P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов

Федоров, Илья Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов"

5 ¡о

На правах рукописи

Фёдоров Илья Валерьевич

Р2У РЕЦЕПТОРЫ ВКУСОВЫХ КЛЕТОК. ФАРМАКОЛОГИЯ И МОДЕЛИРОВАНИЕ Са2+ ОТВЕТОВ.

Специальность «Биофизика» 03 00.02.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2007

003175908

Работа выполнена в Пущинском государственном университете на базе Институте биофизики клетки РАН, г Пущино, Россия

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович

доктор физико-математических наук Цатурян Андрей Кимович

Ведущая организация

Институт биологии развития им НК Кольцова РАН

Защита состоится 05 12 2007 г в 15 30 на заседании диссертационного совета Д 002 093 01 при Институте теоретической экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, 3

Автореферат разослан « 2 » иОЛ А 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

.Панина НФ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Наряду со зрением, осязанием, слухом и обонянием, вкус является одним из основных чувств, участвующих в восприятии информации об окружающем нас мире Вкусовое ощущение зарождается при возбуждении специализированных сенсорных клеток - вкусовых ре-цепторных клеток - в составе плотных клеточных образований - вкусовых почек Вкусовые почки формируют периферический вкусовой орган - вкусовые сосочки 5 типов, 3 из которых локализованы на языке — желобоватые, листовидные и грибовидные Основополагающей функцией хеморецелторных клеток в составе вкусовых почек является распознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации о их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга

На основе ультраструктурных критериев во вкусовых почках идентифицировано несколько типов клеток округлые базальные клетки и три типа веретеновидных клеток (типы I, П, П1), которые выполняют рецепторную, поддерживающую и/или секреторную функции Эти клетки обмениваются примерно раз в две недели, развиваясь из базальных клеток и в конце жизни подвергаясь апоптозу Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы со вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергаться первичной обработке во вкусовой почке Протекание всех этих гетерогенных, но синхронизированных процессов, несомненно, требует хорошо отлаженных коммуникаций между вкусовыми клетками Поэтому одной из актуальных задач физиологии периферической вкусовой системы является исследование межклеточных коммуникаций во вкусовой почке

Исследования, выполненные в нашей лаборатории в последние годы, свидетельствуют о том, что пуринергическая сигнальная система может играть ключевую роль в функционировании вкусовой почки млекопитающих Так, было показано, что в желобоватом и листовидном сосочках субпопуляция вкусовых клеток экспрессирует метаботропные P2Y рецепторы, активация которых приводит к мобилизации внутриклеточного Са2+ (Kim et al, 2000, Baryshnikov et al, 2003, Bystrova et al, 2006) Было также установлено, что вкусовые клетки типа П секретируют АТР в ответ на их стимуляцию (Romanov et al, 2007) и что мишенью нуклеотида являются клетки типа HI (Romanov et al, в печати) Кроме того, было показано, что генетический нокаут ионотропных Р2Х2/Р2Х3 рецепторов, которые функционируют в афферентном вкусовом нерве, приводит к полному подавлению вкусовой чувствительности у генетически модифицированных животных (Fmger et al, 2005) Это является убедительным

аргументом в пользу того, что АТР выполняет функцию афферентного нейротрансмитгера в акте вкусовой трансдукции

Перечисленные выше факты свидетельствуют о том, что внеклеточный АТР является ключевой сигнальной молекулой в периферическом вкусовом органе, которая вовлечена как в афферентную передачу вкусовой информации, так и в паракрииную регуляцию физиологических функций определенных клеток вкусовой почки В свете изложенного, нам представлялось весьма важным детально исследовать Са2+ сигнализацию во вкусовых клетках при участии Р2У рецепторов

Цепь исследования.

Основная цель данного исследования - охарактеризовать фармакологический профиль P2Y рецепторов, функционирующих во вкусовых клетках, чтобы оценить роль различных изоформ метаботропных пуринорецепторов в генерации клеточных ответов на нуклеотиды

Основные задачи исследования.

1 Охарактеризовать чувствительность вкусовых клеток к нуклеотидам и исследовать эффекты антагонистов P2Y рецепторов на клеточные ответы

2 Получить кривые доза-ответ в широком диапазоне концентраций агонистов и антагонистов P2Y рецепторов

3 Разработать математическую модель пуринергической Са2+ сигнализации во вкусовых клетках и на ее основе провести анализ полученных экспериментальных данных

Научная новизна работы

Впервые исследованы ответы вкусовых клеток на ряд агонистов P2Y рецепторов в широком диапазоне концентраций (до 5 порядков), получены кривые доза-ответ для различных агонистов и антагонистов и тем самым получен фармакологический профиль пуринорецепторов, функционально экспрессируемых во вкусовых клетках Полученные данные свидетельствуют о том, что во вкусовых клетках функционирует рецептор нуклеотидов со свойствами, ранее не описанными для P2Y рецепторов, изученных при гетерологичной экспрессии Для объяснения экспериментальных фактов предложена гипотеза, согласно которой основные изоформы экспрессируемые во вкусовых клетках (P2Y2 и P2Y4), функционируют в виде гомо- и гетеродимеров С целью количественной проверки гипотезы впервые разработана модель пуринергической Са2+ сигнализации в данном типе клеток, которая обеспечивает возможность расчета кривых доза-ответ для различных комбинаций P2Y рецепторов (мономерных и/или димерных) Разработанная модель носит универсальный характер и может быть расширена для интерпретации клеточных ответов, опосредуемых рецепторами различных типов, которые сопряжены с фосфолипазным сигнальным каскадом и мобилизацией внутриклеточного Са2+

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты значительно расширяют существующие представления о физиологии вкусовых клеток и, в частности, о пуринергичеекой сигнальной системе, участвующей в межклеточных коммуникациях во вкусовой почке Разработанная математическая модель Са2+ сигнализации во вкусовых клетках при участи P2Y рецепторов носит универсальный характер и поэтому она может быть использована - непосредственно или после некоторой модификации - для интерпретации экспериментальных данных, полученных при исследовании других клеточных систем

Апуобания диссертации.

Материалы диссертации были представлены на «14th international symposium on olfaction and taste» (Япония, 2004), на 19-том и 20-м съезде физиологического общества им И П Павлова (Екатеринбург, 2004 г, Москва, 2007 г), на 9-й Пущинской коференции молодых ученых (Пущино, 2005 г), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007 гг), на всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С -Петербург, 2005 г), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005 г )

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в 10 печатных работах, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на $0 страницах с использованием /V рисунков, £ таблиц и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы Список литературы содержит ссылок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на одиночных вкусовых клетках и клетках в составе вкусовых почек, изолированных из желобоватого сосочка языка мыши по описанной ранее методике (Baryshmkov et al, 2003) Объекты помещались в перфузируемую фотометрическую камеру на покровном стекле, покрытом адгезивным материалом Cell-Tak (BD Biosciences, Bedford, USA) Для измерения внутриклеточного Са2+ использовался проникающий флуоресцентный зонд Fura-2AM Для возбуждения красителя использовался сканирующий моно-хроматор DeltaRAM™ (Photon Technology International (PTI), USA) Регистрация флуоресценции прокрашеных Fura-2 клеток осуществлялась с использованием фотометра М40 (РТТ) в режиме счета фотонов, инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 100S (Zeiss, Germany) и объектива Neofluar achroplan 40х (Zeiss, Germany) Для оценки концентрации внутриклеточного Са2+ (Gryrikievicz et al, 1985) измерялось отношение интенсивностей

флуоресценции Fura-2 на 510 нм при возбуждении на 340/380 нм Для сбора и анализа данных использовалась программа Felix (PTI), а для статистических и графических работ - программа SigmaPlot 8 0 (Jandel Scientific, США)

Эксперименты проводились при температуре 25-27 °С в экстраклеточном растворе (мМ) 130 NaCl, 5 КС1,1 СаС12, 1 MgS04; 1 Na2HP04,1 NaH2P04, 5 NaHC03, 10 HEPES (натриевая соль), 5 Глюкоза, 5 На-пкруват. рН 7 4 Часть экспериментов проводилась в растворе, содержащем вместо 1мМ СаСЬ - 5мМ СаСЬ или 1мМ EGTA + 0 ОбЗмМ СаС12 (100 нМ свободного Са2+) В работе использовались ингибитор пуринорецепгоров сурамин (Calbio-chem), ATP, ADP, UTP, UDP и 2', 3'-0-(4-benzoylbenzoyl)ATP (BzATP), NaCl и другие соли (Sigma-Aldnch)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Аппликация определенных нуклеотидов вызывает повышение Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток Эти ответы опосредуются метаботропными пуринергическими рецепторами, которые экспрессируются во вкусовой ткани, и сопряжены с активацией фосфоинозитидного каскада, включающего последовательные стадии активации G-белка, фосфолипазы С (ФЛС) и продукции Ю?з (Baryshmkov et al, 2003) Учитывая полученные ранее данные (Bystrova et al, 2006) о том, что вкусовые клетки экспрессируют несколько изоформ P2Y рецепторов, включая P2Yi (ADP рецептор), P2Y6 (UDP рецептор), P2Y2 и P2Y4 (ATP и UTP рецепторы), нами исследовалась способность ATP, UTP, ADP и UDP мобилизовать Са2+ во вкусовых клетках Оказалось, что при насыщающих концентрациях АТР и UTP вызывали примерно равные Са2+ ответы, которые по амплитуде как минимум вдвое превышали ответы на ADP и UDP (Рис 1 А,Б) Эти данные свидетельствовали о том, P2Y изоформы, идентифицированные методами молекулярной биологи, действительно функциональны во' вкусовых клетках, а именно - P2Y2 и/или P2Y4 участвуют в генерации клеточных ответов на трифосфаты, в то время как за генерацию ответов на ADP и UDP ответственны P2Yi и P2Y& соответственно Поскольку BzATP - аналог АТР - является полным агонистом для P2Y2 и антагонистом для P2Y4, по ответам на BzATP можно было бы судить о вкладе каждой из изоформ Как оказалось, аппликация BzATP вызывала Са2+ сигналы практически той же амплитуды, что и в случае АТР и UTP (Рис 1В, Рис 2) Этот факт может рассматриваться как свидетельство того, что для P2Y рецептора, функционирующего во вкусовых клетках и преимущественно ответственного за генерацию Са2+ ответов, АТР, UTP, и BzATP являются полными агонистами Поскольку среди рекомбинантных рецепторов такой ряд полных агонистов характерен только для P2Y2 (Abbracchio et al, 2006), примерно равная эффективность насыщающих BzATP, АТР и UTP (Рис 2) могла быть следствием того, что именно P2Y2 обеспечивает чувствительность вкусовых клеток к исследовавшимся трифосфатам

400 ■

300 ■

200 -

100 ■

400 •

+ "

го

и 300 •

-а

о 200 ■

100 ■

а.

X 400

300

200

100

utp

ATP

utp

udp

ATP

Рисунок 1. Изменение Ca т в цитоплазме вкусовых клеток в ответ на аппликацию различных агонистов P2Y (ATP, UTP, ADP UDP и BzATP). Период аппликации вещества обозначен горизонтальной чертой над кривой регистрации.

ч.

300

600

900 1200

Время, сек.

1500 1800 2100

га

fc 100 ш

а во

60 40 20 0

ч-II с

Рисунок 2. Ответы вкусовых клеток на некоторые нуклеотиды в насыщающих концентрациях, нормализованные на ответ на 200 мкМ АТР. Данные представлены как среднее по п экспериментам ± стандартная ошибка (п указано на рисунке).

to I! С

500 мкМ 1 мМ 300 мкМ 500 мкМ UTP BzATP ADP UDP

Если это так, то кривые доза-ответ для этих агонистов должны были бы описываться уравнениями с одним центром связывания, как это следует из соответствующих концентрационных зависимостей, полученных для рекомбинантных P2Y рецепторов (Wildman et al., 2003). Однако, анализ ответов вкусовых клеток на нуклеотиды в широком диапазоне концентраций показал, что характерные особенности кривых доза-ответ, полученных для АТР и BzATP, невозможно объяснить лишь активностью Р2Уг рецепторов. 1. Ответы на АТР

В качестве первого шага нами были получена кривая доза-ответ для АТР и анализировалось ее изменение в присутствии P2Y антагониста сурамина. В контроле (отсутствии су-

рамина) (Рис. 3), амплитуда Са2+ ответов как функция концентрации АТР удовлетворительно аппроксимировалась уравнением Хилла с одним центром связывания и коэффициентом Хилла ~ 1:

Подобная концентрационная зависимость характерна практически для всех изоформ Р2У рецепторов, исследовавшихся в зкспрессионной системе. Поэтому данные, представленные на Рис. 3, не противоречат идее о доминирующем вкладе P2Y2 рецептора в генерацию ответов на АТР и другие трифосфаты.

10-2 10-i 10о 10i 102 10з

Концентрация АТР, мкМ

Для P2Y рецепторов сурамин является конкурентным антагонистом, эффекты которого проявляются в том, что в его присутствии концентрационные кривые для агонистов сдвигаются в сторону больших концентраций без изменения их формы. В случае, если бы P2Y2 играл основную роль в рецепции АТР вкусовыми клетками, то эффект сурамина на зависимость доза-ответ (Рис. 3) должен был бы сводиться просто к ее сдвигу. Оказалось, что сурамин (10 мкМ) не только сдвигает концентрационную зависимость, полученную нами для АТР, но и меняет ее форму (Рис. 4). Подобный эффект вполне объясним, если помимо P2Y2 вклад в клеточные ответы на АТР также вносит P2Y4 рецепторы, для которых сурамин является слабым антагонистом, ингибирующее действие которого наблюдается при концентрациях на три порядка больших, чем для P2Y2 изоформы. Аналитический анализ экспериментальных кривых также предполагал, что как минимум два типа P2Y рецепторов вовлечено в генерацию ответов на АТР. Действительно, когда концентрационные зависимости для АТР, полученные в контроле и в присутствии сурамина, одновременно аппроксимировались уравнениями с двумя центрами связывания, были получены следующие уравнения, соответственно (Рис. 4, непрерывная и пунктирная кривые):

а)

150

Рисунок 3. Зависимость амплитуды ответа от концентрации АТР. Значения ответов нормировались на амплитуду контрольного ответа на 10 цМ АТР. Здесь и ниже экспериментальные данные (•), представлены как среднее ± стандартная ошибка (и = 7-12). Сплошная линия соответствует уравнению (1).

Ratp'K*, = 0-4/(1 + (0.6/[Л7Р]°8)) + 0.6/(1 + 5/[АТР])

(2)

ratp !rm ax = 0.4/(1 + {V[ATP]f2) + 0.6/(1 + 4 /[ATP])

(3)

Из сравнения уравнений (2) и (3) видно, что при таком формальном описании эффект сурамина в основном сводится к десятикратному повышению концентрации полуэффекта для высокоаффинной компоненты. Это вполне согласуется с тем, что вкусовые клетки экс-прессируют Р2У2 и Р2У4 изоформы, для которых характерны, соответственно, высокая и низкая чувствительность к сурамину в микромолярной области концентраций последнего (\УН<Зтап е! а]., 2003).

150

о юо -

§ 50

го

z о. о

0 J

Рисунок 4. Концентрационные зависимости ответов на АТР в контроле (•) и в присутствии сурамина (♦). Значения ответов нормировались на амплитуду контрольного ответа на 10 мкМ АТР. Сплошная линия соответствует уравнению (2), пунктирная линия - уравнению

(3).

Ю-2 10-' 10° 101 10г 103 Концентрация АТФ, мкМ

2. Ответы на BzATP

Согласно литературным данным по фармакологии рекомбинантных P2Y рецепторов (Abbracchio et al., 2006), BzATP стимулирует только P2Y2 и P2Yn изоформы; для остальных этот аналог АТР является либо антагонистом, либо никак не влияет на их активность. Следовательно, при доминирующем вкладе P2Y4 и P2Y2 изоформ ответы на BzATP должны были бы описываться монотонной зависимостью с одним центром связывания, которая должна была бы сдвигаться в присутствии сурамина.

150

^ юо

о.

о X

10° 101 Ю2 103 Концентрация BzATP, мкМ

Рисунок 5. Концентрационные зависимости ответов на BzATP в контроле (•) и в присутствии сурамина (А). Значения ответов нормировались на амплитуду контрольного ответа на 10 цМ АТР. Сплошная и пунктирная кривые соответствуют уравнениям (4) и (5) с Rmax=135.

Между тем в контроле, экспериментальная кривая доза-ответ для BzATP (Рис 5, кружки) оказалась бифазной, и ее удовлетворительная аппроксимация явно требовала использования уравнения, предполагающего два центра связывания нуклеотида (Рис 5, сплошная кривая)

=0 4/(1 + 9 7/[2fe47P]I63) + 0 6/(l + (347/[ife47P])25) (4) Эти данные с очевидностью свидетельствовали, что во вкусовых клетках функционирует как минимум два различных нуклеотидных рецептора, для которых BzATP является полным или частичным агонистом Сурамин (10 мкМ) ингибировал ответы на BzATP преимущественно при низких концентрациях последнего (Рис 5, треугольники), так что соответствующая концентрационная кривая аппроксимировалась следующем уравнением (Рис 5, пунктирная линия)

*штг 'К* = 0 4/(1 + 25 /[BzATPf') + 0 6/(1 + (347/[BzATP])25) (5) Из сравнения уравнений (4) и (5) следует, что как и в случае ответов на АТР, ингиби-руклций эффект сурамина сводится к уменьшению концентрации полуэффекта для компоненты с высокой аффинностью к BzATP

Таким образом, концентрационные зависимости, полученные в контроле и в присутствии сурамина (Рис 4 и Рис 5), и их аналитическая аппроксимация (уравнения (2)-(5)) свидетельствуют о том, что ответы вкусовых клеток на нуклеотидгрифосфаты обеспечиваются рецепторами как минимум двух типов При этом рецептор с высокой аффинностью к нуклео-тидам эффективно ингибируется сурамином, а низкоаффинный рецептор - характеризуется относительно низкой чувствительностью к этому антагонисту

Напомним, что для рекомбинантных P2Y рецепторов (i) UTP является полным агонистом только для P2Y2 и P2Y4 рецепторов, (п) BzATP является потным агонистом только для 2-х рецепторов - P2Yj и P2Yn и слабым антагонистом P2Y4 изоформы, (ш) за исключением P2Y4, сурамин в микромолярных концентрациях эффективно ингибирует все P2Y рецепторы, включая P2Y2 и P2Yn изоформы Принимая во внимание эти фак ты, очевидно, что не существует комбинации рекомбинантных рецепторов, которая могла бы одновременно обеспечить во вкусовых клетках

1 Эквипотентность ATP, UTP и BzATP в насыщающих концентрациях 2. Присутствие как минимум двух различных типов рецепторов BzATP 3 Низкую чувствительность к сурамину одного их рецепторов к BzATP Таким образом, экспериментальные данные, полученные нами, свидетельствуют о том, что во вкусовых клетках функционирует нуклеотидный рецептор с неизвестными ранее свойствами, для которого BzATP является агонистом, но который характеризуется низкой чувствительность к сурамину С другой стороны, в геноме мыши методами биоинформатики

не найдены изоформы P2Y, отличные от уже исследованных в экспрессионной системе. Следовательно, «неизвестный» P2Y рецептор должен быть одним из известных P2Y рецепторов или быть их комбинацией.

С момента открытия рецепторов, сопряженных с G-белками, считалось, что они являются мономерными молекулами. Однако в последнее время, как это было рассмотрено в обзоре литературы, появилось много свидетельств того, что эти рецепторы способны к образованию гомо- и гетеродимеров и даже более сложных рецепторных комплексов. Димеризация и олигомеризация мономеров может приводить к появлению новых свойств у образовавшегося рецептора. Биологическая значимость олигомеризации рецепторов, видимо, состоит в том, что комбинируя имеющееся (весьма ограниченное) число мономерных белков-рецепторов, можно существенно увеличить число рецепторных единиц с новыми свойствами, не увеличивая количестве генов, кодирующих рецепторные белки.

Возвращаясь к уравнениям, описывающим концентрационную зависимость для BzATP, можно видеть, что каждая из компонент характеризуется коэффициентом Хилла порядка 2. Это может быть следствием того, что для активации BzATP рецептора необходимо связывание как минимум 2-х молекул агониста. Учитывая сказанное выше, мы предположили, что в специфических условиях вкусовой клетки имеет место димеризация P2Y рецепторов и что рецептор с неизвестными у рекомбинантных белков свойствами может появиться в результате димеризации известных изоформ P2Y рецепторов, скорее всего, P2Y2 и P2Y4. С целью количественной проверки данного предположения нами была разработана модель пуринерги-ческой Са2+ сигнализации во вкусовых клетках и проведены компьютерные симуляции кривых доза-ответ для АТР и BzATP. Кроме того, с целью расширения экспериментальной базы для подбора параметров модели, нами были получены ингибиторные кривые для сурамина (Рис. 6).

120 -|

100 80 -60 -40 -20 -О -

Рисунок 6. Концентрационная кривая ингиби-рования сурамином ответов на 10 мкМ АТР. Ответы при разных концентрациях сурамина нормализовались на величину контрольного ответа на 10 мкМ АТР. Сплошная кривая описывается уравнением 0,16 / (1 + +([Sur] / 0,7)2) + 0,69 / (1 + ([Sur]//21)1,76) + 0.15, где [Sur] - концентрация сурамина.

10"2

ю-1 10° 101

Сурамин, мкМ

ТТЛ,—г

ю2

3. Модель пуринергической Са + сигнализации.

При создании модели мы использовали следующее основное уравнение для концентрации свободного Са2+ в цитоплазме:

(1 + кВ9,)Г^[Саг*]/Л = ^, (б)

где Авсу1 и Усу, - константы связывания характеризующие буферную емкость и объем цитоплазмы соответственно, У/ - значение Са2+ потоков, опосредуемых высвобождением Са2+ (Ле), входом Са2+ (Л„) или удалением Са2" (см. Рис. 7)

Внеклеточное пространство

Рисунок 7. Схема Са потоков, определяющих концентрацию Са2+ в цитоплазме клетки.

Когда ответ на АТР достигает максимума, й[Са = 0, то есть 7ге+Лп-ЛР--4<=0,

что позволяет нам применить равновесную аппроксимацию. Во вкусовых клетках первоначальное повышение внутриклеточного Са2+ в основном определяется 1Рз-зависимым выбросом депонированного Са2+ при незначительном вкладе депо-зависимого входа Са2+ из внеклеточного пространства. Это означает, что с большой точностью пик цитозольного Са2+ -результат перераспределения внутриклеточного Са2* между эндоплазматическим ретикулу-мом (ЭР) и цитоплазмой. Это эквивалентно следующему аналитическому условию:

О + KER)VER\Ca2+\ER + (1 + ksW[Ca2>]= V[Ca2+]

(7)

где kBER - константа связывания Са + ретикулярного Са2т буфера, VER - объем ЭР, [Ca2+]ER и [Са2'']!- - концентрации ретикулярного Са2+ и общая концентрация обмениваемого Са2т, V -объем клетки. В этом уравнении учтено, что ряд экспериментальных фактов позволяет рассматривать цитозольный и ретикулярный Са2+ буферы как линейную систему, т.е. предполагать прямо пропорциональную зависимость между концентрацией свободного и связанного

Са2+ В отвечающих на АТР вкусовых клетках удаление Са2т из цитоплазмы в основном опосредуется Са2+ АТР-азой плазматической мембраны (РМСА), тогда как Ма7Са2+-обменник, ретикулярный Са2+ насос и митохондрии играют незначительную роль (Baryshmkov et al, 2003) Учитывая эти обстоятельства, баланс потоков в моменте пика Са2+ может быть записан как /о+^ея^рмса, где Jo - величина Са2+ входа в покое, /Бя и Jvuca - величины Са2+ потоков из ЭР и выходящего потока Са2+ опосредованного РМСА, соответственно Для потоков мы использовали следующие аппроксимации

J0=Ptu{{Ca2^-[Ca2+J)

Ля = + «[Са2+]er - [Са2*]) (8)

где [Ca2+]out- концентрация внеклеточного Са2+, Ррм - константа проницаемости плазматической мембраны в покое, Pl и Pffj - константы

Са2+ проницаемости ЭР мембраны, опосредуемой утечкой из ретикулума и 1Рз рецепторами, vex и КРМса - максимальные скорости откачки Са2+ и кажущаяся константа диссоциации для связывания Са2+ и РМСА Комбинация уравнений (7)-(9) дает следующее выражение

Рт([Са2+1ш-[Ca2-}) + (PL+Pm)(r{Ca2+]T-(rc + 1)[Ог+]) = = Уех/(1 + Кшсл/[Са2+]Г) где г = F/(Fer(1 + kmK)) и rc = VQyt(l + £Bcyt)/(FER(l + U))

Цитозольный Са2+ потенцирует 1Рз рецепторы при малых концентрациях и ингибирует их в больших концентрациях Это приводит к колоколообразной зависимости вероятности открытия 1Р3 рецептора в стационарном состоянии от концентрации Са2+

Р{Са2*) = Р0 /((1 + (Ка 1[Са2+ ])На )(1 + ([Са2+ ] / К, )ш )) (10)

где Ро - вероятность открытия в стационарном состоянии при данной концентрации £Р3 и [Са2+] = 0, Ка и К, - кажущиеся константы диссоциации активирующего и ингибирующего сайтов связывания Са2+, На и Н, - соответствующие коэффициенты Хилла (Tu et al 2005) Так как для 3-го типа ГРз рецепторов (изоформы, преимущественно экспрессирующейся в клетках млекопитающих), К, ~ 40 цМ при миллимолярной концентрации внутриклеточного ATP (Hagar, Ehrlich, 2000) и поскольку амплитуда АТР-зависимого Са2+ ответа не превышает 300 нМ, Са2+-ингибирующий член в (10) может быть исключен в нашем случае Таким образом, для 1Рз-зависимой константы проницаемости может быть записано

Рт = P^VPJ /(№]",s +[ЩТ)(1 + (Ка[Са1+-\Г) (И)

где [1Рз]о,5 - концентрация полуактивации 1Рз рецептора Принимая во внимания что [Са2+]0и » [Са2+], окончательное уравнение для величины Са2+ пика как функции концентрации 1Рз приобретает вид

r[Ca2% (rc+l)-[Ca2+L

1 +

чч v..

т о, [Щ]

к„

\На

[Са2

+^M[C«2+]011t - п , fv. к г* Л* л ш

(\ + {кЖА /[с«2+]рг

Активация ФЛС и продукция Щ. Продукция 1Рз в результате гидролиза РЗРг активированной ФЛС и его конверсия киназами в другие инозитолфосфаты (IPs) описывается следующей схемой

РЩ = PLC* PIP2PLC* PLC* +DAG + Щ Щ -*IPs Соответствующее уравнение

d[IP,]dt = vm ~кг![Щ1

имеет следующее решение

(13)

[Д> ] = exp(-i/)([/P3]0 + JvIh exp(kdt)dt)

(14)

где vjp3 - скорость продукции 1Рз фосфолипазой С, ка - константа скорости конверсии П>3 и [П»з]о - концентрация 1Рз при t = О

Приняв, что независимая от G-белка, но зависящая от Са2+, ФЛС также функционирует во вкусовых клетках, мы расширили уравнение скорости гидролиза PIP2 (Lemon et al, 2003) до следующего уравнения

ущ =аО*[Р1Рг\[Са*У(Кса + [Са1* ]) + р[Р1Рг\[Са^ ] 1{КС + [Са2+ ]) (15)

где р - константа, Kcg и Кс - кажущиеся константы диссоциации связывания Са2+ с ФЛС для зависящих и от независящих от G-белков изоформ ФЛС соответственно Комбинация (14) и (15) дает выражение для коцентрации IP3 в момент времени, когда Са2+ достигает пика (tp)

[/P3]P=exp(-V,X№]o +

+ ][PIPJCa2+\(aG * /(KCG + [Ca2+]) + p!(Kc + [Ca2+])exp(^i)^) ^

На основе теоремы о среднем для монотонной функции G(x) ъ С ь

JG{x)F{x)dx = G{d) \P{x)dx + G(b) JF(x)dx

и постулируя, что [РП>2] понижается монотонно при 0 < I < 1Р и что в* = 0 в нестимулирован-ной клетке, можно получить,

[П>з]Р /РРЗ]0 5= Ц + У[Са2+]ДАЬ + [Са2+]р) + [Са2+У(*сс + [Са2+]р) (18)

где ц = ехр№гр)([1Рз]о/[П>з]о5+ Р/1[Са2+]0/([1Рз](А:с + [Са2+]0))), V = р/2ехр(-/сагр)/[1Рз]о5) 6 = аОт/2ехр(-^р)/[1Рз]о5 , ^ = ]"[Р1Р2]ехр(^г^ 12 = |[РГР2]ехр(^гЭпри 0 < Ь <

О (,

Ра~ 0*/(Зт - доля активированных й-белков, йт - общая концентрация в-белка Вводя безразмерные переменные х = [Са2+]ДСа2+]о и у = [1Рз]р/[1РЗ]о 5, где [Са2+]о - концентрация Са2+ в покое, можно получить следующую систему, комбинируя уравнения (12) и (18)

Гг+х у2+х

где Ъ=Рш[Саг*}аЛ/Уех, щ =(г/(ге +1))([Ог2+]г/[СЪ2+]г),

=0*/0т - фракция активированных О-белков, вт - общая коцентрация О-белков 4. Моделирование ответов на нуклеотиды.

Аналитическая структура системы (19) показывает, что кинетические свойства стадии связывание агониста-активация О-белка влияют на модельный ответ в той степени, в какой она определяют величину Ро - долю активированных в-белков Фактически, это позволяет моделировать процессы связывания агонистов и антагонистов с Р2У рецепторами и активацию О-белков независимо от процессов высвобождения Са2+

Хотя одиночный рецептор может активировать в-белки со скоростью порядка 102 сек"1, пик ответа на АТР достигается за время 5-10 сек Это позволяет предположить, что продукция 1Р3 и высвобождение депонированного Са2+ являются лимитирующими стадиями в последовательности внутриклеточных событий, приводящих к мобилизации внутриклеточного Са2+ Поэтому, для упрощения вычисления доли активированных О-белков Ре мы постулировали, что после аппликации агониста все активированные участники цепочки Р2У-0-белок-ФЛС достигают фактического равновесия до момента пика Са2+ Это позволяет определять их концентрацию используя равновесную аппроксимацию

Поскольку обратный агонизм не был установлен для Р2У рецепторов, мы также постулировали, что активность этих рецепторов в покое пренебрежимо мала, и использовали следующую кинетическую схему для описания связывания агониста с рецептором и последующей активации О-белков и их деактивации А + Я <-> АЛ*, АР* + в <-> АЯ*в —> АН* + в* и в* —» в, где Я, АЛ*, бив* обозначают активный и неактивный рецептор и в-белок, соответственно Для данной схемы фракция мономерных рецепторов, связанных с агониетом А в присутствии конкурентного антагониста I, может быть записана как

Fg = [ЛЯ*]/[*,.] = ([Ä\IK)I{\ + [iyKt + [А]! К) (20)

где [Я] и [AR*] - общая концентрация рецепторов и концентрация рецепторов, связанных с агонистом, то есть активированных, [А] и [i] - концентрации агониста и антагониста, К я К,-константы диссоциации для связывания агониста и антагониста, соответственно Поскольку в стационарном состоянии [G*] = [G]{AR*}/Ka, где кажущаяся константа диссоциации Кв является комбинацией микроскопических констант скоростей, фракция активированных G-белков записывается как

Fe -\G*y\GT~[-([AR*]/Kß)/(l + [AÄ*]/Kg) = ÖFr/(1 + ÖFr) (21)

где Gj - общая концентрация G-белков и 8 = [Rt\IKq

Приведенная выше диаграмма является упрощенной аппроксимацией взаимодействий в системе агонист-рецептор-в-белок и сопряженных процессов внутриклеточной сигнализации В то же время, при избытке G-белка (то есть, когда fGi]»[^i?*]) и при незначительной конститутивной активности рецепторов разнообразные модели, включая СТС (cubic ternary complex) модель (Kenakm, 2004), предсказывают, что концентрация тройного комплекса AR*G и, соответственно, концентрация активированных G-белков описывается простой изотермой Ленгмюра, т е уравнением типа (20) В этой связи, предлагаемая нами упрощенная аппроксимация может быть применима фактически к более сложным кинетическим схемам, которые описывают сопряжение активных рецепторов с G-белками и далее с относительно медленной Са2+ сигнализацией при участии фосфолипазы С

С целю уменьшения степени произвола в процессе вычислений, в уравнениях (19) -(21) ряд параметров был фиксирован на основе литературных данных и собственных экспериментальных наблюдений В частности, использовались следующие величины физических констант Ка = 30 нМ и На= 1 8 (Tu et al 2005), Кс = 500 нМ, iCfMCA = 500 нМ (Wennemuth et al, 2003), Кса = 400 нМ и m = 2 (Lemon et al, 2003), n=2 (Hagar, Ehrlich, 2000) и [Ca2+]0 = 70 нМ (Kim et al 2000) Это дает следующие значения параметров р -Ка /[Са2+]0= 0 43, X = ЯрмсА/[Са2+]0 = 7 l,Yi = Кс /[Са2+]0 = 7 1, у2 = Ксс /[Са2+]0 = 57 Дальнейшая работа проводилась следующим образом Используя систему (19), вычислялись теоретические зависимости доза-ответ для данной комбинации рецепторов, чтобы аппроксимировать экспериментальные кривые независимо друг от друга С этой целью подбирали,сь параметры удовлетворяющие критерию наименьших квадратов Затем параметры варьировались вблизи найденных значений для достижения наилучшей аппроксимации одновременно трех экспериментальных зависимостей, а именно, кривой доза-ответ для АТР в контроле и в присутствии 10 мкМ сурамина и для кривой ингибирования АТР ответов сурами-ном При этом минимизировался следующий функционал

(22)

где N, - число экспериментальных точек кривой доза-ответ, äJh Щ -экспериментальный и рассчитанные Са2+ ответы, соответственно, при данной концентрации агониста, Dtj - дисперсия Щ Далее расчитывалась оптимальная (с точки зрения метода наименьших квадра-

тов) кривая для BzATP, варьируя лишь константы диссоциации для связывания BzATP-P2Y рецептор и эффективность активации G-белков.

4,1. Модели мономерных рецепторных единиц.

В качестве одного из тестов для нашей модели, мы проверили может ли она воспроизвести количественно качественный вывод, сделанный выше, о том, что рекомбинантные (т.е. мономерные) рецепторы не могут дать приемлемого описания клеточных ответов на BzATP. Были рассмотрены следующие комбинации рецепторов.

P2Y4 + P2Y4. Комбинация P2Y4 + P2Y4, как видно на Рис. 8, дает приемлемое описание ответов на АТР в контроле (Рис. 8А, сплошная кривая) и кривой ингибирования для сурами-на (Рис. 8Б, сплошная кривая). Вполне ожидаемо, модель описывала эффект сурамина на ответы на АТР как сдвиг кривой доза-ответ в сторону больших концентраций без изменения ее формы (Рис. 8А, пунктир), что не соответствует экспериментальным наблюдениям. В случае BzATP, теоретическая концентрационная зависимость вычислялась, принимая 8А = 0, то есть предполагая, что P2Y2 - единственный рецептор, отвечающий за чувствительность к BzATP. И, как ожидалось, в случае комбинации двух мономерных рецепторов модель не способна воспроизвести формы кривых доза-ответ для BzATP в контроле (Рис. 8В, сплошная кривая) и в присутствии 10 цМ сурамина (Рис. 8В, пунктирная кривая).

А Б В

Рисунок 8. Модельные кривые, рассчитанные с использованием модели двух мономерных рецепторов. А -сплошная линия - контрольная кривая ответов на АТР, пунктир - ответы на АТР в присутствии сурамина. Б -кривая ингибирования сурамином ответов на 10 цМ АТР. В - сплошная линия - контрольная кривая ответов на BzATP, пунктир - ответы на BzATP в присутствии сурамина.

P2Y2 + P2Y4 + P2Yn- По сравнению с P2Y2 + P2Y4 добавление P2Y, i немного улучшило аппроксимацию кривой ингибирования сурамином, тогда как кривая для АТР не претерпевала значительных изменений. Присутствие 2-х рецепторов, способных активироваться BzATP (P2Y2 и P2Yh) улучшало описание контрольной кривей ответов на BzATP (Рис.9В, непрерывная кривая). Однако, модель неверно воспроизводила эффект сурамина, предсказывая ингибирование при высоких концентрациях BzATP (Рис.9В, пунктирная кривая).

Рисунок 9. Кривые, рассчитанные с использованием модели трех мономерных рецепторов. А - сплошная линия - контрольная кривая ответов на АТР, пунктир - ответы на АТР в присутствии сурамина. Б - кривая ингибирования сурамином ответов на 10 цМ АТР. В - сплошная линия - контрольная кривая ответов на BzATP, пунктир - ответы на BzATP в присутствии сурамина.

4.2. Модели димерных рецепторных единиц.

Вычисления с мономерными рецепторами, даже если число их повышалось до 4-х, не приводило к существенному улучшению описания экспериментальных данных, одновременно для АТР и BzATP. Правильное предсказание зависимости ответов на BzATP от концентрации агониста оказалась специфической проблемой, которая не могла быть решена по причине высокой чувствительности мономерных рецепторов P2Y2 и P2Yn (единственно активируемы BzATP) к сурамину.

Чтобы объяснить эффекты сурамина на кривую доза-ответ для BzATP, мы постулировали, что P2Y2 и P2Y4 рецепторы способны образовывать гетеродимер, который и является нуклеотидным рецептором с нужными свойствами. Более точно, BzATP является полным агонистом для P2Y2-P2Y4 гетеродимера благодаря присутствии! P2Y2 субъединицы, a P2Y4 субъединица придает этому комплексу низкую чувствительность к сурамину. Для гомодиме-ров P2Y2-P2Y2 и P2Y4-P2Y4 было предположено, что они преимущественно сохраняют свойства образующих субъединиц.

Для моделирования Са2+ сигналов при участии димерных P2Y рецепторов, т.е. для вычисления фракции активированных рецепторов для P2Y22, P2Y24 и P2Y« димеров использовались следующие уравнения:

F21={[A]IKnf/\+{I]l Кт +[А]/ Кп )2

F» = (М2 '(К2<2КШ )) /((1 + [/] / Кап + [А] / KU2 XI + [/] / Ki244 + [А] / К2М )) (24) Fu = ([Л]/К„ f /1 + [/]/Кт +[АуКи)2

1Г

где K„w и Ктт - константы диссоциации харктеризующие связывание агониста и антагониста с каждым нуклеотидным сайтом в димере.

P2Y2 + Р2У24 + P2Y4. В сравнении с комбинацией P2Y2 + P2Y2 + P2Yn ни аппроксимация кривой ингибирования сурамином, ни аппроксимация контрольных кривых для АТР и BzATP значительно не улучшились. Тем не менее, при наличие гетеродимера P2Y24 концентрационные зависимости ответов на АТР и BzATP в присутствии 10 цМ сурамина воспроизводились моделью более адекватно (Рис. 10).

А Б В

АТР, мкМ Сурамин, мкМ BzATP, мкМ

Рисунок 10. Модельные кривые, рассчитанные с использованием модели двух мономерных рецепторов и одного гетеродимерного. А - сплошная линия - контрольная кривая ответов на АТР, пунктир - ответы на АТР в присутствии сурамина. Б - кривая ингибирования сурамином ответов на 10 рМ АТР. В - сплошная линия -контрольная кривая ответов на BzATP, пунктир - ответы на BzATP в присутствии сурамина.

P2Y22 + P2Y24 + P2Y44. Как видно из Рис. 11, данный набор рецепторов позволяет наилучшим образом описать модельными кривыми все фармакологические данные. В частности, кривые доза-ответ для BzATP в контроле и в присутствии сурамина адекватно воспроизводились моделью при параметрах, указанных в Табл. 1. Следует отметить, что присутствие гетеродимера Р2У24 необходимо для корректного описания экспериментальных зависимостей для ответов на BzATP. Для любых комбинаций P2Y рецепторов без P2Y24 модель не способна генерировать корректное описание кривых доза-ответ для BzATP.

А Б В

Рисунок 11. Модельные кривые, рассчитанные с использованием модели двух гомодимерных рецепторов н одного гетеродимерного. А - сплошная линия - контрольная кривая ответов на АТР, пунктир - ответы на АТР в присутствии сурамина. В - кривая ингибирования сурамином ответов на 10 рМ АТР. С - сплошная линия -контрольная кривая ответов на BzATP, пунктир - ответы на BzATP в присутствии сурамина.

Табл 1 Параметры, использованные для рассчетов модели трех димерных рецепторов (НО - не определено)

АТР К,,=1 7 Ку,=20 К,40 К»= 0 0IS Ка-21 К1242— 51 Ко,4" 1000 К,44= 1000 S2f=4 5 S24 = 5 5 844=027 7],=0 00016 42=0069 r)s—100 П4=0 ООП fl^lOIS v=01 0=0 2

BzATP Кр= 5 1 Кгю= 450 Кг„" 450 Кн= НО Кц2=2 1 Кцлг 51 Ка44= 1000 К144 — НО 5«= 9 844=0 Т1,=00001 Т1г-0 069 113=100 Л4=0 0011 ц=0 015 v-0 1 8=0 2

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные знания о молекулярной природе рецепторов и о их сопряжении с сигнальными каскадами преимущественно базируются на исследованиях клеточных ответов, проводимых с использованием гетерологично экспрессированных рецепторов Хотя данный подход является весьма эффективным, обычно, экспрессионные системы - это линия клеток с относительно простой физиологией В клетках организма те же рецепторы могут функционировать отличным образом, поскольку пребывают в ином микроокружения и находятся под контролем иных аксессорных белков и регуляторных каскадов Кроме того, природные клетки экспрессируют, как правило, множественные изоформы сигнальных белков Можно поэтому думать, что прямая экстраполяция данных, полученных при использовании экспресси-онных систем, на нативные системы - процедура не вполне правомерная Поэтому анализ связывания агониста с рецепторами и дальнейшего прохождения внутриклеточного сигнала в нативных клеточных системах - задача весьма непростая

Вкусовые клетки отвечают на аппликацию АТР и ряда других нуклеотидов мобилизацией цитоплазматического Са2+ Генерация этих Са2+ сигналов обусловлена стимуляцией фосфоинозитидного каскада при участии метаботропных рецегп оров нуклеотидов P2Y типа, в то время как вклад ионотропных рецепторов Р2Х типа пренебрежимо мал (Baryshnikov et al, 2003) Методами молекулярной биологии и иммуногистохимии нами было показано, что вкусовые клетки экспрессируют несколько изоформ P2Y рецепторов, в частности P2Yi, P2Y2, P2Y4 и P2Y6 (Bystrova et al, 2006) Поскольку внеклеточный АТР является сигнальной молекулой, которая вовлечена в афферентную нейропередачу ÇFmger et al, 2005) и пара-кринную регуляцию (Baryshnikov et al, 2003) во вкусовой почке, детальное исследование пу-ринергической сигнализации в периферическом вкусовом органе может внести существенный вклад в понимание молекулярных механизмов вкуса. В частности, нам представлялось целесообразным исследовать вклад различных изоформ P2Y рецепторов в генерацию ответов вкусовых клеток на АТР, что и послужило отправной точкой для данного исследования Учитывая, что агонистами P2Yi и P2Yû рецепторов являются ADP и UDP, соответственно, мы a prion предполагали, что основной вклад в АТР-чувствителъность вкусовых клеток вносят P2Y2 и P2Y4 изоформы Учитывая фармакологические данные, полученные на рекомби-нантных P2Y рецепторах, мы исследовали ответы клеток на AIT и BzATP в присутствии и отсутствии сурамина - антагониста P2Y рецепторов Выбор данных веществ основывался на том, что АТР является полным агонистом как для P2Y2, так и для P2Y4, BzATP является пол-

ным агонистом для P2Y2 и антагонистом для P2Y4, сурамин эффективно ингибирует P2Y2 и является слабым антагонистом для P2Y4 Поэтому использование ATP, BzATP и сурамина в различных комбинациях должно было бы прояснить вклад P2Y2 и P2Y4 изоформ в генерацию физиологических ответов на нуклеотиды

Полученные данные привета нас, к парадоксальным выводам - во вкусовых клетках функционирует P2Y рецептор, который по своим свойствам отличается от любого рекомби-нантного P2Y рецептора В качестве гипотезы, которая могла бы примирить наши и литературные экспериментальные факты, мы предположили, что в рекомбинантных системах P2Y рецепторы преимущественно функционируют в мономерной форме, но в специфических условиях вкусовых клеток P2Y рецепторы способны димеризоваться, что приводит к индукции новых свойств, обычно не наблюдаемых в рекомбинантных системах

Для количественной проверки гипотезы о димеризации рецепторов, нами была разработана математическая модель, основанная на равновесной аппроксимации процесса сопряжения активного P2Y рецептора с Са2+ ответом Модель позволила симулировать клеточные ответы (более точно, кривые доза-ответ) при неизменном каскаде Са2+ сигнализации, но при разных рецепторных единицах Проверяя различные комбинации мономерных и димерных P2Y рецепторов, мы установили, что модель способна полностью воспроизводить всю совокупность экспериментальных данных, но лишь в случае, если в качестве рецепторных единиц берутся два гомодимера P2Y2 и P2Y4 изоформ и их гетеродимер Причем присутствие гетеродимера абсолютно необходимо для описания концентрационной зависимости для BzATP в контроле и в присутствии Р2У-антагониста - сурамина На наш взгляд, данные математического моделирования являются существенным аргументом в пользу димеризации P2Y рецепторов во вкусовых клетках, существование которой, разумеется, может быть окончательно доказано лишь в специальных экспериментах

В заключении отметим, что разработанная нами модель пуринергической Са2+ сигнализации носит достаточно универсальный характер, и поэтому она может быть расширена и применена для интерпретации клеточных ответов, опосредуемых рецепторами не P2Y типа, но которые сопряжены с мобилизацией внутриклеточного Са2+ фосфоинозитидным каскадом

ВЫВОДЫ

1 Изучена мобилизация Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток при аппликации различных агонистов P2Y рецепторов и эффекты их антагонистов Получен следующий ряд эффективности агонистов при насыщающих концентрациях ATP ~ BzATP ~ UTP > ADP > UTP

2 Фармакологические свойства рекомбинантных P2Y рецепторов таковы, что ни одна из их комбинаций не может одновременно объяснить наблюдаемый фармакологический профиль ответов вкусовых клеток на нуклеотиды и полученные кривые доза-ответ Данное несоответствие удается объяснить, если предположить, что в экспрессионной системе P2Y рецепторы функционируют в виде мономеров, в то время как во вкусовых клетках P2Y рецепторы димеризуются, что изменяет их сродство к агонистам и чувствительность к антагонистам по сравнению с мономерными рецепторами

3 Для количественной проверки гипотезы о димеризации P2Y рецепторов разработана математическая модель пуринергической Са2+ сигнализации во вкусовых клетках Модель носит достаточно универсальный характер и, следовательно, применима для анализа клеточных ответов на агонисты других рецепторов, сопряженных с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией внутриклеточного Са2+

4 Проведены вычисления Са2+ ответов вкусовых клеток, которые показали, что разработанная модель способна адекватно воспроизвести всю совокупность экспериментальных данных, но лишь в случае, если P2Y рецепторы предполагаются существующими в ди-мерной форме Это является серьезным аргументом в пользу димеризации P2Y рецепторов в специфических условиях вкусовых клеток

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1 Bystrova М F, Yatzenko Y Е, Fedorov IV, Rogachevskaja О А, Kolesmkov S S (2006) P2Y isoforms operative m mouse taste cells Cell Tissue Res 323, 377-382

2 Fedorov IV, Rogachevskaja О A, Kolesmkov S S (2007) Modeimg P2Y receptor-Ca2+ response coupling in taste cells Biochim Biophys Acta 1768,1727 1740

Тезисы докладов

1 Барышников С Г, Рогачевская О А, Яценко Ю Е, Федоров И В , Романов Р А, Колесников С С Пуринергическая сигнальная система вкусовых клеток 19-ый съезд физиологического общества им И П Павлова, Материалы съезда, 2004

2 Baryshnikov S G, Rogachevskaya О А, Fedorov IV, Yatzenko Y Е, Kolesmkov S S P2Y receptors operative m mouse taste cells 14th international symposium on olfaction and taste/ 38th Japanese association for taste and smell, 2004

3 Рогачевская О A , Федоров И В , Колесников С С Пуринэргческая сигнальная система вкусовых клеток, роль цАМФ Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина», Санкт-Петербург 14-16 апреля 2005г

4 Федоров И В , Рогачевская О А, Яценко Ю Е, Колесников С С Экспрессия P2Y2 и P2Y4 рецепторов во вкусовых клетках и их роль в генерации Са2+ ответов на нуклеотиды Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2005

5 OA Рогачевская, Ю Е Яценко, И В Федоров, Р А Романов, С С Колесников Рецепция экстраклеточного АТР вкусовыми клетками Научные труды I съезда физиологов СНГ, том 1 Сочи, Дагомыс, 2005

6 Яценко Ю Е, Федоров И В Идентификация P2Y рецепторов во вкусовых клетках // 9-ая Путинская школа-конференция молодых ученых, 2005 Сборник тезисов

7 Федоров И В , Рогачевская О А, Колесников С С Фармакология и моделирование Са2+ ответов вкусовых клеток 20-ый съезд физиологического общества им И П Павлова, Материалы съезда, 2007

8 Федоров И В , Рогачевская О А , Колесников С С Механизмы пуринергической Са2+ сигнализации вкусовых клеток Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005

Подписано в печать 31 10 2007 г Исполнено 01 11 2007 г Печать трафаретная

Заказ Ks 953 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федоров, Илья Валерьевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Организация вкусового анализатора.

1.1.1. Устройство периферического вкусового рецепторного органа.

1.2. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке.

1.2.1. Первичные мессенджеры вкусовой почки.

1.2.2. АТР как афферентный вкусовой нейротрансмиттер.

1.3. Пуринорецепторы.

1.4. Кальций - классический вторичный посредник.

1.5. Функциональная роль олигомеризации сигнальных белков.

2. Материалы и методы.

2.1. Выделение изолированных вкусовых клеток.

2.2. Метод микрофотометрии и экспериментальная установка.

2.3. Кривые доза-ответ. Достоверность полученных результатов.

2.4. Обработка данных и математическое моделирование.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Эффекты агонистов пуринорецепторов.

3.1.1. Ответы на АТР.

3.1.2. Ответы на BzATP.„.

3.2. Модель пуринергической кальциевой сигнализации.

3.3. Моделирование ответов на нуклеотиды.

3.3.1. Проверка модели.

3.3.2. Модели мономерных рецепторных единиц.

3.3.3. Модели димерных рецепторных единиц.

Введение Диссертация по биологии, на тему "P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов"

Наряду со зрением, осязанием, слухом и обонянием, вкус является одним из основных чувств, участвующих в восприятии информации об окружающем нас мире. Вкусовое ощущение зарождается при возбуждении специализированных сенсорных клеток - вкусовых рецепторных клеток - в составе плотных клеточных образований - вкусовых почек. Вкусовые почки формируют периферический вкусовой орган - вкусовые сосочки 5 типов, 3 из которых локализованы на языке - желобоватые, листовидные и грибовидные. Основополагающей функцией хеморецепторных клеток в составе вкусовых почек является распознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации о их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга.

На основе ультраструктурных критериев во вкусовых почках идентифицировано несколько типов клеток: округлые базальные клетки и три типа веретеновидных клеток (типы I, II, III), которые выполняют рецепторную, поддерживающую и/или секреторную функции. Эти клетки обмениваются примерно раз в две недели, развиваясь из базальных клеток и в конце жизни подвергаясь апоптозу. Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы со вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергаться первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных, но синхронизированных процессов, несомненно, требует хорошо отлаженных коммуникаций между вкусовыми клетками. Поэтому одной из актуальных задач физиологии периферической вкусовой системы является исследование межклеточных коммуникаций во вкусовой почке.

Исследования, выполненные в нашей лаборатории в последние годы, свидетельствуют о том, что пуринергическая сигнальная система может играть ключевую роль в функционировании вкусовой почки млекопитающих. Так было показано, что в желобоватом и листовидном сосочках субпопуляция вкусовых клеток экспрессирует метаботропные P2Y рецепторы, активация которых приводит к мобилизации внутриклеточного Са2+ (Kim et а1., 2000; Baryshnikov et al., 2003; Bystrova et al., 2006). Было также установлено, что вкусовые клетки типа II секретируют АТР в ответ на их стимуляцию (Romanov et al., 2007) и что мишенью нуклеотида являются клетки типа III (Romanov et al., в печати). Кроме того, Фингером с соавторами (Finger et al., 2005) недавно было показано, что генетический нокаут ионотропных Р2Х2/Р2Х3 рецепторов, которые функционируют в афферентном вкусовом нерве, приводит к полному подавлению вкусовой чувствительности у генетически модифицированных животных. Это является убедительным аргументом в пользу того, что АТР выполняет функцию афферентного нейротрансмиттера в акте вкусовой трансдукции.

Перечисленные выше факты свидетельствуют о том, что внеклеточный АТР является основной сигнальной молекулой во вкусовой почке, которая вовлечена как в передачу вкусовой информации, так и в паракринную регуляцию. В свете изложенного, нам представлялось важным детально

2+ исследовать Са сигнализацию во вкусовых клетках при участи P2Y рецепторов. Прежде всего мы попытались охарактеризовать фармакологический профиль пуринорецепторов, функционально экспрессируемых во вкусовых клетках, используя определенный набор P2Y агонистов и антагонистов и регистрируя Са ответы. В результате проделанной работы были получены кривые доза-ответ, которые было невозможно объяснить в своей совокупности, опираясь на представленные в литературе фармакологические свойства рекомбинантных P2Y рецепторов. В поисках объяснения данного противоречия, мы предположили, что в экспрессионной системе P2Y рецепторы функционируют преимущественно в мономерной форме, в то время как во вкусовых клетках P2Y рецепторы образуют димеры. Для количественной проверки этой идеи нами была разработана математическая модель пуринергической Са2+ сигнализации, которая описывала активацию P2Y рецепторов (мономерных и/или димерных), стимуляцию фосфоинозитидного сигнального каскада (G-белок, фосфолипаза С, продукция 1Р3) и мобилизацию внутриклеточного Са2+. Как и ожидалось, компьютерные эксперименты показали, что модель адекватно воспроизводит экспериментальные кривые доза-ответ только в случае димерных P2Y рецепторов. Разработанная модель может быть расширена для интерпретации любых клеточных ответов, опосредуемых рецепторами, сопряженными с фосфолипазным сигнальным каскадом и мобилизацией внутриклеточного Са2+.

1. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Федоров, Илья Валерьевич

Выводы

1. Изучена мобилизация Са в цитоплазме вкусовых клеток при аппликации различных агонистов P2Y рецепторов и эффекты их антагонистов. Получен следующий ряд эффективности агонистов при насыщающих концентрациях: АТР ~ BzATP ~ UTP > ADP > UTP.

2. Фармакологические свойства рекомбинантных P2Y рецепторов таковы, что ни одна из их комбинациий не может одновременно объяснить наблюдаемый фармакологический профиль ответов вкусовых клеток на нуклеотиды и полученные кривые доза-ответ. Данное несоответствие удается объяснить, если предположить, что в экспрессионной системе P2Y рецепторы функционируют в виде мономеров, в то время как во вкусовых клетках P2Y рецепторы димеризуются, что изменяет их сродство к агонистам и чувствительность к антагонистам по сравнению с мономерными рецепторами.

3. Для количественной проверки гипотезы о димеризации P2Y рецепторов разработана математическая модель пуринергической Са2+ сигнализации во вкусовых клетках. Модель носит достаточно универсальный характер и, следовательно, применима для анализа клеточных ответов на агонисты других рецепторов, сопряженных с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией внутриклеточного Са2+.

944. Проведены вычисления Са ответов вкусовых клеток, которые показали, что разработанная модель способна адекватно воспроизвести всю совокупность экспериментальных данных, но лишь в случае, если P2Y рецепторы предполагаются существующими в димерной форме. Это является серьезным аргументом в пользу димеризации P2Y рецепторов в специфических условиях вкусовых клеток.

Заключение

Современные знания о молекулярной природе рецепторов и о их сопряжении с сигнальными каскадами преимущественно базируются на исследованиях клеточных ответов, проводимых с использованием гетерологично экспрессированных рецепторов. Хотя данный подход является весьма эффективным, обычно, экспрессионные системы - это линия клеток с относительно простой физиологией. В клетках организма те же рецепторы могут функционировать отличным образом, поскольку пребывают в ином микроокружении и находятся под контролем иных аксессорных белков и регуляторных каскадов. Кроме того, природные клетки экспрессируют, как правило, множественные изоформы сигнальных белков. Можно поэтому думать, что прямая экстраполяция данных, полученных при использовании экспрессионных систем, на нативные системы - процедура не вполне правомерная. Поэтому анализ связывания агониста с рецепторами и дальнейшего прохождения внутриклеточного сигнала в нативных клеточных системах - задача весьма непростая.

Вкусовые клетки отвечают на аппликацию АТР и ряда других нуклеотидов мобилизацией цитоплазматического Са2+. Генерация этих Са2+ сигналов обусловлена стимуляцией фосфоинозитидного каскада при участии метаботропных рецепторов нуклеотидов P2Y типа, в то время как вклад ионотропных рецепторов Р2Х типа пренебрежимо мал (Baryshnikov et al, 2003). Методами молекулярной биологии и иммуногистохимии нами было показано, что вкусовые клетки экспрессируют несколько изоформ P2Y рецепторов, в частности P2Yb P2Y2, P2Y4 и P2Y6. (Bystrova et al, 2006). Поскольку внеклеточный ATP является сигнальной молекулой, которая вовлечена в афферентную нейропередачу (Finger et al, 2005) и паракринную регуляцию (Baryshnikov et al, 2003) во вкусовой почке, детальное исследование пуринергической сигнализации в периферическом вкусовом органе может внести существенный вклад в понимание молекулярных механизмов вкуса. В частности, нам представлялось целесообразным исследовать вклад различных изоформ P2Y рецепторов в генерацию ответов вкусовых клеток на АТР, что и послужило отправной точкой для данного исследования. Учитывая, что агонистами P2Yi и Р2Уб рецепторов являются ADP и UDP, соответственно, мы a priori предполагали, что основной вклад в АТР-чувствительность вкусовых клеток вносят P2Y2 и P2Y4 изоформы. Учитывая фармакологические данные, полученные на рекомбинантных P2Y рецепторах, мы исследовали ответы клеток на АТР и BzATP в присутствии и отсутствии сурамина - антагониста P2Y рецепторов. Выбор данных веществ основывался на том, что АТР является полным агонистом как для P2Y2, так и для P2Y4, BzATP является полным агонистом для P2Y2 и антагонистом для P2Y4, сурамин эффективно ингибирует P2Y2 и является слабым антагонистом для P2Y4. Поэтому использование АТР, BzATP и сурамина в различных комбинациях должно было бы прояснить вклад P2Y2 и P2Y4 изоформ в генерацию физиологических ответов на нуклеотиды.

Полученные данные привели нас, к парадоксальным выводам - во вкусовых клетках функционирует P2Y рецептор, который по своим свойствам отличается от любого рекомбинантного P2Y рецептора. В качестве гипотезы, которая могла бы примирить наши и литературные экспериментальные факты, мы предположили, что в рекомбинантных системах P2Y рецепторы преимущественно функционируют в мономерной форме, но в специфических условиях вкусовых клеток P2Y рецепторы способны димеризоваться, что приводит к индукции новых свойств, обычно не наблюдаемых в рекомбинантных системах.

Для количественной проверки гипотезы о димеризации рецепторов, нами была разработана математическая модель, основанная на равновесной аппроксимации процесса сопряжения активного P2Y рецептора с Са2+ ответом. Модель позволила симулировать клеточные ответы (более точно, кривые доза-ответ) при неизменном каскаде Са2+ сигнализации, но при разных рецепторных единицах. Проверяя различные комбинации мономерных и димерных P2Y рецепторов, мы установили, что модель способна полностью воспроизводить всю совокупность экспериментальных данных, но лишь в случае, если в качестве рецепторных единиц берутся два гомодимера P2Y2 и P2Y4 изоформ и их гетеродимер. Причем присутствие гетеродимера абсолютно необходимо для описания концентрационной зависимости для BzATP в контроле и в присутствии Р2У-антагониста -сурамина. На наш взгляд, данные математического моделирования являются существенным аргументом в пользу димеризации P2Y рецепторов во вкусовых клетках, существование которой, разумеется, может быть окончательно доказано лишь в специальных экспериментах.

В заключении отметим, что разработанная нами модель пуринергической Са2+ сигнализации носит достаточно универсальный характер, и поэтому она может быть расширена и применена для интерпретации клеточных ответов, опосредуемых рецепторами не только P2Y типа, но теми, которые сопряжены с мобилизацией внутриклеточного Са фосфоинозитидным каскадом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федоров, Илья Валерьевич, Пущино

1. Авдонин ПВ, Ткачук ВА. Рецепторы и внутриклеточный кальций. // М., Наука. 1994. 288.

2. Барышников СГ, Рогачевская OA, Ким ЮВ, Колесников СС.1. Л I

3. Мобилизация Са экстраклеточным АТР во вкусовых рецепторных клетках. // Биологические мембраны. 2002. 19, 4, 283-288.

4. Костюк ПГ. Кальций и внутриклеточная возбудимость. // М., Наука, 1986. 250.

5. Крутецкая ЗИ, Лебедев ОЕ. Метаболизм фосфоинозитидов и формирование кальциевого ответа в клетке. // Цитология. 1992. 34, 26-44.

6. Левицкий ДО. Кальций и биологические мембраны. // Биохимия мембран. Учебное пособие, под ред. А.А. Болдырева; кн. 7. М., Высш. Шк, 1990. 124.

7. Abbaffy Т, Trubey KR, and Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and modulation of camp in rat taste cells. // Am J.Physiol. Cell Physiol. 2003. 284, 1420-1428.

8. Airey JA, Grinsell MM, Jones LR, Sutko JL, and Witcher D. Three ryanodine receptor isoforms exist in avian striated muscles. // Biochemistry. 1993. 32, 5739-5745.

9. Armstrong D and Strange PG. Dopamine D2 receptor dimer formation: evidence from ligand binding. IIJ Biol Chem 2001. 276:22621-22629.

10. Asano-Miyoshia M, Abe K, and Emori Y. Co-expression of calcium signaling components in vertebrate taste bud cells. // Neurosci Lett. 2000. 283, 6164.

11. Babcock GJ, Farzan M, and Sodroski J. Ligand-independent dimerization of CXCR4, a principal HIV-1 coreceptor. IIJ Biol Chem. 2003. 278:3378-3385.

12. Bagchi S, Liao Z, Gonzalez FA, Chorna NE, Seye CI, Weisman GA, and Erb L. The P2Y2 nucleotide receptor requires interaction with v integrins to communicate with G0 and stimulate chemotaxis. IIJ Biol Chem. 2005. 280:3905839066.

13. Bailey MA, Turner CM, Hus-Citharel A, Marchetti J, Imbert-Teboul M, Milner P, Burnstock G, Unwin RJ. P2Y receptors present in the native and isolated rat glomerulus. // Nephron Physiol. 2004. 96, 79-90.

14. Baryshnikov SG, Rogachevskaja OA, and Kolesnikov SS. Cacium signaling mediated by P2Y2 receptors in mouse taste cells. // J. Neurophysiol. 2003. 90, 3283-3294.

15. Berridge MJ, Lipp P, and Bootman MD. The versatility and universality of calcium signaling. 11 Nature Rev Mol Cell Biol. 2000. 1, 11-21.

16. Berridge MJ. Capacititive calcium entry. // Biochemical J. 1995. 312,1-11.

17. Beidler LM, Smallman RL. Renewal of cells within taste buds. // J Cell Biol. 1965.27(2), 263-72.

18. Bigiani A, Delay RJ, Chaudhari N, Kinnamon SC, and Roper SD. Responses to glutamate in rat taste cells. I IJ Neurophysiol 1997. 77, 3048-3059.

19. Во X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, Burnstock G. Localization of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds. // Neuroreport. 1999. 10,1107-1111.

20. Bodor ET, Waldo GL, Hooks SB, Corbitt J, Boyer JL, Harden TK. Purification and functional reconstitution of the human P2Y12 receptor. // Mol Pharmacol. 2003. Nov, 64 (5). 1210-6.

21. Bunemann M, Lee KB, Pals-Rylaarsdam R, Roseberry AG, Hosey MM. Desensitization of G-protein coupled receptors in the cardiovascular system. // Annu Rev Physiol. 1999. 61,169-192.

22. Burnstock G. Purine-mediated signalling in pain and visceral perception. // Trends Pharm.Sci. 2001. 22, 182-188.

23. Burnstock G. The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. II Neuropharmacology. 1997. 36,1127-1139.

24. Bystrova MF, Yatzenko YE, Fedorov IV, Rogachevskaja OA, and Kolesnikov SS. P2Y isoforms operative in mouse taste cells. // Cell and Tissue Research. 2006. 323, 377-382.

25. Caicedo A, Jafri MS, and Roper SD. In Situ Ca2+ Imaging Reveals Neurotransmitter Receptors for Glutamate in Taste Receptor Cells. // J.Neurosci. 2000.20, 7978-7985.

26. Carrillo JJ, Pediani J, and Milligan G. Dimers of class A G protein-coupled receptors function via agonist-mediated trans-activation of associated G proteins. // J Biol Chem. 2003. 278:42578-42587.

27. Cattaneo M, Lecchi A, Joshi BV, Ohno M, Besada P, Tchilibon S, Lombardi R, Bischofberger N, Harden TK, and Jacobson KA Antiaggregatory activity in human platelets of potent antagonists of the P2Y1 receptor. // Biochem Pharmacol. 2004. 68:1995-2002.

28. Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A novel metabotropic glutamate receptor is a taste receptor for monosodium L-glutamate. // Nat.Neurosci. 2000. 3, 113-119.

29. Chaudhari N, Yang H, Lamp C, Delay E, Cartford C, Than T, and Roper S. The taste of monosodium glutamate, Membrane receptors in taste buds. // J Neurosci. 1996. 16, 3817-3826.

30. Chen SR, Ebisawa K, Li X, and Zhang L. Functional characterization of the recombinant type 3 Ca release channel (ryanodine receptor) expressed in HEK293 cells. IIJ Biol Chem. 1997. 272, 24234-24246.

31. Chen SR, Ebisawa K, Li X, and Zhang L. Molecular identification of the ryanodine receptor Ca2+ sensor. IIJ Biol Chem. 1998. 273,14675-14678.

32. Communi D, Suarez Gonzales N, Detheux M, Brezillon S, Lannoy V, Parmentier M, and Boeynaems J-M. Identification of a novel human ADP receptor coupled to Gi. IIJ Biol Chem. 2001. 276,41479-41485.

33. Coronado R, Morrissette J, Sukhareva M, and Vaughan D.M., Structureand function of ryanodine receptors. // Am J Physiol Cell Physiol. 1994. 266, 14851504.

34. Cvejic S and Devi LA. Dimerization of the delta opioid receptor: implication for a role in receptor internalisation. // J Biol Chem. 1997. 272:26959-26964.

35. Dascal N. Ion-channel regulation by G proteins. // Trends in Endocrinology and Metabolism. 2001.12.

36. Delay RJ and Roper SD. Ultrastructure of taste cells and synapses in the mudpuppy Necturus maculosus. IIJ Comp Neurol. 1988. 277, 268-280.

37. Delay RJ, Kinnamon SC, and Roper SD. Serotonin modulates voltage dependent calcium current in Necturus taste cells. // J Neurophysiol. 1997. 77, 2515-2524.

38. Dinger MC, Bader JE, Kobor AD, Kretzschmar AK, and Beck-Sickinger AG. Homodimerization of neuropeptide у receptors investigated by fluorescence resonance energy transfer in living cells. IIJ Biol Chem. 2003. 278:10562-10571.

39. Di Virgilio F and Solini A. P2 receptors, new potential players in atherosclerosis. II Br J Pharmacol. 2002. 135, 831-842.

40. Dolphin AC. G Protein Modulation of Voltage-Gated Calcium Channels. // Pharmacol Rev. 2003. 55, 607-627.

41. Dunn PM, Zhong Y, and Burnstock G. P2X receptors in peripheral neurons. II Progr Neurobiol. 2001. 65, 107-134.

42. Fill M, Copello JA. Ryanodine receptor calcium release channels. Physiol Rev. 2002. Oct; 82(4):893-922.

43. Finger ET, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L, Hellekant G, Kinnamon SC. ATP Signaling Is Crucial for Communication from Taste Buds to Gustatory Nerves. II Science. 2005. 310,1495-1499

44. Franke H., Krugel U., Grosche J., Heine C., Hartig W., Allgaier C., and Illes P. P2Y receptor expression on astrocytes in the nucleus accumbens of rats. // Neuroscience 2004. 127:431-441.

45. Fries JE, Wheeler-Schilling TH, Kohler K, Guenther E. Distribution of metabotropic P2Y receptors in the rat retina, a single-cell RT-PCR study. // Mol Brain Res. 2004. 130,1-6.

46. Fruen BR, Bardy JM, Byrem TM, Strasburg GM, and Louis CF. Differential Ca sensitivity of skeletal and cardiac muscle ryanodine receptors in the presence of calmodulin. II Am J Physiol Cell Physiol. 2000. 279, 724-733.

47. Galligan JJ, LePard, Schneider, and Zhou X. Multiple mechanisms of fast excitatory synaptic transmission in the enteric nervous system. // J Auton Nerv Syst. 2000.81,97-103.

48. Ganchrow D and Ganchrow RJ. Renewal of taste bud cells. // Med Sci Res. 1992. 20, 653-656.

49. Ganchrow JR and Ganchrow D. Long-term effects of gustatory neurectomy on fungiform papillae in the young rat. // Anat Rec. 1988. 225, 224-231.

50. Ganchrow JR. Taste cell function, Structural and biochemical implications. II Physiol Behav. 2000. 69, 29-40.

51. Gilbertson ТА, Damak S, and Margolskee RF. The molecular physiology of taste transduction. // Current Opinion in Neurobiology. 2000. 10, 519-527.

52. Grynkiewicz G, Poenie M, and Tsien RY. A novel generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. // J Biol Chem. 1985. 260, 3440-3450.

53. Hagar RE and Ehrlich BE. The regulation of the type III InsP3 receptor by InsP3 and ATP. // Biophys J. 2000. 79: 271-278.

54. Hain J, Onoue H, Mayrleitner M, Fleischer S, and Schindler H. Phosphorylation modulates the function of the calcium release channel of sarcoplasmic reticulum from cardiac muscle. // J Biol Chem. 1995. 270, 20742081.

55. Herness MS and Chen Y. Serotonergic agonists inhibit calcium-activated potassium and voltage-dependent sodium currents in rat taste receptor cells. // J Memb Biol. 2000. 173, 27-138.

56. Herness MS and Gilbertson ТА. Cellular mechanisms of taste transduction. II Annu Rev Physiol. 1999.61, 873-900.

57. Herness MS and Sun XD. Characterization of chloride currents and their noradrenergic modulation in rat taste receptor cells. // J Neurophysiol. 1999. 82, 260-271.

58. Herness S, Zhao F, Kaya N, Lu S, Shen T, and Sun X. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. IIJ Physiol. 2002a. 543, 601-614.

59. Herness S, Zhao F, Lu S, Kaya N, and Shen T. Expression and Physiological Actions of Cholecystokinin in Rat Taste Receptor Cells. // J Neurosci. 2002b. 22, 10018-10029.

60. Hoth M, Penner R. Calcium release-activated calcium current in rat mast cells. J Physiol. 1993. Jun;465:359-86.

61. Huang Y-J, Maruyama Y, Lu K-S, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D, and Roper SD. Mouse Taste Buds Use Serotonin as a Neurotransmitter. // J Neurosci. 2005. 25,4, 843-847.

62. Hussain A., Inesi G. Involvement of Sarco/endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPases in Cell Function and the Cellular Consequences of Their Inhibition. // J. Membrane Biol. 1999. 172, 91-99.

63. Irvine RF and Schell MJ. Back in the water, The Return of the inositol phosphates. // Molecular Cell Biology. 2001. 2.

64. Ishii K, Kaneda M, Li H, Rockland KS, Hashikawa T. Neuron-specific distribution of P2X7 purinergic receptors in the monkey retina. IIJ Comp Neurol. 2003. 459, 267-277.

65. Jabs R, Guenther E, Marquordt K, Wheeler-Schilling TH. Evidence for P2X3, P2X4, P2X5 but not for P2X7 containing purinergic receptors in Muller cells of the rat retina. // Brain Res Mol Brain Res. 2000. 76,205-210.

66. Jeyakumar LH, Copello JA, O'Malley AM, Wu GM, Grassucci R, Wagenkhecht T, and Fleischer S. Purification and characterization of ryanodine receptor 3 from mammalian tissue. IIJ Biol Chem. 1998. 273,16011-16020.

67. Jiang Q, Guo D, Lee BX, Van Rhee AM, Kim YC, Nicholas RA, Schachter JB, Harden TK, and Jacobson KA. A mutational analysis of residues essential for ligand recognition at the human P2Y1 receptor. // Mol Pharmacol. 1997. 52:499507.

68. Karczewski P, Hendrischke T, Wolf-Peter W, Morano I, Bartel S, Schrader J. Phosphorylation of phospholambancorrelates with relaxation of coronary artery induced by nitricoxide, adenosine, and prostracyclin in the pig. // J Cell Biochem 1998. 70,49-59.

69. Kataoka S, Toyono T, Seta Y, Ogura T, Toyoshima K. Expression of P2Y1 receptors in rat taste buds. Histochem Cell Biol. 2004. 121:419

70. Kauffenstein G, Hechler B, Cazenave JP, and Gachet C. Adenine triphosphate nucleotides are antagonists at the P2Y12 receptor. // J Thromb Haemost. 2004. 2:1980-1988.

71. Kaupp UB and Seifert R. Cyclic Nucleotide-Gated Ion Channels. // Physiol Rev. 2002. 82, 769-824.

72. Kawai K, Sugimoto K, Nakashima K, Miura H, and Ninomiya Y. Leptin as a modulator of sweet taste sensitivities in mice. II Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97,11044-11049.

73. Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, Herness S. A paracrine signaling role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor subtypes. II Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004. 286(4), R649-58.

74. Kenakin T. Principles: receptor theory in pharmacology. // Trends Pharmacol Sci. 2004. 25(4): 186-92.

75. Kim YV, Bobkov YV, and Kolesnikov SS. ATP mobilizes cytosolic calcium and modulates ionic currents in mouse taste receptor cells. // NeurosciLett. 2000. 290,165-168.

76. Klepeis VE, Weinger I, Kaczmarek E, Trinkaus-Randall V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. // J Cell Biochem. 2004. 93, 1115-1133.

77. Kraus-Friedmann N. Cyclic nucleotide-gated channels in non-sensory organs. // Cell Calcium. 2000. 27, 3,127-138.

78. Krimm RF, Miller KK, Kitzman PH, Davis BM, and Albers KM. Epithelial Overexpression of BDNF or NT4 Disrupts Targeting of Taste Neurons That Innervate the Anterior Tongue. // Develop Biol. 2001. 232, 508-521.

79. Kunapuli SP, Dorsamy RT, Kimz S, Quinton TM. Platelet purinergic receptors. // Curr Opin Pharmacol. 2003. 3,175-180.

80. Launay S, Babe R, Lacabaratz-Porret C, Bredoux R, Ко vacs T, Enouf J, Papp B. Modulation of endoplasmic reticulum calcium pump expression during T lymphocyte activation. II J. Biol. Chem. 1997. 272, 10746-10750.

81. Lazarowski ER, Homolya L, Boucher RC, and Harden TK. Identification of an ecto-nucleoside diphosphokinase and its contribution to interconversion of P2 receptor agonists. IIJ Biol Chem. 1997. 272:20402-20407.

82. Lee C, Ji I, Ryu K, Song Y, Conn PM, and Ji TH. Two defective heterozygous luteinizing hormone receptors can rescue hormone action. // J Biol Chem. 2002. 277:15795-15800.

83. Lemon G, Gibson WG, and Bennett MR. Metabotropic receptor activation, desensitization and sequestration. I: modelling calcium and inositol 1,4,5trisphosphate dynamics following receptor activation. // J Theor Biol. 2003. 223: 93-111.

84. Lin W and Kinnamon SC. Electrophysiological evidence for ionotropic and metabotropic glutamate receptors in rat taste cells. // J Neurophysiol. 1999. 82, 2061-2069.

85. Lindemann B. Receptors and transduction in taste. // Nature. 2001. 413, 219-225.

86. Lindemann B. Taste Reception. // Physiol Rev. 1996. 76, 719-766.

87. Lokuta AJ, Rogers ТВ, Lederer WJ, and Valdivia H.H. Modulation of cardiac ryanodine receptors of swine and rabbit by a phosphorylation-dephosphorylation mechanism. IIJ Physiol. 1995. 487, 609-622.

88. Мак DOD, McBride S, and Foskett JK. Regulation by Ca and Inositol 1,4,5 9-1

89. Trisphosphate (InsP) of Single Recombinant Type 3 InsP Receptor Channels, Ca Activation Uniquely Distinguishes Types 1 and 3 InsP Receptors. // J. Gen. Physiol. 2001.117, 435-446.

90. Margolskee RF. Molecular Mechanisms of Bitter and Sweet Taste Transduction. IIJ Biol Chem. 2002. 277, 1-4.

91. Marshall FH, Jones KA, Kaupmann K, and Bettler B. GABAB receptors— the first 7TM heterodimers. // Trends Pharmacol Sci. 1999. 20:396-399.

92. Marteau F, Le Poul E, Communi D, Labouret C, Savi P, Boeynaems JM, and Gonzalez NS. Pharmacological characterization of the human P2Y13 receptor. IIMolPharmacol. 2003. 64:104-112.

93. Matsunami H and Amrein H. Taste perception: how to make a gourmet mouse. // Curr Biol. 2004.14:118-120.

94. Michael F and Copello JA. Ryanodine Receptor Calcium Release Channels II Physiol Rev. 2002. 82, 893-922.

95. Milligan G. Applications of bioluminescence- and fluorescence resonance energy transfer to drug discovery at G protein-coupled receptors. Eur J Pharrn Sci. 2004.21:397-405.

96. Monteith GR. and Roufogalis BD. The plasma membrane calcium pump, a physiological perspective on its regulation. // Cell Calcium. 1995. 18,459-470.

97. Moro S, Guo D, Camaioni E, Boyer JL, Harden TK, and Jacobson KA. Human P2Y1 receptor: molecular modelling and site-directed mutagenesis as tools to identify agonist and antagonist recognition sites. IIJ Med Chem. 1998. 41:14561466.

98. Mozhaeva GN, Naumov AP, Kuryshev YA. Inositol 1,4,5-trisphosphate activated two types of Ca2+-permeable channels in human carcinoma cells. // FEBS Lett. 1990. 277,233-234.

99. Murray RG, Murray A, and Fujimoto A. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. // J Ultrastruct Res. 1969. 27, 444-461.

100. Nagai T, Kim DJ, Delay RJ, and Roper SD. Neuromodulation of transduction and signal processing in the end organs of taste. // Chem Senses. 1996. 21,353-365.

101. Nagato T, Matsumoto K, Tanioka H, Kodama J and Toh H. Effect of denervation on morphogenesis of the rat fungiform papilla. // Acta Anat. 1995. 153, 301-309.

102. Nimchinsky EA, Hof PR, Janssen WG, Morrison JH, and Schmauss С () Expression of dopamine D3 receptor dimers and tetramers in brain and in transfected cells. IIJ Biol Chem. 1997. 272:29229-29237.

103. North RA. Molecular physiology of P2X receptors. // Physiol Rev. 2002. 82, 1013-1067.

104. Oakley B, Wu LH, Lawton A, and DeSibour С L. Neural control of ectopic filiform spines in adult tongue. II Neurosci. 1990. 36, 831-838.

105. Obata H, Shimada K, Sakai N, Saito N. GABAergic neurotransmission in rat taste buds, immunocytochemical study for GABA and GABA transporter subtypes. // Mol Brain Res. 1997.49,29-36.

106. Ogura T, Margolskee RF, and Kinnamon S. Taste Receptor Cell Responses to the Bitter Stimulus Denatonium Involve Ca2+ Influx Via Store-Operated Channels. IIJNeurophysiol. 2002. 87, 3152-3155.

107. Ogura Т. Acetylcholine increases intracellular Са in taste cells via activation of muscarinic receptors. П J Neurophysiol. 2002. 87, 2643-2649.

108. Pan YX, Bolan E, and Pastrnak GW. Dimerization or morphine and orphanin/nociceptin receptors: generation of a novel opioid receptor subtype. // Biochem Biophys Res Commun. 2002. 297:659-663.

109. Pendergast W, Yerxa BR, Douglass JG 3rd, Shaver SR, Dougherty RW, Redick CC, Sims IF, and Rideout JL. Synthesis and P2Y receptor activity of a series of uridine dinucleoside 5-polyphosphates. // Bioorg Med Chem Lett. 2001.11:157-160.

110. Penniston JT. and Enyedi A. Modulation of the plasma membrane Ca21 pump Л JMembrBiol. 1998. 165,101-109.

111. Petersen OH and Fedirko NV. Calcium signalling, Store-operated channel found at last. // CurrBiol. 2001. 11, 520-523.

112. Proenza C, O'Brien J, Nakai J, Mukherjee S, Allen P.D, and Beam K.G. Identification of a region of RYR1 that participates in allosteric coupling with the 1S CaVl.l. II-III loop. IIJ Biol Chem. 2002. 277, 6530-6535.

113. Protasi F. Structural interaction between RYRs and DHPRs in calcium release units of cardiac and skeletal muscle cells. // Front Biosci. 2002. 7, 650-658.

114. Pumplin DW and Getschman E. Synaptic proteins in rat taste bud cells, Appearance in the Golgi apparatus and relationship to a-Gustducin and the Lewisb and A antigens. /IJComp Neurol. 2000. 427,171-184.

115. Ralevic V and Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines. // Pharmacol Rev. 1998. 50, 413-492.

116. Rebecchi MJ and Pentyala SN. Structure, Function, and Control of Phosphoinositide-Specific Phospholipase С. II Physiol Rev. 2000. 80,1291-1335.

117. Roper SD. Signal transduction and information processing in mammalian taste buds. // Pflugers Arch. 2007. 454(5): 759-76.

118. Ren Y, Shimada K, Shirai Y, Fujimiya M, and Saito N. Immunocytochemical localization of serotonin and serotonin transporter SET. in taste buds of rat. // Mol Brain Res. 1999. 74, 221-224.

119. Royer SM and Kinnamon JC. HVEM serial-section analysis of rabbit foliate taste buds, I. Type III cells and their synapses. // J Comp Neurol. 1991. 306, 4972.

120. Scott, K. (2004) The sweet and the bitter of mammalian taste. Current Opinion in Neurobiology. 2004, 14:423-427

121. Schwinger R, Munch G, BOck B, Karczewski P, Krause EG and Erdmann E. Reduced Ca2+-Sensitivity of SERCA 2a in Failing Human Myocardium due to Reduced Serin-16 Phospholamban phoshorylation J. II Mol Cell Cardiol. 1999. 31, 479^91.

122. Seta Y, Toyono S, Takeda S, and Toyoshima K. Expression of Mash 1 in basal cells of rat circumvallate taste buds is dependent upon gustatory innervation. IIFEBS Lett. 1999. 444,43-46.

123. Shoshan-Barmatz, V. and Ashley, R. H, The structure, function, and cellular regulation of ryanodine-sensitive Ca2+ release channels. // Int. Rev. Cytol. 1998. 183, 185-270.

124. Sollars SI, Smith PC, and Hill DL. Time course of morphological alterations of fungiform papillae and taste buds following chorda tympani transection in neonatal rats. // JNeurobiol. 2002. 51, 223-236.

125. Soyer OS, Dimmic MW, Neubig RR, and Goldstein RA. Dimerization inaminergic G-protein-coupled receptors: application of a hidden-site class model ofevolution. Biochemistry. 2003. 42:14522-14531.

126. Stanasila L, Perez J-B, Vogel H, and Cotecchia S. Oligomerization of the la and lb-adrenergic receptor subtypes. // J Biol Chem. 2003. 278:4023940251.

127. Stojilkovic SS and Koshimizu T. Signaling by extracellular nucleotides in anterior pituitary cells. // Trends Endocr Metab. 2001. 12, 218-225.

128. Strehler E.E. and. Zacharias D.A. Role of Alternative Splicing in Generating Isoform Diversity Among Plasma Membrane Calcium Pumps. // Physiological Reviews. 2001.81, 1.

129. Suh B-C and Hille B. Recovery from Muscarinic Modulation of M Current Channels Requires Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Synthesis. // Neuron. 2002. 35, 507-520.

130. Sun H and Oakley B. Development of Anterior Gustatory Epithelia in the Palate and Tongue Requires Epidermal Growth Factor Receptor. // Develop Biol. 2002. 242,31^3.

131. Takeda M, Suzuki Y, Obara N, and Nagai Y. Apoptosis in mouse taste buds after denervation. // Cell Tissue Res. 1996. 286, 55-62.

132. Tanabe T, Mikami A, Niidome T, Numa S, Adams B.A, and Beam KG. Structure and function of voltage-dependent calcium channels from muscle. // Ann NYAcadSci. 1993. 707, 81-86.

133. Terrillon S, Durroux T, Mouillac B, Breit A, Ayoub MA, Taulan M, Jockers R, Barberis C, and Bouvier M. Oxytocin and vasopressin Via and V2 receptors form constitutive homo- and heterodimers during biosynthesis. // Mol Endocrinol. 2003.17:677-691.

134. Thrower EC, Hagar RE, and Ehrlich BE. Regulation of Ins 1,4,5. P3 receptor isoforms by endogenous modulators. // Trends Pharm Sci. 2001. 22, 580586.

135. Torres GE, Egan TM, Voigt MM. N-Linked glycosylation is essential for the functional expression of the recombinant P2X2 receptor. // Biochemistry. 1998. Oct 20. 37(42):14845-51

136. Toyono T, Seta Y, Kataoka S, Harada H, Morotomi T, Kawano S, Shigemoto R, and Toyoshima K. Expression of the metabotropic glutamate receptor, mGluR4a, in the taste hairs of taste buds in rat gustatory papillae. I I Arch Histol Cytol. 2002. 65, 91-96.

137. Tu H, Wang Z, and Bezprozvanny I. Modulation of mammalian inositol 1,4,5-trisphosphate receptor isoforms by calcium: A role of calcium sensor region. // Biophys J. 2005. 88:1056-1069.

138. Vassort Guy, Adenosine 59-Triphosphate, a P2-Purinergic Agonist in the Myocardium. II Physiological Reviews. 2001. 81, 2.

139. Venkatachalam К, Ma HT, Ford DL, and Gill DL. Expression of functional receptor-coupled TRPC3 channels in DT40 triple InsP3 receptor-knockout cells. // J Biol Chem. 2001. 276, 33980-33985.

140. Venkatachalam K, van Rossum DB, Patterson RL, Ma H-T, and Gill DL. The cellular and molecular basis of store-operated calcium entry. // Nature Cell Biol. 2002. 4, 263-272.

141. Vigne P, Hechler B, Gachet C, Breittmayer JP, Frelin C. Benzoyl ATP is an antagonist of rat and human P2Y1 receptors and of platelet aggregation. // Biochem Biophys Res Commun. 1999. 256, 94-97.

142. Von Kugelgen I, Spath L, and Starke K. Evidence for P2-purinoceptor-mediated inhibition of noradrenaline release in rat brain cortex. // Br J Pharmac. 1994.113,815-822.

143. Waldo GL, Harden TK. Agonist binding and Gq-stimulating activities of the purified human P2Y1 receptor. II Mol Pharmacol. 2004. 65,426-436.

144. Wennemuth G, Babcock DF and Hille B. Calcium clearance mechanisms of mouse sperm. I IJ Gen Physiol. 2003. 122: 115-128.

145. Wheeler-Schilling TH, Marquordt K, Kohler K, Guenther E, Jabs R. Identification of purinergic receptors in retinal ganglion cells. // Mol Brain Res. 2001.92, 177-180.

146. Wheeler-Schilling TH, Marquordt K, Kohler K, Jabs R, Guenther E. Expression of purinergic receptors in bipolar cells of the rat retina. // Brain Res Mol Brain Res. 2000. 76,415^118.

147. White PJ, Webb ТЕ, and Boarder MR. Characterization of a Ca2+ response to both UTP and ATP at human P2Y11 receptors: evidence for agonist-specific signaling. // Mol Pharmacol. 2003. 63:1356-1363.

148. Wildman SS, Unwin RJ, and King BF. Extended pharmacological profiles of rat P2Y2 and rat P2Y4 receptors and their sensitivity to extracellular H+ and Zn2+ ions. II Br J Pharmacol. 2003. 140:1177-1186.

149. Williams AJ, West DJ and Rebecca Sitsapesan. Light at the end of the Ca2+-release channel tunnel, structures and mechanisms involved in ion translocation in ryanodine receptor channels. // Quarterly Reviews of Biophysics. 2001.34, 1, pp. 61-104.

150. Yamamoto T, Nagei T, Shimura T, Yasoshimi Y. Roles of chemical mediators in the taste system. // Jpn J Pharmacol. 1998. 76, 325-348.

151. Yang R, Crowley HH, Rock ME, and Kinnamon JC. Taste bud cells with synapses express SNAP-25-like immunoreactivity. // J Comp Neurol. 2000a. 424, 205-215.

152. Yang R, Tabata S, Crowley HH, Margolskee RF, and Kinnamon JC. Ultrastructural localization of gustducin immunoreactivity in microvilli of type II taste cells in the rat. IIJ Comp Neurol. 2000b. 425, 139-151.

153. Yee CL, Yang R, Bottger B, Finger ТЕ, and Kinnamon JC. "Type III" Cells of Rat Taste Buds, Immunohistochemical and Ultrastructural Studies of Neuron-Specific Enolase, Protein Gene Product 9.5, and Serotonin. // J Comp Neurol. 2001.440, 97-108.

154. Yegutkin GG, Henttinen T, and Jalkanen S. Extracellular ATP formation on vascular endothelial cells is mediated by ecto-nucleotide kinase activities via phosphotransfer reactions. //FASEB. 2001.15,251-260.

155. Yegutkin GG, Henttinen T, Samburski SS, Spychala J, and Jalkanen S. The evidence for two opposite, ATP-generating and ATP-consuming, extracellular pathways on endothelial and lymphoid cells. // Biochem. J. 2002. 367,121-128.

156. Yoshioka K, Saitoh O, and Nakata H. Heteromeric association creates a P2Y-like adenosine receptor. II Proc Natl Acad Sci USA. 2001. 98:7617-7622.

157. Yoshie S, Kanazawa H, and Fujita T. A possibility of efferent innervation of the gustatory cell in the rat circumvallate taste bud. // Arch Histol Cytol. 1996. 59, 479^84.

158. Zeng Q, Kwan A, and Oakley B. Gustatory innervation and Bax-dependent Caspase-2, Participants in the life and death pathways of mouse taste receptors cells. IIJ Comp Neurol. 2000. 424, 640-650.

159. Zhao GQ, Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Erlenbach I, Ryba NJ, and Zuker CS. The receptors for mammalian sweet and umami taste. // Cell. 2003. 115:255-266.

160. Zimmermann H. Extracellular metabolism of ATP and other nucleotides. // Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 2000. 362, 299-309.

Информация о работе

Федоров, Илья Валерьевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федоров, Илья Валерьевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Федоров, Илья Валерьевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федоров, Илья Валерьевич, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика