маркерный фрагмент на признак ремонтантности у малины, длиной около 270 п.н.

6. Установлено, что использование метода ISSR-PCR для молекуляр-но-генетического исследования малины эффективнее метода RAPD-PCR по проценту выявляемого полиморфизма, как межвидового (на 27,6%), так и внутривидового ( на 50%), а также по воспроизводимости результатов.

7. Создана модификация метода выделения ДНК по Дорохову, заключающаяся в внесение поликлар AT и дополнительных антиоксидантов (2-меркаптоэтанол - ОД % и о-третбутилоксианизол - 50 мг/л)в экстракционный буфер, а также в замене спиртового осаждения ДНК на осаждение 20% ПЭГ - 6000.

Подобранные условия позволяют получать препараты ДНК высокого качества из тканей малины, которая отличается высоким содержанием фенольных соединений.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, профессору кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии д.б.н. В.В. Заякину и зав. лабораторией биотехнологии, к.б.н. И.Я. Нам за огромную помощь при проведении исследований, обсуждении результатов изложенных в диссертационной работе и ее подготовке.

Автор признателен заведующему кафедрой плодоовощеводства Брянской ГСХА, член. корр. РАСХН И.В. Казакову за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор благодарен заведующему кафедрой с.-х. биотехнологии МСХА им. К.А. Тимирязева, академику РАСХН B.C. Шевелухе за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор сердечно благодарит зав. лабораторией регуляторов роста МСХА, к.б.н. Г.И. Карлова за неоценимую помощь оказанную им при проведении исследований, а также выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку сотрудникам кафедры с.-х. биотехнологии МСХА Г.Н. Андреевой, А.Н. Сахаровой, И.А. Фесенко и М.Ю. Куклеву.

Автор благодарит сотрудников лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА: А.Г. Соболеву и E.JI. Зуеву за поддержку и дружеское отношение, а так же сотрудника кафедры экологического растениеводства к. с.-х. н. Сорокина А.Е. за помощь в оформлении работы.

Глубокую признательность за помощь, ценные советы и участие автор выражает ведущему научному сотруднику лаборатории генетической инженерии растений ИОГен РАН, д.б.н., Голденковой Ирине Васильевне и руководителю группы трансгенеза лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ИФР РАН, к.б.н., Ралдутиной Галине Николаевне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соболев, Владимир Васильевич, Москва

1. Айала Ф., 1984. Введение в популяционную генетику. М.: Мир.

2. Алтухов Ю.П., Рынков Ю.Г., 1972. Генетический мономорфизм видов и его возможное биологическое значение. Журн. общ. Биологии, 33, 281-300.

3. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М., 2001. Молекулярно генетическая идентификация и паспортизация сортов сои (Glycinemax L.). Генетика, 37(9): 1266-1273.

4. Бузун Г.А., 1972. выделение ферментов из растений в присутствии эндогенных фенолов. Усп. биол. химии 13: 102-115.

5. Вартапетян А.Б., 1991. Полимеразная цепная реакция. Молекулярная биология, 25(4): 926-936.

6. Глазко В.И., Созинов И.А. Генетика изоферментов животных и растений. Киев, 1993.

7. Данилова Т.В., Данилов С.С., Карлов Г.И., 2003. Исследование молекулярно генетического полиморфизма сортов хмеля обыкновенного (Humulus lupulus) с использованием ISSR - ПЦР анализа. Генетика, 39(11): 1484-1489.

8. Данилова Т.В., Тикунов Ю. М., Weber G., Карлов Г. И. 2001, Молекулярное маркирование пола у хмеля (Humulus lupulus L.) с использованием ISSR-ПЦР. Сельскохозяйственная биотехнология. Том II. М.: Воскресенье.

9. Джинчарадзе А.Г., Иванов П.Л., Рысков А.П., 1987. Геномная «дактилоскопия»: характеристика клонированной последовательности генома человека, обладающей в составе вектора М13 свойствами высокополиморфного маркера ДНК. Доклюю АН СССР, 295, 230-233.

10. Журавлев Ю.Н., Арткжова Е.В., Козыренко М.М., Реунова Г.Д., 2003. Изучение генетических связей между дальневосточными видами семейства Araliaceae методом RAPD. Генетика, 39(1): 57-63.

11. Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д., Артюкова Е.В. и др. 1998. Изучение генетической изменчивости дикорастущего женьшеня (RAPD анализ). Молек. Биол. 32(6): 1075-1079.

12. Казаков И. В. Генетические ресурсы для создания хозяйственно-ценных форм малины ремонтантного типа. Сб. Современные проблемы генетики и селекции плодовых и ягодных культур и пути их решения. Мичуринск, 1999. с. 67-70.

13. Казаков И. В. Малина в вашем саду. «Придесенье», 1994. с. 144.

14. Казаков И. В. Малина и ежевика. Москва, «Фолио», 2001 С. 17-28.

15. Казаков И. В. Селекция малины в средней полосе РСФСР. Тула, При-окское книжное издательство, 1989. с. 53-61.

16. Кичина В. В. Генетика и селекция ягодных культур. М., Колос, 1984. С. 278.

