Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование RAPD-метода для исследования внутривидового полиморфизма генома гороха

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование RAPD-метода для исследования внутривидового полиморфизма генома гороха"

руБ ^ ■3 - СВ ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК: 575.174.015.3:582.739

КОКАЕВА ЗАРЕМА ГРИГОРЬЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАРО-МЕТОДА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА ГОРОХА

03.00.15 - ГЕНЕТИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории генетики растений кафедры генетики и селекции Биологического факультете МГУ и в лаборатории геносистематики растений Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С.А. Гостимский Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.А. Пухальский

кандидат биологических наук Ю.В . Малеева

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур РАСХН

Защита диссертации состоится « »окл^Ьл 1998 г. в_часов на

заседании Специализированного совета Д 002.49.01 в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу:

117809, ГСП-1, г. Москва, В-333, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН.

Автореферат разослан а^ч-с^гс^ 1998 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В исследовании организации и изменчивости геномов растений большое значение приобретают молекулярно-генетические маркеры. Использование молекулярных маркеров на основе ДНК открывает большие перспективы для подробного картирования хромосом, идентификации генов, обеспечивающих важные свойства растений, их клонирования и генетического конструирования новых сортов. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появляются новые возможности для установления видовой и сортовой специфичности, а также для определения таксономических взаимоотношений между отдельными видами.

Существенно ускоряет и упрощает задачу выявления молекулярных ДНК-маркеров использование методов, основанных на полимсразной цепной реакции. В последние годы наиболее широко применяется вариант амплификации ДНК с произвольными праймерами - RAPD (random amplified polymorphic DNA) (Williams et al., 1990). С его помощью можно быстро обнаружить вариабельность сразу большого числа локусов по всему геному. Полиморфизм, возникающий из-за различий в сайтах связывания праймера, а также в результате инсерций и делеций, выявляется при электрофорезе как присутствие или отсутствие отдельного фрагмента.

Показано, что с помощью RAPD-анализа можно изучать полиморфизм ДНК у высших растений (Joshi et al., 1993; Brummet et al., 1995; Журавлев и др., 1996; Дорохов и др., 1997), конструировать генетические карты (Reiter et al., 1992), осуществлять генотипирование (Welsh et al., 1990), видовую и сортовую идентификацию (Mackill et al., 1996), устанавливать филогенетические связи (Jacobsen et al., 1996; Сиволап и др., 1998).

В изучении генома гороха, который является классическим объектом генетических исследований, еще недостаточно использовались молекулярные методы анализа, поэтому новым этапом анализа генома гороха является поиск

молекулярных маркеров, позволяющих проводить генотипирование, картирование и идентификацию сортов и разновидностей.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлись анализ генетического полиморфизма различных сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха (Р1зит Байуит) при помощи полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (11АМ)-метод) и выявление ДНК-маркеров в геноме гороха.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

¡.Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами для сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха и подбор праймеров, наиболее эффективно выявляющих полиморфизм у данных объектов.

2. Проведение сравнительного анализа и количественной оценки полиморфизма различных сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха по 1Ъ\РП-спектрам.

3. Анализ наследования КАРБ-маркеров в Б;, и поколениях.

4. Клонирование и секвенирование полиморфных ИАРО-фрагментов и использование их нуклеотидной последовательности для создания специфических маркеров для дальнейшего анализа генома гороха.

Научная новизна работы. Впервые в данной работе были проведены внутривидовые сравнительные исследования генетического полиморфизма гороха с анализом генетических дистанций и определением уровней дивергенции по данным КАРБ-анализа. Показана возможность использования КАРО-спектров для паспортизации сортов гороха.

Впервые выявлен и количественно оценен полиморфизм ДНК у сомаклональных вариантов гороха, полученных с помощью культуры тканей.

Обнаружен ЯАРО-маркер, сцепленный с определенным морфологическим признаком.

Определены нуклеотидные последовательности некоторых фрагментов RAPD-спектра у гороха и степень их гомологии с известными последовательностями из других растений.

Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании результаты вносят определенный вклад в изучение генома гороха. Экспериментально подтверждена возможность использования молекулярных маркеров, выявленных с помощью RAPD-метода, для картирования генома гороха.

Установлено, что RAPD-маркеры можно применять для идентификации сортов гороха и исследования их генетического родства. Впервые получены клонированные RAPD-маркеры гороха.

Оптимизированный нами RAPD-анализ полиморфизма ДНК введен в учебный практикум подготовки студентов кафедры генетики Биологического факультета МГУ и может быть рекомендован для практических занятий в других учебных заведениях с биологическим профилем.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ленинские горы - 95», Москва, 1995; на IV Международной конференции «Геном растений», Сан-Диего, США, 1996; на Российско-Германской конференции по биотехнологии, Санкт-Петербург, 1996; на VII Международной конференции по биотехнологии и сохранению генофонда, Москва, ] 997; на конференции молодых ученых и аспирантов Учебно-научного центра по генетике, Москва, 1997; на научных семинарах кафедры генетики и селекции МГУ и на научном семинаре Института общей генетики РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликованы две статьи и тезисы трех международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа

содержит 7 таблиц, 37 рисунков. Список литературы включает ^^наименований цитированных работ.

Растительный материал. В работе были использованы 34 образца гороха, представляющие сорта, линии, мутанты и сомаклональные варианты, находящиеся в коллекции кафедры генетики и селекции Биологического факультета МГУ.

Для скрещиваний были взяты сомаклональные варианты, полученные из сорта Ранний Зеленый в результате длительного культивирования тканей in vitro. В скрещиваниях также использовали маркерные линии L-1238, L-108, М-10 и сорт Ранний Зеленый. Для маркирования генома гороха и исследования природы RAPD-маркеров использовали скрещивания сомаклонального варианта Ch-6 с множественно маркированной линией L-1238 (исходно полученной из коллекции S.Blixt, Швеция). Для анализа наследуемости основных RAPD-фрагментов и выявления сцепленного наследования фрагментов с определенными признаками были отобраны 50 рекомбинантных инбредных линий (РИЛ) пятого поколения, полученных на основе скрещивания: Ch-6 х L-1238.

Выделение ДНК. Экстракцию суммарной ДНК для RAPD-анализа проводили из свежих или высушенных в силикагеле листьев гороха по методике (Moller et al., 1992) с незначительными модификациями.

RAPD-анализ. Для проведения RAPD-анализа были использованы праймеры:

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал в методы исследования

В-340

5'GAGAGGCACC3', В-450 5'AGGCGGGAAC3', С09 5'ACGGTACCAG3', В-318

5'CGGAGAGCCC3', 5'CTCACCGTCC3\ 5'CGGAGAGCGA3\

В-474

F12

ОР-4

5'AATCGGGCTG3', С5 5'AGGCGGGTAC3', Pr-11

5'GATGACCGCC3 5' AGGCGGGAACG3'.

Pr-10

Первые 8 праймеров применялись ранее при анализе геномов пшеницы и гороха (Vierling et al., 1992; Темных, 1994). Праймеры Рг-10 и Pr-11 разработаны нами. Все использованные праймеры были синтезированы в Институте биоорганической химии (Москва).

Амплификацию ДНК проводили в амплификаторе Cyclo Temp б (СТС, Москва) в следующих условиях: 2 цикла: денатурация - 95°, Змин.; отжиг - 37°, 1мин.; элонгация - 72°, 1мин. и 35 циклов при значениях для соответствующих процессов 94°, 1мин.; 37°, 1мин. и 72°, 1мин. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 2,5 ед. Taq-полимеразы (Бион, Россия), 10 тМ трис-HCl, рН 8,3; 50шМ КС1; 00,1% Tween 20, по ЮОмкМ каждого из дезоксинукле-озидтрифосфатов (Pharmacia, Швеция), 1 мкМ праймера, 4 мМ MgCb и 20нг ДНК. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2-% агарозном геле в трис-боратном буфере.

