Изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L., произрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана

Кавракова, Зубайда Бурихоновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L., произрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L., произрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана"

На правах рукописи

□03463Э22

КАВРАКОВА ЗУБАЙДА БУРИХОНОВНА с/Й

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ДНК У ВИДОВ

РОДА Л ЕС ПОР Б Ь., ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ ТАДЖИКИСТАНА

03.00.12- физиология и биохимия растений, 03.00.15-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУШАНБЕ- 2009

003463922

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Насырова Фируза Юсуфовна,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Наймов Сафарали

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Гиясов Таваккал Джураевич, Таджикский национальный университет,

кандидат биологических наук Усманов Тимур Пулатович, Институт физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан

Ведущая организация: Таджикский аграрный университет

Защита состоится "eLl" 2009 г. в $ ч. на заседании

диссертационного совета Д 047. 001.01 при Институте физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан (734063, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2, e-mail: asrtkarimov@mail.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. И. Ганди Академии наук Республики Таджикистан.

Автореф ерат разослан "/V "т^/и^-лт г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент (¡^у

Б. Джумаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в области сравнительной генетики зерновых злаков интенсивно проводятся эксперименты с использованием молекулярных маркеров. В результате таких исследований либо строятся практически лишенные функциональных генов карты, либо проводится "сравнительная привязка" того или иного гена разных видов к одним и тем же молекулярным маркерам (Гречко, 2002; Горюнова, 2004). Это связано с тем, что сравнительно-генетические исследования помогают эффективно сопоставить геномы разных видов растений и открывают дополнительные резервы мобилизации генетических ресурсов видов, родов при создании нового исходного материала, который может быть использован как для повышения эффективности генетических исследований, так и для селекции (Вавилов, 1967; Ко-нарев, 1980; Алтухов, 1989; Гончаров, 2002).

Важнейшей характеристикой популяций служит их внутрипопуля-ционная генетическая изменчивость, "полиморфизм" по дискретным качественным и непрерывным количественным признакам (Дрейпер, 1991; Зеленин, 2001; Жимулев, 2002).

Изучение практически всех видов рода Aegilops L. развивалось и развивается в связи с их высокой устойчивостью к ряду грибковых болезней и некоторым насекомым-вредителям, а также с возможностью проведения между ними и возделываемыми видами пшеницы интрогресеивной гибридизации для передачи им полезных прюнаков (Корень, 1998; Картель, 1999).

Географическое расположение Таджикистана с его своеобразными климатическими условиями, а также разнообразием диких представителей зерновых злаков представляет особый интерес для изучения полиморфизма ДНК генома видов Aegilops L. Поэтому нам представлялось вполне актуальным провести исследование природных форм и типов (биотипов) видов рода Aegilops Lпроизрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана с применением молекулярных маркеров.

Цель и задачи работы. Целью нашей работы было изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L. с использованием молекулярных маркеров, а также геномный анализ образцов видов рода Aegilops L., произрастающих в различных регионах Таджикистана. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• экспедиционные сборы семян видов рода Aegilops, произрастающих в различных природно-климатических условиях Центрального, Южного и Северного Таджикистана, и их краткое фенотипическое описание;

• использование молекулярных маркеров на основе проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа генетической вариабельности каждого вида;

• геномный анализ образцов видов, собранных в различных природно-климатических условиях Таджикистана;

• использование ЯДРО - маркеров для геномного анализа образцов видов рода Aegilops;

• использование микросателлитов или БЯЯ - маркеров для выявления филогенетических связей между видами и внутривидового полиморфизма представителей рода Ае°Иорх флоры Таджикистана;

• определение генетического расстояния и построение дендрограм-мы на основе анализа различных молекулярных маркеров для выявления степени генетической близости или различия у образцов изученных видов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые с использованием двух типов молекулярных маркеров (11АР1) и ЗБЯ) проведен анализ широкого набора образцов представителей четырёх видов рода Ас^Иорз, произрастающих на территории Таджикистана. На основе полученных данных определены уровни внутри- и межвидового геномного полиморфизма и показаны существенные различия внутривидовой геномной вариабельности у изученных видов. Обнаружен определенный параллелизм внутривидовой вариабельности морфо-биологических признаков с вариабельностью молекулярного анализа генома. У исследованных видов Ае?,Иоря выявлен внутри- и межвидовой полиморфизм по всем использованным молекулярным маркерам, что свидетельствует об информативности данных маркеров. Впервые был проанализирован полиморфизм ДНК у видов, произрастающих на разных высотах над уровнем моря и в разных природно-климатических условиях Таджикистана. В связи с этим особую практическую значимость имеют результаты, касающиеся образцов, обладающих высоким уровнем изменчивости генов, ответственных за соле - и засухоустойчивость, а также устойчивостью к различным заболеваниям. Подобранные нами методы и праймеры позволяют эффективно выявлять меж- и внутривидовую изменчивость у изученных видов и могут быть использованы селекционерами в их работе по созданию устойчивых сортов зерновых злаков. Кроме того, полученные результаты были использованы при создании коллекции рода Aegilops, произрастающих в различных экологических условиях Таджикистана.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены (или представлены) на: шестом съезде физиологов растений РФ

(Сыктывкар, 2006), второй Центрально-Азиатской конференции по зерновым культурам (Иссык-Куль, Киргизия, 2006), конференции, посвященной 120-летию Н.И.Вавилова "Вклад Н.И.Вавилова в изучение растительных ресурсов Таджикистана" (Душанбе, 2006), конференции посвященной 120-летию Н.И.Вавилова в ВИРе (Санкт-Петербург, 2006), семинаре лаборатории молекулярной генетики зерновых злаков Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (Новосибирск, 2007), конференции молодых ученых Академии наук Республики Таджикистан (Душанбе, 2007), конференции "Адаптационные аспекты функционирования живых систем" (Душанбе, 2007), конференции, посвя-щённой 100-летию профессора О.Ш. Шукурова (Душанбе, 2008), конференции, посвященной памяти академика АН Республики Таджикистан Ю.С. Насырова (Душанбе, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 97 страницах печатного текста, включая 9 таблиц, 11 схем и 15 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 118 работ.

Благодарность. Экспериментальная работа выполнена при поддержке гранта Международного научно-технического центра №Т-1105.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. Объекты и методы исследований

Материалом для исследования служили образцы четырех видов рода Aegilops L. (Эгилопс) - однолетние травянистые растения, относящиеся к семейству злаков, которые являются ближайшими сородичами пшеницы. Aegilops имеют в составе своего аллоплоидного генома геном D: Aegilops crassa (геном XCIDal и X°DcrIDcfi), Aegilops cylindrica (CCDC) и диплоидный вид Aegilops tauschii (D), который является донором D-генома для культурных сортов пшеницы. Кроме того, в анализ был включен диплоидный вид Aegilops triuncialis с геномом С и U.

Географическое расположение Таджикистана с его своеобразными природно-климатическими условиями и рядом экстремальных факторов (температурные перепады, высотные пределы, засушливость, засоленность почв) способствовали формированию уникальных морфотипов Aegilops L. В зависимости от мест произрастания видов Aegilops L фор-

мировались биотипы (морфотипы) с различной степенью устойчивости. Одни морфотипы приспосабливались к жарким и засоленным местам произрастания, другие - к местам с умеренной температурой. Более жесткие климатические условия, действуя как селективный фильтр, способствовали сохранению и распространению наиболее приспособленных биотипов.

Каждый из видов имеет свой высотный предел распространения:

Aegilops crassa Boiss. произрастает на высоте от 400 до 600 м над ур. моря; Aegilops triuncialis L. произрастает повсеместно как в Центральном, Северном, так и Южном Таджикистане до 2000 м над ур. моря; Aegilops cylindrica Host, произрастает в среднегорье и долинной части до 1600-1800 м над ур. моря; Aegilops tauschii Coss. распространен повсеместно на высоте от 360 до 2000 м над ур. моря (Наймов, 2002). Для анализа генома видов Aegilops L. отбирали образцы, собранные в разных регионах Таджикистана, характеризующихся своими природно-климатическими особенностями.

1.1. Выделение ДНК из проростков Aegilops микрометодом

ДНК выделяли из проросших семян согласно общепринятой методике (Plaschke et al., 1996).

1.2. Проведение ПЦР - анализа

В стерильных условиях готовили реакционную смесь, содержащую: ПЦР-буфер, смесь dNTP, праймеры, фермент Taq - полимеразу и образцы ДНК. Полученную смесь доводили дистиллированной водой до 25 мкл. Смесь в пробирке ставили в амплификатор и проводили ПЦР (Sharma, 1995, 2002).

Для RAPD-анализа использовался набор случайных праймеров длиной 10-11 нуклеотидов.

Для SSR-анализа использовался набор праймеров длиной 20-22 нуклеотидов для выявления полиморфизма длины простых повторов ДНК.

1.3. Проведение электрофореза в агарозном геле

Электрофорез ПЦР - продуктов проводили в агарозном геле. Для электрофоретического разделения фрагментов амплифицированной ДНК использовали 2% агарозный гель с добавлением бромистого эти-дия (Sharma, 1995). После окончания электрофореза электрофореграм-мы фотографировали под ультрафиолетовым светом и анализировали с помощью системы Bio Doc System.

1.4. Анализ продуктов ПЦР в полиакриламидном геле (ПААГ) Разделение немеченых продуктов амплификации, полученных с праймерами к SSR-последовательностям, проводили в 10% и 12% ПААГ. Электрофорез вели при напряжении 3-10 вольт/см в течение 6-20 ч. Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (5 мкг/ мл) в течение 20 мин, затем отмывали в дистиллированной воде в течение 20 мин и электро-фореграммы фотографировали в УФ-свете. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали Pstl-гидролизат ДНК фага X (Plaschke, 1995: Pestsova, 1998).

ГЛАВА 2. Результаты исследований

2.1 Анализ RAPD - маркеров для генотипирования видов рода Aegilops L. флоры Таджикистана Применение различных типов генетических маркеров, морфологических, биохимических и, особенно, молекулярных становится все более обычным в изучении генетики злаковых растений (Peterson, 1997). Однако становится все более очевидным, что разные типы генетических маркеров могут решать разные задачи (Belaj, 2002). Поэтому нами была поставлена задача использовать RAPD-маркеры для генотипирования видов рода Aegilops Таджикистана. Цель работы заключалась в изучении генетической изменчивости представителей рода Aegilops и сравнении генетического расстояния между различными образцами разных видов Aegilops с помощью RAPD-анализа.

Использованные виды рода Aegilops отличались друг от друга не только по месту произрастания и фенотипическим признакам, но и по структуре генома.

В настоящее время мало изучены сравнительная характеристика уровней внутривидового полиморфизма и филогенетические отношения у всех видов Aegilops с D-геномом. Для молекулярного анализа было отобрано по 30 образцов каждого вида рода Aegilops, произрастающих на территории Таджикистана. При отборе образцов мы руководствовались их географической приуроченностью, так, чтобы максимально охватить ареал вида и, тем самым, попытаться наиболее полно охарактеризовать генетическую вариабельность каждого анализируемого вида.

