Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИДЕНТИФИКАЦИЯ, КЛОНИРОВАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОМА ГОРОХА

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ИДЕНТИФИКАЦИЯ, КЛОНИРОВАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОМА ГОРОХА"



На правах рукописи

КОВЕЗА ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха '

Специальность 03.00.15 — генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в лаборатория генетики растений кафедры генетики Биологического факультета МГУ им, М.В Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Гостимский Сергей Александрович

Суяямова Галина Ефимовна Малеева Юлия Владимировна

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тииирязева

Защита диссертации состоится « » 2003г. в часов на заседания

Диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей геветикн им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, г.Москва, улГубкина, д.3. Факс: (095)132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан * » _2003г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.НЛолухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетня молекулярные маркеры пашлл опель широкое применение в различных областях генетических исследований [Caetano-Anoltes, 1993; Mohan et al„ 1997].

Использование молекулярных маркеров позволило решить проблему недостатка морфологических маркеров л составить подробные тспетнческие карты различных видов растений (Canal et al., 1992; Vu et al„ 1995; Laukou et al., 1998; Saliba-Colorabarn et al., 2C00; Iraykowska et al., 2001 и др.].

Молекулярные маркеры также используют для точной и быстрой паспортизации различных видов и сортов растений [Multani and Lion, 1995; Журавлев и лр., 1996; Sanchez-Escribano et al,, 1999], для изучения филогенетического родства [Gonzales and Ferrer, 1993; Lan2a et al., 1997; Chowdari et al., 1998), исследования сомаклокальной изменчивости [Кокаева и др., 1997; Осипом и др., 2001], идентификации соматических гибридов [Гавриленко и др., 1994; Дорохов, Клоке, 1997].

Молекулярные маркеры нашли применение в таких направлениях, как идентификация и маркирование селекционно ценных признаков [Messeguer et al, 1991, Barzen et al., 1997]. Они значительно облегчают процесс клонирования генов [Tanksley et al., 1995; Mohan et al,, 1997], a также важны при изучении полигенных локусов количественных признаков (QTL) [Tanksley, 1993; Van der Кпаар et aJ„ 2002].

Наиболее быстро и легко молекулярные маркеры выявляют с помощью нолнмеразной пенной реакции (ПЦР). В частности, RAPD-метод (random amplified polymorphic DNA) - метод ПЦР с использованием короткого случайного праймера [Williams et al,, 1990], является одним из наиболее эффективных методов создания молекулярных маркеров. Он позволяет быстро выявлять большое количество маркеров, распределенных по всему геному, является достаточно простым и дешевым. Однако RAPD-анализ выявляет анонимные участки генома, природа которых до конца не известна.

Дтя того, чтобы выйти на конкретные геномные последовательности, на основе RAPD-фрагментов были разработаны SCAR-маркеры (sequence characterized amplified region) [Kesseli et al., 1993], Превращение RAPD-маркеров в SCAR сопровождается клонированием и секвенлрованием RAPD-продукгов. На основании данных сиквенса С1Ш1«нруются даа более длинных (обычно 20-25-нуклеотидных) SCAR-праймера, соответствующие концам RAPD-фрагмента в, как правило, включающие в себя исходные RAPD-праймеры, SCAR-праймеры с высокой специфичностью и воспроизводимостью

к г

обычно амилифицируют одну полосу, а не целый спектр фрагментов. как в случае RAPD-метала и позволяют идеггтифнцировзть определенные участки ДНК.

В связи с этим представляло интерес получить RAPD-маркеры, характеризующие определенные линии и сорта гороха, либо сцепленные с различными мутациями генома гороха и использовать их для создания SCAR-маркеров. Подобный методический подход даст возможность не только генотшшровать различные линии и сорта гороха, но н выйти на определенные последовательности генома, соседствующие с наиболее интересными и физиологически значимыми генами, что является важным шагом на пути клонирования этих генов и понимая!и структуры генома гороха,

Цель и задачи исследования. Целью данной работа являлся поиск новых молекулярных маркеров (RAPD u SCAR) и их использование для изучепия генома гороха. Для решения этой проблемы быяи поставлены следующие задачи;

1. Выявить полиморфные RAPD и SCAR-маркеры в ДНК различных лилий, сортов и мутантов гороха из генетической коллекции кафедры генетики МГУ и изучить их наследование.

2. Осуществить картирование молекулярных маркеров.

3. Клонировать и секвенировать полиморфные RAPD-фрагменты и провести анализ их нукяеотидной последовательности.

4. Из полиморфных RAPD-маркеров получить SCAR-маркеры. Изучить их природу, а также использовать полученные SCAR-маркеры для генотипирования различных Л1шиП, сортов и мутантов гороха.

Научная новизна.

1, Обнаружены новые полиморфные RAPD-фрагменты, характерные для определенных линий, сортов и мутантов горюха, которые могут Быть использованы для их идентификации.

2, Найдено 10 RAPD-маркеров, щеплглных с генам» гороха А, Л, Л, Chi-15 н Ха-18. Рассчитаны генетические расстояния между RAPD-маркерами и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение RAPD-маркеров на хромосомах.

3, Получены данные о нуклеотидных последовательностях для 14 полиморфных RAPD-фрагментов,

4, Создано 14 новых STS-маркеров генома гороха. 12 из которых являются также SCAR-маркерами.

5, Установлен полиморфизм полученных SCAR-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха. Впервые SCAR-маркеры были использованы для идентификации различных линий, сортов и мутантов гороха.

Практическая и теоретическая чивчпмосп» Полученные в настоящем исследовании результаты вносят определенный вклад в изучение генома гороха.

Полиморфные RAPD-фрагменты, обнаруженные при исследовании 20 сортоа, 4 линий в 10 мутантов гороха, могут быть использованы для их идентификации, а также для определения родственных отношений между различными сортами и линиями.

10 новых RAPD-марксров, сцепленных с различными генами гороха, могут найти применение в работе по детальному картированию хромосом гороха, а также для клонирования этих генов.

Данные о куклеотидн ой последовательности участков генома гороха могут быть использованы как для дальнейшего изучения организации генома гороха, так и для получения новых молекулярных маркеров.

С помощью созданных SCAR-маркеров можно идентифицировать большинство исследованных линий, сортов и мутантов гороха. Информацию о полиморфизме SCAR-маркеров в различных геномах можно также использовать для планирования скрещиваний в работе но картированию.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2ч>и Съезде Всероссийского общества генетиков it селекционеров (Санкт-Петербург, 2000), на 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва. 2000), на 7-ой Международной конференции студентов и аспирантов но фундаментальным наукам «Ломоносов-2000» (Москва, 2000), на 2-ой Международной Ираио-Российской конференции «Agriculture and Natural Resources» {Москва, 2001), на 1-ой конференции памяти Грегора Менделя (Москва, 2001), на конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.РЛСебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени К.Л.Тимиря1ева (Москва, 2002), на 3-ей Международной Ирано-РоссиЙскоЯ конференции «Agriculture and Natural Resources» (Москва, 2002), на 4-ой Международной конференции «Геном растений» (Одесса, 2003),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на _ страницах,

состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и

обсуждения», заключения, выводов и списка литературы, включающего _

источников. Работа содержит_рисунков н_таблиц.

