Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение ISSR-PCR маркеров для изучения внутривидового генетического полиморфизма сосны обыкновенной на объектах единого генетико-селекционного комплекса

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Применение ISSR-PCR маркеров для изучения внутривидового генетического полиморфизма сосны обыкновенной на объектах единого генетико-селекционного комплекса"

На правах рукописи

НОВИКОВ ПЕТР СЕРГЕЕВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ ЮБН-РС!* МАРКЕРОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВНУТРИВИДОВОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ НА ОБЪЕКТАХ ЕДИНОГО ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННОГО КОМПЛЕКСА

03.02.07 - Генетика

5 ДЕК 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2013

005542957

Работа выполнена на кафедре лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждение высшего профессионального образования «Поволжский государственный технологический университет».

Научный руководитель

Шейкина Ольга Викторовна

Кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Официальные оппоненты:

Янбаев Юлай Аглямович

Путенихин Валерий Петрович

Доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет»

Проректор по учебной работе

Доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

ФГБУН Ботанический сад-институт Уфимского

научного цеетра РАН

Заведующий лабораторией дендрологии и

лесной селекции

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Защита диссертации состоится » /Л. 2013 г. в «_» часов

на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

2013г.

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Генетические ресурсы основных лесообразующих пород к настоящему времени на территории бывшего СССР исследованы достаточно детально (Крутовский и др., 1989; Гоичаренко, 2001; Падутов, 2001; Потенко, 2004; Политов, 2007 и др.). Однако изучению генетических ресурсов искусственных насаждений посвящено гораздо меньше исследований (Шигапов и др., 1996; Авров, 2001; Коршиков и др., 2010). К тому же основная часть этих работ выполнена с применением в качестве маркеров изоферментов, имеющих ряд методологических и методических ограничений (Сулимова, 2004). Современные генетические маркеры и методы в популяционно-генетических исследованиях древесных растений в России (по сравнению с зарубежными странами) применяются крайне редко (Семериков, 2007; Боронникова, 2009; Bushbom et al, 2011).

Сосна обыкновенная (Pinns sylvestris L.) - один из наиболее широко распространенных экономически важных лесообразующих видов России, играющий исключительно важную роль в формировании структуры и функций лесных экосистем (Тараканов, 2003). В европейской части России более 65 % работ по созданию объектов единого генетико-селекционного комплекса (ЕГСК) приходится на сосну обыкновенную (Прохорова и др., 2008; Ефимов, 2010). Традиционными в лесной генетике и селекции являются пути, основанные на изучении географических культур и использовании плюсовой селекции (Видякин, 2008). Однако они не учитывают исторически сложившуюся генетическую структуру природных популяций древесных видов и необходимость сохранения и воспроизводства генетических ресурсов в условиях ex silu (Политов, 2007). По этой причине генетические исследования объектов ЕГСК, основанные на применении современных эффективных методов генетического анализа и сравнении полученных оценок с генофондом природных популяций, представляются актуальными. Они позволят оценить эффективность селекционных и лесовосстановительных мероприятий, организовать мониторинг динамики генофондов.

/! ■7

ISSR-анализ генетического полиморфизма, основанный на ПЦР, включает амплификацию фрагментов ДНК, находящихся между двумя близко расположенными микросателлитными последовательностями (Zietkiewicz et al., 1994). Данный сравнительно простой и воспроизводимый метод имеет ряд преимуществ: позволяет анализировать одновременно до 150 локусов в геноме (Reddy et а!., 2002) и по уровню выявляемого полиморфизма не уступает RFLP-маркерам (Nagaoka, Ogihara, 1997). Он находит широкое применение в областях генетики, связанных с изучением биоразнообразия, картированием геномов, определением генетического сходства особей и сортов, мониторингом генетического разнообразия при различных манипуляциях и т.д. (Reddy et al., 2002; Rakoczy-Trojanowska, 2004). ISSR-анализ, использованный для изучения геномов широкого круга растений, в том числе, древесных (Боронникова и др., 2009), для сосны обыкновенной ранее практически не использовался. Одна из основных причин этому - трудности при выделении ДНК из древесины и хвои -тканей, богатых у данного вида вторичными метаболитами, инактивирующими нуклеиновые кислоты (Ganopoulos et al, 2013).

На основании вышесказанного были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования — разработка молекулярных ISSR-PCR маркеров и анализ генетического полиморфизма сосны обыкновенной на объектах единого генетико-селекционного комплекса.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать методику ISSR-анализа ДНК сосны обыкновенной из хвои и древесины для оценки ее внутривидового генетического полиморфизма.

2. Провести анализ генетической изменчивости деревьев сосны обыкновенной различных селекционных категорий.

3. Провести сравнительный анализ генетического разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных географических районов.

Научная новизна работы. Разработана методика ISSR-PCR анализа для оценки генетического полиморфизма сосны обыкновенной. Показана информативность в этих целях 6-ти полиморфных ISSR-праймеров, ранее

использованных для генетического анализа растений других таксонов. Получены оценки генетического разнообразия плюсового насаждения сосны обыкновенной в Республике Марий Эл и различий в полиморфизме ДНК деревьев разных селекционных категорий. Впервые проанализирован уровень генетического разнообразия и степень генетической дифференциации групп плюсовых деревьев сосны обыкновенной из Республики Марий Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей.

Научно-практическая значимость работы. Создан программный модуль для анализа и обработки изображений фрагментов ДНК на электрофореграммах, получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ Biolmage Geles PCR Analysis v. 1.0. Разработанная методика анализа генетического полиморфизма сосны обыкновенной по ISSR-маркерам может быть рекомендована к использованию для оценки генофонда популяций данного вида, при разработке лесосеменного районирования на генетической основе, для мониторинга эффективности селекционных и лесовосстановительных мероприятий, при проведении экспертиз по идентификации растений сосны в криминалистических лабораториях. Данные о генетической изменчивости плюсового насаждения в Республике Марий Эл и плюсовых деревьев сосны обыкновенной с идентифицированными генотипами из Республики Марий Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей могут быть использованы при разработке научно-обоснованных программ создания и эксплуатации объектов ЕГСК в Среднем Поволжье. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при проведении учебных занятий по направлению «Лесное дело» в вузах, а также на курсах повышения квалификации работников лесного хозяйства.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международной научной студенческой конференции по естественным и техническим дисциплинам «Научному прогрессу - творчество молодых» (г. Йошкар-Ола, 2007-2011), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Д. Данилова «Современные проблемы теории и практики лесного хозяйства» (Йошкар-Ола,

2008), Международной научной конференции «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2009, 2011), III Российском форуме «Российским инновациям - российский капитал», (Ижевск, 2010), Всероссийском молодежном образовательном форуме «Селигер -2010» (Селигер, 2010), Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2010), Международной конференции с элементами научной школы для молодёжи «Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг иадаптационные технологии» (Йошкар-Ола, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), Постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием «Вавиловские чтения» (Йошкар-Ола, 2010, 2011), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), 3-м международном совещании «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири» (Красноярск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования» (Йошкар-Ола, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. 3 - в рецензируемых журналах из перечня ВАК. Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ.

