Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха"

На правах рукописи

КОВЕЗА ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003 I

! Г4 <' * ? •.

Работа выполнена в лаборатории генетики растений кафедры генетики Биологического факультета МГУ им, М.ВЛомоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Гостимский Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Сулимова Галина Ефимовна Малеева Юлия Владимировна

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится « »_2003г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, г.Москва, ул.Губкина, д.З. Факс: (095)132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан « »_2003г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.НЛолухина

âoû^i

(¿481

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия молекулярные маркеры нашли очень широкое применение в различных областях генетических исследований [Caetano-Anolles, 1993; Mohan et al., 1997].

Использование молекулярных маркеров позволило решить проблему недостатка морфологических маркеров и составить подробные генетические карты различных видов растений [Ganal et al., 1992; Yu et al., 1995; Laukou et al., 1998; Saliba-Colombani et al., 2000; Irzykowska et al., 2001 и др.].

Молекулярные маркеры также используют для точной и быстрой паспортизации различных видов и сортов растений [Multani and Lion, 1995; Журавлев и др., 1996; Sanchez-Escribano et al., 1999], для изучения филогенетического родства [Gonzales and Ferrer, 1993; Lanza et al., 1997; Chowdari et al., 1998], исследования сомаклональной изменчивости [Кокаева и др., 1997; Осипова и др., 2001], идентификации соматических гибридов [Гавриленко и др., 1994; Дорохов, Клоке, 1997].

Молекулярные маркеры нашли применение в таких направлениях, как идентификация и маркирование селекционно ценных признаков [Messeguer et al. 1991, Barzen et al., 1997]. Они значительно облегчают процесс клонирования генов [Tanksley et al., 1995; Mohan et al., 1997], a также важны при изучении полигенных локусов количественных признаков (QTL) [Tanksley, 1993; Van der Knaap et al., 2002].

Наиболее быстро и легко молекулярные маркеры выявляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В частности, RAPD-метод (random amplified polymorphic DNA) - метод ПЦР с использованием короткого случайного праймера [Williams et al., 1990], является одним из наиболее эффективных методов создания молекулярных маркеров. Он позволяет быстро выявлять большое количество маркеров, распределенных по всему геному, является достаточно простым и дешевым. Однако RAPD-анализ выявляет анонимные участки генома, природа которых до конца не известна.

Для того, чтобы выйти на конкретные геномные последовательности, на основе RAPD-фрагментов были разработаны SCAR-маркеры (sequence characterized amplified region) [Kesseli et al., 1993]. Превращение RAPD-маркеров в SCAR сопровождается клонированием и секвенированием RAPD-продуктов. На основании данных сихвенса синтезируются два более длинных (обычно 20-25-нуклеотидных) SCAR-праймера, соответствующие концам RAPD-фрагмента и, как правило, включающие в себя исходные RAPD-праймеры. SCAR-праймеры с высокой специфичностью и воспроизводимостью

НОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

ЭЭ Щ^ч-^fôl

обычно амшшфицируют одну полосу, а не целый спектр фрагментов, как в случае RAPD-метода и позволяют идентифицировать определенные участки ДНК.

В связи с этим представляло интерес получить RAPD-маркеры, характеризующие определенные линии и сорта гороха, либо сцепленпые с различными мутациями генома гороха и использовать их для создания SCAR-маркеров. Подобный методический подход даст возможность не только генотипировать различные линии и сорта гороха, но и выйгги на определенные последовательности генома, соседствующие с наиболее интересными и физиоло! ически значимыми генами, что является важным шагом на пути клонирования этих генов и понимания структуры генома гороха.

Цель и задачи исследования. Целью данной работа являлся поиск новых молекулярных маркеров (RAPD и SCAR) и их использование для изучения генома гороха. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Выявить полиморфные RAPD и SCAR-маркеры в ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха из генетической коллекции кафедры генетики МГУ и изучить их наследование.

2. Осуществить картирование молекулярных маркеров.

3. Клонировать и секвенировать полиморфные RAPD-фрагменты и провести анализ их нуклеотидной последовательности.

4. Из полиморфных RAPD-маркеров получить SCAR-маркеры. Изучить их природу, а также использовать полученные SCAR-маркеры для генотипирования различных линий, сортов и мутантов гороха.

Научная новизна.

1. Обнаружены новые полиморфные RAPD-фрагменты, характерные для определенных линий, сортов и мутантов гороха, которые могут быть использованы для их идентификации.

2. Найдено 10 RAPD-маркеров, сцепленных с генами гороха A, R, 77, СЫ-15 и Ха-18. Рассчитаны генетические расстояния между RAPD-маркерами и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение RAPD-маркеров на хромосомах.

3. Получены данные о нуклеотидных последовательностях для 14 полиморфных RAPD-фрагментов.

4. Создало 14 новых STS-маркеров генома гороха, 12 из которых являются также SCAR-маркерами.

5. Установлен полиморфизм полученных SCAR-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха. Впервые SCAR-маркеры были использованы для идентификации различных линий, сортов и мутантов гороха.

Практическая и теоретическая значимость. Полученные в настоящем исследовании результаты вносят определенный вклад в изучение генома гороха.

Полиморфные RAPD-фрагменты, обнаруженные при исследовании 20 сортов, 4 линий и 10 мутантов гороха, могут быть использованы для их идентификации, а также для определения родственных отношений между различными сортами и линиями.

10 новых RAPD-маркеров, сцепленных с различными генами гороха, могут найти применение в работе по детальному картированию хромосом гороха, а также для клонирования этих генов.

Данные о нуклсотидной последовательности участков генома гороха могут бьггь использованы как для дальнейшего изучения организации генома гороха, так и для получения новых молекулярных маркеров.

С помощью созданных SCAR-маркеров можно идентифицировать большинство исследованных линий, сортов и мутантов гороха. Информацию о полиморфизме SCAR-маркеров в различных геномах можно также использовать для планирования скрещиваний в работе по картированию.

Аиробапия работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ом Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2ООО), на 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на 7-ой Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000» (Москва, 2000), на 2-ой Международной Ирапо-Российской конференции «Agriculture and Natural Resources» (Москва, 2001), на 1-ой конференции памяти Грегора Менделя (Москва, 2001), на конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2002), на 3-ей Международной Ирано-Российской конференции «Agriculture and Natural Resources» (Москва, 2002), на 4-ой Международной конференции «Геном растений» (Одесса, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовало 11 печатпых работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на _ страницах,

состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и

обсуждения», заключения, выводов и списка литературы, включающего _

источников. Работа содержит_рисунков и_таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 98-04-342, 01-0448080).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

В работе были использованы сорта, линии и мутанты гороха (Pisum sativum L.) из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли из листьев растений по методу Möller et al., 1992 с незначительными модификациями.

Амплификация ДНК гороха. Амплификацию ДНК с RAPD-праймерами проводили в реакционной смеси объемом ЗОмкл, содержащей 5мкл ДНК, 2.5ед. Taq-полимеразы (НП АО ЗТ "Силекс М"), dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 0.2мМ каждого и О.бмкМ RAPD-праймера. В реакции использовали 24.5мкл 1х ПЦР-буфера (НПФ "ДНК-Технология"), содержащего 3.1мМ MgC^. Для обеспечения «горячего старта» использовали 25мкл жидкого парафина. Амплификационную смесь покрывали 25мкл минерального масла (Sigma).

Амплификацию проводили в приборе МС2 (НПФ "ДНК-Технология") в режиме Precise по следующей программе: первая ступень - 94°С, 1мин.30сек.

вторая ступень - 94°С, 20сек.; W, 5сек; 71°С, Юсек. - 5 циклов третья ступень - 94°С, 1сек.; W, 5сек.; 71°С, Юсек. - 35 циклов W = 34, 36, 37,38,40 и 42°С

Праймеры, использованные для проведения RAPD-метода, приведены в таблице 1.

Каждому взятому в работу RAPD-маркеру было дано название, состоящее из двух частей. Первая часть соответствует праймеру, при амплификации с которым был обнаружен данный фрагмент; вторая часть названия - приблизительный размер в пн.

Амплификацию ДНК со SCAR-праймерами проводили в реакционной смеси, содержащей те же компоненты, что и при RAPD-анализе, однако вместо одного короткого RAPD-праймера в каждой ПЦР-реакции использовали два SCAR-праймера размером от 18 до 23 нуклеотидов в концентрации О.ЗмкМ каждый.

Амплификацию проводили в приборе МС2 (НПФ "ДНК-Технология") в режиме Precise по следующей программе: первая ступень - 94°С, 2мин.

вторая ступень - 94°С, Юсек.; W, 5сек; 72°С, 1мин. - 5 циклов третья ступень - 93°С, 1сек.; W, 1сек.; 72°С, 1мин. - п циклов

Были использованы программы с разной W (от 47 до 72°С) и с разным количеством циклов третьей ступени п (от 20 до 40).

Каждому фрагменту, полученному в результате амплификации со SCAR-праймерами, было дано название, состоящее из двух частей. Первая часть названия такая

же, как у исходного RAPD-праймера; вторая часть названия - приблизительный размер в пн.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2.5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Электрофорез проводили в режиме 5В/см в lx TBE буфере. После электрофореза гели анализировали в УФ свете и фотографировали на пленку Микрат-300 и Микрат-500.

Табл. 1. RAPD-праймеры, использованные в работе.

Праймер Последовательность 5*-3' Праймер Последовательность S'- 3'

AD04 GTAGGCCTCA QR-l CGGTCACTGT

Х01 CTGGGCACGA QR-2 CGGCCACTGT

Х15 CAGACAAGCC QR-3 CGGCCCCTGT

АЕ13 TGTGGACTGG QR-4 CGGCCCCGGT

R03 ACACAGAGGG QR-5 CGGCCCCGGC

АЕ07 GTGTCAGTGG I CGTCGTTACC

R12 ACAGGTGCGT II GTCCTCAGTG

V20 CAGCATGGTC III GCAGACTGAG

Q20 TCGCCCAGTC IV TCTTAGTGCC

Q09 GGCTAACCGA V GACAGTAGCA

007 CAGCACTGAC VI CTTGGATGGA

£16 GGTGACTGTG K7 AGCGAGCAAG

R11 GTAGCCGTCT K8 GAACACTGGG

V03 CTCCCTGCAA K9 CCCTACCGAC

R06 GTCTACGGCA K10 GTGCAACGTG

Leb-10 AGCCGCAGCT A15 TTCCGAACCC

PrlO AGGCGGGTAC D6 ACCTGAACGG

Prll AGGCGGGAACG D12 CACCGTATCC

В340 GAGAGGCACC N19 GTCCGTACTG

В474 AGGCGGGAAC

Эпюирование RAPD-фрагментов. Элюирование RAPD-фрагментов из агарозного геля проводили, используя QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN), по протоколу фирмы-производителя.

Клонирование RAPD-фрагментов. Элюированный RAPD-фрагмент лигировали с pGEM-Т вектором набора для клонирования pGEM-T vector system II (Promega, USA). .Цитирование и последующую трансформацию проводили согласно протоколу фирмы Promega.

После трансформации из рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК, проверяли на наличие клонированных RAPD-фрагментов и использовали для секвенирования.

Секвенирование. Секвенирование клонированных фрагментов было проведено Полтараусом А.Б. (Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов и поиск последовательностей, гомологичных исследуемым, проводили в базах данных GenBank, EMBL, DDBJ и PDB при помощи программы GeneBee BLAST 2.2.2. Services

ibttp://www.genebee.msu.su/blast_new/blastform.php'). используя алгоритм blastn. При помощи этой же программы и алгоритма blastx были предсказаны продукты трансляции для клонированных последовательностей и проведено их сравнение с белковыми последовательностями, имеющимися в белковых базах данных.

Подбор SCAR-праймеров. На основании данных о последовательности клонированных RAPD-фрагментов для каждого из фрагментов были подобраны праймеры размером от 18 до 24 нуклеотидов, соответствующие концам RAPD-фрагмента (собственно SCAR-праймеры) или более внутренним его районам (внутренние SCAR- праймеры).

Праймеры были подобраны при помощи компьютерных программ Oligo 4.0. [Rychlik and Rhoads, 1989].

Массовый сегрегационный анализ. Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с определенными генами гороха, осуществлялся с помощью массового сегрегационного анализа. Массовый сегрегационный анализ проводили на расщепляющихся популяциях F2 (L-lll х Хл-15), (L-84 х Хл-18) и (Хл-18 х L-1238).

Индивидуальные растения F2 разделяли на две группы, состоящие из восьми растений каждая. Группы растений различались между собой исследуемым признаком (доминант-рецессив), распределение же остальных признаков в пределах группы было случайным.

Из отобранных растений выделяли геномную ДНК и для каждой группы готовили смесь ДНК, состоящую из равных количеств ДНК всех растений группы. Две смеси ДНК, а также ДНК родительских растений исследовали на наличие полиморфизма RAPD-методом. Если фрагмент присутствовал в одной смеси ДНК и в ДНК одного из родителей и отсутствовал в другой смеси ДНК и у другого родителя, то предполагалось потенциальное сцепление этого фрагмента с исследуемым геном.

Сцепление также предполагалось, если фрагмент был полиморфным у родительских растений, а в разных смесях ДНК значительно различался по концентрации.

Сцепление подтверждалось на основе анализа RAPD-методом ДНК индивидуальных растений F2.

Математическая обработка данных. Для количественной оценки полиморфизма и определения уровня дивергенции между исследуемыми линиями, сортами и мутантами гороха данные RAPD-анализа были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в RAPD-спектрах одинаковых по размеру

ампликонов соответствовало значениям 1 или 0. Значение 1 присваивали только амллюсонам, проявляющимся с высокой интенсивностью и стабильно повторяющимися во всех опытах. По матрице состояний была составлена матрица различий, генетические расстояния в которой рассчитывались по Ней и Ли [Nei and Li, 1979] с использованием компьютерной программы Treecon [Van de Peer, Wächter, 1994].

На основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA) (Unweighted Paig-Group Method) [Sokal and Michener, 1958] была построена генеалогическая депдрограмма, отражающая степень различий между RAPD-спектрами исследуемых объектов. Для построения дендрограммы использовали компьютерную программу Treecon [Van de Peer, Wächter, 1994] с применением 100 реплик бутстрепа [Felsenstein, 1985].

Анализ статистической достоверности расщепления и оценку сцепления между двумя маркерами проводили по методу хи-квадрат [Серебровский, 1970], а также при помощи компьютерной программы MAPMAKER 3.0. [Lander et al., 1987] по результатам F2. Программу MAPMAKER 3.0. использовали также для расчета частоты рекомбинации между маркерами и для определения их взаимного расположения на хромосомах.

Результаты и обсуждение. 1. Картирование гена ха-18 у гороха с помощью морфологических маркеров.

ха-18 - хлорофильная полудоминантная мутация, в гомозиготе детальна. Гомозиготные по данной мутации проростки имеют кремово-желтый цвет. Они не способны к фотосинтезу, поскольку синтез хлорофилла у них полностью блокирован, и могут существовать лишь некоторое время за счет запасных веществ семядолей (Гостимский и др., 1982). Гетерозиготы имеют недостаток хлорофилла и желто-зеленую окраску. В случае успешной локализации, данная мутация могла бы использоваться в качестве нового маркера генома гороха в дальнейшей работе по картированию.

С целью локализации гена Ха-18 гетерозиготные по данной мутации растения скрещивали с маркерной линией L-1238. Выщеплякяциеся желто-зеленые растения, представляющие собой гибриды Fl, несущие мутацию ха-18 в гетерозиготе, использовали для получения F2 популяции.

Было проведено исследование 197 растений популяции F2(Jüi-18 х L-1238) на наличие сцепления гена Ха-18 с маркерными генами Wb, 77, R, Le, К и Gp.

Ген Ха-18 оказался несцеплен с маркерными генами линии L-1238.

Неудача с локализацией гена Ха-18 демонстрирует трудности, возникающие при использовании в работе по картированию только морфологических маркеров, и указывает на необходимость применения в дальнейшем молекулярных маркеров.

2. Выявление ЫАРБ-маркеров в ДНК гороха.

С целью получения полиморфных ЯАРО-фрагментов, было проведено исследование КА1Ч)-методом ДНК двадцати сортов (Ранний зеленый, Рапорт, Капитал, Норд, Филби, Пионер, Флагман, Немчиновский, Король гурманов, Жегаловский, Роза Краун, Анвенд, Изумруд, Виола, Сахарный-2, Богатырь, Неосыпающийся, Труженик, Орус, Узкобобовый), четырех линий (Ь-1238, Ь-111, Ь-25, Ь-84) и десяти мутантов гороха (13.-64, Хл-42, Хл-7, Хл-15, Хл-18 , 1ЫЗ, W-2, Хамелеон, Люпиноид, Вио-В) с использованием 23 праймеров.

Перед началом поиска полиморфных КАРО-фрагментов все линии и сорта, используемые в работе, были исследованы на гомогенность.

Для этого по 10 индивидуальных растений каждой линии или сорта были исследованы ЯАРВ-методом с использованием праймеров В474, РгЮ, Рг11, (^-1 и <311-2. Все исследованные линии и сорта гороха оказались мономорфными по КАРИ-спектрам, что свидетельствует об отсутствии внутрисортовой и внутрилинейной изменчивости (рис. 1.).

пн М К" 1234 56789 10

Рис. 1. Продукты амплификации ДНК различных растений сорта Флагман с праймером В474. М -маркер молекулярной массы 1.5Kb+100bp DNA ladder ("Сибэнзим"); К"- отрицательный контроль; 1 -10 - различные индивидуальные растения сорта Флагман.

При анализе RAPD-методом ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха, наряду с наличием общих ампликонов, были обнаружены полиморфные фрагменты (рис.2.).

Рис.2. RAPD-спектры сортов, линий и мутантов гороха.

«« М Ю 2 3 4 5 б 7 в 9 1011121314151£17 101$2О 21 22 23 М233б272в29ЭОЭ1Э2 33 Э4М 1500- _

! —Рг|0«20

__________________________________ -МОМбО

300- ~

400- ~

------•>>•-.- 1

р* Г* V —

Продукты амплификации ДНК сортов, линий и мутантов гороха с праймером РгЮ.

М - маркер молекулярной массы !.5Kb+100bp DNA ladder ("Сибэнзим"); К" - отрицательный контроль; 1 - Ранний зеленый; 2 - Рапорт; 3 - Капитал; 4 - Норд; 5 - Филби; 6 - Пионер; 7 -Флагман; 8 - Немчиновский; 9 - Король гурманов; 10 - Жегаловский; 11 - Роза Краун; 12 -Анвенд; 13 - Изумруд; 14 - Виола; 15 - Сахарный-2; 16 - Богатырь; 17 - Неосыпаюпийся; 18 -Труженик; 19-Орус; 20 - Узкобобовый; 21 - L-1238; 22-L-lll; 23-L-2S; 24-L-84; 25-R-64; 26 - Хл-42; 27 - Хл-7; 28 - R-13; 29 - Хл-18; 30 - Хл-15; 31 - W-2; 32 - Хамелеон; 33 -Люпиноид; 34 - Вио-В.

Стрелки указывают некоторые полиморфные RAPD-фрагменты.

Такие полиморфные КАРБ-фрагменты, характерные для определенных мутантов, линий или сортов гороха, могут быть в дальнейшем использованы как для их идентификации, так и в работе по картированию. 2. Изучение наследования полиморфных КАРО-фрагментов.

Для изучения наследования полиморфных КАРО-фрагментов, ЯАРБ-методом были исследованы различные гибриды Р1 и Р2, а также родительские растения. Исследуемые полиморфные ЯАРП-фрагменты присутствовали во всех образцах гибридов Р1. В Р2 расщепление по признаку «присутствие - отсутствие» исследуемых КАЛЭ-фрагментов достоверно не отличалось от 3 : 1 (рис.3, а,б).

Рис.3. Изучение наследования RAPD-маркера В474#800.

1 23456789 10 К~ Мпн

•mm ьн» т, * • **т *** — 369

а) Продукты амплификации ДНК гороха с праймером В474. М - маркер молекулярной массы 123bp DNA ladder ("Life Technologies"); К"- отрицательный контроль; 1 - 10 - разные растения Fl(W-2xL-lll).

МК12345678

861738 — 615492369-

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

• f? [' j[J ?r

«• « Ä .«»•*** »li U « «» *-B474#800

б) Продукты амплификации ДНК гороха с праймером В474. М - маркер молекулярной массы I23bp DNA ladder ("Life Technologies"); К'- отрицательный контроль; l-L-lll;2-W-2; 322 - разные растения F2 (W-2 х L-l 11).

Стрелки указывают В474#800 RAPD-маркер.

Таким образом, проведенные исследования показали, что данные RAPD-фрагменты являются доминантными и наследуются в соответствии с законами Менделя, что согласуется с литературными данными [Waugh and Powell, 1992; Tingey et al., 1992]. 3. Количественная оценка RAPD-полиморфнзма и построение дендрограмм.

Для количественной оценки полиморфизма и определения уровня дивергенции между различными линиями, сортами и мутантами гороха, данные, полученные при изучении RAPD-лолиморфизма, были представлены в виде матрицы состояний 90 бинарных признаков и использованы для расчета генетических расстояний и построения генеалогической дендрограммы (рис.4). Следует отметить, что из 90 RAPD-фрагментов, взятых в работу, 72.2% были полиморфными.

Дивергенция между различными сортами гороха составила в среднем 18.7%. Средний уровень дивергенции между родственными мутантами и сортами равен 7.6%.

Для оценки значимости генеалогических реконструкций был использован метод бутстрепа [Felsenstein, 1985]. Топология дерева в участках со значениями, меньшими, по крайней мере, 50%, не может считаться надежно установленной. На рис.4, отмечены только значения бутстрепа больше 50%.

Их дендрограммы видно, что надежные кластеры с высокими значениями бутстрепа (от 73 до 100%) образуют мутанты и исходные сорта (исключение составляет сорт Немчиновский, расположенный отдельно от своих мутантов), а также сорта Рапорт и Роза Краун, входящие в один кластер со значением бутстрепа 77%. Сорт Анвенд кластеризуется вместе с сортом Виола и его мутантом Вио-В со значением бутстрепа 60%. Сорт Немчиновский с более низким значением бутстрепа (58%) образует одну группу с мутантом Хл-15, происходящим из сорта Торсдаг, а сорта Флагман и Неосьптающийся входят в один кластер со значением бутстрепа 57%.

Рис.4. Деидрограмма, построенная ЦРвМА методом для всех исследованных линий, сортов и мутантов гороха.

;п

Н-«4 П. Хл-42 „1 Ь-Ш

Сахарный-2 Флагман Неосыпающийся Король гурманов Ь-1238 Пионер Филбн Труженнк Люпиноид Рапорт -1 Роза1фаун Жегаловский Ь-25

Хамелеон Норд Богатырь Изумруд Анвенд Виола Вио-В Капитал Хл-7 ¡V И-13 J Немчиновский Хл-15 Ранний зеленый ^ \У-2 |УИ

i IV

¡VI

<<«.>'>*>■ Хл-18 Орус

Узкобобовый L-84

. 01GD I

I - VII - выявляемые кластеры.

GD - генетическое расстояние по Ней и Ли.

На дереве цифрами указаны значения бутстрепа (в %).

Заштрихованы мутанты и родственные сорта, а также родственные мутанты гороха.

5. Поиск НАРО-маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха.

При помощи массового сегрегационного анализа было найдено 10 КАРП-марксров (Е16Я840, Ш)б#470, К8#620, Ш)6#1100, 06#550, К10#950, У03#800, Ю1#540, Рг10#340 и ШШ1800), сцепленных с генами СМ-15, А, Ха-18, Я и 77.

На основании анализа индивидуальных растений Р2, при использовании компьютерной программы МАРМАКЕЯ 3.0. были рассчитаны генетические расстояния

между ЯАРО-маркерами и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение ЯАРО-маркеров на хромосомах (рис.5.).

Рис.5. Взаимное расположение маркеров.

а) Популяция F2(Xi-18 х L-1238)

б) Популяция F2(L-111 х Хл-15)

в) Популяция F2(Xn-18 х L-84)

• -Prl0#340

3 2 сМ

- - г --Ü

9 2 сМ

- -R03#1800

-К10#950 8.2 сМ D6#550 + Chl-15 И 3 сМ

- -R06M70

8бсМ + К8#620

- -R06#1100 ..

15 8 сМ

А

5.4 сМ - "ЕШ840

П

V03#800 - -Ха-18

23.9 сМ

--Rll#540

б. Создание SCAR-маркеров из полиморфных RAPD-маркеров и их изучение.

Поскольку SCAR-маркеры позволяют идентифицировать определенные участки ДНК и являются более надежным типом маркеров по сравнению с RAPD [Kesseli et al., 1993; Weng et al., 1998; Zijlstra, 2000], нами была поставлена задача получить из полиморфных RAPD-фрагменгов SCAR-маркеры, которые в дальнейшем можно было бы использовать в работе по картированию и для идентификации различных линий и сортов гороха.

Для получения SCAR-маркеров были выбраны полиморфные RAPD-фрагменты, обнаружившие сцепление с генами гороха, а также те RAPD-маркеры, наследуемость которых была показана в предыдущей частя работы.

Данные фрагменты были клонированы и секвенированы. На основании данных о нуклеотидной последовательности для каждого из фрагментов с целью создания SCAR-маркеров были подобраны и синтезированы два специфических SCAR-праймера, которые использовали для амплификации SCAR-маркеров.

Сразу получить полиморфные SCAR-маркеры удалось для 2 из 14 исходных RAPD-фрагментов (В474#680 и R03#1800). Во всех остальных случаях при проведении ПЦР при температурах отжига, подобранных по программе Oligo 4.0, наблюдалась потеря исходного RAPD-полиморфизма.

Исчезновение полиморфизма при создании SCAR-маркеров - известное явление, уже отмеченное в литературе [Kesseli et al., 1993; Deng et al., 1997; Laroche et al., 2000]. Оно обычно происходит в тех случаях, когда исходный RAPD-полиморфизм был вызван точковой мутацией в сайте отжига праймера и объясняется тем, что единичная замена основания в сайте отжига предотвращает посадку туда короткого RAPD-праймера, но не препятствует отжигу длинного SCAR-праймера, удерживаемого большим числом связей [Paran and Michelmore, 1993; Weng et al., 1998; Mongkolpom et al., 1999; Weber et al., 2002]. Более того, в случае использования SCAR-праймеров, сайт точковой мутации, лежащий в основе исходного RAPD-полиморфизма, смещается в середину SCAR-праймера и, как правило, не влияет на эффективность и специфичность амплификации [Weng et al., 1998].

Существует несколько подходов к восстановлению полиморфизма, наиболее распространенные из которых - оптимизация параметров ПЦР (температуры отжига, количества циклов ПЦР, концентрации ионов Mg2'1') [Paran and Michelmore, 1993; Deng et al., 1997; Jiang and Sink, 1997; Weng et al., 1998], рестрикция продуктов амплификации с целью получения CAPS-маркеров [Paran and Michelmore, 1993; Deng et al., 1997; Dax et al., 1998; Komatsuda et al., 1998], подбор новых пар праймеров на основании последовательности исходного RAPD-фрагмента [Barzen et al., 1997; Laroche et al., 2000; Zijlstra, 2000], а также включение в работу новых, более генетически отдаленных линий и сортов [Paran and Michelmore, 1993; Weng et al., 1998].

С помощью увеличения температуры отжига удалось получить полиморфные SCAR-маркеры из семи RAPD-продуктов (К10#950, Prl0#820, К8#620, V03#800, R06#470, В474#550 и R11#540) (рис.6.).

Рис.6. Результаты амплификации при использовании вСАИ-праймеров К10#950_1 и К10#950_2 при различных температурах отжига.

пн М1 К" 1 2 3 4 пн М2 К- 1 2 3 4

1500- ф

~КШ95° 'ЩгЦ - - -К10#950

"fi

a)W67°C 6)tOI»69°C

Ml - маркер молекулярной массы ЮОЬр DNA ladder ("Сибэнзим"); M2 - маркер молекулярной массы l,5KtH-100bp DNA ladder ("Сибэнзим"); К" -отрицательный контроль; 1-L-Ш; 2-Хл-15; 3-смесь ДНК растений F2(Xn-l5 х L-111) с нормальной окраской листьев; 4 - смесь ДНК растений Р2(Хл-15 х L-Ш) с бледно-зеленой окраской листьев.

Для получения SCAR-маркера из Е16#840 RAPD-фрагмента потребовался подбор новой пары праймеров с последующим увеличением температуры отжига.

Полиморфизм D6#550 SCAR-маркера удалось достичь путем одновременного увеличения температуры отжига и уменьшения количества циклов.

Для Рг10#660 фрагмента не удалось достичь полиморфизма путем изменения параметров ПЦР. С целью обнаружения полиморфизма был синтезирован новый, вырожденный SCAR-праймер, отличающийся от ранее использованного SCAR-праймера наличием в 6™ положении от 3'-конца нуклеотидной замены и, таким образом, содержащий один нуклеотид, некомплементарный матричной ДНК. При использовании этого праймера в ПЦР, были подобраны условия, при которых амплификация SCAR-маркера происходила только в линии L-25.

Необходимо отметить, что введение единичных нуклеотидных замен в праймер усиливает дестабилизацию системы праймер-матрица. Эта дестабилизация будет проявляться сильнее в сайте отжига, уже содержащим одну нуклеотидную замену, давшую начало исходному RAPD-полиморфизму, следовательно, можно подобрать условия, в которых будет происходить амплификация только одного аллеля, не содержащего исходно точковой мутации в сайте отжига RAPD-праймера.

Метод введения нуклеотидных замен в праймер впервые был использован для обнаружения точковых мутаций в ARMS-системах (Amplification Refractory Mutation System) с целью увеличения специфичности таких систем [Newton et al., 1989; Зыкова и др., 1997; Патрушев и др., 1998]. Отличие применения этого метода в ARMS-системах от разработки SCAR-маркеров состоит в том, что с помощью ARMS обнаруживают известные мутации, положение которых на матрице ДНК уже ранее было определено. Это обуславливает конструкцию праймера и положение единичных нуклеотидных замен, вводимых в праймер ближе к 3'- концу.

При создании SCAR-маркеров положение мутаций, давших начало полиморфизму, точно не известно, поэтому нуклеотидные замены в праймер приходится включать более произвольно, и не в 3'- конец, а внутрь праймера, что не всегда может дать положительные результаты, поскольку единичные, некомплементарные матрице нуклеотиды, расположенные внутри праймера, часто значительно не влияют на эффективность амплификации [Newton et al., 1989; Okayama et al., 1989; Kwok et al., 1990].

Для двух фрагментов (Prl0#340 и R06#1100), несмотря на использование таких способов выявления полиморфизма, как изменение параметров ПЦР, рестрикция продуктов амплификации, подбор новых пар праймеров и введение в праймеры единичных нуклеотидных замен, получить полиморфные SCAR-маркеры не удалось. При

проведении ПЦР фрагмент присутствовал у всех исследуемых линий, сортов и мутантов гороха (рис.7).

Рис.7. Результаты амплификации ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха при использовании вСЛИ-праймеров Рг10#340_1 и Рг10#340_2 я 107Ж65°С.

™ м к

1500- —

Я»- 5

400- — 300-

1 1 3 « 5 С 7 a 91OU121314 15U17UUa02X 22 23 3t3S3(7)a>a>»31II33MM

М - маркер молекулярной массы 1.5Kb+100bp DNA ladder ("Сибэнзим"); IT - отрицательный контроль; 1 - Ранний зеленый; 2 - Рапорт; 3 - Капитал; 4 - Норд; 5 - Филби; 6 - Пионер; 7 -Флагман; 8 - Немчиновский; 9 - Король гурманов; 10 - Жегаловский; 11 - Роза Краун; 12 -Анвенд; 13 - Изумруд; 14 - Виола; 15 - Сахарный-2; 16 - Богатырь; 17 - Неосыпающийся; 18 -Труженик; 19 - Орус; 20 - Узкобобовый; 21 - L-1238; 22 - L-1 И; 23 - L-25; 24 - L-84; 25 - R-64; 26 - Хл-42; 27 - Хл-7; 28 - R-13; 29 - Хл-18; 30 - Хл-15; 31 - W-2; 32 - Хамелеон; 33 -Люпиноид; 34 - Вио-В.

Таким образом, из 14 RAPD-фрагментов было получено 14 STS-маркеров (sequence tagged sites) - маркеров, характеризующих конкретные последовательности генома гороха, которые можно изучать и амплифицировать, используя данные сиквенса для этих фрагментов. Причем 12 из 14 STS-маркеров являются полиморфными, то есть представляют собой SCAR-маркеры, которые не только маркируют определенные последовательности генома, но и являются также генетическими маркерами и могут быть использованы в генанализе.

Изучение амплификации полученных SCAR-маркеров при разных температурах отжига показало, что только три из них (В474#680, R03#1800 и Рг10#820) являются полиморфными в довольно широких температурных пределах, все остальные SCAR-маркеры требуют более или менее жестких условий для проявления полиморфизма. Следовательно, можно предположить, что исходный RAPD-полиморфизм для большинства фрагментов был вызван, по-видимому, точковыми мутациями в сайтах отжига праймеров, и только в трех случаях - более крупными перестройками.

Было изучено наследование полиморфных SCAR-маркеров Рг10#660, Рг10#680, РгЮ#820 и В474#550 в F1, SCAR-маркеров KICW950, R03#1800, К8#620, Е1б#730, R06#470, R11#540, D6#550 и V03#800 - в F2, а SCAR-маркера В474#680 как в F1, так и в F2.

За исключением У03#800 маркера, наследование полученных ЭСАЯ-маркеров совпадало с наследованием исходных ЯАРО-фрагментов. БСАК-маркеры присутствовали в ДНК всех исследованных образцов П, а также в ДНК тех же самых растений Р2, что и исходные ИАРО-маркеры (рис.8).

Подобно исходным ЛАРО-маркерам, полученные вСАЯ-маркеры являлись доминантными и наследовались в соответствии с законами Менделя.

Рис.8. Наследование RAPD и SCAR-маркера К10#950 в F2.

пн МК1 234 56789 10 11 12 13 1500-

'8®= 8 -киммо

«ое- Щ ......<• fim-.-r-' rr г»

зоо- * «•»»..♦.■„»i*»*!**»*»«***

400- *>

а) Наследование RAPD-фрагмента К10#950 в F2.

пн М К 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1500- «•

IQQC— Ш т. _ — — •• ав am >-К10#950

2 -

б) Наследование SCAR-фрагмента К10#950 в F2.

М - маркер молекулярной массы l,5Kb+100bp DNA ladder ("Сибэнзим"); К" -отрицательный контроль; 1-L-111; 2-Хл-15; 3-13-различные растенияF2(L-111 х Хл-15).

Несовпадение наследования RAPD и SCAR-маркера V03#800, а также отклонение расщепления по данному маркеру от 3 : 1 в F2 может быть связано с возможной гетерозиготностью линии L-84 по сайту отжига полученных SCAR-праймеров, а также наличием еще одного локуса, обеспечивающего отжиг SCAR-, но не RAPD-праймеров, в геноме данной линии.

Для изучения возможности использования SCAR-маркеров для идентификации отдельных генотипов было проведено исследование различных линий, сортов и мутантов гороха на наличие созданных SCAR-маркеров.

Здесь следует отметить переход от сложных RAPD-спектров к амплификации одного конкретного фрагмента (рис.9, а,б), что значительно облегчает исследование больших выборок на наличие данного фрагмента. При этом предоставляется возможность исключить стадию электрофореза и определять наличие продукта более быстрыми способами, окрашивая содержимое постамплификационных пробирок бромистым этидием и исследуя его флуоресценцию в УФ свете [Hernandez et al., 2002].

Рис.9. Анализ присутствия КАРБ и вСАК-маркера К03#1800 у различных сортов, линий и мутантов гороха.

"Х К К' 1 1 3 4 5 6 7 В 9 10 1112 13 М 15 16 17 U19 20 Я 22 2> » Z Э£ 37 2829 Ж 31 S Я М М

,500-- fc-SrUgftiftegl

700_Г 1-Х- ж- .и? -I" w ч-BS Z

600- — -•*■•■-_

500— — " 400- —

300- - ""

а) Продукты амплификации ДНК сортов, линий и мутантов гороха с праймером Я03.

™ М К" 1 2 3 4 5 ( 7 В 9 10 11121314 1516 17 183Э 20 21 222324 25 2£27Э82930Э1Э23334М

1500— w «* ***** mmщт-п *

•ooo-g g

б) Продукты амплификации ДНК сортов, линий и мутантов гороха с праймерами R03#1800_l и R03#1800_2.

М - маркер молекулярной массы 1.5Kb+100bp DNA ladder ("Сибэнзим"); К" - отрицательный контроль; 1 - Ранний зеленый; 2 - Рапорт; 3 - Капитал; 4 - Норд; 5 - Филби; б - Пионер; 7 -Флагман; 8 - Немчиновский; 9 - Король гурманов; 10 - Жегаловский; 11 - Роза Краун; 12 -Анвенд; 13 - Изумруд; 14 - Виола; 15 - Сахарный-2; 16 - Богатырь; 17 - Неосыпающийся; 18 -Труженик; 19 - Орус; 20 - Узкобобовый; 21 - L-1238; 22 - L-ll 1; 23 - L-25; 24 - L-84; 25 - R-64; 26 - Хл-42; 27 - Хл-7; 28 - R-13; 29 - Хл-18; 30 - Хл-15; 31 - W-2; 32 - Хамелеон; 33 -Люпиноид; 34 - Вио-В.

18 I

Для большинства полученных БСАЯ-маркеров (К10#950, В474#680, Я03#1800, Рг10#820, Е1б#730, ИИ#540, Рг10#б60) их наличие и отсутствие в различных генотипах совпадало с исходными ЯЛРВ-маркерами (рис.9, а,б). Вместе с тем, амплификация 8САК-маркеров К8#620, Я06#470 и У03#800 не происходила в некоторых генотипах, в которых |

присутствовали исходные ЯАРО-маркеры, а ЯСАК-маркеры В474Я550, Б6#550 и У03#800 амплифицировались в некоторых генотипах, не содержащих исходных КАГО-маркеров. |

При этом присутствие и отсутствие ЯАРБ и вСАЯ-маркеров всегда совпадало у тех линий и сортов, из амплификационных спектров которых вырезались исходные ЯАРО- '

фрагменты, использованные для создания вСАЯ-праймеров.

Исчезновение фрагмента у некоторых линий и сортов при проведении ПЦР со 8САЯ-праймерами и амплификацию этого фрагмента с короткими ИАРВ-праймерами можно объяснить тем, что ЯАРО-фрагменты разных линий и сортов, имея одинаковый ^

размер и сходную последовательность в районе отжига десятичленных ЯАРО-праймеров, отличаются по нуклеотидной последовательности внутренних участков. Поэтому вСАЯ-праймеры, подобранные на основе последовательности КАРБ-фрагмента одной линии, могут не подходить для амплификации ЭСАЯ-маркера из ДНК других линий и сортов. 1

Напротив, фрагменты, полученные в результате амплификации со вСАЯ-праймерами. но не амплифицирующиеся с ЯАРО-праймерами, скорее всего отличаются от исходного ИАРП-фрагмента в районе отжига ЯАРО-праймеров, но имеют сходные внутренние последовательности, которые и обеспечивают отжиг ЭСАЯ-праймеров.

Таким образом, явление, при котором присутствие и отсутствие ЛАРБ и ЭСАЛ-маркеров в одних и тех же генотипах не совпадает, подтверждает тот факт, что сходные по размеру ЯАРВ-фрагменты, амплифицирующиеся у разных линий, сортов и мутантов, могут отличаться по нуклеотидной последовательности.

В таблице 2 приведены данные о присутствии всех полученных ЭСАЯ-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха. Пользуясь этими данными, можно идентифицировать большинство исследованных линий, сортов и мутантов гороха. Эти данные можно также использовать для планирования скрещиваний в работе по картированию.

Табл. 2. Амплификация всех полученных вСАК-маркеров в различных линиях, сортах н мутантах гороха.

| 1 В474#б80 1 о VI VI * г- 8 ее 5: о а: § £ ¡Е § £ £ £ § о п Г-» 35 5 ¡г I 1 § * 2 о «л 8 8 00 1

Ранний зеленый + +

Рапорт + - + + - • +

Капитал - + - - -

Норд - +

Филби + + + ч-

Пионер + ч + +■ -

Флагман * . - + + +

Немчиновский - - + . - - +

Король гурманов + ■ + + + .

Жегаловский - - + + + +

Роза Краун + - - ч?

Анвенд + + .+ „ +

Изумруд - * - +

Виола - - + V*1 '

Сахарный-2 + + + + +

Богатырь - + + + + + +

Неосыпаю щийся + - + + + + +

Труженик + - + + , А

Орус + -

Узкобобовый - * + + <4щ +

Ь-1238 + - + - + + +

Ы11 + + + + + + 1 +

Ь-25 - + »+ + +

Ь-84 + + + + +

Я-64 + «-ь - + +

Хл-42 + - - + Ч;

Хл-7 -ь' + • - -

Я-13

Хл-18 - - + -

Хл-15 - + + - - ■ +

W-2 + - - * + -

Хамелеон . + + -

Люпиноид + - + +

Вио-В - + - + - - *, - -

+ - наличие маркера — - отсутствие маркера

7. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения вСАИ-маркеров.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения БСАЛ-маркеров, позволил установить, что часть последовательности одного из фрагментов, В474#550, гомологична некодирующей части гена халконсинтезы гороха. Другая часть этого же фрагмента гомологична части повторяющегося элемента гороха (рис.10.).

Рис.10. Схема юмологии последовательности В474#550 фрагмента с последовательностями, найденными в базах даиных.

Последовательность фрагмента В474#550. Цифрами обозначены порядковые номера нуклеотидов.

При сравнительном анализе белковых последовательностей, ожидаемые продукты трансляции повторяющегося элемента оказались гомологичными различным белкам ретроэлементов арабидопсиса, риса и кукурузы. Исходя из этих данных, повторяющийся элемент скорее всего является ретротранспозоном, однако полученные данные пока не дают возможности предположить, произошло ли встраивание повторяющегося элемента в некодирующую область действующего гена халконсинтазы гороха, или нами была клонирована часть псевдогена.

Часть последовательности другого фрагмента, Е1б#840, гомологична различным частям повторяющихся элементов гороха и других бобовых. Анализ белковых последовательностей выявил значительную гомологию предполагаемых продуктов трансляции Е16#840 фрагмента с продуктами трансляции ретротранспозонов риса, арабидопсиса, глицинии. Судя по этим гомологиям, Е16#840 фрагмент, возможно, является частью ретротранспозона или некой ретротранспозоноподобной последовательности генома гороха.

Часть нуклеотидной последовательности R06#l 100 фрагмента показала гомологию с частью гена полипротеина ретротранспозона Medicago sativa. Поиск гомологии в базах данных белковых последовательностей также подтвердил, что часть R06#l 100 фрагмента скорее всего является частью ретротранспозона генома гороха.

Для остальных фрагментов не было выявлено существенной гомологии их последовательностей ни с одной из известных нуклеотидных последовательностей. Однако поиск в белковых базах данных выявил гомологию продуктов трансляции Rll#540 и К10#950 фрагментов с различными предполагаемыми ретроэлементами, а также с продуктами трансляции ретротранспозонов.

Таким образом, из 14 клонированных RAPD-фрагментов часть одного (В474#550) оказалась гомологичной некодирующей части гена халконсинтазы гороха, другая часть этого же фрагмента вероятно является частью ретротранспозона. Четыре фрагмента

1—5'

1544—552

Гомология на 91% с частью Гомология на 84% с последовательности гена частью последовательности халконсинтазы гороха РзСН84 повторяющегося элемента

(D88260)

гороха(AJ002213)

(Е16#840, Я06#1100, 1Ш#540 и К10#950) скорее всего являются частями ретротранспозонов или неких ретротранспозоноподобных последовательностей генома гороха. Для остальных девяти фрагментов не было выявлено существенной гомологии ни с одной из известных нуклеотидных или белковых последовательностей.

Полученные результаты свидетельствуют о довольно большом количестве ретротранспозонов в геноме гороха, что согласуется с литературными данными, согласно которым ретротранспозоны широко распространены в растительных геномах [Моигоуа е1 а1., 2001; Ко е1 а1., 2002] и у гороха, в частности [КаЮ й а1„ 1999; Реагсе ег а1., 2000; №итапп е< а1., 2001]. Причем, согласно работам некоторых исследователей [КаЮ е! а!., 1999], транскрипция ряда ретротранспозонов гороха, неактивных в нормальных условиях, активируется при различного рода стрессовых воздействиях. Такие ретротранспозоны должны играть важную биологическую роль, участвуя в регуляции генов и оптимизируя гепную экспрессию в ответ на различные воздействия окружающей среды [Кай е1 а!., 1999].

Последовательности фрагментов Я0б#470, К8#620, Е16#840, П6#550, Рг10#340 и Я06#1100 загружены в базу данных йепВапк (ЪЦр://уууулу.псЫ.п1ш.т11.еоу') и доступны по номерам записи АУ303675, АУ303676, АУ303677, АУ303678, АУ303679 и АУ303680 соответственно.

Заключение.

Проведенное исследование Демонстрирует возможность получения молекулярных маркеров с помощью КАРЭ-метода и их использование в работе по картированию, для определения родственных отношений между различными линиями и сортами гороха, а также для маркирования различных генотипов гороха.

Для более глубокого понимания природы КАРП-фрагментов и дальнейшего изучения генома гороха было проведено детальное исследование ряда полиморфных КАРО-фрагментов. Установлен характер их наследования. Проанализированы нуклеотидные последовательности исследуемых ЯАРВ-фрагментов и предполагаемые продукты трансляции. Анализ показал, что из 14 КАРО-фрагментов 5 обнаружили значительную гомологию с известными последовательностями. Причем только один из них проявил гомологию со структурным геном гороха. Другая часть этого же фрагмента, а также четыре других скорее всего являются частями ретротранспозонов или неких ретротранспозоноподобных последовательностей.

Полученные результаты свидетельствуют о довольно большом количестве ретротранспозонов в геноме гороха, что согласуется с литературными данными [Kato et - al., 1999; Pearce et al., 2000; Neumann et al., 2001].

С целью создания более специфических маркеров, характеризующих конкретные участки генома гороха, данные о нуклеотидных последовательностях RAPD-фрагментов были использованы для подбора более длинных праймеров, с помощью которых можно амплифицировать один фрагмент, соответствующий одному определенному участку ДНК.

Таким образом, из 14 полиморфных RAPD-фрагментов было получено 14 STS-маркеров, причем 12 из них являются полиморфными, то есть представляют собой SCAR-маркеры, которые можно использовать в генанализе.

Переход от сложных RAPD-спектров к амплификации одного конкретного SCAR-маркера значительно облегчает анализ больших выборок на наличие и отсутствие исследуемого фрагмента. SCAR-маркеры также удобны для идентификации различных линий и сортов гороха. Однако следует отметить, что не все SCAR-маркеры получаются сразу. Для большинства из них необходимо провести определенную работу по выявлению полиморфизма. Это требует некоторых затрат времени и средств, но, тем не менее, является необходимым шагом в процессе создания SCAR-маркеров.

Анализ литературных и собственных экспериментальных данных показал, что изучение амплификации STS-маркеров в разных генотипах гороха при различных температурах отжига и сравнение с амплификацией исходных RAPD-фрагментов в этих же генотипах может служить косвенным подходом к изучению природы RAPD-полиморфизма. Так, в случаях, когда полиморфизм у STS-маркера проявляется в довольно жестких условиях реакции, можно предположить, что исходный RAPD-полиморфизм был вызван точковой мутацией в сайте отжига праймера. При более крупных перестройках генома, захватывающих сайты отжига праймеров, полиморфизм STS-маркеров проявляется в более широких температурных пределах. Проведепная работа показала, что для большинства полиморфных RAPD-фрагментов их полиморфизм был вызван, по-видимому, точковыми мутациями в сайте отжига праймеров, и только в трех случаях -более крупными перестройками.

23

ВЫВОДЫ.

1. С помощью ЯАРО-мегода, при использовании 23 праймеров выявлен внутривидовой ДНК-полиморфизм у двадцати сортов, четырех линий и десяти мутантов гороха. Обнаружены полиморфные КАРО-фрагменты, характерные для определенных сортов, линий и мутантов гороха, которые могут быть использованы для идентификации разных генотипов, для построения филогенетических дендрограмм и для генанализа.

• 2. Найдено 10 ЯАРП-маркеров, сцепленных с генами А, Я, П, СМ-15 и Ха-18. Рассчитаны генетические расстояния между ЛАРО-маркерами и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение ЯАРВ-маркеров на хромосомах.

3. Клонированы и секвенированы 14 полиморфных КАРО-фрагментов гороха. Установлена гомология исследованных фрагментов с некоторыми известными последовательностями (некодирующая часть гена халконсинтазы гороха Р5СН84, части повторяющихся элементов гороха и других бобовых). Последовательности, шести КАРО-фрагментов загружены в базу данных ОепВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov1.

4. На основании данных сиквенса 14 клонированных КАРО-фрагментов получено 12 ЗСАЯ-маркеров.

5. Установлено, что одиннадцать из двенадцати БСАЯ-маркеров наследовались, подобно исходным ЯАРО-маркерам, как простые доминантные признаки.

6. Установлен полиморфизм полученных БСАЯ-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха. Впервые вСАЯ-маркеры были использованы для идентификации различных линий, сортов и мутантов гороха.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи в научных журналах:

1. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Петрова Т.В., Осипова Е.С. (2001) Создание SCAR-маркера у гороха (Pisum sativum L.) на основании RAPD-анализа. Генетика, том 37, №4, 574-576.

2. K.Cheghamirza, O.Koveza, F.Konovalov and S.Gostimsky (2002) Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.). Cellular & Molecular Biology Letters. Volume 7, pp.649-655.

3. Осипова E.C., Ковеза O.B., Троицкий A.B., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. (2003) Выявление специфических RAPD- и ISSR-фрагментов у сомаклонов кукурузы (Zea mays L.) и создание на их основе SCAR-маркеров. Генетика, том 39, №12.

Тезисы конференций:

1. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Багрова A.M., Ковеза О.В., Троицкий A.B. (2000) Использование ПЦР-метода для изучения генома гороха. "II Съезд Всероссийского общества генетиков и селекционеров". Санкт-Петербург, стр.100-101.

. 2. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Боброва В.К., Багрова A.M., Хартина Г.А., Гостимский С. А., Троицкий A.B. (2000) Использование RAPD-метода для идентификации генотипов гороха. П Международная научная конференция «Биотехнология в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, стр.80-81.

3. Ковеза О.В. (2000) Поиск и изучение молекулярных маркеров у гороха (Pisum sativum L.). VII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000». Москва, стр.35-3б.

4. Кокаева З.Г., Ковеза О.В., Чегамирза К., Аш OA., Гостимский С.А. (2001) Выявление полиморфизма ДНК у разных генотипов гороха с помощью полимеразной цепной реакции.ТЬе Second International Iran and Russia Conference «Agriculture and Natural Resources». Москва, стр.8 - 9.

5. Ковеза O.B., Кокаева З.Г. (2001) Наследование ДНК-маркеров у гороха (Pisum sativum L.). I конференция памяти Грегора Менделя. Москва, стр.50-51.

• 6. Чегамирза К., Ковеза О.В., Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. (2002) Выявление и картирование RAPD-маркеров у гороха (Pisum sativum L.). Конференция, посвященная 100-летаю со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тимирязева. Москва, стр.349350.

7. Ковеза О.В., Гостимский С.А. (2002) Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха. The 3rd International Iran and Russia Conference «Agriculture and Natural Resources». Москва, стр.14.

8. Чегамирза К., Ковеза.О.В., Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. (2003) Картирование гена chi-15 с помощью молекулярных маркеров у гороха. IV Международная конференция «Геном растений». Одесса, стр.42.

>

)

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 22.09.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 80 экз. Заказ 753. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

г

I

p16*8 1

(64 & i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковеза, Оксана Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярные маркеры и их использование для исследования генома растений.

1.2. ПДРФ-маркеры.

1.3. Полимеразная цепная реакция.

1.4. ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции.

1.5. Использование RAPD-метода в исследовании генома растений.

1.6. SCAR-маркеры и проблемы, связанные с их получением.

1.7. Системы обнаружения известных точковых мутаций.

1.8. Генетическая карта посевного гороха (Pisum sativum L.).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика растительного материала.

2.2. Получение гибридов Fin расщепляющихся популяций F2.

2.3. Выделение тотальной ДНК из листьев гороха.

2.4. Метод ПЦР с использованием коротких случайных праймеров (RAPD-метод).

2.5. Клонирование RAPD-фрагментов.

2.5.1. Получение ДНК-фрагментов для клонирования.

2.5.2. Лигирование фрагментов ДНК с pGEM-T вектором.

2.5.3. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.5.4. Трансформация E.coli (штамм JM109) плазмидной ДНК.

2.6. Метод выделения плазмидной ДНК.

2.7. Анализ векторной ДНК на наличие требуемых вставок.

2.8. Секвенирование клонированных фрагментов.

2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей.

2.10. Создание SCAR-маркеров.

2.10.1. Подбор праймеров для амплификации специфических фрагментов ДНК.

2.10.2.Реакция амплификации с использованием SCAR-праймеров.

2.10.3.Подготовка ПЦР-фрагментов для рестрикции.

2.10.4.Рестрикция ПЦР-фрагментов.

2.11. Массовый сегрегационный анализ.

2.12. Математическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Картирование гена Ха-18 у гороха с помощью морфологических маркеров.

3.2. Выявление RAPD-маркеров в ДНК гороха.

3.3. Изучение наследования полиморфных RAPD-фрагментов.

3.4. Количественная оценка RAPD-полиморфизма и построение дендрограмм.

3.5. Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха.

3.6. Создание и изучение SCAR-маркеров.

3.6.1. Получение SCAR-маркера из К10#950 RAPD-фрагмента.

3.6.2. Получение SCAR-маркера из В474#800 RAPD-фрагмента.

3.6.3. Получение SCAR-маркера из R03# 1800 RAPD-фрагмента.

3.6.4. Получение SCAR-маркера из Рг10#820 RAPD-фрагмента.

3.6.5. Получение SCAR-маркера из К8#620 RAPD-фрагмента.

3.6.6. Получение SCAR-маркера из Е16#860 RAPD-фрагмента.

3.6.7. Получение SCAR-маркера из R06#470 RAPD-фрагмента.

3.6.8. Получение SCAR-маркера из В474#550 RAPD-фрагмента.

3.6.9. Получение SCAR-маркера из R11#540 RAPD-фрагмента.

3.6.10.Получение SCAR-маркера из Рг10#660 RAPD-фрагмента.

3.6.11.Получение SCAR-маркера из D6#550 RAPD-фрагмента.

3.6.12.Получение SCAR-маркера из Рг10#340 RAPD-фрагмента.

3.6.13. Получение SCAR-маркера из R06# 1100 RAPD-фрагмента.

3.6.14.Получение SCAR-маркера из V03#800 RAPD-фрагмента.

3.7. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения SCAR-маркеров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха"

Актуальность проблемы. В последние десятилетия применение молекулярных маркеров в генетике растений получило широкое распространение. Разнообразные методы получения молекулярных маркеров позволили решить проблему недостатка морфологических маркеров, используемых для картирования классической генетикой.

Наличие огромного числа молекулярных маркеров дает возможность эффективно выявлять и картировать интересующие исследователей мутации по всему геному, в том числе и у гороха (Pisum sativum L.), геном которого отличается значительной сложностью.

Более того, разработка и изучение ДНК-маркеров является принципиально новым этапом исследования генома растений, поскольку они выявляют полиморфизм на уровне самой структуры ДНК и позволяют выйти на конкретные последовательности генома.

Одним из методов получения молекулярных маркеров является RAPD-метод (random amplified polymorphic DNA) - метод полимеразной цепной реакции с короткими случайными праймерами [Williams et al., 1990]. Данный метод позволяет быстро выявлять большое количество маркеров, распределенных по всему геному, является достаточно простым и дешевым, чем и объясняется его довольно широкое использование.

Однако RAPD-анализ выявляет анонимные участки генома, природа которых до конца не известна.

Для того, чтобы выйти на конкретные геномные последовательности, на основе RAPD-фрагментов были разработаны SCAR-маркеры (sequence characterized amplified region) [Kesseli et al., 1993]. Превращение RAPD-маркеров в SCAR сопровождается клонированием и секвенированием RAPD-продуктов. На основании данных сиквенса синтезируются два более длинных (обычно 20-25-нуклеотидных) SCAR-праймера, соответствующие концам RAPD-фрагмента и, как правило, включающие в себя исходные RAPD-праймеры. SCAR-праймеры с высокой специфичностью и воспроизводимостью обычно амплифицируют одну полосу, а не целый спектр фрагментов, как в случае RAPD-метода, и позволяют идентифицировать определенные участки ДНК.

В связи с этим представляло интерес получить RAPD-маркеры, характеризующие определенные линии и сорта гороха, либо сцепленные с различными мутациями генома гороха, и использовать их для создания SCAR-маркеров. Подобный методический подход даст возможность не только генотипировать различные линии и сорта гороха, но и выйти на определенные последовательности генома, соседствующие с наиболее интересными и физиологически значимыми генами, что является важным шагом на пути клонирования этих генов и понимания структуры генома гороха.

Цель и задачи исследования. Целью данной работа являлся поиск новых молекулярных маркеров (RAPD и SCAR) и их использование для изучения генома гороха. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Выявить полиморфные RAPD и SCAR-маркеры в ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха из генетической коллекции кафедры генетики МГУ и изучить их наследование.

2. Осуществить картирование молекулярных маркеров.

3. Клонировать и секвенировать полиморфные RAPD-фрагменты и провести анализ их нуклеотидной последовательности.

4. Из полиморфных RAPD-маркеров получить SCAR-маркеры. Изучить их природу, а также использовать полученные SCAR-маркеры для генотипирования различных линий, сортов и мутантов гороха.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ковеза, Оксана Владимировна

ВЫВОДЫ.

1. С помощью RAPD-метода, при использовании 23 праймеров выявлен внутривидовой ДНК-полиморфизм у двадцати сортов, четырех линий и десяти мутантов гороха. Обнаружены полиморфные RAPD-фрагменты, характерные для определенных сортов, линий и мутантов гороха, которые могут быть использованы для идентификации разных генотипов, для построения филогенетических дендрограмм и для генанализа.

2. Найдено 10 RAPD-маркеров, сцепленных с генами A, R, Tl, СЫ-15 и Ха-18. Рассчитаны генетические расстояния между RAPD-маркерами и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение RAPD-маркеров на хромосомах.

3. Клонированы и секвенированы 14 полиморфных RAPD-фрагментов гороха. Установлена гомология исследованных фрагментов с некоторыми известными последовательностями (некодирующая часть гена халконсинтазы гороха PsCHS4, части повторяющихся элементов гороха и других бобовых). Последовательности шести RAPD-фрагментов загружены в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov').

4. На основании данных сиквенса 14 клонированных RAPD-фрагментов получено 12 SCAR-маркеров.

5. Установлено, что одиннадцать из двенадцати SCAR-маркеров наследовались, подобно исходным RAPD-маркерам, как простые доминантные признаки.

6. Установлен полиморфизм полученных SCAR-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха. Впервые SCAR-маркеры были использованы для идентификации различных линий, сортов и мутантов гороха.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время применение молекулярных маркеров в генетике растений получило широкое распространение. Паспортизация различных геномов растений, изучение филогенетических отношений, маркирование хозяйственно важных генов, составление генетических карт, клонирование - ряд проблем, которые решаются с помощью молекулярных маркеров.

Проведенное исследование демонстрирует получение молекулярных маркеров с помощью RAPD-метода и их использование в работе по картированию, для определения родственных связей между различными линиями и сортами гороха, а также для маркирования различных генотипов гороха.

Для получения RAPD-маркеров, полиморфных между различными линиями, сортами и мутантами гороха, было проведено исследование RAPD-методом ДНК двадцати сортов, четырех линий и десяти мутантов гороха с использованием 23 праймеров. Были получены полиморфные RAPD-фрагменты, характерные для определенных мутантов, линий и сортов гороха, которые могут быть использованы для идентификации данных генотипов.

С целью проверки воспроизводимости полученных результатов, эксперимент с использованием каждого из праймеров был повторен не менее трех раз. Показана воспроизводимость результатов, получаемых RAPD-методом.

Все линии, сорта и мутанты, используемые в работе, были исследованы на гомогенность. Для этого RAPD-методом с использованием пяти различных праймеров было исследовано по 10 индивидуальных растений всех использованных в работе линий, сортов и мутантов гороха. Показана мономорфность по RAPD-спектрам данных линий и сортов, что свидетельствует об отсутствие внутрисортовой и внутрилинейной изменчивости.

Была проведена проверка наследуемости некоторых RAPD-фрагментов, полиморфных между различными линиями, сортами и мутантами гороха. Показано, что исследуемые RAPD-фрагменты являются доминантными и наследуются в соответствии с законами Менделя, что согласуется с литературными данными [Waugh and Powell, 1992; Tingey et al., 1993].

Используя данные, полученные при изучении RAPD-полиморфизма, были рассчитаны генетические расстояния между различными сортами, линиями и мутантами гороха, исходя из которых была построена генеалогическая дендрограмма, отражающая степень различий между RAPD-спектрами исследуемых объектов. Дивергенция между различными сортами гороха составила в среднем 18.7%. Средний уровень различий между мутантами и исходными сортами, а также между родственными мутантами, полученными из одного сорта, составил 7.6%, что достаточно хорошо согласуется с предыдущими работами [Кокаева и др., 1998].

С использованием массового сегрегационного анализа был осуществлен поиск RAPD-маркеров, сцепленных с различными генами гороха. Найдено 10 RAPD-маркеров, сцепленных с генами Chl-15, А, Ха-18, R и 77. При помощи компьютерной программы MAPMAKER 3.0. были рассчитаны генетические расстояния между RAPD-маркерами и генами, с которыми они сцеплены, а также определено взаимное расположение RAPD-маркеров на хромосомах.

С целью создания более специфических маркеров, характеризующих конкретные участки генома гороха, RAPD-фрагменты, обнаружившие сцепление с генами гороха, а также те RAPD-маркеры, наследуемость которых была показана в предыдущей части работы, были клонированы и секвенированы. На основании данных о нуклеотидной последовательности для каждого из фрагментов были подобраны и синтезированы два праймера размером от 18 до 24 нуклеотидов, соответствующие концам RAPD-фрагмента (собственно SCAR-праймеры) или более внутренним его районам (внутренние SCAR-праймеры), которые использовали для амплификации SCAR-маркеров.

Для 12 из 14 RAPD-фрагментов, выбранных для создания SCAR-маркеров, были получены полиморфные SCAR-маркеры.

Из двух RAPD-фрагментов SCAR-маркеры получить не удалось. Для них можно говорить лишь о получении STS-маркеров, маркирующих определенные последовательности генома гороха, которые мы можем изучать и амплифицировать, используя данные сиквенса, полученные для этих двух фрагментов. Но данные STS-маркеры, в отличие от SCAR-маркеров, не являются генетическими маркерами, поскольку они не полиморфны между различными линиями, сортами и мутантами гороха.

Сразу получить SCAR-маркеры, проявляющие полиморфизм при проведении ПЦР при температурах отжига, подобранных по Oligo 4.0 удалось только для двух фрагментов. Во всех остальных случаях наблюдалась потеря исходного RAPD-полиморфизма.

Исчезновение полиморфизма при создании SCAR-маркеров -известное явление, довольно часто встречающееся в литературе [Kesseli et al., 1993; Deng et al., 1997; Laroche et al., 2000].

Для восстановления полиморфизма были предприняты такие подходы, описанные в литературе, как изменение параметров ПЦР

J I температуры отжига, количества циклов ПЦР, концентрации ионов Mg ) [Paran and Michelmore, 1993; Deng et al., 1997; Jiang and Sink, 1997; Weng et al., 1998], рестрикция продуктов амплификации [Paran and Michelmore, 1993; Deng et al., 1997; Dax et al.,1998; Komatsuda et al., 1998], а также подбор новых пар праймеров [Barzen et al., 1997; Laroche et al., 2000; Zijlstra, 2000]. Путем изменения параметров ПЦР было получено девять полиморфных SCAR-маркеров.

Впервые с целью выявления полиморфизма SCAR-фрагментов был применен метод введения единичных нуклеотидных замен в SCAR-праймер. Данный подход применялся ранее для обнаружения лишь известных мутаций, положение которых на матрице ДНК уже было определено предварительно [Newton et al., 1989]. Это обусловливало конструкцию праймера и место введения нуклеотидных замен. При создании же SCAR-маркеров, положение мутаций, давших начало полиморфизму, точно не известно, поэтому место введения нуклеотидных замен в праймер приходится выбирать более произвольно, что снижает шансы получения положительных результатов. Используя данный метод в сочетании с увеличением температуры отжига и уменьшением количества циклов, для одного из фрагментов удалось получить полиморфный SCAR-маркер.

Результаты проведенных исследований показали, что большинство из полученных SCAR-маркеров проявляет полиморфизм в довольно жестких условиях. Так, только три из полученных двенадцати SCAR-маркеров являются полиморфными в довольно широких температурных пределах. Все остальные SCAR-маркеры требуют более или менее жестких условий для проявления полиморфизма.

Изучение амплификации SCAR-маркеров в разных генотипах гороха при различных температурах отжига и сравнение с амплификацией исходных RAPD-фрагментов в этих же генотипах может служить косвенным подходом к изучению природы RAPD-полиморфизма. Так, в случаях, когда полиморфизм у SCAR-маркера проявляется в довольно жестких условиях реакции, можно предположить, что исходный RAPD-полиморфизм был вызван точковой мутацией в сайте отжига праймера. При более крупных перестройках генома, захватывающих сайты отжига праймеров, полиморфизм SCAR-маркеров проявляется в более широких температурных пределах. Проведенная работа показала, что для большинства полиморфных RAPD-фрагментов их полиморфизм был вызван, по-видимому, точковыми мутациями в сайте отжига праймеров, и только в трех случаях - более крупными перестройками.

Было изучено наследование полученных SCAR-маркеров в первом и втором поколениях.

За исключением V03#800 маркера, наследование полученных SCAR-маркеров совпадало с наследованием исходных RAPD-фрагментов. SCAR-маркеры присутствовали в ДНК всех исследованных образцов F1, а также в ДНК тех же самых растений F2, что и исходные RAPD-маркеры. Подобно исходным RAPD-маркерам, полученные SCAR-маркеры являлись доминантными и наследовались в соответствии с законами Менделя.

Несовпадение наследования RAPD и SCAR-маркера V03#800 может быть связано с возможной гетерозиготностью одной из родительских линий по сайту отжига полученных SCAR-праймеров, а также наличием еще одного локуса, обеспечивающего отжиг SCAR-, но не RAPD-праймеров, в геноме данной линии.

Исследование различных линий, сортов и мутантов гороха на наличие / отсутствие полученных SCAR-маркеров показало, что для большинства SCAR-маркеров их амплификация в различных геномах совпадает с исходными RAPD-маркерами. Но для пяти из двенадцати полученных SCAR-маркеров, их наличие / отсутсвие не совпадало с исходными RAPD-маркерами для ряда сортов, линий и мутантов гороха.

Данные о наличии SCAR-маркеров в различных линиях, сортах и мутантах гороха можно использовать для планирования скрещиваний в работе по картированию, а также для идентификации большинства исследованных линий, сортов и мутантов гороха. Следует отметить переход от сложных RAPD-спектров к амплификации одного продукта ПЦР, что значительно облегчает анализ больших выборок на наличие и отсутствие исследуемого фрагмента.

Для более глубокого понимания природы RAPD-фрагментов, а также для дальнейшего изучения генома гороха был проведен анализ нуклеотидных последовательностей RAPD-фрагментов, использованных для получения SCAR-маркеров. Анализ показал, что из 14 RAPD-фрагментов 5 обнаружили значительную гомологию с известными последовательностями. Причем только один из них проявил гомологию со структурным геном гороха. Другая часть этого же фрагмента, а также четыре других скорее всего являются частями ретротранспозонов или неких ретротранспозоноподобных последовательностей.

Полученные результаты свидетельствуют о довольно большом количестве ретротранспозонов в геноме гороха, что согласуется с литературными данными [Kato et al., 1999; Pearce et al., 2000; Neumann et al., 2001].

Таким образом, данная работа демонстрирует использование RAPD-метода для получения полиморфных маркеров, характерных для определенных генотипов гороха, показывает эффективность применения массового сегрегационного анализа в сочетании с RAPD-методом для обнаружения маркеров, сцепленных с интересующими генами, демонстрирует возможность создания SCAR-маркеров из полиморфных RAPD-фрагментов и их использование для идентификации различных линий, сортов и мутантов гороха, а также для изучения генома гороха.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковеза, Оксана Владимировна, Москва

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. «Полиморфизм ДНК в популяционной генетике». Генетика 38(9): 1173-1195, 2002

2. Гавриленко Т.А., Дорохов Д.Б., Никуленкова Т.В. «Характеристика межродовых соматических гибридов томата Lycopersicon Esculentum Mill, и неклубеньковых видов картофеля серии Etuberosa». Генетика 30(12): 1605-1615, 1994

3. Гостимский С.А., Карвовская Е.А., Синещеков В.А., Беляева О.Б. «Электронно-микроскопические и спектральные свойства желтых летальных мутантов гороха». Генетика 28(1): 124-132, 1982

4. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. «Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений». Генетика 35(11): 1538-1549, 1999

5. Дорохов Д.Б., Клоке Э. «Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов». Генетика 33(4): 443-450, 1997

6. Ежова Т.А., Гостимский С.А. «Генетический анализ хлорофильных мутантов гороха». Генетика 25(4): 691-700, 1979

7. ЕжОва Т.А., Солдатова О.П., Пенин А.А., Шестаков С.В. «Молекулярно-генетическое картирование генома растений». Москва, 2002.

8. Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Музарок Т.И., Еляков Г.Б. «ПЦР-генетическое типирование женьшеня с использованием произвольных праймеров». Доклады Академии Наук, т.349, №1: 111-114, 1996

9. Калинин В.Н., Шипицина Г.И., Кикодзе М.Л., Рубцов П.М., Свердлова П.С., Скрябин К.Г., Логачев М.Ф., Князев Ю.А. «Использование генов гормона роста для диагностики заболевания карликовостью». Мол. генет. микробиол. и вирусология №6: 30-32, 1988

10. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А.В. «RAPD-анализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха». Доклады Академии Наук 355(1): 1-7, 1997

11. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А., Троицкий А.В. «Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа». Генетика 34(6): 771-777, 1998

12. Конарев В.Г., Гаврилюк Н.К., Губарева и др., под ред. Конарева В.Г. «Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции». М.: Колос, 1993

13. Кочиева Е.З., Оганисян А.С., Рысков А.П. «RAPD-маркеры генома картофеля: клонирование и использование для определения межвидовых и межсортовых различий». Молекулярная биология 33(5): 893-897, 1999

14. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н., Храпалова И.А., Пухальский В.А. «Использование метода RAPD анализа в определении генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon (Tourn.) Mill.». Генетика 38(9): 1298-1303, 2002

15. Малышев С.В., Картель Н.А. «Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений». Молекулярная биология 31(62): 197-208, 1997

16. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. «Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование». Москва, «Мир», 1984

17. Патрушев Л.И., Зыкова Е.С., Каюшин A.JL, Коростелева М.Д., Мирошников А.И. "Новая тест-система ДНК диагностики для идентификации гомозиготных и гетерозиготных точковых мутаций". Биоорган. Химия 24: 194-200, 1998

18. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Зеленин А.В., Гостимский С.А. «Идентификация хромосом генома гороха (Pisum sativum L.) по рисунку С-окраски». Доклады академии наук 387(5): 714-717, 2002

19. Серебровский А.С. «Генетический анализ». М.: Наука, 1970

20. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. «Генетический полиморфизм ячменя, выявленный ПЦР с произвольными праймерами». Генетика 31(10): 1358-1364, 1995

21. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.П. «Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя {Hordeum vulgare L.)». Генетика 33(1): 53-60, 1997

22. Сиволап Ю.М., Солоденко А.Е., Бурлов В.В. «RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus)». Генетика, т.34, № 2: 266-271, 1998

23. Сулимова Г.Е., Салменкова Е.А., Политов Д.В., Зинченко В.В., Глазер В.М. «Практикум по полиморфизму ДНК и белков». Москва, 2002

24. Фучжуи JL, Гостимский С.А. «Исследование транслокаций у гороха». Генетика, 34(9): 1-8, 1998

25. Хлесткина Е.К., Салина Е.А., Леонова И.Н., Лайкова Л.И., Коваль С.Ф. «Использование RAPD- и STS-анализа для маркирования генов пятой гомеологической группы хромосом мягкой пшеницы». Генетика, т.35, №35: 1349-1357, 1999

26. Шишкин С.С., Калинин В.Н. «Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики». Москва, 1992

27. Abd-Elsalam К.А. "Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design". African Journal of Biotechnology 2(5): 91-95, 2003

28. Asakura N., Nakamura C., and Ohtsuka I. "RAPD markers lined to the nuclear gene from Triticum tiropheevii that confers compatability with Aegilops squarrosa cytoplasm on alloplasmic durum wheat". Genome 40: 201-210, 1997

29. Bai Y., Michaels Т.Е. and Pauls K.P. "Identification of RAPD markers linked to common bacterial blight resistant genes in Phaseolus vulgaris L." Genome 40: 544-551, 1997

30. Bai D. "Three novel Nicotiana debneyi specific repetitive DNA elements derived from a RAPD marker". Genome, 42: 104-109, 1999

31. Barzen E., Stahl R., Fuchs E., Borchardt D.C., Salamini F. "Development of coupling-repulsion-phase SCAR markers diagnostic for the sugar beet Rrl allele conferring resistance to rhizomania". Molecular Breeding 3: 231238, 1997

32. Bassam B.J., Caetano-Anolles G. "Automated "Hot Start" PCR using mineral oil and parafin wax". BioTechniques 14(1): 30-34, 1993

33. Baumbusch L.O., Sundal I.K., Hughes D.W., Galau G.A. & Jakobsen K.S. "Efficient protocols for CAPS-based mapping in Arabidopsis". Plant Mol. Biol. Rep. 19: 137-149, 2001

34. Ben Chaim A., Grube R.C., Lapidot M., Jahn M.K. and Paran I. "Identification of quantitative trait loci associated with resistance to cucumber mosaic virus in Capsicum annuum". Theor Appl Genet 102: 1213-1220, 2001

35. Bennetzen J.L., SanMiguel P., Chen M., Tikhonov A., Francki M., and Avramova Z. "Grass genomes" PNAS 95(5): 1975 1978, 1998

36. Benter Т., Papadopoulos S., Pape M., Mannas M. and Poliwoda H. "Optimization and reproducibility of random amplified polymorphic DNA". Analytical Biochemistry 230: 92-100, 1995

37. Bhat K.V., Jarret R.L., Rana R.S. "DNA profiling of banana and plantain cultivars using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers". Electrophoresis 16(9): 1736-1745, 1995

38. Birch D.E., Kolmodin L., Laird W.J., McKinney N., Wong J., Young K.K.Y., Zangenberg G.A., Zoccoli M.A. "Simplified Hot-Start PCR". Nature 381: 445-446, 1996

39. Blixt S. "Cytology in Pisum. III. Investigation of five interchange lines and coordination of linkage groups with chromosomes". Agri Hort. Genet. 17(1-2): 47-75, 1959

40. Bogani P., Simoni A., Lio P., Germinario A. and Buiatti M. "Molecular variation in plant cell populations evolving in vitro in different physiological contexts". Genome 44: 549-558, 2001

41. Brauner S., Murphy R.L., Walling J.G., Przyborowski J. and Weeden, N.F. "STS markers for comparative mapping in legumes". J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127(4): 616-622, 2002

42. Brown P.T.H., Lange F.D., Kranz E. and Lorz H. "Analysis of single protoplasts and regenerated plants by PCR and RAPD technology". Mol. Gen. Genet. 237: 311-317, 1993

43. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. "DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers". Biotechnology (NY) 9(6): 553-557, 1991

44. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. "DNA amplification fingerprinting with very short primers". Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Joint Plant Breeding Symposia Series: 18-25, 1992

45. Caetano-Annoles G. "Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers". PCR Methods and Applications 3: 85-94, 1993

46. Carneiro M.S., Camargo L.E.A., Coelho A.S.G., Vencovsky R., Junior R.P.L., Stenzel N.M.C. and Vieira M.L.C. "RAPD-based genetic linkage maps of yellow passion fruit (Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg.)". Genome 45: 670-678, 2002

47. Chakrabarti R. and Schutt C.E. "The enhancement of PCR amplification by low molecular weight amides". Nucleic Acids Res. 29(11): 2377-2381, 2001

48. Chalmers K.J., Barua U.M., Hackett C.A., Thomas W.T.B., Waugh R., Powell W. "Identification of RAPD markers linked to genetic factors controlling the milling energy requirement of barley". Theor Appl Genet 87: 314-320, 1993

49. Chou Q., Russell M., Birch D.E., Raymond J. & Bloch W. "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications". Nucleic Acids Research 20(7): 1717-1723, 1992

50. Chowdari К. V., Venkatachalam S. R., Davierwala A. P., Gupta V. S., Ranjekar P. K., Govila O. P. "Hybrid performance and genetic distance as revealed by the (GATA)4 microsatellite and RAPD markers in pearl millet". Theor Appl Genet 97: 163-169, 1998

51. Dang, C. & Jayasena S.D. "Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR". J. Mol. Biol., 264: 268-278, 1996

52. Dax E., Livneh O., Aliskevicius E., Edelbaum O., Kedar N., Gavish N.,Milo J., Geffen A. Blumenthal A., Rabinowitch H.D., Sela I. "A SCAR marker linked to the ToMV resistance gene, Tm2 , in tomato". Euphytica 101:73-77,1998

53. Deng Z., Huang S., Xiao S.Y. and Gmitter F.G., Jr. "Development and characterization of SCAR markers linked to the citrus tristeza virus resistance gene from Poncirus trifoliata". Genome. 40. p.697-704, 1997

54. Diwan N., Fluhr R., Eshed Y., Zamir D. & Tanksley S. D. "Mapping of Ve in tomato: a gene conferring resistance to the broad-spectrum pathogen, Verticillium dahliae race 1." Theor. Appl. Genet. 98: 315-319, 1999

55. Domoney C., Ellis T.H.N, and Davies D.R. "Organisation and mapping of legumin genes in Pisum". Mol. Gen.Genet. 202: 280-285, 1986

56. Ellis Т.Н., Turner L., Hellens R.P., Lee D., Harker C.L., Enard C., Domoney C., Davies D.R. "Linkage maps in pea". Genetics 130(3): 649663, 1992

57. Ellis Т.Н., Hellens R.P., Turner L., Lee D., Domoney C. and Welhan T. "On the pea linkage map". Pisum Genetics 25: 5-12, 1993

58. Felsenstein J. "Confidence limits on phylogenies: an approach using bootstrap". Evolution 39(4): 783-791, 1985

59. Fodde R., Losekoot M. "Mutation analysis by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)". In: Pfeifer M (ed). Technologies for detection of DNA damage and mutations: 253-265,1996

60. Folkeson D. "The use of BSG-staining in making a more detailed nomenclature possible for interchange systems in Pisum sativum L.". Hereditas 101: 119-122, 1984(a)

61. Folkeson D. "Free segregation beetwen a (3S-7S) interchange and genes within linkage group VII in Pisum sativum L." Hereditas 101: 127-133, 1984(b)

62. Folkeson D. "Assignment of linkage segments to chromosomes 3 and 5 in Pisum sativum". Hereditas 112: 249-255, 1990(a)

63. Folkeson D. "Assignment of linkage segments to the satellite chromosomes 4 and 7 in Pisum sativum". Hereditas 112: 257-263, 1990(b)

64. Folkeson D. "A revised genetic map of Pisum sativum". Department of Genetics, University of Lund. Sweden, 1-33, 1990(c)

65. Galande A.A., Tiwari R., Ammiraju J.S.S., Santra D.K., Lagu M.D., Rao V.S., Gupta V.S., Misra B.K., Nagarajan S., Ranjekar P.K. "Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers". Theor. Appl. Genet. 103: 601-606, 2001

66. Ganal M.W., Bonierbale M.W., Roeder M.S., Park W.D. and Tanksley S.D. "Genetic and physical mapping of the papatin in potato and tomato". Mol. Gen. Genet. 225: 501-509, 1991

67. Ganal M.W., Broun P., Tanksley S.D. "Genetic mapping of tandemly repeated telomeric DNA sequences in Tomato (Lycopersicon esculentum)". Genomics 14: 444-448, 1992

68. Gelfand D.H. and White T.J. "Termostable DNA polymerases". PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications: 129-141, 1990

69. Gibbs R.A., Nguyen P.-N. and Caskey C.T. "Detection of single DNA base differences by competitive oligonucleotide priming". Nucleic Acids Res 17(7): 2437-2448, 1989

70. Giese H., Holm-Jensen A.G., Mathiassen H., Kjasr В., Rasmussen S.K., Bay H. and Jensen J. "Distribution of RAPD markers on a linkage map of barley". Hereditas 120: 267-273, 1994

71. Gilpin B.J., McCallum J.A., Frew T.J. and Timmerman-Vaughan G.M. "A linkage map ot the pea (Pisum sativum L.) genome containing cloned sequences of known function and expressed sequence tags (ESTs)". Theor. Appl. Genet. 95: 1289-1299, 1997

72. Gonzalez J.M. and Ferrer E. "Random amplified polymorphic DNA analysis in Hordeum species". Genome 38: 1029-1031, 1993

73. Grompe M. "The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids". Nat Genet 5(2): 111-7, 1993

74. Guadagnuolo R., Savova-Bianchi D. and Felber F. "Specific genetic markers for wheat, spelt and four wild relatives : comparison of isozymes, RAPD and wheat microsatellites". Genome 44 (4): 610-621, 2001

75. Hahn V., Blankenhorn K., Schwall M., Melchinger A. E. "Relationships among early European maize inbreds: III. Genetic diversity revealed with RAPD markers and comparison with RFLP and Pedigree data". Maydica 40: 299-310, 1995

76. Hallden C., Hansen M., Nilsson N.-O., Hjerdin A., Sail T. "Competition as source of errors in RAPD analysis". Theor. Appl. Genet 93: 1185-1192, 1996

77. Han T.-H., Jeu M.D., Van Eck H. and Jacobsen E. "Genetic diversity of Chilen and Brazilian Alstroemerica species assessed by AFLP analysis". Heredity 84(5): 564-569, 2000

78. Hansen M., Hallden C. and Sail T. "Error rates and polymorphism frequencies for three RAPD protocols". Plant Molecular Biology Reporter 16: 139-146, 1998

79. Hernandez P., Dorado G., Cabrera A., Laurie D.A., Snape J.W. and Martin A. "Rapid verification of wheat-Hordeum introgressions by direct staining of SCAR, STS, and SSR amplicons". Genome 45: 198-203, 2002

80. Hicks M., Adams D., O'Keefe S., Macdonald E., and Hodgetts R. "The development of RAPD and microsatellite markers in lodgepole pine (Pinus contorta var. latifolia)". Genome 41: 797-805, 1998

81. Horn R., Kusterer В., Lazarescu E., Priife M., Friedt W. "Molecular mapping of the Rfl gene restoring pollen fertility in PET 1-based Fi hybrids in sunflower {Helianthus annuus L.)". Theor Appl Genet 106: 599-606, 2003

82. Horton R. M. Hoppe B.L. and Conti-Tronconi B.M. "AmpliGrease: "hot start" PCR using petroleum jelly". BioTechniques, 16(1): 42-43, 1994

83. Huang S.C., Tsai C.C. and Sheu C.S. "Genetic analysis of Chrysanthemum hybrids based on RAPD molecular markers". Bot. Bull. Acad. Sin. 41: 257262,2000

84. Irzikowska L., Wolko В., Swi^cicki W.K. "The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers". Pisum Genetics 33: 13-18, 2001

85. Ito M., Ichinose Y., Kato H., Shiraishi T. and Yamada T. "Molecular evolution and functional relevance of the chalcone synthase genes of pea". Mol. Gen. Genet. 255 (1): 28-37, 1997

86. Jiang C. and Sink K.C. "RAPD and SCAR markers linked to the sex expression locus M in asparagus". Euphytica 94: 229-333, 1997

87. Joshi C.P., Nguyen H.T. "RAPD (Random Amplified polymorphic DNA) analysis based intervarietal relationships among hexaploid wheat". Plant Science 93: 95-103, 1993.

88. Kaboev O.K., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., and Bahrmand A.R. "PCR hot start using primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure)". Nucleic Acids Res 28: E94, 2000

89. Kainz P., Schmiedlechner A., Strack H.B. "Specificity-enhanced Hot-start PCR: addition of double-stranded DNA fragments atapted to the annealing temperature". Biotechniques 28: 278-282, 2000

90. Kasai K., Morikawa Y., Sorri V.A., Valkonen J.P.T., Gebhardt C., Watanabe K.N. "Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on a common feature of plant disease resistance genes". Genome 43: 1-8,2000

91. Kesseli R.V., Paran I., Michelmore R.W. "Efficient mapping of specifically targeted genomic regions and the tagging of these regions with reliable

92. PCR-based genetic markers". In: Proceeding of the Symposium: "Application of RAPD technology to plant breeding". Joint Plant Breeding Symposia Series. Minneapolis, Minnesota, US: 31-36, 1992

93. Khlestkina E.K., Pestova E.G., Salina E., Roder M.S., Arbuzova V.S., Koval S.F. and Borner A. "Molecular mapping and tagging of wheat genes using RAPD, STS and SSR markers". Cellular & Molecular Biology Letters 7: 795-802, 2002

94. Kim S.-H., Jeong J.-H., Kim S.-K., Paek K.-Y. "Parentage Identification of 'Daebong' Grape (Vitis spp.) Using RAPD Analysis". J. Plant Biotechnology: 4(2): 67-70, 2002

95. Ко J.-M., Do G.-S., Suh D.-Y., Seo B.-B., Shin D.-C. and Moon H.-P. "Identification and chromosomal organization of two rye genome-specificRAPD products useful as introgression markers in wheat". Genome 45:157-164,2002

96. Komatsuda Т., Nakamura I., Takaiwa F., and Oka S. "Development of STS markers closely linked to the vrsl locus of barley, Hordeum vulgare". Genome 41:680-685, 1998

97. Kwok S., Kellog D. E., McKinney N., Spasic D., Coda L., Levenson C., Sninsky J. J. "Effects of primer-template mismatches on the polyme- rase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies". Nucleic Acid Research 18: 999-1005, 1990

98. Labrune P., Melle D., Rey F., Berthelon M., Caillaud C., Rey J., Munnich A. and Lyonnet S. " Single-strand conformation polymorphisms for detection of mutations and base substitutions in phenylketonuria" Am. J. Hum. Genet. 48: 1115-1120, 1991

99. Lamm R. and Miravalle J.R. "A translocation tester set in Pisum sativum". Hereditas 4: 417-440, 1959

100. Lamm R. "Giemsa C-banding and silver-staining for cytological studies in Pisum". Hereditas 94: 45-52, 19811 lO.Lamprecht H. "The variation in linkage and the course of crossing over". Agric. Hortic. Genet. 6: 10-48, 1948

101. Lanza L. L. В., de Souza C. L. Jr., Ottoboni L. M. M., Vieira M. L. C., de Souza A. P. "Genetic distance of inbred lines and prediction of maize single-cross performance using RAPD markers" Theor Appl Genet 94(8): 1023-1030,1997

102. Laroche A., Demeke Т., Gaudet D.A., Puchalski В., Frick M. & McKenzie R. "Development of a PCR marker for rapid identification of the Bt-10 gene for common bunt resistance in wheat". Genome 43: 217-223, 2000

103. Laucou V., Haurogne K., Ellis N., Rameau C. "Genetic mapping in pea. 1. RAPD-based genetic linkage map of Pisum Sativum". Theor. Appl. Genet. V.97. p.905-915, 1998

104. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J., Lincoln S.E. and Newburg L. "MAPMAKER: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations". Genomics v.l: 174-181, 1987

105. Lin Y., & Jayasena S.D. "Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer". J. Mol. Biol., 271: 100-111, 1997

106. Lopez-Brana I., Romero M.D. and Delibes A. "Analysis of "Heterodera avenae" populations by the random amplified polymorphic DNA technique". Genome 39: 118-122, 1996

107. Lukowitz W., Gillmor C. S. and Scheible W. R. "Positional cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you". Plant Physiol. 123: 795-805, 2000

108. Manzanares-Dauleux M.J., Barret P. and Thomas G. "Development of pathotipe specific SCAR marker in Plasmodiophora brassicae". Europen Journal of Plant Pathology 106: 781-787, 2000

109. McClelland M., Arensdorf H., Cheng R., Welsh J. "Arbitrarily primed PCR fingerprints resolved on SSCP gels". Nucleic Acids Res 22: 1770-1771, 1994

110. Messeguer R., Ganal M., de Vicente M.C., Young N.D., Bolkan H. and Tanksley S.D. "High resolution RFLP map around the root knot nematode resistance gene (Mi) in tomato" Theor Appl Genet 82: 529-536, 1991

111. Miklas P.M., Larsen R.C., Riley R. and Kelly J.D. "Potential marker-assisted selection for bc-12 resistance to bean common mosaic potyvirus in common bean". Euphytica 116: 211-219, 2000

112. Mohan M, Nair S., Bhagwat A., Krishna T. G., Yano M., Bhatia C. R. and Saski T. "Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants". Molecular Breeding 3: 87-103, 1997

113. Mongkolporn O., Pang E.C.K., Kadkol G.P. and Taylor P.W.J. "Evaluation of SCAR Markers for Shatter Resistance in Brassicas". 10th International Rapeseed Conference, Canberra, Australia, 1999

114. Mueller U.G. and Wolfenbarger L. "AFLP genotyping and fingerprinting". Trends in Ecology and Evolution 14: 389-394, 1999

115. M6ller E.M., Bahnweg G., Sandermann H. and Geiger H.H. "A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues". Nucl. Acids Res. 20:6115-6116, 1992

116. Multani P.S. and Lyon B.R. "Genetic fingerprinting of Australian cotton cultivars with RAPD markers". Genome 38: 1005-1008, 1995

117. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. "A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer". Nucleic Acids Res 25: 2516-2521, 1997

118. Nei M. and Li W.-H. "Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases". Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76: 5269-5273, 1979

119. Newbury H.J. and Fofd-Lloyd B.V. "The use of RAPD for assessing variation in plants". Plant Growth Regulation 12: 43-51, 1993

120. Neumann P., Nouzova M. and Macas J. "Molecular and cytogenetic analysis of repetitive DNA in pea (pisum sativum L.)". Genome 44 (4), 716728, 2001

121. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markham A.F. "Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)". Nucleic Acids Res 17(7): 2503-2516,1989

122. Nilson N.-O., На1Ыёп С., Hansen M., Hjerdin A. and Sail T. "Comparing the distribution of RAPD and RFLP markers in a high density linkage map of sugar beet". Genome 40:644-651, 1997

123. Nkongolo K.K., Michael P., and Gratton W.S. "Identification and characterization of RAPD markers inferring genetic relationships among Pine species" Genome 45: 51-58, 2002

124. Noli E., Salvi S. and Tuberosa R. "Comparative analysis of genetic relationships in barley based on RFLP and RAPD markers". Genome 40: 607-616, 1997

125. Nouzova M., Neumann P., Navratilova A., Galbraith D.W., Macas J. "Microarray-based survey of repetitive genomic sequences in Vicia spp.". Plant Mol Biol 45(2): 229-44, 2001

126. Okayama H., Curiel D.T., Brantly M.L., Holmes M.D. and Crystal R.G. "Rapid, nonradioactive detection of mutations in human genome by allele-specific amplification" J Lab Clin Med 114(2): 105-113, 1989

127. Olson M., Hood L., Cantor C., Botstein D. "A common language for physical mapping of the human genome". Science 245: 1434-1435, 1989

128. Paniego N., Echaide M., Munoz M., Fernandez L., Torales S., Faccio P., Fuxan I., Carrera M., Zandomeni R., Suarez E.Y., Hopp H.E. "Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annuus L.)". Genome 45(1): 34-43, 2002

129. Paran I., Kesseli R. V. and Michelmore R. W. "Identification of RFLP and RAPD markers to downy mildew resistance genes in lettuce with near isogenic lines". Genome 35: 1021 1027, 1991.

130. Paran J., Michelmore R.W. "Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce". Theor Appl Genet 85: 985-993, 1993

131. Pearce S.R., Knox M.R., Ellis T.H.N., Flavell A J., Kumar A. "Pea Tyl-copia group retrotransposon: transpositional activity and use as markers to study genetic diversity in Pisum.'''' Molecular & General Genetics, 263: 898907, 2000

132. Perry M.D., Davey M.R., Power J.B., Lowe K.C., Bligh H.F.J., Roach P.S.and Jones C. "DNA Isolation and AFLP™ Genetic Fingerprinting of Theobroma cacao (L.) ". Plant Molecular Biology Reporter 16: 49-59, 1998

133. Qui J., van Senten E. and Tuzun S. "Optimization of DNA amplification fingerprinting to study genetic relationships of white lupin germplasm". Plant Breeding 114: 525-529, 1995

134. Rafalki, J.A., and Tingey, S.V. "Genetic diagnostics in plant breeding; RAPDs, microsatelites, and machines". TIG 9(8), 275-280, 1993

135. Rameau C., Denoue D., Fraval F., Haurogne K., Josserand J., Laucou V., Batge S., Murfet I.C. "Genetic mapping in pea. 2. Identification of RAPD and SCAR markers linked to genes affecting plant architecture". Theor Appl Genet v.97: 916-928, 1998

136. Roder M.S., Plaschke J., Konig S.U., Borner A., Sorrells M.E., Tanksley S.D. and Ganal M.W. "Abundance, variability and chromosomal location microsatellites in wheat". Mol. Gen. Genet. 246: 327-333, 1995

137. Ronald P.S., Penner G.A., Brown P.A. and Brule-Babe A. "Identification of RAPD markers for percent hull in oat". Genome 40: 873-878, 1997

138. Rus-Kortekaas V., Smulder M.J.M., Arens P. and Vosman V. "Direct comparision of levels of genetic variation in tomato detected by a GACA-containing microsatellite probe and by random amplified polymorphic DNA". Genome 37: 375-381, 1994

139. Rychlik W. & Rhoads R.E. "A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA". Nucleic Acids Res 17: 8543-8551, 1989

140. Saiki R. "Amplification of genomic DNA". In M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (eds) PCR protocols. Academic Press, Inc. San Diego: 13-20., 1990

141. Saliba-Colombani V., Causse M., Gervais L., and Philouze J. "Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome". Genome 43: 29-40, 2000

142. Shan X., Blake Т. K. and Talbert L. E. "Conversion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat". Theor. Appl. Genet. 98: 1072-1078, 1999

143. Sanchez de la Hoz M.P., Davila J.P., Loarce Y. and Ferrer E. "Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley". Genome 39: 112-117, 1996

144. Sanchez-Escribano E.M., Martin J.P., Carreno J., Cenis J.L. "Use of sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars". Genome 42: 87-93,1999

145. Sharkey D.J., Scalice E.R., Christy K,G. Jr., Atwood S.M. and Daiss J.L. "Antibodies as thermolabile switches: high temperature triggering for polymerase chain reaction" BioTechnology 12: 506-509, 1994

146. Sharma R., Aggarwal R.A.K., Kumar R., Mohapatra T. and Sharma R.P. "Construction of RAPD linkage map and localization of QTLs for oleic acid level using recombinant inbreds in mustard". Genome 45(3): 467-472, 2002

147. Simon C.J. and Muehlbauer F.J. " Construction of a chickpea linkage map and its comparison with maps of pea and lentil". The Journal of Heredity: 88(2), 115-119, 1997

148. Simioniuc D., Uptmoor R., Friedt W. and Ordon F. "Genetic diversity and relationships among pea cultivars revealed by RAPDs and AFLPs". Plant Breeding 121: 429-435, 2002

149. Simsek M., Adnan H. "Effect of single mismatches at З'-end of primers on polymerase chain reaction". Medical Sciences 2: 11-14, 2000

150. Singh V.K. and Kumar A. "PCR Primer Design". Mol. Biol. Today 2(2): 2732,2001

151. Sokal R.R. and Michener C.D. "A statistical method for evaluating systematic relationships". University of Kansas Science Bulletin, 38: 14091438, 1958

152. Sommer S.S., Cassady J.D., Sobell J.L., Bottema C.D. "A novel method for detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers of phenylketonuria". Mayo Clin Proc 64(11): 1361-72, 1989

153. Southern E.M. "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". J. Mol. Biol. 98(3): 503-517, 1975

154. Svitashev S., Bryngelsson Т., Li X. and Wang R.R.-C. "Genome specific repetitive DNA and RAPD markers for genome identification in Elymus and Hordelymus". Genome 41: 120-128, 1998

155. Swi?cicki W.K., Wolko B. and Weeden N.F. "Mendel's genetics, the Pisum genome and pea breeding". Vortr. Planzenzuchtg. 48: 65-76,2000

156. Tanksley S.D., Ganal M.W., Martin G.B. "Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes". Trends Biotechnol. 11(2): 63-68, 1995

157. Tanksley S.D. "Mapping polygenes". Annual reviw of genetics 27, 205-233, 1993

158. Timmerman G.M., Frew T.J., Miller A.L., Weeden N.F. and Jermyn W.A. "Linkage mapping of sbm-1, a gene conferring resistance to pea seedbornemosaic virus, using molecular markers in Pisum sativum". Theor. Appl. Genet. 85: 609-615, 1993

159. Tingey S.V., Rafalsky J.A. and Williams J.G.K. "Genetic analysis with RAPD markers". In: Proceeding of the Symposium: "Application of RAPD technology to plant breeding". Joint Plant Breeding Symposia Series. Minneapolis, Minnesota, US.: 3-6, 1992

160. Tiwari K.R., Penner G.A., and Warkentin T.D. "Inheritence of powdery mildew resistance in pea". Can. J. Plant Sci. 77: 307-310, 1997

161. Urasaki N., Tokumoto M., Tarora K., Ban Y., Kayano Т., Tanaka H., Oku H., Chinen I., Terauchi R. "A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya {Carica papaya L.)'\ Theor Appl Genet 104 (2-3): 281285, 2002

162. Van de Peer Y. "TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment". Computer Applications in the Biosciences 10(5): 569-570, 1994

163. Van de Wiel C., Arens P. and Vosman B. "Microsatellite retrieval in lettuce (Lactuca sativa L)". Genome 42:139-149,1999

164. Van der Knaap E., Lippman Z.B. and Tanksley S.D. "Extremely elongated tomato fruit controlled by four quantitative trait loci with epistatic interactions". Theor and Appl Genet 104: 241-247, 2002

165. Vasquez M.P., Schijman A.G., Ben-Dov C., Lorenzi H., Levin M.J. "Detection of polymorphism in the Trypanosoma cruzi TcP2b gene family by single strand conformational analysis (SSCA)". Gene 180: 43-48, 1996

166. Vicient C.M., Suoniemi A., Anamthawat-Jonsson K., Tanskanean J., Beharav A., Nevo E. and Schulman A.H. "Retrotransposon BARE-1 and its role in genome evolution in the genus Hordeum". Plant Cell 11: 1769-1784, 1999

167. Von Stackelberg M., Lindemann S., Menke M., Jacobsen H.-J. "Identification of AFLP and STS markers closely linked to the def locus in pea". Theor Appl Genet 106: 1293-1299, 2003

168. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Rejans M., van de Lee Т., Homes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., and Zabeau M. "AFLP: a new technique for DNA fingerprinting". Nucl. Acids Res. 23: 4407-4414, 1995

169. Wainwright L. A. and Seifert H. S. "Paraffin beads can replace mineral oil as an evaporation barrier in PCR". BioTechniques 14: 34-36, 1993

170. Waugh R. and Powell W. "Using RAPD markers for crop improvement". Trends Biotechnol. 10: 186-191, 1992

171. Weber J., Diez J., Selosse M.A., Tagu D. Le Tacon F. "SCAR markers to detect mycorrhizas of an American Laccaria bicolor strain inoculated in European Douglas-fir plantations". MYCORRHIZA. 12(1): 19-27,2002

172. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Ambrose A. and Timmerman G.M. "Linkage groups of pea". Pisum Genetics 25: 4 and cover, 1993(a)

173. Weeden N.F., Timmerman G.M., Hemmat M., Kneen B.E., and Lodhi M.A. "Inheritance and reliability of RAPD markers". Applications of RAPD Technology to Plant Breeding: 12-17, 1993(b)

174. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Timmerman-Vaughan G.M., Ellis T.H.N., Ambrose M. "The current pea linkage map". Pisum Genetics 28: 1-4, 1996

175. Weeden N.F., Ellis T.H.N., Timmerman-Vaughan G.M., Swiecicki W.K., Rozov S.M. and Berdnikov V.A. "A consensus linkage map for Pisum sativum". Pisum Genetics 30: 1-4, 1998

176. Weir B.J., St-Pierre R.G. and Chibbar R.N. "Isolation of DNA for RAPD analysis from leaves of the saskatoon (Amelanchier alnifolia Nutt.) and other horticultural crops". Canadian Journal of Plant Science 76: 819-824, 1996

177. Welsh J., McClelland M. "Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers". Nucleic Acids Res 18(24): 7213-7218, 1990

178. Weng C., Kubisiak T.L., Stine M. "SCAR markers in a longleaf pine x slash pine Fj family". Forest Genetics 5(4): 239-247, 1998

179. Westfall В., Sitaraman K., Solus J., Hughes J., and Rashtchian A. "Improved PCR specificity and yield with platinum™ Taq DNA Polymerase". FOCUS 19(3): 46-48,1997

180. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A. and Tingey S.V. "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers". Nucleic Acids Research 18(22): 6531-6535, 1990

181. Williams K. J., Fisher J.M. and Langridge P. "Identification of RFLP markers linked to the cereal cyst nematode resistance gene (Cre) in wheat". Theor Appl Genet 89: 927-930, 1994

182. Wu D.Y., Ugozzoli L., Pal B.K. and Wallace R.B. "Allele-specific enzymatic amplification of p-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2757-2760, 1989

183. Wu J.-Y., Wu H.-K. and Chung M.-C. "Co-dominant RAPD markers closely linked with two morphological genes in rice (Oryza sativa Z,)". Bot Bull Acad Sin 43: 171-180, 2002

184. Yu Z.H., McCouch S.R., Kinoshita Т., Sato S. and Tanksley S.D. "Association of morphological and RFLP markers in rice (Oryza sativa L.)". Genome 38: 566-574, 1995

185. Yu K., Park S.J. and Poysa V. "Abudance and variation of microsatellite DNA sequences in beans (Phaseolus and Vigna)". Genome 42: 27-34, 1999

186. Zhou L., Wang Y. and Gui J.F. "Molecular analysis of silver crucian carp (Carassius auratus gibelio Bloch) clones by SCAR markers". Aquaculture 201:219-228, 2001