Иммуно-физиологический статус у рыб из природных популяций и аквакультуры в норме и при патологии

Маклакова, Мария Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуно-физиологический статус у рыб из природных популяций и аквакультуры в норме и при патологии
ВАК РФ 03.02.06, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Иммуно-физиологический статус у рыб из природных популяций и аквакультуры в норме и при патологии"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

Маклакова Мария Евгеньевна

ИММУНО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У РЫБ ИЗ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ И АКВАКУЛЬТУРЫ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.02.06 - ихтиология 03.03.03 - иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МДР Ш

005012524

МОСКВА-2012

005012524

Работа выполнена на кафедрах иммунологии и ихтиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В .Ломоносова

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент

Кондратьева Ирина Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Касумян Александр Ованесович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Микодина Екатерина Викторовна (Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, Москва)

доктор биологических наук, профессор Микряков Вениамин Романович (Институт биологии внутренних вод имени И.Д. Папанина РАН, Борок, Ярославская обл.)

Ведущая организация: Институт водных проблем Севера Карельского

научного центра РАН (Петрозаводск)

Защита диссертации состоится 23 марта 2012 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.53 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова, по адресу: 119234 Москва, Ленинские Горы, 1,12, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, аудитория 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «22» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Т.И. Куга

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время во многих развитых странах мира увеличивается производство продуктов питания, получаемых за счет аквакультуры. Масштабный рост искусственного выращивания рыб и других гидробионтов неизбежно сопровождается деградацией водных экосистем, вспышками массовых заболеваний среди культивируемых объектов и аборигенных представителей природных водоемов, усилением дестабилизирующего воздействия на рыб различных стрессовых факторов естественного и антропогенного происхождения (Наумова, 1991; Лукьяненко, Кулик, 1994; Буторина, 1997; Van der Oost, 1998; Грищенко и др., 1999; Карасева, 2001; Казимирченко, 2006; Мелехова и др., 2010; Lukin, 2011). В связи с этим особую актуальность приобретают исследования, направленные на выяснение закономерностей и особенностей естественных защитных функций организма рыб, к важнейшим из которых относится врожденная система иммунитета (Janeway, Medzhitov, 2002; Medzhitov, 2008; Ярилин, 2010). Изучение закономерностей ее функционирования и определение факторов, влияющих на иммуно-физиологический статус рыб, относится к одному из наиболее активно развиваемых направлений в физиологии рыб (Микряков и др., 1992, 2001; Балабанова, Степанова, 2000; Головин, Головина, 2001; Юхименко и др., 2005). Особый интерес представляет понимание пределов нормы иммуно-физиологического состояния рыб, находящихся под воздействием широкого спектра различных абиотических и биотических факторов, в том числе таких как паразитарные, бактериальные и вирусные инфекции (Cipriano, Shchelkunov et al., 2005; Казарникова, Шестаковская, 2005; Meijer, Spaink, 2011).

Важным, но остающимся слабо разработанным направлением современной иммунологии рыб, является поиск индикаторных характеристик, позволяющих оценивать иммуно-физиологический статус особи, проводить раннюю диагностику патологических состояний и восприимчивости рыб к заболеваниям, в том числе, к латентным формам инфекций (Anderson, 1990; Peakall, 1994; Bressler et al., 1999; Skouras, 2002; Verburg-van Kemenade, 2011). Разработка принципов и методов контроля здоровья рыб в природных водоемах и особенно для рыб, выращиваемых искусственным образом, создание новых или совершенствование существующих способов лечения рыб имеет важное прикладное значение. Широкое применение антибиотиков, используемых в аквакультуре для подавления инфекций и в профилактических целях, не всегда дает желаемый эффект (Киташова и др., 2002; Егоров, 2004; Samanidou, Evaggelopoulou, 2007). Многими авторами отмечено иммуносупрессивное действие антибиотиков на больных рыб (Zeiikoff, 1994; Кондратьева, Киташова, 2002; Saglam, Yonar, 2009). Недостаточно изучено влияние лекарственных препаратов на иммуно-физиологическое состояние здоровых рыб (Rodgers, 1991; Maqsood et al., 2009). Отсутствуют сведения о хемосенсорных свойствах антибиотиков и их влиянии на вкусовую привлекательность лечебных и профилактических кормов для рыб.

В связи с вышесказанным представляется актуальным изучение закономерностей формирования клеточного и гуморального ответа врожденного иммунитета у рыб в норме и находящихся под влиянием разнообразных факторов естественного и искусственного происхождения.

Цель работы - установить особенности иммуно-физиологического статуса рыб из природных популяций и содержащихся в искусственных условиях при поражениях различной этиологии, выяснить хемосенсорные свойства антибиотиков и их влияние на рыб.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• определить у рыб из природных водоемов и аквакультуры иммуно-физиологические параметры в норме и при поражениях различной этиологии (паразитарные, вирусные, бактериальные и смешанные инфекции)

• установить гематологические индикаторы иммуно-физиологического состояния рыб

• выяснить влияние антибиотиков на иммуно-физиологическое состояние здоровых рыб

оценить вкусовые свойства антибиотиков и их влияние на пищевое поведение рыб

Научная новизна. Впервые определены доминирующие аэробные виды бактерий у трески Сайт тогкиа таш-а1Ы и наваги Е1е%ти$ navaga Белого моря. Установлена возможность оценки иммуно-физиологического статуса рыб по электрофоретическому анализу соотношения белковых фракций в сыворотки крови и по лейкограмме. Впервые продемонстрировано, что антибиотики бензилпенициллин и окситетрациклин вызывают у здоровых особей радужной форели РагазаЫо (= ОпсогНупскш) туЫзя. нейтропению, элиминируют альбуминовую фракцию в сыворотке крови, индуцируют появление липоидных скоплений и других патологий внутренних органов, это негативное влияние зависит от длительности их применения. Негативное влияние антибиотиков зависит от длительности их применения. Впервые обнаружено, что антибиотики обладают для рыб привлекательными (окситетрациклин в высокой концентрации и неомицин в широком диапазоне концентраций) или отталкивающими (бензилпенициллин в высокой, а окситетрациклин в низкой концентрации) свойствами.

Практическая значимость работы. Подготовлены научно-практические рекомендации по диагностике иммупо-физиологического статуса рыб для специалистов ихтиопатологов и рыбоводов. Полученные результаты используются в лекционных курсах па биологическом факультете МГУ имени М.В.Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рыбы из природных популяций и не имеющие внешних клинических проявлений заболевания могут быть носителями возбудителей паразитарных и бактериальных инфекций. Особи с минимальным

количеством паразитов во внутренних органах имеют нормальные показатели лейкограммы и содержания сывороточных белков крови.

2. Фракционный состав белков сыворотки крови и лейкограмма являются индикаторами иммуно-физиологического состояния рыб.

3. Длительное применение антибиотиков ухудшает иммуно-физиологическое состояние здоровых рыб.

4. Антибиотики обладают для рыб выраженными вкусовыми свойствами и влияют на их пищевое поведение.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006, 2009); на Российском иммунологическом форуме (Санкт-Петербурге, 2008); на двусторонней конференции Россия - США по здоровью гидробионтов (Шеффердстон, Западная Вирджиния, 2009); на открытых заседаниях Научно-консультативного совета по болезням рыб ФГУ «Межведомственная ихтиологическая комиссия» (Москва, 2009, 2010); на совместном заседании кафедр ихтиологии и иммунологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (Москва, 2012).