Личный вклад заключается во включенном участии автора на всех этапах выполнения диссертационной работы, в т.ч. при постановке цели и задач, анализе литературных данных, разработке программы и методики исследований, первичном сборе экспериментального материала, выполнении лабораторных исследований, написании и оформлении диссертации, апробации полученных данных на научных форумах различного уровня. Подготовка публикаций и программы для ЭВМ выполнена лично или при активном участии автора.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по направлению 1.3.2 «Проведение научных исследований целевыми

аспирантами» (ГК № 14.740.11.0458 от 01.10.2010 г. «Оценка генетического полиморфизма деревьев хвойных видов, отличающихся по селекционным категориям и географическому происхождению, на основе использования молекулярных маркеров»; Соглашение № 14.132.21.1767 от 15.10.2012 г. «Проведение исследований по оценке возможности использования ISSR-маркеров для генетической идентификации, паспортизации и сертификации растительного сырья»), а также Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках личного гранта по программе УМНИК (2009 г.) «Метод ДНК-маркеров для выявления фактов несанкционированных заготовок древесины».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 26 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 149 источников.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований являлась сосна обыкновенная на объектах ЕГСК (архив клонов, плюсовое насаждение, лесосеменные плантации) из регионов Среднего Поволжья - Республики Марий Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей. Всего для определения параметров генетического полиморфизма и генетической дифференциации были идентифицированы генотипы 187 деревьев сосны обыкновенной.

Для лабораторных исследований отбирали образцы хвои и древесины. Всего было проведено более 3000 реакций ПЦР, получены более 250 препаратов ДНК сосны обыкновенной. При выделении суммарной ДНК за основу брали модифицированный нами протокол с применением СТАВ-буфера (Doyle and, Doyle, 1987). Для проведения ПЦР использовали набор реактивов «Encyclo PCR kit» (Evrogen). Использованы 6 полиморфных ISSR-праймеров: (CA)6RY, (CA)6AG, (CA)6GT, (CA)6AC, (AG)„T, (AG)8YT (Wolfe, 1998; Li et al, 2005). Реакции проводили в тонкостенных пробирках объемом 200 мкл на

амплификаторе MJ Mini™ Gradient Thermal Cycler (BIO-RAD, США). Разделение ДНК проводили в агарозных гелях с концентрацией агарозы 1,5 % в электрофорезной камере PowerPac™ Universal (BIO-RAD, США) в TBE буфере (0,89 М Трис-ОН, 0,89 М борная кислота, 50 мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия в течение 3-3,5 часов при напряженности электрического поля 70 V. В качестве красителя использовали бромфеноловый синий. Визуализацию ДНК, обработку и анализ полученных изображений проводили с помощью системы гель-документации GelDoc 2000 (BIO-RAD) с использованием программного пакета Quantity One® v. 4.6.3. В качестве стандарта использовали ДНК-маркер 100Ьр+1,5кЬ+3,0кЬ (СибЭнзим, Россия). ISSR-профили анализировались по наличию (1) или отсутствию (0) полос на геле. Для создания матрицы использовали программу собственной разработки Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0. Математическую обработку данных проводили в среде POPGENE v. 1.32 (Yeh, 1997) и Statistica 8.0. Полученные частоты ISSR-фрагментов использовались для оценки основных параметров генетической изменчивости деревьев сосны: эффективного числа аллелей (NJ, общего генетического разнообразия (Н) и индекса Шеннона (I) (Lewontin, 1972; Kimura, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация методики ISSR-анализа для оценки генетического полиморфизма сосны обыкновенной.

Для выбора оптимального метода разрушения клеточных структур сосны обыкновенной при экстракции ДНК сравнивались 3 варианта: с использованием жидкого азота, простого механического растирания и разрушения тканей с использованием гомогенизатора. Наилучшим был признан последний метод (рис. 1). При этом были получены препараты ДНК, превосходящие по качеству альтернативные варианты. В случае с использованием в качестве источника ДНК древесины только данный метод позволил получить препараты ДНК сосны обыкновенной удовлетворительного качества. Если источником ДНК является хвоя, можно также рекомендовать метод разрушения клеточных структур с

использованием жидкого азота. Метод простого механического растирания в присутствии экстрагирующего буфера оказался малоэффективным.

а) б)

Рис. 1. Результаты пробных ПЦР с препаратами ДНК, полученными из древесины (а) и хвои (б) с применением гомогенизатора

Для решения поставленных задач нами для сосны обыкновенной сравнивалась эффективность и информативность 17-ти праймеров, которые ранее применялись в исследованиях как данного вида (Li et al, 2005), так и растений других таксономических групп (Wolfe, 1998). Было выявлено, что описанные в литературе условия проведения ПЦР не были удовлетворительны. По этой причине нами экспериментальным путем была подобрана температура отжига (Та). Показано, что число амплифицированных участков и их размер меняются в зависимости от выбранной температуры отжига праймеров (рис. 2).

Рис. 2. Подбор оптимальной температуры отжига для праймера (АО)8УТ при амплификации ДНК сосны обыкновенной: 1 -4 - номера образцов ДНК, 50-65 -температура отжига °С, М - маркер молекулярных размеров (СибЭнзим,

100Ьр+3,0кЬ)

После оценки изображений были установлены оптимальные режимы температуры отжига (Та) для тестируемых ШЭК-праймеров. Отобранные для

дальнейших исследований праймеры (табл.1) характеризуются наиболее интерпретируемыми и воспроизводимыми результатами.

Таблица 1

Оптимальные температуры отжига праймеров (Т0)

№ Праймер Секвиенс Расчетная температура отжига, °C Опытная температура отжига, °С

4 (CA)6RY CACACACACACAATGC 48 60

5 (CA)6AG CACACACACACAAGG 46 60

6 (CA)6GT CACACACACACAGT 42 60

7 (СА)бАС CACACACACACAAC 58 60

11 (AG)8T AGAGAGAGAGAGAGAGT 50 60

14 (AG)8YT AGAGAGAGAGAGAGAGGCT 42 65

Для повышения точности и скорости обработки изображений ISSR-анализа был разработан программный модуль Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0. Изображения содержат аддитивную и мультипликативную составляющую шума (Гонсалес, 2005), поэтому они могут быть представлены математической моделью:

g(x,y)=f(x,y)i(x,y)+<j(x,y)+c, (1)

где т(х,у) - мультипликативная составляющая, а(х,у) - аддитивная составляющая и

с - постоянная шума.