17. Кичина В. В., Казаков И. В. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур. Орёл, 1995. С. 368-380.

18. Кочиева Е. 3. и Т. П. Супрунова. 1999. Идентификация видового и сортового полиморфизма у томатов. Генетика, т. 35, №10, 1386 -1389.

19. Кочиева Е. 3., Супрунова Т. П. и С. К. Семёнова, 1999. Использование RAPD-анализа для идентификации сортов баклажанов (Solarium melongenaL.). Генетика. Т. 35, №8, 1165 1168.

20. Оганисян А. С., Кочиева Е. 3. и А. П. Рысков. 1996. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR. Генетика, т. 32, №448-451.

21. Розанова М.А., 1939. Роль автоплоидии в происхождении сибирской малины. Докл. АН СССР, 24, 58-60.

22. Сиволап Ю.М., Балашова И.А., Трошин Л.П., 1996. Исследование генетического полиморфизма винограда при помощи RAPD-анализа. Цитология и генетика, 30(6): 33-37.

23. Сиволап Ю.М., Вербицкая Т.Г., Тулаева М.И., Барышева И.А. 1993. Анализ генетических дистанций методом ПДРФ у винограда. Цитология и Генетика, 27(6), 24-28.

24. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.П., 1997. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя. Генетика, 33(1): 53-60.

25. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Чеботарь С.В., 1994. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами. Цитология и генетика, 28(6): 54-61.

26. Сиволап Ю.М., Кожухова Н.Э., Вареник Б.Ф., 1999. Идентификация инбредных линий кукурузы с помощью произвольно праймированной ПЦР и SSR- ПЦР. Доклады Российской Академии Сельскохозяйственных Наук, 6: 3-6.

27. Сиволап Ю.М., Куцевич Л.И., Паламарчук А.И., Тоцкий В.Н., 1997. Молекулярно-генетический полиморфизм озимой твердой пшеницы, определяемый ПЦР с произвольными праймерами. Доклады РАСХН, 1: 6-8.

28. Сиволап Ю.М., Солоденко А.Е., Бурлов В.В., 1998. RAPD анализ молекулярно - генетического полиморфизма подсолнечника (Helian-thus annuus). Генетика, 34(2): 266-271.

29. Сиволап Ю.М., Топчиева Е.А., Чеботарь С.В., 2000. Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD и SSRP -анализа. Генетика, 36(1): 44-51.

30. Сиволап Ю.М., Чеботарь С.В., Топчиева Е.А., Корзун В.Н., Тоцкий В.Н., 1999. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма сортов Triticum aestivum L. с помощью RAPD и SSRP - анализа. Генетика, 35(12): 1665-1673.

31. Сулимова Г.Е., 1993. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК сельскохозяйственных животных: методология, результаты и перспективы. Успехи совр. Генетики. Вып. 18.: 3-35.

32. Фортэ А.В., Игнатов А.Н., Пономаренко В.В., Дорохов Д.Б., Савельев Н.И., 2002. Филогения видов яблони рода Malus на основе оценки морфологических признаков и молекулярного анализа ДНК. Генетика, 38(10): 1357-1369.

33. Ярославцев Е. И. Малина. Москва, Колос, 1979. С. 159.

34. Agwanda CO., Lashermes P., Trouslot P. et al., 1997. Identification of RAPD markers for resistance to coffee berry disease, Colletotrichum ka-hawae. in arabica coffee. Euphytica, 97: 241-248.

35. Ajibade S. R., Weeden N. F., Chite S. M. 2000. Inter simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna. Euphytica 111: 47-55.

36. Alice, L.A., Eriksson, Т., Eriksen, B. and Campbell, C.S., 1997. Intersub-generic hybridization between a diploid raspberry. Rubus idaeus, and a tetraploid blackberry, R, caesius (Rosaceae). American Journal of Botany, 84, 171.

37. Alice. L.A. and Campbell. C.S., 1996. A phylogeny of Rubus (Rosaceae: Rosoideae) based on internal transcribed space (ITS) sequences of nuclear ribosomal DNA. American Journal of Botany, 83, 136.

38. Antonius, K. and Nybom. H., 1995. Discrimination between sexual recombination and apomixis/automixis in a Rubus plant breeding programme. Hereditas. 123, 205-213.

39. Antonius. K. Werlemark, G. and Nybom, H., 1997. DNA fingerprinting demonstrates extremely low levels of genetic variation among blackberry cultivars grown in Finland. Agricultural and Food Science in Finland, 6, 241-245.

40. Arcade, A., Anselin, F., Faivre Rampant, P., Lesage, M.C., L. E. Paques & D. Prat, 2000. Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese Larch. Theor Appl Genet 100: 299 -307.

41. Areshchenkova, Т. & M. W. Ganal, 1999. Long tomato microsatellites are predominantly associated with centromeric regions. Genome 42: 536 -544.

42. Bammi R.K., 1965. Cytogenetics of Rubus. 4. Pachytene morphology of Rubus parvifolius L. chromosome complement. Can. J. Gen. Cyt., 7, 254258.

43. Becker, J. & M. Heun, 1995a. Barley microstellites: allele variation and mapping. Plant Molecular Biology 27: 835-845.