Работа выполнена ирн финансовой поддержке РФФИ (проекты 9S-04-342, 01-04-4S0S0).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

В работе были использованы сорта, линии и мутанты гороха (Pisum sativum L.) из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова. Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли нз листьев растений по методу Mol 1er et al., 1992 с незначительными модификациями.

Амплификация ДНК гороха. Амплификацию ДНК с RAPD-праймерами проводили в реакционной смеси объемом ЗОмкл, содержащей 5мкл ДНК, 2.5ед. Taq-полимеразы (НП АО ЗТ "Силекс M"), dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 0.2мМ каждого и О.бмкМ RAPD-праймера. В реакции использовали 24,5мкл 1х ПЦР-буфера (НПФ "ДНК-Технология"), содержащею 3.1мМ MgCh, Для обеспечения «горячего старта» использовали 25мкл жидкого парафина. Амплнфикацио!шyio смесь покрывали 25мкл минерального масла (Sigma).

Амплификацию проводили в приборе МС2 (НПО "ДИК-Технолопи"> s режиме Precise по следующей программе: первая ступень - 94°С, 1мин,30сек.

вторая ступень - 94"С, 20сек.; V*, 5сек; 71°С, Юсек. - 5 циклов третья ступень - 94°С, 1сек,; W, 5сек.; 71°С, 10сек. — 35 циклов U« - 34,36,37,38,40 и 42°С

ПраКмеры, использованные для проведения RAPD-метода, приведены в таблице 1.

Каждому взятому в работу RAPJï-маркеру было дано название, состоящее из двух частей. Первая часть соответствует праймеру, прп амплификации с которым был обнаружен данный фрагмогг, вторая часть названия - приблизительный размер в пн.

Амплификацию ДНК со SCAR-праймерами проводили в реакционной смеси, содержащей те же компоненты, что и t:pn RAPD-анализе, однако вместо одного короткого RAPD-npafiмера в каждой ПЦР-реаюши использовали два SCAR-праймера размером от 1В до 23 нуадеотидов в концентрации О.ЗмкМ каждый.

Амплификацию проводили в приборе МС2 (НПФ "ДНК-Технология") в режиме Precise но следующей программе: первая ступень - 94°С, 2мин.

вторая ступень -94°С, 10сск.; w, 5сек; 72°С, 1мдн.-5 циклов третья ступень - 93°С, Icck.; V«, 1сек,; 72°С, 1мин. -п циклов

Были использованы программы с разной W (от 47 до 72°С) и с разным количеством циклов третей ступени п (от 20 до 40).

Каждому фрагменту, полученному В результате амилификашш со SCAR-праймерами, было дано название, состоящее in двух частей. Перзая часть названия такал

же, как у исходного RAPD-праймера; вторая часть названия - приблизительный размер в пи.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2.5% агарозном геле, окрашенной бромистым этвднем. Электрофорез проводили в режиме 5В/см в Ix TBE буфере. После электрофореза гели анализировали в УФ свете и фотографировали на шейку Микрэт-ЗОО и Мшфат-500.

Табл. 1. RAPD-праймеры, использоваппые в работе.

Праймер П оследовательпость S'-У Праймер По следовательпость 5'- 3'

ad04 GTAGGCCTCA QK-l CGGTCACTGT

xot CTGGGCACGA QR-2 CGGCCÄCTGT

Х15 CAGACAAGCC QK-3 CüGCCCCTGT

АЕП TGTGGACIGG Ц(Ы CGGCCCCtiüT

kflj acacauagüü (JK-3 cggccccggc

AF.07 GTGTCAGTGÜ I CGTCGTTACC

R12 acaggtgcgt 11 G TCCTCAG TG

V20 cagcatgütc Ш GCAGACTGAÜ

(j:o TCGCCCAGTC IV tcttagtgcc

GGCTAACCGA V 1 GACAGTAüCA

«от cagcactgac VI i CTTGGATGGA

R!6 GGTGACTGTG К 7 1 AG CTGAGCAAU

R1I GTAGCCt 1ТСГ KS 1 GAACACTGGG

V03 CICCtHGCAA K9 1 CCCTACCGAC

RC6 GTCTACüGCA K10 GTGCAACGTG

Leb-10 1 AGCCGCAGCT AIS 1 TTCCUAACCC

ггю AUUCGüOTAC Uü | ACCTGAACGG

Pill AGGCGGGAACG D12 [ CACCGTATCC

8310 gagaggcacc N19 t G rCCGTACTG

B474 aggcgggaac i

Эдюирование RA PD-фрагментощ, Элюирование RAPD-фрагментов г» агзрозного геля проводили, используя QIAEX II Gel Extraction Kit (QLAGEN), по протоколу фирмы-ироизводшедя.

Клонирование RAPD-фрагментое. Элюироваияый RAPD-фрагмент лигировалн с pGEM-Т вектором набора для клонирования pGF.M-T vector system II (Promega, USA). Лишровшше и последующую трансформацию проводили согласно протоколу фирмы Promega.

После трансформации т рекомОингиггаых клонов выделяли плазмидную ДНК, проверяли на наличие клонированных RAPD-фрагментов и использовали для секвепирования,

Секвепироеание. Секвенирование клонированных фрагментов было проведено По.тгараусом А,Б, (Институт молекулярной биологии им. В.Д.Энгельгардта РАН).

Анализ нукпеотидпых последоеател ьностей. Лпаяиз нуклеотмдных последовательностей фрагментов и поиск последовательностей, гомологичных исследуемым, проводили в базах данных GenBank, EMBL, DDBJ u PDB при помощи программы GeneBee BLAST 2.2.2. Services

flittp;//www,genebec. m su, su/b) ast new/blastform.pho~). используя алгоритм blastn. При помощи згой же программы и алгоритма biastx были предсказаны продукты трансляции для клонированных последовательностей и проведено их сравпение с белковыми последовательностями, имеющимися в белковых базах данных.

Подбор SCAR-праймерое. На основании данных о последовательности клонированных ЯДРО-фрагментов для каждого из фрагментов были подобраны праймеры размером от 18 до 24 пуклсо1Нлов, соответствующий концам RAPD-фрагмента (собственно SCAR-праймеры) или Более внутренним его районам (внутренние SCAR- праймеры),

Праймеры были подобраны при помоши компьютерных программ Oligo 4.0. (Rychlik and Rhoads, 1989].

Массовый сегрегационный анализ. Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с определенными генами гороха, осуществлялся с помопн.ю массового сегрегационного анализа. Массовый сегрегационный анализ проводили на расщепляющихся популяциях F2 (L-Ш х Хл-15), (L-84 х Хя-18) и (Хл-18 х L-1238).

Индивидуальные растеши F2 разделяли на две группы, состоящие из восьми растений каждая. Группы растений различались между собой исследуемым признаком (доминант-рецсссив), распределение же остальных признаков в пределах группы было случайным.

Из отобранных растений выделяли геномную ДНК и для каждой группы готовили смесь ДНК, состоящую из равных количеств ДНК всех растений группы. Две смеси ДНК, а также ДНК родительских растений исследовали на наличие полиморфизма RAPD-методом. Если фрагмент присутствовал в одной смеси ДНК и в ДНК одного из родителей и окутствовал в другой смеси ДНК и у другого родителя, то предполагалось потенциальное сцепление этого фрагмента с исследуемым геном.

Сцепление также предполагалось, если фрагмент был полиморфным у родительских растений, а в разных смесях ДНК значительно различался но концентрации, Сцииение подтверждалось на основе анализа RAPD-Meraaoy ДНК индивидуальных растений F2.

Математическая обработка данных. Для количественной оценки полиморфизма и определения уровня дивергенции между исследуемыми линиями, сортами и мутантами гороха данные RAPD-апализа были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, r которой наличие или отсутствие в RAPD-епектрах одинаковых по размеру

амшнконов соответствовало значениям 1 или 0, Значение 1 присваивала только амяликонам, проявляющимся с высокой интенсивностью п стабильно повторяющимися во всех опытах. По матрице состояний была составлена матрица различий, генетические расстояния в которой рассчитывались по Ней и Ли fNci and Li, 1979] с использованием компьютерной jгрограммы Тгеесоа [Van de Peer, Wächter, 1994].

На основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым метолом (UPGMA) (Unweighted Paig-Group Method) IS oka] and Michener, 3 958] была построена генеалогическая деидро грамма. отражаюп;ая степень различий между RAPD-спектрами исслсдуемых объектов. Для построения деядро граммы использовали компьютерную программу Тгеесоа [Van de Реет, Wächter, 1994] с применением 100 реплик бутстрепа [Felsenstein, 1985].

Анализ статистической достоверности расщепления и оценку сцепления между двумя маркерами проводили но методу хи-квадрат [Серебровский, 1970J, а также при помощи компьютерной программы MAPMAKER 3.0. [Lander et al,, 1987] по результатам F2. Программу MAPMAKER 3.0. использовали также для расчета частоты рекомбинации между маркерами и для определения их взаимного расположения на хромосомах.

Результаты и обсуждение. 1. Картирование гена у гороха с намошью морфологических маркеров.

ха-18 - хлорофильиая пояудоминантная мутация, в гомозиготе летальна. Гомо«нотные по данной мутации проростки имеют кремово-желтый цвет. Они не способны к фотосинтезу, поскольку синтез хлорофилла у них полностью блокирован, к могут существовать лишь некоторое время за счет запасных веществ семядолей (Гостимский и др., 1982). Гетерозиготы имеют недостаток хлорофилла и желто-зеленую окраску. В случае успешной локализации, данная мутация могла бы использоваться в качестве нового маркера генома гороха в дальнейшей работе по картированию.

С целью локализации гена Ха-18 гетерозиготные по данной мутации растения скрещивали с маркерной линией L-1238. Вышештошпеся ж*еято-зеленые растения, представляющие собой шбриды Fl, несушие мутацию ха-18 в гетерозигоге, непользовали для получения F2 популяции.

Было проведено исследование 197 растений ионуляши F2(X.T-18 х L-1238) на наличие сцепления тенаЛ-JS с маркерными генами 1М>, 77, Д, Le, К и Ср.

Ген Xu-78 оказался несиеплен с маркерными генами линии L-1238.

Неудача с локализацией гена Ха-18 демонстрирует трудности, возникающие при использовании в работе по картированию только морфологических маркеров, и указывает иа необходимость применения в дальнейшем молекулярных маркеров.

2. Выявление ЯАГО-маркеров в ДНК гороха.

С целью получения полиморфных 11АРО-фрагментов, было проведено исследование ЫАРО-методом ДНК двадцати сортов (Ранний зеленый, Рапорт, Капитал, Норд, Филби, Пионер, Флагман, Немчиновский, Король гурманов, Жегаловский, Роза Краун, Аявенд, Изумруд. Виола, Сахарный-2. Богатырь, Неосыпающийся, Труженик, Ору с. Узкобобовый), четырех линий (Ь-1238, 1,-111, Ь-25, Ь-84) и десяти мутантов гороха №-64, Хл-42, Хл-7, Хл-15, Хл-18 , Я-13, W-2, Хамелеон, Люпиновд, Вио-В) с использованием 23 праймеров.

Перед началом поиска полиморфных КАР1>фрагментов все линии и сорта, используемые в работе, были исследованы на гомогенность.

Для этого по 10 индивидуальных растений каждой линии или сорта были исследованы КАРО-методом с использованием праймеров В474, РгЮ, Рг11, и (}К-2, Все исследованные линии н сорта гороха оказались мокоморфнымн по ИАРО-спектрам, что свидетельствует об отсутствии внутрисортовой и внутрилинейной изменчивости (рнс. 1.),

М К~ 1 2 3 4 56 7S91Q

1000— BOO— ;*-•

too- .'

500— •• <00-ха-

р? CT fr? тЙ щ 'ГТ ji^^T^'Pr

. . .. i. Ji__y^t•- 1 ^ i I IM * T1 .. 7

Рис. 1. Продукты амплификации ДНК различных растении сорта Флагман с праймером В474. М -маркер молекулярной массы l.SKtrt-lOGbp DNA ladder ("Сибэнзим"); К*- отрицательный контроль; 1 - 10 -различные индивидуальные растения сорта Флагман.

При анализе ЛАРО-методом ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха, наряду с наличием общих ампликонов, были обнаружены полиморфные фрагменты (рис.2.).

Рпс.2. RAFD-спектры сортов, ланий и мутантов гороха, лн н к"i a 3 4 s с i е situuuuuuuiiumisBHaxnnxnusBHH

IJOO- w «i

- —~ В - - -f -- - - w-*--1*™*"

КЧ- *- — — •■«»ран™« лпцнсвиовГцГ-

— " ' ..... ~ _

]д>_ s. - _ ____- ----í* „i^ -P.B««

Продукты амплификации ДНК сортов, линий и мутантов гороха с гтраймером РгЮ.

М - маркер молекулярной чассы I.JKb+IOObp DNA Jadder ("СнЕЬнэнм"); К" - отрицательный контроль; 1 - Ранний зеленый; 2 - Рапорт; 3 - Капитал; 4 - Норд; 5 - Филби; 6 - Пионер; 7 -Флагман; 8 — Немчиновский; 9 - Король гурманов; 10 - Жсгаловский; U — Роза Крауи; 12 -Анаенд; 13 - Изумруд; t4 - Виола; 15 - СахарныЙ-2; 16 - Богатырь; 17 - Неоеыпаюцшйся; 18 -Труженик; 19-Орус; 20 - У}кобобовый; 21 - L-1238; 22 - L-111; 23 - L-25; 24 - L-84; 25-R-64; 26 - Хл-42; 27-Хл-7; 2! - R-13; 29 - Хл-18; 30 - Хл-15; 31 - W-2; 32 - Хамелеон; 33-Люпиноид; 34 - Вио-В.

Стрелки указывают некоторые полиморфные RAPD-фрагменты.

Такие полиморфные RAPD-фрагменты, характерные для определенных мутантов, линий или сортов гороха, могут быть в дальнейшем использованы как для их идентификация, так п в работе по картированию. 2. Изучение наследования полиморфных RAPD-фрагментов.

Для изучения наследования полиморфных RAPD-фрагментов, RAPD-метсшом были исследованы различные гибриды F1 и F2, а также родительские растения. Исследуемые полиморфные RAPD-фрагменты присутствовали во всех образцах гибридов FI. В F2 расщепление по признаку «присутствие - отсутствие» исследуемых RAPD-фрагментов достоверно ие отличалось от 3 :1 (рис.3. а,б).

Рис.З. Изучение наследования RAP D-маркера В474#800,

123456789 10 К" Мл

р I.Í и i,1, i* > ■ í;: ¡I ü й П

ЦмЬти "

B474#800-

-m

-Tit -615 —492

-369

а) Продукты амплификации ДНК гороха с праймером В474. М — маркер молекулярной массы 123bp DNA ladder ("Life Technologies"); К"- отрицательный контроль; 1 - 10 - разные растения Fl (W-2 х L-] 11).

м к

If"

inns—

Hl-1«-

X4-

1 2 3

ш

4 5

'■'г ):

6 7 8 i 10 11 12 IJ 14 15 16 IT IS I» 20 Л 22

t

if« M Ml

LiUL........

va k* ** H — — — Bit4<iDO

б) Продукты амплификации ДНК гороха с праймером В474. М - маркер молекулярной пассы ИЗЬр ЮЫЛ Ы<1ег ("Ше ТесЬпо1о£1е$"); К"-отрицательный контроль; 1-Ь-Ш; 2-W-2; 322 - разные растения Р2 хЬ-П1).

Стрелки указывают В474#800 КАРО-чаркер,

Таким образом, проведенные исследования показали, что данные RAPD-фрагменш являются доминантными и наследуются в соответствии с законами Менделя, что согласуется с литературными данными (Waugh and Powell, 1992; Tingey et al„ 1992}, 3. Количественная оценка RAPD-no диморфизма и построение деыдрограмм.

Для количественной оценки полиморфизма н определения уровня дивергенции между различными линиями, сортами и мутантами гороха, данные, полученные при изучении RAPD-полиморфизма, были представлены в виде матрицы состояний 90 бинарных признаков и использованы для расчета генетических расстояний и построения генеалогической декдрограммы (рис.4). Следует отметить, что из 90 RAPD-фрагментов, взятых в paGoiy, 72.2% были полиморфными.

Дивергенция между различными сортами гороха составила в среднем 18.7%. Средний уровень дивергенции между родственными мутантами и сортами равен 7.6%.

Для оценки значимости генеалогических реконструкций был использован метод бутстрепа [Felsenstein, 1985]. Топология дерева в участках со значениями, меньшими, по крайней мере, 50%, не может считаться надежно установленной. На рис.4, отмечены только значения бутстрепа больше 50%.

tlx дендрограммы видно, что надежные кластеры с высокими значениями бутстрепа (от 73 до 100%) образуют мутанты и исходные сорта (исключение составляет сорг Немчиновский, расположенный отдельпо от своих мутантов), в также сорта Рапорт и Роза Краун, входящие в один кластер со значением бутстрепа 77%. Сорт Анвенд кластеризуется вместе с сортом Виола н его мутантом В но-В со значением бутстрепа 60%. Сорт Немчиновскнй с более низким значением бутстрепа (58%) образует одну группу с мутантом Хл-15, происходящим из сорта Торсдаг, а сорта Флагман и Неосыпающийся входят в один кластер со значением бутстрепа 57%,

Рнс,4. Дендрограмма, построенная UFGMA методом для всех исследованных лаппй, сортов п мутантов гороха.

Л

Флагмвв Неосыпашщяйсо Король гури^вщ

Оное ер Филбц

РоэаКрвун J,u ЖегмовскнИ I.-25

Х*иелми Норд Богатырь JííyMpjjr Айв* яд Вя№» Внф-В К>ащал

IV

J

Кмчв^кклй „ XJ.-1S J"

Гаиннй аслевьгй "

w-г vn

Хд-lí . |

Opys

Уигобобовыя L-84

;iv

м GD

l-VU - выявляемые кластеры,

GD - генетическое расстояние по Ней И Ли.

На дереве цифрами указаны значения бутстрепа {в 94).

Заштрихованы мутанты и родственные сорта, а также родственные мутанты гороха.

5. Поиск ИЛРО-маркеров, сцепленвых с некоторыми генами гороха.

При помощи массового сегрегационного анализа было найдено 10 ЙАРП-м аркеров (Е1б#840, К0б#470, К8»620, КОбШОО, Эб#550, К10#950, У03#800, К! 1#540, Рг10«40 и К03#1800), сцепленных с генами Ск!-15,Л,Ха-18% Я и 37.

На основании анализа индивидуальных растений Р2, при использовании компьютерной программы МАРМАКЕЯ 3,0, были рассчитаны генетические расстояния

между ЛАРО-маркерамк и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение ЯАРО-маркеров на хромосомах (рис,5,).

Рпс.5. BjaiiMiioe расположение маркеров.

а) Популнкнп Р2(Хл-18 х L-1238)

б) Популяция F2<L-111 хХл-15)

в) Популяция Р2(Хл-18 х L-84)

PrlOfrUO liitM

+ Ха-1в

■ - г

3.1 tM

+ Ii

9 IcM

H2 сM DWS50 + Cs:-lS 11 JiM + R<is*1I00

RC6M70 S6cM

кшоо

li.icM

А

J4cM

Eitern

vowoo

Xa-18

23-9 cM

- -Rll#540

6. Создание SCAH-маркеров из полиморфных RAPD-чаркеров а их изучение.

Поскольку SCAR-маркеры позноляют идентифицировать определенные участки ДНК и являются более надежным типам маркеров по сравнению с RAPD [Kesselt et al., 1993; Weng et ai., 1998; Zijhtra, 2000}, нами была поставлена задача получить iß полиморфных RAPD-фрагмептов SCAR-маркеры, которые в дальнейшем можно было бы использовать в рабоге но картированию к для идентификации различных линий и сортов горома.

Для получения SCAR-маркеров были выбраны полиморфные RAPD-фрагменты, обнаружившие сне пленив с генами гороха, а также те RAPD-маркеры, наследуемость которых была показана в предыдущей части работы.

Данные фрагменты были клонированы и секвенированы. На основании данных о нуклеотидной последовательности дм каждого из фрагментов с целью создания SCAR-моркеров были подобраны и синтезированы два специфических SCAR-праймера, которые использовали для амплификации SCAR-маркеров.

Сразу получить полиморфные SCAR-маркеры удалось для 2 из 14 исходных RAPD-фрагментов {В474«680 и R03*IS00). Во всех остальных случаях ври проведен im ПЦР при температурах отжига, подобранных по программе Oligo 4,0, паблюдалась потеря исходного RAPD-полнморфизма.

Исчезновение полиморфизма при создании SCAR-маркеров - известное явление, уже отмеченное в литературе [Kesseli et al,, 1993; Deng et al., 1997; Laroche et al., 2000], Оно обычно происходит в тех случаях, когда исходный RAPD-полиморфиэм бьш вызван точковой мутацией в сайте отжига праймера и объясняется тем, что единичная замена основания в сайте отжига предотвращает посадку туда короткого RAPD-праймера, но не препятствует отжигу длинного SCAR-праймера, удерживаемого большим числом связей [Paran and Michelmore, 1993; Weng et al., 1998; Mongkolporn et a]„ 1999; Weber etal., 2002). Более того, в случае использования SCAR-праймеров, сайт точковой мутации, лежащий в основе исходного RAPD-полиморфизма, смещается в середину SCAR-праймера и, как правило, не влияет на эффективность ц специфичность амплификации [Weng etat,, 1998].

Существует несколько подходов к восстановлению полиморфизма, наиболее распространенные из которых - оптимизация параметров ГЩР (температуры отжига, количества циклов ПЦР, концентрации ионов Mg3*) [Paran and Micbelmore, 1993; Deng et al., 1997; Jiaog and Sink, 1997; Weng et al., 1998], рестрикция продуктов амплификации с нелью получения CAPS-маркеров [Paran and Michelmore, 1993; Deng etal,, 1997; Dax et al., 1998; Korn at suda et al., 1998], подбор новых пар праймеров на основании последовательности исходного RAPD-фрапиеита [Barten et al,, 1997; Laroche et al., 2000; Zijlstra, 2СИЮJ, а также включение в работу новых, более генетически отдаленных линий и сортов [Paran and Michelmore, 1993; Weng et al., 1998].

С помощью увеличения температуры ошнга удалось получить полиморфные SCAR-маркеры из семи RAPD-продуктов (К 10*950, Prl0#820. К8#620, V03#800, R06#470, В474«50 и R11 #540) (рис.6.).

Рпс.6. Результаты амплификации при »«пользовании SCAR-праймеров К10#950_1 н К10#950_2 при разлитых температурах отжига.

im Ml ft" 1 2 3 4 пн М2 КГ t 2 3 4

ПОЮ— mm

'Ш= H H 'ЖЕ * "" — -Kiowo

a) t„«670C б)1отеб90С

Ml - маркер молекулярной массы ЮОЬр DNA ladder ("Сибэнзим");

M2 - маркер молекулярной массы 1,SKb- I ООЪр DNA ladder ("Сибэнзн«");

JC - отрицательный контроль; 1-L-111; 2-Х л-15; 3-смесь ДНК растений FZiXi-lS х L-1М) с

нормальной окраской листьев; 4 - смесь ДНК растений F2(Xn-IS х L-111) с бледно-зеленой

окраской листьев.

Для получения SCAR-маркера из Е16#840 RAPD-фрагмента потребовался подбор новой пары праймеров с последующим увеличением температуры отжига.

Полиморфизм D6#550 SCAR-маркера удалось достичь путем одновременного увеличения температуры отжига и уменьшения количества циклов.

Для Рг10>(б60 фрагмента не удалось достичь полиморфизма путем изменения параметров ПНР. С целью обнаружения полиморфизма был синтезирован новый, вырожденный SCAR-праймер, отличающийся от ранее использованного SCAR-праймера наличием в положении от З'-конца нуклеотидной замены и, таким образом, содержащий од1ш ыуклеотид, некомплементарный матричной ДНК. При использовании этого праймера в ПЦР, были подобраны условия, ира которых амплификация SCAR-маркера происходила только в линии L-2S.

Необходимо отметать, что введение единичных нуклеотидных замен в праймер усиливает дестабилизацию системы праймер-матраца. Эта дестабилизация будет проявляться сильнее в сайте отжига, уже содержащим одну нуклеотидиую замену, давшую начало исходному RAPD-лолиморфизму, следовательно, можно подобрать условия, в которых будет происходить амплификация только одного аллеля, не содержащего исходно точковой мутацин в сайте отжига RAPD-праймера.

Метод введения нуклеотпаиых замен в праймер впервые был использован для обнаружения точковых мутаций в ARMS -системах (Amplification Refractory Mutation System) с целью увеличения специфичности таких систем [Newton et al., 1939; Зыкова и др., 1997; Патрушев и др., 1998]. Отличие применения этого метода в ARMS-снстемах от разработки SCAR-маркеров состоит в том, что с помощью ARMS обнаруживают известные мутации, положение которых на матрице ДНК уже ранее было определено. Это обуславливает конструкцию праймера п положение единичных нуклеотидных замен, вводимых в праймер ближе к 3'- концу.

При создании SCAR-маркеров положение мутаций, давших начало полиморфизму, точно не известно, поэтому нуклеотидные замены в праймер приходится включать более произвольно, и не в 3'- конец, а внутрь праймера, что не всегда может дать положительные результаты, поскольку единичные, некомплементарные матрице нуклеотиды, расположенные внутри праймера, часто значительно ко влияют на эффективность амплификации [Newton et al., 1989; Окауавта et al., 1989; Kwok et al., 1990].

Для двух фрагментов (Prl(W340 и R06#1100), несмотря на использование таких способов выявления полиморфизма, как изменение параметров ПЦР, рестрикция продуктов амплификация, подбор новых пар праймеров и введение в праймеры единичных нуклеотидных замен, получить полиморфные SCAR-маркеры не удаюсь. При

проведении ПЦР фрагмент присутствовал у всех исследуемых линий, сортов и мутантов гороха (рис.7).

Рис.7. Результаты амплификации ДНК различных jiiiiiiii, сортов н мутантов гороха при использовании SCAR-праПмеров Рг10#340_1 и Prt0#340_2 и t^ 65®С.

"" м к" 1 1 1 < s s 1 • iiiuuuuiiuii^uxiiSHMzxsaaKiinJixM мв- ш у

М - маркер молекулярной массы l.SKb-HOObp DNA Udder ("Сибзнзим"); К" - отрицательный контроль; I - Ранний зеленый; 2 - Рапорт, 3 - Капитал; 4 - Нора; 5 - Филби; 6 - Пионер; 7 -Флагман; 8 - НемчиновекиП; 9 - Король гурманов; 10 - Жегаловский; 11 - Ром Краун; 12 -Анвенд; 13 - Изумруд; 14 - Виола; 15 - Сахарный-2; 16 - Богатырь; 17 - Неосьшаюшийся; 18 -Труженик; 19-Орус;20-Узкобобовый;21 -L-I238; 22-L-1I1; 23-L-25; 24-L-S4;25-R-64; 26 - Хл-42; 27 - Хл-7; 28 - R-13; 29 - Хл-18; 30 - Хт-15; 31 - W-2; 32 - Хамелеон; 33 -Люпннонд; 34 - Вио-В.

Таким образом, нз 14 RAPD-фрагментов было получено 14 STS-маркеров (sequence tagged sites) — маркеров, характеризующих конкретные последовательности генома гороха, которые можно изучать и амплифицнровэть, используя данные снквенса для этих фрагментов. Причем 12 из 14 STS-маркеров являются полиморфными, то есть представляют собой SCAR-маркеры, которые не только маркируют определенные последовательности генома, но и являются также генетическими маркерами и могут быть использованы в генанализе.

Изучение амплификации полученных SCAR-маркеров лри разных температурах отжига показало, что только три из них (В474#б80, R03#1800 к Рг10»820) являются полиморфными в довольно широких температурных пределах, все остальные SCAR-маркеры требуют более или менее жестких условий для проявления полиморфизма. Следовательно, можно предположить, что «сходный RAPD-полиморфнзм для большинства фрагментов был вызван, по-видимому, точкоаыми мутациями в сайтах отжига праймеров, и только в трех случаях - более крупными перестройками.

Было изучено наследование полиморфных SCAR-маркеров Рг 10*660, Рг10#680, Рг 10ч820 и B474WS50 в F1, SCAR-маркеров K10f950, R034I800, K8S620, Е1б»730, R06#470, R1I#540, D6«550 и V03#800 - в F2. а SCAR-маркера В474И680 как в F1, так и в F2.

За исключением У03#800 маркера, наследование полученных ЭСАЯ-маркеров совпадало с наследованием исходных ЛАРО-фрагмеятов. БСАЯ-маркеры присутствовали в ДНК всех исследованных образцов И!, а также в ДНК тех же самых растений Р2, что и исходные ПАР1)-маркеры (рис.8).

Подобно исходным РАРЦ-маркерам, полученные 5САД-маркеры являлись доминантными н наследовались в соответствии с законами Менделя.

Рис.8. Наследование RAPD и SCAR-маркера К10#950 в F2.

вы М К." 1 234 S 6 7 Я 9 10 11 12 13 «SOO— —

С 5-.iS5f.HSS5«wS -KUMSSO JJJT " ....... I". " r> « г-1 v

SOO- w U «V M.*a

«0- • > ** ii

а) Наследование RAPD-фрагмента KKW950 в F2.

ПН M К ) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

1500- —

'Ш= ~ — щт — — —«• — «• яя -KKNWiO

6) Наследование 5САК-фрагменгаК10#950в F2.

М - маркер молекулярной массы lOObp DNA ladder ("Сибанзим1"); К"

отрицательный контроль; 1-L-111; 2-Хл-!5; 3-13-различныерастенияF2(L-111 хХл-15).

Несовпадение наследования RAPD н SCAR-маркера V03#800, а также отклонение расщепления по данному маркеру от 3 : 1 в F2 может быть связано с возможной гетерозиготностью линии L-84 по сайту отжига полученных SCAR-праймеров, а также наличием еше одного локуса, обеспечивающего отжиг SCAR-, во не RAPD-праЙмеров, в геноме данной линпи.

Для изучения возможности использования SCAR-маркеров для идентификации отдельных генотипов было проведено исследование различных линий, сортов и мутантов гороха на наличие созданных SCAR-маркеров.

Здесь следует отметить переход от сложных RAPD-спектров к амплификации одного конкретного фрагмента (рис.9, а,б), что значительно облегчает исследование больших выборок на наличие данного фрагмента. При этом предоставляется возможность исключить стадию электрофореза и определять наличие продукта более быстрыми способами, окрашивая содержимое постами лификациониых пробирок бромистым этидием и исследуя его флуоресценцию в УФ свете [Hernandez et al., 2002J,

Рис.9, Анализ присутствия RAPD и SCAR-маркера RÜ3#1800 у различных сортов, линий н мутантов гороха.

М К" 1 1 J 4 S 6 7 в >10Иа1ЭМ1$1(17Ц1э»11»»МаЗ« SOU М

W. —t — - , «-ОЩсЦПО

1350--

а) Продукты амплификации ДНК сортов, линий и мутантов гороха с праймером R03.

в* МК"1 Л J 4 5 С 7 В »1Э11Ш11415Ц17 1|1920Э13Эа»:ВЯгтгЯ29ЯП31ЭЗМК

!»»-_ *»и иияаи» а«ци*»м>п -

1И0-Я -

б) Продукты амплификации ДНК сортов, линий и мутантов гороха с прайм ерам и R03#1800_l и R03#1800_2.

М - маркер молекулярной массы 1,5КЬ+100Ьр DNA ladder ("Сибэнзнм"); К" - отрицательный контроль; I - Ранкнй зеленый; 2 - Рапорт; 3 - Капитал; 4 - Норд; S - Филби; б - Пионер; 7 -Флагман; 8 - Немчнноеский; 9 - Король гурманов; 10 - ЖегаловскнП; 11 - Роза Краун; 12 -Анвенд; 13 —Изумруд; 14 - Виола; ] 5 - Сахарны й-2; ] 6 - Богатырь; 17 — НеосылающнПся; 18-Труженнк; 19-Орус; 20 - Узкобобовый;21 -L-1238; 12-Ы11; 23 - L-25: 2А - L-84; 25 - R-64: 26 - Хя*42; 27 - Хл-7; 28 - R-13; 29 - Хл-lS; 30 - Хл-tJ; 31 - W-2; 32 - Хамелеон; 33 -Лютшоид; 34 - Вио-В.

Для большинства полученных SCAR-маркеров (K10S950, B474S680, R03#1800, РгЮ#820, Е1б»7Э0, R11Й540, Рг 10*660) их наличие и отсутствие в различных генотипах совпадало с исходными RAPD-мзркерами (рлс.9. а,б). Вместе с тем, амплификация SCAR-маркеров К8#620, R06#470 и V03#800 не происходила в некоторых генотипах, в которых присутствовали исходные RAPD-маркеры, а SCAR-маркеры В4744550, D6#550 и V03#800 ам (инфицировались в некоторых генотипах, не содержащих исходных RAPD-маркеров, При этом присутствие и отсутствие RAPD и SCAR-маркеров всегда совпадало у тех линий и сортов, из амллификацнонных спектров которых вырезались исходные RAPD-фрагменты, использованные для создания SCAR-праймеров.

Исчезновение фрагмента у некоторых линий н сортов при проведении ПНР со SCAR-праймерами и ампляфшсацню этого фрагмента с короткими RAPD-праймерамц можно объяснить тем, что RAPD-фрагменты разных линий и сортов, имея одинаковый размер и сходную последовательность в районе отжига дссятичлснных RAFD-нраймеров, отличаются по нуклеогндной последовательности внутренних участков. Поэтому SCAR-праймеры, подобранные на основе последовательности RAPD-фрагмента одной линии, могут не подходить для амплификации SC AR-маркера из ДНК других линий и сортов.

Напротив, фрагменты, полученные в результате амплификации со SCAR-праймерами, но не амнотифицирующиеся с RAPD-праймерами, скорее всего отличаются от исходного RAPD-фрагмента в районе отжига RAPD-праЙмеров, но имеют сходные внутренние последовательности, которые и обеспечивают отжиг SCAR-праймеров.

Таким образом, явление, при котором присутствие и отсутствие RAPD и SCAR-маркеров в одних и тех же генотипах не совпадает, подтверждает тот факт, что сходные по размеру RAPD-фрагменш, амплифипнрующиеся у разных линий, оортоа и мутантов, могут отличаться по нуклеотндыой последовательности.

В таблице 2 приведены данные о присутствии всех полученных SCAR-маркеров в различных линиях, сортах н мутантах гороха. Пользуясь этими данными, можно идентифицировать большинство исследованных линий, сортов и мутантов гороха. Эти данные можно также использовать для планирования скрещиваний в работе по картированию.

Табл. 2. Лмилнфпкации всех полученных КСАК-маркеров в различных линиях, сортах II мутантах гороха.

5 С- 4 О о О« «ь г о Ц; К 3 8 «О К л ей О & 3 £ 1 £ 1 £ О а ОО ¡4 О Г— * Й § п о « £ 8 к и 3

Ранний зеленый 4 . ■ • - 4- 4-

Рзгйрт 4 * 4 - 4 4

Капитал - 4 • . 1 - *

Нора - + ■ - * ■4 . +■

Филбн + ' - - V < 4 ■4

Пионер 4 ' - [ ч- 4 -

Флагман 4 ' - - IV 4 1 . 4 4

НемчнновскнЛ + I ■ 1 - . * 4

Король г урман.-и 1 * . 4- - 4 1 . • 4 4

Жег&ЛОВСкий 1 - - 4 4- . 1 . 4 . 4 4

Роза Кра\н - - 1 • +■'.•. 4 ' 4

Анаеиа 1 ■К - .*' I 4- ' 4

Изумруд 4 - 4 - 4- 4 . 4

Виола - - 4 * 4 .

Сахарныя-г * 4 4 •4- 4

Богатырь - +■ ■ 4 4 1 . •4 4 4

Неосы пающнйся 4 ч- 4 . | . * I - +- •4

Труженик ♦ • • 1 - 1 - 4 1 . 4 4 • 4

Орус . . " + '4-

Умгобобоэый * +* ■ 4т 4- - (- 4-

Ы218 \ *' 4 - 1 - 4 ' 4 4

Ы11 4" +• 4 + > . 4 4 •

им - 4 4 т 4- 4

ЬМ 4 4 4 1 1- 4 4

И-64 + + • I - 4 4

Хл-42 + +1 - I - 4 • 4 -

Хл-7 4 ■ . 1 . -

к-п 4- • • 1 . * - •

Х-И8 • * 1 . 4 4

Хл-15 1 > 4 - 1 ■ 1. . . 4

4' ) Ш - * 4 4

Хамеяейн + 1 * - 1 ' 4 4 *

Люпнноид •• 4- 1 - 1 - 1 - - 1 . 4 - 4" 4

Вно-В - 1 - 4 • - 1 • ■4 ; • -

+ - наличие маркера — - отсутствие маркера

7. Анализ нуклеоотыных последовательностей фрагментов, использованных дли получения ЭСАЛ-марк-еров.

Анализ нуклеотидиых последовательностей фрагментов, использованных для получения БСАЯ-маркеров, позволил установить, что часть последовательности одного из фрагментов, В474#550, гомологична некодируюшей части гена халконсинтезы гороха. Другая часть этого же фрагмента гомологична части повторяющегося элемента гороха (рис.10.).

Рнс.10. Схема гомолога» последовательности B474S5S0 фрагмента с последовательностями, найден ним в в 6aiai данных.

Последовательность фрагмента В474#550. Цифрами обозначены порядковые номера нуклеотидов.

1 — 5'

ШЕЕ

^54^—552

Гомология на 91% с частью Гомология на 84% с последовательности гена частью последовательности халконсинтазы гороха FsCHS4 повторяющеюся элемента

(D88260)

гороха (AJ002213)

При сравнительном анализе белковых последовательностей, ожидаемые продукты трансляции повторяющегося элемента оказались гомологичными различным бедкам ретроэлементов арабидопсиса. риса и кукурузы. Исходя из этих данных, повторяющийся элемент скорее всего является ретротрапспозоном, однако полученные данные пока ие дают возможности предположить, произошло ли встраивание повторяющегося элемента в некодирующую область действующего гена халконсинтазы гороха, или нами была клонирована часть псевдогена.

Часть последовательности другого фрагмента, Е16#840, гомологична различным частям повторяющихся элементов гороха и других бобовых. Анализ белковых последовательностей выявил значительную гомологию предполагаемых продуктов трансляции Е1б#840 фрагмента с продуктами трансляции регротранспозонов риса, арабидоисиса, глицинии. Судя по этим гомолопмм, Е1б#840 фрагмент, возможно, является частью регротрансп озона или некой ретротраяспозоноподобной последовательности генома гороха.

Часть иуклсотадяой последовательности R06#I100 фрагмента показала гомологию с частью гена полапротеина ретротранспозона Síedicago sativa. Поиск гомологии в базах данных белковых последовательностей также подтвердил, что часть R06#1100 фрагмента скорее всего является частью ретротраиспозона генома гороха.

Ятя остальных фрагментов не было выявлено существенной гомологии их последовательностей ни с одной из известных нуклеотидпых последовательностей. Однако поиск в белковых базах данных выявил гомологию продуктов трансляции R11S540 и К10*950 фрагментов с различными предполагаемыми ретроэлементамп, а также с продуктами трансляции регротранспозонов,

Таким образом, из 14 клонированных RAPD-фрагментов часть одного (В474#550) оказалась гомологичной некодпрующей части гена халконсинтазы гороха, другая часть этого же фрагмента вероятно является частью ретротранспозона. Четыре фрагмента

(Е] 6*840, М6#1100, 1Ш #540 и К10*950) скорее всего являются частями ретротранспозонов или неких ретротранспозонеподобных последовательностей генома гороха. Для остальных девяти фрагментов не было выявлено существенной гомологии ни с одноЛ из известных нуклеопшшх ила белковых носледовательностеЛ,

Полученные результаты свидетельствуют о довольно большом количестве ретротранспозонов в геноме гороха, что согласуется с литературными данными, согласно которым ретротранснозоны широко распространены в растительных геномах [Моигоуа е1 а1„ 2001; Ко « а1., 20021 11 У гороха, в частности [Каю е1 а1., 1999; Реатсе « а!„ 2000; Мешпапп е1 а]., 2001]. Причем, согласно работам некоторых исследователей [Ка!о е1 а]., 1999], транскрипция ряда ретротранспозонов гороха, неактивных в нормальных условиях, активируется при различного рода стрессовых воздействиях. Такие ретро транс позоны должны играть важную биологическую роль, участвуя в регуляции генов и оптимизируя генную экспрессию в ответ на различные воздействия окружающей среды [Каю е1 а]., 1999].

Последовательности фрагментов 1*064470, К8#620, Е16Д840, Об«550, РгЮ#340 и Ш)6#1100 загружены в базу данных ОепВапк <¡тор://^™.t19bi.nJm.mh.pov> и доступны по номерам записи АУ303675, ЛУЗ03676, АУ303677, АУ303678, А УЗ03679 и ЛУЗ03680 соответственно.

Заключение.

Проведенное исследование демонстрирует возможность получения молекулярных маркеров с помощью КЛРО-метода и их использование в работе по картированию, ятя определения родственных отношений между различными линиями и сор1ами гороха, а также для маркирования различных генотипов гороха.

Для более глубокого понимания природы КАРО-фрагментов и дальнейшего изучения генома гороха было проведено детальное исследование ряда полиморфных КЛРО-фрашентов. Установлен характер их наследования. Проанализированы нуклеотцдные последовательности исследуемых КАРО-фрагментов и предполагаемые продукты трансляции. Анализ показал, что из 14 КАРВ-фрашентов 5 обнаружили знач1гтельную гомологию с известными последовательностями. Причем только один из них проявил гомологию со структурным геном гороха. Другая часть этого же фрагмента, а также четыре других скорее всего являются частями ретротранспозонов или неких ретротраиспозонопо добных последовательное гей.

Полученные результаты свидетельствуют о довольно большом количестве ретротранспозонов в геноме гороха, что согласуется с литературными данными [Kato et al., 1999; Реагсе et al., 2000; Neumann et at., 200IJ.

С целью создания более специфических маркеров, характеризующих конкретные участки генома гороха, данные о нуклеотидных последовательностях RAPD-фрагментов были использованы для подбора более длинных праймеров, с помощью которых можно ампдифицировать один фрагмент, соответствующий одному определенному участку ДНК, Таким образом, из 14 полиморфных RAPD-фрагментов было получено 14 STS-маркеров, причем 12 из них являются полиморфными, то есть представляют собой SCAR-маркеры, которые можно использовать в генаналнзе.

Переход от сложных RAPD-спектров к амплификации одного конкретного SCAR-маркера значительно облегчает анализ больших выборок на наличие и отсутствие исследуемого фрагмента. SCAR-маркеры также удобны для идентификации различных линий и сортов гороха. Однако следует отметить, что не все SCAR-маркеры получаются сразу. Для большинства из них необходимо провести определенную работу по выявлению полиморфизма. Это требует некоторых затрат времени и средств, но, тем не менее, является необходимым шагом в процессе создания SCAR-маркеров,

Анализ литературных и собственных экспериментальных данных показал, что изучение амплификации STS-маркеров в разных генотипах гороха при различных температурах отжига н сравнение с амплификацией исходных RAPD-фрагментов в зтнх же генотипах может служить косвенным подходом к изучению природы RAPO-полиморфизма. Так, в случаях, когда полиморфизм у STS-маркера проявляется в довольно жестких условиях реакции, можно предположить, что исходный RAPD-полиморфизм был вызван точковой мутацией в сайте отжига праймера.. При более крупных перестройках генома, захватывающих сайты отжига праймеров, полиморфизм STS-маркеров проявляется в более широких температурных пределах. Проведенная работа показала, что для большинства полиморфных RAPD-фрагментев их полиморфизм был вызван, по-видимому, точковыми мутациями в сайге отжига праймеров, и только в трех случаях -более крупными перестройками. -

23

ВЫВОДЫ.

1. С помощью КАР0-метода, при использовании 23 праймеров выявлен внутривидовой ДНК-полиморфизм у двадцати сортов, четырех линий и десяти мутантов гороха. Обнаружены полиморфные 1*АРО-фрагменты, характерные для определенных сортов, линий и мутантов гороха, которые могут быть использованы для идентификации разных генотипов, ятя построения филогенетических деидрограмм и для генанализа.

• 2, Найдено 10 ЯАР1>-маркеров, сцепленных с генами А, Д, 77, СЫ-15 и Ха-1Н. Рассчитаны генетические расстояния между ЯАРО-маркерами п генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение ЯАРО-ыаркеров на хромосомах.

3. Клонированы и секвенировапы 14 полиморфных ИАРП-фрагм енто в гороха. Установлена гомология исследованных фрагментов с некоторыми известными последовательностями (некодирутогаая часть гена халконеннтазы гороха РзСИ34, части повторяющихся элементов гороха и других бобовых). Последовательности шести ЯАРВ-фрагментов загружены в базу данных ОепВапк (http://www.ncb ¡. nlm.nih.gov).

4. На основании данных сиквенса 14 клонированных ЛАРО-фрагментов получено 12 БСАК-маркеров.

5. Установлено, что одиннадцать из двенадцати ЯСАЯ-маркеров наследовались, подобно исходным ЯЛРО-маркерам, как простые доминантные признаки.

6. Установлен полиморфизм полученных 5САК-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха. Впервые ЯСАК-маркеры были использованы для идептификапии различных линий, сортов и мутантов гороха.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи в научных журналах;

1. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Гостимский СЛ., Петрова Т.В„ Осапова Е.С. (2001) Создание SCAR-маркера у гороха (Pisum sativum L.) на основании RAPD-анализа. Генетика, том 37, №4,574-576.

2. K.Cheghamiiza, O.Koveia, F.Konovalov anil S.Gostimsky (2002) Identification of RAPD markers and their use far molecular mapping in pea (Pisum sativum L.). Cellular & Molecular Biology Letters. Volume 7, pp.649-655.

3. Осипом K.C., Ковеза O.B., Троицкий АЛ., Долгах Ю.И., Шампна З.К., Гостимский С.А. (2003) Выявление специфических RAPD- и ISSR-фрагментов у сомакяонов кукурузы (2еа mays L.) и создание на их основе SCAR-маркеров. Генетика, том 39, №12.

Тезисы конференций:

1. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Багрова A.M., Ковеза ОЗ., Троицкий А.В. (2000) Использование ПЦР-метода для изучения генома гороха. "И Съезд Всероссийского общества генетиков и селекционеров". Санкт-Петербург, стр.100-101.

2. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Боброва BJO, Багрова А.М., ХартинаГ.А., Гостимский С.А., Троцкий А.В. (2000) Использование RAPD-метода для идентификации генотипов гороха. II Международная научная конференция «Биотехнология в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, стр.80-8!.

3. Ковеза О.В. (2000) Поиск и изучение молекулярных маркеров у гороха (Pisum sativum L.). VII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000». Москва, стр.35-36.

4. Кокаева З.Г., Ковеза О.В., Чегамирза К., Аш OA., Гостимский С.А. (2001) Выявление полиморфизма ДНК у разных генотипов гороха с помощью полнмеразной цепной реакции.ТЬе Second International Iran and Russia Conference «Agriculture and Natural Resources«. Москва, стр.8 - 9.

5. Ковеза ОЗ., Кокаева З.Г. (2001) Наследование ДНК-маркеров у гороха (Pisum sativum L.). I конференция памягп Грегора Менделя, Москва, стр.50-51.

■ 6. Чегамирза К„ Ковеза О.В,, Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. (2002) Выявление и картирование RAPO-маркеров у гороха (Pisum sativum L.). Конференция, посвященная 100-летию со дня рождения АР.Жсбрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тямирязева. Москва, стр.349350.

7. Ковеза О.В., Гостимский С.А. (2002) Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха. The 3rd International Iran and Russia Conference «Agriculture and Natural Resources». Москва, стр.14.

8, Чегамирза К., Ковеза.О,В,, Коновалов Ф.А., Гостимский С-А, (2003) Картирование гена сЫ-15 с помощью молекулярных маркеров у гороха, IV Международная конференция «Геном растений». Одесса, стр.42.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 22.09.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж № экз. Заказ 753. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Телефакс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.