После устранения всех видов шумов можно перейти к синтезу алгоритма нахождения основных объектов на изображении. К таким объектам относятся координаты начала и конца всех слотов, а также координаты маркеров. Усреднение яркостей вдоль высоты изображения позволяет получить точные горизонтальные координаты всех ампликонов (рис. 3).

45 «о

Х- .:....;. - . . ....... .... . ....................................

10

5 • • ■ ...... - • • .........................................

50 100 ISO 300 ?S0 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1 ООО 1 OSO 1 100 1 150

Рис. 3. Принцип работы программного модуля Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0.

10

Вертикальные координаты задаются оператором в диалоговом режиме, поскольку таких значений всего два. Таким образом, получаются пространственные координаты начала - А(х,у) и конца - В(х,у) для каждого ампликона.

Далее в программном комплексе реализован инструментарий, который позволяет зарегистрировать и сформировать данные для последующего анализа, при минимизации человеко-машинных операций. Программа позволяет в интерактивном режиме относить фрагменты к той или иной линии. При этом автоматически фиксируется положение «О», или «1» и ведется подсчет молекулярного размера линии. В результате мы получаем матрицу, которая в дальнейшем используется для подсчета показателей генетической изменчивости, кластерного анализа и построения популяционной структуры анализируемых растений (рис. 4).

1: 1 X 1: X: X: X: X: X: X: X: X: X: X: X: X: X 502,222

X: 1 1 1: X: X: 0: X: X: X: X: X: X: X: X: X: X 425,4X8

1: 1 1 1: X: X; X: X; X: X: X: X: X: X: X: X: X 361,603

1: 1 1 1: х-. X: 1-. X: X: X: X: X: X: X: X: X: X 627,632

1: 1 1 0: 1: 0: X: X: X: X: X: X: 0: X: 0: 0: X 1099,249

0: 1 1 1: X: X: X: X: X: X: X: X: 0: X: X: X: X 950,62Х

1: 1 1 1: 1: X: X: X: 0: 0: X: X: 0: 0: X: X: X 858,565

1: Д 1 X: 0: X: 0: X: X: X: X: х-. 0: X: 0: 0: X 72?,08

0: X 1 1: X: 0: X: X: X: X: X: X: X: X: X: 0: X 790,054

1: X 1 X: X: X: X: X: X: X: 0: X: X: X: 0: 0: 0 2X1,566

1: 0 1 0: 0: 0: X: 0: X: X: 0: X: X: X: 0: 0: 0 341,799

0: 0 1 X: 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: X: 0: 0: 0 227,67Х

1: 0 X 0: 0: X: 1: 0: 0: 0: 0: 0: 0: X: 0: 0: 0 207,67

0: 1 0 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0; 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0 163,9X7

0: 0 0 0: 0: X: 0: 0: X: 0: 0: 0: X: X: X: X: X 222,9

0: 0 0 0: 0: 0: X: 0: 0: 0: 0: X: X: 0: 0: 0: 0 252.4X2

0: 0 0 0: 0: 0: X: 0: 0: X: X: 0: X: 0: 0: 0: 0 40Х.989

0: 0 0 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: 0: X: 0: X: 0 Х085,349

0: 0 1 1: 0: 1: 1: X: X: X г X: 0: X: X: X: X: X 576,942

0: 0 1 X: X: X: 0: X: 0: 0: 0: X: X: 0: 0: 1: 0 541,Х29

Рис. 4. Результат анализа изображения с применением программного модуля Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0.

Таким образом, разработаны алгоритмы и программный инструментарий для анализа и обработки изображений в генетических исследованиях (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2012619172 Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0 от 11.10.2012 г.). Данная программа обеспечивает быструю и эффективную обработку больших массивов данных по цифровым изображениям электрофоретического разделения продуктов полимеразной цепной реакции. Нами сделана оценка, показавшая, что использование данного модуля позволяет

повысить точность обработки изображений в среднем в 1,5-2 раза, по сравнению с существующими на данный момент подходами.

ISSR-анализ выборок сосны обыкновенной различных селекционных

категорий

Всего с использованием шести ISSR-праймеров было получено 178 ампликонов, из них 168 оказались полиморфными, что составляет 94 % от общего их количества. Используемые праймеры позволили идентифицировать от 24 до 35 ампликонов, длины фрагментов ДНК варьировали от 140 до 2500 пар нуклеотидов (табл. 2).

Таблица 2

Результаты lSSR-анализа деревьев сосны разных селекционных категорий

Праймеры Количество фрагментов ДНК Длины амплифицируемых фрагментов, п.н.

Всего Полиморфных

(CA)6RY 24 22 205, 240, 265, 300, 340, 370, 385,405, 430, 455, 530, 580, 610, 665, 770, 830, 870, 910, 1015, 1175, 1225, 1265, 1450, 1510

(CA)6AG 32 29 210, 250, 265, 285, 325, 340, 360,390, 410, 435,460,480, 500, 540,590, 615, 635, 670, 700, 745, 785, 830, 870, 940, 1000, 1055, 1120, 1200, 1370, 1700, 2030, 2500

(CA)6GT 28 28 140, 190, 260, 280, 300, 315, 364, 390, 400, 430, 440,465,485, 510, 555, 585, 640, 710, 780, 810, 860, 990, 1050, 1210, 1300, 1460, 1860,2150

(СА)бАС 35 32 220, 300, 365, 375, 390,410, 420,445, 460, 470, 515, 555, 580, 600, 620, 640, 670, 690, 715, 760, 850, 900, 995, 1005, 1040, 1080, 1190, 1250, 1350, 1430, 1600, 1760, 1820, 2350, 2480

(AG)8T 27 26 185, 300, 315, 330, 340, 345, 410,420,430, 465, 515, 540,570, 575, 625, 650, 690, 725, 740, 785, 850, 960, 1115, 1140, 1185, 1210, 1260

(AG)sYT 32 31 160, 175, 210, 245, 260, 280, 295, 320, 335, 345, 365, 390,410,445,455, 475,490, 520, 565, 585, 630, 635, 660, 695, 720, 735, 750, 780,860,980,1000,1070 |

Примечание: жирным шрифтом обозначены мономорфные фрагменты ДНК

12

В таблице 3 приведены значения основных параметров генетической изменчивости выборок сосны (эффективное число аллелей - общее генетическое разнообразие - Я, индекс Шеннона - Г), рассчитанные на основе полученных частот 188К-фрагментов. Для сравнительного анализа здесь же приведены данные для архива клонов, находящегося в Республике Марий Эл.

Таблица 3

Основные параметры генетической изменчивости деревьев сосны

Селекционные категории деревьев Показатели

Ые Н /

Минусовые 1,380 0,236 0,367

Нормальные 1,415 0,259 0,402

Плюсовые 1,386 0,242 0,378

В целом для насаждения 1,427 0,274 0,430

Архив клонов в Республике Марий Эл 1,405 0,257 0,407

Все показатели в целом (табл. 3) для насаждения оказались выше, чем при подсчете отдельно по группам деревьев. Наивысшие значения параметров генетической изменчивости характерны для нормальных деревьев, низшие - для минусовых. Плюсовые деревья по данным показателям занимают среднее положение. В целом уровень генетической изменчивости плюсового насаждения превышает уровень генетической изменчивости плюсовых деревьев в архиве клонов. То есть можно предположить, что генетическое разнообразие изученного насаждения не уступает уровню генетической изменчивости на видовом уровне в Среднем Поволжье, так как на архиве клонов представлены плюсовые деревья из нескольких областей этого региона.

Для оценки степени генетической дифференциации деревьев разных селекционных категорий была рассчитана генетическая дистанция (табл. 4).

Таблица 4

Генетическая дистанция по Ые1 (под диагональю) и генетическая идентичность

(над диагональю) групп деревьев разных селекционных категорий

Селекционные категории Минусовые деревья Нормальные деревья Плюсовые деревья

Минусовые деревья - 0,962 0,921

Нормальные деревья 0,038 - 0,949

Плюсовые деревья 0,082 0,052 -

Все три группы деревьев генетически дифференцированы друг от друга, при этом наибольшая генетическая дистанция наблюдается между минусовыми и плюсовыми деревьями (0,082), а наименьшая - между минусовыми и нормальными (0,038).

На основании невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (иРвМА) была построена деидрограмма (рис. 5).

Минусовые деревья Нормальные деревья Плюсовые деревья

0.10

Рис. 5 Дендрограмма, построенная на основании коэффициентов генетической дистанции Нея, показывающая степень генетической дифференциации селекционных групп Р. sylvestris L.

Достоверные различия между показателями генетической изменчивости изученных групп деревьев разных селекционных категорий установлены не были. При этом из 178 полученных фрагментов ДНК не были выявлены ампликоны, присутствующие только в одной группе и отсутствующие в других. Другими словами, маркеры, которые были бы идентифицирующими для какой-либо селекционной категории деревьев, не были обнаружены.

На генетическую неоднородность растений внутри выделенных селекционных категорий указывает значение индекса Gst, который составляет 0,103. Это говорит о том, что 89,7 % генетической изменчивости по ISSR фрагментам ДНК находится внутри групп, а доля межвыброчной составляющей генетической изменчивости составляет всего 10,3 %.

^БК-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной из различных географических районов

В таблице 5 приводится сравнительная оценка генетического полиморфизма 98 плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных регионов Среднего Поволжья (Кировская область, Республика Марий Эл, Пензенская область, Чувашская Республика).

Таблица 5

Результаты 188Я-анализа плюсовых деревьев из различных географических

районов

Праймеры Ь фра Всего Соличество гментов ДНК Полиморфных Длины амплифицируемых фрагментов, п.н.

(CA)6RY 33 30 165, 190, 210, 225, 240, 300, 315, 335, 350, 370, 380,410, 430, 450, 480, 520, 550, 580, 610, 650, 670, 720, 760, 800, 850, 880, 1000, 1060, 1150, 1190, 1210, 1260, 1460

(CA)6AG 30 26 190, 200, 240, 260, 280, 310, 330, 350, 370, 390,420,480, 520, 570, 610, 650, 690, 740, 780, 830, 870, 940, 990, 1060, 1130, 1160, 1200, 1330, 1480, 1800

(CA)6GT 26 24 140, 190, 250, 270, 300, 350, 380, 410, 440, 480, 500, 540, 570, 610, 630, 670, 710, 760, 840, 890,970, 1020, 1170, 1250, 1380, 1800

(СА)6АС 31 27 150, 170, 210, 230, 250, 270, 300, 330, 370, 410,430,450, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 660, 710, 760, 830, 880, 970, 1030, 1180, 1300, 1440,1580, ¡780, 1840

(AG)8T 22 18 170, 240, 290, 310, 320, 340,400, 410, 450, 490,530, 570, 610, 660, 700, 760, 820, 930, 1060, 1150, 1200 1280

(AG)8YT 37 36 130, 140, 170, 190, 210, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 390, 420,440,460,490, 530, 570, 600,640, 690, 730, 770, 800, 860, 890, 960, 1030, 1090, 1150, 1220, 1350, 1380, 1540, 1720, 2300

Примечание: жирным шрифтом обозначены мономорфные фрагменты ДНК

Используемые праймеры позволили идентифицировать широкий диапазон разнообразия ^Я-фрагментов ДНК исследуемых групп деревьев. Количество

ампликонов варьировало от 22 до 37, а длины фрагментов ДНК - от 130 до 2300 пар нуклеотидов. Общее число полученных локусов составило 179, из которых 90 % (161) оказались полиморфными.

Далее были рассчитаны частоты встречаемости аллелей обнаруженных локусов для анализируемых совокупностей плюсовых деревьев из разных географических районов (табл. 6).

Таблица 6

Основные параметры генетической изменчивости плюсовых деревьев сосны

Регионы Показатели

Н I

Кировская область 1,346 0,205 0,309

Республика Марий Эл 1,334 0,199 0,302

Пензенская область 1,435 0,256 0,384

Чувашская Республика 1,447 0,260 0,387

В целом для анализируемых регионов 1,489 0,297 0,453

Плюсовое насаждение в Республике Марий Эл 1,427 0,274 0,430

Наивысшие значения параметров генетической изменчивости характерны для плюсовых деревьев из Чувашской Республики (Ые = 1,447, Н = 0,260, I = 0,387). Самые низкие показатели генетического разнообразия характерны для плюсовых деревьев из Республики Марий Эл, у которых данные параметры составили 1,334, 1,991 и 0,302 соответственно. В целом для всей объединенной выборки плюсовых деревьев значения параметров оказались выше, чем для групп, в пределах отдельных регионов.

Если сравнить полученные данные по параметрам генетической изменчивости с плюсовым насаждением в Республике Марий Эл, то в целом можно увидеть, что уровень генетической изменчивости плюсового насаждения превышает уровень генетической изменчивости плюсовых деревьев по отдельно взятым регионам. В то же время значения параметров для всей совокупности плюсовых деревьев превышают значения, полученные для плюсового насаждения.

Для оценки степени генетической дифференциации плюсовых деревьев из разных географических районов была рассчитана генетическая дистанция (табл. 7) и на основании невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (ЦРОМА) была построена дендрограмма (рис. 6).