Каждый ПЦР-продукт амплифицируется из участка геномной ДНК, который содержит две короткие последовательности ДНК. Эти последовательности должны находиться на противоположных цепях и на достаточно близком расстоянии, чтобы амплификация прошла успеш-

но- Использование коротких праймеров гарантирует то, что несколько случайно распределенных в геноме локусов дадут амплификационные продукты. Полиморфизм между особями может возникать из-за различий в одном или обоих сайтах связывания праймера и тогда выявляется при электрофорезе как присутствие или отсутствие отдельной RAPD-полосы (Малышев, 1997). Если же амплифицируемый фрагмент ДНК-матрицы содержит ин-серцию или делецию, то RAPD в основном наследуются как доминантные маркеры, кодоминантное наследование встречается относительно редко.

Для RAPD-анализа было отобрано 17 праймеров (табл. 1) длиной в 10-11 нуклеотидов, отобранных на основании выявления большего числа ПЦР-фрагментов при использовании их для амплификации геномной ДНК образцов Aegilops. ПЦР - анализ продуктов амплификации проводили согласно описанным ранее методикам (Lapítan, 1992; Salina, 1998).

Анализ амплификации ДНК четырёх видов Aegilops с использованием 17 RAPD-праймеров выявил 1118 ПЦР - фрагментов. Каждый из праймеров образовал от 7 до 26 фрагментов ДНК, в зависимости от вида и изучаемых образцов.

Таблица 1

RAPD - праймеры, использованные при генотипировании видов рода Aegilops L.

Название праймеров Первичная структура праймеров Количество фрагментов

R 031 -GTCGA-CGCAT-G-(63%) 14-17

R033 -TGGTG-CTGAG-A-(54%) 14-19

R039 -AGCAC-CTCAC-A-(54%) ¡5-26

R058 -ATCGG-TCGGT-A-(54%) 11-20

R064 -ATGCC-CTAGA-(54%) 14-26

R068 -CAACT-AGACG-G- (54%) 12-20

R074 -CCCTG-AAACA-C-(45%) 13-18

R082 -GATGG-AACGA-C-(45%) 10-20

R091 -CATAC-GATAC-G-(45%) 17-23

R156 -TGCAC-ACTGA-(50%) 14-20

R157 -TGGTG-ACTGA-(50%) 18-25

R158 -TGGTC-TCTGA-(50%) 14-23

R159 -TGGTC-AGTGA-(50%) 07-12

RI60 -TGGTC-ACTCA-(50%) 14-25

R177 -CCGAA-CGGGI-(70%) 13-17

R342 -GGCTG-CAATG-(60%) 11-17

R565 -CCAAA-ATCGT-A-(60%) 12-19

Полученные результаты представляют интерес в плане выявления внутри- и межвидовой изменчивости у Aegilops. В ЯАРЭ - генотипиро-вание были включены образцы видов, отличающихся друг от друга по

ряду морфологических признаков: окраске колосьев и остей, меняющихся от светло-желтой до. зеленой, коричневой и фиолетовой, а также присутствием или отсутствием воскового налета. Результаты электро-форетического исследования RAPD 17- праймера у 16 образцов видов Ае. triuncialis, Ае. cilyndrica, Ае. tauschii и Ае. crassa представлены на рис. 1 и 2, где наблюдается проявление полиморфизма между образами одного и того же вида и между изученными видами.

Вид Ае, triuncialis распространен во всех климатических условиях Таджикистана и имеет большой диапазон внутривидовой изменчивости по фенотипическим признакам, что позволяет виду адаптироваться к самым неблагоприятным факторам среды.

Среди 278 обнаруженных ПЦР-фрагментов у образцов Ае. triuncialis 182 из них (65, 4%) оказались полиморфными, то есть фрагменты цепочки ДНК данного праймера оказались разной величины у каждого образца, 96 (34,6%) оказались мономорфными, то есть имели одинаковую длину фрагментов у всех изученных образцов.

Сравнение результатов RAPD-анализа с SSR-праймерами показывает обратную картину. 14 SSR-праймеры (43,4%) оказались полиморфными, 56,6% мономорфными. Эти данные позволяют нам предположить, что RAPD-праймеры можно использовать для анализа внутривидовой изменчивости видов рода Aegilops.

Вид Ае. crassa имеет узкий ареал распространения в Таджикистане (400-550 м над ур. моря) и характеризуется небольшим разнообразием по фенотипическим признакам. В наших работах было показано, что по микросателлитному анализу у Ае. crassa было обнаружено 81,3% полиморфных и 18 ,6% мономорфных локусов. В отличие от других видов, у Ае. crassa по RAPD-праймерам выявлен самый низкий уровень изменчивости - 48,1 % полиморфных и 51,9% мономорфных локусов. Полученные данные свидетельствуют о среднем уровне внутривидовой изменчивости Ае. crassa по RAPD-анализу. Это позволяет сделать заключение о том, что молекулярные маркеры можно использовать для изучения внутривидового разнообразия видов рода Aegilops.

У вида Ае. cylindrica обнаружен высокой внутривидовой полиморфизм по фенотипическим признакам. Различие между использованными образцами проявляется в интенсивности окраски колосковых элементов. Из 281 ПЦР-фрагментов 207 (73,7%) были полиморфны и 74 (26,3%) мономорфны. Эти данные подтверждают данные по 14 SSR-праймерам, где 88,8% были полиморфные и только 11,2% мономорф-ные. Необходимо отметить, что только у праймера R 058 у одного образца Ае. cylindrica, собранного в Файзабадском районе, было обнару-

жено 100% полиморфных локусов. Высокий уровень разнообразия у этого вида, по-видимому, связан с тем, что вид очень пластичный и имеет большой диапазон внутривидовой изменчивости по местам их широкого произрастания в различных регионах Таджикистана.

Образцы ДНК

Рис.1. Электрофореграммы ПЦР - продуктов 157-RAPD праймера образцов Ае. triuncialis. Обозначения: I.линейки; 2.Файзабидский р-н, около к-ка Дубеда, 3; З.Гиссарскийр-н, около соледобываюшего источника, 5; 4. Рудакинскийр-н, Эсанбой, 31-06; 5.Пенджикентский р-н, 33-06; 6. Пенд-жикентский р-н, 3S-06; 7. Файзабидский р-н, Бодомо; 16; S. Ходжа Оби-гарм, 17; 9. Пенджикентский р-н, 42-06; 10. Окулок, S-06; 11. Файзабад-ский р-н, 15-06; 12. Файзабидский р-н, Чашмасор, 17-06; 13. Рудакинский р-н, Лохур, 22-06; 14. Рудакинский р-н, Лохур, 23-06; 15. Окулок, 25-06; 16. Рудакинский р-н, Эсанбой, 27-06. Указаны места произрастания и каталожные номера (Наймов и др., 2007).

Многие исследователи считают, что Ае. tauschii является донором современних тетраплоидных и гексаплоидных пшениц. Этот вид используется в селекционной программе как донор устойчивости к абиотическим и биотическим факторам среды. В зависимости от места произрастания, возможно, разные биотипы Ае. tauschii адаптировались к различным воздействиям неблагоприятных факторов среды и, соответственно, это не могло не отразиться на молекулярном уровне генома.

Из 289 ПЦР-фрагментов, выявленных с помощью 17 RAPD- прай-меров, у изученных образцов Ае. tauschii 161 (55,7%) были полиморфными и 128 (44,3%) фрагментов мономорфными. У этого вида почти половина обнаруженных фрагментов у всех изученных образцов остаются стабильными. Это свидетельствует о небольшой информативное-

ти данного ираймера по отношению к геному Aegilops. При анализе 14 SSR-праймеров. обнаружилась обратная картина по сравнению с RAPD-праймерам. Самый высокий уровень внутривидового полиморфизма (до 90,4 % у Ае. tauschii) был обнаружен у всех изученных видов с использованием данного праймера. Нами рекомендуется использовать этот прай-мер для изучения генома видов Aegilops.

На рис. 1 и 2 представлены результаты ПЦР-анализа по RAPD-праймерам, где имеются отличия в количестве фрагментов у различных видов рода Aegilops.

A soon

2000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10- И 12 13 14 15 16

Образцы ДНК

Рис. 2. Электрофореграммы ПЦР - продуктов с 157 - RAPD прайме-ром образцов Ае. tauschii. Обозначения: 1. линейка; 2. Рудакинский р-н, Эсанбой, 7; 3. Карагты, 10-1; 4. Пянджскт р-н, 16-2; 5. Оби Киик 3-1; 6. Раштский р-н, 36-1; 7. Тавилдаринский р-н, 37-1; 8. Рудакинский р-н, 411; 9. Файзабадский р-н, 14-06; 10. Рудакинский р-н, 24-06; 11. Пенджнкен-тский р-н, 28-06; 12. Пенджикептский р-н, 32- 06; 13. Пенджикентский р-н, 12-06; 14. Пенджикентский р-н, 26 06; 15. Гиссарский р-н, около соледобывающего источника, 42-06; 16. Раштский р-н, 35-1. Указаны места произрастания и каталожные номера (Наймов и др., 2007).

В качестве примера на рис. 1 приведены результаты анализа продуктов Г1ЦР, полученных с праймером R-157. Длина фрагментов - в пределах от 200 до 2000 п.н. при амплификации ДНК по 15 образцам каждого из видов Aegilops. Фрагменты ДНК, имеющие 340, 450, 420, 550, 650, 700, 850 п.н., оказались неполиморфными, а фрагменты длиной 380, 500, 750, 770 и выше 1000 п.н. оказались полиморфными.

Вид Ае. сгси*а имеет фенотипическую изменчивость, что подтвердилКАРО-анализ (48,1% фрагментов полиморфные). Уровень внутривидового различия по КАРО-анализу у различных видов Аефорз неодинаковый, что подтверждает их разнообразие в природе. В табл. 2 приведены сравнительние данные по ИАРП- и ББИ-анализу видов Aegilops, произрастающих в Таджикистане. В основном результаты по двум молекулярным маркерам совпадают с фенотипическим разнообразием признаков у всех изученных видов Ае^йорз Ь.

Таблица 2

Сравнительный анализ между КАРЕ»- и ББИ- праймерами у видов Aegilops

Образцы Aegilops Ь. 8811-фрашенты ИАРО-фрагменты

количество фрагментов полиморфные, % мономор фные, % количество фрагментов полиморфные, % моно- морфные, %

Ае. (аизсКп 52 90,4 9,6 289 55.7 44,3

Ае. суНпсЗлса. 18 88,8 11,2 281 73,7 26,3

Ае. сгавза 59 81,3 18,6 270 48,1 51,9

Ае. ишпааИБ 23 43,4 56,6 278 65,4 34,6

Как следует из приведенных выше данных, ИАРО-анализ образцов Ае. 1атс1ш проявляет примерно 50%-ный внутривидовой полиморфизм, что, вероятно, связано с его адаптивными возможностями. С использованием того же праймера у вида Ае. ашяа проявился небольшой уровень внутривидового полиморфизма. Возможно, это связано с узким ареалом распространения данного вида в Таджикистане. В то же время из литературных источников известно, что этот вид имеет высокий уровень хромосомного полиморфизма и разнообразие морфологических признаков (Гончаров, 2002).

В целом, виды, имеющие Э-геном, проявляют общую картину фе-нотипической изменчивости по сравнению с видами, не имеющими Гогеном. Таким образом, в результате 11АРО-маркирования видов рода Aegilops, произрастающих в Таджикистане, впервые определен уровень генетического полиморфизма и коэффициент сходства их геномов с использованным молекулярным маркером.

Для оценки уровня внутривидовых различий для каждого из анализируемых видов Aegilops методом 11АРО-маркирования было использовано 17 отобранных праймеров, которые показали высокую информативность при анализе геномов злаковых. Было проанализировано 53 образца четырех видов Aegilops, из которых обнаружено всего 1117 ЛАРО-

фрагментов. По результатам анализа были определены генетические расстояния и иерархические кластерные группы внутри каждого вида (с использованием стандартной компьютерной программы Ш^ЗУБ-рс, 2.0) и построены дендрограммы кластерного анализа. Максимальное внутривидовое сходство между группами образцов было отмечено для Ае. суИпс1гка (коэффициент генетического сходства составил 0,92).

Анализ коэффициента генетического сходства между различными образцами вида Ае. хпипс 'шИз показал, что имеется два основных кластера: первый кластер объединяет, в основном, образцы, произрастающие в северных регионах Таджикистана, а второй кластер - в южных регионах. Показано, что данный вид имеет наибольший уровень биоразнообразия среди всех изученных видов Aegilops. С точки зрения места произрастания по наибольшему генетическому разнообразию выделяются представители образцов, собранных в Файзабадском районе (населенный пункт Бодомо). Между образцами из Рудакинского и Варзобского районов (Лохур и Ходжа Обигарм) существенного различия не обнаружено. У вида Ае. суИпс!гка выделяются два кластера, внутри которых образцы располагаются равномерно. У видов Ае. спша и Ае. 1аияскй по изученным праймерам выявлен примерно 50%-ный полиморфизм.

В задачу наших исследований входил также анализ филогенетических связей в группе видов Ле£11ор.ч, имеющих О-геном, а также родственные отношения видов, не имеющих О-геном.

Как известно, диплоидный ввд Ае. ШиБсИи имеет О-геном, а виды Ае. сп^яа и Ае. суПпёпса являются полиплоидными видами, но также имеют О-геном (СавШЪо, 1995). Поэтому молекулярный анализ установления филогенетических связей у видов с О-геномом является актуальным.

Что касается полиплоидных видов Ае. атяа и Ае. суИп<1гка (схема 1) с О-геномом, то они имеют более низкий уровень внутривидового разнообразия. Наши данные показывают, что образцы вида Ае. сгазва имеют более близкий уровень генетического сходства с Ае. ¡аизсЬи, чем с Ае. суНпйгка, что, по-видимому. связано с тем, что вид Ае. суИпйпса, кроме О-генома, имеет еще и С-геном. Иногда образцы Ае. суИпАчса могут образовывать один кластер с представителями других видов, в частности, наши данные показывают, что образцы Ас. су/тс/гка образуют общий подкластер с образцами вида Ае. (гшпслаНя из Ходжа Оби-гарма и Лохура. Полиплоидный вид Ае. (гшпегаНя не имеет О-генома, но имеет Сии -геном, благодаря которому этот вид образует единый кластер с Ае. суйтЫса. Таким образом, виды Ае. суИпёпса и Ае. и 'шпсгаИв имеют общий геном С, что подтверждается наличием общего кластера по КАРО-праймеру.

I Ae. tri. ЭсанбойД2 -I Ae. tri. Пенажикент,33 I Ae. tri. Чашмасор,17

I Ae. tri-Хоча Обигарм 1 Ле. tri. Лохур,22

Ae. cyl. ЭсанбайЗ Ae. су). Пепджикснт,5 - Ae. cyl. Ганчи A«. су!. Шнркеит Ae. cyl. Г'иссар,21

Ae. tau. Оби Кинк Ae. tau. Пенджикент,32 Ae. tau. Рашт _________Ae. tau. Файзабад,14

- Ae .tau .Гиссар

p_j Ae. era. Файзабад

Ae. era. Гиссар,2

________________________1 Ae. era. Рудаки,7

Ae. era. Рудаки,6

- Ae. era. Гиссар,1

!-'-1-1-1-1-'-'-'-'-1-1-'-'-1-1-1-1-1-1-1

043 076 OS* C93 It

CoeiScKiil

Схема 1. Дендрограмма, отражающая степень генетического сходства у изученных образцов различных видов рода Aegilops на основании данных RAPD-анализа.

В отличие от видов, имеющих D-геном, представители вида с U-гено-мом (Ae. triuncialis) характеризуются значительным уровнем внутривидового разнообразия. Этот вид является одним из распространенных во флоре Таджикистан и имеет высокий уровень генетического разнообразия.

Как известно, различные виды рода Aegilops L. всегда привлекали большое внимание исследователей в качестве перспективных разнообразных генетических источников для селекции. Как показали многочисленные исследования, некоторые виды рода Aegilops L. принимали непосредственное участие в эволюционном становлении тетраплоид-ных и гексаплоидных пшениц (Долгушин, 1935; Дорофеев, 1966).

В последнее время для определения уровней межвидового и внутривидового геномного полиморфизма, определения филогенетических и эволюционных отношений между видами широко используются методы молекулярного анализа. Нами на основе результатов анализа по-

диморфизма фрагментов RAPD - праймера составлены дендрограммы, позволяющие определить коэффициент генетического сходства между различными образцами видов рода Aegilops. Необходимо отметить, что использование одновременно нескольких праймеров дает более полную картину генетического сходства при изучении генома растений.

2.2. Микросателлиптый (SSR) анализ генома видов Aegilops, произрастающих в Таджикистане

Выбор SSR - маркеров для гепотипирования основан, прежде всего, на высокой информативности данного метода. SSR - маркеры кодо.минан-тны, близкородсгвенные локусы содержат различные аллели, они широко распространены по всему геному и встречаются с частотой 1/10000 п.н. Также привлекает простота, доступность и экономичность этого метода. Выбор праймеров был основан на литературных данных и по рекомендации профессора М. Родер из Гатерслебена, Германия (Roder, 1998). Была выделена геномная ДНК из 5-8 растений микрометодом. Проведен ПЦР-анализ с каждой из выделенных ДНК и с каждой парой праймеров к микросателлитным районам, после этого был проведен электрофорез в агарозном геле и полиакриламидных гелях для выявления микро-сателлитных локусов. Нами был использован электрофорез продуктов ПЦР в 2% агарозном, а также в 8% и 12% - ых неденатурирующих полиакриламидных гелях для изучения в сравнительном аспекте методов разделения полиморфных микросателлитных локусов, различающихся по своей длине на несколько десятков пар нуклеотидов. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 2% -ом агарозном геле при напряжении 100 V, в течение 2 ч. В 12 %-ом ПААГ концентрирование продуктов ПЦР, имеющих одинаковый нуклеотидный размер, происходит наиболее четко, амшшфиконы определяются в виде неразмытых тонких полос с характерной локализацией для каждого образца ДНК При анализе продуктов ПЦР в 12 %-ом ПААГ стало возможным выявить как внутривидовой микроса-теллитный полиморфизм (Ае. crassa), так и межвидовой (между Ае. crassa, Ае. triuncialis, Ае. cylindrica), что хорошо согласуется с уже известными и опубликованными данными по SSR-маркированию (Roder, 1998). Для обнаружения внутривидового и межвидового полиморфизма среди видов рода Aegilops использовали SSR-праймеры, любезно предоставленные нам из Германии профессором М. Родер. Нами было использовано 106 образцов Aegilops для анализа полиморфизма ДНК по SSR - праймерам.

В результате амплификации с использованием 14 SSR-маркеров было получено в общей сложности 152 ПЦР - фрагмента, из них 121 -полиморфные и 31 - мономорфные фрагменты.

Микросателлитный анализ показал, что количество ПЦР - фрагментов у использованных праймеров на один маркер варьировало от 1 до 20. В некоторых вариантах встречается только один ПЦР - фрагмент - мономорфный. Иногда у одного образца выявлялся более чем один фрагмент, что можно объяснить наличием внутривидовой гетерогенности. Данные ББЯ-анализа показали, что каждый вид обладал характерными, не повторяющимися ПЦР-фрагментами.

На рис. 3 приведены данные ПЦР-анализа ЗБЯ-праймера ^У8Р-190 у различных образцов разных видов Aegilops. Например, микросателлитный анализ \VSP-190 8811-праймера показал наличие высокого полиморфизма ДНК внутри каждого изученного вида, а также между различными видами. Как показано на рис. 3, различные образцы А е. МипйаШ, произрастающего в различных регионах Таджикистана, дают три ПЦР-фрагмента.

Образцы ДНК

Рис. 3. Электрофореграммы ПЦР продуктов с 190 праймером образцов А е. ишпе'шШ. Обозначения: 1. линейка; 2. Файзабадский р-н, возле к-ка Дубеда. 3; 3. Гиссарский р-н, около соледобывающего источника 5; 4. Рудакинский р-н, Эсанбай, 31-06; 5. Пенджикентский р-н, 31-06; 6. Пенджикентский р-н, 31-06; 7. Пенджикентский р-н, 38-06; 8. Пенджикентский р-н, 16; 9. Пенджикентский р-н, 17; 10. Пенджикентский р-н, 42-06; 11. Пенджикентский р-н, 46-06; 12. Пенджикентский р-н, 4806; 13. Восточные Холмы г. Душанбе, 52-06; 14. Гиссарский р-н, около соледобывающего источника, 54-06; 15. Окулок, 11-06; 16. Рудакинский р-н, Эсанбай, 2-06; 17. линейка. Указаны места произрастания и каталожные номера (Наймов и др., 2007).

А Р Ы

5«П0

Н 2000

л 850 Е

О 400 Г

И,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Образцы ДНК

Рис.4. Электрофореграммы ПЦР продуктов с 190-SSR праймером образцов Ае. tauschii. Обозначения: 1-линейка; 2. Рудакинский р-н, Эсанбой 3; 3. Карагазы 9-2; 4. Карагазы 10-1; 5. Карагазы 10-2; 6. Пянджский р-н, 12; 7. Пянджский р-н, 16-2; 8. Оби Киик; 9. Раштский р-н; 10. Тавилдаринекий р-н; 11. Восточные Холмы, г. Душанбе; 12. Файзабадский р-н, 40; 13. Рудакинский р-н, 41-1; 14. Варзобский р-н, 15. Пшджикенгский р-н, 2-06. Указаны места произрастания и каталожные номера (Наймов и др., 2007).