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 8 печатных работах, в том числе в 5-и ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах печатного текста, включает 8 таблиц, 28 рисунков. Состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 298 источников, из них 188 - на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает благодарность за помощь в получении и обработке результатов Г.А. Дольниковой, Е.А. Завьяловой, Е.А. Марусову, Г.Г. Миллер, Е.С. Михайловой, Т.Д. Пичугиной; за постоянные консультации A.B. Киташову, A.M. Наумовой; сотрудникам кафедры иммунологии, ихтиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко, лаборатории ассоциированных инфекций ГУ НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи за поддержку на всех этапах работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе пред став лены современные сведения об иммунной систзмз рыб, о чувствительности показателей врожденного иммунитета (клеточный и белковый состав крови) к воздействию разнообразных факторов окружающей среды (температура воды, условия обитания, кормовая база, наличие загрязнений). Отражено использование рыб как модельного объекта в изучении общих закономерностей врожденного и приобретенного иммунитета.

Рассмотрены бактериальные, вирусные и паразитарные инфекции рыб и их влияние на иммуно-физиологическое состояние особей. Кратко проанализированы методы борьбы с инфекциями в условиях аквакультуры и хемосенсорные эффекты различных добавок в корма для рыб.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена на кафедрах иммунологии, ихтиологии и на Беломорской биологической станции биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (ББС МГУ), во Всероссийском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) и в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи (ГУ НЙИЭМ) в период с 2006 по 2011 гг.

Объектами исследования служили: беломорская треска Gadus morhua marís-albi (30 особей), навага Eleginus navaga (22 особей) (из Кандалакшского залива Белого моря), карп Cypriniis carpió (70 особей из трех подмосковных рыбоводческих хозяйств), радужная форель Parasalmo (=Oncorhynchus) mykiss) (45 особей из Всероссийского научно-производственного объединения по рыбоводству, пос. Рыбное, Московская обл.), перевиваемая культура клеток карпа ЕРС (ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко).

Таблица 1. Общая характеристика объема работы.

Метод исследования Число исследований или образцов

1 этап работы 2 этап работы 3 этап работы 4 этап работы Всего

Патологоанатомический 52 70 30 - 152

Лейкограмма 52 70 30 - 152

Электрофорез сыворотки крови 104 140 60 - 304

Паразитологический анализ органов брюшной полости 52 70 30 - 152

Взятие проб для микробиологического анализа 156 210 - - 366

Культивирование и идентификация бактерий 260 420 - - 680

Взятие проб для вирусологического анализа - 70 - - 70

Выявление вируса в клетках ЕРС - 70 - - 70

Электронная микроскопия - 100 - - 100

Влияние антибиотиков на состояние здоровых рыб - - 120 - 120

Оценка вкусовой привлекательности антибиотиков - - - 1400 1400

Перед вскрытием у рыб брали кровь для получения сыворотки (Кондратьева, Ярилин, 2004). Для определения лейкоцитарной формулы делали мазок крови и окраску по Романовскому-Гимза (Житенева и др., 2004). Электрофорез сыворотки крови проводили по модифицированному для рыб методу Laemmli в денатурирующих условиях (Клаус, 1990). Электрофореграммы обрабатывали с помощью компьютерной программы Total Lab Quant vl2.2.

При патоморфологическом исследовании оценивали состояние внешних покровов рыб, внутренних органов по их размерам, окраске, наличию гиперемии, изменению консистенции, присутствию липоидных скоплений и фибринозных воспалений (Карташев и др., 1981; Грищенко и др., 1999).

Первичные посевы микроорганизмов из смывов с поверхности тела, жабр и кишечника рыб осуществляли по стандартной методике. После получения чистых культур, выделенные бактерии идентифицировали по биохимическим и морфологическим признакам (Берджи, 1997). Сбор многоклеточных паразитов производили в органах брюшной полости (Быховская-Павловская,1985). Вирус весенней виремии карпа выделяли из внутренних органов (печень, почки, селезенка) (Pichugina et al., 2003). Полученный вирус в супернатанте вносили в культуру клеток ЕРС для заражения (Щелкунов и др., 2004). Для идентификации вируса и для изучения его действия на клетки использовали метод электронной микроскопии (Granzow et al., 2001).

Вкусовую привлекательность терапевтических агентов и особенности пищевого поведения оценивали по реакции одиночных подопытных особей радужной форели на агар-агаровые гранулы (2%), содержащие краситель (Ponceau 4R, 0.0005 M) и одно из использованных веществ - натриевую соль бензилпенициллина, гидрохлорид окситетрациклина, цефазолин-акос или сульфат неомицина в концентрации 1, 10 и 100 мг/мл (Касумян, Сидоров, 1994).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование иммуно-физнологического статуса трески и наваги.

Исследовали треску и навагу, выловленную в Белом море около ББС в августе 2008, 2009 гг. Подвергнутые анализу особи были внешне клинически здорова. При вскрытии обнаружили множественные патологии внутренних органов, которые оценивали в соответствии с принятыми рекомендациями по ихтиопатологическому анализу (Грищенко и др., 1999).

Основными патологиями у рыб были фибринозное воспаление, нарушение кровоснабжения внутренних органов (желудка, печени, пилорических придатков, кишечника), изменения консистенции органов (пилорических придатков, селезенки, печени), в некоторых случаях наблюдали набухание туловищной почки (Рис. 1, 2). Наиболее часто у трески встречались патологии печени и кишечника, у наваги - печени, пилорических придатков и селезенки (Рис. 3).

Рис. 1. Патологии внутренних органов трески. 1 - гиперемия и отечность кишечника; 2 - гиперемия и пониженный тургор пилорических придатков; 3 - геморрагии печени;

4 - многоклеточные паразиты;

5 - гиперемия желудка;

6 - фибринозное воспаление.

Рис. 2. Патологии внутренних органов наваги. 1 - гиперемия и отечность кишечника; 2 - пониженный тургор пилорических придатков; 3 - геморрагии, изменение цвета и консистенции печени; 4 - дряблость селезенки; 5 - многоклеточные паразиты; 6 - фибринозное воспаление.

При вскрытии в органах брюшной полости были обнаружены гельминты следующих видов: скребень Echinorhynchus gadi, нематоды Anisakis simplex, Hysterothylacium aduncum gadi, трематода Pyramicocephalus phocarum, цестода Bothricephalus acheilognathi. Экстенсивность инвазии трески (отношение числа зараженных особей к общему количеству рыб) составила 87%, наваги - 91%. Интенсивность инвазии (число паразитов на особь) у трески была ниже, чем у наваги (Рис. 4).

и ПОЧКИ

□ пилорические придатки И селезенка r-J-

70%

□ 0-4 шт. 0 5-10 шт. ■ 11-20 шт.

треска навага

Рис. 3. Частота встречаемости патологий внутренних органов у трески и наваги,

треска

Рис. 4. Распределение рыб по совокупной численности гельминтов в

имеющих многоклеточных паразитов. органах брюшной полости.

На жабрах и поверхности тела были выявлены представители следующих родов: грамотрицательные Achromobpcter, Aeromonas, Alcaligenes, Alteromonas, Cytophaga, Deleya, Flavobacterium, Flexibacter, Photobacreium, Pseudomonas, Vibrio и грамположительные Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Marinococcus.

В кишечнике обоих видов основными доминирующими родами были Pseudomonas, Alteromonas, Corynebacterium, Photobacterium, Vibrio, оксидазо- и каталазоположительные, в меньшей степени были представлены Bacillus, Marinococcus, Micrococcus, Deleya, Bacillus, Aeromonas.

При усилении инвазии у трески и наваги в лейкограмме увеличивается доля незрелых форм клеток - лейкобластов, и эозинофилов (Рис. 5), которые, как известно, в основном участвуют в противопаразитарном иммунитете (Ярилин, 2010; Meijer, Spaink, 2011). Полученные данные свидетельствует об изменении темпов кроветворения и направленности процессов клеточной дифференцировки в сторону усиления гранулоцитопоэза.

Треска

100% п

й 80%

60% -

40%

д о

4 20% 1

И Эозинофилы

^Нейтрофилы 100% -

И Моноциты ю 80% -

НО Лимфоциты н К

Я" © 60% -

Я Лейкобласты SÖ >к <й

R W 40% -

20% -0% -

Навага

0-5 20

паразитов паразитов

5 30-40

паразитов паразитов

Рис. 5. Относительное число различных форм лейкоцитов (в %) в крови трески и наваги, имеющих разное количество многоклеточных паразитов.