44. Beckmann, J.S. & M. Soller, 1990. Toward a unified approach to genetic mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites. Biotechnology 8: 930-932.

45. Bell, С. J. & J. R. Ecker, 1994. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19: 137 144.

46. Bretting P.K., Widrlechner M.P., 1995. Genetic markers and plant genetic resource management. Plant. Breed. Rev., 13, 11-86.

47. Bretting P.K., Widrlechner M.P., 1995. Genetic markers and plant genetic resource management. Plant Breed. Rev.,13: 11-86.

48. Bringhurst. R.S., Arulsekar. S. Hancock, J.F. and Voth. V., 1981. Electrophoretic characterization of strawberry cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Science, 106, 684-687.

49. Broun, P. & S. D. Tanksley, 1996. Characterization and genetic mapping in simple sequence repeats in the tomato genome. Mol Gen Genet 250: 39 -49.

50. Busemeyer, D.T., Pelikan. S., Kennedy. R.S. and Rogstad, S.H., 1997. Genetic diversity of Philippine Rubus moluccanus L. (Rosaceae) populations examined with VNTR DNA probes. Journal of Tropical Ecology. 14, 867-884.

51. Cao. E.P., 1993." Chloroplast DNA polymorphism in selected species of Rubus L. (Rosaceae). Thesis, Agris-database abstract.

52. Casas A.M., Igartua E., Balaguer G., Moreno M.A., 1999. Genetic diversity of Primus rootstocks analyzed by RAPD markers. Euphytica, 110: 139-149.

53. Cecikc C., Battey N. H. and M. J. Wilkinson. 2001. The potencial of ISSR-PCR primer-pair combination for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model. Theor Appl Genet 103:540-564

54. Cecikc C., Battey N. H. and M. J. Wilkinson. 2001. The potencial of ISSR-PCR primer-pair combination for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model. Theor Appl Genet 103:540564.

55. Charlesworth В, Morgan MT, Charlesworth D (1993) The effect of deleterious mutations on neutral molecular variation. Genetics 134:1289-1303

56. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L., 1972. Non chromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R -factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 - 2114.

57. Coletta Filho H.D., Machado M.A., Targon M.L.P.N. et al., 1998. Analysis of the genetic diversity among mandarins (Citrus ssp.) using RAPD markers. Euphytica, 102: 133-139.

58. Cousineau J.C. and Donnelly. D.J., 1992a. Use of isoenzyme analysis to characterize raspberry cultivars and detect cultivar mislabelling. HortScience, 27, 1023-1025.

59. Cousineau, J.C and Donnelly. D.J. 1989a. Identification of raspberry cultivars by starch gel electrophoresis and isoenzyme staining. Acta Horticulture, 262, 259-265.

60. Cousineau. J.C, Anderson. A.K., Daubeny. H.A. and Donnelly. D.J., 1993. Characterization of red raspberry cultivars and selections using isoenzyme analysis. HortScience, 28, 1185-1186.

61. Cousineau. J.C. and Donnelly. D.J., 1989b. Identification of raspberry cultivars in vivo and vitro using isoenzyme analysis. HortScience, 24, 490-492.

62. Cousineau. J.C. and Donnelly. D.J., 1992b. Genetic analysis of isoenzymes in raspberry. Journal of the American Society for Horticultural Science, 117, 996-999.

63. Cousineau. J.C., 1992. Isoenzyme studies and tissue culture of raspberry (Rubus). Thesis, Dissertation Abstracts-database.

64. Dahleen L.S., Hoffman D.L., Dohrmann J., Gruber R. and Franckowiak J., 1997. Use of a subset of doubled haploid lines for RAPD interval mapping in barley. Genome, 40: 626-632.

65. Degani С., Rowland L.J., Saunders J.A. ei al., 2001. A comparison of genetic relationship measures in strawberry (Fragariu x anun-assa Duch.) based on AFLP, RAPD and pedigree data. Euphytica, 117: 1-12.

66. Dorokhov D., Kloke E., 1996. Rapid of RAPD analyses of plant genome and nature of the RAPD spectra. German Russian Cooper. Biotechnology. Workshop lv. Plant Molec. Biol., Genetics and Biotechnology, P. 34.

67. Du J.-K., Yao Y.-Y., Ni Z.-F., Peng H.-R., Sun Q.-X., 2002. Genetic diversity revealed by ISSR molecular marker in common wheat, spelt, Com-pactum and progeny of recurrent selection. Acta genet. Sinica, 29(5): 445452.

68. Dudley J.W., 1993. Molecular markers in plant improvement manipulation of genes affecting quantitative traits. Crop Sci., 33: 660-668.

69. Dunemann F., Kahnau R., Schmidt H., 1994. Genetic relation ships in Mains evaluated by RAPD "fingerprinting" of cultivars and wild species. Plant Breeding, 113: 150-159.

70. Dunning A.M., Talmud P., Humphries S.F., 1988. Errors in the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res., 16: 10393.

71. Echt, C. S., May-Marquardt, P., M. Hseih & R. Zahorchak, 1996. Charactrization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39: 1102-1108.