Таблица 7

Генетическая дистанция по (под диагональю) и генетическая идентичность (над диагональю) групп деревьев из различных географических районов

Регионы Кировская область Республика Марий Эл Пензенская область Чувашская Республика

Кировская область - 0,976 0,871 0,868

Республика Марий Эл 0,024 - 0,894 0,875

Пензенская область 0,139 0,113 - 0,903

Чувашская Республика 0,141 0,134 0,102 -

Было установлено, что все четыре группы плюсовых деревьев генетически существенно дифференцированы друг от друга. Но статистически достоверных различий между показателями генетической изменчивости изучаемых групп деревьев выявлено fie было. Наибольшая генетическая дистанция наблюдается между плюсовыми деревьями из Чувашской Республики и из Кировской области (0,141), а наименьшая - между деревьями из Республики Марий Эл и Кировской области (0,024). Эти уровни выше, чем показано в научной литературе для природных популяций сосны обыкновенной при изучении их генетической дифференциации. Следовательно, при использовании их семян для создания лесных культур следует прогнозировать усиление генетической подразделенное™ новых лесов.

^ - Кировская область

2 ~ Республика Марий Эл

2 ----Пензенская область

———- Чувашская Республика

015 0,10 0,05 о

Рис. 6. Дендро1рамма, построенная на основании коэффициентов генетической дистанции Нея, показывающая степень генетической дифференциации плюсовых деревьев из разных регионов

Расчет показателя генетической дифференциации изученных групп плюсовых деревьев (GST) показал, что доля межгрупповой компоненты

17

генетической изменчивости составляет 0,204, и, следовательно, основная доля генетического полиморфизма находится внутри групп (79,6 %).

Анализируя дендрограмму (рис. 6), можно также увидеть, что исследованные группы плюсовых деревьев разделяются на два кластера. В первую из них входят деревья из Кировской области и Республики Марий Эл, во вторую -деревья из Пензенской области и Чувашской Республики. Возможно, это объясняется тем, что регионы первой и второй групп находятся на разных берегах р. Волги, что в свою очередь обусловило длительное развитие популяций без влияния друг на друга, что и выражено в их значительной генетической дифференциации.

Для плюсовых деревьев из Пензенской области и Чувашской Республики были обнаружены ^БЯ-фрагменты, которые не идентифицированы у остальных изучаемых групп (табл. 8). Для плюсовых деревьев из Кировской области и Республики Марий Эл таких специфических фрагментов обнаружено не было. Эти фрагменты ДНК могут быть маркерными для определенных географических районов.

Таблица 8

Фрагменты ДНК, соответствующие определенным регионам

Праймеры гаБЯ фрагменты ДНК, п.н. / частота встречаемости фрагмента в % от объема выборки

Кировская область Республика Марий Эл Пензенская область Чувашская Республика

(СА)6КУ - - - 1210/41,4

(СА)6АС - - 200/47,1 830/65,5

(СА)6ОТ - - 610/94,1 1800/55,2

(СА)&АС - - 170/67,6 230/70,6 270/67,6 -

(АО)8Т - - - -

(АС)8УТ - - 1350/47,1 420/58,6; 890/44,8

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что для фрагментного ^БЯ-анализа сосны обыкновенной информативно использование 6-ти праймеров - ((СА)611У, (СА)бАО, (СА)бО'Г, (СА)6АС, (АО)8Т, (АО)8УТ). Экспериментально подобранные

18

температуры отжига позволяют амплифицировать около 180 lSSR-фрагментов ДНК, более 90% из которых являются полиморфными.

2. Разработанная программа анализа и обработки изображений в генетических исследованиях Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0 позволяет повысить точность и снизить трудоемкость работ при анализе электрофореграмм и рекомендуется к использованию при различных видах фрагментного анализа (ISSR, RAPD, DAF и 1RAP).

3. Не выявлены статистически достоверные различия у групп плюсовых деревьев из разных географических районов по уровню генетической изменчивости. В целом для всей анализируемой совокупности плюсовых деревьев значение параметров оказались выше, чем в группах из отдельных регионов. Наивысшие значения параметров генетической изменчивости характерны для плюсовых деревьев из Чувашской Республики, для которых эффективное число аллелей составило 1,447, общее генетическое разнообразие - 0,260, и индекс Шеннона - 0,387. Самые низкие показатели генетического разнообразия характерны для плюсовых деревьев из Республики Марий Эл, у которых данные параметры составили 1,334; 1,991 и 0,302 соответственно.

4. Деревья разных селекционных категорий имеют сопоставимый уровень генетического разнообразия: эффективное число аллелей варьирует от 1,380 до 1,420, общее генетическое разнообразие по Нею от 0,236 до 0,260, индекс Шеннона от 0,367 до 0,402. Следовательно, раздельный сбор и использование семенного материала плюсовых, нормальных и минусов ых деревьев в лесокультурных целях не приведет к существенному изменению генофонда природных популяций в условиях exsitu.

5. Наибольшая часть генетической изменчивости lSSR-фрагментов ДНК относится к ее внутривыборочной комоненте (89,7% для деревьев разной селекционной категории и 79,6% для плюсовых деревьев из разных районов). Генетическая дифференциация между выборками плюсовых деревьев из удаленных географических районов выражена в большей степени. Наибольшая генетическая дистанция наблюдается между группами плюсовых деревьев из Чувашской Республики и Пензенской области (0,141), а наименьшая - между

деревьями из Республики Марий Эл и Кировской области (0,024). Этот результат представляет интерес для уточнения лесосеменного районирования с учетом генетических данных и для учета при обмене между регионами семенным материалом из объектов ЕГСК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Новиков, П.С. Изменчивость плюсовых деревьев сосны обыкновенной на архиве клонов по ISSR-маркерам / П.С. Новиков, О.В. Шейкина, Т.Н. Милютина // Вестник МарГТУ. Серия «Лес. Экология. Природопользование», 2011, №3 (13), С. 82-87.

2. Новиков П.С. ISSR-анализ деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) различных селекционных категорий / П.С. Новиков, О.В. Шейкина // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2012. - №08(82). - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/08/pdf765.pdf, 0,750 у.п.л.

3. Милютина, Т.Н. Молекулярно-генетические исследования изменчивости клонов плюсовых деревьев Pinus sylvestris L. по ISSR-маркерам / Т.Н. Милютина, О.В. Шейкина, П.С. Новиков // Хвойные бореалыюй зоны. -2013,-Т. 31. .-№1-2. С. 102-105.

Патенты и изобретения

1. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ. Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0 / Ю.А. Ипатов, П.С. Новиков, P.B. Сергеев, А.И. Шургин, О.В. Шейкина; заявитель и патентообладатель Поволжский государственный технологический университет. - №2012619172, заявл. 20.08.2012 г.; опубл. 11.10.2012 г. Публикации в других изданиях

1. Яковлева, A.A. Метод ДНК-маркеров для исследования уровня генетического разнообразия лесных популяций / A.A. Яковлева, П.С. Новиков, О.В. Шейкина // Научному прогрессу - творчество молодых: сборник материалов Международной научной студенческой конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам: в 3 ч. - Ч. 2. - Йошкар-Ола: МарГТУ, 2010. -С. 342343.

2. Новиков, П.С. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны на архиве клонов / П.С. Новиков, Т.Н. Милютина, О.В. Шейкина // Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг и адаптационные технологии: материалы международной конференции с элементами научной школы для молодёжи [Электронный ресурс]. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, - 2010. url: http://csfm.marstu.net/publications.html- С. 100-104.

3. Милютина, Т.Н. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны на коллекционно-маточном участке / Т.Н. Милютина, П.С. Новиков, О.В. Шейкина // Лесные экосистемы в условиях изменения климата:

биологическая продуктивность, мониторинг и адаптационные технологии: материалы международной конференции с элементами научной школы для молодёжи [Электронный ресурс]. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, - 2010. url: http://csfrn.marstu.net/publications.html — С. 8184.

4. Милютина, Т.Н. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны обыкновенной / Т.Н. Милютина, П.С. Новиков, О.В. Шейкина // Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», Волгоград, 4-6 августа 2010 - Волгоград: Изд-во AVATARS, 2010.-С. 334-338.

5. Новиков, П.С. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) ISSR-маркерами / П.С. Новиков, Т.Н. Милютина, О.В. Шейкина // Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», Волгоград, 4-6 августа 2010 - Волгоград: Изд-во AVATARS, 2010. - С. 339-343.

6. Новиков, П.С. Метод ДНК-маркеров для выявления несанкционированных заготовок древесины / П.С. Новиков, A.B. Канарский // Ульяновский центр трансфера технологий: Сборник аннотаций проектов Молодежного инновационного форума Приволжского федерального округа (УлГТУ, 12-14 мая 2010 г.). -Ульяновск: УлГТУ, 2010. - С. 305-307.

7. Милютина, Т.Н. Генетическая паспортизация плюсовых деревьев Pinus sylvestris L. / Т.Н. Милютина, П.С. Новиков, О.В. Шейкина, // Россия в глобальном мире: вызовы и перспективы развития. Четырнадцатые Вавиловские чтения: материалы постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием: в 2 ч. / под общей редакцией проф. В.П. Шалаева. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, 2011. - Ч. 2. - С. 227-228.

8. Шейкина, О.В. Исследования генетической изменчивости плюсовых деревьев Pinus sylvestris L. ISSR-маркерами / О.В. Шейкина, П.С. Новиков, Т.Н. Милютина // VI московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы VI Московского международного конгресса, часть 1 (Москва, 21-25 марта, 2011 г.) М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2011 - С. 292.

9. Шейкина, О.В. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев ели на архиве клонов в республике Марий Эл / О.В. Шейкина, П.С. Новиков, Т.Н. Милютина // Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири. Материалы 3-го международного совещания 23-29 августа 2011 - Красноярск: Институт леса им. Сукачева СО РАН, 2011. - С. 150-151.

10. Новиков, П.С. Оптимизация проведения ПЦР-реакции при ISSR-анализе ДНК плюсовых деревьев сосны обыкновенной / П.С. Новиков, О.В. Шейкина, Т.Н. Милютина // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений: материалы XIV Международной научной конференции. -Красноярск: СибГТУ, 2011, - С. 79-81.

11. Шейкина, O.B. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев Pinus sylvestris L. на лесосеменной плантации в Пензенской области / О.В. Шейкина, Т.Н. Милютина, П.С. Новиков // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений: материалы XIV Международной научной конференции. - Красноярск: СибГТУ, 2011, - С. 127-130.

12. Новиков, П.С. Подбор ISSR-праймеров для фрагментного анализа ДНК сосны обыкновенной / П.С. Новиков, Т.Н. Милютина, О.В. Шейкина // Сборник материалов международной молодежной научной конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам «Научному прогрессу -творчество молодых», 15-16 апр. 2011: в 3 ч. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, 2011. - Ч. 3. -С. 35-36.

13. Милютина, Т.Н. ISSR-анализ, как метод изучения генетического разнообразия сосны обыкновенной / Т.Н. Милютина, П.С. Новиков, О.В. Шейкина // Сборник материалов международной молодежной научной конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам «Научному прогрессу - творчество молодых», 15-16 апр. 2011: в 3 ч. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, 2011. - Ч. 3. -С. 35-36.

14. Новиков, П. С. ISSR-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной из различных географических районов / П. С. Новиков, О. В. Шейкина // Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования: сборник статей - Йошкар-Ола: Поволжский государственный технологический университет, 2013. -с. 249-253.

15. Ипатов, Ю. А. Создание автоматизированной системы анализа изображений полимеразной цепной реакции / Ю. А. Ипатов, П. С. Новиков, А.И. Шургин // Информационные технологии в профессиональной деятельности и научной работе: сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: в 2 ч. - Йошкар-Ола: Поволжский государственный технологический университет, 2013. -с. 23-27.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ DAF— DNA amplification fingerprint; IRAP - Inter Retrotransposone Amplified Polymoxphism; ISSR- Inter Simple Sequence Repeats; PCR (ПЦР) - Полимеразная цепная реакция; RAPD - Random amplified polymorphic DNA; RFLP - Restriction fragment length polymorphism; UPGMA - Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages; ЕГСК - Единый генетико-селекционный комплекс; СТАВ - Цетилтриметиламмоний бромид;

УМНИК - Конкурс молодежных научных инновационных проектов; ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота.

Подписано в печать 22.11.2013. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 5249.

Редакционно-издательский центр Поволжского государственного технологического университета 424006 Йошкар-Ола, ул. Панфилова, 17

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новиков, Петр Сергеевич, Уфа

ПОВОЛЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

Новиков Петр Сергеевич

ПРИМЕНЕНИЕ ^И-РС!* МАРКЕРОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВНУТРИВИДОВОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ НА ОБЪЕКТАХ ЕДИНОГО ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННОГО КОМПЛЕКСА

Специальность: 03.02.07 - Генетика

1Т описи

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат

сельскохозяйственных наук, доцент

О.В. Шейкина

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................4

I. АНАШТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................10

1.1. Развитие молекулярно-генетических методов исследования

видов Pinus L...................................................................................................10

1.2. Основные направления исследований растений рода

Pinus L. с применением молекулярно-генетических маркеров....................13

1.3. Исследования в популяционной биологии сосны обыкновенной {Pinus sylvestris L.) на территории СНГ......................................................... 25

II. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................32

2.1. Объекты исследований...........................................................................32

2.2. Сбор и хранение образцов для анализа...................................................34

2.3. Выделение геномной ДНК растений для ПЦР анализа.........................34

2.4. Полимеразная цепная реакция.................................................................36

2.5. Электрофорез продуктов амплификации................................................37

2.6. Визуализация и математическая обработка данных ПЦР-анализа.......37

2.7. Объем исследований................................................................................38

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................39

3.1. Оптимизация методики ISSR-анализа для оценки

генетического полиморфизма сосны обыкновенной.................................... 39

3.1.1. Выбор оптимального метода разрушения клеточных структур ... 39

3.1.2 Подбор ISSR-праймеров для анализа генетического полиморфизма сосны обыкновенной..........................................................46

3.1.3 Разработка программного модуля Bioimage Geles PCR

Analysis v.l.0................................................................................................52

3.4 ^БЯ-анализ выборок сосны обыкновенной различных

селекционных категорий................................................................................57

3.5. ^БЯ-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной

из различных географических районов.........................................................65

ВЫВОДЫ...........................................................................................................74

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................76

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................77

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.......................95

ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................96

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Генетические ресурсы основных лесообразующих пород к настоящему времени на территории бывшего СССР исследованы достаточно детально (Крутовский и др., 1989; Путенихин, 2000; Гончаренко, 2001; Падутов, 2001; Потенко, 2004; Политов, 2007 и др.). Однако изучению генетических ресурсов искусственных насаждений посвящено гораздо меньше исследований (Шигапов и др., 1996; Авров, 2001; Коршиков и др., 2010). К тому же основная часть этих работ выполнена с применением в качестве маркеров изоферментов, имеющих ряд методологических и методических ограничений (Сулимова, 2004). Современные генетические маркеры и методы в популяционно-генетических исследованиях древесных растений в России (по сравнению с зарубежными странами) применяются крайне редко (Семериков, 2007; Боронникова, 2009; Bushbom et al., 2011).

Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) - один из наиболее широко распространенных экономически важных лесообразующих видов России, играющий исключительно важную роль в формировании структуры и

функций лесных экосистем (Тараканов, 2003). В европейской части России

/

более 65 % работ по созданию объектов единого генетико-селекционного

комплекса (ЕГСК) приходится на сосну обыкновенную (Прохорова и др.,

2008; Ефимов, 2010). Традиционными в лесной генетике и селекции

являются пути, основанные на изучении географических культур и

использовании плюсовой селекции (Видякин, 2008). Однако они не

учитывают исторически сложившуюся генетическую структуру природных

популяций древесных видов и необходимость сохранения и воспроизводства

генетических ресурсов в условиях ex situ (Политов, 2007). По этой причине

генетические исследования объектов ЕГСК, основанные на применении

современных эффективных методов генетического анализа и сравнении

полученных оценок с генофондом природных популяций, представляются

актуальными. Они позволят оценить эффективность селекционных и

4

лесовосстановительных мероприятий, организовать мониторинг динамики генофондов.

ISSR-анализ генетического полиморфизма, основанный на ПЦР, включает амплификацию фрагментов ДНК, находящихся между двумя близко расположенными микросателлитными последовательностями (Zietkiewicz et al, 1994). Данный сравнительно простой и воспроизводимый метод имеет ряд преимуществ: позволяет анализировать одновременно до 150 локусов в геноме (Reddy et al., 2002) и по уровню выявляемого полиморфизма не уступает RFLP-маркерам (Nagaoka, Ogihara, 1997). Он находит широкое применение в областях генетики, связанных с изучением биоразнообразия, картированием геномов, определением генетического сходства особей и сортов, мониторингом генетического разнообразия при различных манипуляциях и т.д. (Reddy et al., 2002; Rakoczy-Trojanowska, 2004). ISSR-анализ, используемый для изучения геномов широкого круга растений, в том числе древесных (Боронникова и др., 2009), для исследований сосны обыкновенной ранее практически не использовался. Одна из основных причин этому - трудности при выделении ДНК из древесины и хвои - тканей, богатых у данного вида вторичными метаболитами, инактивирующими нуклеиновые кислоты (Ganopoulos et al., 2013).

На основании вышесказанного были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - разработка молекулярных ISSR-PCR маркеров и анализ генетического полиморфизма сосны обыкновенной на объектах единого генетико-селекционного комплекса.

Задачи исследования:

1) оптимизировать методику ISSR-анализа ДНК сосны обыкновенной из хвои и древесины для оценки ее внутривидового генетического полиморфизма;

2) провести анализ генетической изменчивости деревьев сосны обыкновенной различных селекционных категорий;

3) провести сравнительный анализ генетического разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных географических районов;

Научная новизна работы. Разработана методика ISSR-PCR анализа для оценки генетического полиморфизма сосны обыкновенной. Показана информативность в этих целях шести полиморфных ISSR-праймеров, ранее использованных для генетического анализа растений других таксонов. Получены оценки генетического разнообразия плюсового насаждения сосны обыкновенной в Республике Марий Эл и различий в полиморфизме ДНК деревьев разных селекционных категорий. Впервые проанализированы уровень генетического разнообразия и степень генетической дифференциации групп плюсовых деревьев сосны обыкновенной из Республики Марий Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей.

Научно-практическая значимость работы. Создан программный

модуль для анализа и обработки изображений фрагментов ДНК на

электрофореграммах, получено свидетельство о государственной

регистрации программы для ЭВМ Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0.

Разработанная методика анализа генетического полиморфизма сосны

обыкновенной по ISSR-маркерам может быть рекомендована к

использованию для оценки генофонда популяций данного вида, при

разработке лесосеменного районирования на генетической основе, для

мониторинга эффективности селекционных и лесовосстановительных

мероприятий, при проведении экспертиз по идентификации растений сосны в

криминалистических лабораториях. Данные о генетической изменчивости

плюсового насаждения в Республике Марий Эл и плюсовых деревьев сосны

обыкновенной с идентифицированными генотипами из Республики Марий

Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей могут быть

использованы при разработке научно обоснованных программ создания и

6

эксплуатации объектов ЕГСК в Среднем Поволжье. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при проведении учебных занятий по направлению «Лесное дело» в вузах, а также на курсах повышения квалификации работников лесного хозяйства.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международной научной студенческой конференции по естественным и техническим дисциплинам «Научному прогрессу - творчество молодых» (г. Йошкар-Ола, 2007-2011), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Д. Данилова «Современные проблемы теории и практики лесного хозяйства» (Йошкар-Ола, 2008), Международной научной конференции «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2009, 2011), III Российском форуме «Российским инновациям - российский капитал», (Ижевск, 2010), Всероссийском молодежном образовательном форуме «Селигер - 2010» (Селигер, 2010), Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2010), Международной конференции с элементами научной школы для молодёжи «Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг и адаптационные технологии» (Йошкар-Ола, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), Постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием «Вавиловские чтения» (Йошкар-Ола, 2010, 2011), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), 3-м международном совещании «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири» (Красноярск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования» (Йошкар-Ола, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. 3 - в рецензируемых журналах из перечня ВАК. Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ.

Личный вклад заключается в активном участии автора на всех этапах выполнения диссертационной работы, в том числе при постановке цели и задач, анализе литературных данных, разработке программы и методики исследований, первичном сборе экспериментального материала, выполнении лабораторных исследований, написании и оформлении диссертации, апробации полученных данных на научных форумах различного уровня. Подготовка публикаций и программы для ЭВМ выполнена лично или при активном участии автора.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы по направлению 1.3.2 «Проведение научных исследований целевыми аспирантами» (ГК № 14.740.11.0458 от 01.10.2010 г. «Оценка генетического полиморфизма деревьев хвойных видов, отличающихся по селекционным категориям и географическому происхождению, на основе использования молекулярных маркеров»; Соглашение № 14.132.21.1767 от 15.10.2012 г. «Проведение исследований по оценке возможности использования 188К-маркеров для генетической идентификации, паспортизации и сертификации растительного сырья»), а также Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках личного гранта по программе УМНИК (2009 г.) «Метод ДНК-маркеров для выявления фактов несанкционированных заготовок древесины».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 26 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов

исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 149 источников.

I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Развитие молекулярно-генетических методов исследования

видов Pin us L.

С 80-х годов прошлого столетия в качестве генетических маркеров в популяционной генетике стали активно применяться изоферменты. Аллозимным исследованиям сосен посвящено достаточно много работ как иностранных авторов (Bergmann et al., 1995; Szmidt et al., 1996; Tani et al., 1998; Yu et al., 2000), так и исследователей из СНГ (Крутовский и др., 1987; Гончаренко и др., 1987; Духарев и др., 1987; Семериков и др., 1991; Белоконь и др., 1995; Потенко, 2004; Коршиков и др., 2005; Политов, 2007 и др.).

Начиная с 90-х годов XX века стали появляться сообщения об

исследованиях природных популяций Pinus L. с применением молекулярных

маркеров. Стали адаптироваться протоколы выделения геномной ДНК,

например для P. radiata на основе СТАВ-метода (Stange et al., 1998). Вначале

применялись RAPD-маркеры (Lu et al., 1995; Devey et al., 1996; Karhu et al.,

1996; Goto et al., 1998 и др.). Практически одновременно, но с меньшим

масштабом стали применяться ISSR-маркеры, например, при изучении

P. pumila из Японии (Tani et al., 1998), а также RFLP-маркеры для изучения

популяций Р. radiata D. Don и P. taeda L. в Австралии (Devey et al., 1996) и

Р. sylvestris в Финляндии (Karhu et al., 1996). В это же время появляются

сообщения об использовании микросателлитов (SSR-маркеров) в

популяционных исследованиях сосен, например Р. sylvestris L. в Италии на

Апеннинах (Scalfi et al., 1998). Позже появились публикации об

использовании AFLP-маркеров в популяционных исследованиях растений

рода Pinus L. (Lerceteau et al., 1999; Remington et al., 2010; Cuesta et al., 2010).

В некоторых работах вышеперечисленные типы маркеров были

использованы в комплексе (Szmidt et al., 1996; Newton et al., 2002; Zhang et

al., 2005; Li et al., 2008; Cuesta et al., 2010, и др.). Некоторые

микросателлитные праймеры разрабатывались для различных видов

растений - Salix reinii , P. densiflora и Robinia pseudoacacia (Chunlan et al.,

10

2001). Все эти типы маркеров применяются для исследований сосен и в настоящее время.

Для проведения филогенетических и филогеографических исследований широко применяются методы анализа митохондриальной и хлоропластной ДНК (Gernandt et al., 2005). Проводились исследования природных популяций Р. kesiya и Р. merkusii в Таиланде и Вьетнаме (Szmidt et al., 1996), Pinus L. подвида Trifoliae в Северной и Центральной Америке и на Карибских островах (Hernández-León et al., 2013), Р. ponderosa тихоокеанских и горных Rocky Mountain популяций (Potter et al., 2013), Р. contorta в Северной Америке (Lesser et al., 2012), Р. sylvestrys вар. mongolica и Р. densiflora в северо-восточном Китае (Ren et al., 2012), Р. koraiensis в популяциях всей северо-восточной Азии (Aizawa et al., 2012), Р. pinaster на Пиренейском полуострове (Salvador et al., 2000; González-Martínez

с

et al., 2001). Филогеографические исследования i3, sylvestris L. с применением молекулярных маркеров осуществлялись и в России (Видякин и др., 2012).

В последнее время все больше уделяется внимание EST- и QTL-маркерам, с применением которых можно исследовать количественные признаки (Zhou et al., 2012; Yang et al., 2013). Исследования деревьев Р. Taeda L. выявили сильные стороны метода оценки геномных отношений, что позволяет методу стать мощным инструментом в лесной селекции (Zapata-Valenzuela et al., 2013). Развитие получают исследования TRNL-интрона и HRM-маркеров для быстрого и точного таксономического определения видов растений и их гибридов (Ganopoulos et al., 2013). Активно изучается связь генетических маркеров с фенотипическими признаками (Abrahamsson et al., 2013). Ведутся исследования по генетическому картированию сосен Р. koraiensis (Chen et al., 2010), Р. elliottii и Р. caribaea вар. hondurensis (Yang et al., 2013), P. taeda L. в Китае (Remington et al., 2010). Также ведутся работы по секвенированию генома сосен (Neves et al., 2013).

В некоторых работах приводится сравнительный анализ различных

типов маркеров для применения их в молекулярно-генетических

11

исследованиях сосен. В ходе исследований P. squamata, проведенных в Китае, с использованием RAPD- и ISSR-маркеров, оказалось, что разные типы маркеров показывают неодинаковую (Gst (RAPD) = 0,011, Gsr (IS SR) = 0,024) степень генетической дифференциации между субпопуляциями (Zhang et al., 2005). Исследования сосны обыкновенной в Финляндии показали, что все типы маркеров (изоферменты, RFLP, RAPD и SSR) показали высокий уровень изменчивости (Karhu et al., 1996). При изучении сомаклональной изменчивости микро растений Р. pinea L. ISSR-, AFLP- и SAMPL-маркеры показали мономорфные профили амплификации и только RAPD-маркеры - некоторую межклональную вариацию (Cuesta et al., 2010). При исследованиях популяций Р. tabulaeformis Карр. RAPD- и ISSR-методы показали сопоставимые результаты (Li et al., 2008).

Нами была проанализирована динамика публикационной активности по вопросам популяционной биологии Pinus L. с применением молекулярно-генетических маркеров. Учитывались отечественные и зарубежные журнальные статьи. График, представленный на рис. 1.1 отображает ситуацию по количеству публикаций, приходящихся на пятилетние промежутки с 90-х годов XX века по сегодняшний день. Количество публикаций по вопросам популяционной биологии Pinus L. резко возрастает начиная с 2000 года. Такая динамика, возможно, объясняется тем, что в последние десятилетия разработано большое количес