Для анализа электрофоретического профиля белков сыворотки крови (Рис. 6) фракции условно были разделены на 3 группы (Рис. 7). Глобулины -самые тяжелые белки (от 66 Ша и выше), в свою очередь были разделены на а-, Р- и у-фракции. К а-фракции относятся белки, участвующие в воспалении, такие как белки острой фазы, С-реактнвный белок, сывороточный амилоид Р (Ярилин, 2010); к у-фракции относятся антитела класса К альбуминам (от 20 до 65 кГ)а) - белки системы комплемента. К преальбуминам (менее 20 Ша) относится, в частности, лизоцим - фермент, способный лизировать клеточную стенку грам-положительных бактерий. У трески с 10 гельминтами повышается уровень преальбуминов и а-фракции, снижается уровень альбуминов. У трески и наваги с максимальным количеством паразитов снижается интенсивность

всех фракций. Этот эффект вызван поражением основных органов (печень, почки, селезенка), где происходит синтез белков, необходимых для врожденного иммунитета, таких как белки системы комплемента, белки острой фазы воспаления, ферменты и кофакторы противопаразитарного и противобактериального иммунного ответа.

Рис. 6. Электрофореграммы сыворотки крови трески и наваги, а — треска без паразитов; б — треска с 5 паразитами; в — треска с 10 паразитами; г — треска с 20 паразитами; д — навага с 5 паразитами; е — навага с 10 паразитами; ж — навага с 30 паразитами.

Рис. 7. Усредненный график изменения основных фракций белков сыворотки крови трески и наваги. По оси ординат средняя интенсивность фракции. По оси абсцисс 1 - 0-5 паразитов, 2-10 паразитов; 3-20 паразитов; 4-30 паразитов.

Повышенная температура воды в период проведения исследований (в августе наблюдается среднегодовой максимум температуры в Белом море), по-видимому, отрицательно влияла на состояние особей, так как практически все особи были заражены многоклеточными паразитами и условно патогенными бактериями. В этом случае пределами нормы является наличие менее 10 гельминтов на особь, поскольку у таких рыб не выявлено существенных изменений в лейкограмме и профиле белков сыворотки крови, по сравнению с незараженными особями. Более высокие значения инвазии приводит к патологиям внутренних органов, изменению белкового профиля и соотношения лейкоцитов, что отражает снижение иммунитета и как следствие ведет к снижению рсзистснтностй организма к инфекциям.

3.2. Исследование иммуно-физиологического статуса карпа при бактериальной и вирусной инфекциях.

Для изучения влияния бактериальных и вирусных инфекций на иммуно-физиологический статус рыб было проведено исследование карпов при

26кОа —К» .. ' __

а б в г д е ж

— " преалъбумины -альбумины

пересадке в нагульные пруды весной, когда часто наблюдаются вспышки вирусных и бактериальных инфекций, которые приводят к массовой гибели рыб. Отбирали карпов с внешними клиническими признаками вирусной весенней виремии карпа (группа 1, Рис. 8) и аэромоноза (группа 2, Рис. 9). Карпы группы 3 были внешне здоровы.

Рис. 8. Внешние признаки весенней виремии карпа (группа 1): ерошение чешуи (а) и гиперемия на жаберных крышках (б)

Рис. 9. Внешние признаки аэромоноза (группа 2): 1 - экзофтальмия; 2 - язвы на поверхности тела; 3 - геморрагии на поверхности тела.

У рыб группы 1 при вскрытии было обнаружено небольшое увеличение почки и селезенки, изменение плавательного пузыря типичного для хронической стадии воспаления плавательного пузыря. Диагноз был подтвержден вирусологическим исследованием в лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко и электронно-микроскопическим исследованием в лаборатории ассоциированных инфекций НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи.

У карпов группы 2 наблюдали при вскрытии у всех особей присутствовало фибринозное воспаление внутренних органов, почка и селезенка были дряблые, увеличены, неравномерно окрашены, желудочно-кишечный тракт не содержал кормовых масс, плавательный пузырь был мутный, задняя камера была искривлена и гиперемирована, в полости тела и в подчешуйных карманах скопился кровянистый экссудат. Описанные изменения плавательного пузыря типичны для хронической формы воспаления

плавательного пузыря. Диагноз был подтвержден микробиологическим исследованием и биопробой в лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.

Рыбы группы 3 не имели внешних признаков патологий. Однако, при патоморфологическом исследовании у этих рыб обнаружили воспаление плавательного пузыря в завершающей стадии и ожирение разной степени. Внутренние органы имели пониженный тургор, часто были увеличены. У трети рыб печень была зеленого цвета, что свидетельствовало об аутоинтоксикации. У всех особей желчный пузырь был переполненный, воспаленный и отечный кишечник без пищи. Такие признаки наблюдаются при размножении условно-патогенной микрофлоры, например, при аэромонозе, и при использовании корма с истекшим сроком годности. У части рыб селезенка имела очень почти черный цвет и была увеличена. Почки у всех рыб были дряблыми.

В качестве контроля брали карпов из благополучного по заболеваниям хозяйства, у которых не было обнаружено внешних или внутренних патологий (Рис. 10, Не).

Рыбы с бактериальной и вирусной инфекциями отличались по лейкоцитарной формуле (Рис. 10). При бактериальной инфекции возрастает относительное содержание нейтрофилов и лейкобластов, что говорит о воспалении.

100%

с 80%

§60%

••я о

2 40%

20%

□ Эозинофилы НБазофилы

Нейтрофилы 0 Моноциты 0 Лимфоциты ■ Лейкобласты

Рис. 10. Относительное число различных форм лейкоцитов (в %) в крови карпов.

1 - контроль;

2 - вирусная инфекция;

3 - бактериальная инфекция;

4 - смешанная инфекция.

При исследовании профиля сыворотки крови рыб групп 1 и 2 были обнаружены характеристические отличия между бактериальной и вирусной инфекциями (Рис. 11). При вирусной инфекции у рыб была повышена интенсивность глобулинов, которые возрастают при септических процессах, острой инфекции, при токсических эффектах. При бактериальной были увеличены фракции альбуминов и преальбуминов, которые участвуют в противобактериальном иммунитете.

У рыб группы 3 наблюдалось присутствие обоих типов изменений профилей сывороточных белков, что позволило предположить смешанную инфекцию. Этот диагноз затем был подтвержден микробиологическим исследованием - посевами на селективные среды и идентификация аэромонад.

щ 84.6 юЩ

86,2 Ю , §§

■ Щ

Ш11 ¡«¡¡а

31 но тш ЗИ| Г" Щ Щ (■

ШЖ -¿¡¡¿¡¿а ¿Ц. ¿Шй г-ц Шт «<я

НОШ ^^^----

а бв гдежзик

200 160 -120 -80 -40 0 -

преальбумины "альбумины "а-глобулины Р-глобулииы

Рис. 11. Электрофореграммы сыворотки крови карпов, а — стандартный маркер б,в - аэромоноз

г,д — весенняя виремия карпов е - контроль

ж-к — смешанная инфекция

Рис. 12. Усредненный график изменения основных фракций белков сыворотки крови карпов. По оси ординат средняя интенсивность

фракции. По оси абсцисс 1 - контроль; 2 - весенняя виремия карпа; 3 - аэромоноз; 4-6 - смешанная инфекция.

Вирусологические исследования были проведены на перевиваемой линии клеток ЕРС, изучали цитопатогенное действие вирусного агента. Полная деградация монослоя клеток развивалась в течение трех дней. Все этапы морфогенеза БУСУ можно проследить на ультратонких срезах разных участков цитоплазмы инфицированных клеток через 48 часов от момента заражения (Рис. 13, 14, 15).

Одним из наиболее заметных признаков заражения рабдовирусами, который был показан в данной работе, является появление в клетках концентрических пластинчатых структур (ПС2), на которых, вероятно, идет синтез гликопротеина (О) оболочки вириона. Были также обнаружены пластинчатые структуры (ПС1), схожие с образованиями, свойственными опухолевым клеткам теплокровных.

Рис. 13 а-в. Клетка ЕРС, инфицированная БУСУ. Инструментальное увеличение 25000х.

Обозначения к рис. 13а-в: Ц - цитоплазма; Эр - гранулярный эндоплазматический ретикулум; Врк -вирус-репликативный комплекс; ПС1 - пластинчатые структуры первого морфологического типа; ПС2 - пластинчатая структура второго типа; Р - рибосома; Я - ядро; Мт - митохондрии; стрелками указана связь ПС2 с Врк и Эр.

Взаимодействие вируса и клеток характеризовалось также разрушением либо беспорядочным ориентированием крист митохондрий и большим количеством лизосом. Репликация вируса 8УСУ происходит- и цитоплазме, соответственно вирус-репликативные комплексы располагались в цитоплазме в окружении свободных рибосом, рядом с пластинчатыми структурами Г1С2. Было показано почкование вирионов на поверхности клетки и в вакуолях, располагающихся рядом с плазматической мембраной. Размер вириона 8УСУ - 120-125X75-80 нм, внутренний канал (40-42 нм).

Рис. 14. Фрагмент клетки ЕРС с почкующимися вирионами БУСУ (указаны стрелками). Инструментальное увеличение 17500х. Обозначения: Я - ядро клетки ЕРС; Ц - цитоплазма.

Рис. 15. Поперечный срез вирионов БУСУ. Инструментальное увеличение ЗООООх. Обозначения: К - внутренний канал вириона; НК - нуклеокапсид; ГП - поверхностный гликопротеин.

3.3. Воздействие инъекций антибиотиков на иммуно-физиологический статуе радужной форели

Антибиотики способны не только осуществлять прямую функцию -бактериолитическую или бактериостатическую, но и также действовать на иммунологические и физиологические показатели рыб. Даже правильно подобранный антибиотик способен вызывать патологии внутренних органов и угнетать иммунную систему. В задачи нашей работы входило выяснение как антибиотики влияют на иммуно-физиологический статус здоровых рыб. Эта часть работы выполнена на радужной форели.

Были использованы наиболее распространенные в ветеринарии антибиотики широкого спектра действия - натриевую соль бензилпеницилина, и гидрохлорид окситетрациклина, активные как против грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Для точного расчета дозы полученного рыбой вещества были выбраны инъекции в брюшную полость. Антибиотики разводили раствором Рингера для холоднокровных животных из расчета 2 мг/кг. Суммарный объем инъекции на особь не превышал 100 мкл. Перед введением рыбу взвешивали. Контрольной группе вводили раствор Рингера для холоднокровных. В каждой группе проводили 3 или 5 инъекций.

11а протяжении всего опыта интактные особи проявляли обычное поведение: рыбы были активны, располагались по всему объему аквариума, охотно питались предлагаемым кормом. При патоморфологическом исследовании каких-либо внешних отклонений внутренних органов от нормы у рыб этой группы не выявлено, этот уровень принят за нулевой. За норму принята также и формула лейкоцитов крови рыб интактной группы.

Уже после 3-х инъекций лекарственных препаратов наблюдали патологии внутренних органов, хотя внешние проявления были нормальными. После 5 инъекций была другая картина. Действие антибиотиков становится генерализованным, т.е. охватывает практически все органы (рис. 16, 17). В лейкограмме наблюдается нейтропения, т.е. снижение количества нейтрофилов (рис. 18). Это фагоцитирующие клетки, представляющие первую линию защиты, участвуют в узнавании. Компенсаторно увеличивается количество моноцитов. Снижается количество незрелых форм, что может свидетельствовать о нарушении гемопоэза.

80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

□ раствор Рингера ! галрохлорид окситетрациклина ¡натриевая соль беюилпеницилина

1 2 3 4 5 6 7

~ I

I г~

Рис. 16. Выраженность патологий внутренних органов и липоидных скоплений радужной форели Рагаза1то (=ОпсогЬупски8) после введения антибиотиков в растворе Рингера после 3 инъекций (а), после 5 инъекций (б):

1 - липоидные скопления

2 - селезенка

3 - желчный пузырь

4 - пилорические придатки

5 - печень

6 - почки

7 - жабры

8 - кишечник

2 3 4 5 6 7 8

После 5 инъекции раствора Рингера для холоднокровных уменьшалась фракция альбуминов и преальбуминов на электрофореграммах сыворотки крови. В группе бензилпенициллина после 3 инъекций практически отсутствовала фракция альбуминов после 3 инъекций, после 5 инъекций увеличивалось число фракций в области альбуминов и преальбуминов. В

группе окситетрациклина после 3 инъекций отсутствовали фракции альбуминов после 3 инъекций, и после 5 инъекций появилась фракция в области альбуминов (Рис. 19, 20).

100%

со о н к иг о

и «

о к к с; о КС

80%

60%

40%

20%

® нейтрофилы 0 моноциты ЕШ лимфоциты ■ лейкобласты

Рис. 17. Патологии внутренних органов радужной форели после 5 инъекций антибиотиков. 1 -липоидные скопления;

2 - гиперемия печени;

3 - гиперемия и дряблость пилорических придатков

Рис. 18. Относительное число различных форм лейкоцитов (в %) в крови радужной форели.

1 - интактные;

2 - инъекции раствора Рингера; 3 - инъекции бензилпенициллина;

4 - инъекции окситетрациклина.

Введение антибиотиков даже при минимальном количестве введений, при минимальной дозе, увеличивает количество липоидных скоплений, начинается процесс патологий внутренних органов, изменение клеточного и белкового состава крови.

У первоначально здоровых особей начинают развиваться клинические проявления заболевания, ухудшение иммунного статуса рыб, все это приводит к развитию условно патогенной микрофлоры и восприимчивости к другим инфекциям.

Рис. 19. Электрофореграммы сыворотки крови радужной форели, а - стандартный маркер б - интактные

в - 3 инъекции раствора Рингера г - 5 инъекций раствора Рингера д - 3 инъекции бензилпенициллина е - 5 инъекций бензилпенициллина ж - 3 инъекции окситетрациклина з-5 инъекций окситетрациклина

Рис. 20 а-г. Усредненный график изменения основных фракций белков сыворотки крови рыб. По оси ординат средняя интенсивность фракции. По оси абсцисс 3 и 5 введений, 0 - контроль.

160 Р-глобулины

40 0

120 ■ 100 -

80 -60 40 20 0

а-глобулины

б /

альбумины

преальбумины

"" окситетрациклин 1 бензилпенициллин 1 раствор Рингера

200 160 120 80 40

"Л

3.4. Оценка вкусовой привлекательности антибиотиков: для радужной форели.

Пероральный способ введения в организм рыб лечебных препаратов является наиболее простым и распространенным. Однако включение дополнительных ингредиентов в рецептуру кормов может влиять на органолептические свойства, снижать их хемосенсорную привлекательность для рыб. Вкусовая рецепция у рыб хорошо развита, ее роль в формировании у рыб решения о заглатывании или отвергании пищи является решающей (Казитуап, Ботн^, 2003). В связи с этим нами были выполнены эксперименты, основной целью которых была оценка вкусовой привлекательности для рыб нескольких антибиотиков. В наши задачи входило также выяснение особенностей пищевого поведения рыб, проявляемого при тестировании ими искусственных пищевых гранул, содержащих антибиотики. Эксперименты выполнены на радужной форели.

Таблица 2. Вкусовая привлекательность антибиотиков для радужной форели. М ± ш - среднее значение показателя и его ошибка; отличия относительно интактных особей достоверны при р: * - < 0.05, ** - < 0.01, *** - < 0.001.