72. Echt, C.S. & P. May-Marquardt, 1997. Survey of microsatellite DNA in pine. Genome 40: 9-17.

73. Ender, A., K. Schwenk, T. Stadler, B. Streit & B. Schierwater, 1996. RAPD identification of microsatellites in Daphina. Molecular Ecology 5:437-441.

74. Eriksson. O. and Bremer. В., 1993. Genet dynamics of the clonal plant Rubus saxatilis. Journal of Ecology. 81, 533-541.

75. Fang D., Krueger R.R., Roose M.L., 1998. Phylogenetic relationships among selected Citrus germplasm accessions revealed by inter simple se-quens repeat (ISSR) markers. J. Am. Soc. Hortic. Sc., 123(4): 612-617.

76. Fanizza G., Colonna G., Resta P., Ferrara G., 1999. The effect of the number of RAPD markers on the evaluation of genotypic distances in Vitis vinifera II Euphytica, 107: 45-50.

77. Fejer S. O., 1977. Inheritance of yild, yield components, and fall fruiting habit in red raspberry diallel crosses- Canad. I. Cenet, Cytol, 19 (1), 1-13.

78. Fiedler J., Bufler G., Bangerth F.f 1998. Genetic relationships of avocado (Persea americana Mill.) using RAPD markers. Euphytica, 101: 249-255.

79. Giese H., Holm Jensen A.G., Mathiassen H., Kjaer В., Rasmussen S.K., Bay H. and Jensen J., 1994. Distribution of RAPD markers on a linkage map of barley. Hereditas, 120: 267-273.

80. Gortner, G., M. Nerino, K. Weising, D. Zink, W. Nagi & G. Kahl, 1998. Chromosomal localization and distribution of simple sequence repeats and the Arabidopsis-type telomere sequence in the genome of Cicer arietinum L. ChromRes 6: 97-104.

81. Graham. J. and McNicol. R.J., 1995. An examination of the ability of RAPD markers to determine the relationships within and between Rubus species. Theoretical and Applied Genetics, 90, 1128-1132.

82. Graham. J., McNicol. R.J., Greig. K. and Van de Ven. W.T.G., 1994. Identficiation of red raspberry cultivars and an assessment of their re-latedness using fingerprints produced by random primers. Journal of Horticultural Science, 69,123-130.

83. Graham. J., Squire. В., Marshall. B. and Harrison. R.E., 1997. Spatially dependent genetic diversity within and between colonies of wild raspberry Rubus idaeus detected using RAPD markers. Molecular Ecology, 6. 1001-1008.

84. Grodzicker Т., Williams J., Sharp P., Sambrook J. 1974. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 439-446.

85. Gruber F., Knight R.L., Keep E., 1962. Fruit-breeding: berries. Rubus L. Sub-genera Idaeobatus Focke and Eubatus Focke. 1. Systematics. 2. Floral biology and seed formation. Handbuch der Pflanzenzuchtung, 6, 477-487.

86. Guichard. E., 1984. Comparison of two N2 entrainment methods for the extraction of volatile compounds from raspberry. Sciences des Aliments, 4. 317-324.

87. Gupta, P. K. and R. K. Varshney, 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analyses and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113:163-185.

88. Gupta, P. K. and R. K. Varshney, 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analyses and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113:163-185.

89. Gupta, P. К., H. S. Balyan, P. C. Sharma & B. Ramesh, 1996. Mi-crosatellites in plants: a new class of molecular markers. Curr Sci 70:4554.

90. Hall H.K., Quazi M.H. & Skirvin R.M., 1990. Isolation of a pure thornless Loganberry by meristem tip culture. Euphytica, 35: 1039-1044.

91. Haskel G., 1960. The raspberry wild in Britain. Watsonia. 4,238-255.

92. Haskell G. and Garrie. J.B., 1966. Fingerprinting raspberry cultivars by empirical paper chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture, 17, 189-192.

93. Heiberg N., Werlemark G. and Nybom. H., 1998. Two Phytophthora resistant raspberry cvs. prove to be almost identical with DNA fingerprinting. Gartenbauwissenschaft.

94. Heinkel R., Hartmann W., Stosser R., 2000. On the origin of the plum cultivars "Cacaks Beauty", "Cacaks Best". "Cacaks Fruitful" as investigated by the inheritance of random amplified polymorphic DNA (RAPD) fragments. Sci. Hortic., 83: 149-155.

95. Heslop-Harrison Y, 1953. Cytological studies in the genus Rubus L. 1. chromosome numbers in the British Rubus flora. New Phytol., 52, 22-39.

96. Hoepfner A.-S., Nestby R. and Nybom H., 1996. Genetic deviation initiated by adventitious shoot regeneration from tissue cultured red raspberry. Journal of Horticultural Science, 71, 71-79.

97. Hoepfner A.-S., Nybom, H., Carlsson U. and Franzen. R., 1993. DNA fingerprinting useful for monitoring cell line identity in micropropa-gated raspberries. Acta Agriculturae Scandinavica. Section B. Soil and Plant Science, 43, 53-57.

98. Hood, D. W., Deadman, M. E., Jennings, M. P., Bisercic, M., Fleischmann, R. D., J. C. Venter & E. R. Moxon, 1996. DNA repeats identify novel virulence genes in Haemophilus influenzae. Proc Natl Acad Sci USA 93: 11121-11125.

99. Jeffreys A.J., Brookfield J.F.Y., Semeonoff R., 1985. Positive identification test-case using human DNA fingerprint. 317, 818-819.

100. Jelkman W. and Martin R.R., 1988. Complementary DNA probes generated from double-stranded RNAs of a Rubus virus provide the potential for rapid in vitro detection. Acta Horticulturae, 236, 103-109.

101. Jennings D. L., 1988. Raspberries and Blackberries Their Breeding, De-seases and Growth. Academic Press., London, New York, 1-230.

102. Jennings D.L. and Charmichael E., 1980. Anthocyanin variation in the genus Rubus. New Phytologist, 84, 505 513.

103. Jennings D.L., Daybeny H.A. and Moore J.N., 1990. Blackberries and raspberries. Acta Hortiadturae, 290, 330-389.

104. Joshi, S. P., Gupta, V. S., Aggarwal, R. К., P. K. Ranjekar & D. S. Brar, 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor Appl Genet 100: 1311 1320.

105. Kalendar R., Grob Т., Regina M., Suoniemi A. and A. Schulman, 1999. IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theor Appl Genet 98:704-711.

106. Kashi Y, Soller M (1999) Functional roles of microsatellites and minisatel-lites. In: Goldstein DB, Schlotterer С (eds) Microsatellites: evolution and applications. Oxford University Press, Oxford, pp 10-23

107. Kaundun S.S., Zhyvoloup A., Park Y.-G., 2000. Evaluation of the genetic diversity among elite tea (Camellia sinensis van sinensis) accessions using RAPD markers. Euphytica, 115: 7-16.

108. Kelly J.D., 1995. Use of random amplified polymorphic DNA markers in breeding for major gene resistance to plant pathogens. HortSci., 30(3): 461-465.

109. Keep E., 1961.Autum fruiting in raspberries. I. of Hort. Sci. 36 (3), 174185.

110. Kojima, Т., Nagaoka, Т., К. Noda & Y. Ogihara, 1998. Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in einkorn wheat in relation to that of RFLP markers. Theor Appl Genet 96: 37 45.

111. Kokko H.I., Kivtneva M. and Karenlampi S.O., 1996. Single-step immu-nocapture RT-PCR in the detection of raspberry bushy dwarf virus. BioTechniques, 20, 842-846.

112. Kolodinska A., 2001. Genetic diversity importance and future prospective a study of barley in Nordic Baltic region. Sver. Utsadesforen. Tidskr., Arg. 111(4): 192-195.

113. Kraft Т., Nybom H. and Werlemark. G., 1994. Rubus vestenicensis (Rosaceae) its hybrid origin revealed by DNA fingerprinting. Sordic Journal of Botany, 15(3), 237 - 242.

114. Karp A, Seberg O., Buiatti M., 1996. Molecular techniques in the assessment of botanic diversity. Ann. Bot., 79(2): 143-149.

115. Lagercrantz U, Ellegren H, Andersson L, 1993. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res 21:1111-1115

116. Lanham P.G., 1996. Estimation of heterozigosity in Ribes nigrum L. using RAPD markers. Genetica, 98: 193-197.

117. Lanham P.G., Brennan R.M., 1999. Genetic characterization of gooseberry (Ribes grossularia, subgenus Grossularia) germplasm using RAPD, ISSR and AFLP markers. J. hortic. Sc. Biotechnology, 74(3): 361-366.

118. Lanham P.G., Korycinska A., Brennan R.M., 2000. Genetic diversity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L. revealed by RAPD and ISSR markers. J. hortic. Sc. Biotechnology, 75(4): 371-375.

119. Lawrence F. J., 1975.The current states and Canada. Fruit varieties journal. 34, 84-89.

120. Lee M., 1995. DNA markers and plant breeding programs. Adv. Agron., 55, 265-344.

121. Leroy, X. J., Leon, K., Hily, J. M., P. Chaumeil & M. Branchard, 2001. Detection of in vitro culture-induced instability through inter-simple sequence repeat analysis. Theor Appl Genet 102: 885 891.

122. Levin, I., Gilboa, N., Yeselson, E., S. Shen & A. A. Schaffer, 2000. Fgr, a major locus that modulates the fructose to glucose ratio in mature tomato fruits. Theor Appl Genet 100: 256 262.

123. Levin, I., Gilboa, N., Yeselson, E., S. Shen & A. A. Schaffer, 2000. Fgr, a major locus that modulates the fructose to glucose ratio in mature tomato fruits. Theor Appl Genet 100: 256 262.

124. Lewis D. The relationschip between polyploidy and fruiting habit in the cultivated raspberry. Proceedings of the 7 International Cenetics Congress, Edinburg, 1939 1941, p. 190.

125. Lis J., 1980. Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation. Metod in Enzymology. V. 65. Nucleic Acids. Part I -New York, 347-353.

126. Machado M.A., Coletta Filho H.D., Targon M.L.P.N., Pompeu.J.J., 1996. Genetic relationship of Mediterranean mandarins (Citrus deliciosa Tenore) using RAPD markers. Euphytica, 92: 321-326.

127. Marczewski W., 2001. Inter simple sequens repeat (ISSR) markers for the Ns resistance gene in potato (Solarium tuberosum L.). J. Appl. Genet, 42(2): 139-144.

128. Martelli G., Sunseri F., Greco I., Sabina M.R., Porreca P., Levi A., 1999. Strawberry cultivars genetic relationship using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Adv. Hort. Sci., 13: 99-104.

129. McGregor C.E., Lambert C.A., Greyling M.M., Louw J.M., Warnich L., 2000. A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solarium tuberosum L.) germplasm. Euphytica, 113(2): 135-144.

130. Mehlenbacher S.A., 1995. Classical and molecular approaches to breeding fruit and nut crops for disease resistance. HortScience, 30, 466477.

131. Melody S. Clark (Ed), 1997(a). Plant Molecular Biology A Laboratory Manual. P. 529.

132. Melody S. Clark (Ed), 1997(b). Plant Molecular Biology A Laboratory Manual. P. 537.

133. Metzgar, D., J. Bytof & C. Wills, 2000. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expantion in coding DNA. Genome Res 10: 72 — 80.

134. Monte Corvo L., Cabrita L., Oliveira C., Leitao J., 2000. Assesment of genetic relationships among Pyrus species and cultivars using AFLP and RAPD markers. Genet. Res. Crop. Evolut., 47: 257-265.

135. Monte Corvo L., Goulao L., Oliveira C., 2001. ISSR analysis of cultivars of pear and suitability of molecular markers for clone discrimination. J. Am. Soc. Hortic. Sc., 126(5): 517-522.

136. Moore P.P., 1993. Chloroplast DNA diversity in raspberry. Journal of the American Society for Horticultural Science, 118, 371-376.

137. Morgante, M. & J. Vogel, 1994. Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms. US patent application no. 08/326456.

138. Morgante, M., A. Rafalski, P. Biddle, S. Tingey & X.M. Oliveri, 1994. Genetic mapping and variability of seven soybean simple sequence repeat loci. Genome 37: 763-769.

139. Nagaoka Т., Ogihara Y., 1997. Applicability of inter simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theor Appl Genet, 94: 597-602.

140. Naruhashi N. and Masuda N., 1986. Seasonal changes of peroxidase isoenzyme in several Rubus species. Acta Horticulturae, 183, 297-304.

141. Nei, M., F. Tajima & Y. Tateno, 1983. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. J Mol Evol 19: 153 — 170.

142. Nicolosi E., Deng Z.N., Gentile A. et al., 2000. Cytrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers. Theor. Appl. Genet., 100: 1155-1166.

143. Nilsson N.-O., Hallden C., Hansen M., Hjerdin A. and Sail Т., 1997. Comparing the distribution of RAPD and RFLP markers in a high density linkage map of sugar beet Genom, 40: 644-651.

144. Noli Enrico, Salvi Silvio and Tuberosa Roberto, 1997. Comparative analysis of genetic relationships in barley based on RFLP and RAPD markers. Genome, 40: 607-616.

145. Nonnecke G. R. Luby J. J., 1992. Raspberry cultivars and production in the Midwest. Fruit Vaieties Journal. 4, 207-212.

146. Nybom H. and Hall H.K., 1991. Minisatellite DNA "fingerprints" can distinguish Rubus cultivars and estimate their degree of related-ness. Euphytica, 53, 107-114.

147. Nybom H. and Schaal B.A., 1990. DNA "fingerprints" reveal genotypic distributions in natural populations of blackberries and raspberries (Rubus, Rosaceae). American Journal of Botany, 77, 883-888.

148. Nybom H., 1994. DNA fingerprinting a useful tool in fruit breeding. Euphynca, 11, 59-64.

149. Nybom H., 1995. Evaluation of interspecific crossing experiments in facultatively apomictic blackberries (Rubus subgen. Rubus) using DNA fingerprinting. Hereditas, 122, 57-65.

150. Nybom H., Rogstad S.H. and Schaal B.A., 1990. Genetic variation detected by use of the M13 "DNA fingerprint" probe in Malus, Prunus and Rubus (Rosaceae). Theoretical and Applied Genetics, 79, 153-156.

151. Nybom H., Schaal B.A. and Rogstad S.H., 1989. DNA "fingerprints" can distinguish cultivars of blackberries and raspberries. Acta Horticultural 262, 305-310.

152. Nybom N., 1966. Thin-layer chromatographv with the Balsgard system. Acta Agriculturae Scandinavica, Suppl., 16, 210-212.

153. Oliveira C.M., Mota M., Monte-Corvo L. el al., 1999. Molecular typing of Pyrus based on RAPD markers. Sci. Hortic., 79: 163-174.

154. Ourecky D. K., Slate G. L., 1969.Heritage. A new fall-bearing red raspberry. Res. Circular of the New York St. Agric. Exp. St., 19.

155. Pamfil.D., Zimmerman R.H., Naess. S.K. and Swartz. H.J., 1996. Taxo-nomic relationships in Ritbus based on RAPD and hybridization analysis. HortScience, 31, 620.

156. Pandolfi S., Rosati A. and Standardi A., 1993. Isozymatic patterns of 15 cultivars of Rubus idaeus L. Acta Horticuiturae, 352. 441-443.

157. Parent J.-G. and Page D., 1992. Identification of raspberry cultivars by non-radioactive DNA fingerprinting. HortScience, 27,1108-1110.

158. Parent J.-G. and Page D., 1998. Identification of raspberry cultivars by sequence characterized amplified region DNA analysis. HortScience, 33, 140-142.

159. Parent J.-G., Fortin. M.G. and Page D., 1993. Identification of raspberry cultivars by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Canadian Journal of Plant Science, 73, 1115-1122.

160. Parsons B. J., Newbury H. J., Jackson M. T. and В. V. Ford-Lloyd. 1997. Contrasting genetic diversity relationship are revealed in rice (Oriza sativa L.) using different marker types. Mol Breeding 3:115-125.

161. Parsons B. J., Newbury H. J., Jackson M. T. and В. V. Ford-Lloyd. 1997. Contrasting genetic diversity relationship are revealed in rice (Oriza sativa L.) using different marker types. Mol Breeding 3:115-125.

162. Pasakinskiene I., Griffiths С. M., Bettany A. J. E., Paplauskiene V., Humphreys M. W. 2000. Anchored simple sequence repeats as primers to generate species-specific DNA markers in Lolium and Festuca grasses. Theor Appl Genet 100:384-390.

163. Plaschke, J., M.W. Ganal & M.S. Roder, 1995. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers. Theor Appl Genet 91: 1001-1007.

164. Potter D., Gao F., Aiello G., Leslie C., McGranahan G., 2002. Inter simple sequens repeat markers for fingerprinting and determining genetic relationships of walnut (Juglan regia) cultivars. J. Am. Soc. Hortic. Sc., 127(1): 75-81.

165. Powell, W., G.C. Machray & J. Provan, 1996a. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends Plant Sci 1: 215-222.

166. Powell, W., M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey & J.A. Rafalaski, 1996b. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225-238.

167. Prasad, M„ R.K. Varshney, J.K. Roy, H.S. Balyan & P.K. Gupta, 2000. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theor Appl Genet 100: 584 -592.

168. Prevost, A. & M. J. Wilkinson, 1999. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor Appl Genet 98: 107- 112.

169. Qi Lili, Cao Mingshu, Chen Peidu, Li Wanlong and Liu Dajun, 1996. Identification, mapping, and application of polymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat. Genome, 39: 191-197.

170. Qian W., Ge S., Hong D-Y. 2001. Genetic variation within and among population of wild rice Oriza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theor Appl Genet 102:440-449.

171. Richardson, Т., S. Cato, J. Ramser, G. Kahl & K. Weising, 1995. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers. Nucl Acids Res 23: 3798-3799.

172. Roder, M.S., J. Plaschke, S.U. Konig, A. Bomer, M.E. Sorells, S.D. Tanksley & M.W. Canal, 1995. Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol Gen Genet 246: 327-333.

173. Saiki R.K., Gelfand D., Staffel S. et al., 1988. Primer directed enzymatic amplification of with a thermosteble DNA polymerase. Scince, 239: 487491.

174. Saiki R.K., Scharf F., Faloona F. et al., 1985. Enzymatic amplification of |3 globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Ibid, 230: 1350-1354.

175. Schlz В., Westphal L. & Wricke G., 1994. Linkage groups of isozymes, RFLP and RAPD markers in carrot (Daucus carota L. sativus). Euphytica, 74: 67-76.

176. Schmidt, T. & J.S. Heslop-Harrison, 1996. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet. Proc Nati Acad Sci USA 93: 8761-8765.

177. Schulz В., Westphal L. & Wricke G. 1994. Linkage groups of isozymes, RFLP and RAPD markers in carrot (Daucus carota L. sativus). Euphytica, 74, 67-76.

178. Shimada Т., Hayama H., Haji T. et al., 1999. Genetic diversity of plums characterized by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Euphytica, 109: 143-147.

179. Shimada Т., Hayama H., Nishimura K, et al., 2001. The genetic diversities of 4 species of subg. Luthocerasus (Prunus. Rosaceae) revealed by RAPD analysis. Euphytica, 117: 85-90.

180. Slate G. L. Suit R. F., 1944.A second on the breeding of autumn-fruiting red raspberries. Proc. of the Amer. Soc. For Hort. Sci., 44, 283-288.

181. Smith J.S.C., Smith O.S., 1992. Fingerprinting crop varieties. Adv. Agron., 47: 85-140.

182. Somers D.J., Zhou Z., Bebeli P.J. et al., 1996. Repetitive, genome specific probes in wheat (Triticum aestivum) L-Em Thell amplified with minisatellite core sequences. Theor. Appl. Genet., 93(5-6): 982-989.

183. Tanksley S.D., Meding-Filho H., Rick C.M. 1982. Use of naturally-occuring enzyme variation to detect and map genes controlling quantitative traits in an interspecific backross of tomato. Heredity, 49,11-25.

184. Tautz, D., 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucl Acids Res 17:6463-6471.

185. Thompson M.M., 1995. Chromosome numbers of Rubus cultivars at the National clonal germplasm repository. HortScience, 30(7), 1453-1456.

186. Thompson M.M., 1997. Survey of chromosome numbers in Rubus (Rosaceae: Rosoideae). Ann. Missouri Bot. Garden, 84(1), 128-164.

187. Tikunov Yu.M., Khrustaleva L.I. & Karlov G.I., 2003. Application of ISSR markers in the genus Lycopersicon. Euphytica 131: 71-80.

188. Trople D.D. and Moore P.P., 1998. Taxonomic relationships in Rubus based on RAPD analysis. Seventh International Rubus-Ribes Symposium,. Australia and New Zealand 1998, Congress Abstracts.

189. Tzouwara-Karayanni S.M. and Philianos S.M., 1981. Chemical constituents of Rubus ulmifolius Schott. Quarterly Journal of Crude Drug Research, 19(2-3), 127-130.

190. Van der Beek, J. G., Yerkerk, K., P. Zabel & P. Lindhout, 1991. Mapping strategy for resistant genes in tomato based on RFLPs between cultivars: Cf9 (resistance to Cladosporium fulvum) on chromosome 1. Theor Appl Genet 84: 106- 112.

191. Vassart G., Georges M., Monsier et al., 1987. F sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA. Scince. 235, 683-684.

192. Verwoerd T.C., Dekker B.M.M., Hoehema A., 1988. A small scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs. Nucl. Acids. Res., 17(6): 2362.

193. Vidal J.R., Coarer M., Defontaine A., 1999. Genetic relationships among grapevine varieties grown in different French and Spanish regions based on RAPD markers. Euphytica, 109: 161-172.

194. Yirk P. S., Zhu J., Newbury H. J., Bryan G. J., Lackson M. Т., Ford-Lloyd В. V. 2000. Effectiveness of different classes of molecular markers for classifying and revealing variation in rice (Oryza sativa) germplasm. Euphytica 112:275-284, 2000.

195. Vosman, B. & P. Arens, 1997. Molecular characterization of GATA/GACA microsatellite repeats in tomato. Genome 40: 25-33.

196. Wang, G., R. Mahalingam & H.T. Karp, 1998. (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max L. Merr. Theor.Appl Genet 96: 1086-1096.

197. Wang, Y.-H., Thomas, C.E., and Dean, R.A. 1997. A genetic map of melon (Cucumis melo L) based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. Theor. Appl. Genet. 95: 791-798.

198. Wang, Z., J.L. Weber, G. Zhong & S.D. Tanksley, 1994. Survey of plant short tandem repeats. Theor Appl Genet 88: 1-6.

199. Waugh R., van de Yen M., Millam S. Brennan R. and Powell W., 1990a. The potential use of restriction fragment length polymorphism in Rubus breeding. Acta Horticulturae, 280, 541-545.

200. Waugh R., van de Ven W.T.G., Phillips. M.S. and Powell W., 1990b. Chloroplast diversity in the genus Rubus (Rosaceae) revealed by Southern hybridization. Plant Systematics and Evolution, 172, 65-75.

201. Weeden N.F. and Lamb R.C., 1985. Identification of apple cultivars by isozyme phenotypes. Journal of the American Society for Horticultural Science, 110, 509-515.

202. Weeden N.F., Hemmat M., Lawson D.M., Lodhi M., Bell R.L., Manga-naris, A.G., Reisch B.L., Brown S.K. and Ye G.-N., 1994. Development and application of molecular marker linkage maps in woody fruit crops. Euphytica, 11, 71-75.

203. Weising K., Nybom H., Wolff K. and Meyer W., 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press Inc., Boca Raton. Florida. USA.

204. Welsh J & McClelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nuc. Acids Res. 18: 7213-7218.

205. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A. & Tingey S.V., 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nuc. Acids Res., 18: 6531-6535.

206. Witsenboer, H„ J. Vogel & R.W. Michelmore, 1997. Identification, genetic localization, and allelic diversity of selectively amplified microsatellite polymorphic loci in lettuce and wild relatives (Lactuca spp.). Genome 40: 923-936.

207. Wolff, К., E. Zietkiewicz & H. Hofstra, 1995. Identification of chrysanthemum cultivars and stability of fingerprint patterns. Theor Appl Genet 91:439-447.

208. Wu Y.-T., Zhang T.Z., Yin J.-M., 2001. Genetic diversity detected by DNA markers and phenotypes in upland cotton. Acta. Genet. Sinica, 28(11): 1040-1050.

209. Yang Hongyu and Kruger Jutta, 1994. Identification of an RAPD Marker Linked to the VF Gene for Scab Resistance in Apples. Plant Breeding, 112: 323-329.

210. Zhou Z.Q., Li Y.N., 2000. The RAPD evidence for the phylogenetic relationship of the closely related species of cultivated apple. Genet. Res. Crop Evolut., 47: 353-357.