На рис. 4 представлены данные по ГЩР-фрагментам 30 образцов Ае. tauschii также с использованием WSP-190 SSR-праймера, свидеттельствующие об обнаружении шести ПЦР-фрагментов. Эти результаты показывают, что 90% изученных образцов Ае. tauschii по данному праймеру полиморфные.

Таким образом, результаты анализов WSP-190 SSR-праймера, а также других праймеров выявили четкое внутривидовое различие у всех видов Aegilops.

Так, маркеры WSP- 006, WSP- 044, WSP-058 у всех изученных образцов и видов Aegilops имеют по одному фрагменту, маркеры WSP-046, WSP-082, WSP-130, WSP-156, WSP-190, WSP-192, WSP-619 для отдельных образцов и видов имеют по одному фрагменту. Обнаружено более трёх ПЦР-фрагментов по WSP-107 и WSP-120 - праймерам у всех видов Aegilops. Эти данные приведены в табл. 3. В основном, полиморфизм видов Ае. cylindrica, Ае. tauschii и Ае. crassa по 14 SSR-праймерам составляет 8095%, за исключением вида Ае. triuncialis, у которого полиморфизм составляет всего 47%. Интересно, что результаты, полученные по Aegilops triuncialis, сильно отличаются от данных, полученных по другим видам.

Возможно, этот вид менее изменчив, независимо от места обитания. Литературные данные также подтверждают, что вид Ае. triuncialis более

мономорфный. Результаты межвидового сравнения ПЦР-фрагментов показали, что между изученными нами видами наблюдается четкое различие при использовании различных праймеров. Данные микросагеллит-ного анализа содержат информацию, необходимую для оценки генетического разнообразия, в частности таких характеристик, как число аллелей на локус и коэффициент сходства. Таким образом, использованный набор из 14 микросатсллитных маркеров для анализа генома четырёх видов Aegi/ops позволяет охарактеризовать каждый изученный вид.

На основании полученных данных можно утверждать, что использованные нами SSR-праймеры весьма информативны и их можно использовать при изучении межвидовых и внутривидовых различий у злаковых культур и их сородичей. В литературе описано, что D-геномные группы растений характеризуются меньшим внутривидовым полиморфизмом, чем большинство полиплоидных видов с U-геномом. Интересные результаты получила C.B. Горюнова (2004) - проведенный RAPD-анализ не выявил различия между плоидностью двух видов Aegilops, хотя зги виды очень сходны морфологически и некоторые авторы не рассматривают их как два самостоятельных вида.

По данным RAPD-анализа единственным исключением среди полиплоидных видов с U - геномом является Ае. triuncialis, который имеет крайне низкий уровень внутривидового различия, а также является малополиморфным по данным дифференциального окрашивания, что подтверждает наши результаты по SSR-маркированию.

Микросателлиты позволяют выявлять высокий уровень полиморфизма у зерновых злаков по сравнению с другими молекулярными маркерами. Из-за большого размера генома пшеницы только 30 % всех праймеров являются функциональными и пригодными для генетического анализа. Большинство таких маркеров наследуется кодоминантным способом и в большинстве случаев они являются хромосомоспецифичными и подходящими для изучения полиплоидных геномов. На рис. 3 и 4 представлены материалы по изучению различных SSR-маркеров у видов рода Aegilops. Эти данные показывают, что четко наблюдается внутривидовой полиморфизм среди образцов видов рода Aegi/ops, произрастающих в различных регионах Таджикистана. Также можно наблюдать межвидовые различия.

В табл. 3 представлены использованные SSR-маркеры, а также соотношение полиморфных и мономорфных локусов у изученных видов Aegilops и количество молекулярных фрагментов у различных SSR-праймеров. У SSR-праймеров WSP-190, WSP-192 встречаются фрагменты с молекулярной массой 100, 800, 1000 и 1200 п.н. У SSR-праймеров WSP- 6, WSP-58, WSP-82, WSP-107 WSP-120, WSP-130, WSP-192, WSP-513 и WSP-619 наблюдается

Количество ББ!^- фрагментов, выявленных у различных видов Aegilops

5511 -праймеры \\'5р у/зр ! Ч\'5Р wsp У.'^р \\ 8Р wsp \\'5р , . / 006 044 046 | 058 082 107 120 130 156 190 192 5р 513

Количество фрагментов Ае§|'1орз 1а1ис1)н

всего 2 2 8 2 3 3 5 3 4 6 4 2 7 1

полиморфные 2 1 7 3 3 5 3 3 5 4 1 7 1

мономорфные - 1 1 - - - - - 1 1 - 1 - -

"/¿полиморфных 100 50 87,5 100 100 100 100 100 75 83,3 100 50 100 100

%мономорфных - 50 12,5 - - - - - 25 16.7 - 50 - -

Aegilops типааПз

всего 2 2 1 2 5 1 2 4 1 3

полиморфные 1 2 - 1 - - 1 1 1 3

мономорфные 1 - 1 1 5 1 1 3 - -

"/»полиморфных 50 100 - 50 - - 50 25 100 100

%мономорфмых 50 - 100 50 100 100 50 75 - -

Ае§Лор5 су1нк)пса

всего 2 3 5 1 1 6

полиморфные 2 3 5 - - 6

мономорфные - - - 1 1 -

%по;шморфных 100 100 100 - - 100

%мономорфных - - - 100 100 -

Aegi]ops сгаэза

всего 4 1 2 2 20 5 5 6 5 9

полиморфные 3 - 1 - 17 5 2 6 2 9

мономорфные 1 1 1 2 3 - 3 - 3 -

"/»полиморфных 75 - 50 - 85 100 40 100 40 100

%мономорфных 25 100 50 100 15 - 60 - 60 -

100%-ный полиморфизм. В табл. 3 представлено общее количество фрагментов ДНК у всех изученных видов рода Aegilops, произрастающих в Таджикистане. В этой же таблице приведены данные о полиморфных и мономорфных локусах всех использованных праймеров у всех видов Aegilops. Как видно из представленных данных, по SSR-маркерам у вида Ае. triuncialis наблюдается примерно 50 % полиморфных локусов, а у остальных видов (Ае. cylindrica, Ае. crassa, Ае. tauschii) полиморфные локусы составляют более 80%. Эти данные указывают на то, что уровень изменчивости у видов Aegilops, имеющих D-геном, примерно одинаков. Используя программу соотношения генетического сходства и различия, составлена дендрограмма по данным SSR-маркеров. Данные по генетическому сходству Ае. triuncialis указывают на высокий уровень генетического разнообразия среди всех изученных видов Aegilops. Вид Ае. triuncialis образует несколько кластеров и подкластеров.

Наибольшее генетическое разнообразие встречается у образцов, произрастающих на территории Файзабадского, Пенджикентского и Рудакинского районов. Самый высокий коэффициент разнообразия наблюдается у образца 48, собранного в Пенджикентском районе, (коэффициент генетического сходства 0,70).

Ае. tri. Эсанбой,22

---—■—— Ае. tri. ПенджикентЗЗ

Ае. tri. Чашмасор,17

_ ; Ае. tri.Xo4a Обигарм

' Ае. tri. ЛохурД2

--| Ае. cyl. ЭсанбайЗ

: Ае. cyl- Пенджикент,5

!! Ае. су). Ганчи Ае. cyi. Ширкент

__Ае. cyl. ГисеарД!

Ае, ts.u. Оби Кикк Ае. tau. Пенджнкент,32 Ае. tau. Рашт __,_,__Ае. tau. Файзабад,14

- Ае .tau .Гиссар

_J Ае. era. Файзабад

Ае. era. Гиссар.2

_ _-j Ае. era. Рудяки,7

Ае. era. Рудаки,6 --■ Ае. era. ГиссарД

,-.-.-.-,-1-,-,-,-,-,-,-,-г—,-1-1-1-.-,-1

«Я СПб QS4 СИ 1 0

СтЗюш!

Схема 2. Дендрограмма, отражающая степень генетического сходства у изученных образцов различных видов рода Aegilops на основании данных SSR -анализа.

У вида Ае, сгавза образцы, собранные в соседних регионах, располагаются в одни и те же группы кластеров. Среди образцов Ае. 1аизс1ш, произрастающего в различных регионах Таджикистана, нет четкого образования кластеров по месту их произрастания, о чем свидетельствует равномерный полиморфизм данного вида.

На дендрограмме 2 представлены данные ЗЗЯ-маркеров по всем изученным нами видам рода Aegilops Ь., произрастающим в Таджикистане. Данная дендрограмма подтверждает результаты использования Б1АРО-праймеров о том, что образцы вида Ае. и 'шпслаИх образуют общий кластер с образцами видов Ае. еуИпйпеа, хотя вид Ае. 1г1ипааШ не имеет О-генома. Но у них имеется общий геном С. Виды, имеющие геном Б (Ае. су1Шпса, Ае. сгахяа, Ае. ¡аизски), в дендрограмме расположены рядом и образуют свои кластеры и в некоторых случаях образуют общие кластеры.

Полученные нами данные на основании молекулярного генотипи-рования по БЗЯ-праймерам показали различную степень внутри- и межвидового полиморфизма у различных видов Aegi!ops.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием ЗБЯ -и ЛАРО- молекулярных маркеров проведен геномный анализ четырёх видов рода Ле^'/о/« Ь. произрастающих на территории Таджикистана. Определен уровень внутри- и межвидового полиморфизма видов Aegilops на уровне случайных ДНК-повторов (ЯАРО) и микросателлитных простых повторов генома (ББЯ).

2. Показано, что на молекулярном уровне виды, имеющие О-геном (Ае. ¡аи.чс1ги, Ае. суИпАпеа и Ае. сгаяха), содержат одинаковые фрагменты ДНК, а вид Ае. Ггшпс/аНх - отличные от них фрагменты.

3. По результатам ЫАРО- и Б Б К- маркирования наиболее полиморфным является вид Ае. ¡аихски (по 8811- маркерам 90% составляет полиморфность и около 10% мономорфность).

4.По коэффициенту генетического сходства между различными образцами вида Ае. типааИз образуется два основных кластера: первый кластер объединяет в основном образцы, произрастающие в северных регионах Таджикистана, а второй кластер - образцы Aegi¡ops, распространенные в южных регионах.

5.Образцы вида Ае. сгазва имеют более близкий уровень генетического сходства с Ае. ¡атскИ, чем с Ае. суИпйпса, что, по-видимому, связано с тем, что вид Ае. суИпЖчса, кроме О-генома, имеет еще и С-геном.

б.Микросателлитный анализ показал, что количество ПЦР -фрагментов у использованных праймеров на один маркер варьировало от

1 до 20. В некоторых вариантах встречается только один ПНР - фрагмент-мономорфный. ПЦР-анализ праймера WSP-190 у различных образцов видов Aegilops выявил наличие высокой степени полиморфизма ДНК внутри каждого изученного вида, а также между различными видами.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1.Кавракова З.Б.,:Хурматов Х.Х. Перспективы использования молекулярных маркеров в селекции пшеницы П Материалы конф. молодых ученых АН РТ. Душанбе. 2007. С. 80-83.

2.Хурматов Х.Х., Кавракова З.Б., Файзиева С. А., Гулов М.К., Сергеев Д. А., Наймов С.Н., Насырова Ф.Ю. Анализ генетического разнообразия рода Aegilops с помощью молекулярных маркеров // Адаптационные аспекты функционирования живых систем. Материалы Республиканской конф. Душанбе. 2007. С. 154-158.

3.Хурматов Х.Х., Сергеев Д.А., Кавракова З.Б., Файзиева С.А., Наймов С., Насырова Ф.Ю. Молекулярные маркеры ДНК в генетико-популяционных исследованиях // Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. наук. 2007, №1 (158). С. 32-37.

4.Наимов С., Нигмонов М., Насырова Ф.Ю., Касымова Г.Ф., Хур-матов Х.Х., Донцова C.B., Кавракова З.Б., Файзиева С.А., Сергеев Д.А., Гулов М.К., Алиев К.А., Рахматов А.С., Кичитов В.К. Каталог видов и образцов рода Aegilops L., собранных в различных эколого-географи-ческих зонах Таджикистана // Институт физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан. Душанбе. 2007.

5.Наймов С., Нигмонов М., Насырова Ф.Ю., Касымова Г.Ф., Хур-матов Х.Х., Донцова C.B., Кавракова З.Б., Файзиева С. А., Сергеев Д.А., Гулов М.К., Алиев К.А., Рахматов А.С., Кичитов В.К. // Авторское свидетельство jV> 048TJ. Душанбе. 2007.

6.Хурматов Х.Х., Сергеев Д.А., Кавракова З.Б., Салина Е.А., Хлёс-ткина Е.К, Насырова Ф.Ю. Геномный анализ культурных и дикорастущих форм зерновых злаков в Таджикистане // Материалы VI съезда Общества физиологов России. Межд. конф. Сыктывкар. 2006. С. 223-225.

7. Кавракова З.Б.,Хурматов Х.Х., Наймов С., Насырова Ф.Ю. Изучение биоразнообразия видов рода Aegilops L. с помощью молекулярных маркеров // Материалы конф., посвященной 100-летию со дня рождения проф. О.Ш. Шукурова. Душанбе. 2008. С. 47-48.

8.Кавракова З.Б., Хурматов Х.Х., Наймов С.Н., Насырова Ф.Ю, Молекулярное генотипирование видов Aegilops L., произрастающих в Таджикистане // Материалы научной конф., посвященной памяти академика Академии наук Республики Таджикистан Ю.С. Насырова. Душанбе. 2008. С. 44-45.

Подписано в печать 19.02.2009 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризография. Тираж 100 шт. Объем 1,5 п.л.

Отпечатано в ООО «Азия-Принт»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кавракова, Зубайда Бурихоновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Геномный анализ зерновых злаков с помощью молекулярных маркеров.

1. 2. RAPD — маркеры в анализе генома зерновых злаков.

1.3. Микросателлиты (SSR - маркеры) в генотипировании зерновых злаков

1.4. Использование молекулярных маркеров в изучении генома видов рода Aegilops L.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Краткая характеристика видов рода Aegilops L.

2.2. Описание видов рода Aegilops L., использованных в работе.

2.1.1. Эгилопс цилиндрический (Aegilops cylindrica Host.).

2.1.2. Эгилопс mayuiuu (Aegilops tauschii Coss.).

2.1.3. Эгилопс трёхдюймовый (Aegilops triuncialis L.).

2.1.4. Эгилопс толстый (Aegilops crassa Boiss).

2.3. Образцы видов Aegilops, собранные в природных условиях и использованные в работе.

2.4. Методы биохимического анализа.

2.4.1. Выделение ДНК из свежих листьев пшеницы микрометодом.

2.4.2. Проведение ПЦР анализа.

2.4.3. Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.4.4. Анализ продуктов ПЦР в ПААГ.

2.4.5. Использование ПЦР метода.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Анализ RAPD маркеров при генотипировании видов рода Aegilops L., произрастающих в Таджикистане.

3.2. Микросателлитный (SSR-маркеры) анализ генома видов Aegilops L.,произрастающих в Таджикистане.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L., произрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана"

Актуальность темы. В настоящее время в области сравнительной генетики зерновых злаков интенсивно проводятся эксперименты с использованием молекулярных маркеров. В результате таких исследований либо строятся практически лишенные функциональных генов карты, либо проводится «сравнительная привязка» того или иного гена разных видов к одним и тем же молекулярных маркерам (Гречко, 2002; Горюнова, 2004). Это связано с тем, что сравнительно-генетические исследования помогают эффективно сопоставить геномы разных видов растений, и открывают дополнительные резервы мобилизации генетических ресурсов видов, родов при создании нового исходного материала, который может быть использован как для повышения эффективности генетических исследований, так и для селекции (Вавилов, 1967; Конарев, 1980; Алтухов, 1989; Гончаров, 2002).

Важнейшей характеристикой популяций служит их внутрипопуляционная генетическая изменчивость, «полиморфизм» по дискретным качественным и непрерывным количественным признакам (Дрейпер, 1991; Зеленин, 2001; Жимулев, 2002).

Изучение практически всех видов рода Aegilops Ь. развивалось и развивается в связи с их высокой устойчивостью к ряду грибковых болезней и некоторым насекомым-вредителям, а также с возможностью проведения между ними и возделываемыми видами пшеницы интрогрессивной гибридизации для передачи им полезных признаков (Корень, 1998; Картель, 1999).

Географическое расположение Таджикистана с его своеобразными климатическими условиями, а также разнообразием диких представителей зерновых злаков представляет особый интерес для изучения полиморфизма ДНК генома видов Aegilops Ь. Поэтому нам представлялось вполне актуальным провести исследование природных форм и типов (биотипов) видов рода Aegilops Ь., произрастающих в различных природно3 климатических условиях Республики Таджикистан с применением молекулярных маркеров.

Цель и задачи работы. Целью нашей работы было изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops Ь. с использованием молекулярных маркеров, а также геномный анализ образцов видов рода Ле§Иоря Ь., произрастающих в различных регионах Таджикистана. Для решения достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• использование молекулярных маркеров на основе проведения полимеразной цепной реакции для анализа генетической вариабельности каждого вида;

• геномный анализ образцов видов, собранных в различных природно-климатических условиях Таджикистана;

• использование ЛАРЮ - маркеров для геномного анализа образцов видов рода Ае&1оря;

• использование микросателлитов или - маркеров для выявления филогенетических связей между видами и внутривидового полиморфизма представителей рода Ае§Иор8 флоры Таджикистана;

• определение генетического расстояния и построение дендрограммы на основе анализа различных молекулярных маркеров для выявления степени генетической близости или различия у образцов изученных видов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые с использованием двух типов молекулярных маркеров (ЯАРО и БЗЯ) проведен анализ широкого набора образцов - представителей четырёх видов рода

Aegilops, произрастающих на территории Таджикистана. На основе полученных данных определены уровни внутри- и межвидового геномного полиморфизма и показаны существенные различия внутривидовой геномной вариабельности у изученных видов. Обнаружен определенный параллелизм внутривидовой вариабельности морфо-биологических признаков с вариабельностью молекулярного анализа генома. У исследованных видов Aegilops выявлен внутри- и межвидовой полиморфизм по всем использованным молекулярным маркерам, что свидетельствует об информативности данных маркеров. Впервые был проанализирован полиморфизм ДНК у видов, произрастающих на разных высотах над уровнем моря и в разных природно-климатических условиях Таджикистана. В связи с этим особую практическую значимость имеют результаты, касающиеся образцов, обладающих высоким уровнем изменчивости генов, ответственных за соле - и засухоустойчивость, а также устойчивость к различным заболеваниям. Подобранные нами методы и праймеры позволяют эффективно выявлять меж- и внутривидовую изменчивость у изученных видов и могут быть использованы селекционерами в их работе по созданию устойчивых сортов зерновых злаков. Кроме того, полезные результаты были использовании при создании коллекции рода Aegilops, произрастающих в различных экологических условиях Таджикистана.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Кавракова, Зубайда Бурихоновна

Выводы

1. Впервые с использованием SSR -и RAPD- молекулярных маркеров проведен геномный анализ четырёх видов рода Aegilops L, произрастающих на территории Таджикистана. Определен уровень внутри- и межвидового полиморфизма видов Aegilops на уровне случайных ДНК-повторов (RAPD) и микросателлитных простых повторов генома (SSR).

2. Показано, что на молекулярном уровне виды, имеющие D-геном (Ае. tauschii, Ае. cylindrica и Ае. crass а), содержат одинаковые фрагменты ДНК, а вид Ае. triuncialis - отличные от них фрагменты.

3. По результатам RAPD -и SSR- маркирования наиболее полиморфным является вид Ае. tauschii (по SSR- маркерам 90% составляет полиморфнисть и около 10% мономорфность).

4. По коэффициенту генетического сходства между различными образцами вида Ае. triuncialis образуется два основных кластера: первый кластер объединяет в основном образцы, произрастающие в северных регионах Таджикистана, а второй кластер - образцы Aegilops, распространенный в южных регионах.

5. Образцы вида Ае. crassa имеют более близкий уровень генетического сходства с Ае. tauschii, чем с Ае. cylindrica, что, по-видимому, связано с тем, что вид Ае. cylindrica, кроме D-генома, имеет еще и С-геном.

6. Микросателлитный анализ показал, что количество ПЦР - фрагментов у использованных праймеров на один маркер варьировало от 1 до 20. В некоторых вариантах встречается только один ПЦР - фрагмент-мономорфный. ПЦР-анализ праймера WSP-190 у различных образцов видов Aegilops выявил наличие высокой степени полиморфизма ДНК внутри каждого изученного вида, а также между различными видами.

Заключение

Из приведенных выше данных видно, что в последние годы наблюдается стремительный рост знаний в области создания и применения молекулярных маркеров в генетике растений. Бурное развитие молекулярной биологии позволяет использовать более мощный разрешающий аппарат, выявляющий изменчивость на уровне нуклеотидной последовательности ДНК, предоставляет исследователям возможность решать вопросы, ответы на которые нельзя было получить другими методами. Применение молекулярных маркеров позволяет существенно продвинуться в понимании структурной организации и эволюции живых организмов. В этих работах используются следующие молекулярные маркеры — КАРО, БКР и 8811. Использование данных маркеров при генотипировании диких видов Aegilops и выявило определенную закономерность. Так, КАРБ-маркеры позволяют выявить межвидовые и межсортовые различия в полиморфизме ДНК. В то же время БЭК-маркеры были информативны для установления внутривидовых различий. Результаты могут быть использованы для паспортизации видов, сортов, линий, что необходимо учитывать при селекционных работах.

Как известно, различные виды рода Aegilops Ь., всегда привлекали большое внимание исследователей в качестве перспективных генетических источников. Как показали многочисленные исследования, некоторые виды рода Aegilops Ь., принимали непосредственное участие в эволюционном становлении тетраплоидных и гексаплоидных пшениц (Гарюнова, 2004).

Для исследования генома различных видов рода Aegilops Ь., использовали 17-ИАРБ и 14 88Я - праймеров, которые показали высокую информативность. Нами было использовано 106 образцов Aegilops, произрастающих в различных регионах Таджикистана для анализа полиморфизма ДНК с помощью молекулярных маркеров.

Высокий уровень полиморфизма генома, сочетающийся с высокой специфичностью для каждого образца ДНК, указывает на преимущества молекулярных маркеров перед другими, известными в литературе маркерами. Также привлекает простота, доступность и экономичность этого метода: полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет легко и быстро проводить микросателлитный анализ, без применения радиоактивности и для этого требуется небольшое количество ДНК.

В результате амплификации с использованием 17-RAPD и 14 SSR были получены в общей сложности около 1300 ПЦР фрагмента.

Данная работа состояла в оценке уровня внутривидовых различий для каждого из анализируемых видов Aegilops L., методом RAPD-маркирования.

Как известно, RAPD- праймеры более характерны для выявления внутривидового полиморфизма.

В работе приведены данные ПЦР-анализа по RAPD-праймерам, где были выявлены отличия в количестве фрагментов у различных видов рода Aegilops. В качестве примера можно привести результаты анализа продуктов ПЦР, полученные с праймером R-157. Длина фрагментов в пределах от 200 до 2000 п.н. при амплификации ДНК по 15 образцам каждого из видов Эгилопса. Как показывает фрагменты ДНК, имеющие 340, 450, 420, 550, 650, 700, 850 п.н. не полиморфные, а фрагменты длиной 380, 500, 750, 770 и выше 1000 п.н. являются полиморфными. Это доказывает что, данные RAPD-анализа показывают высокий уровень внутривидового полиморфизма. Интересные результаты были получены для вида Ае. crassa, который имеет незначительную фенотипическую изменчивость, и что подтвердил RAPD-анализ (48.1% фрагментов полиморфные). Уровень внутривидового различия по RAPD-анализу у различных видов Aegilops не одинаковый, что подтверждает их разнообразие в природе. В целом, на наш взгляд, данная работа намечает подходы к более детальному анализу генома диких сородичей злаковых на уровне картирования генов.

В дальнейшем можно, используя эти данные, проводить исследования по определению генетического расстояния между видами и построить дендрограмму.

Как следует из приведенных выше данных, Б^АРЭ - анализ образцов Aegilops вид Ае. IатсНИ имеет примерно 50%-ный внутривидовой полиморфизм, что указывает на древнее происхождение данного вида и его адаптивные возможности. Вид Ае. сгаБва по нашим данным имеет очень низкий уровень внутривидового полиморфизма, в то же время из литературных источников известно, что этот вид имеет высокий уровень хромосомного полиморфизма и разнообразие морфологических признаков. Таким образом, в результате ЛАРО-маркирования видов рода Aegilops в Таджикистане впервые удалось определить уровень генетического полиморфизма и коэффициент сходства их геномов по использованным молекулярным маркерам. Для построения дендрограммы для кластерного анализа (ЦРОМА) при использовании компьютерной программы ИТ8У8-рс, 2.0 (№1 М. 1987) (Р1к) использовалась построенная бинарная матрица. По результатам анализа были определены генетические расстояния и методом иерархического кластерного анализа построены дендрограммы. Максимальное внутривидовое сходство было отмечено для Ае. суНпйпса (коэффициент генетического сходства - 0,92).

На схеме 2 представлена дендрограмма на основании коэффициента генетического сходства между различными образцами вида Ае. ЫипсгаИй, где образуется два основных кластера: первый кластер объединяет в основном образцы, произрастающие в северных регионах Таджикистана, а второй кластер - в южных региона. Дендрограмма показывает, что данный вид имеет наибольший уровень генетического разнообразия среди всех изученных видов Aegilops. Внутри вида наибольшим генетическим разнообразием выделяются представители образцов, собранные из Файзабадского района. Между образцами из Рудакинского и Варзобского районов существенного различия не обнаружено.

На схеме 3 представлены данные по Ае. суНпс1пса, которые имеют высокий уровень внутривидовой изменчивости и выделяются 2 кластера, внутри которых образцы имеют большое генетическое сходство. Виды Ае. crassa и Ae. tauschii по изученным праймерам показали примерно 50%-ный полиморфизм.

На схеме 4 приведены данные дендрограммы, где не выявлено высокого уровня генетического разнообразия среди образцов Ae. crassa, здесь образовано два основных кластера. В первом кластере подпадают образцы, произрастающие в районе Рудаки, а второй кластер -подразделяется на два подкластера, в котором сгруппированы образцы из Гиссарского солевого источника.

Вид Ae. tauschii на схеме 5 имеет высокий уровень генетического сходства и образует два кластера — первый кластер состоит из 8 образцов, где не наблюдается генетического разнообразия, тогда как во втором кластере -большое генетическое разнообразие.

Нами были проанализированы филогенетические связи в группе видов Aegilops, имеющих D-геном, а также родственные отношения : видов, не имеющих D-геном.

На схеме б представлены данные диплоидного вида Ae. tauschii (D-геном), а также виды А е. crassa и Ae. cylindrica, являющие полиплоидными видами, но также имеющие D-геном. Поэтому молекулярный анализ для установления филогенетических связей видов Aegilops с D-геномом является актуальным. По литературным данным, диплоидный вид Aegilops tauschii при использовании RAPD-анализа является самым полиморфным.

Что касается полиплоидных видов Ae. crassa и Ae. cylindrica с D-геномом, то они имеют более низкий уровень внутривидового разнообразия. Наши данные показывают, что образцы вида Ae. crassa имеют более близкий уровень генетического сходства с Ae. tauschii, чем с Ae. cylindrica, что, по-видимому, связано с тем, что вид Ae. cylindrica, кроме D-генома, имеет еще и С-геном. Полиплоидный вид Ae. triuncialis не имеет D-генома, но имеет С-геном и U -геном благодаря которому этот вид образует единый кластер с Ае. cylindrica. Таким образом, виды Ae. cylindrica u Ae. triuncialis имеет общий геном С, что подтверждается наличием общего кластера по RAPD-анализа.

В отличие от видов, имеющих Э-геном, представители вида с Ц-геномом (Ае. МипЫаНБ) характеризуются значительным уровнем внутривидового разнообразия. Вид Ае. МипЫаШ среди изученных нами видов является одним из распространенных и имеет высокий уровень генетического разнообразия. Данные на схеме 2 показывают, что у вида Ае. МипсгаШ выделяется несколько кластеров по образцам, произрастающим в различных регионах Таджикистана. Исходя из полученных результатов, можно предположить множественное независимое происхождение полиплоидных видов Ае2йорз от различных диплоидных видов.

Как известно, различные виды рода Aegilops Ь. всегда привлекали большое внимание исследователей в качестве перспективных разнообразных генетических источников. Как показали многочисленные исследования, некоторые виды рода Aegilops Ь. принимали непосредственное участие в эволюционном становлении тетраплоидных и гексаплоидных. пшеницы (Горюнова, 2004).

Микросателлитный анализ показал, что количество ПЦР фрагментов у использованных преймеров на один маркер варьировало от 1 до 20. В некоторых вариантах встречается только один ПЦР фрагмент— мономорфный. Иногда у одного образца выявлялись более чем один фрагмент, что можно объяснить наличием внутривидовой гетерогенности. Данные БЭЯ—анализа показали, что каждый вид обладал характерными, не повторяющимися ПЦР-фрагментами. Данные ПЦР-анализа праймера 190 у различных образцов разных видов Aegilops показал наличие высокого полиморфизма ДНК внутри каждого изученного вида, а также между различными видами. Как показывают результаты получение по различные образцы Ае. МипыаНз, произрастающие в различных регионах Таджикистана дают три ПЦР-фрагмента и почти половина из них — полиморфные. Данные по ПЦР-фрагментам 30 образцов Ае. гатски, также с использованием 190 88Я-праймера где имеется, 6 ПЦР-фрагментов показывают, что 90% изученных образцов полиморфные. Данные, приведенные в табл. 3, показывают, в основном, полиморфизм у видов Ае. cylindrica, Ае. tauschii и Ае. crassa по 14 SSR-праймерам, что составляет 80-95%, за исключением вида Ае. triuncialis, где полиморфизм составляет всего 47%. Интересно, что результаты, полученные по Ае. triuncialis, сильно отличаются от данных, полученных по другим видам Aegilops. Возможно, этот вид менее изменчив независимо от места обитания и литературные данные также подтверждают, что вид Ае. triuncialis более мономорфный по различным фенотипическим признакам. Результат межвидового анализа ПЦР-фрагментов показал, что между изученными нами видами наблюдается четкое различие при использовании различных праймеров. Данные микросателлитного анализа содержат информацию, необходимую для оценки генетического разнообразия, а именно таких характеристик как число аллелей на локус и коэффициент сходства.

Таким образом, использованный набор из 14 микросателлитных маркеров для анализа генома различных видов Aegilops позволяет охарактеризовать каждый изученный вид. На основании наших данных можно сказать, что использованные нами SSR-праймеры очень информативные и их можно использовать при изучении межвидовых и внутривидовых различий у злаковых культур и их сородичей. В литературе описано, что D-геномные группы растений характеризуется меньшим внутривидовым полиморфизмом, чем большинство полиплоидных видов с U-геномом. Интересные результаты получила С. Горюнова, у которой RAPD-анализ не показал различия между плоидностью двух видов Aegilops, хотя эти виды очень сходны морфологически и некоторые авторы их не рассматривают как два самостоятельных вида (Горюнова, 2004). По данным RAPD-анализа единственным исключением среди высоко полиморфных полиплдоидных видов с U геномом является Ае. triuncialis, который имеет крайне низкий уровень внутривидового различия, а также является малополиморфным по данным дифференциального окрашивания и FISH, что подтверждает наши результаты по SSR-маркированию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кавракова, Зубайда Бурихоновна, Душанбе

1. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. Москва. Наука. 1989.

2. Вавилов Н. И. Мировые растительные ресурсы и их использование в селекции // Изб. тр. Москва. Ленинград. Т. 3. 1962.

3. Васильева JI.A. Биологическая статистика (Избр. гл.). Новосибирск. 2000.С. 40-43.

4. Горюнова C.B., Кочиева Е.З., Чикида H.H., Пухальский В.А. RAPD-анализ внутривидовой изменчивости и филогенетических связей видов Aegilops L. с D- геномом, содержащих D-геном // Генетика 2004. Т. 40, №5. С. 642-651.

5. Гвоздев В.А. Изменчивость гетероароматических районов генома эукариот в связи с их биологической ролью // Мол. биология. 1993. Т. 27(6). С. 1205-1217.

6. Гончаров Н.П. Сравнительная генетика пшеницы и их сородичей. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во. 2002.

7. Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики //Генетика. 2002. Т. 38(8). С. 1013-1025.

8. Гиляров А. М. Мнимые и действительные проблемы биоразнообразия // Успехи современной биологии. 1996. Т.116, №.4. С. 493-506.

9. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. 1999. Т.35, №11. С.1538.

10. Гулов М.К., Хурматов Х.Х., Наймов С., Насырова Ф.Ю. Использование SSR-маркеров для выявления полиморфизма генома Aegilops tauschii // Мат. респ. конф. Адаптационные аспекты функционирования живых систем. Душанбе. 2007. С. 44-46.

11. Дорофеев В.Ф., Мигушова Э.Ф. Ботаническое разнообразие Aegilops L. Закавказья // Тр. по прикл. бот. ген. и селек. 1966 Т. 38, №2. С. 152-158.

12. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. // Генная инженерия растений. Москва. Мир. 1991. С. 245-248.

13. Долгушин Д.А. Мировая коллекция пшеницы на фоне яровизации. Москва. 1935.

14. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сиб. ун-та изд-во. 2002. С. 73.

15. Зеленин A.B., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений // Молекулярная биология. 2001. Т.35, №3. С. 339-348

16. Конарев В.Г. Белки пшеницы. М.: Колос. 1980. С. 350.

17. Каминская JI.H., Корень JI.B., Леонова И.Н., Адонина И.Г., Хотылева JI.B., Салина Е.А. Создание линий тритикале, маркированных Vrn-генами и их молекулярно-генетический анализ // Вестник ВОГ и С. 2005. Т 9, №4. С. 481-489.

18. Корень Л.В., Каминская Л.Н., Хатылева Л.В. Цитологическое исследование пшенично-ржаных амфиплоидов с включением Vrn-генов. // Докл. АН Беларуси. 1998. Т.42, №2. С. 79-84.

19. Кудрявцев A.M., Мартынов С.П., Броджио М., Пухальский В.А. Оценка правомерности использования RAPD- анализа для выявления филогенетических связей между сортами яровой твердой пшеницы (Т. Durum Desf.) //Генетика. 2003. Т.39, №9. С. 1237-1246.

20. Картель H.A., Макеева E.H., Мезенко A.M. Генетика. Энциклопедический словарь. Минск: Технология. 1999. С. 90.

21. Костюченко М.В., Удина И.Г., Зайцев A.M., Храброва Л.А., Сулимова Г.Е. Изучение генетического разнообразия пород лошадей отечественнойселекции на основе RAPD-PCR и микросателлитных маркеров // Сельскохозяйственная биология. 2001. № 6. С.29-34.

22. Мазин A.B., КузнеделовК.Д., Краев A.C. Методы молекулярной генетики и генной инженерии // Новосибирск: Наука, 1990. С. 248.

23. Малышев C.B., Картель H.A. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений // Молекулярная биология. 1997. Т. 31(2). С. 197208.

24. Майстренко О.И. Ефремова Т. Т., Салина Е. А., Шумный В.К. Открытие и изучение не проявления гена ярового образа жизни ржи Spl в линиях с чужеродным замещением хромосомы 5R (5А) // Докл. РАН. 1998. Т. 360, №4. С. 574-576.

25. Мигушева Э.Ф. К вопросу о происхождении геномов пшеницы // Тр. по прикл. бот. ген. и сел. 1975. Т.55, № 3. С. 3-26.

26. Мартынов С.П., Добротворская Т.В. Анализ генетического разнообразия пшеницы с помощью Информационно-аналитической системы генетических GRIS //Генетика. 2000. Т. 36, №2. С. 195-202.

27. Флора Таджикской ССР. Названия видов Aegilops L. и их характеристика //Москва-Ленинград. 1957. Т 1.

28. Наймов С., Касымова. Г.Ф., Нигмонов М. Морфобиологическое и биохимическое разнообразие видов Эгилопс, произрастающих в разных экологических условиях Таджикистана // Тезисы докладов. Душанбе. 2002. С. 126-127.

29. Наймов С., Каримов С., Нигмонов М., Луис Е.У. Оссес. Испытание сортообразцов пшеницы в высокогорной зоне Таджикистана // Вестник региональной сети по внедрению сортов пшеницы и семеноводству, Алматы. 2002. № 2 (03). С. 42-46.

30. Наймов С., Касымова Г. Ф., Нигмонов М., Каримов Х.Х. Сбор и характеристика видов Aegilops L. Флоры Таджикистана // The 3 rdinternational IRAN and Russia conference // Agriculture and Natural Resources. Moscow. 2002. P. 27-28.

31. Наймов С., Каримов X.X. Солеустойчивость зерновых злаков трибы Triticeae Dumort флоры Таджикистана // Мат. Республ. конф. по зерновым и зернобобовым культурам. Душанбе. 2004. С. 23-24.

32. Иванец Т.А. Использование ПЦР метода // Мат. Региональной научно-практической конференцию МЦ «Асклепий». Владивосток. 2000.

33. Овчинников П.Н. О некоторых направлениях в классификации растительности Средней Азии // Изв. Отд. естеств. Наук АН ТаджССР, 1957.

34. Салина Е.А., Песцова Е.Г., Вершинин A.B. "Spelt-1" новое семейство тандемных повторов злаков // Генетика. 1997. Т. 33 (4). С. 437-442.

35. Салина Е. А., Леонова И.Н., Родер М. Микросателлиты пшеницы перспективы использования для картирования генов и анализа реконструированных геномов // Физиология растений. 2001. Т.48. С. 441446.

36. Стельмах А. Ф. Наследование и генетическая роль различий по типу и скорости развития у мягкой пшеницы. Автореферат дисс. д-ра биол. наук Москва, 1987.

37. Сергеев Д.А., Хурматов Х.Х., Наймов С.Н., Насырова Ф.Ю. Применение микросателлитного анализа в изучении полиморфизма ДНК культурныхзлаков // Мат. респ. конф. Адаптационные аспекты функционирования живых систем. Душанбе. 2007. С. 120-122.

38. Сергеев Д.А., Гулов М.К., Хурматов Х.Х., Насырова Ф.Ю. Применение ДНК маркеров в изучении генома злаковых культур, произрастающих в Таджикистане // Мат. конф. молодых ученых АН РТ Душанбе. 2007. С. 121.

39. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его знание в генетике и селекции // Москва. Наука, 1985. С. 272

40. Тютерев С. JL, Чимелева З.В., Мойса И.И., Дорофеев В.Ф. Изучение содержания белка и незаменимых аминокислот в зерне видов пшеницы и ее диких сородичей // Тр. по прикл. бот. ген. и сел. 1973. Т.52, №1. С. 222241.

41. Хлесткина Е., Салина Е.А., Леонова И. Использование RAPD и STS анализа для маркирования генов 5 гомеологической группы хромосом мягкой пшеницы // Генетика. 1999. Т.35, №8. С. 1-9.

42. Хлёсткина Е., Салина Е., Леонова И., Лайкова Л.И., Коваль С.Ф. Использование RAPD и STS анализ для маркирования генов 5 гомеологической группы хромосом мягкой пшеницы // Генетика. 1999. Т. 35. С.1349-1357.

43. Флейвелл Р. Амплификация, делеция и перегруппировка последовательностей: основные источники изменчивости в процессе дивергенции видов // Эволюция генома. Москва. Мир, 1986. С. 291-311.

44. Хурматов Х.Х., Сергеев Д.А., Салина Е.А., Хлесткина Е.К., Насырова Ф.Ю., Алиев К.А. RAPD и SNP-анализ генома пшеницы и диких сородичей зерновых злаков Таджикистана // Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. наук. 2006. № 1 (154) С. 18-24.

45. X. X. Хурматов, Д. А. Сергеев, Е.К. Хлёсткина, Е. А. Салина, Ф. Ю. Насырова, К. А. Алиев "Анализ генома пшеницы и диких сородичей зерновых злаков Таджикистана с помощью молекулярных маркеров // Депонировании рукопись №242. Душанбе. 2006.

46. Цвел ев Н.Н. Злаки СССР. Л.: Наука, 1976.

47. Цвелев Н.Н. Система злаков (Роасеае) и их эволюция // Комаровские чтения. Л.: Наука, 1987. С. 75.

48. Akkaya M.S., Bhagwat А.А., Cregan P.B. Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soybean // Genetics 1992. P. 1131-1139

49. Anamthawat-Jonsson K., Heslop-Harrison J.S. Isolation and characterization of genome-specific DNA sequences in Triticeae species // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 240. P. 151-158.

50. Belaj A., Satovic Z., Rallo L., Trujillo I. Genetic diversity and relationships in olive {Olea euoropaea L.) germaplasm collections as determined by randomly amplified polymorphic DNA // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 105. P. 638-644.

51. Botstein D., White R.L., Scolnick M., Davis R.V. Constructions of genetic linkage map in man using restriction fragment lengh polymorphisms // Am. J. Hum. Genet. 1980. V. 32. P. 314-331.

52. Borner A., Korzun V., Worland A J. Comparative genetic mapping of mutant loci affecting plant height and development in cereals // Euphytica. 1998. V. 100. P. 245-248.

53. Baker C.M., Manwell C. Anim. Blood Groups and Biochem // Genet. 1980. V.ll.P. 127.

54. Castilho A., Heslop-Harrison J.S. Physical mapping of 5S and 18S-25S rDNA and repetitive DNA sequences in Aegilops umbellulata И Genome. 1995. V. 38. P. 91-96.

55. Csink A.K., Henihoff S. Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats // Trends Genet. V. 14. P. 199-203.

56. Daud H.M., Gustafson J.P., Molecular evidence for Triticum speltoides as B-genome progenitor of wheat (Triticum aestivum) // Genome. 1996. V. 39. P. 543-548.

57. Devos K.M., Chao S., Li Q.Y., Simonetti M.C., Gael M.D. Relationship between chromosome 9 of maize and wheat homoeologous group 7 chromosomes//Genetics. 1994. V. 138. P. 1287-1292.

58. Devos K.M., Gale M.D. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 84. P. 567-572.

59. Devos K.M., Gale M.D. The genetic maps of wheat and their potential in plant breading // Outlook Agric. 19936. V. 22. P. 93-99.

60. Dover G., Brown S., Coen E. et al. Dinamic of genome evolution and species differentiation // In: Dover G.A., Flavell R.B // Genome Evolution. Academic Press. London. 1982.

61. Dweikat I., Mackenzie S., Levy M., Ohm H. Pedigree assessment using RAPD-DDGE in cereal crop species // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 497-505.

62. Felsenstein J. PHYLIP: Phylogeny Inference Package, version 3.572 // Dept. Genetics, Univ. Washington, Seattle. 1995.

63. Friebe B., Gill B.S. Chromosome banding and genome analysis in diploid and cultivated polyploidy wheat. In: Methods of genome analysis in plants (ed. Jauhar P.P.) // Boka Raton et al.: CRC Press. 1996. P. 36-60.

64. Fritsch P., Hanson M.A., Spore C.D., Pack P.E., Riseberg L.H. Constancy of RAPD primer amlification strength among distantly related taxons of flowering plants // Plant Mol. Biol. Rep. 1993. V. 11. P. 10-20.

65. Guadagnuolo R., Bianchi D.S., Felber F. Specific genetic markers for wheat, spelt, and four wild relatives: comparison of isozymes, RAPDs, and wheat microsatellites // Genome. 2002. v. 44. P. 610.

66. Gupta P.K., Roy J.K., Prasad M. Single nucleotide polymorphism: a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism with emphasis on their use in plants // Current Sci. 2001. V. 80. P. 524-535.

67. Gupta P.K., Varshney R.K., Sharma P.S., Ramesh B. Molecular markers and their applications in wheat breading // Plant Breed. 1999. V. 118. P. 369-390.

68. Huff D.R., Peakall R., Smouse P.E. RAPD variation within and among natural populations of outcrossing buffalo grass (Buchloe dactyloides (Nutt.) Englem) II Theor. Appl. Genet. Y. 86. P. 927-934

69. Iqbal M.J., Rayburn A.L. Stability of RAPD markers for determining cultivars specific DNA profiles in rye (Secale sereale) // Euphytica. 1994. V. 75. P. 215220

70. Jaaska V. Aspartate aminotransferase and alcohol dehydrogenase isozymes: intraspecific differentiations in Aegilops tauschii and the origin of the D genome polyploids in the wheat group // PI. Syst. Evol. 1981. V. 137. P. 259273.

71. Jones J., Flavell R. The structure, amount and chromosomal location of defined repeated DNA sequences in species of the genus Secale.) II Chromosoma. 1982. V. 86. P. 613-641.

72. Joshi C.P., Nguyen H.T. RAPD (random amplified polymorphic DNA) analysis based on intervarietal genetic relationships among hexaploid wheats // Plant Sci. Y. 93. P. 95-103.

73. Kato K., Miura H., Sawada S. Comparative mapping of the wheat Vrn-Al region with the rice Hd-6 region II Genome. 1999. V. 42. P. 204-209.

74. Kellog E., Apples R. Intraspecific and interspecific variation in 5S RNA genes are decoupled in diploid wheat relatives II Genetics. 1995. V. 140. P. 325-343.

75. Khan S.A., Hussain D., Askari E., Stewat J McD., Malik K.A., Zafar Y. Molecular phylogeny of Gossypium species by DNA fingerprinting // Theor. Appl. Genet. 2000. V. 101. P. 931-938.

76. Khlestkina E.K., Salina E.A. Genome-specific markers of tetraploid wheats and their putative diploid progenitor species // Plant Breading. 2001. V. 120. P. 227-232.

77. Kunugi H., Ishida S. et al. A functional polymorphism in the promoter region of monoamine oxidase-A gene and mood disorders // Mol. Psychiatry. V. 4(4). 1994 P. 393-405.

78. Khurmatov Kh. Kh., Sergeev D. A., Kavrakova Z. B, Salina E.A., Khlestkina E.K, Nasyrova F. Y. Genom analysis of local species and wild forms of cereal crops in Tajikistan // Материалы 6 съезда физиологов растений. Сыктывкар, РФ 2007. С. 223-225.

79. Lapitan N.L.V. Organization and evolution of higher plant nuclear genomes // Genome. 1992. V. 35. P. 171-181.

80. Leitch I., Heslop-Harrison J. Physical mapping of the 18S, 5.8S, 26S rRNA genes in barley by in situ hybridization // Genome. 1992. V.35. P. 1013-1018.

81. Ma Z.Q., Lapitan N.L.V. A comparison of amplified and restriction fragment length polymorphism in wheat // Cereal Res. Com. 1998. V. 26. P. 7-13.

82. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual // New York: Cold Spring Harbor Lab., 1982. P. 362.

83. Mclntyre C. Variations at isozyme loci in Triticeae // PI. Syst. Evol. 1988 V. 160. P. 123-142.

84. Miller Т.Е. Systematics and evolution In: Wheat breeding (ed. Lupton) // London, New York. 1987. P. 1-30.

85. Morgante M., Olivieri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plants genetics // The Plant Journal. 1993. V. 3(1). P. 175-182.

86. Naqvi N1, Chattoo BB. Molecular genetic analysis and marker- assisted indirect selection of blast resistance in rice // In: Rice Genetics. 1997.

87. Nei M. Molecular evolutionary genetics // New York. Columbia Univ. Press, 1987. P. 512.

88. Naimov S., Kasimova G. F., Donsova S. V., Nigmonov M The characteris of gliadins of Aegilops L, species, growing in different climatic condtions of Tajikistan // Материалы 6 съезда физиологов растений, Сыктывкар, РФ 2007. С. 202-203

89. Ohnishi О., Matsuoka Y. Search for the wild ancestor of buckwheat. II. Taxonomy of the Fagopyrum (Polygonaceae) species based on morfology, isozyme and chloroplast DNA variability // Genes Genet. Syst. 1996. V. 71. P. 383-390.

90. Pederson C., Rasmussen S., Linde-Laursen I. Genome and chromosome identification in cultivated barley and related species of Triticeae (Poaceae) by in situ hybridization with GAA-satellite sequences // Genome. 1996. V.39. P. 93-104.

91. Plaschke J., Ganal M.W., Roder M.S. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers // Theor. Appl. Genet., 1995. V.91.P. 1001-1007

92. Penner G.A. RAPD analysis of plant genome. In: Methods of genome analysis in plants (ed. Jauhar P.P.) // Boka Raton et al.\ CRC Press. 1996. P. 251-270.

93. Pestsova E.G., Goncharov N.P., Salina E.A. Elimination of a tandem repeat of telomeric heterochromatin during evolution of wheat // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 1380-1386.

94. Peterson G., Seberg O. Phylogenetic analysis of the Triticiaea (Poaceae) based on proA sequence data // Mol. Phylogenet. Evol. 1997. V. 7. P. 217-230.

95. Panaud O., Chen X., McCouchR. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequensce length polimorphism (SSLP) in rice (Oryza Sativa L.) // Mol. Gen. Genet. 1996 V. 252. P. 597-607.

96. Peil A., ICorzun V., SchubernV., Schumann E., Weber W.E., Roder M.S. The aplicatio of wheat microsatellites to identifi disomic Triticum Aestivum -Aegilops markgrafii addition lines // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 96, P. 138146.

97. Roder M.S., Korzun V., Wendeheke K., Plaschke J., Tixier M.H., Leroy P., Ganal M.W.A Microsatellite Map of Wheat // Genetics 1998. V. 149. P. 20072023.

98. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arncheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Sciense. 1985. V. 230. P. 1350-1354.

99. Salina E.A., Pestsova E.G., Adonina I.G., Vershinin A.V. Identification of a new family of tandem repeats in Triticeae genomes // Euphytica. 1998. V. 100. P. 231-237.

100. SasanumaT., Miyashita N.T., Tsunewaki K. Wheat phylogeny determined by RFLP analysis of nuclear DNA. 3. Intra- and interspecific variation of the five Aegilops Sitopsis species // Theor. Appl. Genet. 1996. V. 92. P. 928-934.

101. Sharma S.K., Dawson I.K., Waugh R. Relationships among cultivated and wild lentils revealed by RAPD analysis // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 91. P. 647654.

102. Sharma T.R., Jana S. Species relationships in Fagopyrum revealed by PCR-based DNA fingerprinting // Theor. Appl. Genet. 2002. V.105. P. 306-312.

103. Stiles J.I., Lemme C., Sondur S., Morshidi M.B., Maitshardt R. Using random amplified polymorphic DNA for evaluating genetic relationship among papaya cultivars // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 697-701.

104. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Higuchi R. Primer-directed enzymatic amplification of DNA. with thermostable DNA polymerase // Science, 1988. P. 239.

105. Subramanian V., Gurtu S., Rao R. C. N., Nigan S.N. Identification of DNA polymorphism in cultivated groundnut using random amplified DNA (RAPD) assay // Genome.2000. V. 43. P. 6565-660.

106. Tautz D., Nuel. Minimal homology requirements for PCR primers // Nucleic Actds. Res 1989 V. 17. P. 6463 6471.

107. Tsuji K., Ohnishi O. Origin of cultivated tatary buckwheat (Fagapyrum tataricum Gaertn.) revealed by RAPD analysis // Genet. Resour. Crop Evol. 2000. V. 47. P. 431-438.

108. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl. Acids Res. 1990. №24. V. 18. P. 7213-7218.

109. Wang G.- Z., Matsuoka Y., Tsunewaki K. Evolutionary features of chondriome divergence in Triticum (wheat) and Aegilops shown by RFLP analysis mitochondrial DNAs // Theor. Appl. Genet. 2000. V.100, P. 221-231.

110. Wang Z. Y., Tanksley S. D. Restriction length polymorphism in Oryza sativa L. // Genome. 1989. V. 32. P. 1113-1118.

111. Wei J.-Z., Wang R. R.-C. Genome- and species-specific markers and genome relationships of diploid perennial species in Triticeae based on RAPD analyses // Genome. 1995. V. 38. P. 1230-1236.

112. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers //Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 7213-7218.

113. West J., Mclntyre C., Appels R. Evolution and systematic relationships in the Triticeae (Poaceae) //PI. Syst. Evol.1988. V. 160, P. 1-28.

114. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

115. Yang Yen, Baenziger P.S., Morris R. Genomic constitution of bread wheat: current status // In: Metods of genome analysis in plants (ed. Jauhar P.P.) // Boka Raton et al\ CRC Press. 1996. P. 359- 373.

116. Zohary D., Feldman M. Hybridization between amphyploids and the evolution of polyploids in the wheat ('Aegilops-Triticum) group // Evolution. 1962. V. 16. P. 44-61.

Информация о работе

Кавракова, Зубайда Бурихоновна
кандидата биологических наук
Душанбе, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L., произрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение полиморфизма ДНК у видов рода Aegilops L., произрастающих в различных природно-климатических условиях Таджикистана - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы