Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологический анализ популяции клеток вкусовой почки. Идентификация хеморецепторных клеток млекопитающих

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физиологический анализ популяции клеток вкусовой почки. Идентификация хеморецепторных клеток млекопитающих"

На правах рукописи

р4

Романов Роман Александрович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ВКУСОВОЙ ПОЧКИ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХЕМОРЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Специальность «Биофизика» 03.00.02.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2007

003068596

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Авдонин Павел Владимирович

кандидат биологических наук Сафронова Валентина Григорьевна

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится 17 мая 2007г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан2007г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Смолихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Самые разнообразные животные от беспозвоночных до млекопитающих обладают органами вкуса, важнейшая функция которых - анализ химического состава пищи. Вкусовое ощущение зарождается при возбуждении специализированных сенсорных клеток - вкусовых рецепторных клеток - в составе плотных клеточных образований - вкусовых почек. Основополагающей функцией вкусовых рецепторных клеток является распознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации о их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга На основе ультраструктурных критериев идентифицировано несколько типов клеток, включая округлые базальные и три типа веретеновидных клеток (типы I, П, Ш), которые функционируют во вкусовых почках. Фактически, популяция веретенообразных клеток во вкусовой почке еще более гетерогенна, поскольку клетки подвергаются постоянному обмену и образуются из пролиферирующих и дифференцирующихся базальных клеток. Поэтому даже во взрослом организме среди веретенообразных вкусовых клеток есть клетки, находящиеся на разных стадиях развития, т.е. взрослеющие, взрослые и апоптотические.

К настоящему времени идентифицирован ряд сигнальных белков, которые, как считается, играют ключевую роль в трансдукции вкусовых стимулов. Среди них следует упомянуть: 1) гептаспиральные трансмембраяные рецепторы вкусовых веществ, вызывающих ощущения горького, сладкого и умами; 2) G-белок гастдуцин, эффекторный фермент фосфолипазу С (52, ионный канал TRPM5, удаление (knock-out) каждого из которых приводит к снижению или даже подавлению чувствительности генетически модифицированных животных к вкусовым веществам, упомянутых выше категорий; 3) ионный канал PKD2L1 (относится к семейству TRP-каналов), участвующий в распознавании кислого. Хотя полученные на настоящий момент данные позволяют нарисовать достаточно стройную картину вкусовой трансдукции, фактически, последовательность внутриклеточных событий от связывания вкусового вещества с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора не прослежена ни для одного из стимулов. Кроме того, ряд ключевых экспериментов допускает неоднозначное толкование. Например, подавление чувствительности вкусовой системы, вызванной нокаутом определенных сигнальных молекул, было продемонстрировано лишь в поведенческих экспериментах и/или на уровне активности вкусового нерва. Между тем, генно-инженерные манипуляции со вкусовой системой могли затрагивать как собственно вкусовую трансдукцию так и механизмы межклеточной коммуникации во вкусовой почке, включая афферентную нейропередачу. Эти две возможные мишени генетического нокаута неотличимы на уровне интегральных тестов, каковыми являются поведенческие эксперименты и регистрация активности вкусового нерва Следовательно, дискутируемые механизмы вкусовой трансдукции требуют проверки на уровне одиночных вкусовых клеток с использованием ингибиторного анализа. В то же

время, в электрофизиологических экспериментах, в которых подобный анализ может быть проведен, морфологические или иммуногистохимические критерии неприменимы для идентификации истинно рецепторных клеток.

Исследование вкусовых ответов предполагает регистрацию активности истинно хеморецепторных вкусовых клеток До настоящего времени функциональных критериев для их идентификации не существовало. Самый естественный на первый взгляд и надежный критерий - ответы на вкусовые стимулы - оказался неэффективным, поскольку процент клеток вкусовой почки, отвечающих на вкусовые стимулы, весьма низок и в разных препаратах составляет 1-3% Это могло быть связано с десенситизацией клеток при выделении, но другой причиной могло быть то, что фракция истинно рецепторных клеток невелика, а фракция клеток, отвечающая за распознавание вкусового стимула данного типа -весьма малочисленна. В силу сказанного, нам представлялось весьма целесообразным разработать критерии для идентификации клеток, изолированных из вкусовой почки, на основе их электрических характеристик.

Цель исследования.

Основным направлением данного исследования было провести физиологический анализ гетерогенной популяции клеток вкусовых почек млекопитающих с целью идентификации истинно рецепторных вкусовых клеток.

Основные задачи исследования.

1. Провести электрофизиологический анализ изолированных вкусовых клеток, который мог бы послужить основой для их идентификации.

2. Установить корреляции между электрофизиологическими характеристиками вкусовых клеток и их функциональными свойствами, включая экспрессию определенных маркерных молекул, способность распознавать вкусовые стимулы и высвобождать АТФ -основной афферентный нейротрансмиттер периферического вкусового органа.

Научная новизна работы.

На основе статистически репрезентативной серии экспериментов, в которых регистрировалась электрическая активность примерно 1000 вкусовых клеток, впервые установлено, что они могут быть однозначно распределены на три группы (А, В, С). Клетки всех трех типов представлены в трех исследовавшихся вкусовых сосочках - желобоватом, листовидном и грибовидном - что свидетельствует о универсальности данной электрофизиологической классификации.

Впервые показано, что вкусовые клетки типа А экспрессируют в-белок гастдуцин и ионные каналы ТКРМ5, являющиеся ключевыми сигнальными элементами системы трансдукции вкусовых стимулов категорий горького и сладкого, и умами. Показано, что данные клетки в ответ на вкусовую стимуляцию генерируют входящий ток, приводящий к их деполяризации. Впервые продемонстрирована функциональная активность ионных каналов ТЯРМ5 и исследована их термочувствительность. В своей совокупности эти и другие результаты свидетельствуют о том, что вкусовые клетки типа А являются истинно

2

хеморецепторными.

Впервые исследована секреция АТФ вкусовыми клетками с использованием АТР-биосенсора. Показано, что одиночные вкусовые клетки, отвечающие за распознавание горького, сладкого и умами, высвобождают АТФ в ответ на деполяризацию плазматической мембраны - явление, которое сопровождает вкусовую трансдухцию. Установлено, что выброс АТФ вкусовыми клетками основан не на классическом секреторном механизме -экзоцитозе - но скорее всего опосредован АТФ-проницаемыми ионными каналами.

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты значительно расширяют существующие представления о молекулярной физиологии вкусовых клеток и о механизмах межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Разработанные электрофизиологические критерии для идентификации клеток вкусовой почки, выполняющих хеморецепторную функцию, позволят существенно повысить эффективность будущих исследований вкусовой трансдукции на уровне одиночных вкусовых клеток. Методические разработки, использовавшиеся в работе, особенно метод биосенсора для мониторинга внеклеточного АТФ, могут представлять интерес для исследования других клеточных систем.

Апробаиия диссертации.

Материалы диссертации были представлены на VII Пущинской конференциии молодых ученых (Пущино, 2003г.); на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005гт.); на «4th European Biophysics Congress» (Испания, 2003г.); на 19-том съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004г.); на всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С.-Петербург, 2005г.); на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005г.); на IV международной конференции «Химическая коммуникация животных. Фундаментальные проблемы» (Москва, 2006г.).

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в 16 печатных работах, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на страницах с использованием рисунков, 2 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на одиночных вкусовых клетках, изолированных из желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков языка мыши по описанной ранее методике (Baryshnikov et al., 2003). Электрическая активность вкусовых клеток регистрировалась методом patch clamp (voltage-clamp, current clamp) в конфигурации «whole-

3

cell» и «perforated patch clamp» (Рис.1 А) с помощью усилителя Axopatch 200 В (Axon Instruments), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1322А и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все «Axon Instruments», США).

Для мониторинга внутриклеточного кальция в клетках АТФ-биосенсорах использовали проникающий флуоресцентный зонд Fluo-4AM. Изменение концентрации цитозольного кальция визуализировали при помощи ICCD-камеры IC-200 (Photon Technology International), используя микроскоп Axioscope-2 и водно-иммерсионный объектив Achroplan-40, NA=0.8 (Zeiss) Флуоресценция возбуждалась на длине волны 480 нм при помощи осветителя на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах с волоконно-оптическим выходом (Хохлов и др., 2007). Эмиссионное излучение фильтровалось интерференционным узкополосным фильтром 535±20 нм (Chroma) и последовательные флуоресцентные изображения регистрировались каждые 0.5-2 сек при помощи программы ImagingWorkBench 5.2 (INDEC Biosystems). Схема эксперимента по одновременной регистрации активности вкусовых клеток и клеток АТФ-биосенсоров представлена на рисунке 1 В.

Все эксперименты проводились при температуре 23-25 °С. Система перфузии обеспечивала смену экстраклеточного раствора со скоростью 0,1 мл/с. При регистрациии в конфигурации «whole-cell» клетки диализовались раствором в составе (мМ): 140 KCl/CsCl, 2 MgATP, 0.5 EGTA или 10 В APTA, 10 HEPES-KOH. При использовании конфигурации «perforated patch clamp» регистрирующий электрод содержал (мМ): 140 KCl/CsCl, 1 MgCb, 0.5 EGTA, 10 HEPES-KOH (CsOH), и 400 мкг/мл амфотерицина Б. Базовый внеклеточный раствор содержал (мМ): 140 NaCl, 1 СаС12, 1 MgCb, 10 HEPES-NaOH. Когда было нужно, раствор модифицировался так что ионы Na+, К+ и/или Cl" эквимолярно замещались на другие катионы и/или анионы. Для всех растворов рН 7,4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток. Три типа вкусовых клеток на основе их электрофизиологических характеристик.

Мы проанализировали около 1000 веретенообразных вкусовых клеток мыши и установили, что в псевдофизиологических условиях регистрации в ответ на импульсную стимуляцию вкусовые клетки демонстрировали наличие потенциал-зависимых (ГО) клеточных токов различных семейств. Характерные регистрации представлены на рис. 2А-С, и для удобства клетки, демонстрирующие родственные семейства интегральных токов, были отнесены к типам А, В и С, соответственно.

Клетки типа А были наиболее представлены в популяции изолированных клеток вкусовой почки (-52%). Для клеток этого типа были характерны входящие ПЗ натриевые токи амплитудой 100-800 пА, блокируемые ТТХ, относительно медленно активирующиеся выходящие токи порядка 2 нА и значительные по амплитуде хвостовые токи, генерируемые в ответ на реполяризацию клеточной мембраны до поддерживаемого потенциала в -70 мВ (Рис. 2А).

Рисунок 1. Экспериментальные методы. А - схема регистрации клеточных токов методом perforated patch clamp. В - схема мониторинга клеткой-биосенсором внеклеточного АТФ, высвобождаемого вкусовыми клетками.

Анализ хвостовых токов позволяет грубо оценить природу проводимости, активируемую при данном командном потенциале. Мгновенный хвостовой ток можно записать как /, = G(VJ (Vh- Vr), где G(V) - проводимость при данном потенциале, Vc -командный потенциал, Vh, - поддерживаемый потенциал, V, - потенциал реверсии. Из уравнения следует, что в псевдофизиологических ионных условиях при Vh =-70 мВ калиевые каналы должны производить выходящие хвостовые токи, в то время как причиной входящих хвостовых токов могут быть другие катионные и анионные каналы. Таким образом, вклад калиевых каналов в ПЗ выходящие токи в клетках типа А мал. Действительно, частичная замена экстраклеточного натрия на теграэтиламмокий {TEA), блокатор калиевых каналов, незначительно блокировала выходящие токи. Кроме того, замена К+ в штч-пипетке на Cs+ не вызывала существенных изменений выходящих токов (Рис, ЗА), как следовало бы ожидать, если бы таковые транспортировались преимущественно К+-селективными каналами.

Тип В (-31% клеток) в псевдофизиологи чесих условиях также демонстрировал наличие чувствительных к ТТХ потенциал-зависимых Na'-токов, обычно превышающих по амплитуде натриевые токи, регистрируемые в клетках типа А (Рис 2В). В сравнении с последними, для выходящих токов клеток типа В была характерна относительно быстрая активация и слабая инактивация. При Vh= -70 мВ хвостовые токи были сравнительно малы и имели входящее направление при потенциалах, меньших -20 мВ и становились выходящими при более положительных потенциалах. Это свидетельствует о том, что К.* являе-гся основным носителем выходящих токов при потенциалах -10 мВ и выше (Рис. 2В-вставка). Соответственно, экстраклеточныс TEA и хинин блокировали данную проводимость. При замене калия на цезий в пэтч-пипетке, т.е. в условиях Na<,ut/Csjn градиента, выходящие токи блокировались почти полностью, а хвостовые токи соответственно становились входящими (Рис. ЗВ),

50 мВ

-120 -60 0 60 Мембранный потенциал (мВ)

Рисунок 3. Эффекты

внутриклеточного Сб* на интегральные токи, регистрируемые от клеток злектрофизиологически идентифицированных подтипов. А -интегральный ток, регистрируемый последовательно от клеток типа А при замене в кончике пэтч-пипетки К.+ на (амплитуда выходящих токов меняется слабо). В и С - замена К+ на Сз+ значительно подавляет выходящие токи в клетках типа В и С.

Рисунок 2. Вкусовые клетки демонстрируют различные наборы интегральных токов. А-С репрезентативные семейства

потенциал- зависимых (ГО) интегральных токов (слева) и соответствующие вольт-амперные кривые (справа). А, В и С справа -зависимость неинактиви-рующегося тока (V), ПЗ Ка+-тока (А), и хвостовых токов (•) (вставки в А и В) от мембранного потенциала. Вставка в С - вольт-амперная зависимость быстрого ёмкостно-подобного тока (о), регистрируемого несмотря на полную компенсацию мембранной ёмкости.

БЗ секунды после прорыва петча

через? мин

В отличие от типов А и В, клетки С-типа при случайной выборке встречались относительно редко (13%). В условиях диализа раствором, содержащим 140 тМ К+, данные клетки демонстрировали потенциал-зависимые (ПЗ) выходящие токи амплитудой 0,3-1 нА и

полное отсутствие потенциал-зависимых натриевых токов (Рис 2С) Экстраклеточный ТЕА и внутриклеточный Сэ* ингибировали выходящие токи (Рис ЗС), из чего мы заключили, что они в значительной мере транспортируются К+ каналами В условиях Каощ/Св,,, градиента даже при качественной компенсации емкостных токов мембраны клетки наблюдались быстрые переходные токи в ответ на поляризацию и реполяризацию Потенциал реверсии для них был примерно равен поддерживаемому потенциалу независимо от его значения -свойства характерные для электрогенного ионного обмена (Рис 2С-вставка, ЗС) Около 4 % клеток не имели потенциал-зависимых токов

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что по характерным наборам интегральных ионных токов, регистрируемых как в условиях Као^/Кщ градиента (Рис 2), так и при Ыаощ/Свщ градиенте (Рис 3), популяцию вкусовых клеток можно четко разделить на три группы Более тщательный электрофизиологический анализ выявил и другие характерные свойства, присущие типам А, В и С Так активность ПЗ Са2+-каналов не наблюдалась ни в клетках типа А, ни в клетках типа С В то же время, для клеток типа В, изолированных из желобоватого и листовидного сосочков, ПЗ Са2+ -токи регистрировались даже при 1 мМ Са2+ в экстраклеточном растворе, и токи значительно возрастали в условиях 10 мМ эксраклеточного Ва2+ (до 100-350 пА) ПЗ Ва2+-токи не инактивировались и блокировались нифедипином (100 мкМ) (Рис 4 А,В), что свидетельствует о преобладании кальциевых каналов Ь-типа Также наблюдались небольшие (~ 40 пА) Т-подобные Ва2+-токи (Рис 4 С-Е)

-60 -30 О 30 60

Мембранный потенциал, мВ

Рисунок 4. ПЗ Ва +-токи в присутствии 2 мкМ ТТХ А, В - ингибирование Ва +-токов 100 мкМ нифедипина С, Э - Т-подобный Ва2+-ток увеличивался и ингибировался при использовании препульсов -90 мВ и -40 мВ соответственно Е - вольтамперные характеристики Т-подобного Ва2+-тока (•) (определяемого как разница между инактивирующейся и неинактивирующейся компонентами ПЗ Ва2+-тока) и ПЗ Ва2+-тока Ь-типа (Д) при при использовании гиперполяризующего препульса -90 мВ

Токи, активируемые длительной гиперполяризацией (In, HCN-, CNH-каналы), впервые были засвидетельствованы на вкусовых клетках крысы (Stevens et al., 2001). Мы также наблюдали 1ь-токи, но исключительно в клетках типа В (Рис. 5). Хотя амплитуда этих токов значительно варьировала от клетки к клетке (50-200 пА), возможно из-за разного внутриклеточного уровня цАМФ, фактически эта проводимость наблюдалась во всех клетках типа В, когда использовался методика перфорированного пэтч-клямпа (Рис. 1), имеющего то преимущество перед «whole-cell» регистрациями, что внутриклеточные компоненты не вымываются.

амплитуда в начальный момент хвостовых токов за вычетом амплитуды токов в начальный момент импульсной стимуляции, G(VC) - проводимость при данном командном потенциале, Vi, -поддерживаемый потенциал, V, - потенциал реверсии.

Более ранние исследования показали наличие К+-токов входящего выпрямления во вкусовых клетках грызунов (Sun & Herness, 1996). В наших экспериментах увеличение экстраклеточной концентрации ионов калия смещало потенциал реверсии интегрального тока вправо и увеличивало входящую компоненту, регистрируемую при отрицательных потенциалах - факты, обычно рассматриваемые как свидетельство активности К+-каналов входящего выпрямления. Отметим однако, что для клеток типов А и С увеличение концентрации экстраклеточного К+ вплоть до 40 мМ оказывало влияние главным образом на выходящие токи, в клетках типа В это вызывало увеличение как входящих, так и выходящих токов. Учитывая, что электрохимическая движущая сила для выходящих калиевых токов падает с увеличением наружного К+, такая зависимость выходящей компоненты от калия предполагает активную роль экстраклеточного К+, включая модуляцию воротного механизма для К+-каналов (Yeilen, 2002) и прямую активацию катионных каналов ионами К+ (Kolesnikov & Margolskee, 1998). Таким образом, для клеток типа В вклад К+-каналов входящего выпрямления в интегральные токи остается неопределенным.

t

Мб

Рисунок 5. Токи, активируемые длительной гиперполяризацией. А - активация 1ь-токов в контроле (сверху) и их ингибирование 2 мМ экстраклеточного CsCl (снизу). Клетка перфузировалась

экстаклеточным Na-pacrBopoM и диализовалась 140 мМ КС1, используя метод «perforated patch clamp». В - Вольт-амперная зависимость Ih-тока. Ток вычислялся как разница между током в конце и начале импульса потенциала. С -Зависимость проводимости Ih-тока от потенциала. Проводимость по формуле G(VJ = V (V„-Vr), где I, -

Полученные нами данные показывают, что три типа клеток, выявленные на основе простых электрофизиологических критериев (Рис. 2, 3), существенно различаются по набору ионных каналов (Таблица 1). Поскольку функционально различные клетки практически всегда различаются и по электрофизиологическим свойствам, как свидетельствуют многочисленные литературные данные, вполне вероятно, что идентифицированные нами электрофизиологические подтипы А, В и С соответствуют функционально различным вкусовым клеткам. В частности, какой-то из этих типов мог бы состоять из истинно хеморецепторных клеток. Поэтому в дальнейшем мы попытались установить корреляции между электрическими свойствами клеток и их другими функциональными характеристиками, чтобы понять могут ли электрофизиологические критерии быть применимы для идентификации хеморецепторных клеток.

Таблица 1. Характеристика вкусовых клеток трех электрофизиологических типов.

Элекгрофизиологические характеристики Тип А Тип В Тип С

Потенцвял-завшямые На+-кянялы + + -

Потендпл*швс1ми( К+-кявалы +> шлый витвд + +

Несся еетнвиая конная проводимость а« MiA + - -

Потенцнал-зависаны« С«2-Нканады L ■ Т *пша - + -

HCN-токя - + -

Калиевые каналы «холящего выпрямления + ? +

Калий-актив ируеиая калиевая яров одни ость - + -

П. Идентификация вкусовых рецепторных клеток, специализирующихся в распознавании веществ категорий горьких, сладких в умами.

II.1. Вкусовые клетки, экспрессирующие гастдуцин, относятся к электрофизиологическому типу А.

Идентификация на основе данных световой и электронной микроскопии трех типов

клеток, имеющих веретенообразную форму, косвенно подразумевает специализацию вкусовых клеток по физиологическим функциям (например, хеморецепторные, поддерживающие, секреторные). Исследования с использованием белков-маркеров позволили провести некоторые корреляции между морфологией и их функциями. Клетки, не относящиеся ко И типу, так как не экспрессируют ни TRPM5, ни T2R, ни T1R (скорее всего тип III), отвечают за распознавание кислых (Huang et al., 2006) стимулов. В то же время считается, что клетки II морфотипа являются рецепторными, специализируясь в распознавании горьких и сладких веществ и относящихся к категории умами. Основанием для этого является то, что клетки типа II экспрессируют рецепторы горького (T2R), сладкого (T1R2/T1R3) и умами (T1R1/T1R3) и сигнальные белки, принимающие непосредственное

участие во вкусовой трансдукции стимулов перечисленных модальностей. Прежде всего это гастдуцин, фосфолипаза С р2 и ионный канал TRPM5, удаление (knock-out) которых приводит к снижению или потере вкусовых ответов на поведенческом уровне и при регистрациях от вкусового нерва (Wong et al., 1996; Zhang et al., 2003). В частности, у мышей с инактивированным геном а-гастдуцина отмечались редуцированные поведенческие реакции и ответы, регистрируемые от вкусового нерва, на такие горькие вещества, как денатониум, хинин, циклогексимид, тетраэтиламмоний, и на сладкие вещества, включая сахарозу, пролин, триптофан, сахарин, ацесульфам К и SC45647 (Wong et al., 1996). В лаборатории Роберта Маргольского (США) была создана генетически модифицированная линия мышей, гастдуцин-положительные клетки которых экспрессируют флуоресцирующий белок GFP, что придает им зеленый цвет. Благодаря этому вкусовые клетки, экспрессирующие гастдуцин, могут бьггь легко идентифицированы во флуоресцентном микроскопе. Нами была проведена серия экспериментов с этими трансгенными животными, в которых мы попытались выяснить, можно ли идентифицировать гастдуцин-положительные вкусовые клетки на основе их электрических характеристик. Как было установлено, зеленые, т.е. экспрессирующие гастдуцин, клетки принадлежат исключительно к типу А. В то же время среди темных клеток, то есть клеток, не имеющих гастдуцина, были клетки всех трех электрофизиологических типов (см. Таблицу 2).

Таблица 2. Электрофизиологически идентифицированные типы вкусовых клеток, выделенные из желобоватого сосочка ОБР-трансгенной мыши.

Количество клеток

Тип А Тип В Тип С Не определен

GFP-положительные (п=48) 48 (100%) 0 0 0

GFP-отрицательные (п=43) 12 (28%) 25 (51%) 7 (16%) 2 (5%)

На основании сравнительного анализа ОБР-положительных и йГР-отрицательных клеток мы оценили, что примерно 2/3 вкусовых клеток типа А являются гастдуцин-положительными. Поскольку гастдуцин положительные клетки - это субпопуляция клеток типа П, полученные выше данные свидетельствовали о том, что электрофизиологический подтип А и морфологический тип П, вероятнее всего, представляют собой одну и ту же популяцию вкусовых клеток (эксперименты с трансгенными животными выполнены совместно с С.С. Колесниковым и Р. Маргольским).

11.2. ТКРМ5 функционирует во вкусовых клетках типа А.

Другим критерием, подтверждающим тождество клеток типа А и типа II, явилось бы наличие в типе А ионных каналов ТКРМ5. таРМ5 - это калыдай-активируемый канал, экспрессирующийся во всех клетках П типа. Так как специфических блокаторов для ТКРМ5 нет, мы попытались выяснить его наличие в типах А, В и С, используя

электрофизиологические методы анализа. Несколько исследовательских групп изучали Са2+-зависимость TRPM5 в экспрессионных системах и опубликовали различающиеся концентрации полуэффекта Kos и коэффициенты Хилла Пн: Ко5=21 мМ и пн=2.4 (Liu and Liman, 2003), Ко 5=840 нМ and nH=5 (Prawitt et al, 2003), и Ко 5=700 нМ и nH=6.1 (Ullrich et al, 2005). Однако для всех этих зависимостей фракция TRPM5 каналов, открытых при [Са2+] = 70 нМ (концентрация кальция в покоящихся клетках - Kim et al., 2000), должна быть порядка 10"6, что предполагает ничтожную активность TRPM5 в нестимулированных вкусовых клетках. Чтобы активировать TRPM5, цитозольный кальций повышался с помощью ионофора иономицина (1-2 мкМ) - это увеличивало ионную проницаемость в клетках типа А. Однако наличие больших ПЗ выходящих токов в клетках типа А, которые варьируют во времени по амплитуде, существенно затрудняло исследование Са2+-зависимой проводимости. В поисках оптимальных условий регистраций, мы обнаружили, что в нестимулированных иономицином клетках ингибитор фосфолипазы С U73122 (5 мМ) вызывал относительно быстрое и фактически необратимое ингибирование ПЗ токов в клетках типа А (Рис. 6А). Механизм такого ингибирования остался не ясен, но это позволило нам изолировать иономицин-стимулируемый ток и построить его вольт-амперные кривые в различных условиях. В клетках типа А, предобработанных U73122, при поддерживаемом потенциале -70 мВ иономицин вызывал хорошо заметный входящий ток (Рис. 6В), сопровождающийся заметным увеличением проводимости мембраны (Рис. 6С). В условиях 140 мМ Naout/140 мМ Csm потенциал реверсии иономицин-стимулированного тока был около ОмВ (п=11) (Рис. 6 С, кривые 4,5 и 5-4), замена наружного Na+ на NMDG+, непроницаемый ион для катион-селективных каналов, включая TRPM5 (Liu and Liman, 2003) смещал потенциал реверсии к -55-60 мВ (Рис. 6В и С, кривые 3 и 6 и 6-3). Эти результаты свидетельствуют о катионной селективности данных каналов и указывают на то, что Na+ и Cs+ действительно одинаково проникают, как и в случае TRPM5 каналов (Liu and Liman, 2003; Prawitt et al, 2003). Кроме того, иономицин-стимулируемые токи сильно увеличивались с повышением температуры в исследовательской камере, показав коэффициент Qio=4.7±0.6 (Рис. 6D и Е). Таким образом, как иономицин-стимулируемый ток, так и TRPM5 каналы характеризуются сходной ионной селективностью, заметным выходящим выпрямлением (Рис. 6 С) (Liu and Liman, 2003) и высокой термочувствительностью (Рис. 6Е) (Ullrich et al, 2005), свойства, подтверждающие их идентичность. Очень важно, что ТЯРМ5-подобный катионный канал был специфичен для клеток типа А: иономицин стимулировал Са-активируемый хлорный ток в клетках типа С (см. П1), и не имел эффекта на базовый ток в клетках типа В. Это первая физиологическая регистрация TRPM5 каналов на клетках вкусовых почек.

Рисунок 6. В клетках типа А функционируют TRPM5- подобные каналы. А -

ингибирование ПЗ каналов ингибитором фосфолипазы С U73122. В - при поддерживаемом потенциале -70 мВ 1 мкМ иономицин активирует в клетках типа А входящий ток, который хорошо детектируется в клетках с подавленными ПЗ

-токами, предварительно обработанных ингибитором фосфолипазы С U73122. С - Вольт-амперные кривые ПЗ токов до обработки U73122 и после обработки (С1, С2); С5, Сб - токи, активированные иономицином в условиях 140 мМ экстраклеточного Na+ и при его замене на 140 мМ NMDG+. С5-4, С6-3 - разности кривых 5 и 4, 6 и 3 соответственно. D, Е -температурная зависимость иономицин-стимулированного тока. D (сверху) — активация входящего тока иономицином, (внизу) - температура в регистрирующей камере. Е - соответствующие (D) вольт-амперные характеристики. Е (вставка) - зависимость отношения 1Л25 от температуры t, I, и 125 -иономицин-стимулированный ток при потенциале -80 мВ и при температурах t и 25° С соответственно (п=5), соответствующий коэффициент Qio=4,7. Регистрации иономицин стимулированного тока были выполнены в конфигурации whole-cell, в условиях диализа внутриклеточным Cs+-pacTBopoM, содержащим 1 мМ EGTA.

II.3. Вкусовые клетки типа А рецептируют горькие вещества.

Так как в клетках типа А функционируют гастдуцин и TRPM5 каналы, клетки данного типа должны быть хеморецепторными, т.е. должны отвечать на вкусовые вещества, в частности горькие. Для того чтобы проверить данное предположение, мы исследовали активность этих клеток в покое и при стимуляции смесью горьких веществ (100 мкМ циклогексимид + 1 мМ денатониум). Способность отвечать у диссоциированных вкусовых клеток оказалась крайне низкой: лишь 5 из 91 клеток типа А (5,5%) ответили на вкусовой стимул генерацией входящего, инактивирующегося тока (Рис. 7). Это сопоставимо с величиной порядка 3%, полученной ранее для клеток, вкусовые ответы которых исследовались фотометрически (De Fazio et al., 2006). Несмотря на столь низкий процент клеток, отвечающих на вкусовые стимулы, данные эксперименты демонстрируют, что клетки типа А действительно способны отвечать на вкусовые стимулы. К тому же, ни в клетках типа В, ни в клетках типа С горькие стимулы не вызывали заметных изменений тока покоя при поддерживаемом потенциале -70 мВ.

Nad NMDGC1

NaCI

. . S мкМ ЦУ3122 (4 мин) 10 сек 11 нА

1 шМиоиощцин

0 1 2 3 4 5 Время (мин)

-80 -40 О 40 80 -ео -40 О 40 80 -60 -«0 0 40 80 Мембранный пагетиал, мВ и ^

D 2 НМ иомоммции Е ? ^

5 сек -

11 нА

-60 -40 0 40 вО Мембранный потеедиал

3 >

с

2 •=

1 ! о] -1 мВ

смесь горьких веществ (100 мкМ циклогексимид+1 мМ денатониум)

Рисунок 7. Ответы на горькие вещества клеток типа А. Слева — аппликация горького вкусового стимула привела к генерации входящего инакгивирующегося тока (регистрация в режиме voltage-clamp, Vh= -70). Справа - деполяризация вкусовой клетки в ответ на горький вкусовой стимул (регистрация в режиме current-clamp).

П.4. Клетки типа А в ответ на деполяризацию высвобождают АТФ.

Недавнее исследование показало, что мыши с инактивированными (knock-out) Р2Х2/Р2ХЗ рецепторами теряют способность отвечать на вкусовые стимулы всех модальностей. Это, как и наблюдение, что горькие вещества стимулировали секрецию АТФ из языкового эпителия, содержащего вкусовые клетки, говорит о том, что АТФ является афферентным нейротрансмиттером в акте вкусовой рецепции (Finger et al., 2005). В этой связи, было естественным исследовать вкусовые клетки на способность секретировать АТФ. Хотя цепь внутриклеточных событий, приводящих к выбросу афферентного медиатора вкусовыми клетками и возбуждению вкусового нерва неизвестна, по аналогии с другими секретирующими клетками, можно предположить, что деполяризация является трштерным механизмом, запускающим секрецию АТФ вкусовыми клетками, которые следовательно должны деполяризоваться в ответ на вкусовую стимуляцию. Те немногочисленные эксперименты, в которых наблюдались ответы вкусовых клеток на горькие вещества, подтвердили, что вкусовые стимулы действительно вызывают деполяризующие ответы (Рис.7).

Способность высвобождать АТФ вкусовыми клетками проверялась в экспериментах (совместно с Рогачевской О А), в которых осуществлялась одновременная регистрация электрической активности вкусовых клеток методом patch clamp и мониторинг внутриклеточного Са2+ в клетках АТФ-биосенсорах (Рис. 1В). В качестве АТФ-биосенсоров использовались клетки линии COS-1, загруженные Са2+ индикатором Fluo-4. Клетки этой линии оказались чувствительны к АТФ в субмикромолярных концентрациях (порог чувствительности около 50 нМ), и практически нечувствительны к другим возможным медиаторам, наличие которых показано для вкусовых клеток (Roper, 2006) - ацетилхолину, серотонину, глутамату, ГАМК (Рис. 8). Ответы клеток COS-1 на 1 мкМ АТФ практически полностью блокировались неспецифическим ингибитором Р2-рецепторов сурамином.

Рясуиок я. к л-1 -Л' линии COS-1 в качестве АТФ-биоеенсора, А - кальциевые сгветы клетки COS-1 при аппликации А"ГФ в ра^:' ачных концсц1~рацияк. ] 1[Х*Л1ЛТ"?-Ш1е>1ные данные имсяол репрезентергивныИ харэкпц! ;■ 5) В - относительные оIве :клеток COS-t на ¡Наличные вещества (г 3-6). Каждая клетка сначала стимулировалась I мкМ АРФ и качества контроля, и iscc ответы нормировались на амилиг\лу контрольного о I ■к'Л принятою 100 %.

Гисунок У. Высво&ождййие АТФ вкусовыми ЛЯП к":'-И! Л исследование секреции АТФ при помощи АТФ-биосенсора ЛI одновременная paich clamp регистрация вкусовой клетки и клетки COS-!, загруженной F1uo-4; Л2-4 флуоресцентное

изображения клеток линии COS-1 в контроле (А2) и после деполяризации вкусовой клетки до Ш мВ (A3, А4) Е1 относительное изменение флуоресценции 3:1по-4, регистрируем^ от верхней левой клетки в ЛI -4, в контроле, в присутствии 100 мкм сурамина и после его отмыва. С корреляции между алекгрофизиол отчески ми характеристиками и выбросом АТФ вкусовыми клетками: лишь клетки типа А сскретируют ЛТФ в ответ па деполяризацию

К си' да вкусовые клетки поддерживались при потенциале -70 мВ. расположенные рядом клетки линии COS-I но

генерировав».....каких кальциевых сигналов (Рис. 9А2). Однако, деполяризация вкусовых

клеток до потенциала -10 мВ и выше инициировала повышение Са ' в клетках COS-1 (Рис. 9А2-4, 9В) с задержкой 3-10 секунд в зависимости от расстояния между вкусовой клеткой и АТФ-биосенсором. Антагонист пурипорецепторов сурам и н (100 мкМ) (Рис. 913) подавлял втвещ АТФ-биосенсора, что подтверждало пуррнергическую природу вещества, высвобождаемого вкусовыми клетками и детектируемого клетками линии COS-1, Таким

образом, электрическая стимуляция вкусовых клеток приводила к повышению экстраклеточной концентрации АТФ вблизи АТФ-сенсора.

Важным вопросом было выяснить, вкусовые клетки какого типа (А, В или С) высвобождали АТФ. Учитывая весьма вероятную идентичность клеток типа А и типа II, являющихся хемосенсорными, можно было бы предположить, что именно клетки типа А должны высвобождать АТФ. Действительно почти все клетки типа А, выделенные из желобоватого и листовидного сосочков, секретировали АТФ в ответ на деполяризацию (87%). В то же время мы не смогли зарегистрировать высвобождение АТФ клетками типа В.

На данный момент известны следующие механизмы секреции АТФ самыми разнообразными клетками: экзоцитоз, управляемый локальным повышением кальция (Тоь$1ег е1 а1.,1999), а также трансмембранный перенос АТФ с помощью АВС-транспортеров или ионных каналов (ВоШп & ВипШоск, 2001; ЬагагохУБЫ е! а1., 2003). Если во вкусовых клетках работает везикулярный механизм выброса АТФ, то блокирование входа наружного Са2+ и/или подавление выброса депонированного Саг+ должно было бы заметно снизить секрецию АТФ. Однако снижение экстраклеточного Са2+ до 100 нМ (п=9) и диализ клеток типа А быстрым кальциевым хелатором ВАРТА (10 мМ) (п=4) не привели к заметным изменениям секреции АТФ этими клетками (Рис. 10А). Этот факт свидетельствует против классического (везикулярного) механизма выброса АТФ.

Рисунок 10. АТФ высвобождается из вкусовых клеток через ионные каналы. А - АТФ-секреция вкусовыми клетками запускается деполяризацией и не зависит от кальция: ни снижение экстраклеточного кальция, ни диализ быстрым кальциевым хелатором ВАРТА (ЮмМ) не вызывало снижения секреции АТФ клетками типа А В - ответы клетки сенсора на серийную деполяризацию вкусовых клеток до потенциалов, указанных над кривыми. С • АТФ-ответы (Д) С08-1 клеток как функция деполяризации вкусовой клетки с -70 мВ до указанного потенциала в течение 5 секунд. Ответы АТФ сенсоров коррелировали с интегральной проводимостью О вкусовых клеток (•), рассчитанную по уравнению I = ¿(У-У^), где I, V и V, - ток, мембранный потенциал и потенциал реверсии соответственно. Данные представлены как среднее±стандартное отклонение (п=3-7).

Серия деполяризирующих импульсов АТФ-секретирующих вкусовых клеток обычно вызывала множественные, хорошо воспроизводимые ответы АТФ биосенсора (п=9) (Рис. 10 В), демонстрируя надежность секреторного механизма. Как функция мембранного потенциала выброс АТФ хорошо коррелировал с интегральной проводимостью и проявлял

Мембранный потенциал, мВ

в 70 40 0 30 ГО 20 10 -10 0 50 20 60 30 -20 30 40мВ 10 сек

строгую потенциал-зависимость. Так, при потенциале покоя вкусовых клеток типа А -43±3 мВ (п=41), пороговый потенциал выброса АТФ - около -10 мВ, а при 0 мВ выброс АТФ достигает половины от максимальных значений (Рис. 10 С). Такая потенциал-зависимость свидетельствовала в пользу ионных каналов как основных структур, транспортирующих АТФ из вкусовых клеток, поскольку было показано, что множество ионных каналов с заметной нелинейной вольт-амперной характеристикой могут опосредовать секрецию АТФ (Cotrina et al., 1998; Hazama et al., 2000; Sabirov et al., 2001; Bell et al., 2003; Bao et al., 2004).

IVJ. Ответы вкусовых клеток на АТФ.

Предыдущие исследования показали наличие ионотропных Р2Х2 и Р2ХЗ рецепторов в окончаниях вкусового нерва, иннервирующих вкусовые почки (Во et al, 1999). Эти рецепторы играют ключевую роль в передаче сигнала от вкусовых клеток к вкусовому нерву (Finger et al., 2005). Мы показали, что вкусовые клетки способны реагировать на вкусовую стимуляцию деполяризацией (Рис. 7) и секретироватъ АТФ (Рис. 9,10).

Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована экспрессия метаботропных P2Y рецепторов 1-й, 2-й, 4-й и 6-й изоформ во вкусовых клетках, сцепленная с мобилизацией внутриклеточного Са2+ (Bystrova et al., 2006). Физиологическая роль P2Y рецепторов в физиологии вкусовых клеток окончательно неясна, и нам представлялось интересным выяснить клетки какого типа способны отвечать на экстраклеточный АТФ. Как оказалось, лишь вкусовые клетки типа С генерировали ответы на экстраклеточные нуклеотиды (АТФ, УТФ и АДФ) в форме изменения тока покоя. Исследование АТФ-индуцируемого тока в клетках типа С показало, что, АТФ-зависимые входящие токи ассоциируются с активацией метаботропных пуринорецепторов (Р2У-рецепторов) и мобилизацией цитозольного кальция при участии фосфоинозитидного каскада.

Рисунок 11. АТФ и Са2+-ионофор А23187 активирует входящий ток в клетках типа С. А - ответы клетки на аппликацию АТФ и А23187 В -вольт-амперные характеристики клетки в контроле (1) и после активации АТФ (2). С - вольт-амперные характеристики клетки в контроле (3), после увеличения наружного Са2+ до 1 мМ (4) и после аппликации 9-АС (5).

2 мМ 9АС

Варьирование экстраклеточного ионного состава показало, что АТФ-индуцируемый

ток транспортируется хлорными каналами, которые ингбируются блокатором анионной проводимости 9-АС. Аппликация раствора, содержащего 1 мМ свободного кальция и Са2+-ионофор А23187, индуцировала входящий ток, характеризующийся линейной вольт-амперной характеристикой и блокируемый 9-АС в потенциал-зависимой манере. Таким образом, экстраклеточный АТФ и вход кальция индуцируют анионные токи со сходными свойствами, что может являться подтверждением того, что обе проводимости обеспечиваются одними и теми же Са2+-активируемыми СГ-каналами (Рис. 11).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак проведенные эксперименты показали, что большинство изолированных вкусовых клеток (>96%) могут быть разделены на три подгруппы (типы А, В и С) на основе простых электрофизиологических критериев Более тщательный элекгрофизиологический анализ подтвердил принципиальные различия клеток А, В и С типов по биофизическим свойствам, и прежде всего, по спектру функционально-экспрессируемых ионных каналов. В частности, для клеток типа А характерным является наличие каналов TRPM5, для клеток типа В - потенциал зависимых Са2+-каналов L-типа, для клеток типа С - отсутствие потенциал зависимых №+-каналов и наличие Са2+-активируемых хлорных каналов (см. также Табл.1). Эти и другие данные свидетельствовали о том, что клетки элекгрофизиологически идентифицированных типов скорее всего отличаются и функционально. Дальнейшие функциональные эксперименты подтвердили эту идею.

Из литературных источников известно, что вкусовые почки состоят их клеток нескольких морфотипов, которые отражают их функциональное различие. В частности, клетки типа П (светлые) функционируют как хеморецепторные для стимулов вкусовых категорий горького, сладкого и умами. Они экспрессируют вкусовые рецепторы и ключевые белки трансдукции данных стимулов: гастдуцин, TRPM5, фосфолипазу С р2. В связи с вышесказанным мы попытались установить корреляции между морфологической систематикой и классификацией на основе электрических параметров, используя характерную экспрессию маркерных молекул, трансгенных животных и функциональные свойства различных вкусовых клеток. Полученные данные привели нас к следующим соображениям:

1. Поскольку лишь клетки типа В экспрессируют потенциал-зависимые Са-каналы L-типа, это дало нам'основание поставить знак равенства между клетками типа В и клетками Ш морфо-типа, для которых характерно наличие потенциал-зависимых кальциевых каналов и образование афферентных синапсов с вкусовым нервом.

2. Морфотип П соответствует элеюрофизиологическому типу А, так как только клетки типа А экспрессируют гастдуцин, TRPM5. Функциональные тесты подтвердили справедливость данного соответствия, поскольку только клетки типа А оказались способны отвечать на вкусовые стимулы и секретироватъ АТФ. Поскольку АТФ является основным нейротрансмиттером во вкусовой рецепции, (Finger et al, 2005), то его секреция является еще одним принципиальным аргументом в пользу того, что вкусовые клетки типа А являются хеморецепторными.

3. Методом исключения клеткам типа С можно сопоставить клетки морфотипа I. Косвенно

такое соответствие подтверждается следующим. Клетки типа 1 экспрессирун» жто-АТФаау и являются об кладочными для клеток П типа, секретируклщгс АТФ. Поэтому тог факт, что клетки типа С способны отвечать на зкетраклеточный АТФ увеличением цитозольнсго кальция, делает целесообразным экспресс« шо экто-АТФазы именно в этом типе клеток.

Используя одновременную регистрацию электрической активности нкусовых клеток и мониторинг внеклеточного АТФ с помощью АТФ-биосенсора, мы исследовали механизм секреции АТФ клешами типа А. Нам удалось показать, что таковая не обусловлена везикулярным механизмом, характерным ддя кдассииескях синапсов., но осуществляется при участи АТФ-проницаемых ионных каналов, природа которых сейчас устанавливается. Эти данные объясняют почему не были идентифицированы классические синаптические структуры между афферентным вкусовым нервом и хеморецепторными клегками II и почему последние не экспрессируют потенциал зависимые Са2+-каналы.

Суммируя сказанное выше, отметим, что с учетом литературных даташх и основываясь та проведенных нами исследованиях, мы пришли к заключению, что хеморецепторными клетками, специализирующимися в распознавании горьких, сладких и умами стимулов, являются клетками типа А в соответствии с введенной нами электрофизиологической классификацией. Эти клетки используют уникаьный механизм для выброса афферентного нейротрансмитгера АТФ. Скорее всего, клетки типа В являются ршепториыми клетками, которые детектируют кислые и соленые стимулы и которые используют классический химический синапс для кодирования и передачи вкусовой информации. Клетки типа С вероятно вылолншот поддерживающую и секретирую-щую функции. В цепом, нам представляется, что клетки вкусовой почки функционируют так, как это представлено на Рис, 12.

Вкусовая клетка типа III Вкусовая клотка типа II Вкусовая клетка типа |

t*t

Рисунок 12.

Ги потети ческая

схема, иллюстрирующая функциональную специализацию клеток вкусовой почки.

выводы

1. Методом patch clamp проанализировно порядка 1000 веретенообразных вкусовых клеток, изолированных из желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков. Показано, что они могут быть однозначно отнесены к трем группам - тип А, В и С - на основе их электрофизиологических характеристик. На основании статистически репрезентативных данных предложены электрофизиологические критерии для идентификации изолированных вкусовых клеток.

2. Установлено, что каждому типу клеток соответствует определенный спектр функциональных ионных каналов. В частности, для типа А характерны потенциал-зависимые №+-каналы, К+-каналы входящего выпрямления, неселективные ионные каналы, катионные каналы TRPM5. Клеткам типа В свойственны потенциал-зависимые К+-каналы, потенциал-зависимые Ыа+-каналы, потенциал-зависимые Са2+-каналы L- и Т-типов, пейсмекерные (HCN) катионные каналы. Для типа С характерно отсутствие потенциал-зависимых Са2+ и Кта+-каналов, наличие потенциал-зависимых К+-каналов и К+-каналов входящего выпрямления, а также Са2+-активируемые С1" -каналы.

3. Разработана методика мониторинга секреции экстраклеточного АТФ при помощи АТФ-биосенсора. Показано, что только вкусовые клетки типа А секретируют АТФ -основной нейротрансмиттер во вкусовой почке - в ответ на деполяризацию. Секреция АТФ происходит без участия везикулярного механизма и, скорее всего, вовлекает АТФ-проницаемые ионные каналы.

4. Показано, что вкусовые клетки типа А экспрессируют G-белок гастдуцин и ионный канал TRPM5 - ключевые сигнальные белки вкусовой трапсдукции. Экспрессия этих маркерных молекул и функциональные свойства вкусовых клеток типа А позволяют идентифицировать их как истинно хеморецепторные, специализирующиеся в распознавании вкусовых веществ, относящихся к категории горького, сладкого и умами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Романов P.A.. Хохлов A.A., Колесников С.С. Входящий ток, активируемый АТР во вкусовых клетках мыши. II Биологические мембраны. 2005.22 (5), 390-395.

2. Romanov R.A.. Kolesnikov S.S. Eiectrophysiologicaly identified subpopulations of taste bud cells. // Neurosci Lett. 2006, 395 (3), 249-54.

3. Romanov R.A.. Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells // EMBO J. 2007. 26(3), 657-67.

4. Хохлов A.A., Романов P.A.. Зубов Б.В., Пашинин А.Д., Колесникрв С.С. Осветитель на излучающих диодах для микрофотометрических исследований клеток. II Приборы и техника эксперимента. 2007. (в печати).

Тезисы докладов

1. Барышников С.Г.. Рогачевская O.A.. Романов P.A.. Колесников С.С. Пуринергический сигнальный каскад вкусовых клеток. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2003. Материалы конференции, с. 3.

2. Барышников С.Г., Рогачевская O.A., Романов P.A. Патрушев М.В., Краева Ю.Е. Пуринергическая сигнальная система вкусовых клеток. //. 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2003. Сборник тезисов, с. 53.

3. Романов P.A.. Патрушев М.В., Краева Ю.Е., Рогачевская O.A., Барышников С. Г., Колесников С.С. Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток. // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2003. Сборник тезисов, с. 72.

4. Патрушев М.В., Краева Ю.Е., Рогачевская O.A., Барышников С.Г., Романов P.A. Анализ экспрессиисигнальных белков во вкусовых клетках. // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2003. Сборник тезисов, с. 360.

5. Романов P.A.. Патрушев М.В., Краева Ю.Е., Колесников С.С. Са2+-каналы L-типа с низкой чувствительностью к дигидропиридинам, экспрессируемые во вкусовых клетках. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2003. Материалы конференции, с. 118.

6. Bystrova М., Romanov R.A.. Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. Electrophysiological identification of taste cells. // 4th European Biophysics Congress, July 5-9, 2003, Spain. European Biophysics Journal, V.32, p.273.

7. Барышников С.Г., Рогачевская O.A., .Яценко Ю.Е., Федоров И.О., Романов P.A.. Колесников С.С. Пуринергическая сигнальная система вкусовых клеток. // 19-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова, 2004. Материалы съезда, с. 129.

8. Романов P.A.. Краева Ю.Е., Рогачевская O.A., Барышников С.Г., Колесников С.С. Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток мыши. // 19-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова, 2004. Материалы съезда, с. 185-186.

9. Романов P.A.. Рогачевская O.A., Колесников С.С. АТФ-зависимые хлорные токи вкусовых клеток мыши. Роль Р2У-рецепторов и фосфоинозитидного каскада.// Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и Медицина», Санкт-Петербург, 2005. Сборник материалов, с. 100.

10. Рогачевская O.A., Яценко Ю.Е., Федоров И.В., Романов P.A.. Колесников С.С. Рецепция экстраклеточного АТФ вкусовыми клетками // Научные труды 1-го съезда физиологов СНГ, 2005, том 1, с. 42.

11. Романов P.A.. Колесников С.С. Три субпопуляции вкусовых клеток идентифицированные на основе их электрофизиологических параметров.// Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2005. Материалы конференции, с. 214.

12. Романов P.A.. Рогачевская O.A., Быстрова М.Ф., Маргольский Р.Ф., Колесников С.С. Пуринергическая сигнализация во вкусовой почке млекопитающих. // IV Международная конференция «Химическая коммуникация животных. Фундаментальные проблемы», Москва, 2006. Материалы конференции, с. 61.

Подписано в печать 30.03.2007 г. Исполнено 03 04.2007 г. Печать трафаретная.

Заказ № 242 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романов, Роман Александрович

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

II. 1. Организация вкусового анализатора.

II. 1.1. Устройство периферического вкусового рецепторного органа.

II. 1.2. Морфологический анализ клеток вкусовой почки.

II. 1.3. Электрофизиологические анализ клеток вкусовой почки.

11.2. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке.

11.2.1. Первичные мессенджеры во вкусовой почке.

11.2.2. АТФ как афферентный вкусовой нейротрансмиттер.

11.2.3. Выброс АТФ.

11.3. Ионные каналы вкусовых клеток.

II. 3.1. Ионные каналы как детекторы вкусовых стимулов.

II. 3.2. Потенциал-зависимые ионные каналы вкусовых клеток.

11.4. Трансдукция вкусовых стимулов, опосредованная системой вторичных мессенджеров.;.

11.4.1. Трансдукция горьких и сладких стимулов.

11.4.3. Роль гастдуцина во вкусовой трансдукции.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

111.1. Выделение вкусовых клеток.

111.2. Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp).

111.3. Мониторинг внутриклеточного кальция (Ca-imaging).

111.4. АТФ-биосенсор.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

IV.1. Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток. Три типа вкусовых клеток на основе их электрофизиологических характеристик.

IV.2. Идентификация вкусовых рецепторных клеток, специализирующихся в распознавании веществ категорий горького, сладкого и умами.

IV.2.1. Вкусовые клетки, экспрессирующие гастдуцин, относятся к электрофизиологическому типу А.

IV. 2.2. TRPM5 функционирует во вкусовых клетках типа А.

IV. 2.3. Вкусовые клетки типа А рецептируют горькие вещества.

IV.2.4. Клетки типа А в ответ на деполяризацию высвобождают АТФ.

IV.3. Ответы вкусовых клеток на АТФ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологический анализ популяции клеток вкусовой почки. Идентификация хеморецепторных клеток млекопитающих"

Вкусовое ощущение заррждается нри возбуждении снециализированных сенсорных клеток вкусовых реценторных клеток в составе нлотных клеточных образований вкусовых ночек. Вкусовые ночки формируют нериферичекский вкусовой орган вкусовые сосочки 5 тинов, 3 из которых локализованы на языке желобоватые, листовидные и грибовидные. Основонолагающей функцией хемореценторных клеток в составе вкусовых ночек является раснознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации о их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга. На основе ультраструктурных критериев идентифицировано несколько тинов клеток, включая округлые базальные и три тина веретеновидных клеток (тины I, II, III), которые функционируют во вкусовых ночках. Фактически, понуляция веретенообразных клеток во вкусовой ночке еще более гетерогенна, носкольку клетки нодвергаются ностоянному обмену и образуются из нролиферирующих и дифференцирующихся базальных клеток. Поэтому даже во взрослом организме среди веретенообразных вкусовых клеток есть клетки, находящиеся на разных стадиях развития, т.е. взрослеющие, взрослые и анонтотические. Современные нредставления о вкусовой трансдукции базируются в основном на данных молекулярной биологии, новеденческих экснериментах и регистрациях электрической активности вкусового нерва. К настоящему времени идентифицирован ряд сигнальных белков, которые, как считается, играют ключевую роль в трансдукции вкусовых стимулов. Среди них следует уномянуть: 1) гентасниральные трансмембранные реценторы вкусовых веществ, вызывающих ощущения горького, сладкого и умами; 2) G-белок гастдуцин, эффекторный фермент фосфолиназу СР2, ионный канал TRPM5, удаление (knock-out) каждого из которых приводит к снижению или даже нодавлению чувствительности генетически модифицированных животных к вкусовым веществам, упомянутых выще категорий; 3) ионный канал PKD2L1 (относится к семейству TRP), участвующий в распознавании кислого. Тем не менее, при всей значимости данных последних лет, полученных преимущественно методами молекулярной биологии и генной инженерии, существующие представления о процессах возбуждения вкусовых клеток носят в значительной степени гипотетический характер. В частности, последовательность внутриклеточных событий от связывания вкусового вещества с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора фактически не прослежена ни для одного из стимулов. В силу этого, обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции еще предстоит проверить на уровне одиночных вкусовых клеток. Прогресс в области исследования сенсорных клеток других типов фоторецепторов, обонятельных и механочувствительных клеток в значительной степени базировался на результатах электрофизиологических или фотометрических экспериментов, в которых исследовались электрические ответы изолированных клеток или Са сигналы в их цитоплазме, индуцированные адекватными сенсорными стимулами светом, запахами, половыми феромонами или механическими возмущениями. Обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции могли бы быть проверены в аналогичных физиологических опытах. Однако, процент вкусовых клеток, отвечающих на вкусовые стимулы чрезвычайно мал. Отчасти это могло быть связано с десенситизацией клеток при их выделении. Другой вероятной причиной могло быть то, что во вкусовой почке многие клетки вовлечены в выполнение нерецепторной функции. Иными словами, фракция истинно рецепторных клеток невелика, а фракция клеток, отвечающая за распознавание вкусового стимула данного типа, весьма немногочисленна. одиночными Поскольку в физиологических их экспериментах на с вкусовыми и клетками идентификация критериев основе нам морфологических цитологических невозможна, представлялось весьма актуальным попытаться идентифицировать вкусовые клетки, в том числе истинно рецепторные, на основе их электрических характеристик. Многочисленные корреляции между морфологией клеток и их биофизическими параметрами, установленные с использованием самых разнообразных клеточных систем, давали надежду, что данный подход окажется эффективным. В свете изложенного, основной целью настоящей работы было провести электрофизиологический анализ гетерогенной популяции изолированных вкусовых клеток, который мог бы послужить основой для их идентификации. В результате проведенных экспериментов нам удалось установить, что вкусовые клетки, выделенные из языковых сосочков всех типов желобоватого, листовидного и грибовидного действительно могут быть однозначно

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Романов, Роман Александрович

1. Методом patch clamp проанализировано порядка 1000 веретенообразных

вкусовых клеток, изолированных из желобоватого, листовидного и

грибовидного сосочков. Показано, что они могут быть однозначно отнесены

к трем группам - тип А, В и С - на основе их электрофизиологических

характеристик. На основании статистически репрезентативных данных

предложены электрофизиологические критерии для идентификации

изолированных вкусовых клеток. 2. Установлено, что каждому типу клеток соответствует определенный

спектр функциональных ионных каналов. В частности, для типа А

характерны потенциал-зависимые Na^-каналы, К^-каналы входящего

выпрямления, неселективные ионные каналы, катионные каналы TRPM5. Клеткам типа В свойственны потенциал-зависимые К'^ -каналы, потенциал зависимые Na'^ -каналы, потенциал-зависимые Са^^-каналы L- и Т-типов,

пейсмейкерные (HCN) катионные каналы. Для типа С характерно отсутствие

потенциал-зависимых Са^ ^ и Na^-каналов, наличие потенциал-зависимых К"^ -

каналов и К^-каналов входящего выпрямления, а также Са^^-активируемые

СГ -каналы. 3. Разработана методика мониторинга секреции экстраклеточного АТФ

при помощи АТФ-биосенсора. Показано, что только вкусовые клетки типа А

секретируют АТФ - основной нейротрансмиттер во вкусовой почке - в ответ

на деполяризацию. Секреция АТФ происходит без участия везикулярного

механизма и, скорее всего, вовлекает АТФ-проницаемые ионные каналы. 4. Показано, что вкусовые клетки типа А экспрессируют G-белок

гастдуцин и ионный канал TRPM5 - ключевые сигнальные белки вкусовой

трансдукции. Экспрессия этих маркерных молекул и функциональные

свойства вкусовых клеток типа А позволяют идентифицировать их как истинно хеморецепторные, специализирующиеся в распознавании вкусовых

веществ, относящихся к категории горького, сладкого и умами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романов, Роман Александрович, Пущино

1. Гистология (введение

2. Романов РА, Хохлов АА, Колесников СС. Входящий ток, активируемый АТР во вкусовых клетках мыши. Биологические мембраны. 2005. 22 (5), 390-395.

3. Хохлов АА, Романов РА, Зубов БВ, Пашинин АД, Колесников СС. Осветитель на излучающих диодах для микрофотометрических исследований клеток. Приборы и техника эксперимента. 2007. №3, 128-131.

4. Abbaffy Т, Trubey KR, Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and modulation of camp in rat taste cells. AmJPhysiol Cell Physiol. 2003. 284, 1420-1428.

5. Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, Zuker CS. Novel Family of Mammalian Taste Receptors. Cell. 2000.100,693-702.

6. Akabas M, Dodd J, Awqati Q. Identification of electrophysiologically distinct subpopulations of rat taste cells. JMembrBiol. 1990.114 (1), 71-8.

7. Avenet P, Lindemann B. Amiloride-blockable sodium currents in isolated taste receptor cells.///Membrane 5/o/. 1988.105,245-255.

8. Avenet P, Lindemann B. Noninvasive recording of receptor cell action potentials and sustained currents from single taste buds maintained in the tongue: the response to mucosal NaCl and amiloride. IIJ Membr Biol. 1991. 124,33-41. 9. Bao L, Locovei S, Dahl G. Pannexin membrane channels are mechanosensitive conduits for ATP. FEBSLett. 2004. 572,65-68.

9. Bartel DL, Sullivan SL, Lavoie EG, Sevigny J, Finger ТЕ. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the Ecto-ATPase of type I cells in taste buds.IIJCompNeurol. 2006. 497:1-12.

10. Baryshnikov SG, Rogachevskaja OA, Kolesnikov SS. Cacium signaling mediated by P2Y receptors in mouse taste cells. J Neurophysiol. 2003. 90, 3283-3294.

11. Behe P, DeSimone JA, Avenet P, Lindemann B. Membrane currents in taste cells of the rat fungiform papilla. Evidence for two types of Ca currents and inhibition of К currents by saccharin. J Gen Physiol. 1990. 96, 10611084.

12. Beidler LM, Smallman RL. Renewal of cells within taste buds. J Cell Biol. 1965.П{2),263-12.

13. Bell PD, Lapointe J-Y, Sabirov R, Hayashi S, Peti-Peterdi J, Manabe K, Kovacs G, Okada Y. Macula densa cell signaling involves ATP release through a maxi anion channel. II Proc Natl Acad Sci USA. 2003.100,4322-4327. 75

14. Bemhardt SJ, Naim M, Zehavi U, Lindemann B. Changes in IP3 and cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of sweet taste in the rat. IIJ Physiol. 1996.490,25-36.

15. Bianchi L, Driscoll M. Protons at the gate: DEG/ENaC ion channels help us feel and remember. Neuron. 2002. 34,337-340.

16. Bigiani A, Delay Ю, Chaudhari N, Kinnamon SC, Roper SD. Responses to glutamate in rat taste cells. IIJNeurophysiol. 1997. 77, 3048-3059.

17. Bigiani A, Ghiaroni V, Fieni F. Channels as taste receptors in vertebrates. II Progress in Biophysics Molecular Biology. 2003. 83,193-225.

18. Bigiani A. Mouse taste cells with glia-like membrane properties. J Neurophysiol. 2001a. 85,1552-1560.

19. Bigiani A. Amiloride-sensitive sodium currents in identified taste cells of U\efrog.llNeuroReport. 2001b. 12,1315-1321.

20. Bigiani AR, Roper SD. Mediation of responses to calcium in taste cells by modulation of a potassium conductance.//iSc/eiJce. 1991.252,126-128. 23. Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, Bumstock G. Localization of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds. Neuroreport. 1999. 10, 1107-1111.

21. Bodin P, Bumstock G. Purinergic signalling: ATP Release. Neurochem /?e5. 2001. 26, 959-969.

22. Boughter JD, Pumplin DW, Yu C, Christy RC, Smith DV. Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and hamster. JNeurosci. 1997.17,2852-2858.

23. Bumstock G. The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. Neuropharmacology. 1997. 36, 1127-1139.

24. Bystrova MF, Yatzenko YE, Fedorov IV, Rogachevskaja OA, Kolesnikov SS. P2Y isoforms operative in mouse taste cells. Cell and Tissue Research. 2006. 323,377-382.

25. Caicedo A, Jafri MS, Roper SD. In Situ Ca Imaging Reveals Neurotransmitter Receptors for Glutamate in Taste Receptor Cells. J Neurosci. 2000. 20, 7978-7985.

26. Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W, Zuker CS, Ryba N. T2Rs Function as Bitter Taste Receptors. Cell. 2000. 100, 703711.

27. Chaudhari N, Landin AM, Roper SD. A novel metabotropic glutamate receptor is a taste receptor for monosodium L-glutamate. Nat Neurosci. 2000. 3,113-119. 76

28. Chen Y, Hemess MS. Electrophysiological actions of quinine on voltagedependent currents in dissociated rat taste cells. PJIugers Arch. 1997. 434,215-26.

29. Chen YS, Sun XD, Herness MS. Characteristics of action potentials and their underlying outward currents in rat taste receptor cells. J Neurophysiol. 1996.75,820-31.

30. Clapp TR, Medler KF, Damak S, Margolskee RF, Kinnamon SC. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMCBiol 2006.4,7.

31. Clapp TR, Stone LM, Margolskee RF, Kinnamon SC. Immunocjochemical evidence for co-expression of Type III receptor with signaling components of bitter taste transduction. Neuroscience. 2001. 6, 210.

32. Cotrina ML, Lin JH, Alves-Rodrigues A, Liu S, Li J, Azmi-Ghadimi H, Kang J, Naus CC, Nedergaard M. Connexins regulate calcium signaling by controlling ATP release.//ProciVa//ca 5c/ USA. 1998. 95,15735-15740.

33. Cummings ТА, Kinnamon SC. Apical K"-channels in Necturus taste cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. J Gen Physiol. 1992. 99,591-613. 38. De Fazio RA, Dvoryanchikov G, Maruyama Y, Kim JW, Pereira E, Roper SD, Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in mouse taste buds. IIJ Neurosci. 2006.26, 3971-3980.

34. Delay RJ, Kinnamon JC, Roper SD. Ultrastructure of mouse vallate taste buds:

35. Cell types and cell lineage. llJComp Neurol. 1986. 253,242-252.

36. Delay RJ, Kinnamon SC, Roper SD. Serotonin modulates voltage dependent calcium current in Necturus taste cells. IIJ Neurophysiol. 1997. 77, 2515-2524.

37. Delay Ю, Roper SD. Ultrastructure of taste cells and synapses in the mudpuppy Necturus maculosus. IIJ Comp Neurol. 1988. 277,268-280.

38. Donaldson SH, Picher M, Boucher RC. Secreted and cell-associated adenylate kinase and nucleoside diphosphokinase contribute to extracellular nucleotide metabolism on human airway surfaces. Am J Respir Cell Mol BioL 2002. 26,209-215.

39. Doolin RE, Gilbertson ТА. Distribution and characterization of functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. IIJ Gen Physiol 1996. 107, 545-554.

40. Elliott EJ, Simon SA. The anion in salt taste: a possible role for paracellular pathways. Brain Res. 1990. 535, 9-17.

41. Evans RJ, Derkach V, Surprenant A. ATP mediates fast synaptic transmission in mammalian neurons. II Nature. 1992. 357,503-505.

42. Finger ET, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L, Hellekant G, Kinnamon SC. ATP Signaling Is Crucial for Communication from Taste Buds to Gustatory Nerves. Science. 2005. 310, 1495-1499.

43. FischerW, Franke H, Groger-Amdt H, Illes P. Evidence for the existence of P2Y( 1,2,4) receptor subtypes in HEK-293 cells: reactivation of P2Y(1) receptors after repetitive agonist application Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2005. 371,466-472.

44. Fossier P, Tauc L, Baux G. Calcium transients and neurotransmitter release at an identified synapse. Trends Neurosci. 1999. 22,161-166.

45. Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Differential distribution of two Ca+dependent and -independent K+ channels throughout receptive and basolateral membranes of bullfrog taste cells. II Arch Eiir J Physiol. 1994.429,285-290.

46. Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Non-selective cation channel in bullfrog taste cell membrane. NeuroReport. 1993. 5,11-13.

47. Furue H, Yoshii K. In-situ tight-seal recordings of taste substance- elicited action currents and voltage-gated Ba currents from single taste bud cells in the peeled epithelium of mouse tongue. Brain Res. 1997. 776,133-139.

48. Ganchrow JR. Taste cell function. Structural and biochemical implications. Physiol Behav. 2000. 69,29-40.

49. Garty H, Palmer LG. Epithelial sodium channels: function, structure, and regulation. II Physiol Rev. 1997.77,359-396.

50. Gilbertson ТА, Avenet P, Kinnamon SC, Roper SD. Proton currents through amiloride-sensitive Na channels in hamster taste cells role in acid transduction. IIJGen Physiol. 1992.100, 803-824.

51. Gilbertson ТА, Damak S, Margolskee RF. The molecular physiology of taste transduction. Curr Opin Neurobiol. 2000.10,519-527. 78

52. Gilbertson ТА, Zhang H. Characterization of sodium transport in gustatory epithelia from the hamster and rat. Chem Senses. 1998a. 23, 283293.

53. Gilbertson ТА, Zhang H. Self-inhibition in amiloride-sensitive sodium channels in taste receptor cells. IIJ Gen Physiol. 1998b. I l l 661-611.

54. Hayashi S, Hazama A, Dutta AK, Sabirov RZ, Okada Y. Detecting ATP release by a biosensor method. Sci STKE. 2004. 258, pi 14.

55. Hazama A, Fan HT, Abdullaev I, Maeno E, Tanaka S, Ando-Akatsuka Y, Okada Y. Swelling-activated, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-augmented ATP release and СГ conductances in murine С127 cells. //JP/2;;5/o/. 2000. 523, 1-11.

56. Heck GL, Mierson S, DeSimone JA. Salt taste transduction occurs through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. Science. 1984. 223,403-405.

57. Hemess MS, Gilbertson ТА. Cellular mechanisms of taste transduction. Annu Rev Physiol 1999. 61, 873-900.

58. Herness MS, Sun XD. Characterization of chloride currents and their noradrenergic modulation in rat taste receptor cells. J Neurophysiol. 1999. 82,260-271.

59. Hemess MS, Sun XD. Voltage-dependent sodium currents recorded from dissociated rat taste cells. IIJMembrBioL 1995. 146,73-84.

60. Herness S, Chen Y. Serotonergic agonists inhibit calcium-activated potassium and voltage-dependent sodium currents in rat taste receptor cells. J MembrBiol. 2000.173(2), 127-38.

61. Herness S, Chen Y. Serotonin inhibits calcium-activated K current in rat taste receptor cells. II NeuroReport. 1997. 8,3257-3261.

62. Hemess S, Zhao F, Kaya N, Lu S, Shen T, Sun X. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. IIJ Physiol. 2002a. 543, 601-614.

63. Hemess S, Zhao F, Lu S, Kaya N, Shen T. Expression and Physiological Actions of Cholecystokinin in Rat Taste Receptor Cells. J Neurosci. 2002b. 22,10018-10029.

64. Hemess S. Coding in taste receptor cells: the early years of intracellular xtcoxdxngs. II Physiol Behav. 2000. 69,17-27.

65. Holland VF, Zampighi GA, Simon SA. Tight junctions in taste buds: possible role in perception of intravascular gustatory stimuli. Chem Senses. 1991.16,69-79.

66. Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba N, Zuker CS. Putative Mammalian Taste Receptors: A Class of Taste-Specific GPCRs with Distinct Topographic Selectivity. Cell. 1999. 96,541-551. 79

67. Huang L, Shanker YG, Dubauskaite J, Zheng JZ, Yan W, Rosenzweig S, Spielman AI, Max M, Margolskee RF. Ggammal3 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nat Neurosci. 1999.2, 1055-1062.

68. Huang Y-J, Lu K-S. Immunohistochemical studies on protein gene product 9.5, serotonin and neuropeptides in vallate taste buds and related nerves of the guinea pig. II Arch Histol Cytol. 1996. 59,43341.

69. Huang Y-J, Maruyama Y, Lu K-S, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D, Roper SD. Mouse Taste Buds Use Serotonin as a Neurotransmitter. J Neurosci. 2005. 25(4), 843-847.

70. Kanazawa H, Yoshie S. The taste bud and its innervation in the rat as studied by immunohistochemistry for PGP 9.5, II Arch Histol Cytol 1996. 59, 357-367.

71. Kawai K, Sugimoto K, Nakashima K, Miura H, Ninomiya Y. Leptin as a modulator of sweet taste sensitivities in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97,11044-11049.

72. Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, Hemess S. A paracrine signaling role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor subtypes. II Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004. 286(4), R649-58.

73. Kinnamon JC, Taylor BG, Delay RJ, Roper SD. Ultrastructure of mouse taste buds. Taste cells and their associated synapses. J Comp Neurol. 1985. 235,48-60.

74. Kinnamon SC, Dionne VE, Beam KG. Apical localization of K+ channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85,7023-7027. 80

75. Kolesnikov SS, Margolskee RF. A cyclic-nucleotide-suppressible conductance activated by transducin in taste cells. Nature. 1995. 376, 85-88.

76. Kolesnikov SS, Margolskee RF. Extracellular K activates a K* and i f permeable conductance ion frog taste receptor cells. IIJ Physiol. 1998. 507, 415432.

77. Kossel AH, McPheeters M, Lin W, Kinnamon SC. Development of membrane properties in taste cells of fungiform papillae: functional evidence for early presence of amiloride-sensitive sodium channels. II JNeurosci. 1997. 17,9634-9641.

78. Kretz 0, Barbry P, Bock R, Lindemann B. Differential expression of RNA and protein of the three pore-forming subunits of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel intaste buds of the rat. J Histochem Cytochem. 1999.47,51-64.

79. Kumazawa T, Brand JG, Teeter JH. Amino acid-activated channels in the catfish taste system. Biophys J. 1998. 75,2757-2766.

80. Kusakabe Y, Yamaguchi E, Tanemura K, Kameyama K, Chiba N, Arai S, Emori Y, Abe K. Identification of two alpha-subunit species of GTP-binding proteins. Gal5 and Gaq, expressed in rat taste buds. Biochim Biophys Ada. 1998.1403,265-272.

81. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Constitutive release of ATP and evidence for major contribution of ecto-nucleotide pyrophosphatase and nucleoside diphosphokinase to extracellular nucleotide concentrations. II JBiol Chem. 2000. 275, 31061-31068.

82. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Interplay of constitutively released nucleotides, nucleotide metabolism and activity of P2Y receptors. DrugDev Res. 2001. 53, 66-71.

83. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Mechanisms of Release of Nucleotides and Integration of Their Action as P2X- and P2Y-Receptor Activating Molecules. II Mol Pharmacol. 2003. 64, 785-795.

84. Leybaert L, Braet K, Vandamme W, Cabooter L, Martin PE, Evans WH. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell CommunAdhes. 2003.10,251-257. 101. Li JH-Y, Lindemann B. Multi-photon imaging of extracellular tracers in taste disk and fungiform papilla of the frog. Cell Tiss Res. 2003. 313,11-27. 102. Li X-J, Blackshaw S, Snyder SH. Expression and localization of amiloride-sensitive sodium channel indicate a role for non-taste cells in taste i USA. 1994. 91,1814-1818. 81

85. Lindemann B, Barbry P, Kretz 0, Bock R. Occurrence of ENaC subunit mRNA and immunocytochemistry of the channel subunits in taste buds of the х2Х\2\Ы2фЬ. II Ann NYAcad Sci. 1998.855,116-127.

86. Lindemann B. Receptors and transduction in taste.// Nature. 2001. 413, 219-225.

87. Lindemann B. Taste reception. //Physiol Rev. 1996. 76,718-766. 110. Liu D, Liman ER. Intracellular Ca and the phospholipids PIP2 regulate the taste transduction ion channel TRPM

88. Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100,15160-15165.

89. Locovei S, Bao L, Dahl G. Pannexin 1 in erythrocytes: function without a gap. Proc Natl Acad Sci USA. 2006. 103,7655-7659.

90. Medler KF, Margolslee RF, Kinnamon SC. Electrophysiological characterization of voltage-gated currents in defined taste cell types in mice. JNeurosci. 2003. 23,2608-2617.

92. Basolateral amiloride-sensitive Na+ transport pathway in rat tongue epithelium. IIJ Neurophysiol. 1996. 76, 1297-1309.

93. Misaka T, Kusakabe Y, Emori Y, Gonoi T, Arai S, Abe K. Taste buds have a cyclic nucleotide-activated channel, CNGgust. J Biol Chem. 1997. 272, 22623-22629. 82

94. Miyamoto T, Miyazaki T, Fujiyama R, Okada Y, Sato T. Differential transduction mechanisms underlying NaCl- and KCl-induced responses in mouse taste cells. Chem Senses. 2001.26,67-77.

95. Miyamoto T, Miyazaki T, Okada Y, Sato T. Whole-cell recording from non-dissociated taste cells in mouse taste bud. IIJ Neurosci Methods. 1996a. 64,245-252.

96. Montmayeur JP, Liberles SD, Matsunami H, Buck LB. A candidate taste receptor gene near a sweet taste locus. Nat Neurosci. 2001 4,492-498.

97. Murray RG, Murray A, Fujimoto A. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. IIJ Ultrastruct Res. 1969. 27,444-461.

98. Murray RG, Murray A. The anatomy and ultrastructure of taste endings. In Taste and Smell in Vertebrates, ed. GEW Wolstenholme, J Knight. 1970. pp. 3-

100. Nagai T, Kim DJ, Delay RJ, Roper SD. Neuromodulation of transduction and signal processing in the end organs of taste. Chem Senses. 1996. 21, 353-365.

101. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJ, Zuker CS. An amino-acid taste receptor. Nature. 2002.416(6877), 199-202.

102. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJ, Zuker CS. Mammalian sweet taste receptors. Cell. 2001.106,381-390.

103. Nelson GM, Finger ТЕ. Immunolocalization of different forms of neural cell adhesion molecule (NCAM) in rat taste buds. llJComp Neurol. 1993. 336, 507-516.

104. Noguchi T, Ikeda Y, Miyajima M, Yoshii K. Voltage-gated channels involved in taste responses and characterizing taste bud cells in mouse soft palates. Brain Res. 2003. 982,241-259.

105. Nolte C, Martini R. Immunocytochemical localization of the LI and NCAM cell adhesion molecules and their shared carbohydrate epitope L2/HNK1 in the developing and differentiated gustatory papillae of the mouse tongue. JNeurocytol. 1992.21,19-33. 131.0gura T. Acetylcholine increases intracellular Ca" in taste cells via activation of muscarinic receptors. IIJ Neurophysiol. 2002. 87,2643-2649.

106. Okada Y, Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Inositol 1,4,5-trisphosphate activates non-selective cation conductance via intracellular Ca2+ increase in isohted frog tastQCQWs. I I EurJ Neurosci. 1998.10,1376-1382.

107. Ostrom RS, Gregorian C, Insel PA. Cellular release of and response to ATP as key determinants of the set-point of signal transduction pathways. J Biol Chem. 2000.275,11735-11739. 83

108. Pearson JD, Gordon JL. Vascular endothelial and smooth muscle cells in culture selectively release adenine nucleotides. Nature. 1979.281,384-386.

109. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, Max M, Margolskee RP. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. //Nat Neurosci. 2002. 5(11), 1169-76.

110. Picher M, Boucher RC. Human airway ecto-adenylate kinase. A mechanism to propagate ATP signaling on airway surfaces. J Biol Chem, 2003.278,11256-11264.

111. Prawitt D, Monteilh-ZoUer MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig A, Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to rapid changes in [Cai. Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100, 1516615171.

112. Romanov RA, Kolesnikov SS. Electrophysiologicaly identified subpopulations of taste bud cells. //Neurosci Lett. 2006. 395 (3), 249-54.

113. Romanov RA, Rogachevskaja OA, Bystrova MF, Jiang P, Margolskee RF, Kolesnikov SS. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. EMBOJ. IQQl. 26(3), 657-67.

114. Roper SD, McBride DWJ. Distribution of ion channels on taste cells and its relationship to chemosensory transduction. IIJ Membr Biol. 1989. 109, 2939.

115. Roper SD. Cell communication in taste buds. Cell Mol Life Sci. 2006. 63,1494-1500.

116. Rossler P, Boekhoff I, Tareilus E, Beck S, Breer H, Freitag J. G protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter transduction. Chem Senses. 2000. 25,413-421.

117. Ruiz-Avila L, McLaughlin SK, Wildman D, McKinnon PJ, Robichon A, Spickofsky N, Margolskee RF. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase through transducin in taste receptor cells. Nature. 1995. 376 (6535). 80-5.

118. Ruiz-Avila L, Wong GT, Damak S, Margolskee RF. Dominant loss of responsiveness to sweet and bitter compounds caused by a single mutation in a-gustducin. II Proc Natl Acad Sci USA. 2001. 98, 8868-8873.

119. Sabirov RZ, Dutta AK, Okada Y. Volume-dependent ATPconductive large-conductance anion channel as a pathway for swelling-induced ATP release. IIJGen Physiol 2001.118,251-266.

120. Schwiebert EM, Zsembery A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim Biophys Acta. 2003.1615,7-32.

121. Schwiebert LM, Rice WC, Kudlow В A, Taylor AL, Schwiebert EM. Extracellular ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayers of 84

122. Shen T, Kaya N, Zhao FL, Lu SG, Cao Y, Hemess S. Co-expression patterns of the neuropeptides vasoactive intestinal peptide and cholecystokinin with the transduction molecules alpha-gustducin and T1R2 in rat taste receptor CQWSJ/Neuroscience. 2005.130(1), 229-38.

123. Simon SA, Holland VF, Benos DJ, Zampighi GA. Transcellular and paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction. IIMicroscRes Tech. 1993. 26,196-208.

124. Smith CUM. Biology of sensory systems John Wiley Songs, Ltd. Chichester, 2000,445 p.

125. Sorensen CE, Novak I. Visualization of ATP release in pancreatic acini in response to cholinergic stimulus. Use of fluorescent probes and confocal microscopy. IIJBiol Chem. 2001. 276,32925-32932.

126. Stevens DR, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof W, Kaupp UB, Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCNl and HCN4 mediate responses to sour stimuli. II Nature. 2001.413, 631-635.

127. Stewart RE, Lyall V, Feldman GM, Heck GL, DeSimone JA. Acidinduced responses in hamster chorda tympani and intracellular pH tracking by taste receptor cells. II Am J Physiol. 1998. 275, C227-C238.

128. Stone LM, Tan S-S, Tam PPL, Finger ТЕ. Analysis of Cell Lineage Relationships in Taste Buds. IIJNeuroscL 2002.22(11), 4522-4529.

129. Stout CE, Costantin JL, Naus CC, Charles AC. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J Biol Chem. 2002. 277, 10482-10488. 157. Sun X-D, Hemess MS. Characterization of inwardly rectifying potassium currents from dissociated rat taste receptor cells. Am J Physiol. 1996. 271, C1221-C1232.

130. Toyono T, Seta Y, Kataoka S, Harada H, Morotomi T, Kawano S, Shigemoto R, Toyoshima K. Expression of the metabotropic glutamate receptor, mGluR4a, in the taste hairs of taste buds in rat gustatory papillae. IIArch Histol Cytol. 2002. 65,91-96.

131. Tsunenari T, Kurahashi T, Kaneko A. Activation by bitter substances of a cationic channel in membrane patches excised from the bull frog taste receptor cell. IIJPhysiol. 1999. 519,39704.

132. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T, Tohyama M, Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. Nature. 1998. 395, 555-556.

133. Ugawa S, Yamamoto T, Ueda T, Ishida Y, Inagaki A, Nishigaki M, Shimada S. Amiloride-insensitive currents of the acid-sensing ion channel-2a ASIC2a)/ASIC2b heteromeric sour-taste receptor channel. II JNeurosci. 2003. 23(9), 3616-3622. 85

134. Wakisaka S, Miyawaki Y, Youn SH, Kato J, Kurisu K. Protein gene product 9.5 in developing mouse circumvallate papilla: comparison with neuron-specific enolase and calcitonin gene-related peptide. Anat Embryol. 1996.194,365-372.

135. Waldmann R, Lazdunski M. H+-gated cation channels: neuronal acid sensors in the NaC/DEG family of ion channels. Curr Opin Neurobiol 1998. 8,418-424.

136. Welsh MJ, Proce MP, Xie J. Biochemical basis of touch perception: mechanosensory function of degenerin/epithelial Na+ channels. II JBiol Chem. 2002. 277,2369-2372.

137. Wong GT, Gannon KS, Margolskee RF Transduction of bitter and sweet taste by gustducin. Nature. 1996. 381,796-800.

138. Yamamoto T, Nagei T, Shimura T, Yasoshimi Y. Roles of chemical mediators in the taste system. llJpn J Pharmacol. 1998. 76,325-348.

139. Yang R, Crowley HH, Rock ME, Kinnamon JC. Taste bud cells with synapses express SNAP-25-like immunoreactivity. J Comp NeuroX. 2000a. 424,205-215.

140. Yegutkin GG, Henttinen T, Jalkanen S. Extracellular ATP formation on vascular endothelial cells is mediated by ecto-nucleotide kinase activities via phosphotransfer reactions. FASEB. 2001.15,251-260.

141. Yegutkin GG, Henttinen T, Samburski SS, Spychala J, Jalkanen S. The evidence for two opposite, ATP-generating and ATP-consuming, extracellular pathways on endothelial and lymphoid cells. Biochem J. 2002.367,121-128.

142. Yellen G. The voltage-gated potassium channels and their relatives. 2002.419, 35-42. 86

144. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D, Zuker CS, Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Different receptor cells sharing similar signaling pathways. Cell. 2003.112,293-301.

145. Zimmermann H. Extracellular metabolism of ATP and other nucleotides. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2000. 362, 299-309. 87