Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ДНК-полиморфизма гороха посевного

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ ДНК-полиморфизма гороха посевного"

на правах рукописи

Дрибноходова Ольга Павловна

Анализ ДНК-полиморфизма гороха посевного (Pisum sativum L.)

Специальность 03.00.15. - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

О 3 CFH 2ODD

003476067

Диссертационная работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В

Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Гостимский Сергей Александрович.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Кудрявцев Александр Михайлович,

кандидат биологических наук Малеева Юлия Владимировна.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Центр «Биоинженерия» РАН.

Защита диссертации состоится «¿У» 2009 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при учреждении Российской Академии Наук Институте общей генетики им. Н.И Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, ул. Губкина, д. 3. Факс (499) 13289-62, электронная почта iogen@vigg.ru, адрес в Интернете: www.vigg.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке учреждения Российской Академии Наук Институте общей генетики им. Н.И Вавилова РАН.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Т. А. Синельщикова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Горох посевной (Pisum sativum L.) является старейшим модельным генетическим объектом, имеющим огромное практическое значение. Он широко используется в учебной и научной работе, на нем ведется изучение фотосинтеза и генетики развития, строения генома растений и мутагенеза (Vershinin et al, 2002; Гостимский и др, 2005). При этом общая площадь его посевов в Российской Федерации превышает 800 тыс. га, а собираемый урожай — полтора миллиона тонн в год; по производству зернового гороха Россия занимает третье место в мире (http://faostat.fao.org), что делает необходимым детальное изучение генома этого вида.

Однако его генетическая карта в настоящее время находится в стадии изучения и корректировки. Количество известных генетических маркеров гороха недостаточно для проведения точного картирования генов важных качественных и количественных признаков. Кроме того, для картирования на основе конкретных скрещиваний и эффективной селекционной работы необходима дополнительная информация о генотипах скрещиваемых линий, прежде всего по ДНК-маркерам. Поэтому в настоящее время перед исследователями стоят вопросы создания системы идентификации сортов гороха, картирования селекционно-ценных генов и оценки уровня генетических различий между сортами и их селекционного потенциала. Разработка системы надежных молекулярных маркеров, отражающих разнообразие сортов и линий гороха, и получение информации об их полиморфизме у репрезентативного набора сортов являются основой для решения этих задач.

Одним из наиболее современных методов ДНК-анализа является изучение микросателлитных локусов. Метод SSR-анализа (Simple Sequence Repeats) нашел широкое применение в научных и прикладных исследованиях для анализа генома растений и в качестве маркеров при конструировании генетических карт и идентификации видов и сортов (Хлесткина, Салина, 2006). Этот метод позволяет выявлять разнообразие генома по количеству нуклеотидных повторов в конкретных микросателлитных локусах. Большое число обнаруживаемых аллелей и высокий уровень изменчивости делают этот метод одним из наиболее информативных и надежных для изучения

генетического разнообразия. В геноме гороха посевного было обнаружено большое число микросателлитных локусов, однако распределение их аллелей в генотипах отдельных линий и сортов практически не исследовано, что ограничивает их практическое применение (Loridon et al., 2005).

RAPD-метод (Random Amplified Polymorphic DNA), позволяющий быстро выявлять большое число полиморфных локусов, расположенных в различных районах генома, является эффективным методом выявления генетического разнообразия, применяемым на многих культурах. На кафедре генетики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова RAPD-метод широко применяется для изучения генома гороха, в ходе исследований был получен большой материал по распределению RAPD-фрагментов у различных сортов и линий генетической коллекции гороха (Гостимский и др., 2005).

Одновременное применение RAPD- и SSR-методов позволяет проводить сравнительный анализ изменчивости генома гороха, основанной на разных мутационных механизмах, имеющей разную природу и скорость эволюции.

Цели и задачи

Целью данной работы являлся анализ молекулярно-генетической изменчивости гороха посевного по микросателлитным (SSR) и произвольным (RAPD) маркерам.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать полиморфные RAPD- и SSR-маркеры в ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха из коллекции кафедры генетики МГУ и определить генотипы этих форм по обнаруженным локусам.

2. Оцеиить уровень генетических различий между исследованными формами.

3. Выявить молекулярные маркеры, сцепленные с генами морфологических признаков гороха посевного и построить молекулярно-генетическую карту I группы сцепления.

4. Использовать полученные ДНК-маркеры для изучения изменчивости генома гороха в условиях космического полета.

Научная новизна

Проделанная работа впервые в России представляет данные по распределению аллелей микросагеллитных локусов у различных линий, сортов и мутантов гороха посевного и сравнительной оценке генетического разнообразия по двум типам молекулярных маркеров. Впервые проведено генотипирование 40 линий, сортов и мутантов по 24 микросателлитным локусам. В результате проведенной работы была составлена база данных генотипов линий и сортов гороха, широко употребляемых в научной и практической работе, по 205 ЛАРО-фрагментам и 24 ЗБЯ-локусам. На основе полученных данных были определены уровни внутривидового разнообразия гороха по ЛАРЭ- и 88К-маркерам. Проведено сравнение мутантных линий с исходными сортами по молекулярным маркерам.

Впервые было обнаружено, что сорта гороха разных направлений селекции различаются как по общему биоразнообразию по обоим типам маркеров, так и по распределению частот аллелей отдельных микросателлитных локусов. В частности, показано, что генетические различия между овощными сортами значительно ниже, чем между зерновыми сортами и маркерными линиями.

В ходе работы было показано, что обе использованные маркерные системы позволяют проводить идентификацию линий и сортов гороха.

Впервые было выявлено наличие пнутрилинейного полиморфизма у различных линий, сортов и мутантов гороха посевного как по ЯДРО-, так и по ЗБЯ-маркерам.

В результате проведенной работы впервые была определена локализация гена СЫ42, участвующего в синтезе хлорофилла, микросателлитного маркера АА155, а также семи ИАРО-маркеров. Кроме того, было уточнено взаимное расположение генов I и А/.

Впервые было установлено, что пребывание растений гороха в условиях космического полета на протяжении трех последовательных поколений не приводит к возникновению новых мутаций на уровне проанализированных последовательностей ДНК.

Практическое значение

В результате проведенной работы была составлена база данных, представляющая молекулярно-генетическое описание исследованных линий,

сортов и мутантов гороха из генетической коллекции кафедры генетики МГУ, используемых в научной и учебной работе. Эта база может быть использована как основа для создания системы идентификации и паспортизации сортов гороха и для сравнения ранее исследованных образцов с вновь изученными.

Анализ генетического родства между разными сортами гороха необходим для планирования скрещиваний как в научной и учебной работе, так и для селекционных мероприятий, а учет внутрисортовой гетерогенности — при разработке систем идентификации сортов.

Молекулярные маркеры, положение которых было определено в данной работе, могут быть использованы в дальнейшем при картировании в качестве генетических маркеров. Данные по локализации гена гороха, участвующего в биосинтезе хлорофилла, могут иметь селекционную ценность.

Молекулярно-генетический анализ генома растений, подвергавшихся воздействию условий космического полета, является необходимым этапом для разработки биологических систем жизнеобеспечения человека вне земной биосферы.

Апробация результатов исследований

Основные положения и результаты работы были представлены на XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004); III съезде ВОГиС (Москва, 2004); XII международной конференции «Ломоносов-2005» (Москва, 2005); третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); м еждународной конференции «Современные проблемы генетики» (к 40-летиго Института генетики и цитологии HAH Беларуси), (Минск, 2005); международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006); XIV международной конференции «Ломоносов-2007» (Москва, 2007); конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию рождения Н.И. Вавилова (Киев, 207); и заслушаны на научном семинаре отдела генетики растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 15 мая 2009 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, включенных в перечень научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 155 страницах и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, состоящий из 173 источников, и приложения. Работа иллюстрирована 24 рисунками, 12 таблицами и 7 диаграммами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе было использовано 40 форм гороха посевного из коллекции кафедры генетики МГУ, в том числе 8 мутантов (Хлорофилл 2, Хлорофилл 13, Хлорофилл 42, Хлорофилл 115, Штамбовый, Скрученный, Waxy 1, Хлорофилл 18), полученных на основе четырех зерновых сортов (Ранний Зеленый, Торсдаг, Капитал, Немчиповский), 13 линий (L-102, L-108, L-131, L-577, L-1132, WL-1238, L-1449, JI-2671, Новая Форма 42, R94, Хамелеон, Люпиноид, Роза Краун), несущих от 3 до 12 морфологических маркеров, а также 10 овощных (Анвенд, Афилла, Виола, Изумруд, Московский Деликатес, Узкобобовый, Амброзия, Жегаловский, Король Гурманов, Сахарный) и 9 зерновых (Богатырь, Капитал, Немчиновский, Неосыпающийся, Orus, Ранний Зеленый, Торсдаг, Филби, Флагман) сортов гороха. Для анализа внутрилинейного полиморфизма было выбрано четыре сорта (Афилла, Немчиновский, Торсдаг, Флагман), три мутанта (Штамбовый, Хлорофилл 2, Хлорофилл 42) и пять линий (Новая Форма 42, L-102, L-108, WL-1238, Люпиноид). Генетический анализ и картирование проводили на двух расщепляющихся популяциях второго поколения, полученных от скрещивания линии Новая Форма 42 с мутантом Штамбовый (в популяции было 160 растений), и мутанта Хлорофилл 2 с маркерной линией L-108 (59 растений). Полевые работы проводили на Звенигородской биостанции МГУ в 2004-2007 годах. Для изучения влияния условий длительного космического

5

полета на геном гороха было использовано 28 растений линии L-131 и 13 растений линии L-102, полученных в результате эксперимента по выращиванию трех последовательных поколений двух генетически маркированных линий гороха - L-102 и L-131. Растения обеих линий высаживали на борту Международной Космической Станции в оранжерее «Лада-3», где они проходили полный цикл вегетации. После созревания половину получаемых семян высаживали в оранжерее для следующего цикла, а остаток передавали на Землю, где выращивали методом гидропоники в условиях, аналогичных оранжерее «Лада-3». Из этих растений выделяли ДНК.

Выделение тотальной ДНК проводили СТАВ-изопропанольным методом. Для анализа было использовано 19 RAPD-, 5 ISSR-, и 4 lRAP-праймера, а также 24 микросателлитных локуса. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» и МС-2 фирмы «ДНК-технология» по программам: для RAPD-маркеров денатурация при 94°С - 2 мин 30 сек; пять циклов денатурация при 94°С - 30 сек, отжиг праймеров при 40 °С - 30 сек, элонгация при 70.5°С - 1 мин 20 сек; тридцать пять циклов денатурация при 93°С - 20 сек, отжиг праймеров при 37°С - 30 сек, элонгация при 71,5°С - 1 мин; конечная элонгация при 72°С - 5 мин; для SSR, ISSR и IRAP-маркеров денатурация при 94°С - 2 мин 30 сек; пять циклов денатурация при 94°С - 30 сек, отжиг праймеров при t+2 °С - 30 сек, элонгация при 70,5°С - 10 сек; тридцать пять циклов тридцать пять циклов денатурация при 93°С - 20 сек, отжиг праймеров при t°C - 30 сек, , элонгация при 71,5°С - 1 мин; конечная элонгация при 72°С - 5 мин. Температура отжига (t) для каждой пары SSR-праймеров была подобрана экспериментально, для IRAP-праймеров использовали температуру отжига 50"С, для ISSR-праймеров - 56°С.

Для электрофоретического разделения продуктов амплификации с RAPD, ISSR и IRAP-праймерами использовали 1,7% агарозный гель, приготовленный на TBE буфере с добавлением бромистого этидия в конечной концентрации 0,001%. SSR-маркеры с длиной амплифицируемого фрагмента менее 250 п.н. разделяли в 6% неденатурирующем полиакриламидном геле, а с длиной фрагмента более 250 п.н. - в 3% агарозном геле. Напряженность электрического поля при горизонтальном электрофорезе составляла 3 В/см, при вертикальном электрофорезе - 10 В/см.

Для проверки воспроизводимости полученных результатов эксперименты проводили в нескольких (не менее двух) повторностях.

Для генетического анализа расщеплений в Р2 использовали программный пакет Mapmaker 3.0 (Lander et al., 2005), a для оценки генетических расстояний между исследованными формами была использована компьютерная программа TREECON 1.3 (van de Peer, Wächter, 1993)

Результаты и обсуждение

Поиск мопекулярпо-гепетических различий между линиями и сортами гороха

Для изучения генетической изменчивости гороха посевного было использовано 8 RAPD-праймеров. Отдельные праймеры выявляли от 18 до 32 фрагментов, из которых 11-25 были полиморфными. С ДНК отдельных форм гороха всеми праймерами амплифицировалось от 115 до 149 фрагментов, в среднем 132,3 маркера на линию. Всего было получено 205 RAPD-маркеров, 155 из них обнаруживали различия между исследованными линиями (рис.1). Доля полиморфных фрагментов менялась от 61,11% до 84,21%, в зависимости от использованного праймера, составляя в среднем 75,46%. Данные по распределению обнаруженных маркеров среди всех сорока проанализированных образцов были представлены в виде матрицы состояний 205 бинарных признаков.

В результате проведенной работы впервые в России были получены данные по аллельному состоянию 24 микросателлитных локусов у 40 форм гороха посевного. Все проанализированные линии и сорта отличались уникальным сочетанием аллелей, а сами аллели хорошо распознавались при повторных анализах (рис. 2).

Количество аллелей, амплифицирующихся в конкретном локусе, менялось от 2 (PSU51918), до 10 (АВ71). Всего было получено 124 аллсля, что составляет в среднем 5,17 аллеля на локус. Индекс полиморфизма каждого локуса PIC (Polymorphism information content), равный

PIC = 1 - £(Pi)2 , где pi - частота аллеля

менялся от 0,119 (АА258) до 0,840 (АВ71), составляя в среднем 0,635. (таблица 1 ).

Рисунок 1. ЯАРО-спектры, полученные при амплификации ДНК линий гороха с праймером К8.

М 1 2 3 4 5 6

Обозначения: 1 - Ь-131, 2 - Ь-577, 3 - Ь-1132, 4 - Ь-1449, 5 - Л-2671, 6 -Люпиноид, М - маркер 100 + 1,5 + 3 кЬ (производство «СибЭнзим»). Электрофорез в 1,7% агарозном геле. Стрелками указаны полиморфные фрагменты.

Рисунок 2. вБИ-спектры линий и сортов гороха, полученные при амплификации локуса АЭ160.

Обозначения: 1 - Анвенд, 2 - Амброзия, 3 - Виола, 4 - Орус, 5 - Ранний Зеленый, 6 - Скрученный, 7 - Л-2671, 8 - Афилла, 9 - 1194, 10 - Ь-131, 11 -Ь-577, 12 - Ь-1449, 13 - Немчиновский, 14 - Роза Краун, 15 - Новая Форма 42, 16 - Ь-1132, 17 - \VL-1238. М - маркер р11С322¡МврП, фрагмент 190 п.н. (производство «СибЭнзим«). Стрелками указаны четыре амплифицируемых аллеля. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле.

Полученные матрицы представляют собой базу данных по аллельным состояниям исследованных ЯАР1> и БЗИ- маркеров и являются основой для расчета уровня внутривидовой изменчивости гороха посевного и определения сортовой принадлежности образцов.

Таблица 1. Аллельные варианты микросателлитных локусов.

ч X 0) ш X < к Р? О а ю < Афилла Богатырь Виола «I О т а о > пЗ: § [Капитал Король Гурманов Московский Деликатес о: о >5 2 га с £ О 0 Щ 1 Ютив [Ранний Зеленый Роза Краун Сахарный га 3 о о >5 3! ш О/ ш ° з; со ^ > е 1 га 2 га с е Число аллелей Размер аллелй (самого короткого и самого длинного, приблизительный в п.н.) ОЫ группа сцепления

А9 0 Е Е Е Е во С С О Е С В Е Э В ЕВ Е 5 360-390 0,744 4

АА67#370 А В о;с А А А А С В А 0 В Р В 0 вю О 7 370-420 0,762 1

АА81 Р С РА Р с Э С Р В О С А Р Э РВ в 7 220-240 0,794 5

АА121 В 0 АЕ 0 А В 0 0 С 0 0 0 О В 0 0 А 6 325-340 0,807 1

АА155 С с С в С С'С В с В 0 Е 0 0 С с с[с А 6 335-365 0,697 1

АА174 в в вв В А В С А В А С 0 С В 0 в|в в 4 430-445 0,701 4

АА200 А А 0|Е О 0 О Е А 0 Е 0 Е О А В 0! Е Е 6 205-220 0,792 6

АА255 #371 0 0 0:0 0 С 0 0 С 0 0 В А 0 С в 0 А С 4 370-380 0,561 4

АА255#295 0 0 0 А В 0 А 0 В 0 В А А А В 0 0 А 0 3 295-300 0,607 2

АА258 А А А А А А А С А А А А А А А А А1А А 3 220-230 0,119 1

АА335 0 А СЮ А А А А О С А А 0 А А В РЮ А 4 214-230 0,614 6

АВ28 А А Э! А А А; А А А А А В 0 А С 0 0 А А 5 375-390 0,527 1

АВ56 В В В; А В В В 0 В В С 0 0 С] В с с с А 5 345-360 0,668 1

АВ71 С В С В С ВС Е С О К В Е В!С в ВС К 10 140-175 0,840 6

АВ83 в В ВО В В В О В В 0 В О С В О вю О 5 360-370 0,633 5

АС75 А Е А: 0 А А: А д А А А А А А А с А:С А 5 260-280 0,557 1

АС76 Е С ЕЕ Е С Е А С Е Е Е А Е Е р Е й в 6 245-275 0,670 6

А051 В В В В 0 В 0 А В В В В А 0 В в В А С 4 230-245 0,582 6

АР147 Я с 0 с Р Р Р С Р Э С Р В Е Бб в 7 300-330 0,823 1

А0160 А А В А А В А А В В А А А С В А В А А 4 190-215 0,646 6

С20ВР А А А А А АА С А А А А А А А с А 0 А 4 230-250 0,392 1

021 I I I С I 1 I В 1 ! Е С 1 Е 1 р 1 й С 9 200-285 0,687 1

Р^51918 А В В В А А А в А В В А В В' В в А А В 2 ОКОЛ0145 0,460 1

Р53Ш1288 С А А А С С С А С А А С С А С в С: С С 3 135-140 0,566 1

Обозначения: По горизонтали перечислены исследованные сорта, по вертикали - проанализированные локусы. Аллели обозначены буквами по возрастанию длины фрагмента, А соответствует самому короткому аллелю, О - нуль-аллель. Для маркеров указаны число обнаруженных аллелей, их примерный размер, индекс полиморфизма каждого докуса и группа сцепления.

Идентификация линий и сортов

Определение сортопринадлежности по молекулярным маркерам является наиболее быстрым и эффективным методом идентификаций линий и сортов (Оганисян и др., 1996; Кожухова, Сиволап, 2004).

В данной работе определяли перспективы идентификации с помощью КАРБ- и ББК-маркеров 10 овощных и 9 зерновых сортов гороха, а также 13 маркерных линий. Мутанты из анализа были исключены, так как для их дифференциации требуется специальный анализ тех локусов, по которым они отличаются от исходных сортов.

Среди исследованных в данной работе полиморфных маркеров было выявлено 6 КАРЭ-фрагментов, амплифицирующихся только у одной формы, и 5 КАРБ-маркеров, присутствующих в спектрах всех линий, кроме одной. Из 124 аллелей, обнаруженных в результате вЗЯ-анализа, 21 аллель встречается только у одного из 32 сортов и линий. Анализ генотипов изученных форм показал, что для идентификации 32 линий и сортов достаточно определить аллельные состояния 4 микросателлитных локусов, что позволяет использовать данный метод для быстрой и эффективной идентификации генотипов. В таблице 3 представлен фрагмент матрицы генотипов сортов гороха, позволяющей идентифицировать исследуемые образцы.

Таблица 3. Матрица генотипов сортов гороха, позволяющая идентифицировать исследуемые образцы.

овощные зерновые

Анвенд Афилла I Виола Изумруд Московский Деликатес Узкобобовый Амброзия 'Жегаповстй Король Гурманов | Сахарный Богатырь Капитал Немчиновский Неосылающийся Огиэ | Ранний Зеленый Торсдаг Филби Флагман

АВ71 С С С С 0 В В В С С В Е Е К В Е в в К

АА255 #295 О О В ГЛ О О О О В В А О В В А !Л О А О

АШ47 г 0 р р Р в С ? ? в С С С с р В Е в в

АА81 р р р р Р Р С С С р А 0 В в С 0 В В

Обозначения: гю горизонтали перечислены сорта, по вертикали - локусы, анализ аллельных состояний которых позволяет идентифицировать эти сорта.

В случае КАРБ-анализа для идентификации образца достаточно 10-15 полиморфных ЯАРО-маркеров, то есть возможно определение сорта по анализу его КАРО-спектра по 1-2 праймерам.

Предложенная система идентификации и паспортизации сортов гороха отличается высокой надежностью, простотой и эффективностью. 8811-анализ позволяет идентифицировать образец по меньшему числу локусов. Однако в случае возможной внутрисортовой гетерогенности этот метод менее надежен, так как при малом числе анализируемых локусов изменение генотипа образца по одному локусу может привести к неправильной идентификации сорта. ИАРО-метод менее трудоемок, а анализ большого числа надежных локусов позволяет нивелировать влияние внутрисортовой гетерогенности. Оба метода позволяют проводить идентификацию образцов за один рабочий день.

Анализ мелслинейпого разнообразия

Средний уровень межлинейного 11АРБ-полиморфизма гороха посевного составляет 25,85%. Для 8811-маркеров средний уровень различий составил 65,54%, то есть в 2,5 раза выше. Тем не менее, данные, полученные при помощи обоих методов, дают сходные результаты.

Максимальный уровень различий в обоих случаях выявлен между сортом Король Гурманов и линией Ь-102 и составляет 92,36% для ЗБК-маркеров и 35,37% для ЯАРО-маркеров. Ближе всего друг к другу сорта Виола и Изумруд, они различаются на 8,33% по БЗЯ и на 2,44% по КАРБ-маркерам, что сопоставимо с уровнем различий между мутантами и исходными сортами. Такой уровень разнообразия по йАРО-маркерам обычен для растений-самоопылителей [Гостимский, 2005; Кудрявцев, 2007].

Сравнение уровня различий среди сортов разного селекционного направления показал, что они значительно отличаются по уровню разнообразия. В результате проделанной работы было установлено, что уровень внутригрупповой 88К-изменчивости среди овощных сортов значительно меньше, чем среди зерновых сортов. Значения полиморфизма среди зерновых сортов и среди маркерных линий близки. При среднем уровне разнообразия, составляющем 65,54% по данным 8811-анализа, внутригрупповая изменчивость зерновых сортов 66,26%, а линий - 67,69%, в то время, как для овощных сортов этот показатель составляет 43,15%, что в

11

1,54 раза ниже, чем у зерновых сортов (диагр. I). По ИАРО-маркерам зерновые и овощньге сорта отличаются в 1,11 раза.

Диаграмма 1. Внутригрупповая изменчивость сортов разного направления селекции по данным ЗБЯ-анализа.

100% 90% ; 80% :

Обозначения: Над столбиками указаны значения внутригрупповой изменчивости в перечисленных группах.

Кроме этого, группы сортов разного направления значительно отличаются по представленности аллелей отдельных ЗБЯ-локусов. Среднее число аллелей на локус для овощных сортов значительно ниже, чем у зерновых сортов, а у зерновых сортов ниже, чем у линий. Для линий обнаружено 20 аллелей, встречающихся только в этой группе, для зерновых сортов - 10. В случае овощных сортов таких аллелей только 3. К тому же овощные сорта полностью мономорфны по четырем локусам (16%), мономорфных локусов у линий и зерновых сортов не обнаружено (табл. 2). Хотя средние уровни различий внутри зерновых сортов и маркерных линий близки, по количеству обнаруженных аллелей маркерные линии значительно превосходят обе группы промышленных сортов. По всей видимости, это связано с особенностями их селекции, во время которой привлекался более разнообразный генетический материал.

В целом, заметные различия по частотам аллелей различных микросателлитных локусов и внутригрупповой гетерогенности у разных групп наблюдаются для всех проанализированных локусов, хотя и в разной

степени. По восемнадцати локусам (75,00% от общего числа проанализированных локусов) все три исследованные группы отличаются друг от друга (диаграмма 2). Еще по пяти локусам (20,83%) зерновые сорта похожи на маркерные линии, но отличаются от овощных сортов. По локусу АА335 (4,17%) овощные сорта сходны с маркерными линиями и отличаются от зерновых сортов.

Таблица 2. Особенности распределения аллелей БЗЯ-локусов у сортов разного селекционного направления.

1 2 4 5

Овощные сорта 59 6Ъ 2,46 3 4

Зерновые сорта 8/ Ъ/ 3,63 10 и

Линии 10Ь 1У 4,38 20 и

Обозначения: 1 - число аллелей, обнаруженных в данной группе; 2 -число аллелей, не обнаруженных в данной группе; 3 - среднее число аллелей на локус; 4 - число аллелей, встречающихся только в этой группе, 5 - число локусов, по которым данная группа мономорфна.

Диаграмма 2. Частота аллелей локуса АВ71 в сортах разного направления.

Овощные сорта Зерновые сорта Линии

аллели А, аллели А, аллель

Е, Р. О, Н, с о.Г.В 15.38°о

аллель Б: I, К аллель К; 1 аллель В: ..„„.,

10.00». \ 0.00"о аллель В ,, о ооп аллелЫ

Обозначения: цифрами на диаграммах указаны частоты соответствующих аллелей в у овощных и зерновых сортов и маркерных линий.

На основании этих данных можно сделать вывод, что овощные сорта отличаются значительно меньшим уровнем внутригрупповой изменчивости, чем сорта зернового направления, межсортовой полиморфизм которых сравним с уровнем изменчивости маркерных линий. При этом низкий уровень разнообразия овощных сортов, по-видимому, не связан с общностью происхождения (в группу входят сорта как отечественной, так и зарубежной селекции), что свидетельствует о снижении генетического разнообразия в этой группе.

На основе матриц генотипов исследованных линий, сортов и мутантов гороха невзвешенпым парно-групповым методом (ШОМА) при помощи компьютерной программы ТЯЕЕСОШ.З были построены дендрограммы, отражающие различия между ЛАРБ- и ЗБК-спектрами изученных образцов. В случае 88Я-маркеров каждый аллель рассматривали как отдельный признак, характеризующийся наличием или отсутствием фрагмента определенного размера (112 бинарных маркеров).

Кластеры с высоким значением бутстрепа (более 70%), поддерживаемые обоими типами маркеров, образуют только мутанты и их исходные сорта. Кроме того, удалось выделить несколько дополнительных групп. Это кластеры, включающие родственные овощные сорта Анвенд, Виола и Изумруд; фасциированные формы Люпиноид, Л-2671 и Роза Краун (все несут мутацию /а). С группой сорта Немчиновский и его мутантов кластеризуются линия Новая Форма 42, несущая мутацию сЫ42, введенную в нее из мутанта Хлорофилл 42, и (только по данным КАРП-анализа) линия Я94, родственная сорту Немчиновский.

На дендрограмме, построенной по данным 88К-анализа, все овощные сорта образуют единую группу. Зерновые сорта отдельной группы не образуют, но с овощными сортами не смешиваются. По данным КАРБ-анализа выделяются два удаленных друг от друга кластера овощных сортов. Первый включает сорта Афилла, Амброзия и Московский Деликатес, а во второй, помимо остальных овощных сортов, включены две линии и зерновой сорт Богатырь.

Анализ генетических дистанций между изученными сортами свидетельствует о том, что овощные сорта образуют отдельную группу, характеризующуюся сниженным уровнем генетического разнообразия, и достаточно четко отделяющуюся от зерновых сортов и маркерных линий. При этом минимальные различия между отдельными овощными сортами (Виола и Изумруд) сопоставимы с различиями между мутантами и их исходными формами, что свидетельствует об их близком родстве. Таким образом, полученные результаты по молекулярно-генетическому анализу изученных образцов позволяют оценить родство и происхождение сортов гороха.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что для получения надежных генеалогических реконструкций на основании БЭЛ-маркеров

14

необходимо использовать большое число локусов, причем желательно каждую аллель рассматривать как отдельный признак.

Анализ мутантов

Среди форм, исследованных в данной работе, было 8 мутантов, полученных на кафедре генетики из четырех разных сортов зернового направления. Семь мутантов были получены путем индуцированного мутагенеза, еще один несет спонтанную морфологическую мутацию. Их сравнение с исходными сортами показало, что по распределению ЯАРО-маркеров все мутанты, исследованные в работе, отличались от исходных форм. Уровень различий между мутантами и исходными сортами составил от 0,98% до 9,51 %, в среднем 3,63%.

Анализ ЗБЯ-спектров показал, что все индуцированные мутанты отличались от исходных сортов. Степень отличий составила 4,17-22,92%, в среднем 9,38%. Различий между спонтанным мутантом Скрученный и исходным сортом Ранний Зеленый по БвЛ-маркерам не обнаружено.

Установленные факты различий между мутантами и исходными сортами представляют значительный интерес, указывая на большой масштаб генетических изменений при мутагенном воздействии.

Анализ внутрилинейногоразнообразия

Одним из основных условий проведения генетических исследований на любом объекте является знание уровня его генетической чистоты. Контроль за чистотой линии имеет большое значение в селекционной работе при формировании новых сортов и при решении вопросов, связанных с правами оригинаторов сортов, а также при необходимости использования однородного материала. Явление внутрилинейного полиморфизма описано у многих видов растений (Кудрявцев, 2006), однако у гороха посевного внутрисортовая изменчивость до сих пор практически не изучена.

Для анализа внутрилинейного разнообразия были выбраны мутанты Хлорофилл 2 и Штамбовый, линии Ь-108 и Новая Форма 42, использованные в дальнейшем для картирования, мутант Хлорофилл 42, на основе которого была получена линия Новая Форма 42, сорт Немчиновский, являющийся исходным для мутантов Штамбовый и Хлорофилл 42. Кроме того, были взяты часто применяемая в учебной и научной работе маркерная линия

15

1238, три промышленных сорта (Флагман, Торсдаг, Афилла) и две линии - Ь-102 и Люпнноид, у которых внутрилинейный полиморфизм был обнаружен ранее (Дрибноходова, 2007). Эти формы были протестированы по 8 ИАРО-праймерам и 12 микросателлитным локусам.

Проведенная работа показала, что все проверенные линии, сорта и мутанты неоднородны по КАРО-марксрам. Однако разные формы значительно различаются по уровню внутрилинейной изменчивости - у 7 из 12 сортов доля полиморфных фрагментов не превышает 2,00%, а в среднем равна 4,84%. По БЗЯ-маркерам внутрилинейные различия были выявлены у 5 из 12 проанализированных форм, количество полиморфных локусов у разных линий менялось от 1 до 4. При этом значения внутрилинейной изменчивости по ЛАРЭ-фрагментам у форм, мономорфных по ББН-маркерам, не превышает 5,00% (Диаграмма 3).

В целом все исследованные формы можно условно разделить на три группы. К первой относится большинство сортов, часть маркерных линий и мутанты Хлорофилл 42 и Штамбовый. Для них характерен низкий уровень внутрилинейной неоднородности по обоим типам маркеров - менее 2% по ЛАРО-маркерам (2-3 локуса на использованном наборе маркеров) и 0-1 полиморфный ББЯ-локус. Такой уровень изменчивости не вызывает затруднений при научной работе и, по-видимому, является обычным для большинства сортов. Близкий уровень внутрисортовых различий обнаружен у ячменя (Брик и др., 2006) и пшеницы (Кудрявцев, 2006). Ко второй группе со средним уровнем внутрилинейного полиморфизма можно отнести сорт Афилла и мутант Хлорофилл 2 - до 6% по КАРЭ-маркерам (8 и 11 ЯАРО-маркеров и 0 и 2 ЗБЯ-локуса, соответственно). К третьей группе относятся три линии (Новая Форма 42, Люпиноид и Ь-102), сортов и мутантов в этой группе нет. Для них характерен высокий уровень внутрилинейной изменчивости по обоим типам маркеров (24-33 ЯАРЭ-фрагментов и 2-4 8811-локуса). Анализ известных данных по происхождению этих форм позволяет сделать вывод, что основной причиной столь высокого уровня неоднородности является недостаточная отселектированность линии по молекулярным признакам в процессе ее получения.

Выявление молекулярной гетерогенности индивидуальных растений разных линий гороха свидетельствует о том, что 11АРО-метод, позволяющий быстро анализировать большое число локусов по всему геному, может с

16

успехом использоваться для выявления истинно чистых линий у гороха и других растений-самоопылителей.

Диаграмма 3. Внутрилинейный полиморфизм по ББЛ- и ЯАРО-маркерам

Обозначения: светло-серым указан уровень внутрилинейного полиморфизма по микросателлитным локусам, темно-серым - по RAPD-маркерам.

Картирование

Обнаруженные в работе полиморфные маркеры были использованы для картирования генов морфологических признаков. Локализация новых генов и насыщение карты молекулярными маркерами остается одной из основных задач генетики, сохраняющей свою важность на всех этапах изучения генома объекта.

В результате проведенной работы на основе популяции второго поколения Новая Форма 42 х Штамбовый были построены фрагмент молекулярно-генетической карты V группы сцепления длиной 6,4 сМ и фрагмент молекулярно-генетической карты I группы сцепления длиной 100,4 elvi. Ген chi42 был локализован на молекулярно-генетической карте гороха посевного в I группе сцепления на расстоянии 35,3 сМ от гена I (рис. 3). Уточнена взаимная ориентация генов / и Af. Обнаружено сцепление RAPD-маркера Q20#1200 с генами R и 77 и RAPD-маркера R13#650 с генами У и c.hi.42, а также сцепление RAPD-маркеров R15#710 и К8#420. Маркеры находятся в состоянии притяжения на расстоянии 4,3 сМ.

На основе второй популяции Р2 (Хлорофилл 2 х Ь-108) были построены два фрагмента молекулярно-генетической карты I группы сцепления протяженностью 18,3 и 14,5 сМ. Расстояния между якорными локусами, рассчитанные на основе этой популяции, оказались значительно меньше, чем можно было ожидать на основании литературных данных (Ьопс1оп е1 а!., 2005). По всей видимости, это связано с влиянием транслокации. На полученной карте были локализованы 5 КАРБ-маркеров и уточнено положение ББЯ-маркера АА155.

Рис.3. Карта участка I группы сцепления гороха в районе локусов сЫ42 - А/

|_ос!" АА67 3.6 I 19.9 сМ

и АВ28 5.241 17.4 сМ

^ АВ56 6.5 | 15.0 сМ м 11 сМ

7.07| 13.6я

АС75

1.8 сМ

21.9 сМ

3771

тЗ#670 6.741 13.4 сМ

Обозначения: Ьос1 - значение Ьоё-балла..

Всего на двух картирующих популяциях было изучено расщепление по 7 морфологическим маркерам, 9 микросателлитным локусам и 25 ЯАРБ-фрагментам. Консенсусная карта I группы сцепления гороха посевного, полученная в результате объединения фрагментов карт, построенных на основании двух скрещиваний, включает 3 морфологических, 6 ЯАРО- и 9 88Г{-марксров и имеет протяженность около 135 сМ.

Изучение влияния условий длительного космического полета на геном гороха.

Проведенная работа по изучению внутри- и межсортовой изменчивости гороха посевного позволила приступить к исследованию генетической изменчивости растений, прошедших несколько генераций на борту

Международной Космической Станции. Одним из приоритетных направлений космических исследований является изучение отдаленных генетических последствий длительного культивирования растений в космосе. Многими авторами высказывалось предположение, что космическое излучение, состав атмосферы орбитальной станции и прочие факторы космического полета могут вызывать изменения генетического аппарата у растений и при длительном воздействии могут способствовать возникновению мутаций. Это значит, что молекулярно-генетический анализ генома растений, подвергавшихся воздействию условий космического полета, является необходимым этапом для разработки биологических систем жизнеобеспечения человека вне земной биосферы.

В ходе работы было исследовано 28 растений линии Ь-131 и 13 растений линии Ь-102; в качестве контроля было использовано по 10 индивидуальных растений этих линий. Всего в ходе исследований было проанализировано 135 КАРБ-фрагменто^ полученных с помощью 10 КАРО-праймеров, 37 18811-маркеров, амплифицируемых 5 18811-праймерами, 149 межретротранспозонных фрагментов ДНК, выявляемых при помощи различных комбинаций четырех ЖАР-праймеров, а также 10 микросателлитиых локусов.

Анализ электрофореграмм индивидуальных контрольных растений показал, что линия 131 однородна по всем исследованным маркерам, кроме АБ04#530 (0,75% внутрилинейиого полиморфизма), а линия 102 проявила виутрилинейный полиморфизм по 12,4% 11АРБ-маркеров и по 88Я-локусу АО 147. Присутствие этих фрагментов в опытных растениях совпадает с контролем. Маркеры, по которым контрольные растения были неоднородны, были исключены из исследования изменчивости.

Сравнение спектров опытных и контрольных растений не обнаружило видимых отличий. Анализ спектров показал, что в каждом опытном растении амплифицируются все ожидаемые фрагменты, при этом новых фрагментов не наблюдается.

Таким образом, всеми использованными методами было показано, что у потомства растений, прошедших несколько генераций в условиях космического полета, новых мутаций на уровне исследованных фрагментов ДНК не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии значительного влияния факторов космического полета на генетический аппарат растений.

выводы

1. Проведен анализ молекулярно-генетического полиморфизма 40 линий, сортов и мутантов гороха посевного по SSR- и RAPD-маркерам. Составлена база данных, представляющая генотипы исследованных образцов по 24 микросателлитным локусам и 205 RAPD-фрагментам, на основе которой разработаны подходы для паспортизации и идентификации сортов и линий гороха этими методами. Выявлены полиморфные SSR- и RAPD-маркеры, характерные для определенных линий и сортов гороха.

2. Установлено, что средний уровень полиморфизма среди изученных форм составляет 65,54% по SSR-маркерам и 25,85% по RAPD-маркерам. Генетическое разнообразие у сортов овощного направления селекции по микросателлитным маркерам в 1,5 раза ниже, чем у сортов зернового направления и маркерных линий, а наименьшие различия по исследованным локусам наблюдаются между мутантами и их исходными сортами и составляют в.среднем 9,38% по SSR-маркерам и 3,63% по RAPD-маркерам.

3. Обнаружен внутрилинейный полиморфизм по RAPD-маркерам у 12 различных форм гороха посевного, составляющий в среднем 4,84%. Внутрилинейный SSR-полиморфизм обнаружен у 5 из 12 проанализированных форм и составляет в среднем 7,64%

4. Построен фрагмент молекулярно-генетической карты I группы сцепления гороха посевного. Впервые локализованы новая морфологическая мутация chi42,1 SSR- и 7 RAPD-маркеров.

5. Показано, что выращивание растений гороха в течение трех последовательных поколений в условиях космического полета не приводит к изменению аллельного состава изученных ДНК-маркеров у потомства этих растений.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Дрибноходова О. П. «Использование молекулярных маркеров для генотипирования линий, сортов и мутантов гороха». Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» М.: МГУ, биологический факультет, 2004. С. 43-44.

2. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Ковеза О.В., Чегамирза К., Коновалов Ф.А., Дрибноходова О.П. «Использование молекулярных маркеров для

анализа генома гороха». Материалы III съезда ВОГИС. т.1. Москва. 2004. С. 69.

3. Дрибноходова О.П. «Использование молекулярных маркеров для выявления изменчивости генома гороха, вызванной условиями космического полета». Материалы международной конференции «Ломоносов-2005». М.: Макс-пресс, 2005. С. 74-75.

4. Дрибноходова О.П., Хартина Г.А. «Использование RAPD-маркеров для генотипирования линий, сортов и мутантов гороха». Материалы Третьего Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», 2005. часть 1. С. 244.

5. Кокаева З.Г., Дрибноходова О.П., Гостимский С.А. «Исследование генетической изменчивости растений гороха под влиянием факторов космического полета». Материалы международной конференции «Современные проблемы генетики» (к 40-летию Института генетики и цитологии НАН Беларуси). Минск, 2005. С. 89.

6. Дрибноходова О.П. «Молекулярно-генетический анализ потомства растений гороха, выращенных в космической оранжерее на борту МКС». Материалы международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГеи им. Н.И. Вавилова РАН. М.: РИИС ФИАН, 2006, С. 63.

7. Дрибноходова О.П. «Изучение меж- и внутрилинейного полиморфизма гороха посевного с помощью RAPD-маркеров. Материалы XIV международной конференции «Ломоносов-2007». М.: Макс-пресс, 2007. С. 52-53.

8. Dribnokhodova P.P., Kokaeva Z.G. «Study of intralinear DNA polymorphism in pea (Pisum sativum L.)». Abstract book conferece for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov. Kyiv, Ukraine, 2007. P.13.

9. Kokaeva Z.G., Dribnokhodova P.P., Aleshin A.V. «Genetic variability of pea caused by space flight conditions». Abstract book conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov. Kyiv, Ukraine, 2007, p. 23.

Ю.Дрибноходова О.П., Кокаева З.Г., Гостимский С.А. «Идентификация сортов, линий и мутантов гороха посевного (Pisum sativum L.) с помощью RAPD-маркеров». Сельскохозяйственная биология, 2005. № 5. С. 61-66.

11 .Гостимский С.А., Левинских М.А., Сычев В.Н., Кокаева З.Г., Дрибноходова О.П., Хартина Г.А., Бингхем Г. «Исследование генетических эффектов в потомстве растений гороха, выращенных в течение полного цикла онтогенеза в космической оранжерее на борту PC МКС». Генетика, 2007, т.43, №8. С.1050-1057.

12.Дрибноходова О. П.. Гостимский С. А. «Исследование аллельного полиморфизма микросателлитных локусов у разных линий, сортов и мутантов гороха посевного (Pisum sativum L.)». Генетика. 2002 т. 45, №7. С. 900-906.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 07-04-00652, программы «Ведущие научные школы» 4202.2006.4 и программы президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

Отпечатано в копицентре «С'Г ПРИНТ» Москва. Ленинские горы. МГУ, 1 Гуманитарный корпус, www.stprint.ru e-mail: elobus9393338@yandex.ru тел.: 939-33-Тираж 70 экз. Подписано в печать 14.07.2009 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дрибноходова, Ольга Павловна

Список сокращений.

Введение.

Цель работы.

Обзор литературы.

Организация ядерного генома высших растений.

Изучение полиморфизма генома растений.

Проблема генетического картирования у растений.

Картирование генома гороха.

Изучение молекулярно-гснетического полиморфизма

RAPD-маркеры.

SSR-маркеры.

Изучение влияния условий космического полета на геном высших растений.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Дрибноходова, Ольга Павловна

Выводы

1. Проведен анализ молекулярно-генетического полиморфизма 40 линий, сортов и мутантов гороха посевного по SSR- и RAPD-маркерам. Составлена база данных, представляющая генотипы исследованных образцов по 24 микросателлитным локусам и 205 RAPD-фрагментам, па основе которой разработаны подходы для паспортизации и идентификации сортов и линий гороха этими методами. Выявлены полиморфные SSR- и RAPD-маркеры, характерные для определенных линий и сортов гороха.

2. Установлено, что средний уровень полиморфизма среди изученных форм составляет 65,54% по SSR-маркерам и 25,85% по RAPD-маркерам. Генетическое разнообразие у сортов овощного направления селекции по микросателлитным маркерам в 1,5 раза ниже, чем у сортов зернового направления и маркерных линий, а наименьшие различия по исследованным локусам наблюдаются между мутантами и их исходными сортами и составляют в среднем 9,38% по SSR-маркерам и 3,63% по RAPD-маркерам.

3. Обнаружен впутрилинейный полиморфизм по RAPD-маркерам у 12 различных форм гороха посевного, составляющий в среднем 4,84%. Впутрилинейный SSR-полиморфизм обнаружен у 5 из 12 проанализированных форм и составляет в среднем 7,64%>

4. Построен фрагмент молекулярно-генетической карты I группы сцепления гороха посевного. Впервые локализованы новая морфологическая мутация chi42, 1 SSR- и 7 RAPD-маркеров.

5. Показано, что выращивание растений гороха в течение трех последовательных поколений в условиях космического полета не приводит к изменению аллельного состава изученных ДНК-маркеров у потомства этих растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенная работа посвящена изучению молекулярно-геиетического полиморфизма гороха посевного. Не первый этап состоял в описании полиморфизма и изучении распределения маркеров двух разных типов -RAPD и SSR - у 40 линий, сортов и мутантов гороха. В общей сложности было проанализировано 24 SSR- и 205 RAPD-локусов.

По обоим типам маркеров был обнаружен высокий уровень генетического разнообразия. 75,46% RAPD-маркеров выявляли полиморфизм на исследованной выборке. Все исследованные микросателлитные локусы были полиморфны, при этом среднее количество аллелей на локус составило 5,17, а среднее значение индекса полиморфизма - 0,635, что хорошо согласуется с литературными данными [Loridon et al., 2005]. Анализ распределения аллелей изученных локусов показал, что различия между линиями и сортами гороха по микросателлитным локусам значительно превышают уровень различий, рассчитанных по данным RAPD-анализа, что свидетельствует о высокой эффективности данного метода. Средний уровень межлипейного RAPD-полиморфизма гороха посевного составляет 25,85%, а SSR-полиморфизма - 65,54%), что в 2,5 раза выше. Тем не менее, данные, полученные при помощи обоих методов, обнаруживают сходную тенденцию.

В результате проведенной работы было обнаружено, что уровень внутригрупповой изменчивости овощных сортов по микросателлитным локусам в 1,54 раза ниже, чем у зерновых сортов. Значения полиморфизма среди зерновых сортов и среди маркерных линий близки. Данные RAPD-анализа показывают ту же тенденцию, но меньший диапазон различий. Среднее число аллелей на SSR-локус для овощных сортов также значительно ниже, чем у зерновых сортов. Таким образом, овощные сорта образуют отдельную группу, характеризующуюся сниженным уровнем генетического разнообразия, и достаточно четко отделяющуюся от зерновых сортов и маркерных линий. Кроме того, все три группы значительно отличаются друг от друга по частотам аллелей различных микросателлитиых локусов.

Суммарные данные по распределению аллелей RAPD- и SSR-локусов у разных линий и сортов гороха представляют собой базу данных, которая может быть использована для дальнейшего планирования эффективных скрещиваний, выявляющих наибольший генетический полиморфизм, что существенно облегчает работу по картированию генома гороха.

Эта база является хорошей основой для разработки методики определения сортоприпадлежности образцов гороха. Показано, что для однозначной идентификации 20 сортов и 12 линий гороха посевного достаточно анализа аллельпых состояний четырех микросателлитиых локусов или 10-15 полиморфных RAPD-фрагмептов. Кроме того, обнаружено 11 RAPD и 21 SSR аллелей, характерных для определенных линий и сортов гороха. Такие маркеры удобны для экспресс-диагностики данных генотипов, изучения родственных отношений форм гороха и картирования.

Высокополиморфиые полилокуспые SSR-маркеры представляют собой мощный инструмент для сравнительного изучения полиморфизма у гороха посевного и идентификации сортов, превосходя в этом отношении RAPD-маркеры.

Анализ данных по распределению исследованных молекулярных маркеров у разных форм гороха при помощи компьютерной программы TREECON1.3 показал, что на дендрограмме, построенной по SSR-маркерам, все овощные сорта образуют отдельный кластер. Зерновые сорта и маркерные линии отдельных групп не образуют. На дендрограмме, основанной па RAPD-маркерах, овощные сорта выделяются в два не связанных друг с другом кластера. Надежные кластеры с высоким значением бутстрепа (более 70%), поддерживаемые обоими типами маркеров, образуют только мутанты и их исходные сорта. Тем не менее, анализ дендрограмм, полученных в данной работе, позволяет проводить приблизительную оценку уровня биоразнообразия в группах сортов и степень близости отдельных форм.

Сравнение дендрограмм, построенных на основе SSR-маркеров разными способами, показывает, что лучшие результаты дает рассмотрение каждой анализируемой аллели как отдельного бинарного локуса. Кроме того, для SSR-анализа требуется использовать большое число локусов, так как их высокая изменчивость не позволяет обнаруживать достаточного уровня сходства между анализируемыми формами.

Уровень различий между изученными в дайной работе мутантами и их предковыми сортами значительно ниже межсортового полиморфизма и составляет в среднем 3,63% по RAPD и 9,38% по SSR-маркерам. Тем не менее, обнаруженные различия между мутантами и исходными сортами указывают на большой масштаб генетических изменений при мутагенном воздействии. То, что линия, полученная самоопылением одного мутантпого растения, отобранного по четко проявляющемуся морфологическому изменению, несет значительное количество невидимых генетических изменений, является перспективным направлением для дальнейших исследований.

Явление внутрилинейного полиморфизма описано у многих видов растений, однако у гороха посевного впутрисортовая изменчивость до сих пор практически не изучена. Проведенный в данной работе анализ внутрилинейного полиморфизма у 12 форм гороха по 8 RAPD-праймерам и 12 микросателлитным локусам показал, что все проверенные линии, сорта и мутанты неоднородны по RAPD-маркерам, в то время как по SSR-маркерам внутрилинейный полиморфизм выявлен только у 5 форм. При этом значения внутрилинейного RAPD-полиморфизма у форм, мономорфных по SSR-маркерам не превышают 5%. Для большинства сортов и маркерных линий характерен низкий уровень внутрилинейного полиморфизма по обоим типам маркеров - менее 2% по RAPD-маркерам (2 - 3 полиморфных локуса на использованном наборе маркеров) и 0 - 1 полиморфный SSR-локус. Такой уровень изменчивости не вызывает затруднений при работе и, по-видимому, является обычным для большинства сортов. Случаи высокого внутрилинейного полиморфизма объясняются недостаточной огселектированностыо линий в процессе их получения.

Выявление молекулярной гетерогенности индивидуальных растений разных линий гороха свидетельствует о том, что RAPD-метод, позволяющий быстро анализировать большое число локусов по всему геному, может с успехом использоваться для выявления истинно чистых линий у гороха и других растений-самоопылителей.

Второй этап проделанной работы состоял в использовании полученных данных для картирования генома гороха. Локализация новых генов и насыщение карты молекулярными маркерами остается одной из основных задач генетики, сохраняющей свою важность па всех этапах изучения генома объекта.

Всего на двух картирующих популяциях было изучено расщепление по 7 морфологическим маркерам, 9 микросателлитиым локусам, 25 RAPD-- фрагментам и трапелокации. В результате проведенной работы была определена локализация гена СЫ42, участвующего в синтезе хлорофилла, SSR-маркера АА155 и семи RAPD-маркеров, уточнено взаимное расположение генов / и Af, а также построены фрагменты молекулярно-генетической карты гороха первой и пятой групп сцепления. Ген chi42 был локализован па молекулярпо-генетической карте гороха посевного в первой группе сцепления на расстоянии 35,3 сМ от гена /. Консенсусная карта первой группы сцепления, полученная в результате объединения данных обоих скрещиваний, включает 3 морфологических, 6 RAPD- и 9 SSR-маркеров имеет протяженность около 135 сМ.

Проделанная работа по изучению внутри- и межсортовой изменчивости гороха посевного позволила приступить к исследованию молекулярно-генетического полиморфизма растений, прошедших несколько генераций на борту Международной Космической Станции. Проведенный анализ двух генетически маркированных линий гороха закладывает основы для изучения влияния условий космического полета на геном высших растений, что является необходимым этапом для разработки биологических систем жизнеобеспечения человека вне земной биосферы. В ходе данной работы было показано, что у потомства растений, прошедших несколько генераций в условиях космического полета, новых мутаций на уровне исследованных фрагментов ДНК не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии значительного влияния факторов космического полета на генетический аппарат растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дрибноходова, Ольга Павловна, Москва

1. Антонов А. С. Геносистематика растений.// М.: ИЦК «Академкнига». 2006. 293 с.

2. Артамонова В. С. Генетические маркеры в популяциоппых исследованиях атлантического лосося (Salmo salar L.) II. Анализ последовательностей ДИК.// Генетика. 2007. т. 47. №4. с. 437-450.

3. Артюкова Е. В., Козыренко М. М., Корень О. Г., Музарок Т. И., Реунова Г. Д., Журавлев Ю. Н. RAPD и аллозимпый анализ генетической изменчивости Panax ginseng С. A. Meyer и P. quinquefolius L.// Генетика. 2004. т. 40. № 2. с. 239 247. (а).

4. Артюкова Е. В., Холипа А. Б., Козыренко М. М., Журавлев Ю. П. Анализ генетической изменчивости редкого эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) на основе RAPD-маркеров.// Генетика. 2004. т. 40. № 7. с. 877-884. (б).

5. Брик А. Ф.5 Календарь Р. Н., Сатула О. Р., Сиволап Ю. М. IRAP- и REMAP анализ сортов ячменя одесской селекции.// Цитология и генетика. 2006. №3. с. 24-33.

6. Бузовкина И. С., Лутова Л. А. Генетическая коллекция инбредных линий редиса: история и перспективы.// Генетика. 2007. т. 43. № ю. с. 1411-1423.

7. Ваулина Э. Н. Исследование мутагенных факторов космического полета. // Мутагенез при действии физических факторов. — под ред. Дубинина Н.П. и др. 1980. М., «Наука», - С. 211.

8. Галаев А. В., Бабаенц Л. Т., Сиволап Ю. М. Детекция интрогрессии элементов генома Aegilops cylindrical Host, в геном Triticum aestivum L. с помощью ISSR и SSR-апализа.// Генетика. 2004. т. 40. №12. с. 1654-1661.

9. Голубовская И. Н. Локализация двух ме-генов кукурузы с помощью В-А транслокаций.// Генетика. 1987. т. 23. № 4. с. 698-706.

10. Гостимский С. А., Кокаева 3. Г., Коновалов Ф. А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров.//Генетика. 2005. т. 41. №4. с. 480-492.

11. Горюнова С. В., Чикида Н. Н., Кочиева Е. 3. Молекулярный анализ филогенетических отношений диплоидных видов эгилопса секции Sitopsis.ll Генетика. 2008. т. 44. № 1. с. 137-141.

12. Грушецкая 3. Е., Лемеш В. А., Поликсенова В. Д., Хотылева Л. В. Картирование локуса Cf-б устойчивости к кладоспориозу томата с помощью SSR-маркеров.// Генетика. 2007. т. 43. №11. с. 1511-1516.

13. Дорохов Д. Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов.// Генетика. 1997. т. 33, №4. с. 443 -450.

14. Дрибноходова О. В, Кокаева 3. Г., Гостимский С. А. Идентификация сортов, линий и мутантов гороха посевного с помощью RAPD-маркеров.// Сельскохозяйственная биология. 2005. №5. с. 61-67.

15. Ежова Т. А., Гостимский С. А. Анализ кариотипов хлорофилльных мутантов и исходных сортов гороха.// Биологические науки. 1976. № 9. с. 101-106.

16. Ежова Т. А., Гостимский С. Л. Локализация хлорофилльных мутантов гороха.// Генешка. т. 17, №7. с. 1259- 1265, 1981 г.

17. Ежова Т. А. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.// М.: МГУ. 1977.

18. Ежова Т. А., Солдатова О. П., Пении А. А., Шесгаков С. В. Молекулярно — генетическое картирование генома растений.// М.: Макс-пресс. 2002.

19. Животовский Л. А. Микросателлитиая изменчивость в популяциях человека и методы ее изучения.// Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. №1. с. 74-96. (а).

20. Животовский Л. А. Популяционные проблемы судебной генетики.// Генетика. 2006. т. 42. № 10.'с. 1426-1436. (б).

21. Журавлев Ю. П., Козырспко М. М., Арткова Е. В., Реунова Г. Д., Музарок Т. И., Еляков Г. Б. ПЦР генетическое типирование женьшеня с использованием произвольных праймеров.// Доклады Академии наук. 1996. т. 349. №1. с. 111 - 114.

22. Ковеза О. В., Кокаева 3. Г., Гостимский С. А., Петрова Т. В., Осипова Е. С. Создание SCAR маркеров у гороха {Pisum sativum L.) на основании RAPD - анализа.// Генетика. 2001. т. 37. №4. с. 574 - 576.

23. Ковеза О. В. Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических паук. Москва. 2003.

24. Ковеза О. В. Кокаева 3. Г., Коновалов Ф. А., Гостимский С. А. Выявление и картирование полиморфных RAPD-маркеров генома гороха (Pisum sativum L).//Генетика. 2005. т. 41. №3. с. 341-348.

25. Ковеза О. В., Гостимский С. А. Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха {Pisum sativum L).// Генетика. 2005. т. 41. №11. с. 15221530.

26. Кожухова Н. Е., Сивалап IO. М. Идентификация и регистрация генотипов кукурузы при помощи молекулярных маркеров.// Генетика. 2004. т. 40. №1. с. 59-66.

27. Кожухова Н. Э., Сиволап Ю. М., Молекулярные маркеры в генетико-селскциоипых исследованиях кукурузы.// Цитология и генетика. 2006. №5. с. 69-80.

28. Козыренко М. М., Артюкова Е. В., Ревунова Г. Д., Левина Е. А, Журавлев Ю. Н. Генетическая изменчивость и взаимоотношения лиственниц Сибири и дальнего востока по данным RAPD анализа.// Генетика. 2004. т. 40. №4. с. 506 - 515.

29. Кокаева 3. Г., Боброва В. К., Вальехо-Роман К. М., Гостимский С. А., Троицкий А. В. RAPD-аиализ сомаклоиальиой и межсортовой изменчивости гороха.// Доклады Академии Наук. 1997. т. 335. №1. с. 134136.

30. Кокаева 3. Г., Боброва В. К., Петрова Т. В., Гостимский С. А., Троицкий А. В. Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха посевного по данным RAPD-анализа.// Генетика. 1998. т. 34. №6. с. 771-777.

31. Кокаева 3. Г., Боброва В. К., Гостимский С. А., Троицкий А. В. Наследование и характеристика RAPD маркеров, выявленных у сомаклоиальных вариантов гороха.// Доклады академии наук. 2000. т. 372. №4. с. 565-567.

32. Кочиева 3. Г., Оганисян А. С., Рыськов А. Г1. RAPD маркеры генома картофеля: клонирование и использование для определения межвидовых и межсортовых различий.// Молекулярная биология. 1999. т. 33. №5. с. 893 -895.

33. Кочиева Е. 3., Рыжова П. П., Легкобит М. П., Хадеева Н. В. RAPD- и ISSR-анализ видов и популяций рода Stachys.ll Генетика. 2006. т. 42. №7. с. 887-892.

34. Кравченко А. П., Ларионова А. Я., Милютин Л. И. Генетической полиморфизм ели сибирской {Picea obovata Lebed.) в средней Сибири.//Генетика. 2008. т. 44. № 1 с. 45-53.

35. Кудрявцев А. М. Внутрисортовая гетерогенность твердой пшеницы важный компонент биоразнообразия вида.// Генетика. 2006. т. 42. №10. с 1437- 1440.

36. Кудрявцев А. М. Создание системы генетических маркеров твердой пшеницы (Т. durum Desf.) и ее применение в научных исследованиях и практических разработках.// Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. 2007. М.: Цифровичок.//

37. Кузнецова О. И., Аш О. А., Хартипа Г. А., Гостимский С. А. Исследование растений-регенсрантов гороха (Pisum sativum L) с помощью молекулярных RAPD- и ISSR-маркеров.//Генетика. 2005. т. 41. №1. с. 1-7.

38. Левина Е. А., Адрианова И. Ю., Реунова Г. Д., Журавлёв Ю. Н. Изучение генетической изменчивости и дифференциации популяций лиственницы в пределах ареала Larix olgensis A. Henry, в приморском крае.// Генетика. 2008. т. 44. № 3. с. 374-380.

39. Малышев С. В., Картель Н. А., Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений.// Молекулярная биология. 1997. т. 31, №2. с. 197-208.

40. Мартиросян Е. В, Рыжова Н. Н., Кочиева Е. 3. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов хлоропластной ДНК сортов картофеля отечественной селекции.// Генетика. 2007. т. 43. №11. с. 15781581.

41. Мартиросян Е. В., Рыжова Н.Н., Скрябин К. Г., Кочиева Е. 3. RAPD-анализ геномного полиморфизма у представителей семейства Lemnaceae (рясковые).// Генетика. 2008. т. 44. №3. с. 417-422.

42. Маслова Е. В. Дифференциация двух видов пикульника (Galeopsis bifida Boenn. и G. tetrahit L.) по морфологическим признакам и ДНК-маркерам.// Генетика. 2008. т. 44. №3. с. 366-373.

43. Невзгодина JT.B., Акатов Ю.А., Архангельский В.В. Хромосомные аберрации как биодозиметрический тест космической радиации (экспериментальные данные на семенах высших растений). // Авиакосмическая и экологическая медицина. 1999. т. 33. №2. с. 42-45.

44. Недолужко А. В., Тихонов А. В., Дорохов Д. Б., Молекулярно-генетический анализ суктуры популяций дикой сои (Glycine soja Sieb.&Zucc.) в антропогенных и естественных ландшафтах приморского края.// Генетика. 2008. т. 44. №8. с. 1084-1088.

45. Никитина Т. В., Назаренко С. А. Микросателлитные последовательности человека: мутационный процесс и эволюция.// Генетика. 2004. т. 40. №10. с. 1301 1318.

46. Оганисян А. С., Кочиева Е. 3., Рысков А. П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-HUP.// Генетика. 1996. т. 32. №3. с. 448-451.

47. Осипова Е. С., Кокаева 3. Г., Троицкий А. В., Долгих Ю. И., Шамина 3. Б., Гостимский С. А. RAPD-анализ сомаклонов кукурузы.// Генетика. 2001. т. 37. №1. с. 91-96.

48. Поморцев А. А., Лялина Е. В. Идентификация и оценка сортовой чистоты ячменя методом электрофореза запасных белков семян.// М.: МСХА, 2003 г.

49. Поморцев А. А., Мартынов С. П., Лялина Е. В. Полиморфизм глиадин-кодирующих локусов в местных популяциях культурного ячменя {Hordeum vulgare L.) ближнего востока.// Генетика. 2008. т. 44. № 6. с. 815828.

50. Прокофьева-Бельговская А. А. Гетерохроматические районы хромосом.// 1986. М.: Наука.

51. Руанет В. В., Кочиева Е. 3., Рыжова PI. IT. Использование сети Кохонена для обработки результатов RAPD и ISSR-анализов у представителей рода Capsicum L.// Генетика. 2005. т. 42. №2. с. 269-278.

52. Рыжова Н. Н., Кочиева Е. 3., Анализ микросателлитиых локусов хлоропластного генома перца (род Capsicum L.).// Генетика, т. 40. №8. с. 1093-1098.

53. Серебровский А. С. Генетический анализ.// М.: Наука, 1970. 342 с.

54. Сиволап Ю. М., Календарь Р. Н., Нецвеаев В. П. Использование продуктов полимеразпой цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgare L.).// Генетика. 1997. т. 33. № I.e. 53-60.

55. Сиволап Ю. М., Солодентсо Е. А., Бурлов В. В. RAPD анализ молекулярно генетического полиморфизма подсолнечника {Heliantus annnus).// Генетика. 1998. т. 34. №2. с. 266 - 271.

56. Сиволап Ю. М., Топчиева Е. А., Чеботарь С. В. Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD и SSR анализа.// Генетика. 2000. т. 36. №1. с 44 51.

57. Синюшин А. А., Фасциация у гороха посевного: основные закономерности морфогенеза. Онтогенез. 2006. т 37. №6. с. 449-456.

58. Синюшин А. А., Гостимский С. А. Генетический контроль признака фасциации у гороха посевного (Pisum sativum L).ll Генетика. 2008. т. 44. №6. с. 807-814.

59. Сулимова Г. Е., Салмепкова Е. А., Политов Д. В., Зипчепко В. В., Глазер В. М. Практикум по полиморфизму ДНК и белков.// М.: «Ойкос» 2002.

60. Федоренко О. М., Грицких М. В. Генетическое разнообразие природных популяций Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на северной границе его ареала: RAPD-анализ// Генетика. 2008. т. 44. № 4. с. 496-499.

61. Фучжун Л. Использование транслокаций для картирования генов гороха// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М.: МГУ. 1997.

62. Фучжун JL, Гостимский С. А Исследование транслокаций у гороха.// Генетика. 1998. т. 34, №9. с. 1269 1276.

63. Хангильдин В. В. Генетические факторы.// В кн. «Генетика и селекция гороха» под ред. Хвостова В. В. Новосибирск. Наука. 1975. с 37106.

64. Хлесткина Е. К., Салипа Е. А. SNP-маркеры: методы анализа, способы разработки и сравнительная характеристика на примере мягкой пшеницы.// Генетика. 2006. т. 42. № 6. с 725-736.

65. Чегамирза К. Молекулярно-генетичсское картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2004.

66. Шеленков А. А., Скрябин К. Г., Коротков Е. В. Классификационный анализ скрытой дипуклеотидной периодичности геномов растений.// Генетика. 2008. т. 44. № 1. с. 120-136.

67. Ashkenazi V., Chani Е., Lavi U., Levy D., Hillel J., Veilleux R. E. Development of microsatellite markers in potato and their use in phylogenetic and fingerprinting analyses. Genome. 2001. v. 44. p, 50-62.

68. Bautista N. S., Solis R., Kamijima O., Ishii T. RAPD, RJFLP, and SSLP analysis of phylogenetic relationship between cultivated and wild species of rice// Genes Genet. Syst. 2001. v. 76. p. 71-79.

69. Bennett M. D., Leitch I. J. Angiosperm DNA C-values database (release 5.0, Dec. 2004)// http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.html, 2004

70. Bennett M. D., Leitch I. J. Plant genome size research: a field in focus.// Annals of Botany. 2005. v. 95. p. 1-6.

71. Bhat K.V., Jarret R. L., Rana R. S. DNA profiling of banana and plantain cultivars using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers.// Electrophoresis. 1995. v. 16. №9. p. 1736-1745.

72. Blanc G, Wolfe К. H. Widespread paleopolyploidy in model plant species inferred from age distributions of duplicate genes. Plant Cell. 2004. v. p. 1667-1678.

73. Blixt S. Cytology in Pisum. II. The normal karyotype.// Agri. Hort. Genet. 1958. V. 16. P. 221-237.

74. Blixt S. Cytology in Pisum. ill. Investigation of five interchange lines and coordination of linkage groups with chromosomes.// Agri. Hort. Genet. 1959. V. 17. P. 47-75.

75. Brauncr S., Murphy R. L., Walling J. G., Przyborowski J., Weeden N.F. STS markers for comparative mapping in legumes.// J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2002. v. 127. №4. p. 616-622.

76. Bricmann В., Klintschar M., Neuhubcr F. Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat// Am. J. Human, genet. 1998. v. 62. p. 1408-1415.

77. Brown P. T. I-L, Lange F. D., Kranz E., Lorz IT. Analysis of single protoplasts and regenerated plants by PCR and RAPD technology.// Mol. Gen. Genet. 1993. v. 237. p. 311-317.

78. Bull L. N., Pabon-Pena C. R., Freimer N. В Compound Microsatellite Repeats: Practical and Theoretical Features.// Genome Res. 1999. №9. p. 830-838.

79. Burnham C. R. Tester-set of translocation// Maize Genet. Coop. Newsl. 1954. v. 28. p. 59-60.

80. Burnham C. R., White F. M., Livers R. Chromosomal interchanges in barley// Cytologia. 1954. V. 19. P. 192-202.

81. Burstin J., Deniot G., Polier C., Weinachler C., Aubert G., Baranger A. Microsatellite polymorphism in Pisum sativum!/ Plant Breeding. 2001. v. 120. p. 211-217.

82. Caetano Anolles G., Bassam B. J., Gresshoff P. M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology. 1991. v. 9. №6. p. 553-557.

83. Cavalier-Smith T. Economy, speed and size matter: evolutionary forces driving nuclear genome miniaturisation and expansion.// Annals of Botany. 2005. v. 95. p. 147-175.

84. Lc Clerc V., Bazante F., Baril C., Guiard J., Zhang D. Assessing temporal changes in genetic diversity of maize varieties using microsatellite markers// Theor. Appl. Genet. 2005. v. 110. № 2. p. 294-302.

85. Daofan Ji, MiJingjiu, Oifeng Xu. Genetics. Beijing.// Agricultural. 1979. p. 143-152.

86. Dellaporta S. L., Wood J., ITiks J. B. A plant DNA minipreparation: version II// Plant Mol. Biol. Rep. 1983. №1. p. 19 20.

87. Deng Z., Huang S., Xiao S.Y., Gmitter F. G. Development and characterization of SCAR markers linked to the citrus tristeza virus resistance gene from Poncirus trifoliata.il Genome. 1997. v. 40. p. 697-704.

88. Dieringer D., Schlotterer S. From the complete genomic sequences of nine species two distinct modes of microsatellite mutation processes: evidence from the complete genomic sequences of nine species.// Genome Res. 2003. v. 13. p. 2242-2251.

89. Domoney C., Ellis Т. H., Davies D. Organization and mapping of legumin genes in Pisum sativum II Mol. Gen. Genet. 1986. v. 202. p. 280-285.

90. Ellis Т. H., Turner L., Hcllens R. P., Lee D., Harker C. L., Enard C., Domoney C., Davies D. R. Linkage maps in pea.// Genetics. 1992. V. 130. №3. p. 649-663.

91. Felsenstein J. Confidence limits on phylogcnies: an approach using the bootstrap.// Evolution. 1985. v. 39. p. 783-791.

92. Feschotte C., Jiang N., Wessler S. R. Plant transposable elements: where genetics meets genomics.//Nat. Rev. Genet. 2002. v. 3. №5. p. 329-341.

93. Folkeson D. A revised genetic map of Pisum sativum.// Department of genetic. University of Lund. Sweden. 1990. P. 33.

94. Ghislain M., Andrade D., Rodriguez F., Hijmans R. J., Spooner D. M. Genetic analysis of the cultivated potato Solarium tuberosum L. Phureja group using RAPDs and nuclear SSRs// Thcor Appl Genet. 2006. v. 113. p. 1515-1527.

95. Giese H., Molm-Jensen A. G., Mathiassen H., Kjacr В., Rasmussen S.K., Bay LI., Jensen J. Distribution of RAPD markers on a linkage map of barley.// Hereditas. 1994. v. 120. p. 267-273

96. Gupta P. K., Varshney R. K., Sharma P. C., Ramesh B. Molecular markers and their application in wheat breeding.// Plant Breed. 1999. V. 118. p. 369-390.

97. Hall K. J., Parker J. S., Ellis Т. H. N., Turner L., Knox M. R., Hofer J. M. I., Lu J., Ferrandiz C., Hunter P. J., Taylor J. D., Baird K. The relationshipbetween genetic and cytogenetic maps of pea.// Genome. 1997. v. 40. p. 744769.

98. Hicks M., Adams D., O'Keefe S., Macdonald E., Hodgetts R. The development of RAPD and microsatellite markers in lodgepole pine {Pinus contorta var. latifolia).// Genome. 1998. v. 41. p. 797-805

99. Hu J., Quiros C. F. Identification of brokkoli and cauli-flower cultivars with RAPD markers.// Plant Cell Rep. 1991. v. 10. p. 505-511.

100. Irzikowska L., Wolko В., Swiecicki W. K. The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers.// Pisum Genetics. 2001. v. 33. p. 13-18.

101. Irzikowska L., Wolko B. and Swiecicki W.K. Interval Mapping of QTLs Controlling Some Morphological Traits In Pea.// Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. №7. p. 417-422.

102. Jing R., Johnson R., Seres A., Kiss G., Anbrose M. J., Knox M. R., Ellis T. LI. N., Flavell A. J. Gene-based sequence analysis of field pea {Pisum). Genetics. 2007. v. 117. p. 2263-2275.

103. Kalendar R., Grob Т., Regina M., Suoniemi A., Schulman A. IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques.// Theor Appl Genet. 1999. v. 98. p. 704-711.

104. Kalo P., Seres A., Taylor S.A., Jalcab J., Kevei Z., Kereszt A., Endre G., Ellis Т. H, Kiss G. B. Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum.// Mol. Genet. Genomics. 2004. v. 272. №3. p. 235246.

105. Knight С. A., Molinari N. A., Pelrov D. A. The Large Genome Constraint Hypothesis: Evolution, Ecology and Phenotype.//Annals of Botany. 2005. v. 95. p. 177-190.

106. Konovalov F., Toshchakova E., Gostimsky S. A CAPS marker set for mapping in linkage group III of pea {Pisum sativum L.).// Cell. Mol. Biol. Lett. 2005. v. 10. №1. p. 163-171.

107. Kosmolak F. G. Gliadin composition of the bred wheat cultivars BW20 and Sinton.// Can J Plant Sci. 1979. v. 59. p. 1001-1005.

108. Lamm R. Giemsa C-banding and silver-staining for cytological studies in Pisum.// Hereditas. 1981. v. 94. p. 45-52.

109. Lamm R., Miravalle J. R. A translocation tester set in Pisum// Hereditas. 1959. v. 45. p. 417-440.

110. Lamprecht FI. The variation in linkage and course of cros sing over// Agri. I-Iort. Genet. 1948. v. 6. p. 10 48.

111. Lamprecht IT. Ein interchange zwischen den chromosome I und VII von Pisum// Agri. I-Iort. Genet. 1954. v. 12. p. 1 15-120.

112. Laucou V., Flaurogne K., lEllis N., Rameau C. Genetic mapping in pea. 1. RAPD-based genetic linkage map of Pisum Sativum.// Theor. Appl. Genet. 1998. v. 97. p. 905-915.

113. Lawson M. J., Zang L. Distinct patterns of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genomes.// Genome Biology. 2006. v. 7. № 2. Article R14 http://genomebiology.eom/2006/7/2/R14

114. Leeton P. R., Smyth D. R. An abundant LINE-like element amplified in the genome of Lilium speciosum. Mol. Gen. Genet. 1993. v. 237. p. 97-104.

115. Liu К., Goodman M., Muse S., Smith J. S., Buckler E., Doebley J. Genetic structure and diversity among maize inbred lines as inferred from DNA microsatellites.// Genetics. 2003. v. 165. p. 2117-2128.

116. Lodhi M. A., Daly M. J., Ye G. N. A molecular marker based linkage map of Vitis.U Genome. 1995. v. 38. p. 786-794.

117. Nadir E., Margalit H., Gallity Т., Ben-Sasson S. A. Microsatellite spreading in the human genome: evolutionary mechanisms and structural implications.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. v. 93. p. 6470-6475

118. Ney. M., Li W-IT. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. v. 76. p. 5269-5273.

119. Okada Т., Gondo Y., Goto J. Unstable transmission of the RS447 human megasatellite tandem repctivc sequence that contains the USP17 deubiquitinating enzime gene.// Hum. Genet. 2002. v. 110. p. 302-313.

120. Polans N. O., Weeden N. F., Thompson W. F. Distribution inheritance and linkage relationship of ribosomal DNA spacer length variation in pea// Theor. Appl. Genet. 1986. v. 72. p. 289-295.

121. Porter В. W., Chittoor J. M., Yano M., Sasaki Т., White F. F. Development and mapping of markers linked to the rice bacterial blight resistance gene Xa7// Crop Sc. 2003. v.43. №4. p. 1484-1492.

122. Rakoczy-Trojanowska M., Bollok H. Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants// CMBL. 2004. v. 9, p. 221 238.

123. Ray D. Т., Endrizzi J. E. A tester-set of translocations in Gossypium hirsutum L.//J. Heredity. 1982. v. 73. № 6. p. 429-433

124. Riesberg L. H. Homology among RAPD fragments in interspecific comparison//Mo 1. Evol. 1996. v. 5. p. 99-105.

125. Roder M. S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M-FL, Leroy P. Ganal M. W. A microsatellite map of wheat.// Genetics. 1998. v. 149. p. 2007-2023.

126. Saliba-Colombani V., Causse M., Gervais L., Philouze J. Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome.// Genome. 2000. v. 43. p. 29-40.

127. Sharma S., Raina S. N. Organization and evolution of highly repeated satellite DNA sequences in plant chromosomes.// Cytogenet. Genome Res. 2005. v. 109. p. 15-26.

128. Schneider K. Mapping Population and Principles of Genetic Mapping// In The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping.// Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley VCH, Weinheim., 2005

129. Shepherd M., Cross M., Dieters M.J., Henry R. Genetic maps for Pinus elliottii var. elliottii and P. caribaea var. hondurensis using AFLP and microsatellite markers.//Theor. Appl. Genet. 2003. v. 106. №8. p. 1409-1419.

130. Smycal P., Horacek J., Dostalova R., Hybl M. Variety discrimination in pea (Pisum sativum L.) by molecular, biochemical and morphological markers/// J. Appl. Genet. 2008. v. 49. № 2. p. 155-166.

131. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.// J. Mol. Biol. 1975. v. 98. № 3. p. 503-517.

132. Sugimoto Т., Yoshida S., Watanabe K., Aino M., Kanto Т., Maekawa K., Irie K. Identification of SSR markers linked to the Phytophthora resistance gene Rpsl-d in soybean.// Plant Breeding. 2008. v. 127/ №2. p. 154159.

133. Sybenga J., Wolters A. H. G. The classification of the chromosomes of the rye (Secale cereale L.): a translocation tester-set.// Genetica. 1972. v. 43. p. 453-464.

134. Tanksley S. D., Ganal M. W., Martin G. B. Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes.// Trends Biotechnol. 1995. v. 11. № 2. p. 63-68.

135. Taramino G., Tingey S. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maise.// Genome. 1996. v. 39. № 2. p. 277 287.

136. Temnykh S., Park W. D., Ayes N., Cartinhour S., Hauck N., Lipovich L., Cho Y. G., Ishii Т., McCouch S. R. Mapping and genomeorganization of microsatellitc sequences in rice {Oriza sativa L.).// J. Appl. Genet. 2000. v. 100. p. 697-712.

137. Van den Berg R. G., Bryan G. J., del Rio A., Spooner D. M. Reduction of species in the wild potato Solarium section Petota series Longipedicellata: AFLP, RAPD and chloroplast SSR data.// Theor Appl Genet.2002. v. 105. p. 1109-1114/

138. Vergnaud G., Denoeud F. Minisatellites: mutability and genome architecture.// Genome Research. 2000. № 10. p. 899-907.

139. Weeden N. P., Swiccicki W. K., Ambrose A., Timmerman G. M. Linkage groups of pea.// Pisum Genetics. 1993. v. 25. p. 4 (a).

140. Weeden N. F., Timmerman G. M., Hemmat M., Kneen В. E., Lodhi M. A. Inheritance and reliability of RAPD markers.// Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. 1993. p. 12-17. (b)

141. Weeden N. F., Ellis Т. H. N., Timmerman-Vaughan G. M., Swiecicki W. K., Rosov S. M., Berdnicov V. A. A consensus linkage map for Pisum sativum.// Pisum Genetics. 1998. v. 30. p. 1-4.

142. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.// Nucl Acids Res. 1991. № 18. p. 251 255.

143. Whittaker J. C., I-Iarbord R. M., Boxall N., Mackay I., Dawson G., Sibly R. M. Likelihood-based estimation of microsatellite mutation rates// Genetics. 2003. v. 164. p. 781-787.

144. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.//Nucl. Acids Res. 1990. v. 18. p. 6531-6535

145. Vision T. J., Brown D. G., Tanksley S.D. The origins of genomic duplications in Arabidopsis.// Science. 2000. v. 290. p. 2114-2117.

146. Yu J., Hu S., Wang J., Wong G.K., Li S. A draft sequence of the rice genome (Oryza saliva L. ssp. indica). Science. 2002. v. 296. p. 79-92.

147. Xu D. II., Abe J., Gai J. Y. Shimamoto Y. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans: evidence for multiple origin of cultivated soybean.// The Appl Genet. 2002. v. 105. p. 645-653.

148. Zhang Y., Sledge M. K., Bouton J. H. Genome mapping of white clover (Trifolium repens L.) and comparative analysis within the Trifolieae using cross-species SSR markers.// Theor. Appl. Genet. 2007. v. 114. p. 13671378.

149. Zhivotovsky L. A., Feldman M. W. Microsatellitc variability and genetic distances// Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. v. 92. p. 11549-11552.

150. Zhivotovsky L. A., Feldman M. W., Grishechkin S. A. Biased mutations and microsatellitc variation// Mol. Biol. Evol. 1997. v. 14. p. 926933.

151. Zhivotovsky L. A., Rosenberg N. A., Feldman M. W. Features of evolution and expansion of modem humans inferred from genome-wide microsatellite markers.// Am. J. Plum. Genet. 2003. v. 72. p. 1171-1186.