Обработку результатов RAPD-анализа проводили с помощью невзвешенного парно-группового кластерного метода с арифметическим усреднением (UPGMA) и метода ближайшего связывания (neighbor-joining, NJ) с использованием программы TREECONW (Van de Peer & De Wacheter, 1994). Для оценки значимости генеалогических реконструкций был использован метод бутстрепа.

Клонирование и ееквенпрование RAPD-фрагмептов. Выбранные индивидуальные RAPD-фрагменты вырезали из агарозного геля, ДНК экстрагировали и реамплифицировали в тех же условиях и с тем же праймером, который изначально выявлял полиморфизм, и клонировали в клетках E.coli с помощью векторов pBluescriptIISK+ или pGEM-T. Идентичность клонированных RAPD-фрагментов устанавливали с помощью гибридизации клонированных фрагментов с Саузерн-блотом исходного RAPD-спектра.

Рекомбинантные двухцепочечные плазмидные ДНК секвеиировали методом дидезокси-терминирования с Т7 или Д Taq полимеразой. Проводили компьютерный поиск гомологии полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями, депонированными в базе данных GENEBANK.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление и изучение полиморфизма ДНК сортов, линий и мутантов гороха.

RAPD-анализ полиморфизма ДНК проводили на 10 сортах гороха отечественной и зарубежной селекции, 10 линиях, полученных на основе различных сортов и разновидностей и 10 мутантах, полученных из сортов Капитал, Немчиновский и Ранний Зеленый. Предварительно были оптимизированы условия реакции амплификации, включая подбор концентраций ДНК, MgCl2 и режима амплификации. Мы обнаружили, что все 8 выбранных праймеров в наших условиях проведения реакции являются вполне пригодными для выявления генетического полиморфизма у сортов, линий и мутантов гороха.

На рис. 1 представлены RAPD-спектры разных сортов, линий и мутантов гороха, полученные при использовании праймеров С09 (a), F-12 (б), В-340 (в). Эти праймеры инициировали синтез наибольшего количества полиморфных фрагментов у различных сортов и линий.

Число ампликонов в зависимости от использованного праймера составляло от 8 до 20 и их размеры варьировали в пределах 200 - 2000 пар оснований.

Сорта и линии имели специфические RAPD-спектры, различавшиеся числом ампликонов, их размерами и степенью выраженности на электрофореграммах. Наряду с наличием общих ампликонов, выявлялись фрагменты, которые присутствовали в одних и отсутствовали в

М/ / 2 3 4 5 6 Г 8 Э /0,4? # /3/4 У5/6 УГ //^д_тМ_2^26_27_28_2Э30 М1

1. (".И.

Г ?

-й Я) 1*

»122

а.

М2 4 5 6 7 8 9 №2425262?282330М-1

М 4 2456789 ^ ^ 23 30

Рис. 1. КАРБ-спектры сортов, линий и мутантов гороха, полученные с праймерами С09 (а), Б-12 (б) и В-340(в). 1 - Роза Краун, 2 - Немчиновский, 3 - Пионер, 4 - Капитал, 5 - Король гурманов, 6

- Неосьшающийся, 7 - Ранний Зеленый, 8 - Узкобобовый, 9 - Рапорт, 10 - Виола, 11 - Ь-84,12 -Ы31, 13 - Ь-1749,14 - Ь-102, 15 - Ь-108, 16 - Ь83, 17 - Ь-851, 18 - Ь4, 19 - М-10, 20 - Ь-1238, 21 - СЬ-15, 22 - СЬ-7(1), 23 - СЫ8, 24 - СЬ-11, 25 - СЬ-7(2), 26 - СЬ-13, 27 - 11-34, 28 - Я-64, 29 - 11-100, 30 - Сиг1-1. М1 - 123 пн маркер, М2 - перевар ДНК фага I, МЗ -

перевар р1!С19+М$р I. Стрелками показаны положения полиморфных фрагментов.

других геномах. Эти фрагменты являются полиморфными маркерами исследуемой ДНК гороха. Так, для RAPD-спектра с праймером С09 были выявлены полиморфные фрагменты длиной 850 п.о., 700 п.о., 600 п.о. и 480 п.о. Только в RAPD-спектре сорта Неосыпающийся был обнаружен фрагмент длиной 900 п.о., который может рассматриваться как сортоспецифичный маркер.

Фрагмент длиной 850 п.о. выявляется в RAPD-спектрах только у трех линий зарубежной селекции, полученных из Швеции.

Для RAPD-спектра с праймером F-12 были выявлены полиморфные фрагменты 320 п.о., 345 п.о., 400 п.о., 415 п.о., 600 п.о., 650 п.о. и 1110 п.о. Показано, что только в RAPD-спектрах двух сортов зернового гороха Немчиновский и Ранний Зеленый присутствует фрагмент длиной 400 п.о. В RAPD-спектре сорта Узкобобовый был обнаружен мажорный сортоспецифичный фрагмент 650 п.о. Такой же фрагмент выявлен в RAPD-спектрах двух транслокационных линий из Швеции.

Для RAPD-спектра с праймером В-340 были выявлены полиморфные фрагменты 300 п.о., 340 п.о., 375 п.о., 480 п.о., 500 п.о. и 600 п.о.

Наши исследования показали, что различия, выявляемые среди мутантов гороха, менее выражены, чем различия, обнаруженные между сортами и линиями. Так при использовании праймера С09 обнаружено только два полиморфных фрагмента. Это фрагменты длиной 850 п.о. и 480 п.о. При использовании праймера F-12 обнаружены полиморфные фрагменты 550 п.о. и 1100 п.о. По-видимому, небольшие различия, обнаруженные между мутантами гороха, связаны с общностью происхождения анализируемых мутантов.

Таким образом, полученные нами результаты согласуются с результатами исследований, проведенных ранее на бобовых (Kazan et al., 1993; Yu and Pauls, 1993). В них изучался генетический полиморфизм среди разных генотипов. Была показана возможность применения RAPD-метода для генетического маркирования, паспортизации и картирования (Weeden et al., 1992). Кроме того,

данные, полученные нами и представленные в литературе, свидетельствуют, что полиморфные фрагменты могут быть использованы для картирования генома гороха в качестве молекулярных маркеров. Появляющиеся в RAPD-спектрах уникальные фрагменты могут применяться в качестве молекулярных зондов для генотипирования.

2. Количественная оценка RAPD полиморфизма и построение дендрограмм.

Для количественной оценки RAPD полиморфизма и определения уровня дивергенции между сортами, линиями и мутантами, полученные данные были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в RAPD-спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0, соответственно. По матрицам состояний были рассчитаны матрицы различий, при этом использовали коэффициент Жаккарда. Исходя из этой матрицы, невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA) и методом ближайшего связывания (neighbor-joining, NJ) были построены дендрограммы, отражающие степень различий между RAPD-спектрами исследуемых объектов (рис. 2 и 3). На рис. 2 видно, что мутанты группируются вместе со своими сортами. Уровень различий по величине расстояния Жаккарда Dj между мутантами и исходными сортами составляет О - 0,1В. Сорта различаются между собой в существенно большей степени -значения Dj составляют 0,30 - 0,40. Для линий эта величина имеет промежуточное значение - 0,19 - 0,38.

В качестве корня в NJ-дендрограмме (рис. 3) использован сорт Виола -один из сортов овощного гороха, наименее сходный с другими на UPGMA-дендрограмме. Значения бутстрепа для ряда внутренних точек ветвления невелики. Тем не менее, надежно выявляется четыре кластера со значениями бутстрепа выше 74 %: 1 - сорт Капитал, производные из него хлорофильные мутанты и линия L-4 с гомозиготной транслокацией между хромосомами 1 и 3;

2 - сорт Немчиновский с производными из него карликовыми мутантами;

3 - линии Ь-1238 и Ь-851; 4 - линии Ь-83 и Ь-1749. Взаимосвязи с остальными объектами нельзя считать надежно установленными в связи с невысоким значением бутстрепа.

0,4 I—

0,3

I. I

0,2 I

0,1

О]

I СК-7 'СЬ-13 -СЬ-И

- Капитал

- 1-4

- Ь-1749

- Ь-83 -М-10

- Рапорт

- Король гурманов

- Немчиновский

- гмоо

- й-34

- К-Й4 -1,-851

-1.-1238

- Неосыпающийся -1.-108

- Ы31 -Ь-102

- Узкобобовый • Виола

]

IV

]

ш

сорта

мутанты

Рис. 2. Дендрограмма, построенная ЦРОМА-методом по 132 бинарным признакам присутствия/отсутствия ампликонов одинакового размера в ЙАРО-спектрах сортов, линий и мутантов гороха, полученных с использованием 6 праймеров. Ц - расстояние Жаккарда. ¡-V -выявляемые кластеры. Заштрихованы мутанты и их исходные формы.

Увеличение достоверности генеалогических реконструкций, очевидно, возможно путем увеличения числа используемых праймеров, применения количественного анализа при сравнении спектров и повышения разрешения при электрофорезе фрагментов ДНК. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования методов ИРОМА и N1 для

количественной оценки НАРБ полиморфизма, а также о реальности

генеалогических взаимоотношений, выявляемых на основании КАРО-анализа. 0.1

-1

_ юо| СЬ-13

59

59'

98

36

'СЬ-7 -СЬ-П

■ Капитал

■Ь4

97

Ь-1238

Ь-851

-1.-83 Ы749 -М-10

26

25

33

100

•1.-102

Ы31 -1.-108

— Неосыпающийся

82

97

сг

И-(00

— Немчиновский — 11-64 К-34

Король гурманов

Рапорт

-Узкобобовый

• Виола

] ]

I

III

IV

II

Рис. 3. Дендрограмма, построенная Ш-методом по 132 бинарным признакам присутствия/отсутствия ампликонов одинакового размера в ЛАРО-спектрах сортов, линий и мутантов гороха, полученных с использованием 6 праймеров. На дереве указаны значения бутстрепа > 25 %. ^ - расстояние Жаккарда. 1-У - выявленные кластеры.

3. Выявление полиморфизма сомлклональных вариантов гороха.

КАРБ-анализ проведен на исходном сорте Ранний Зеленый и полученных от него стабильных регенерантах 11-1, Л-9, W-l, СЬ-6. Регенераты И-1 и Я-9 отличаются от исходного сорта Ранний Зеленый только по времени зацветания, у растений в отличие от исходного сорта отсутствует восковой налет на листьях и стебле, регенеранта СЬ-6 характеризуются недостатком хлорофилла.

Исследования, проведенные ранее (Багрова и др., 1991) на этих регенерантах, показали, что приобретенные в культуре ткани изменения наследуются моногенно.

Для работы использовали четыре праймера В-450, В-474, С09 и В-318. На рис. 4 представлены электрофореграммы разделения в агарозном геле продуктов амплификации исследуемых сомаклонов гороха с праймером В-450. Обнаружен полиморфизм ДНК как между разными сомаклонами, так и между сомаклонами и исходным сортом Ранний Зеленый.

.4 5 6 М2 Г 8 8 9 10 Ш

ъхшшшшшяяашяшшшшяшшявщ

«*•*<*к ifrnrnm -

800l ТОО.

- i^.- MMtat- »s^i.- •. Mgi'fr ifr.ifrifi

тштшш

53 f!t ** ^

Ml и*

Шил.

400^

***

¿ф- & tSr

Рис. 4. RAPD-спектры сортов, линий, мутантов и сомаклональных

вариантов гороха, полученные с праймером В-450. I - Curl; 2 - Ch-6; 3 - W-l; 4 - R-9; 5 - R-l; 6 - Каллус; 7 - Ранний Зеленый; 8 - Ы08; 9 -М-10; 10 - L-1238. Ml - перевар ДНК фага X+PstI; М2 - перевар pUC19 + Mspl. Стрелками показаны полиморфные фрагменты.

RAPD-спектры исследованных сомаклонов образованы

14 - 18 фрагментами, область разделения которых располагается в районе

270 - 1500 п.о. Спектры состоят из мономорфных и полиморфных фрагментов. Так, у сомаклопа R-1 обнаружен минорный фрагмент около 700 п.о., отличающий его от других сомаклонов, а также от исходного сорта Ранний Зеленый. У сомаклонов Ch-б и W-1 выявлены фрагменты 780 п.о. и 800 п.о., отсутствующие у других сомаклонов. В отличие от исходного сорта Ранний Зеленый в RAPD-спектрах всех исследованных сомаклонов присутствует фрагмент длиной 400 п.о. и отсутствует фрагмент 650 п.о.

Полученные данные дают возможность предположить, что сомаклональные изменения в изучаемых линиях растений-регенерантов связаны с возможными тонкими перестройками ДНК, которые выявляются при RAPD-анализе в виде наличия или отсутствия отдельных фрагментов в RAPD-спектре. Высокая разрешающая способность RAPD-метода позволяет обнаружить изменения наследственной информации клеток на разных этапах их культивирования, что может способствовать изучению природы сомаклональной изменчивости.

4. Сравнительный анализ RAPD фрагментов исходных родительских линий, Fj, Fj и F5 поколений.

Основным свойством, обеспечивающим возможность успешного использования RAPD-маркеров в генетических исследованиях, является их стабильность. В наших экспериментах воспроизводимость RAPD-спектров обеспечивалась строгим соблюдением условий проведения реакции амплификации, контролем качества и количества взятой в реакцию ДНК. Чтобы исключить возможность того, что полиморфные фрагменты являются результатом амплификации контаминирующей ДНК или других артефактов PCR, были проведены скрещивания сомаклональных вариантов с маркерными линиями L-1238, М-10, L-108 и получены гибриды первого поколения. Способность RAPD-фрагментов наследоваться является важным тестом достоверности RAPD-анализа. В большинстве случаев гибриды первого

поколения имели спектры амплифицированных продуктов, характерные для обоих родителей, в соответствии с доминантным характером наследования ЛАРВ-маркеров. На рис. 5 представлены ЛАРБ-спектры с праймером С09 гибридов первого поколения и исходных родительских линий .

Рис. 5. Продукты амплификации ДНК родителей и гибридов Fi гороха с праймером С09. М-123 bp DNA ladder. 1 - Fi (Curl x L-108); 2 - L-108; 3 - Curl; 4 - M-10; 5 - F, (Curl x M-10); 6 - L-1238; 7 - Curl; 8 - F, (Curl x L-1238); 9 - Ch-6; 10 - L-1238; 11 - Fi (Ch-6 x L-1238); 12 - Ранний Зеленый; 13 - Curl; 14 - Ft (Cuil x Ранний Зеленый). Стрелками показаны полиморфные фрагменты.

Нами также была предпринята попытка поиска RAPD-маркеров, сцепленных с генами, отвечающими за некоторые морфологические признаки. Для этого было использовано скрещивание линии L-1238, маркированной 25 морфологическими маркерами, и сомаклонального варианта Ch-6, дефектного по хлорофиллу. Для 63 растений второго поколения были получены RAPD-спектры с праймерами С09 и В-474.

По данным ЛАРО-анализа между скрещиваемыми линиями были выявлены различающиеся фрагменты 980 п.о. и 861 и.о., присутствующие в линии Ь-1238, а также фрагмент 570 п.о., имеющийся у сомаклона СЬ-6. Анализ наследования каждого из этих полиморфных фрагментов показал соотношение, близкое к 3:1, что соответствует закономерностям моногенных расщеплений. Анализ КАРБ-спектров среди потомков Р2 выявил наличие как исходных спектров, имеющихся у родителей, так и перекомбинированных спектров, что еще раз подтверждает менделевский характер наследования изученных 1Ъ\РЕ)-фрагментов.

Анализ спектров всех 63 растений Р2-поколения от скрещивания Ь-1238 х СЬ-6 показал, что НАРО-фрагменты 980 п.о. и 861 п.о. наследуются независимо друг от друга, а фрагменты 861 п.о. и 570 п.о. проявляют сцепление.

Была вычислена частота рекомбинации р, которая, по нашим данным, между маркерами 861 п.о. и 570 п.о. составляла 5,8 %. Критерием достоверности 2

служил % =36,3.

Анализ морфологических признаков гибридов Р2 исследуемого скрещивания не выявил сцепления хлорофильного дефекта с маркерными генами а, 1е, 11". Результаты анализа представлены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты сцепления в Г2 от скрещивания сомаклона СЬ-6 с маркерной лшшей Ь-1238.

Пары генов Число растений в Р2 Х2а Х'в Х'ав

С данным фенотипом Всего

АВ АЬ АВ аЬ N

СЬ-6 х Ь-1238 СЫ-6 а 19 9 6 2 36 0,14 0,59 0,19

СЫ-6 1е 38 13 8 4 63 1,22 0,13 0,206

СЫ-6 ёр 28 10 7 1 46 1,42 0,02 1,3

СЫ-6 А" 34 18 1 10 1 63 1,91 0,07 2,96

A, а - доминантный и рецессивный фенотип первого гена.

B, Ь - второй ген.

Информативность ЕАРЭ-анализа в Р2 снижается из-за доминантной природы ЯАРО-маркеров, которые не позволяют отличать гетерозиготы от доминантных гомозигот. В связи с этим мы исследовали растения пятого поколения, где Н = 0,626 (Н - доля гетерозигот в популяции).

С помощью последовательного индивидуального отбора были получены 50 рекомбинантных инбредных линий (РИЛ) пятого поколения, созданных на основе скрещивания СЬ-6 х Ь-1238. В поколении мы наблюдали наследование практически всех фрагментов КАРО-спектра, выявленных во втором поколении. Полученные ЯАРБ-спектры были распределены на фенотипические классы (рис, 6 а). Распределение линий пятого поколения от исследуемого скрещивания по признаку окраски семян позволило получить ЛАРВ-спектры двух фенотипических классов, которые отличались по антоциановой пигментации семени (гену Ап) (рис б б). КАРВ-спектры этих пулов ДНК отличались только по фрагменту 980 п.о. На основании этих данных мы делаем заключение, что фрагмент 980 п.о., вероятно, сцеплен с одним из генов антоциановой пигментации семени (геном А").

Рис. 6 а. Схема продуктов амплификации с праймером С09.

1 - 7 - фенотипические классы Р5 поколения. Стрелками показаны отличающиеся фрагменты.

5. Характеристика КА1'Г)-фраг.чентов ДНК.

С целью изучения природы ЛАРО-маркеров гороха было проведено клонирование и секвенирование трех общих для всех сортов, линий и мутантов фрагментов, образующих наиболее яркие полосы длиной 1300 п.о., 680 п.о., 420 п.о. (рис. 7 а), двух фрагментов, общих для сомаклональных вариантов гороха, длиной 450 п.о. и 420 п.о., а также фрагмента 370 п.о., характерного для СЬ-6 (рис. 7 б)., но отсутствующего у других сомаклонов.

Рис. 6 б. Схема продуктов амплификации с праймером С09.

1 - фенотипический класс (наличие антоциановой пигментации);

2 - фенотипический класс (отсутствие антоциановой пигментации).

Нуклеотидные последовательности рекомбинантных клонов были сравнены с последовательностями, депонированными в базе данных GENEBANK.

Поиск гомологичных последовательностей позволил выявить гомологию в 69 % одного из общих фрагментов длиной 1300 п.о. с уже известной последовательностью Arabidopsis thaliana и гомологию в 70 % фрагмента 450п.о. из RAPD-спектра хлорофильного сомаклона с участком последовательности длиной 3400 п.о. ALF-RPE 15А генома люцерны, относящимся к средним повторам с числом копий 2-ЗхЮ3 на гаплоидный геном. Поиск последовательностей, гомологичных фрагментам 370 п.о., 420 п.о. и 680 п.о. не выявил высокой степени гомологии ни с одной из известных последовательностей из банка.

Клонированный фрагмент 420 п.о., общий для всех сортов, линий и мутантов, был использован в качестве зонда при гибридизации с блот-фильтром 11АРВ-фрагментов разных сортов гороха. На рис. 8 видно, что все фрагменты спектра с молекулярным весом около 420 п.о. гибридизуются с радиоактивной пробой. Этот результат подтверждает, что клонированный фрагмент 420 п.о. принадлежит данному КАРО-спектру, а также свидетельствует о том, что фрагменты спектра с одинаковым молекулярным весом являются го м о логичными.

Рис. 7. КАРО-спектры ДНК: а - сортов гороха с праймером С09, б - сомаклональных вариантов гороха с праймером В-474. Стрелками показаны фрагменты, взятые для клонирования.

Полученная информация о нуклеотидной последовательности различающегося фрагмента 370 п.о. у СЬ-6 может служить основой для конструирования двух специфических праймеров, комплементарных концам

этого фрагмента. С их помощью на исходной матрице ДНК специфически амплифицируется единичный локус, который может быть использован в качестве вторичного кодоминантного маркера для последующего генетического анализа.

Рис. 8. Радиоавтограф блот-фильтра КАРБ-фрагментов сортов гороха с меченным 32Р фрагментом 420 п.о.

Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют эффективность использования ИАРВ-метода для изучения генетической изменчивости, а также для выявления в геноме гороха новых молекулярных маркеров.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием оптимизированных условий проведения ЛАРО-реакции и подобранных праймеров выявлен полиморфизм ДНК у сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха.

2. Индивидуальные ЛАРО-спектры сортов гороха позволяют проводить их паспортизацию и дифференциацию.

3. Уровни генетических различий между сортами, линиями и мутантами гороха, установленные с помощью методов кластерного анализа, составили, в среднем, 0,35; 0,28 и 0,09, соответственно.

4. Установлено, что полиморфные фрагменты ЛАРО-спектра, обнаруженные у сомаклона СЪ-6 и маркерной линии Ь-1238, наследуются как простые доминантные маркеры и выявляются у гибридов Бь Бг и поколений.

5. Обнаружен ЛАРО-маркер, сцепленный с одним из генов антоциановой пигментации семени.

6. Клонированы и секвенированы 6 ЛАРО-фрагментов генома гороха. Показано, что фрагменты 1300 п.о. и 450 п.о. гомологичны уже известным последовательностям геномов люцерны и арабидопсиса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kokaeva Z.G., Valiejo-Roman К.М., Bobrova V.K., Troitsky A.V., Gostimsky S.A. Application of random amplified polymorphic DNA technique for detection of polymorphism among somaclonal variants of pea. // Plant Genome IV. The International Conference of the Status of Plant Genome Research. San Diego. California. 1996, p. 41.

2. Kokaeva Z., Petrova Т., Bobrova V., Troitsky A., Gostimsky S. Genetic diversity between the varieties, mutants and somaclonal variants of pea observed by RAPD technique. // German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. St.Peterburg. 1996, p. 37.

3. Кокаева З.Г., Боброва B.K., Вальехо-Роман K.M., Гостимский С.А., Троицкий А.В. RAPD-анализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха. // Доклады РАН. 1997, т. 355, № 1, с. 134 - 136.

4. Кокаева З.Г., Петрова Т.В., Боброва В.К., Багрова А.М., Троицкий А.В., Гостимский С.А.. Сомаклональная изменчивость и генетический полиморфизм, выявляемый RAPD методом. // Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда. Тезисы докладов VII Международной конференции, Москва, 1997, с. 221.

5. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А., Троицкий А.В. Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа. // Генетика. 1998, т. 34, № 6, с. 803 - 809.

Издательство АО "Диалог-МГУ".

ЛР № 063999 от 04.04.95 г. Подписано к печати 17.07.98 г. Усл.печ.л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ 781. Тел. 939-3890,928-2227,928-1042. Факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.