Раздражитель Концентрация, мг/мл Потребление гранул, % Индекс вкусовой привлекательности, %

1 45.0 ±5.0 0-0.09

Бензилпенициллин 10 53.0 ±5.0 0-0.01

100 24.0 ±4.3*** -38.46

1 32.0 ± 4.7** -25.58

Окситетрациклин 10 73.0 ±4.5** -14.96

100 74.0 ±4.4** -15.63

1 30.0 ±4.6*** -28.57

Цефазолин-акос 10 46.0 ±5.0 : 0-0.08

100 34.0 ±4.8** -22.73

1 90.0 ±3.0*** -25.00

Неомицин 10 98.0 ± 1.4*** -28.95

100 98.0 ± 1.4'*'** -28.95

Экстракт личинок 175 98.0 ±1.4*** -28.95

. хирономид

Контроль 54.0 ±5.0 -

Испытанные антибиотики значительно различаются между собой по вкусовой привлекательности для радужной форели. Наиболее сильным привлекательным вкусом обладает сульфат неомицина (Табл. 2), гранулы с которым подопытные рыбы потребляли почти во всех опытах (от 90% до 98%, в зависимости от концентрации). По своей эффективности сульфат неомицина сравним с высокопривлекательным для рыб экстрактом мотыля (98%). Натриевая соль бензилпенициллина при относительно низкой концентрации (1-

10 мг/мл) характеризуется инертным вкусом и значимо не влияет на потребление рыбами гранул. Однако при высоком содержании в гранулах (100 мг/мл) этот антибиотик приобретает свойства детеррента, подавляющего потребление гранул более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Цефазолин-акос при высокой и низкой концентрации (1 и 100 мг/мл) вызывает у рыб негативные вкусовые ответы, однако при промежуточной концентрации (10 мг/мл) этот эффект не проявляется. У гидрохлорида окситетрациклина наблюдается положительная связь между вкусовой привлекательностью и концентрацией антибиотика: с повышением его содержания в гранулах их потребление рыбами закономерно растет, причем наиболее быстро в диапазоне концентраций от 1 до 10 мг/мл, когда статистически достоверное детеррентное действие {р < 0.01) сменяется достоверным стимулирующим эффектом (р < 0.01) (табл. 2).

Гранулы с наиболее высоким уровнем потребления (сульфат неомицина 1-100 мг/мл, гидрохлориД окситетрациклина 10-100 мг/мл, экстракт личинок хирономид 175 мг/мл) значительно реже, чем контрольные, подвергаются повторным тестированиям (отверганиям и повторным схватываниям), а также намного дольше удерживаются подопытными рыбами в ротовой полости Как при первом схватывании, так и в течение опыта. Все остальные гранулы (гидрохлорид окситетрациклина 1 мг/мл, цефазолин-акос и натриевая соль бензилпенициллина 1-100 мг/мл) рыбы в среднем схватывали повторно столько же раз, что и контрольные гранулы. Однако средняя длительность удержания почти всех типов этих гранул короче, чем контрольных, в ряде случаев это различие статистически достоверно (табл. 3).

Сравнение реакции рыб на гранулы в опытах, завершившихся потреблением гранулы, и в опытах, в которых гранула рыбами отвергалась, показывает, что эти группы опытов различаются между собой по длительности тестирования рыбами свойств гранул. В опытах, завершившихся потреблением гранулы, гранулы удерживаются в 3-4 раза, дольше как при первом схватывании, так и в течение всего опыта, по сравнению с опытами, закончившимися отверганием гранулы. Причем в этих возможных вариантах завершения опыта (отвергание или потребление гранулы) длительности удержаний гранул в ротовой полости близкие для разных типов гранул. Так, в опытах с потреблением длительность удержания варьирует от 6.4 до 8.4 с при первом схватывании и от 6.8 до 9.0 с за все время опыта, в опытах с отверганием - от 1.3 до 2.3 и от 2.0 до 2.7 с, соответственно (без учета выборок с минимальным числом опытов - 2). В опытах с.отверганием рыбы в среднем совершали большее число повторных схватываний (10 типов гранул из 14), причем для большинства типов гранул эти различия были статистически достоверными (табл. 3).

Таблица 3. Параметры вкусового ответа (М ± ш) радужной форели в опытах, закончившихся потреблением (над чертой) или отверганием (под

чертой) гранул с антибиотиками. М ± m - среднее значение показателя и его ошибка; отличия относительно интактных особей достоверны при р: * - < 0.05.

Продолжительность удержания

Раздражитель Концентрация, Число гранулы, с

мг/мл схватываний после первого схватывания в течение всего опыта

1 1.3 ±0.1 7.4 ± 0.4 8.2 ±0.3

1.7 ± 0.1* 1.5 ±0.1*** 2.2 ±0.2***

Бензил- 10 1.4 ±0.1 7.1 ±0.4 8.5 ± 0.3

пенициллин 1.7 ±0.2* 1.5 ±0.1*** 2.5 ±0.3***

100 1.8 ±0.3 6.6 ±0.7 8.3 ± 0.5

1.6±0.1 1.7 ± 0.1*** 2.3 ±0.2***

1 1.3 ±0.1 7.0 ±0.5 7.9 ± 0.4

1.9 ±0.2** 1.3 ±0.1*** 2.2 ±0.2***

Окситетра- io 1.1 ±0.0 8.4 ± 0.3 8.7 ±0.3

циклин 1.4 ± 0.1*** 1.6 ±0.2*** 2.0 ±0.2***

100 1.0 ±0.0 8.4 ±0.3 8.6 ±0.3

1.5 ± 0.1*** 1.6 ±0.2*** 2.0 ±0.3***

1 1.6 ±0.2 6.8 ±0.6 8.7 ± 0.4

1.5 ±0.1 1.6 ± 0.1*** 2.1 ±0.2***

Цефазолин- 10 1.6 ±0.2 6.9 ±0.4 8.2 ±0.3

акос 1.9 ±0.2 1.6 ± 0.1*** 2.6 ±0.3***

100 1.6 ±0.2 6.9 ±0.7 9.0 ± 0.4

1 1.6± 0.1 1.9 ±0.2*** 2.5 ±0.2***

1 1.0 ±0.0 7.7 ±0.3 7.9 ± 0.2

1.3 ±0.2** 2.3 ±0.9*** 2.6 ±0.8***

Сульфат 10 1.0 ±0.0 8.2 ±0.3 8.4 ± 0.2

неомицина 1.5 ±0.5*** 1.8 ±0.2*** 2.4 ±0.4***

100 1.1 ±0.0 7.5 ± 0.3 7.8 ±0.2

1.0 ±0.0 2.6 ± 1.0* 2.6 ±0.1**

Экстракт 175 1.1 ±0.0 6.4 ± 0.3 6.8 ±0.3

хирономид 4.0 ± 1.0*** 1.2 ±0.0* 4.0 ± 1.0

Контроль 1.6 ±0.2 6.5 ±0.4 8.3 ± 0.3

1.9 ±0.2 1.9 ± 0.2*** 2.7 ±0.3***

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью и задачами были проведены исследования трески и наваги из природных популяций Белого моря, карпа и радужной форели, содержащихся в искусственных условиях. Использование количественного показателя (лейкоцитарная формула крови) и качественных (белковый профиль сыворотки крови, патоморфологический анализ) позволило оценить иммуно-физиологический статус рыб, находящихся в разных условиях.

Установлено, что в природных водоемах при низком уровне антропогенной нагрузки и загрязнений рыбы демонстрируют сложившуюся эволюционно норму реакции. На примере трески и наваги Белого моря определено влияние паразитарной и бактериальной инфекции на иммунологические параметры рыб. Патологии органов, наблюдаемые у большинства особей, коррелируют со степенью инвазии и составом микрофлоры кишечника исследованных рыб. На основании анализа состояния внутренних органов, лейкоцитарной формулы и фракционного состава сыворотки крови сделан вывод, что в данных климатических условиях зараженность внутренних органов рыб гельминтами менее 10 экземпляров на особь может быть принята за норму. При таком значении интенсивности инвазии гематологические показатели пораженных особей и особей, не имеющих паразитов, близки. При усилении зараженности и при доминировании условно-патогенных бактерий в кишечнике проявляются патологические изменения внутренних органов, а изменения иммунологических параметров свидетельствуют об угнетении лимфопоэза, и ослаблении иммуно-физиологического состояния рыб.

В аквакультуре рыбы более всего подвержены бактериальным и вирусным инфекциям. На примере карпа было исследовано влияние бактериальной (аэромоноз), вирусной (весенняя виремия карпа) и смешанной инфекций на иммунологические показатели. Определены явные различия белкового профиля сыворотки крови и лейкограммы у рыб, зараженных различными типами инфекций. Эти критерии могут использоваться как диагностический тест.

Для предотвращения вспышек заболеваний при искусственном разведении рыб и других гидробионтов применяют лекарственные препараты. Антибиотики, как многие другие экзогенные вещества, обладают собственным действием на организм рыб, нередко приводящим к реинфекциям или секундарным инфекциям. При исследовании наиболее распространенных в ветеринарии препаратов - натриевой соли бензилпенициллина и гидрохлорида окситетрациклина обнаружено негативное действие этих препаратов на иммунологические и физиологические параметры здоровых особей радужной форели. Длительное применение антибиотиков приводит к усилению и распространению патологий внутренних органов. Введение бензилпенициллина и окситетрациклина вызывает подавление гемопоэза, что проявляется в виде нейтропении, резкого снижения бластных форм клеток крови, уменьшения

фракции альбуминов. Суммарным эффектом является снижение иммунитета особей и усиление зараженности.условно-патогенными бактериями и вирусами.

Несмотря на негативные аспекты использования антибиотиков, их применение необходимо для контроля массовых заболеваний в аквакультуре. Наиболее удобным способом лечения является добавление лекарственных препаратов в корм. При исследовании четырех различных антибиотиков было обнаружено, что они могут иметь диаметрально противоположные вкусовые свойства для рыб. Например, неомицин и окситетрациклин (в концентрации 100 мг/мл) обладают высокопривлекательными свойствами для радужной форели, а цефазолин-акос и бензипенициллин (в концентрации 100 мг/мл) проявляют свойства детеррента.

Известно, что вкусовые спектры у рыб характеризуются высокой межвидовой вариабельностью. Вещества, привлекательные или отталкивающие по вкусу для одних видов могут быть индифферентными вкусовыми стимулами или иметь противоположные вкусовые свойства для рыб других видов. Эта особенность вкусовой рецепции важна при выборе антибиотиков и других терапевтических препаратов для практического использования в аквакультуре, поскольку вкусовые свойства одного и того же лекарственного средства для разных видов рыб могут резко различаться, Препараты с неблагоприятным вкусом будут снижать пищевую активность рыб и, как следствие, приводить к развитию нежелательного побочного эффекта - к снижению темпа роста, к ухудшению или медленному восстановлению состояния рыб после лечения, к неэффективным тратам корма.

Использование разных типов гранул, отличающихся по составу или концентрации присутствующих в них веществ, позволило подтвердить ряд важных общих закономерностей тестирования рыбами пищевых объектов. Поведение тестирования пищи, как показывают наши результаты, у радужной форели может развиваться по одному из двух стереотипов. Стереотип, заканчивающийся потреблением объекта, характеризуется длительным внутриротовым опробыванием объекта, в 3-4 раза более продолжительным, чем стереотип, заканчивающийся отверганием объекта. По числу отверганий и повторных схватываний объекта эти стереотипы у радужной форели отличаются слабо, хотя можно отметить, что в случае потребления число манипуляций с гранулами обычно меньше. Наличие у рыб двух стереотипов тестирования пищевых объектов выявлено к настоящему времени лишь на примере ограниченного числа видов рыб.

Контроль вкусовой компоненты лечебных кормов и диагностика состояния рыб по клеточному и белковому составу крови позволит определить оптимальную схему применения лекарственных препаратов, учитывающую видовые особенности выращиваемых рыб, что, в свою очередь, приведет к минимизации экономических затрат на профилактику здоровья рыб и устранение вспышек заболеваний.

выводы

1. В природных популяциях трески Gadus morhua maris-albi и наваги Eleginus navaga Белого моря большинство особей поражены паразитарными инвазиями. Преобладающими гельминтами во внутренних органах у трески и наваги являются скребни Echinorhynchus gadi, нематоды Anisakis Simplex, Hysterothylacium aduhcum gadi, трематоды Pyramicocephalus phocarum, цестоды Bothricephalus acheilognathi. При интенсивности инвазии менее 10 гельминтов на особь белковый профиль сыворотки крови и лейкограмма у трески и наваги не изменяются.

2. При интенсивности инвазии^ превышающей 10 экземпляров гельминтов на особь, и при доминировании в кишечнике бактерий рода Pseudomonas у тресковых рыб наблюдается фибринозное воспаление внутренних органов, в белковом профиле сыворотки крови повышается уровень преальбуминов и глобулинов, снижаегся уровень альбуминов, в крови изменяется

' процентное соотношение лейкоцитов. Это указывает на изменение реакций врожденного иммунитета и, в целом, на снижение иммуно-фшиологическо! о статуса рыб. Усиление инвазии (20 и более многоклеточных паразитов на особь) приводит к дальнейшему подавлению у рыб иммунных функций.

' 3. Поражение вирусной, бактериальной и смешанной инфекциями вызывает у

' ' искусственно выращенных рыб (карп Cyprinus carpio) специфические изменения в белковом составе сыворотке крови. При вирусной инфекции в составе сыворотки крови увеличивается фракция глобулинов, снижается содержание альбуминов и преальбуминов; при бактериальной инфекции возрастает содержание фракции альбуминов и преальбуминов, смешанная инфекция сопровождается снижением в сыворотке крови фракции у-глобулинов и повышением фракции альбуминов.

4. Применение антибиотиков (натриевая соль бензилпенициллина, гидрохлорид окситетрациклина) вызывает у здоровых рыб (молодь радужной форели Parasalmo (=Oncorhynchus) mykiss) нейтропению, приводит к исчезновению альбуминовой фракции в сыворотке крови, индуцирует появление липоидных скоплений и других патологий внутренних ; органов, что Свидетельствует о снижении общей резистентности рыб к инфекциям.

5. Присутствие антибиотиков в составе йскусственных кормов может существенно изменять их вкусовую привлекательность для выращиваемых рыб. Антибиотики цефазолин-акос и натриевая соль бензилпенициллина в высоких концентрациях и гидрохлорид окситетрациклина в низких концентрациях обладают отталкивающим (детеррентным) вкусом для радужной форели. Антибиотики сульфат неомицина в широком диапазоне концентраций и окситетрациклин в высоких концентрациях имеют привлекательный вкус для радужной форели и повышают потребление искусственных пищевых гранул.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Завьялова Е.А., Маклакова М.Е., Пичугина Т.Д., Борисова М.Н., Кондратьева И.А. 2006. Особенности морфологии культур клеток из различных органов рыб и влияние на них некоторых вирусов. Материалы Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, 16-19 мая, М.: МАКС Пресс - с. 12-14.

2. Маклакова М.Е., Кондратьева И.А., Пичугина Т.Д., Борисова М.Н. 2008. Диагностика заболеваний по белковому профилю сыворотки крови рыб. Российский иммунологический журнал. Т.2 (11), 2-3, с. 168.

3. Маклакова М.Е., Ступин Р.В., Кондратьева И.А. 2009. Исследование влияния различных агентов на иммуно-физиологический статус радужной форели. Бюллетень МОИП. Т. 114, № 2, с. 64-65.

4. Kondratieva I.A., Maklakova М.Е., Riabov V.B., Gui L.X. 2009. Principle directions of aquaculture research in Russia and China. Proceeding of the Third Bilateral Conference between Russia and United States on Aquatic Animal Health. Shepherdstown, WV, USA. P. 25

5. Кондратьева И.А., Маклакова M.E., Гуй Ляньсин. 2010. Аквакультура КНР и России: научные центры по изучению патологии рыб и других объектов. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. №3, с. 34-40.

6. Maklakova М. Е., Kondratieva I. A., Mikhailova Е. S., Stupin R. V., Khapchaev Sh. Yu., and Kasumyan A. O. 2011. Effect of Antibiotics on Immunophysiological Status and Their Taste Attractiveness for Rainbow Trout Parasalmo (-Oncorhynchus) mykiss (Salmoniformes, Salmonidae). Journal of Ichthyology. V. 51, № 11, P. 1131 -1142.

7. Kondratieva I.A., Maklakova M.E., Riabov V.B., Gui L.X. 2011. Principle directions of aquaculture research in Russia and China, in Cipriano R.C., Bruckner A.W., Schelkunov I.S., editors. Bridging America and Russia with shared perspectives on aquatic animal health. Proceeding of the Third Bilateral Conference between Russia and United States. Shepherdstown, WV. P. 357.

8. Маклакова M.E., Хапчаев Ш.Ю., P.B, Ступин, И.А. Кондратьева. 2012. Воздействие температурного стресса на иммунореактивность рыб. Рыбное хозяйство. № 1, с. 53-54.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Объем 1.0 п.л. Подписано в печать 21.02.2012 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маклакова, Мария Евгеньевна, Москва

61 12-3/608

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

МАКЛАКОВА Мария Евгеньевна

ИММУНО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У РЫБ ИЗ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ И АКВАКУЛЬТУРЫ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

Специальность 03.02.06 - ихтиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Кондратьева Ирина Анатольевна доктор биологических наук, профессор Касумян Александр Ованесович

МОСКВА-2012

Содержание

Введение.........................................................................................................................................5

1. Обзор литературы..................................................................................................................9

Современные представления об иммунной системе рыб.....................................................9

Бактериальные инфекции.......................................................................................................14

Вирусные инфекции................................................................................................................23

Инвазии....................................................................................................................................27

Антибиотики и их влияние на иммуно-физиологическое состояние рыб.........................32

Хемо сенсорные свойства различных веществ для рыб......................................................38

2. Материалы и методы...........................................................................................................43

2.1. Объекты........................................................................................................................43

2.2. Методы.........................................................................................................................44

2.2.1. Гематологический анализ.......................................................................................44

2.2.2. Клинический осмотр рыб и патологоанатомическое исследование...................45

2.2.3. Бактериологическое исследование........................................................................46

2.2.4. Вирусологическое исследование...........................................................................46

2.2.5. Паразитологическое исследование........................................................................47

2.2.6. Электрофоретическое исследование сыворотки крови.......................................47

2.2.7. Введение антибиотиков..........................................................................................48

2.2.8. Электронная микроскопия.....................................................................................49

2.2.9. Исследование вкусовой привлекательности гранул с антибиотиками..............51

2.2.10. Статистический анализ результатов......................................................................53

3. Результаты............................................................................................................................55

3.1. Исследование иммуно-физиологического статуса трески и наваги.......................55

3.2. Исследование иммуно-физиологического статуса карпа при бактериальной и вирусной инфекциях...............................................................................................................66

Морфогенез БУСУ..........................................................................................................74

Ультраструктура и строение вириона 8УСУ...............................................................80

3.3. Влияние антибиотиков на иммунофизиологический статус радужной форели... 82

3.4. Оценка вкусовой привлекательности антибиотиков...............................................88

4. Обсуждение результатов.....................................................................................................95

4.1. Исследование иммуно-физиологического статуса трески и наваги.......................95

4.2. Исследование иммуно-физиологического статуса карпа при бактериальной и вирусной инфекциях.............................................................................................................100

4.3. Воздействие инъекций антибиотиков на иммуно-физиологический статус форели 102

4.4. Оценка вкусовой привлекательности антибиотиков для радужной форели.......105

Заключение................................................................................................................................109

Выводы.......................................................................................................................................112

Список литературы...................................................................................................................114

Список сокращений

ДИ-частицы - делеционные мутанты вируса 8УСУ

ЕРС - перевиваемая культура клеток из эпителиальной папилломы карпа.

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт.

М - матриксный белок вириона 8УСУ

МПА — мясопептонный агар.

МПБ — мясопептонный бульон.

ПСА - персульфат аммония.

с/х животные - сельскохозяйственные животные.

Список МЭБ - заразные (трансмиссивные) болезни, которые имеют способность к опасному и быстрому распространению безотносительно к государственным границам, сопровождаются серьезными последствиями в области общественной экономики и здравоохранения, имеют важное значение в международной торговле животными и продуктами животноводства.

ТЕМЭД - N,N,N',14' - тетраметилэтилендиамин.

ТЦД - титр вируса, количество вируса, которое вызывает ЦПД в 50% зараженных лунок с культурой клеток. ЦПД - цитопатогенное действие вируса. ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота. (-) ббИКА - минус-цепь вирусная РНК. (+) 88ЮЧ[А - плюс-цепь вирусная РНК (З-МЭ - (3-меркаптоэтанол. ВБМА - диметилбензиламин. ББ8 А - додецилянтарный ангидрид. (¿бБЫА - двуцепочечная вирусная ДНК. в - гликопротеин оболочки вириона 8УСУ.

IHNV - вирус некроза гематопоэтической ткани лососевых.

1 - длина тела до конца чешуйного покрова.

N, NS, L - белки нуклеокапсида вириона SVCV.

SDS - додецилсульфат натрия.

SVCV - вирус весенней виремии карпов.

TL - максимальная длина.

TTSS - Type three secretion system, система белков грамотрицательных

бактерий, увеличивающая их патогенность.

YHSV - вирус геморрагической септицемии лососевых.

VSV - вирус везикулярного стоматита.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время во многих развитых странах мира увеличивается производство продуктов питания, получаемых за счет аквакультуры. Масштабный рост искусственного выращивания рыб и других гидробионтов неизбежно сопровождается деградацией водных экосистем, вспышками массовых заболеваний среди культивируемых объектов и аборигенных представителей природных водоемов, усилением дестабилизирующего воздействия на рыб различных стрессовых факторов естественного и антропогенного происхождения (Наумова, 1991; Лукьяненко, Кулик, 1994; Буторина, 1997; Van der Oost, 1998; Грищенко и др., 1999; Карасева, 2001; Карманова, Рудакова и др., 2004; Казимирченко, 2006; Мелехова и др., 2010). В связи с этим особую актуальность приобретают исследования, направленные на выяснение закономерностей и особенностей естественных защитных функций организма рыб, к важнейшим из которых относится врожденная система иммунитета (Ярилин, 2010). Изучение закономерностей ее функционирования и определение факторов, влияющих на иммуно-физиологический статус рыб, относится к одному из наиболее активно развиваемых направлений в физиологии рыб (Микряков и др., 1992, 2001; Балабанова, Степанова, 2000; Головин, Головина, 2001; Юхименко и др., 2005). Особый интерес представляет понимание пределов нормы иммуно-физиологического состояния рыб, находящихся под воздействием широкого спектра различных абиотических и биотических факторов, в том числе, таких как паразитарные, бактериальные и вирусные инфекции (Cipriano, Shchelkunov et al., 2005; Казарникова, Шестаковская, 2005).

инфекций (Anderson, 1990; Peakall, 1994; Bressler et al., 1999; Skouras, 2002). Разработка принципов и методов контроля здоровья рыб в природных водоемах и, особенно для рыб, выращиваемых искусственным образом, создание новых или совершенствование существующих способов лечения рыб имеет важное прикладное значение. Широкое применение антибиотиков, используемых в аквакультуре для подавления инфекций и в профилактических целях, не всегда дает желаемый эффект (Киташова и др., 2002; Егоров, 2004; Samanidou, Evaggelopoulou, 2007). Многими авторами отмечено иммуносупрессивное действие антибиотиков на больных рыб (Zelikoff, 1994; Кондратьева, Киташова, 2002; Saglam, Yonar, 2009). Недостаточно изучено влияние лекарственных препаратов на иммуно-физиологическое состояние здоровых рыб (Rodgers, 1991; Maqsood et al., 2009). Отсутствуют сведения о хемосенсорных свойствах антибиотиков и их влиянии на вкусовую привлекательность лечебных и профилактических кормов для рыб.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• установить гематологические индикаторы иммуно-физиологического состояния рыб

• выяснить влияние антибиотиков на иммуно-физиологическое состояние здоровых рыб

• оценить вкусовые свойства антибиотиков и их влияние на пищевое поведение рыб

Научная новизна. Впервые определены доминирующие аэробные виды бактерий у трески Сайт тогкиа тат-а1Ы и наваги Е^тш navaga Белого моря. Установлена возможность оценки иммуно-физиологического статуса рыб по электрофоретическому анализу соотношения белковых фракций в сыворотки крови и по лейкограмме. Впервые продемонстрировано, что антибиотики бензилпенициллин и окситетрациклин вызывают у здоровых особей радужной форели РагаяаЫо (= Опсогкупскш) туШ$. нейтропению, элиминируют альбуминовую фракцию в сыворотке крови, индуцируют появление липоидных скоплений и других патологий внутренних органов. Негативное влияние антибиотиков зависит от длительности их применения. Впервые обнаружено, что антибиотики обладают для рыб привлекательными (окситетрациклин в высокой концентрации и неомицин в широком диапазоне концентраций) или отталкивающими (бензилпенициллин в высокой, а окситетрациклин в низкой концентрации) свойствами.

Практическая значимость работы. Подготовлены научно-практические рекомендации по диагностике иммуно-физиологического статуса рыб для специалистов ихтиопатологов и рыбоводов. Полученные результаты используются в лекционных курсах на биологическом факультете МГУ имени М.В.Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту.

3. Длительное применение антибиотиков ухудшает иммуно-физиологическое состояние здоровых рыб.

4. Антибиотики обладают для рыб выраженными вкусовыми свойствами и влияют на их пищевое поведение.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах печатного текста, включает 6 таблиц, 25 рисунков. Состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 321 источников, из них 221 - на иностранных языках.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Современные представления об иммунной системе рыб

Исследования иммунной системы рыб наиболее активно развиваются в течение последних 30-40 лет, анатомия и морфология иммунной системы в основном определены, однако сведения о функционировании в норме, при патологии, при воздействии различных веществ фрагментарны (Ellis, 1977; Микряков, Лапирова, 1997; Кондратьева и др., 2001; Микряков и др., 2001; Cooper, 2002; Кондратьева, 2002; Микряков, Микряков, 2002). При развитии аквакультуры возникла необходимость изучения способов поддержания здоровья рыб, методов диагностики и борьбы с инфекциями. Поэтому вначале большинство исследований было посвящено прикладным вопросам, изучению патогенов и их биологии, терапевтических препаратов и применению пробиотиков. И лишь в последние годы большое внимание стали уделять фундаментальным исследованиям иммунной системы рыб (Галактионов, 2005).

В поддержании гомеостаза рыб ключевую роль играют следующие органы и ткани иммунной системы рыб: центральные (тимус и почка) и периферические (селезенка, кровь, скопления лимфоидной ткани, ассоциированные с кишечником, жабрами, эпикардом), у осетровых, скатов и двоякодышащих рыб обнаружен краниальный гемопоэтический орган (Кондратьева и др., 2001; Галактионов, 2005). У млекопитающих центральными лимфоидными органами являются костный мозг и тимус; периферическими — лимфатические узлы, периферическая кровь, селезенка, лимфоидные скопления, ассоциированные со слизистыми оболочками, кожа, Пейеровы бляшки (Ярилин, 2010). Почка рыб — это основной гематопоэтический орган, где возникают все клеточные линии крови, эритроидная, миелоидная и лимфоидная. Почка делится на про- и мезонефрос (Josefsson, Tatner, 1993). В пронефросе в онтогенезе утрачивает

экскреторную функцию, становясь только гемопоэтическим и иммунным органом, клеткам гооловного отдела почки свойственно более высокая активность иммунных клеток (Ellis, 1980). В отличие от млекопитающих в этом органе не только появляются предшественники клеток крови, но и происходит их дифференциация, созревание и начало функционирования. В почке представлены как антиген-презентирующие клетки (макрофаги), так и эффекторы (B-лимфоциты, цитотоксические Т-лимфоциты), поэтому в почке может развиваться собственный иммунный ответ (Graves et al., 1984). Тимус рыб схож с тимусом млекопитающих. Он отделен капсулой, подразделен на дольки, выделяют мозговую и корковую часть (Josefsson, Tatner, 1993). В тимусе предшественники Т-лимфоцитов претерпевают дифференцировку и селекцию, зрелые Т-лимфоциты поступают затем в периферический отдел иммунной системы (Romano et al., 1999b). Селезенка у костистых рыб в основном эритроидная с мелано-макрофагальными центрами. У осетровых, скатов и двоякодышащих рыб она состоит из красной и белой пульпы (Fange, 1986). У осетровых также обнаружен краниальный гемопоэтический орган и лимфоидные эпикардиальные образования (Говядинова и др., 2000). По-видимому, краниальный гемопоэтический орган — первая в эволюции ассоциация кроветворной ткани и скелета.

В онтогенезе лимфоидных органов костистых морских рыб первыми появляются почка и селезенка, затем уже тимус; селезенка личинок в основном эритроидная (Pulsford et al., 1994; Padrós, Crespo, 1996; Schroder et al., 1998; Yun Liu et al., 2004). У костистых пресноводных рыб первым лимфоидным органом в онтогенезе является тимус, а затем почка (Ellis, 1977; Romano et al., 1999a, 1999b; Zapata et al., 2006). Клетки иммунной системы рыб соответствуют клеткам млекопитающим. Иммунная система костистых рыб включает гранулоциты, моноциты и макрофаги, НК-клетки (натуральные киллеры), неспецифические цитотоксические клетки NCC (Nakanishi et al., 1999; Evans, Jaso-Freidmann, 2001), В- и Т-лимфоциты (Ellis, 1977). Среди

гранулоцитов рыб преобладают нейтрофилы. Эти клетки одними из первых оказываются в зараженной бактериями ткани, они всегда многочисленны в зоне воспаления. Эозинофилы рыб, ассоциируются с повреждениями, вызванными многоклеточными паразитами. Макрофаги рыб способны к фагоцитозу, они могут напрямую убивать микроорганизмы с помощью активных форм кислорода и азота, а также продуцировать подобные интерлейкинам млекопитающих вещества, которые усиливают или подавляют иммунные реакции (Janeway, Medzhitov, 2002). У рыб своего максимального развития достигает система комплемента и белков острой фазы (Sunyer, Tort, 1995; Sunyer et al., 1997; Boshra et al., 2006). Помимо этих крупных защитных систем белков в крови и слизи рыб присутствуют также ферменты, такие как хитиназа и трансферраза, лизоцим, антимикробные пептиды (Alexander, Ingram, 1992). У рыб найдены белки и гликопротеины, схожие по строению и функциям с цитокинами млекопитающих (Secombes et al., 2001). Как у высших позвоночных, гуморальными факторами приобретенного имм

Информация о работе

Маклакова, Мария Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.06

Диссертация

Иммуно-физиологический статус у рыб из природных популяций и аквакультуры в норме и при патологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы