Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация хемосенсорных систем у беспозвоночных и низших позвоночных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Организация хемосенсорных систем у беспозвоночных и низших позвоночных"

На правах рукописи

НЕЗЛИН Леонид Павлович

ОРГАНИЗАЦИЯ ХЕМОСЕНСОРНЫХ СИСТЕМ У БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.13 - физиология

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук,

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития РАН (директор - академик РАН Н. Г. Хрущов)

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, чл.-корр. РАМН Скребицкий В.Г. Доктор биологических наук, профессор Шульговский В. В. Доктор биологических наук Лапшин Д. Н.

Ведущее учреждение: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 22 марта 2004 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы Горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан 21 февраля 2004г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор биологических наук

Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хеморецегщия - это несомненно наиболее древнее чувство. На заре эволюции именно хеморецепция дала первым живым существам возможность искать пищу и избегать опасности. Впоследствии из этого древнего чувства родились обоняние и вкус. В настоящее время общепризнано, что сигнальная система химической рецепции у большинства животных является ведущей не только для поиска пищи и полового партнера, но и для определения опасности и социальных сигналов, а также участвует в регуляции индивидуального развития. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе восприятия и распознавания химических сигналов является принципиально важным.

Для человека, на первый взгляд, хеморецепция не - так важна, особенно хеморецепция дистантная - обоняние. Большинство из нас больше полагается на зрение и слух, и мы часто не сознаем важность обоняния и вкуса до тех пор, пока их не лишимся. Предполагается, что в нашем организме около тысячи генов кодируют обонятельные рецепторы, и это составляет около одного процента от общего числа генов в нашем геноме. Такое поразительное число рецепторов свидетельствует о принципиальной важности хеморецепции.

Различают контактную, или вкусовую хеморецепцию и дистантную, или обонятельную (ольфакторную). У беспозвоночных специализированные вкусовые клетки расположены почти везде на поверхности тела, например на щупальцах (у улиток и у осьминогов) или на ногах (у членистоногих). Чаще всего они расположены вокруг рта, где пища проверяется на пригодность или токсичность. Обычно вкусовые рецепторные клетки расположены группами, причем каждая клетка имеет длинный дистальный отросток, выходящий через пору или ямку на поверхность тела. У круглых червей (нематод) так устроен орган химической чувствительности— амфида (Ward, 1977). Часто пара подобных чувствительных органов имеется и на хвостовом конце тела у червей. Дистальные отростки чувствительных клеток представляют собой видоизмененные реснички. Различные вещества проникают через поверхностную пору и стимулируют кончики ресничек. Хеморецепторы насекомых устроены подобным, но более специализированным образом. Для них характерно заключение рецепторов в структуру, называемую сенсиллой (Hansen, 1978; Kaissling and Thorson, 1979). Это образование из - измененной кутикулы, которое имеет форму стерженька, ямки, пластинки или волоска. К настоящему времени самой изученной структурой являются волоски. Тела рецепторных клеток лежат у основания it ■-г mini и н" .TT"f"r',TIh"H'*

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

«

отростки входят в волосок и тянутся до его кончика. Эти отростки можно считать дендритами, хотя в действительности это реснички (как у нематод), которые содержат набор микротрубочек (9+2). На кончике находится отверстие поры, покрытое капелькой вязкой жидкости. Молекулы стимулирующего вещества диффундируют в эту жидкость через пору и соприкасаются с дендритами (Alter et al., 1977). Считается, что на дендритах расположены рецепторные белки, которые вызывают изменение проводимости мембраны/Именно в этом месте происходит сенсорное преобразование химического сигнала в электрический импульс.

Интенсивнее всего физиология вкусовых рецепторов изучалась на модели мясной мухи Phormia regina группой Детье (Dethier, 1976) в Массачусетском университете. Так, было установлено, что каждая из четырех клеток во вкусовом волоске мухи избирательно чувствительна к определенному типу молекул. Это вкусовые клетки для воды, для сахара, два вида «солевых» клеток, чувствительных к катионам или к анионам, а также еще один тип клеток, являющихся механорецепторами. Избирательная чувствительность клетки к данному химическому соединению характеризуется тем, что она реагирует на него с самым низким порогом и самой сильной активностью по сравнению с ее реакцией на другие соединения. Обычно клетка обладает также некоторой реактивностью и к другим веществам. Кроме того, между реакциями на два вещества возможно тормозное действие. Оно может осуществлятся или на рецепторных участках мембраны, или между ресничками, или между телами клеток в волоске (Dethier, 1976). Такие свойства проявляются в ответах на чистые стимулы, такие как сахар или соль. При стимуляции естественными пищевыми веществами клетки в одном волоске вступают в более сложные комбинации реактивности. Соответственно, разные пищевые вещества дают разные комбинации ответов. Как пишет Детье: «каждое (естественное) вещество...имеет сложный химический состав, и каждая рецепторная клетка волоска обладает характерным спектром активности, а не одной единственной специфичностью. Если центральная нервная система способна анализировать эти комбинации, то это значит, что они содержат достаточно информации, чтобы характеризовать одно вещество как отличное от другого» (Dethier, 1976).

У низших позвоночных, как и у многих беспозвоночных, вкусовые рецепторы не вегда сосредоточены только во рту. Например, у некоторых придонных рыб от грудных плавников отходят пальцеобразные выросты, направленные вниз и несущие на своих кончиках хемочувствительные рецепторы.

Для высших позвоночных характерно расположение рецепторов на языке, в заднем отделе рта и в глотке. Вкусовые рецепторные клетки объединены во вкусовые почки, которые в свою очередь собраны в сосочки (Murray, 1973). Сосочки бывают нескольких типов и по-разному распределены на поверхности языка. Примечательно, что хеморецепторные клетки живут всего около 10 дней. Таким образом, и во вкусовых почках, и в обонятельных рецепторах идет непрерывное обновление сенсорных клеток (Graziadei and Monti-Graziadei, 1978). Как при такой непрерывной замене сенсорных элементов сохраняется специфичность хемосенсорной единицы, остается неясным.

Когда на рецепторы попадает натуральная пища, то вкусовые ощущения представляют собой сложные смеси вкусовых качеств. При тестировании вкуса чистыми химическими веществами, ощущения могут быть разбиты на четыре качества: сладкое, соленое, кислое и горькое. Наличие этих качеств было впервые установлено в начале прошлого века, и с тех пор это представление господствует в понимании вкусовых механизмов. Соленый вкус создается в самом чистом виде хлористым натрием. Считается, что катионы оказывают на рецепторные мембраны возбуждающее действие, а анионы. - тормозное. Кислый вкус - создается кислотами. Он может объясняться действием иона водорода в случае неорганических кислот, но может также определяться действием аниона органических кислот. Сладкий вкус, как полагают, зависит от стереохимической конфигурации глюкозы и близких к ней органических молекул. Для горького вкуса характерно, что он вызывается ядовитыми (токсичными) веществами, например, хинином. Механизм их действия неизвестен; возможно, он локализован на поверхностной мембране или же внутри клетки (Bartoshuk, 1978; Beidler, 1980). Тот факт, что соответствующие вкусовые ощущения вызываются преимущественно (по не исключительно) с разных участков языка, казалось бы, говорит о том, что каждый такой участок может быть основой «меченой линии», несущей в мозг информацию о своей специфической модальности. Однако записи от одиночных волокон в барабанной струне, полученные в 1941 г. Пфаффменом (Pfaffinan) показали, что это не так. Одиночное волокно может лучше всего отвечать на один стимул, но оно обычно в той или иной степени реагирует и на другие типы стимуляции. Это говорит о том, что данное волокно синаптически связано во вкусовой почке с несколькими рецепторными клетками разной специфичности. (Pfaffman et al., 1976). Пфаффман предположил, что в такой системе сенсорное качество определяется не просто активацией известной группы волокон, но и характером импульсации других активных групп. Эта теория вкусовых качеств получила название теории «распределения активности между волокнами» (across-fibcr pattern).

В настоящее время представление о восприятии вкуса объединяет в себе обе теории: и «меченой линии», и «распределения активности между волокнами». Четыре основных вкусовых качества по-прежнему служат простейшей схемой для объяснения большинства физиологических и психических данных. В пределах этой схемы представляется, что и специфические рецепторные клетки, и вкусовые почки, и волокна барабанной струны обладают каждый своим собственным стимулом, но на каждом из этих уровней может существовать в разной степени реактивность к стимулам других типов (Shepherd, 1992).

Что касается дистантной хеморецепции, то источником. запахов. является практически. все. Растения, хищники, добыча, другие особи того же вида - все это испускает запахи, которые животному необходимо распознавать и классифицировать. Разумеется, в процессе эволюции оказалось возможным создать более изощренные слуховые и зрительные системы. Иногда эти новые формы коммуникации превосходят исходные химические системы, но у большинства организмов основная роль по-прежнему принадлежит дистантной хеморецепции (Wilson, 1975).

Рецепторы для дистантных, стимулирующих молекул называют обонятельными (ольфакторными), а соответствующую сенсорную модальность - обонянием. Можно сказать, что обонятельными рецепторами обладают, все организмы. У водных животных стимулирующие молекулы передаются через воду, а у наземных передающей средой служит воздух. Среди беспозвоночных обоняние достигает наивысшего развития у общественных, насекомых. Это проявляется чисто анатомически. На передающей стороне они обладают более чем десятком различных эндокринных желез (Wilson, 1975). Принимаются исходящие сигналы рецепторами, большинство из которых обычно сосредоточено в антеннах (усиках) — парных ветвистых. придатках на голове насекомого (см. например, Синицына и др., 2003). Общее число рецепторов в обоих усиках колеблется у разных насекомых от 40 000 до 200 000. Как и во вкусовых рецепторах насекомого, обонятельные сенсорные клетки собраны в сенсиллы, или волоски, по строению очень похожие на вкусовые волоски. Однако волосок может содержать, одну или несколько клеток, и каждая клетка обладает несколькими периферическими ресничками (дендритами). Обонятельные волоски отличаются также своими системами поверхностных пор. В некоторых случаях пор очень много (до 15 000 на волосок). Каждая пора является наружным отверстием углубления в кутикуле волоска. На дне углубления начинаются трубочки, пронизывающие кутикулярную стенку и сообщающиеся с пространством внутри оболочки и дендритами рецепторных клеток. Считается, что пахучие молекулы

адсорбируются на наружной кутикуле и через нее диффундируют к поре, а оттуда внутрь через систему трубочек к рецепторным дендритам (Kaissling, 1974; Boeckh, 1980). При тестировании разными запахами данный обонятельный рецептор насекомого отвечает на определенное их число, составляющее его спектр реактивности. При анализе реакций на широкий круг обонятельных стимулов выделяют группы рецепторов со сходными спектрами. По мнению Бекха (Boeckh) их можно классифицировать как «специализированные к феромонам» - это клетки с узкой настройкой на молекулу данного феромона; «специализированные па запахи пищи» -это клетки, обладающие сходными спектрами реактивности к разным спиртам, эфирам и другим соединениям, создающим запахи. пищевых продуктов. Считается, что конкретное пищевое вещество опознается при стимуляции рецепторов разных типов в разных сочетаниях. И третий тип рецепторов - «обобщающие». Клетки этого типа реагируют на широкий круг веществ. Из обонятельных стимулирующих молекул лучше всего изучены феромоны, а среди феромонов - половые аттрактанты. Вычислено, что достаточно одной молекулы, чтобы вызвать заметный ответ рецепторной клетки, а 200 молекул достаточно, чтобы вызвать поведенческую реакцию самца (Kaissling and Thorson, 1979). Такая ситуация характерна также для слухового и зрительного восприятия, в то время как вкусовая рецепция требует гораздо больших концентраций стимулятора.

Все животные имеют характерные. периферические обонятельные органы, для улавливания. запахов. Это обычно носовая полость с сенсорным эпителием у позвоночных, и камеры или сенсиллы у беспозвоночных. Молекулы запахов растворяются в слизи (мукусе) и транспортируются специальными белками к расположенным на ресничках обонятельных рецепторных нейронов рецепторам. Роль мукуса и этих белков остается пока совершенно неясной, поскольку обонятельные рецепторные нейроны могут реагировать на запахи и в отсутствие мукуса (Firestein et al., 1990). Общепринято, что один рецепторный нейрон экспрессирует только один рецепторный ген (Lancet, 1986; Shepherd, 1990,1992; Shepherd and Firestein, 1991; Chess et al., 1994). Однако, прямого экспериментального доказательства этому до сих пор не получено.

У позвоночных обоняние осуществляется рецепторами, заложенными глубоко в носовой полости. У низших позвоночных, таких как рыбы или лягушки, носовая полость обычно имеет форму сравнительно простого мешочка, и струя воды или воздуха проходит непосредственно над рецепторным слоем. У млекопитающих, а особенно у животных с тонким обонянием, таких, как опоссум, кролик или собака,

носовые полости имеют сложную форму (Haberly, 1979). У этих животных воздух сначала нагревается и увлажняется, и лишь затем достигает обонятельных рецепторов. Обонятельные рецепторные клетки расположены тонким слоем. Зрелая клетка имеет длинный тонкий, дендрит, который оканчивается небольшим утолщением на поверхности (см. например Williams, 1973). От этого утолщения отходят несколько ресничек, которые могут быть длиной до 200 мкм, а диаметром 0.1-0.2 мкм. Реснички содержат стандартный набор микротрубочек (9 пар+2), то есть такой же, как реснички в других тканях и покрыты слизью, выделяемой опорными клетками и боуменовыми железами.

Пахучие вещества сначала" поглощаются слизью, и лишь затем проникают к ресничкам и концевому утолщению дендрита, где связываются с рецепторными молекулами в мембране. Распознавание молекулы запаха начинается с взаимодействия запаха и рецептора аналогичных взаимодействию антиген - антитело в имунной системе или нейромедиатор - рецептор в нервной системе (Lancet 1986; Shepherd, 1987). Это приводит к деполяризации - рецепторного нейрона и генерации потенциалов действия (обзор литературы см. в Anholt, 1993; Minor, Kaissling, 2003). Электрический импульс по аксону приходит в обонятельные клубочки (гломерулы) - специфические структуры, которые, как считается, являются неотъемлемой структурной и функциональной частью обонятельной системы (Leise, 1990). Клетки обонятельного рецептора очень малы, и только в последнее время стало возможным непосредственное отведение потенциала от тела единичной клетки. Как и вкусовые рецепторные клетки, так и обонятельные рецепторные клетки не являются статичной популяцией нейронов. Они дифференцируются из базальных клеток-предшественников, и этот процесс продолжается в течение всей жизни. Просуществовав около 60 дней, клетки дегенерируют и подвергаются фагоцитозу.

У млекопитающих в дополнение к главной обонятельной системе имеется и дополнительная обонятельная система, которая начинается вомеронасальным органом. Его функции остаются совершенно неизвестными. Ранее считалось, что он детектирует феромоны (обзор литературы см. в Beauchamp et al., 1976). Однако в дальнейшем выяснилось, что нейроны основной обонятельной системы чувствительны к феромонам, а нейроны вомеронасального органа чувствительны к веществам, не относящимся к феромонам (Domes et al., 1996).

Бросающиеся в глаза общие черты в организации обонятельных систем насекомых и позвоночных были давно замечены биологами. В дальнейшем, когда в орбиту исследований стали вовлекаться другие группы животных, например нематоды,

моллюски и ракообразные, оказалось, что некоторые черты обонятельных систем присутствуют всегда, вне зависимости от систематического положения и сложности организации животного. Что представляют собой подобные черты, и что за этим скрывается? Что это - основные элементы, без которых невозможно обоняние, или тому, что они постоянно присутствуют даже у далеких друг от друга типов животных, есть иное объяснение?

В современной физиологии, в основном, господствует так называемый «модельный» подход, при котором эволюционным и сравнительным данным уделяется относительно мало внимания. При этом считается как бы само собой разумеющимся, что наличие сходства в строении, развитии, или физиологии вероятнее всего отражает основные закономерности биологии. Сравнительно-физиологический подход, в свою очередь, рассматривает возможные пути появления этих закономерностей. Изучаемый механизм или структура могли, например, развиться однажды у дальнего предка тех животных, которых мы сравниваем и быть, таким образом, унаследованным от общего источника (гомология), или они могли развиться у них независимо из разных (конвергенция) или из одного и того же источника (параллелизм). Наиболее четко этот подход проявляется в анализе механизмов обоняния. В последние годы все большую популярность у сравнительных физиологов приобретает идея, что сходство в организации обонятельных систем у далеких друг от друга животных является, как раз, результатом конвергенции, а значит, это сходство отражает базовые механизмы, лежащие в основе получения и обработки химической информации (например, Hildebrandt, Shepperd, 1997; Ache, Restrepo, 2000).

Наиболее изученными в сравнительно-физиологическом плане типами животных были представители нематод, насекомых, моллюсков и позвоночных (см. таблицу 1). И у всех у них обонятельные системы - имеют некие черты разительного сходства, которые, при этом, не встречаются в других сенсорных системах. Так, обонятельные сенсорные нейроны - это всегда биполярные клетки, дендрит которых оканчивается в жидкости. Этот дендрит имеет реснички и/или микроворсинки, на которых, как предполагается, локализованы обонятельные рецепторы. Большинство обонятельных рецепторов взаимодействуют с G- белками и активируют внутриклеточный сигнальный каскад. На противоположном конце клетки находится. аксон, который проходит непосредственно в мозг и там образует синапсы с различными типами клеток внутри специфических образований, называемых гломерулами или клубочками.

Тип

Класс

нематоды сецерненты

членистоногие ракообразные

насекомые

моллюски гастроподы

позвоночные костистые рыбы

амфибии

млекопитающие

_Вид_

Caenorhabditis elegans Homarus americanus Panulirus argus Apis mellifera Drosophila melanogaster Heliothis virescens Manducasexta Periplaneta americana Schistocerca americana Achatinafulica Helixaspersa Limaxmarginatus Limaxmaximus Brachydanio rerio Carassius auratus; lctaluruspunctatus Oncorhynchus mykiss Ambystoma tigrinum Necturus maculosus. Rana spp. Xenopus laevis Mesocricetus auratus Musmusculus domesticus Rattus norvegicus Caviaporcellus Susscrofa Bos taunts Ovis aries _Homosapiens_

Таблица 1. Модельные виды, наиболее часто используемые в изучении обоняния.

У позвоночных обонятельные сенсорные нейроны находятся в псевдоупорядоченном эпителии внутри носовой полости, а их аксоны проходят в обонятельную луковицу (ростральная часть головного мозга), где входят в гломерулы. У насекомых обонятельные нейроны объединены в группы внутри кутикуляризованных сенсилл, которые расположены, по большей части, вдоль антенн. Молекулы запахов достигают обонятельных нейронов через поры в кутикуле; аксоны этих нейронов идут в антенную долю мозга. У лангустов обонятельные нейроны расположены группами внутри специализированных. сенсилл, находящихся на антеннулах, а их аксоны оканчиваются в обонятельной доле дейтоцеребрума. У улиток обонятельные нейроны объединены в субэпителиальные группы, а их дендриты иннервируют обонятельный эпителий на кончиках щупалец. Аксоны же идут в

щупальцевые ганглии. У нематоды Caenorhabditis elegans обонятельные нейроны локализованы в парных амфидах - специализированных органах обоняния, осязания и вкуса, расположенных около ротового отверстия. Любопытно, что из 12 нейронов в каждом амфиде 3 реагируют исключительно на воздушные химические стимулы и, следовательно, являются чисто обонятельными, а еще два реагируют кроме того и на другие стимулы (Baigmann и др., 1993; Mori, Ohshima, 1997).

Аксоны обонятельных рецепторных нейронов всегда проецируются в обонятельные гломерулы - плотные клубочки нейропиля. У позвоночных они находятся. в обонятельной луковице мозга, у насекомых - в антеннальной доле, у ракообразных -в обонятельной доле, у моллюсков - в щупальцевом ганглии. Клубочки - это чаще всего сферические структуры, состоящие из претерминальных аксонов и терминальных окончаний обонятельных рецепторных нейронов и дистальных дендритных пучков митральных и перигломерулярных клеток. Диаметр гломерул 50-200 мкм у млекопитающих и 20-50 мкм у амфибий и рыб (Pinching and Powell, 1971). Число гломерул у разных видов варьирует: 5000 (собака), 2000 (кролик), 1500 (крыса), 1000 (мышь) (Allison, 1952; Meisami, 1991). Число обонятельных рецепторных нейронов значительно больше, и в одну гломерулу у кролика, например, сходится около 25000 нейронов. С выходящей стороны у кролика имеется около 50000 митральных и 25000 тафтных клеток (Allison, 1952).

Различные данные свидетельствуют о том, что гломерулы являются функциональными и анатомическими единицами процессинга обонятельной информации (Leveteau and MacLeod, 1966; Воронков, Гусельникова, 1967,1968; Sharp et al., 1975,1977; Lancet et al., 1981; Stewart et al., 1979; Марголис, 1983; Воронков, 1987, 1988; Потапов, 1987; Минор и Ревищин, 1997). Удалось даже обнаружить корреляцию между конкретным запахом и идентифицированными гломерулами (Teicher et al., 1980; Rodersen and Blass, 1981; Greer. et al., 1982; Coopersmith and.Leon, 1984; Cinelli and Kauer, _ 1994). Микроинъекции пероксидазы хрена в гломерулы выявили, что иннервирующие их обонятельные рецепторные нейроны мозаично разбросаны в эпителии (Jastreboff et al., 1984; Pedersen et al., 1986; Astic and Saucier, 1986). Обобщая, можно сказать, что каждая гломерула представляет собой центр сложной цепи, которая структурно определяется обонятельными рецепторными нейронами, проецирующимися в нее, и митральными клетками, ее иннервирующими. Функционально она определяется совокупностью обонятельных рецепторов, т.е. спектром запахов, которые возбуждают эти нейроны и, соответственно данную гломерулу (Hildebrand and Shepherd, 1997). Однако, несмотря на то, что число гломерул в абсолютном большинстве обонятельных систем намного

меньше, чем число обонятельных нейронов и явно меньше, чем число различаемых животными запахов; господствующим является мнение, что число гломерул соответствует числу обонятельных рецепторов и что все нейроны, экспрессирующие один тип рецептора, сходятся в одну гломерулу (Lancet, 1986; Ressler et al., 1994; Vassar etal.,1994).

Гломерулы обонятельной луковицы позвоночных состоят из отростков рецепторных нейронов, интернейронов (перигломерульные клетки) и нескольких типов проекционных нейронов. У беспозвоночных гломерулы часто структурно' и функционально похожи на таковые позвоночных (Hamstram, 1928; Boeckh et al., 1990; Boeckh and Tolbert,. 1993; Hildebrand, 1995). Их число несколько меньше и сильно варьирует: 50-300 (ракообразные), 9-1000 (насекомые) (Blaustein et al., 1988; Rospars, 1988; Boeckh et al., 1990). Обонятельные нейроны варьируют в числе от 2000 до 350000 (Blaustein et al., 1988; Rospars, 1988). Гломерулы иннервируются относительно небольшим числом главных нейронов (principal neurons, аналог митральных клеток): 250-300 (Boeckh et al., 1984; Homberg et al., 1988, 1989). Таким образом,.можно предположить более комплексный процессинг сенсорной информации в обонятельной системе беспозвоночных.

Примечательно, что у ряда насекомых (например Manduca sexta) гломерулы устроены точно таким же образом, как у позвоночных, и состоят из отростков рецепторных нейронов, интернейронов и проекционных нейронов антеннальной доли (Hildebrand, Shepherd, 1997; Strausfeld, Hildebrand, 1999). Сходство в строении гломерул у позвоночных и насекомых отмечалось многими авторами, однако необходимо иметь в виду, что практически все имеющиеся данные получены на нескольких объектах - это крыса (R. norvegicus), мышь (M, musculus domesticus), бабочка-бражник (Manduca) и дрозофила (Drosoph i la).

Каждая гломерула реагирует на конкретный набор запахов, точнее каждый конкретный запах в конкретной концентрации активирует один и тот же набор гломерул у каждой особи одного и того же вида. Это было показано на крысах, мышах, рыбах данио, пчелах и бражниках (Friedrich, Korsching, 1997; Vickers et al., 1998; Galizia et al., 1999; Rubin, Katz, 1999; Wachowiak, Cohen, 2001). В дополнение к этому, проекции обонятельных рецепторных нейронов в гломерулы постоянны у особей одного и того же вида. И у крыс, и у дрозофил аксоны рецепторных нейронов, экспрессирующих один и тот же рецептор или набор рецепторов проецируются в одни и те же гломерулы (Ressler et al., 1994; Mombaerts et al., 1996). Таким образом, хотя роль гломерул в кодировании хемосенсорной информации и остается неясной,

очевидно, что она сходна у всех изученных видов. Даже построение гломерул в онтогенезе происходит очень похожим образом и у млекопитающих, и у насекомых (Graziadei, Monti Graziadei, 1986; Valverde et al., 1992; Ноздрачев и др., 1995; Oland, Tolbert, 1998).

У ракообразных гломерулы построены сходным образом, хотя имеют несколько важных отличий. Так, у десятиногих раков аксоны обонятельных рецепторных нейронов взаимодействуют с интернейронами и проекционными нейронами внутри уникальных для этой группы конических гломерул (Schmidt et al., 1992; Helluy et al., 1995). У лангустов гломерулы состоят из трех разных частей, которые иннервируются различными интернейронами (Schmidt et al., 1992; Schmidt, Ache,. 1997). Похожее деление гломерул на «отделы» было недавно описано и у млекопитающих (например, Kasowski et al., 1999). Является ли это свойство еще одной общей обязательной чертой обонятельных гломерул? Ответ на этот вопрос может быть получен только в результате дальнейших сравнительно-физиологических исследований.

В дополнение к морфологическому сходству, многие физиологические характеристики гломерул являются общими для всех изученных видов: например, пресинаптическое торможение сенсорного сигнала при входе в гломерулы описано и у черепах (Terapene Carolina), и у лангустов (P. argus), хотя механизмы этого торможения и отличаются (Wachowiak, Cohen, 1999).

Необходимо отметить, что обонятельные гломерулы встречаются не у всех видов. У наиболее примитивных хордовых - ланцетника и асцидий они не обнаружены (Bone, 1960). Среди моллюсков гломерулы могут присутствовать, а могут отсутствовать. У головоногих они не обнаружены (Young, 1965, 1971). У гастропод гломерулы присутствуют (Зайцева, 1994), но аксоны многих рецепторных нейронов проходят, минуя их, непосредственно в тентакулярные или даже церебральные ганглии (Chase, Toloczko, 1993). Функциональное значение этой экстрагломерулярной обонятельной системы остается совершенно неясным. Следует отметить, что и у ряда позвоночных описаны аксоны обонятельных нейронов, которые минуют обонятельную луковицу (Eisthen, 1997).

Строение гломерул у насекомых чрезвычайно разнообразно. Они могут совсем отсутствовать, например, у плавунцов Dytiscus marginalis, поденок, стрекоз и некоторых других (Strausfeld, 1998; Strausfeld, Hildebrand, 1999). У ракообразных гломерулы также могут отсутствовать.

Обонятельные нейроны амфидов С. elegans не образуют гломерул. Можно полагать, что нейронные сети у нематод принципиально отличаются от таковых у других типов

животных. Каждый обонятельный нейрон образует синапсы и с интернейронами, и с другими хемосенсорными нейронами, включая иногда парный ему контралатеральный нейрон (White et al., 1986).

Таким образом, гломерулы, хотя и являются важной частью системы дистантной хеморецепции, не являются абсолютно необходимыми. Да и само определение «гломерулы» является проблематичным. Первоначально этот термин употребил Рамон-и-Кахаль (Cajal, 1890) при описании обонятельной луковицы. В дальнейшем его стали употреблять для описания различных клубочков отростков (Pinching, Powell, 1971) или даже любых синаптических образований, отделенных глиальной мембраной или иными клеточными структурами (Shepherd, 1974). Однако под такое определение попадает большинство участков центральной. нервной системы. и позвоночных, и беспозвоночных. Очевидно, что обонятельные гломерулы отличаются от остальных похожих структур, как очевидно и то, что они важны для восприятия запахов. Однакр остается неясным, в чем же состоят эти отличия, и что в строении гломерул является необходимым для цроцессинга обонятельной информации.

Обонятельные гломерулы отсутствуют у примитивных насекомых и ракообразных, поэтому маловероятно, что они появились у общего предка членистоногих, моллюсков и позвоночных. Более того, предполагается, что гломерулы появлялись независимо и у разных представителей членистоногих (Strausfeld et al., 1995; 1998). Таким образом, гомология обонятельных гломерул в разных типах вряд ли возможна. В настоящее время практически все исследователи предполагают конвергентное развитие этих структур как функциональную адаптацию для процессинга обонятельной информации. Если так, то изучение их строения чрезвычайно важно для понимания принципов кодирования обонятельной информации. Вероятно, гломерулы служат в обонятельной системе для топографического кодирования, по аналогии с тем, как это происходит в зрительной или слуховой системах. Действительно, с тех пор, как Адриан (Adrian, 1950) и Кларк (Clark, 1951, 1957) обнаружили топографическую организацию ответов на запахи в обонятельной луковице, гломерулы стали рассматриваться как функционально значимые зоны синаптического процессинга первичной афферентной информации, которая в них пространственно картируется. Позже было показано, что у позвоночных проекции рецепторных нейронов топографически организованы (обзор литературы см. в Schoenfeld et al., 1994), а у улиток пространственно организованы ответы на запахи (Никитин, Балабан, 1999; Nikitin, Balaban, 2000).

Механизмы, используемые в этой системе, остаются неизвестными, мы лишь можем предположить, что гломерулы необходимы для усиления обонятельного сигнала

и для осуществления латерального торможения, служащего для точной настройки на конкретный сигнал. Как бы то ни было, очевидно, что эти структуры необходимы для усиления соотношения сигнал-шум при работе самой чувствительной из сенсорных систем.

Таким образом, становится ясным, что для понимания принципов функционирования хеморецепции необходим междисциплинарный подход, который бы базировался на данных анатомии, физиологии и молекулярной биологии. И особенно важным здесь является то, что такие принципы должны быть основаны на изучении как позвоночных, так и беспозвоночных животных, поскольку, как мы видим, в процессе эволюции у разных типов животных выработались схожие механизмы детекции химических стимулов (Hanstram, 1928; Deithier, 1990; Shepperd, 1992; Smith and Getz, 1994; Hildebrand, 1995; Hildebrand and Shepherd, 1997; Eisthen, 2002).

Основные вопросы, связанные с организацией и функционированием обонятельной системы все еще остаются неясными. Так, неизвестно, насколько одинаково строение обонятельной системы у разных животных? Какие структуры всегда необходимы для распознавания запахов, а какие являются «частным случаем» адаптации конкретной группы животных к конкретным условиям обитания? Как кодируется запах на уровне обонятельных нейронов и как на уровне гломерул? Как участвуют в распознавании запахов вышележащие отделы ЦНС? Ответы на эти и другие вопросы о том, как работает обонятельная система, имеют и теоретическое, и чисто практическое значение.

Имеются неопровержимые доказательства того, что обоняние прямо влияет на настроение, память, половое поведение, эмоцик, эндокринную и иммунную системы. Больные анисомией (лишенные обоняния) страдают от депрессий, и их существование очень серьезно осложнено. В настоящее время мало что может им помочь, поскольку, несмотря на успехи в этой области, базовые механизмы, определяющие строение, развитие и функционирование хемосенсорных систем, все еще остаются неясными.

Одним из возможных путей их изучения является сравнительный анализ сенсорных систем позвоночных и беспозвоночных животных. Нервная система беспозвоночных долгое время изучалась в основном зоологами, пытающимися познать план строения нервной системы как таковой, и построить эволюционное древо. С другой стороны, нервную систему позвоночных изучали, во многом, потому, что человек - это тоже позвоночное и образует с остальными позвоночными небольшую компактную группу. Это было важно, прежде всего, с медицинской точки зрения, поскольку давало возможность изучать как бы «человеческую» нервную систему, но методами, которые

не могли бы быть использованы для изучения действительно нервной системы человека

Базовое сходство между нервной системой позвоночных и беспозвоночных животных было подмечено очень давно. Сент Иллер был первым (1822), кто предложил перевернуть рака на спину и увидеть единство плана его строения с позвоночными. С тех пор было накоплено огромное. количество данных, подтверждающих единство организации нервных систем позвоночных и беспозвоночных. Между тем, физиология все еще изучает эти две группы животных отдельно. Позвоночных используют, как «модель» человека, например, когда изучают высшие функции мозга и поведение. Беспозвоночных используют, когда нужны их просто устроенные нервные системы с узнаваемыми клетками, или уникальные гигантские нейроны, или их феноменальная толерантность в эксперименте, когда отдельные части центральной или даже периферической нервной системы с эффекторами извлекаются из тела животного и живут часами, а то и днями, в чашке Петри, сохраняя свои физиологические реакции. Это дает возможность изучать изолированные нервно-мышечные или сенсорные системы.

До сих пор не проводилось сравнительного анализа хемосенсорных. систем позвоночных и беспозвоночных животных. Физиологи, занимающиеся хеморецепцией, традиционно изучают или тех, или других. Между тем, именно сравнительное изучение таких систем способно дать ответы на вопросы об основных закономерностях их строения, развития и функционирования.

Одним из наиболее любопытных хемосенсорных органов беспозвоночных животных важным, на наш взгляд, для сравнительного анализа является осфрадий моллюсков. Давно известно, что это орган дистантной хеморецепции (Соколов и др., 1980; Соколов, Зайцева, 1982; Croll, 1983; Haszprunar, 1985; Зайцева и др., 1987, 2000; Зайцева, 1991,1992; Emery, 1992). Расположение и схожие черты строения этого органа у разных, далеких в систематическом отношении видов позволяют с уверенностью утверждать, что этот орган является гомологичным.

Осфрадий состоит из сенсорного эпителия и ганглия, связанного с ЦНС одним или несколькими осфрадиальными > нервами. Наиболее изученным является осфрадий пресноводных пульмонат (Lacase-Duthiers, 1872; Benjamin, 1971; Benjamin and Peat, 1971; Камардин и Цирулис, 1980). Известно, что он содержит первичные рецепторные нейроны, вставочные нейроны, нейросекреторные клетки и клетки, проецирующиеся в ЦНС, и реагирует на содержание углекислого газа, кислорода и органические вещества, растворенные в воде (Камардин, 1976; Kamardin et al., 1999). Ранее было высказано

предположение об интегративной функции осфрадия в обработке хемосенсорной информации (Benjamin, 1971). Поэтому нам представлялось важным провести сравнительное изучение этого органа наряду с обонятельной луковицей позвоночных..

Другой хемосенсорный орган, присущий практически всем трохофорным животным, а также встречающийся и у представителей других групп - аборальный (апикальный) орган. Это клеточное образование, характерное для личиночной стадии, которое формируется с началом плавания и редуцируется после метаморфоза. Апикальный орган имеется у представителей даже таких таксонов, которые считаются. неродственными, и не связан с тем, является ли личинка свободноплавающей планктотрофной или развивается внутри яйцевой капсулы до достижения ювенильной стадии (Schaefer and Ruthensteiner, 2001). У всех личинок, имеющих апикальный орган, он всегда расположен на аборальном полюсе личинки и включает султанчик чувствительных ресничек и лежащий в его основании комплекс сенсорных нейронов (Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977; Nielsen, 2001, и другие), часть из которых (от одной до четырех сенсорных и обычно две несенсорных клетки) является серотонинергическими (Hay-Schmidt А. 1995; Kempf et al., 1997; Marois and Carew, 1997; Dickinson et al., 1999; Page and Parries, 2000, и другие). Кроме того, комплекс апикальных нейронов включает в себя нейроны, экспрессирующие пептид FMRFaмид (Kempf et al., 1992; Dickinson et al. 1999). В некоторых случаях серотонин и FMRFaмид могут быть колокализованы в одной клетке (Voronezhskaya et al., 2002), а у Lymnae stagnalis в двух апикальных нейронах, являющихся рудиментами апикального органа (Voronezhskaya et al., 1999; Kuang and Goldberg, 2001; Koss et al., 2003) колокализованы как минимум три трансмиттера: серотонин, дофамин и FMRFa^TO (Voronezhskaya and Elekes, 1993; Voronezhskaya et aL, 1999; Voronezhskaya and Elckes, 2003).

Структурная организация апикального органа позволяет предположить, что он воспринимает и передает многообразные химические сигналы, получаемые из окружающей среды, а также осуществляет первичную обработку полученной информации (см. например Kempf et al., 1997; Marois and Carew, 1997; Koss et al., 2003). Тем не менее десятилетия сравнительных и экспериментальных исследований не привели к формированию аргументированного взгляда на функцию апикального органа. Считается, что он участвует в индукции оседания и/или метаморфоза личинки (Conklin, 1897; Chia and Rice, 1978; Hadficld ct al., 2000). На связь этого хемосенсорного органа с метаморфозом указывают многочисленные данные. Так, у личинки моллюска Haliotis на ресничках апикального султанчика обнаружены рецепторы к фактору внешней среды - релизеру метаморфоза (Baxter and Morse, 1992). Личинка моллюска

Phestilla после разрушения нейронов в основании апикального органа теряла способность отвечать на такие релизеры, хотя способность проходить метаморфоз при этом сохранялась (Hadfield et al., 2000). Однако существуют факты, которые не вписываются в представление о том, что апикальный орган нужен исключительно в период прохождения метаморфоза. Так, известно, что этот хемосенсорный орган дифференцируется как одна из наиболее ранних нейронных структур и полностью формируется раньше центральных ганглиев, то есть задолго (у разных видов от нескольких дней. до нескольких недель) до готовности личинки к метаморфозу (Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1977; Marois and Carew, 1997 и другие), причем у некоторых видов он редуцируется еще до прохождения метаморфоза (Page, 2002; Wanninger and Haszprunar, 2003). Хотя было показано, что среди сенсорных нейронов апикального органа всегда присутствуют серотонинергические (Page and Parries, 2000; см ссылки выше), однако вызвать серотонином метаморфоз удалось только у одного из нескольких протестированных видов (Leise et al., 2001).

Зародыши, пресноводных улиток большого прудовика, Lymnaea. stagnalis, и аквариумной катушки, Helisoma trivolvis (Mollusca Pulmonata Basommatophora) представляют уникалыгую модель для изучения возможной функции раннего хемосенсорного органа, в индивидуальном развитии. Их зародыши развиваются, проходя те же главные стадии, что и морские гастроподы, личинки которых, как правило, выходят из яйцевых оболочек намного раньше. Спиральное дробление яйца прудовика и катушки приводит к образованию «зародыша», плавающего в перивителлиновой жидкости благодаря биениям ресничек. Эта личиночная стадия соответствует трохофоре. Трохофора развивается в велигера, который через несколько дней начинает прикрепляться ногой к внутренней поверхности яйца, что соответствует оседанию свободноживущей личинки. Несколько позже велигер проходит метаморфоз, становясь ювенильной улиткой, ползающей при помощи ресничек подошвы по внутренней поверхности яйцевой капсулы (Мещеряков, 1975; Goldberg and Kater, 1989; Voronezhskaya et al., 1999).

Развитие Lymnaea и Helisoma проходит практически одинаково. Это относится и к их хемосенсорному органу, который у обоих видов включает два нейрона. Каждый нейрон биполярен, его апикальный отросток заканчивается пучком ресничек, а базальный многократно ветвится недалеко от тела клетки, создавая область тонких отростков с варикозными расширениями. При достаточно сходной морфологии, нейроны апикального органа прудовика и катушки проявляют различный химизм. У прудовика они содержат преимущественно дофамин (экспрессируя также некий пептид

семейства FMRFaмидa и серотонин) (Croll and Voronezhskaya, 1996; Voronezhskaya et al., 1999; Voronezhskaya and Elekes, 2003), а у катушки исключительно серотонин (Goldberg and Kater, 1989; Diefenbach et al., 1991,1995,1998; Voronezhskaya and Elekes, 1993; Koss et al., 2003). На стадиях трохофоры-среднего велигера, только эти два нейрона являются моноаминергическими (Diefenbach et al. 1998; Voronezhskaya et al. 1999). Таким образом, зародыши прудовика и катушки являются уникальной моделью для изучения роли различных моноаминов, выделяемых нейронами раннего хемосенорного органа на эмбриональное развитие и поведение.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось сравнительное изучение хемосенсорных систем модельных беспозвоночных и низших позвоночных животных на разных стадиях онтогенеза для определения основных закономерностей, лежащих в основе их строения, функционирования и развития.

Для достижения поставленной цели были подробно изучены строение и физиология следующих хемосенсорных органов: обонятельная луковица головастика лягушки Xenopus laevis и осфрадий пресноводной улитки Lymnaeastagnalis. Основное внимание при этом уделялось базовым характеристикам сенсорных систем и, где возможно, идентифицированным нейронам, определяющим физиологические особенности органов и регулируемое ими поведение.

Кроме того, было изучено возникновение и развитие нервных структур у наиболее примитивного представителя хордовых - асцидии Molgula citrina, у типичного представителя полухордовых Balanoglossus, представителей вторичноротых — форонид, типичных представителей типа Annelida - полихеты Phyllodoce maculata, а также у нескольких представителей различных класов типа Mollusca. Особенное внимание уделялось закладке и развитию сенсорных органов и их возможной роли в регуляции развития и поведения личинок.

Научная новизна работы

Впервые показано, что строение обонятельной луковицы Xenopus значительно отличается от того, что считалось ранее общим для всех позвоночных животных. Было обнаружено, что в нормально функционирующей обонятельной луковице осуществляется иннервация обонятельными сенсорными нейронами не одной, а нескольких обонятельных гломерул, а также доказано отсутствие глиальной и клеточной стенки гломерул.

Для изучения физиологических характеристик клеток обонятельной луковицы впервые была разработана методика культивирования срезов с сохранением как луковицы и сенсорного эпителия (мукозы), так и вышележащих отделов головного мозга, что позволило ставить электрофизиологические эксперименты параллельно с измерением уровня Са2+ в нейронах, сохраняющих эфферентные и афферентные связи. Изучена роль норадреналина в механизме торможения митральных клеток и показано, что оно осуществляется путем блокирования пресинаптических Са2+-токов, опосредуемых а2-адренорецепторами.

Была подробно изучена нервная система важных в филогенетическом плане личинок наиболее примитивного хордового животного асцидии,. полухордового животного Balanoglossus proterogonius, различных видов иглокожих и форониды Phoronopsis harmeri. Было показано, что у них полностью отсутствуют обонятельные гломерулы, что имеет важное значение для понимания появления этих структур в филогенезе.

Впервые были обнаружены периферические нейросекреторные клетки и ОЛБЛ-ергические первичные сенсорные нейроны в хемосенсорыом органе большого прудовика. Показана возбуждающая роль ОЛБЛ в этом органе и описано взаимодействие нейротрансмиттеров, необходимое для первичной обработки хемосенсорной информации на уровне периферических сенсорных входов. Описан новый механизм участия периферического хемосенсорного органа в управлении поведением - прямое тоническое тормозное действие.

Впервые было гистохимически и биохимически показано присутствие системы синтеза окиси азота (МО-синтазной активности) в нервной системе беспозвоночных животных и предположено участие N0 в хеморецепции.

Впервые описан неизвестный ранее провизорный сенсорный орган, расположенный па каудальном конце тела у личинки полихеты Phyllodoce maculata.

Обнаружено, что у трохофорных животных первые нервные элементы, дифференцирующиеся в процессе нейрогенеза и маркирующие контуры будущей ЦНС, являются периферическими хемосенсорными нейронами. Впервые показана роль ранних хемосенсорных нейронов в индивидуальном развитии пресноводных моллюсков. Обнаружено, что продуцируемый нейронами апикального органа трансмиттерный моноамин тормозит эмбриональное развитие, и такое торможение функционально значимо при развитии в среде, неблагоприятной для метаморфоза и вылупления.

Научно-теоретическое и практическое значение работы

Данные о клеточном строении и связи нервных элементов значительно изменили существующее представление о строении обонятельной луковицы у низших позвоночных. Описанные механизмы нейронного и трансмиттерного взаимодействия в хемосенсорных системах модельных беспозвоночных и низших позвоночных расширяют существующие представления о роли сенсорных нейронов в поведении. Данные о возникновении и онтогенетическом развитии хемосенсорных систем у личинок трохофорных, полухордовых и хордовых животных раскрывают неизвестную ранее функцию ранних периферических нейронов в индивидуальном развитии. Совокупность представленных данных является важной для понимания механизмов развития и функционирования сенсорных. систем, а разработанная методика культивирования срезов может найти применение при изучении патологий обоняния.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Строение обонятельной луковицы низших позвоночных (на примере головастика шпорцевой лягушки Xenopus laevis) принципиально отличается от того, что ранее считалось общепринятым для позвоночных. Так, отдельные обонятельные рецепторные нейроны проецируются не в одну обонятельную гломерулу каждый, а в несколько, причем сложным перекрестным образом. Сами гломерулы не имеют клеточной стенки, и их пространственная организация определяется исключительно взаимодействием аксонов обонятельных рецепторных нейронов и дендритов митральных клеток.

2. Возможно культивирование срезов обонятельной луковицы с сохранением как периферических входов, так и центральных проекций составляющих ее нейронов, с сохранением клеточной специализации и основных физиологических характеристик нейронов в такой культуре.

3. В нервной системе личинок важных в филогенетическом плане животных: наиболее примитивного хордового животного асцидии, иглокожих, полухордового животного Balanoglossus и вторичноротого животного Phoronopsis не обнаружены обонятельные гломерулы, что имеет большое зпачепие для понимания появления этих структур в филогенезе.

4. Аналогично позвоночным, система синтеза окиси азота (КО-синтазная. активность) присутствует в нервной системе продвинутых беспозвоночных, локализована в определенных участках нервной системы и участвует в хеморецепции.

5. В хемосенсорном органе прудовика Lymnaea stagnalis гамма-аминомасляная кислота служит возбуждающим нейротрансмиттером. Не только интенсивность, но и

полярность реакции на нейротрансмитгеры модулируется, в частности, серотонином. Таким образом, интегративная функция медиаторов проявляется не только в координации моторных программ, как считалось ранее, но также и в модуляции сенсорных входов и процессинге поступающей информации, осуществляемыми уже на уровне периферической сенсорной структуры. Кроме приема информации и передачи ее в центральные отделы, периферический хемосенсорный орган оказывает. непосредственное тоническое влияние на реализацию поведенческой программы.

6. У трохофорных животных периферические хемосенсорные нейроны являются первыми нервными элементами, которые дифференцируются - в онтогенезе. Их активность оказывает непосредственное влияние на развитие. Продуцируемый нейронами апикального органа трансмиттерный моноамин тормозит эмбриональное развитие, и такое торможение функционально значимо при развитии в среде, неблагоприятной для вылупления.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на I-V Международных Конференциях «Простые Нервные Системы» (Regional Meetings of the International Society for Invertebrate Neurobiology) (Казань, 1985, 1988; Минск, 1991; Пущино, 1994, 2000; Москва, 1997; Калининград 2003); VI и VIII Симпозиумах Международного Общества Нейробиологии Беспозвоночных (ISIN) (Symposium on Invertebrate Neurobiology, Tihany, Hungary, 1987, 1996); на Симпозиуме «Проблемы филогении и систематики иглокожих» (Таллин, 1987); на II Всесоюзном Совещании по Проблемам Эволюции (Москва, 1988); на Международном Симпозиуме «Интегративная деятельность нейронов: молекулярные основы», посвященном 90-летию со дня рождения П.К.Лнохина (Москва, 1988); на X Всесоюзном Совещании по Эволюционной Физиологии, посвященном памяти академика Л.А.Орбели" (Ленинград, 1990); на IV международном симпозиуме по нейробиологии моллюсков (IVth International Symposium on Molluscan Neurobiology, SIMON, Amsterdam, the Nederlands, 1994); на 24м и 30м съезде Нейробиологического Общества (24th and 30th Annual Meetings of the Society for Neurosciences, Miami Beach, USA, 1994, San Diego, USA, 2001); на 26й, 28й и 29й Геттингенских нейрообиологических конференциях (26th, 28th and 29th Goettingen Neurobiology Conferences, Goetingen, Germany, 1998,2001,2003); на XV Конгрессе Европейского Общества Хеморецепции (XVI Congress of European Chemoreception Organisation, ECRO, Erlangen, Germany, 2002).

Публикации

По теме диссертации опубликовано и принято в печать 53 статьи в реферируемых журналах, из них 23 в отечественных и 30 в международных журналах, а.также 36 тезисов докладов на всесоюзных, всероссийских и международных конференциях..

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объекты исследования

Основными объектами исследования служили головастики африканской шпорцевой лягушки Xenopus lexis (Amphibia: Anura), получаемые методом стимуляции нереста инъекцией гонадотропина на факультете нейрофизиологии университета г. Геттинген (Германия), и взрослые особи, и эмбрионы пресноводных улиток из лабораторной культуры Института биологии развития РАН: большой прудовик Lymnaea stagnalis и аквариумная. катушка Helisoma trivolvis (Mollusca: Pulmonata). Кроме того, в сравнительном плане изучались репрезентативные представители важнейших таксономических групп беспозвоночных животных: плоские черви (Plathelmintes), круглые черви (Nematoda), многощетинковый червь Phyllodoce metadata (Polychaeta: Phyllodocidae), примитивный многощитковый моллюск хитон Icshnochiton hakodadensis (Mollusca: Polyplacophora), примитивное вторичноротое форонида Phoronopsis harmeri (Phoronida), личинки нескольких видов иглокожих (Echinodermata), включая морских звезд, морских ежей, голотурий и офиур, а также торнария - личинка полухордового кишечнодышащего Balanoglossus proterogonius (Hemichordata) и личинка наиболее примитивного хордового - асцидии - Molgula citrina (Chordata).

2. Электрофизиологические эксперименты

1) Головастик X laevis..

Головастиков на стадиях развития 50-56 (по Neiuwkoop, 1956) анестезировали, погружая в смесь воды со льдом, и вырезали блок ткани, содержащий головной мозг и обе обонятельные камеры. Блок приклеивали на столик вибратома (Leica), помещали в физиологический раствор для ксенопуса (Geiling and Schild 1996) (в миллимолях: 101 NaCl, I KC1, 2 MgCl2, 5 Glucose, 5 Na-Piruvate, 10 HEPES, pH 7.8) и срезали верхнюю четверть мозга (при работе с нейронами обонятельной, луковицы) или верхнюю половину обонятельных камер (при работе с обонятельными рецепторными нейронами). Затем препарат помещати в физиологический раствор в чашку Петри (диаметр 40 мм) с отверстием в дне (20x10 мм), заклеенном покровным стеклом, и

фиксировали рамкой. Нейроны обонятельной луковицы или мукозы изучали методом patch-clamp в конфигурации whole cell. Для регистрации физиологической активности и инъекции красителей использовали установку, смонтированную на прямом микроскопе Axioscope 100 (Zeiss). Для регистрации динамики кальция в нейронах использовали установку, смонтированную на инвертированном лазерном конфокальном микроскопе LSM-510 (Zeiss).

Срезы (свежие или культивированные) помещали в камеру на столик прямого или инвертированного микроскопа, на котором были смонтированы микроманипуляторы и предусилитель микроэлектродного усилителя (ЕРС7, List, Germany). Микропипетки с диаметром кончика 1-2 мкм и сопротивлением 6-8 МЛ вытягивали из боросиликатного стекла при помощи двухступенчатого пулера (Narishige, Japan) и полировали нагреванием. Толчки тока и напряжения генерировались микроконтроллером, направлялись в D/A преобразователь и затем в усилитель. Ток и напряжение отцифровывались в режиме on-line и записывались в компьютер. Управление экспериментом и обработка данных осуществлялись на PC в операционной системе LINUX (SuSE).

2) ПрудовикХ. stagnalis.

Улиток анестезировали, погружая в смесь воды со льдом, и вырезали осфрадий вместе с небольшим участком стенки тела, окружающей его сенсорный канал. Затем стенку тела прикалывали микроиголками на дно чашки Петри (диаметр 40 мм), покрытое силиконом, содержащей физиологический раствор для прудовика (Benjamin, Winlow, 1981) (в миллимолях: 50 NaCl, 1.7 KCl, 4 СаСЬг, 1.5"MgCI¿ 10 Tris, pH 7.8). Отверстие канала прижимали ко дну так, чтобы можно было апплицировать химические вещества непосредственно на поверхность осфрадиального ганглия, а не на сенсорный эпителий.

Для экстраклеточной регистрации конец осфрадиального нерва засасывали в пластиковую микропипетку и подводили вплотную к нему кончик серебряного хлорированного электрода. Электрическую активность в осфрадиальном нерве записывали, используя стандартное оборудование (Micromed, Hungary). Сигнал конвертировали при помощи A/D преобразователя, записывали в IBM совместимый компьютер и подвергали рамочному дискриминационному анализу (windows discrimination analysis) при помощи специально написанной программы (NIBR). Два стандартных участка записи по 30 сек - один непосредственно перед аппликацией вещества, а другой через 30 сек после аппликации - обсчитывались по следующему алгоритму: каждая запись разбивалась на 9 равных и всегда одинаковых амплитудных

Рис 1. Запись активности в осфрадиальном нерве после аппликации 5-НТ (10 мкл, 100 мкМ) с наложенной на нее рамкой для амплитудного дискриминационного анализа.

зон по отношению к уровню шума (рис. 1). Подсчитывались спайки, оканчивающиеся в каждой амплитудной зоне. Спайки, оканчивающиеся в зонах 1,2,8,9 объединялись как «большие», 3 и 7 — «средние», а 4 и 6 - «маленькие». Зона. 5 считалась. «шумом» и не учитывалась. После. 5-НТ-апшшкации; подсчитывалось

абсолютное изменение суммарного числа спайков и спайков каждой из трех групп, а затем вычислялось изменение в процентах относительно числа спайков непосредственно перед аппликацией. Для каждого вещества подсчитывалось среднее значение. Для определения, достоверности результатов использовали критерий Стьюдента (f-test). «Отсутствием эффекта» считали изменение числа спайков менее чем на 10%, «слабым эффектом» - на 10-20% и «сильным эффектом - более чем на 20%.

Для внутриклеточной регистрации активности нейронов осфрадия его прикалывали ко дну чашки Петри, обрабатывали протеазой (Protease E, 0.3%, 10 мин.), заливали в кашпо низкотемпературной агарозы (low gelling Agarose, Sigma) и заполняли чашку физиологическим раствором. Использовали острые стеклянные микроэлектроды, заполненные 3 М КС1 или 10% раствором люцифера желтого (Lycifer yellow, Sigma), с сопротивлением 35-45 Mil. После усилителя (Micromed) сигнал конвертировался АЦП и записывался в компьютер.

Аппликацию химических веществ проводили из автоматической микропипетки локально - 10 мкл раствора за 2 секунды на поверхность ганглия. При одиночных аппликациях промывка. после каждой составляла 20 мин. При последовательной аппликации нескольких веществ их подавали через 2 мин без промежуточной промывки. Каждый препарат использовали только для одной серии аппликаций.

Для инъекции в клетку люцифера из микроэлектрода подавали гиперполяризационный ток (2-3 нА, 3-5 час). После инъекции препарат помещали в свежий физиологический раствор на 3-5 часов при 10 °С, затем фиксировали в 4% растворе параформальдегида на 0.1 М Na-Na фосфатном буфере (ФБ, рН 7.4), просветляли в ФБ с глицерином (1:1) и изучали под эпифлуоресцентным микроскопом Jenaval (Zeiss Jena).

3. Культивирование срезов мозга

Головастиков X. laevis обеззараживали в растворе КМпО4 (7.5 мкМ), анестезировали на льду, ополаскивали в 70% этаноле и стерилизованном растворе Рингера. Затем вырезали блок ткани, резали на вибратоме (Leica VT1000) и срезы (250 мкм) переносили на стерильное покровное стекло 12x24 мм в каплю (30 мкл) куриной плазмы.(0.2 мг% гепарина, Cocalico Biologicals, USA). Затем на стекло добавляли 30 мкл тромбина (Merck, Germany), активность которого была понижена до 167 Ед/мл разбавлением, и перемешивали. Стекла помещали, в культивационные пробирки (Nunc, Danmark), в 750 мкл забуференной HEPES культивационной среды (FM-65-L), содержащей: 5% лошадиной сыворотки и 5 мг% гентамицина (Sigma). Пробирки помещали на наклонный вращающийся диск (1 об/мин) и культивировали при 20-22° С, меняя культуральную среду каждые 4-6 дней.

4. Ретроградное и антероградное окрашивание

Для одиночного окрашивания использовали биоцитин (Molecular Probes, USA). Для двойного окрашивания использовали биоцитин в комбинации с пероксидазой хрена (horseradish peroxidase, Sigma) или декстраном (3 кДа, коныогирован. с Texas Red, Molecular Probes).

Для антероградного окрашивания обонятельных гломерул ксенопуса головной мозг с обонятельными нервами отпрепаровывали в физиологическом растворе. На покрытое силиконом дно чашки Петри, заполненной физиологическим раствором, помещали кашпо минерального масла. В центр капли прикалывали округлый кусочек фильтровальной бумаги, смоченной физиологическим раствором. Мозг прикалывали рядом с каплей и концы нервов прикрепляли к фильтровальной бумаге, так что они были изолированы маслом. Затем, на фильтровальную бумагу наносили 4-5 мкл 1% раствора биоцитина или декстрана в дистиллированной воде. Через 1-2 часа мозг помещали в свежий физиологический раствор на 2 часа, затем фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере.

Для ретроградного окрашивания митральных клеток головной мозг отпрепаровывали в физиологическом растворе, осушали, быстро помещали при помощи микроиголок маленький кристаллик биоцитина или декстрана в мозг на уровне передней комиссуры в область прохождения латерального обонятельного тракта, закрывали это место минеральным маслом и помещали мозг в проток

физиологического - раствора. Через 3-5 часов мозг фиксировали в 4% параформальдегиде.

После 5-10 часов фиксации мозг отмывали в фосфатном буфере и серийно резали или на замораживающем микротоме (Criocut, Leica), срезы 20 мкм, или на вибратоме (VT1000, Leica), срезы 50 мкм. Для выявления биоцитина срезы инкубировали в растворе авидина, коньюгированного с А1еха-488 (5 мкг/мл в ФБ) в течение 4-5 часов, затем просветляли в ФБ с глицерином (1:1) и заключали в ФБ-глицерин (1:2).

4. Иммунохимическое маркирование

Для иммунохимического маркирования медиатор-специфичных нервных элементов использовались антитела против следующих нейромедиаторов:

Серотонин (5-НТ): поликлональные антитела, выработанные в кролике, DiaSorin, USA;

Нейропептид РМЕНМамвд поликлональные антитела, выработанные в кролике, DiaSorin, USA;

Гамма-аминомаслянная кислота (GABA): поликлональные антитела, выработанные в мыши, Sigma, USA;

Глютамат: поликлональные антитела, выработанные в кролике, любезно предоставлены профессором Оттерсеном (Университет Осло, Норвегия);

Лейцин и метионин-энкефалин: поликлональные антитела, выработанные в кролике, lncstar, USA.

Для маркировки синаптических контактов использовали антитела против синаптофизина, поликлональные, выработаны в кролике, любезно предоставлены доктором Яном (Институт Макса Планка, Геттинген, Германия).

Для. маркировки клеточных ресничек и цитоскелета нейрональных элементов использовались антитела против ацетилированного а-тубулина: моноклональные, произведены в мыши, Sigma, USA.

Радиальную глию в обонятельной луковице головастика выявляли антителами против виментина, mouse clon Vim 3B4, DAKO, Danmark.

Для выявления инъецированной пероксидазы хрена использовали антитела против пероксидазы хрена, моноклональные, выработаны в мыши, Sigma, USA.

Первичные антитела выявляли при. помощи вторичных антител против иммуноглобулинов кролика или мыши, меченных одним из следующих флуоресцентных маркеров: флуоресцеинизотиоцианат (FITC), родамин, Texas Red,

Alexa-488, Alexa-546 (все Molecular Probes, USA). Для лазерной конфокальной микроскопии использовали только маркеры Alexa-488 и Alexa-546.

Для точного определения тел нейронов при иммунохимической реакции и окрашивании использовали флуоресцентные маркеры ДНК: йодистый пропидий и DAPI (Molecular Probes), которые добавляли в буфер для последней перед заключением промывки в концентрации соответственно 5 и 3 мкг/мл.

Препараты изучали и фотографировали при помощи микроскопа проходящего света. Jenaval, эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 1000, или лазерного конфокального микроскопа LSM510 (все Zeiss, Germany),

5. Подсчет числа клеток Число нейронов различного типа и гломерул в обонятельной луковице головастика подсчитывали на серийных срезах мозга, сделанных на замораживающем микротоме. Для каждого типа клеток было выбрано пять полных серий, в которых окрашивалось наибольшее число клеток. Подсчитывали число клеток или гломерул на каждом срезе и суммировали. Поправку на двойной подсчет вводили, деля результат на (1+d/t), где d средний диаметр клеток или гломерул, а t толщина срезов (Weibel, 1979).

6. Электронная микроскопия Использовали стандартные методы трансмиссионной (ТЭМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Для ТЭМ животных анестезировали и ткани фиксировали в 2.5% глутаральдегиде в 0.05 - 0.1 М какодилатном буфере (рН 7.4), изотоничном- внутренней среде животного 1.5-4 часа при 4°С, отмывали в какодилатном буфере, постфиксировали 1 час при комнатной температуре в 2% растворе четырехокиси осмия в какодилатном буфере, проводили через: спирты и заливали в Аралдит, Эпон, или Спурр. Полутонкие срезы' толщиной 1-2 мкм окрашивали толуидиновым синим и изучали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы 40-60 нм получали на ультратоме LKB-III (LKB, Sweden), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца вручную или в приборе для окрашивания Ultrastainer Carlsberg System (Sweden) и изучали в электронных микроскопах Jeol JEM 100В, JEM 100СХ, или JEM 1200EX. Дтя СЭМ животных фиксировали аналогично, поверхность хемосенсорного эпителия обрабатывали 6 часов в растворе гиалуронидазы (Sigma, 50-100 единиц на мл) в фосфатном буфере, обезвоживали в серии спиртов, высушивали в критической точке СО2 (Balseres Union Critical Point Dryer, Sweden),

монтировали на столик и напыляли 14 нм золота, используя Bio-Rad Polaron Coating System. Препараты изучали в сканирующих микроскопах Jeol JEM 100CX и JSM-T330.

7. Повенденческие эксперименты Для поведенческих экспериментов использовали больших прудовиков L. stagnalis. Для изучения влияния осфрадия на поведение животных их разделяли в каждой из шести экспериментальных серий на четыре группы по 20 особей: а) группа с удаленным осфрадием; б) группа с перерезанным, осфрадиальным нервом; в) интактные; г) ложно-оперированные. Для операций улиток анестезировали инъекцией раствора MgC2 (50 мМ, 1 мл) и удаляли осфрадий или перерезали осфрадиальный нерв под бинокуляром через маленький разрез стенки мантии. Улиток группы г) аналогично анестезировали и делали разрез, но осфрадий не удаляли. Всех улиток содержали в одинаковых условиях 50 дней после операции. Число отложенных яиц подсчитывали каждый день. Данные для. каждой группы объединяли и: подсчитывали среднее значение и стандартное отклонение. Достоверность результатов определяли по критерию Уилкоксона (Wilcoxon matched pairs test).

8. Идентификация системы синтеза окиси азота (NO) Для гистохимического выявления НАДФдиафоразной активности животных анестезировали погружением или инъекцией 0.2 М раствора MgC2 и фиксировали в 4% параформальдегиде на ФБ 5-6 мин при 4°С. Затем отмывали в ФБ, инкубировали в 20% растворе сахарозы в 0.1 М трис-HCl буфере (ТБ), замораживали в жидком азоте и резали на криостате (Frigocut E, Reichert-Jung) серийные срезы 30 мкм. Срезы приклеивали на покрытые хром-алюм-желатиной предметные стекла, сушили на воздухе, промывали в ТБ и инкубировали в растворе, содержащем 1 мМ натриевой соли NADPH (Sigma), 0.5 мМ Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma) и 0.2% Triton X-100 в 0.05-0.5 M ТБ в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. Затем промывали в ТБ, обезвоживали в серии спиртов, просветляли в ксилоле и заключали в Энтеллан. Контроля включали замену NADPH на NADP, NADH, или NAD, а также исключение из реакции NADPH или NBT.

Для биохимического выявления NO-синтазной активности использовали три разных источника ткани прудовика: осфрадий, буккальные ганглии и остальные ганглии ЦНС. Указанные ткани вырезали из 75 анестезированных прудовиков и собирали в гемолимфу прудовика при 0°С. Ткань гомогенизировали при 0°С в 20 мМ HEPES, 0.5

мМ EDTA, 1 мМ dithiothrcitol (DTT), pH 72. Гомогенат центрифугировали при 35000 g 10 минут, осадок растворяли в свежем буфере и проводили ферментативную реакцию при постоянном аэрировании при комнатной температуре с 2 мМ NADPH, 0.9 мМ СаСЬ, 0.4 мМ L-aiginine и 25 U/m calmodulin (Sigma). Контроль включал 0.1 мМ Nca-nitro-L-aiginine (NO2Aig, Sigma) в качестве ингибитора. По 200 мкл инкубационного раствора отбирали, центрифугировали при 10000 g 10 минут и смешивали 150 мкл супернатанта с 150 мкл o-phtaldialdehyde reagent solution (Sigma) перед тем, как провести HPLC анализ синтезированного цитруллина. (Heckeer et aL, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. ДИСТАНТНАЯ ХЕМОРЕЦЕПЦИЯ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ,

1. Строение и функционирование обонятельной луковицы

головастикаХепор^ laevis Изучение строения обонятельной луковицы (ОЛ) головастика ксенопуса па тканевом, клеточном и электронно-микроскопическом уровне показало, что оно принципиально отличается от того, что является общепринятым в мировой литературе.

Подробно описана структура ОЛ: локализация основных клеточных типов (перигломерулярные, митральные и гранулярные клетки, рис. 2), структура и расположение обонятельных гломерул и иммунореактивность клеточных элементов ОЛ к антителам против глутамата и GABA

Вентральная часть главной ОЛ имеет хорошо различимые гломерулы, в то время как дорзальная часть ее гломерулярного слоя заполнена неструктурированной сетью клеточных отростков, образующих сгущения диаметром не более 5 мкм. В то же время, весь объем гломерулярного слоя дополнительной ОЛ заполнен округлыми гломерулами. Общее число гломерул составило 234+51 (средняя и стандартная ошибка средней) в основной и 341+64 в дополнительной луковице. Перигломерулярные клетки были немногочисленны (175+20 в основной и 69+10 в дополнительной луковице) и располагались в основном по периферии слоя.

Абсолютное большинство митральных клеток было локализовано в дорзальной части ОЛ и посылало дендриты в гломерулы вентральной части. Число митральных клеток составило 1324+225 в основной и 2106+143 в дополнительной луковице. Гранулярные клетки обеих луковиц располагались одной компактной группой (3096+186).

Наибольшее внимание привлекает отсутствие дифференцированных гломерул в дорзальной части ОЛ. С одной стороны, митральные. клетки на этой стадии уже дифференцированы, и их отростки иннервируют гломерулярный слой. С другой стороны,: обонятельные рецепторные нейроны, которые проецируются в дорзальную часть ОЛ, начинают экспрессировать рецепторы 2-го типа (так называемого «воздушного носа») на значительно более ранней стадии (Freitag et al., 1995; Mezler et al, 1999) Однако головастики пока еще находятся постоянно под водой и, следовательно, не имеют контакта с воздушными запахами. Поэтому мы предполагаем, что отсутствие специфической хемосенсорной информации в аксонах, иннервирующих дорзальную часть ОЛ, препятствует гломерулогенезу.

Другим интересным моментом является высокая изменчивость в числе и расположении гломерул, поскольку общепринято, что их число постоянно и связано с количеством экспрессирующихся обонятельных рецепторов, и это постоянство важно для формирования первичной карты запаха (Buck, 1996; Bailer and Korsching, 1994; и другие). Возможно, такое постоянство не обязательно для ксенопуса, или это онтогенетическая особенность личиночной стадии. Для ответа на этот вопрос необходимо подробно изучить строение ОЛ у взрослого животного.

Максимальное число митральных клеток, подсчитанное нами как после инъекций красителя , так и после иммуноокрашивания, в 5-10 раз меньше, чем общее число

Рис. 2. Схема строения обонятельной луковицы головастика Xenopus. A. Горизонтальный срез вентральной части, показывающий организацию клеточных слоев в главной и дополнительной луковицах. Б. Парасаггита-льный срез через главную луковицу; gc - гранулярные клетки; gl - гломеру-лярный слой; тс - митральные клетки; nl - нервный слой; v - вентрикулюм. A- anterior, D- dorsal, L- left, P-posterior, R- right, V- ventral.

клеток в митральном слое (Byrd and Burd, 1991). Вероятно, остальные клетки принадлежат к другим типам, или это незрелые митральные клетки.

Обонятельные гломерулы - главные функциональные образования ОЛ, не имеют ни глиальной оболочки, ни стенки из тел перигломерулярных нейронов, что ранее считалось неотъемлемой частью обонятельных гломерул. Напротив, полностью развитые и функционирующие (что было подтверждено регистрацией изменения уровня кальция, а значит, активности нейронов в ОЛ в ответ на аппликацию запахов, а также их ультраструктурой и плотностью синапсов) гломерулы сформированы исключительно аксонами обонятельных сенсорных нейронов и митральных (mitral/tufted) клеток. Перигломерулярные клетки, хотя и присутствуют в гломерулярном слое ОЛ, но их дендриты обильно ветвятся, охватывая большие участки ОЛ, и не участвуют в образовании стенок гломерул. Из всех маркеров на глиальные элементы (тестировались также антитела против DFAP (anti-glial acidic protein), MAG (myelin associated glycoprotein)), только антитела против виментина выявили в ОЛ отростки клеток радиальной глии (хотя клетки, иммунопозитивные к остальным маркерам, встречались в других зонах мозга). Тела клеток радиальной глии были локализованы в эпендиме позади ОЛ. Однако их отростки проходили ОЛ насквозь и заканчивались в районе входа в мозг обонятельного нерва, не участвуя в образовании гломерул.

Обонятельные сенсорные нейроны проецируются не в одну гломерулу каждый, как считалось ранее, а иннервируют как минимум 2 гломерулы (а иногда и до 4-х), причем определенным «перекрестным» образом. На входе в ОЛ аксон, чаще всего, раздваивается, две ветви идут параллельно, входят в гломерулярный слой, каждая снова делится на две, и каждая из получившихся пар ветвей перекрестно иннервирует две гломерулы (рис. 3). Физиологический смысл такой иннервации неизвестен.

Таким образом, господствующее в современной науке представление о консервативном строении обонятельной системы животных (Hildebrand and Shepherd,

Рис 3. Типичная схема иннервации двух гломерул обонятельной луковицы головастика одиночным рецепторным нейроном.

1997), по-видимому, не совсем верно. Под термином «обонятельная гломерула» понималась сферическая структура, образованная телами перигломерулярных и глиальных клеток, куда постепенно врастают аксоны обонятельных рецепторных клеток и дендриты митральных (Valverde et al., 1992; Bailey et al., 1999). Наши данные показывают, что единственной обязательной. морфологической характеристикой обонятельной гломерулы является множественный синаптический контакт между аксонами и дендритами. Остальные детали могут варьировать.

Данные, полученные на других представителях низших позвоночных, подтверждают нашу точку зрения. У рыб также не было обнаружено клеточной стенки обонятельных гломерул (Ichikawa, 1976). Плотность синапсов, подсчитанная нами в гломерулах головастика (0.5 на кв. мкм) даже выше, чем у взрослой крысы (0.1 на кв. мкм) (Moriizumi et al., 1995; Toida et al., 2000). В отличие от млекопитающих, архитектура обонятельных гломерул у ксенопуса определяется исключительно взаимодействием аксонов рецепторных нейронов и дендритов митральных клеток. Эти два компонента. являются необходимыми и достаточными для образования той структурной и функциональной единицы, которая выделяется как «обонятельная гломерула». Следующей важной задачей является изучение физиологического взаимодействия основных нейронов обонятельной системы, формирующих гломерулы.

Для изучения физиологических характеристик нейронов ОЛ была впервые разработана методика культивирования толстых срезов мозга амфибии, включающих в себя обонятельный эпителий мукозы, обонятельные нервы, ольфакторную луковицу и теленцефалон. При культивировании в течение 6 дней срезы утоньшаются с первоначальных 250 мкм до приблизительно 40 мкм, что соответствует трем клеточным слоям. При этом тканевая структура среза, а также периферические и центральные связи нейронов ОЛ остаются ненарушенными.

Нейроны ОЛ можно легко изучать методами patch-clamp и одновременно оптически регистрировать уровень кальция в телах и отдельных дендритах. Электрофизиологические характеристики основных типов нейронов в культивированных срезах соответствуют таковым нейронов интактной ОЛ -митральным и гранульным клеткам (рис. 4).

Нейроны в таком культивированном срезе не подвергаются деградации, что неизбежно при культивировании срезов мозга, в которых отсутствуют периферические и центральные связи. Преимущества подобного метода очевидны: свежий срез нельзя использовать для электрофизиологических опытов, включающих оптическое изучение динамики кальция с высоким раз "г-------'у пт(Ч"'"г ^^ш-п.лв с

СОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 1

__ I Бикляотсл I 33 I епткутг I оэ reo «»г J

большим увеличением (не менее 40х) и большой цифровой апертурой (не менее 1.2), а значит неизбежно использование инвертированной оптики. В инвертированном микроскопе, однако, невозможно при таком увеличении и такой, апертуре использование для электрофизиологических опытов срезов толщиной более 30-40 мкм, чего невозможно достичь, не повредив большинство нейронов среза и не лишив их внешних связей. С другой стороны, первичная клеточная культура из диссоциированных клеток идеальна для инвертированной оптики, но нейроны, ее составляющие, заведомо дегенерировали и имеют мало общего с интактными, поэтому полученные на культуре данные трудно интерпретировать.

Рис 4. Сравнение физиологических характеристик нейронов в шестидневной культутре (А-С) и свежем срезе (Б-Р). А. Нейрон первого типа. Подпороговые и надпороговые ответы на инъекцию тока показывают деполяризацию и следы спайков. В,С. Нейрон второго типа. А. Ответ на инъекцию потенциала показывает задержанный быстрый входящий ток. С. Характерные ответы на инъекции тока. Быстрая вначале деполяризация замедляется, и генерируются спайки. Аналогичные реакции наблюдаются в гранулярных СБ) и митральных

Рис. 5. А. Вызванное норадреналином (МБ, 500 нМ) уменьшение Са тока в митральной клетке. Регистрация тока при пульсах от -80 до 0 мВ. В. Уменьшение максимального Са2+тока в митральной клетке при аппликации клонидина (20 нМ). Регистрация тока при пульсах от -80 до 0 мВ через каждые 5 сек. СБ). Уменьшение интегрированного синаптического тока в гранулярной (С) и митральной (Б) клетках после аппликации 500 нМ норадреналина. Е. Вызванные глутаматом потенциалзависимые входящие токи в гранулярной клетке нечувствительны к а-метил-норадреналину. Б. Амплитуды ызванных глутаматом токов в гранулярной клетке до (1а) и во время (1с) аппликации клонидина (белые значки) и а-метил-норадреналина (черные значки) при (квадраты) или без (круги) блокирования кальциевых каналов 2 мМ Со2+.

В культивированном же срезе, с одной стороны, за 5-7 дней достигается удовлетворительная тонкость среза, а с другой, нейроны явно не подвергаются деградации.

Для изучения влияния центральных отделов нервной системы на процессинг обонятельной информации было исследовано. влияние эфферентных путей, приходящих в ОЛ из locus coeruleus. Повышение уровня норадреналина в ОЛ или аппликация агонистов а2-рецепторов, клонидина и а-метил-норадреналина приводили к блокаде потенциалзависимого кальциевого тока в митральных клетках и блокаде спонтанной синаптической активности митральных и гранулярных клеток (рис. 5). Амплитуда индуцированных глутаматом кальциевых токов в гранулярных клетках не модулировалась агонистами а2-рецепторов. Основным эффектом норадренергического, пресинаптического, опосредованного а2-рецепторами блокирования кальциевых токов в митральных клетках является, по-видимому, широкое дезингибирование митральных клеток в главной и дополнительной ОЛ.

2. Строение нервной системы личинки асцидии Molgula citrina

Асцидии расположены ближе всех других животных к предковой линии хордовых, включая позвоночных, а их личинка - обладает чертами наиболее примитивных хордовых. Нервная система личинки имеет структуры, точно соответствующие структурам мозга позвоночных. Однако, тонкости ее строения остаются малоизученными.

Нами подробно описано строение нервной системы личинки асцидии Molgula citrina (рис. 6). Особенно подробно изучено строение периферических отделов нервной системы и сенсорных, входов. Антитела против ацетилированного тубулина маркировали пару ростральных нервов, отходящих от 8-10 сенсорных клеток, разбросанных в эпителии стенки тела (но не образующих ростральные папиллы, как у многих других видов асцидии), и пару хвостовых нервов. В сенсорном пузырьке обнаружена пара антеннальных клеток, ассоциированых со статоцистом. Пучок из примерно 150 ресничек находится в гипофизарпом канале. Дорзальный пучок нервных волокон образует на поверхности сенсорного пузырька плексус, который простирается к хвосту за висцеральный ганглий.

Антитела против нейротрансмиттеров и близких к ним веществ (нейропептидов: субстанция Р, FMRFaMim, соматостотин, нейропептид Y, CGRP, VIP, биогенных аминов: серотонип, дофамин, норадреналин, а также GABA) не дали специфической иммунореакции где бы то ни было в нервной системе. Любопытно, что эпителий

стенки тела равномерно покрыт ресничками, но не имеет папилл, хотя ростральные сенсорные нервы присутствуют. Сенсорные клетки в хвостовом нерве не имеют респичек.

Рис 6. Основные компоненты нервной системы личинки асцидии (вид сбоку на туловище и основание хвоста). На врезке - строение сенсорного пузырька. Показаны следующие компоненты периферической нервной системы: ростральные нервы (стрелки), хвостовой нерв (треугольник). Условные обозначения: ас - антеннальная клетка; ag - зачаток дефинитивного ганглия; Ы - базальная мембрана; ch - хорда; en -эндодерма; hy - пшофизарный канал; пс - нервный ствол; sv - сенсорный пузырек; st - статоцист; vg - висцеральный ганглий. Линейка 100 мкм.

До последнего времени, периферическая иннервация личинок асцидий была слабо изучена, особенно в части иннервации сенсорных структур на поверхности тела. Большинство асцидий прикрепляется к субстрату при метаморфозе при помощи трех прикрепительных папилл, имеющих сенсорную и адгезивную функции. Эти папиллы имеют различную степень сложности у разных видов и иногда состоят из 900 клеток различного типа (Torrence and Cloney, 1983). М. citrina является противоположным крайним случаем - у нее эти папиллы отсутствуют. Данные о наличии или отсутствии ростральных нервов противоречивы, но общепринято то, что у видов, у которых папиллы отсутствуют, ростральные нервы также не найдены. Таким образом, остается открытым вопрос о том, являются ли ростральные нервы сенсорными, передающими информацию от передних хемосенсорных нейронов, моторными, управляющими адгезивными клетками папилл, или смешанными.

Наши дайнье доказали, что ростральные нервы не обязательно связаны с папиллами, а могут иннервировать сенсорные клетки, разбросанные в эпителии передней поверхности тела. Таким образом, мы предполагаем, что эти нервы -сенсорные по своей природе. Аналогичные ростральные нервы у личинки ашхендикулярии Oikopleura dionica отходят от рецепторов вентрального сенсорного органа и считаются кёуосенсорпыми (Bollner et al., 1986). Также два ростральных нерва с предположительно хемосенсорной функцией имеются и у личинки ланцетника (Lacalli et al, I994). Логично предположить,. что эти нервы. гомологичны. Следовательно сравнение наших данных с вышеперечисленными свидетельствует о гомологичности первичных хемосенсорных путей у хордовых животных.

Обращает на себя внимание то, что нам не удалось получить положительную иммунореакцию ни с одним из антител против нейромедиаторов и физиологически активных вещёств Тестировались антитела к 5-НТ, CGRP, dopamine, GABA, noradrenalme, netitepeptide Y, somatostatin, substance P, VIP, FMRFamide. Все они дали отрицательную реакцию, и только антитела против а-тубулина продемонстрировали положительнутю реакцию, показав, что дело не в проницаемости кутикулы. Многочисленные сделанные нами контроли говорят о том, что отсутствие перечисленных веществ в количестве, которое детектируется антителами - это факт. Между тем, некоторые из перечисленных веществ были успешно выявлены у взрослых асцидий (Ge6rges and Dubois, 1985; Bollner et al., 1993a,b). Подобное отсутствие реакции на наиболее распространенные нейротрансмиттеры. является совершенно непонятным и чрезвычайно интригующим.

Сенсорные клентки, связанные со статоцистом, были описаны ранее у нескольких видов асцидий как антеннальные клетки (Воронцова, 1985). Функции этих клеток остаются малопонятными. Большинство авторов предполагает для них механосенсорную функцию, но, поскольку у ряда видов они не имеют ресничек, то и хемосенсорна функция этих клеток не исключена.

П. ДИСТАНТНАЯ ХЕМОРЕЦЕПЦИЯ У БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

1. Строение апикального органа торнарии полухордовых

Торпария полухордовых занимает центральное положение в филогенетических построениях о происхождении позвоночных. Личинки типа диплеврулы (торнария и личинки иглокожих) считаются первичными в их жизненных циклах, а значит, повторяют предковую форму, общую для всех трех типов - иглокожих, полухордовых и

хордовых (Garstang, 1894, 1928; Иванова-Казас, Иванов, 1987; Иванова-Казас, 1995; Crowther and Whittakcr 1992; Lacalli 1994; 1996; Lacalli and Holland 1998; Nielsen 1999; 2001). Между тем, личинки и примитивных, и продвинутых хордовых не имеют ничего общего с личинками типа диплеврулы. Нервная система личинок иглокожих подробно изучена, а аналогичные данные для полухордовых отсутствуют. Для ответа на вопрос, базируется. ли сходство между личинками иглокожих и полухордовых на их гомологичности или конвергенции, подробно изучено строение нервной системы торнарии кишечнодышащего полухордового Balanoglossus proterogonius с особым вниманием к апикальным сенсорным структурам.

Описано распределение ацетилхолинэстеразы, биогенных моноаминов (катехоламины и серотонин) и FMRFaмидa, а также ультраструктура апикального органа. Катехоламинсодержащие и серотонин-иммунореактивные нейроны обнаружены в апикальном и подглоточном ганглиях, FMRFaмид-иммунореактивные -в апикальном ганглии и в эпителии желудка. На ультраструктурном уровне апикальный орган состоит из столбчатого эпителия, включающего в себя сенсорные и опорные клетки, а также пару пигментированных глазков. В основании органа лежит апикальный ганглий, состоящий из периферически расположенных тел нейронов различной ультраструктуры и центрального нейроггаля. Сравнение с личинками иглокожих показывает принципиальное различие в строении апикального сенсорного органа и нервной системы в целом. Это ставит под сомнение гомологию личинок иглокожих и полухордовых, а значит и господствующую теорию происхождения хордовых животных. Последние данные по экспрессии консервативных генов у личинок полухордовых и иглокожих подтверждают нашу точку зрения (Lowe at al., 2003).

2. Строение и функционирование периферического хемосенсорного органа у прудовика L stagnate

Подробно изучено строение осфрадия прудовика L stagnate и нескольких других видов моллюсков, различающихся по строению, экологии и систематическому положению, на световом, иммунохимическом и электронно-микроскопическом уровне. В осфрадии L stagnalis были картированы нейроны иммунореактивные к GABA, 5-НТ и нейропептидам: FMRFamide, Leu-enkephalin and Met-enkephalin (рис. 7,8).

GABA и FMRFa были обнаружены в периферических хемосенсорных нейронах, причем иногда они были колокализованы. Густая 5-НТ-иммунореактивная сеть отростков оплетала основание сенсорного канала. Подобная локализация

иммунореактивностей заставила предположить, что на уровне периферического сенсорного органа - осфрадия осуществляется взаимодействие нейромедиаторов, характерное для первичного процессинга сенсорной информации.

Рис 7. Схема локализации нейронов, иммунореактивных к GABA в осфрадии L stagnate..Can - отверстие сенсорного канала; СП - ресничный отдел эпителия канала; OG - осфрадиальный ганглий; ON - осфрадиальный нерв; Sec -секреторный отдел эпителия канала; Sen - сенсорный отдел эпителия канала.

Рис 8. Схема локализации нейронов, иммунореактивных к лейцин-энкефали-ну (LEnk), метионин-энкефалину (MEnk), FMRF-амиду (FMRFa) и серото-нину (5НТ) в осфрадии L stagnalis.

Суммарная активность нейронов осфрадия. Аппликация на осфрадиальный ганглий 5-НТ или вызывала слабое увеличение активности в осфрадиальном нерве (п = 33), или была неэффективной (п = 11), или слабо уменьшала эту активность (п = 10). GABA обычно не изменяла активности в нерве (п = 27), но иногда слабо увеличивала (п = 6) или слабо уменьшала (п = 2). Однако действие GABA становилось более выраженным после предварительного воздействия 5-НТ. Она, в основном, увеличивала активность (п = 28), хотя иногда не давала эффекта (п = 9) ив одном случае незначительно ее уменьшила.

Мусцимол (muscimol, специфичный агонист GABAA рецепторов) полностью повторял эффекты GABA как при одиночной аппликации (неэффективен: п = 8, слабо

увеличивал: п = 3, слабо уменьшал: п = 1) так и после 5-НТ (слабо увеличивал: п = 29, неэффективен: п = 4). Баклофен (Ьае1о1еп, специфичный агонист оавав рецепторов) не оказывал эффекта ни один (п = 5), ни после 5-НТ (п = 4). Аппликация пикротоксина полностью блокировала все эффекты ОАВА (п = 6) и мусцимола (п = 5). РМИБа всегда уменьшал активность (п = 11), причем предварительная аппликация ОАВА (п = 16) достоверно усиливала его эффект (р = 0.03). Предварительная аппликация ОАВА не изменяла эффекты 5-НТ (п = 12). ОАВА не оказывала эффекта после аппликации РМИБа (п = 8). Результаты суммированы на рис. 9А

А Б

Рис. 9. Изменения в числе спайков (в процентах от контроля) после аппликации 5-НТ (S), GABA (G), GABA после 5-НТ (S-G), мусцимола после 5-НТ (S-M), баклофена пос-ле 5-НТ (S-B), FMRFa (F), FMRFa после GABA (G-F), FMRFa после мусцимола (M-F). Вертикальные линии показывают стандартную ошибку средней; * Р < 0.05. А. Суммарное число спайков в нерве. Б. Суммарное число спайков в трех амплитудных группах (small, medium, large)

Амплитудный дискриминационный анализ показал, что аппликация 5-НТ достоверно увеличивает частоту средних спайков, а аппликация ОАВА или мусцимола после 5-НТ достоверно увеличивает частоту средних и больших спайков (рис.9,Б). FMRFa уменьшал частоту во всех группах, но наиболее сильно в группе средних спайков.

Клеточные корреляты (внутриклеточное отведение). Семь из 75 нейронов осфрадия показали характерный ответ на аппликацию ОАВА после предобработки 5-НТ (рис. 10). ОАВА сама по себе не оказывала на них влияния, а 5-НТ давал слабый возбуждающий эффект. Аппликация же ОАВА после 5-НТ приводила к значительному возбуждению, которое полностью тормозилось FMRFa. Все эти клетки были

идентифицированы после инъекций люцифера желтого как первичные сенсорные нейроны (рис. 10, Е).

Известно, что у моллюсков GABA вызывает и возбуждающий, и тормозный, и модулирующий эффект на центральные нейроны (Vehovszky et al., 1989: Walker, 1986; Bravarenko et al., 2001). Любопытно, что в осфрадии GABA обычно не оказывала эффекта сама по себе. Однако предобработка серотонином трансформировала в определенной субпопуляции нейронов осфрадия эффекты GABA в возбуждающие (что следует из амплитудного дискриминационного анализа экстраклеточных отведений). Внутриклеточное отведение показало, что в эту субпопуляцию входят первичные рецепторные нейроны.

Рис 10. Ответы идентифицированного хемосенсорного нейрона на аппликацию 5-НТ, GABA и FMRFa (10 мкл, 100 мкМ). А GABA не вызывала эффекта. В. 5-НТ вызывал несколько потенциалов действия. С. GABA, аппашцированная после 5-НТ вызывала долговременную активность. D. FMRFamide тормозил активность, вызванную GABA. E. Внешний вид этого нейрона после инъекции люцифера желтого (рисунок выполнен с помощью рисовального аппарата). От тела отходит дендрит в сенсорный эпителий канала и аксон в осфрадиальный нерв и далее в ЦНС. Линейка 100 мкм.

Известно, что комбинированное воздействие нейромедиаторов отличается от их одиночного действия. Некоторые авторы предполагают, что такое воздействие более точно отражает ситуацию в реальной нейронной сети (Сахаров, 1974, 1990; Dyakonova 1991; Greenbeig and Price, 1992; Weiss et al., 1992). Согласно нашим данным, то что эффекты GABA становятся возбуждающими после предобработки 5-НТ, a GABA, в свою очередь, значительно усиливает тормозное действие FMRFaмидa, говорит о том, что взаимодействие между нейромедиаторами функционально значимо для суммарной активности периферической сенсорной сети.

Неожиданным было обнаружение колоколизации GABA и FMRFaмидa в одних и тех же клетках, поскольку и в наших электрофизиологических экспериментах, и ранее было показано противоположное действие этих веществ в моторной системе моллюсков (Arshavsky et al., 1993; Norekian and Satterlie, 1993). Физиологическая роль этой колоколизации неясна. Возможно, тормозное действие FMRFa, выделяемого вместе с GABA, предохраняет систему от перевозбуждения.

Густая сеть серотошшергических волокон, оплетающих сенсорный канал, показывает важную роль этого вещества в функционировании осфрадия. Известна интегративная роль серотонина в координации комплексных форм поведения (Sakharov, 1990). Наши данные показывают, что серотонин в осфрадии меняет функциональное состояние его нейронной сети, модулируя эффекты других медиаторов. Таким образом, интегративная функция серотонина проявляется не только в координации моторных программ, но и в модуляции сенсорных входов и процессинга.

Большинство нейронов осфрадия, включая первичные рецепторные клетки, прямо проецируется в ЦНС, заставляя предположить, что они передают сенсорную информацию непосредственно в центральные ганглии. Взаимодействие нейромедиаторов, однако, показывает, что процессинг осуществляется уже на периферии. По-видимому, хемосенсорная информация, получаемая осфрадием, передается в ЦНС двумя разными путями - и непосредственно, и после предварительной обработки.

Имеются данные, что сенсорные входы важны для нормальной работы центральных генераторов (Rosen et al., 1982; Kemenes et al., 1986; Syed et al., 1991). Очевидно, осфрадии является одним из таких входов, участвующим в регуляции различных видов поведения, в частности, откладки яиц.

День после операции

Рис 11. Активность откладки яиц у улиток с удаленным, осфрадием (г), перерезанным осфрадиальным

нервом (И), интактных (т) и ложно оперированных, (1у). Вертикальные линии показывают минимумы и максимумы.

Удаление осфрадия приводило к тому, что улитки (наблюдались в течение 50 дней) начинали откладывать достоверно больше яиц (рис. 11). Перерезка осфрадиального нерва в меньшей степени увеличивала откладку яиц, и только в течение первых 15-20 дней. При этом улитки с удаленным осфрадием и перерезанным нервом оставались чувствительными к чистоте воды и содержанию в ней кислорода. Каких-либо других изменений в поведении у них не наблюдалось.

Рис 12. Изменение длительности потенциалов действия (А) и интервалов между ними (Б) в спонтанных (спонт.), вызванных пороговой деполяризацией (депол.) и аппликацией серотонина (5-НТ) пачках. Потенциалы и интервалы объединялись по 20 и на графике откладывалось

среднее значение. Вертикальные линии показывают границы минимального и максимального отклонения.

Мы предположили, что нейроны осфрадия тонически, нейрогуморально подавляют поведение откладки яиц, и этот блок снимается при поступлении сигнала от сенсорных нейронов. Таким образом, предполагается,- что регуляция поведенческой программы осуществляется на уровне периферического хемосенсорного органа.

Поиск клеточных кандидатов на эту роль привел к неожиданным результатам. В осфрадиальном ганглии были обнаружены нейросекреторные клетки с осцилляторной активностью типа «параболический пачечный нейрон» ("parabolic burster", Strumwasser, 1965), обнаруженные ранее только в ЦНС. Аппликация на эти клетки 5-НТ вызывала длительную пачку потенциалов действия, в которой длительность спайков увеличивалась в 4-5 раз по сравнению с нормой (рис. 12). Единственный отросток этих клеток уходил в осфрадиальный нерв,. многократно ветвился и заканчивался в париетальном нерве пучком отростков с многочисленными варикозами (рис. 13). Возможно, именно эти клетки осуществляют тоническое тормозное влияние на откладку яиц.

Нами впервые была обнаружена МЮ-синтазная активность в нервной системе беспозвоночных животных. Были протестированы представители разных типов - от низших до высших (таблица 2). Селективная реакция на МАОРН-диафоразу, позволяющая предположить наличие МЮ-синтазы, была, в частности, обнаружена в отдельных нейронах в нервной системе аннелид, артропод и моллюсков. В осфрапии Ь stagnalis интенсивная реакция была в эпителии сенсорного канала, и некоторых нейронах осфрадиального ганглия. Тестирование активности МЮ-синтазы показало образование цитрущшна в гомогенате тканей ЦНС (5.8 пмсяь мин"1 * мг белка), буккальных ганглиев (14 пмоль мин"1 * мг белка) и осфрадия (2.0 п м (мш'к >м г белка). В присутствии 0.1 мМ МО2Ащ образование цитруллина уменьшалось до 4% от первоначального.

Рис. 13. Локализация и проекции нейро-секреторной клетки в осфради-альном ганглии большого прудовика, Ь. stagnalis, после инъекции люцифера желтого (рисунок выполнен с помощью рисовального аппарата); ВПН -внутренний париетальный нерв, ОН -осфрадиальный нерв, СК - сенсорный канал осфрадия.

3. NO-сингазная активность в нервной системе беспозвоночных

Согласно нашим данным, высокая активность NADPH-диафоразы характерна для определенной небольшой части нейронов у определенных беспозвоночных животных, так же, как это известно для млекопитающих, и, аналогично млекопитающим, эта популяция нейронов не ассоциируется ни с одним нейромедиатором (Vincent and Hope, 1992; Bredt and Snyder, 1992). Идентичность нейронов позитивных на NADPH-диафоразу с клетками иммунопозитивными к NO-синтазе была доказана у млекопитающих. По-видимому, аналогично обстоит.дело и у беспозвоночных, и некоторые их нейроны также используют N0 как межклеточный передатчик.

Таксоны Виды Результат

Coelenterata Hydra oligactis (15) Aiptasiasp. (4) Неспецифическое окрашивание всего животного

Platyhelminthes Dugesiagonocephala (9) Нет окрашивания

Nemathelminthes Caenorhabditis elegans (11) Нет окрашивания

Annelida. Lumbricusterrestris (8) Haemopis sanguisuga (4) Отдельные нейроны в ЦНС, отдельные мышцы и клетки в висцеральных органах

Arthropoda Pacifastacusleniusculus (5) Отдельные нейроны в ЦНС

Mollusca Polyplacophora Lepidopleurus acellus(6*) Буккальные мышцы

Mollusca Prosobranchia Littorina littorea (4*) Отдельные нейроны в ЦНС

Mollusca Stylommatophora Helix aspersa (5) Отдельные нейроны в ЦНС,

Cepaea nemoralis (6) неидентифицированные клетки

Umax maximus (5) в периферических органах

Lymnaeastagnalis (18) Отдельные нейроны в ЦНС,

Mollusca L. ovata (4) осфрадий (эпителий

Basommatophora Physafonlinalis (3) сенсорного канала и нейроны

Planorbarius corneus (6) ганглия),

Planorbissp. (4) неидентифицированные клетки в периферических органах

Urochordata Ascidiella aspersa (17*) Реакция в эндостиле

Таблица 2. Результаты гистохимической реакции на МАОРН-диафоразу у представителей различных групп беспозвоночных животных. Большинство видов содержалось в лабораторной культуре, кроме отмеченных *, которых собирали в природе. Число изученных животных каждого вида указано в скобках.

Дополнительным подтверждением этому являются биохимические данные, прямо показавшие наличие N0 синтазы в осфрадии и ЦНС прудовика. Неожиданно высоким оказалась содержание этого фермента в осфрадии, где его специфическая активность в десять раз превышает таковую в мозжечке (Bredt and Snyder, 1989). Столь высокая активность позволяет предположить, что N0 непосредственно участвует в хеморецепции.

В сравнительном плане распределение клеток позитивных на NADPH-диафоразу в разных группах беспозвоночных ограничено таксонами с более сложной и хорошо развитой нервной системой (аннелиды, членистоногие и моллюски). По-видимому, с эволюционной точки зрения окись азота как межклеточный передатчик характерна для продвинутых беспозвоночных.

4. Роль хемосенсорных нейронов в индивидуальном развитии трохофорных животных

Изучение появления первых нервных элементов в процессе онтогенеза ряда модельных беспозвоночных исследовалось иммуногистохимически по одной и той же схеме. У развивающихся личинок нервные клетки и их отростки выявляли при помощи антител к ацетилированному тубулину, которые, как было показано ранее многими исследователями, маркируют нейротрубочки всех нейронов трохофорных животных, и, таким образом, являются нейронным маркером (Jackson, et al., 1995; Croll, Voronezhskaya, 1998; Muller, Westheide, 2000; и другие). Мечение антителами против тубулина проводили в комбинации с иммуноокрашиванием антителами против серотонина или FMRFaмидa. Личинок фиксировали не реже чем через каждые 4-6 часов, на каждой стадии окрашивали не менее 100 штук и каждую полностью сканировали в конфокальном лазерном микроскопе, что позволяло составлять подробные нейронные карты и прослеживать изменения в нервной системе с точностью до нейрона.

Показано, что периферические хемосенсорные нейроны являются первыми нервными элементами, дифференцирующимися в процессе нейрогенеза у таких модельных трохофорных животных как полихета Phyllodoce maculata, хитон Jchnochiton hakodadensis, голожаберный моллюск Tritonia diomedea, прудовик L stagnalis и катушка Helisoma trivolvis.

Пейрогенез полихеты Phyllodoce ЫасыШа

Развитие филлодоце типично для полихет. Через 36-40 часов после оплодотворения (при 15°С) образуется. сферическая трохофора с экваториально расположенным прототрохом и апикальным султанчиком длинных ресничек. Вылупление из яйца происходит через 60-70 часов. После вылупления появляются дополнительные ресничные структуры: акротрох (ресничный воротничок вокруг апикального султанчика), пять ресничных полей на вентральной стороне эписферы, нейротрох и реснички в пищеводе. Начиная со стадии поздней трохофоры, исчезает апикальный султанчик, и развивается ресничное кольцо вокруг ротового отверстия.

Первый нейрон появляется через 36 часов после оплодотворения, задолго до вылупления. Это одиночный серотонин-иммунореактивный сенсорный (предположительно хемосенсорный) нейрон, расположенный на дорзальной стороне задней оконечности тела (ер 1; рис. 14). Он овальной формы, размером примерно 9Х12 мкм с одним коротким апикальным отростком, выходящим на поверхность и несущим три короткие реснички, и с двумя тонкими базальными отростками.

Оба базальных отростка отходят вентролатерально, а на их концах видны конусы роста. Когда конусы роста достигают вентральной области, они поворачивают вперед и начинают расти в направлении переднего конца тела. Когда они достигают уровня прототроха (44 часа), каждый раздваивается и оба отростка идут вдоль прототроха в его основании навстречу друг другу. Антитела против тубулина также маркировали тело и отростки этого нейрона. При этом никаких других нервных элементов обнаружено не было. Поэтому, можно полагать, что эта клетка. является первым нейроном, дифференцирующимся в процессе онтогенеза.

Через 46-48 часов после начала развития на дорзальной стороне появляются еще две сенсорные (предположительно хемосенсорные) клетки - одна позади и одна впереди прототроха и sd2; рис. 14). Базальные отростки этих клеток замыкают нерв прототроха. Еще через 2-4 часа (около 50 часов после оплодотворения) появляется первая серотонин-иммунореактивная клетка в апикальном сенсорном органе.

Первый иммунореактивный к FMRFaMitny нейрон появлялся в апикальном сенсорном органе через 48 часов после оплодотворения (й1; рис. 14). Вскоре таких нейронов там появлялось еще три (1а2-1а4; рис. 14), и их базальные отростки образовывали компактный сферический нейропиль в основании органа. Затем на вентральной стороне эписферы появлялась крупная одиночная клетка с двумя апикальными сенсорными отростками (М; рис. 14). Ее базальные отростки идут вдоль формирующегося нерва прототроха

Рис 14. Схема развития серотонин- (А) и РМЕРамида- (В) иммунореактивных нервных элементов в личиночном онтогенезе Рку1Ыоее шаеиШа до момента вылупления. Указано время в часах (И) после оплодотворения. А. Первый нейрон - это одиночная хемосенсорная каудодорзальная серотонин-иммунореактивная клетка 8р1. Затем появляются сенсорные клетки всС1 и вс12. Их базальные отростки вместе с отростками клетки вр1 образуют кольцевой нерв прототроха. Одновременно появляется первый серотонинергический нейрон в апикальном сенсорном органе. Ко времени вылупления (60 часов) появляются еще нейроны в апикальном органе, сенсорные клетки вокруг рта и на заднем конце тела (клетка вр2); в11 - непарный серотонинергический латеральный: нейрон; - серотонинергическая претрохальная: клетка. В. Первая РМКРаМт-иммунореактивная сенсорная клетка (Ы). Через 52 часа там же появляются клетки 1а2-М и хемосенсорная клетка М. Вскоре (56 часов) появляются две сенсорные клетки на заднем конце тела. Одна из них (1р1) посылает базальный отросток, маркирующий положение будущего вентрального ствола и церебрального ганглия, а другая (ф2) очерчивает будущее окологлоточное нервное кольцо, окружающее ротовое отверстие (то). Таким образом, ко времени вылупления (60 часов) основные части будущей дефинитивной нервной системы: церебральный ганглий парный вентральный ствол (ус), нерв прототроха и окологлоточное нервное кольцо (епг) уже очерчены базальными отростками первых периферических хемосенсорных клеток.

Через 56 часов две FMRFaмид-иммунореактивные клетки появляются на заднем конце тела. Обе они являются сенсорными. Базальный отросток одной из них (ф1) идет вперед вдоль вентральной части правой стороны тела, доходит до района, где будет формироваться будущий церебральный ганглий, переходит на левую сторону и идет назад, маркируя, таким образом, будущие вентральный ствол и церебральный ганглий. Отростки другой клетки (1р2) образуют окологлоточное кольцо. Следовательно, еще до вылупления трохофоры базальные отростки периферических сенсорных (предположительно хемосенсорных) клеток М, ф1 и гр2 обозначают основные контуры будущей дефинитивной нервной системы, в то время как отростки клеток апикального сенсорного органа на ранних стадиях не проходят дальше апикального нейропиля.

Непосредственно перед вылуплением число серотонин-иммунореактивных нейронов начинает быстро увеличиваться, причем большинство из них являются хемосенсорными: 4-6 клеток появляются в апикальном сенсорном органе, еще одна на заднем конце тела (вр2) и 2-4 клетки вокруг ротового отверстия. К моменту вылупления отростки серотонинергических нейронов прорастают в шесть меридиональных протрохальных нервов, соединяющих апикальный орган и нерв прототроха, в окологлоточное нервное кольцо и вентральный нервный ствол.

После вылупления новые серотонин- и FMRFaмид-иммунореактивные нейроны практически не появляются. Лишь у немногих особей выявлялись два дополнительных серотонин- и один FMRFaмидергический нейрон со слабой иммунофлуоресцешнцией в апикальном сенсорном органе. Значительно увеличивается, лишь число иммунопозитивных. отростков в формирующейся дефинитивной нервной системе (церебральный ганглий, нерв прототроха, вентральные стволы и окологлоточное кольцо). Базальные отростки FMRFaмид-иммунореактивных нейронов апикального органа прорастают назад и соединяются с вентральными отделами нервной системы. В дальнейшем иммунореактивность в нейронах личиночной нервной системы постепенно исчезает.

Необходимо отметить, что кроме описанного выше набора хемосепсорных нейронов и в дополнение к апикальному сенсорному органу, который считается единственным хемосенсорным органом трохофор, нами был обнаружен и описан неизвестный ранее непарный хемосенсорный орган на заднем конце тела у вылупившихся трохофор РИуНо(осе (рис. 15). Он был изучен не только иммунохимически (анти-тубулин и анти-серотонин иммуномечение, комбинированное с конфокальной лазерной микроскопией), но и методом объемной реконструкции после

заливки в эпоксидную смолу PolyBed 812 и серийной резки на ультратоме срезов толщиной 2 мкм и их окраски толуидиновым синим.

Сенсорный орган расположен в средней части дорзальной стороны гипосферы, и его сенсорная часть направлена назад. Он содержит окружающие сенсорные нейроны под держивающие клетки, а также пять сенсорных клеток, две из которых серотонин-иммунопозитивньк Трансмиттерная специфичность остальных нейронов неизвестна. Каждая клетка имеет апикальный дендрит, который идет к поверхности тела и несет одну ресничку. Нейроны этого органа, названного нами по аналогии с апикальным сенсорным органом (apical sensory organ, ASO) «задним сенсорным органом» (posterior sensory organ, PSO), иннервируют нерв прототроха и церебральный ганглий. Одиночный отросток из апикального органа иннервирует задний сенсорный орган.

Рис 15. Схема заднего сенсорного органа у трохофоры полихеты Phyllodoce maculata, вид сдорзальной стороны. Нейроны 1, 2 и 4 проецируются в нерв прототроха (рп), нейроны 3 и 5 в церебральный ганглий (eg). Нейроны 1 и 2 серотонин-иммунореактивны. Одиночное

волокно из апикального органа (ао) иннервирует орган. Линейка 10 мкм.

В процессе развития орган подвергается постепенной дегенерации,. которая начинается через 2 дня после вылупления, а через 5 дней после вылупления от заднего сенсорного органа остаются только следы дегенерировавших клеток, которые вскоре полностью исчезают.

Ранее никаких структур, подобных описанному нами органу у трохофор не было известно. Он не соответствует ни периферическим сенсорным клеткам, описанным ранее Экессоном и Лакалли (Akesson, 1967; Lacalli, 1981; 1984; 1986), ни задним периферическим нейронам гастропод (обзор литературы в Croll, 2000), ни нухальным органам взрослых полихет (Purschke 1997; Jelsing, 2002). Скорее всего, задний сенсорный орган - это специфически личиночная провизорная сенсорная структура.

Нейрогеиез хитона 1скпоекНоп hakodadensis Развитие этого вида типично для хитонов. Трохофора с хорошо развитым прототрохом и апикальным сенсорным органом вылупляется из яйца через примерно 15 часов после оплодотворения (при 19-21°С) и начинает плавать апикальным концом вперед, вращаясь вокруг продольной оси. Через 40 часов после оплодотворения на дорзальной стороне появляются семь поперечных валиков, а на вентральной стороне формируется'нога. Личинка оседает через 90-100 часов. после оплодотворения, прототрох и апикальный орган редуцируются, и молодой моллюск начинает ползать и питаться.

Рис. 16. Схема развития РМЕБамид-иммунореактивных нервных элементов в онтогенезе хитона Ь^посМ1оп hakodadensis. Указано время в часах (И) после оплодотворения. Первыми появляются клетки г1 1-2, 11 1-2, и ск 1-4. Через 30-40 часов после оплодотворения появляются клетки а8 1-6, хЪа 1,2, и 1Ьа 1,2; и набор личиночных нейронов становится полным (впоследствии добавляются только периферические сенсорные клетки в передней полусфере). Начинает развиваться дефинитивная нервная система. Первые клетки в церебральном ганглии и педальных стволах появляются примерно через 40 часов, а в плевровисцеральных стволах через 50 часов. Через 120 часов (10 часов после оседания) все личиночные нейроны исчезают.

Первыми нервными элементами, дифференцирующимися в процессе онтогенеза, являются четыре периферических хемосенсорных нейрона, расположенные попарно по

бокам эписферы (г1 1-2; 11 1-2; рис. 16-17). Строение этих клеток идентично строению так называемых ампулляторных клеток - хемосенсорных нейронов, часто встречающихся у различных трохофорных животных. У хитона эти клетки появляются непосредственно перед вылуплением и демонстрируют иммунореактивность как против серотонина, так и FMRFaмидa. Аксоны этих клеток проецируются в зону будущего церебрального ганглия (в основании развивающегся апикального органа), прорастают в контролатеральную половину тела и поворачивают вниз и назад, маркируя положение будущих парных педальных (вентральных) нервных стволов. Таким образом, уже при вылуплении трохофоры аксоны первых хемосенсорных клеток маркируют контур будущих основных нервных центров, которые начнут развиваться значительно позже.

Рис 17. Схема развития серотонин-иммунореактивных нервных элементов в онтогенезе хитона ЬсИпосИМоп hakodadensis. Указано время в часах (И) после оплодотворения. Через 24 часа после оплодотворения набор клеток идентичен FMRFaмид-иммунореакшвным (г! 1-2,111-2, ск 1-4) плюс клетки as 7-14, ге 1-4 и (Ъ 4-8. Через 30 часов появляются клетки ^ 3, 1Ъи 3, г#8 и Мк, набор нейронов личиночной нервной системы становится полным, и начинает, формироваться дефинитивная нервная система. Первыми появляются нейроны и отростки в педальных стволах (рс), затем в церебральном ганглии и плевровисцеральных стволах (рус). Через 50 часов появляется плексус в передней части развивающейся ноги и каудальный плексус. Иммунореакция в клетках г1 1-2 и II 1-2 исчезает. Через 120 часов (10 часов после оседания) все личиночные нейроны исчезают.

Примерно через пять часов дифференцируются новые нервные клетки. И опять это периферические хемосенсорные нейроны - четыре сенсорные клетки на дорзальной стороне эписферы, которые также иммунореактивны к РМИРамиду и серотонину (ск 14; рис. 16-17). Еще через пять часов появляются первые нейроны в апикальном сенсорном органе - четыре РМИРамид-иммунореактивные сенсорные клетки, восемь серотонин-иммунореактивных сенсорных клеток, две РМ11Рамид-иммунореактивные несепсорные клетки и две несенсорные клетки, иммунореактивные к обоим нейротрансмиттерам (соответственно, клетки а8 1-4; а8 7-14; гЬа 2; 1Ьа 2; гЬа 1; 1Ьа 1 на рис. 16-17).

До 12 клеток меньшего размера появляется в эпителии латеральной и дорзолатеральной части претрохального полушария. В это же время- первые РМКРамид-иммунореактивные волокна начинают прорастать из нейропиля апикального органа в область будущих педальных стволов. Одновременно с этим на вентральной и на дорзальной стороне эписферы появляются две группы из четырех сенсорных серотонин-иммунореактивных клеток (ув 1-4; ск 5-8; рис. 17). Вскоре в основании апикального сенсорного органа появляется еще одна пара несенсорных серотониниммунореактивных клеток (ГЬа 3 и 1Ьа 3; рис. 17) и пара дорзолатеральных сенсорных нейронов (гс1к и Ык; рис. 17).

В дальнейшем число РМИРамид-иммунореактивных нейронов в личиночной нервной системе начинает быстро увеличиваться, и примерно через 10 часов первые РМИРамид-иммунореактивные нейроны начинают дифференцироваться в формирующемся церебральном ганглии дефинитивной нервной системы. Волокна в педальных стволах дорастают до заднего конца тела и стволы соединяются, а по ходу этих стволов дифференцируются пять пар РМИРамид-иммунореактивных сенсорных нейронов.

Набор серотонин-иммунореактивных нейронов личиночной нервной системы, наоборот, остается практически неизменным до самого оседания. Однако начинают появляться первые серотонинергические нейроны дефинитивной нервной системы. Сначала в формирующихся педальных стволах появляются иммунопозитивные клетки, причем первые из этих клеток появляются в каудальной части стволов. Их отростки растут вперед, но довольно долго не соединяются с передними серотонинергическими элементами. Затем появляется первая пара нейронов в церебральном ганглии (с1 и с 2; рис. 17), отростки серотонин-иммунопозитивных клеток прорастают во всю длину вентральных стволов, в плевровисцеральные (латеральные) стволы и поперечные комиссуры, а также образуют плексус вдоль переднего края формирующейся ноги.

Таким образом, к этому моменту все главные составные части дефинитивной нервной системы уже сформированы.

Далее в процессе развития РМИРамид-иммунореактивные волокна появляются по всей формирующейся дефинитивной нервной системе, а именно: в церебральном ганглии, педальных стволах, плевровисцеральных стволах и поперечных комиссурах. Число нейронов в церебральном ганглии достигает 50.

Начиная с этого времени, больших изменений в строении РМИРамид-иммунореактивной части нервной системы уже не происходит. Постепенно увеличивается число волокон в дефинитивной нервной системе. Следует отметить, что в это время интенсивность иммунореакции в телах нейронов rl 1-2 и 111-2 значительно увеличивается, и они становятся значительно ярче всех остальных иммунопозитивных клеток нервной системы.

Что касается серотонин иммунореактивных нервных элементов, то увеличивается число нейронов и волокон в развивающемся церебральном ганглии, педальных стволах и плевровисцеральных стволах. В дополнение к переднему вентральному плексусу появляется задний вентральный плексус. Параллельно с усилением иммунореакции к РМИРамиду в телах нейронов rl 1-2 и 11 1-2 происходит постепенное исчезновение реакции к серотонину, так что незадолго до оседания он там уже не выявляется.

Во время, непосредственно предшествующее оседанию личинок, интенсивность иммунореакции к РМИРамиду в апикальных сенсорных нейронах значительно возрастает, а. в остальных клетках личиночной нервной системы,, наоборот, уменьшается. После оседания реакция к обоим трансмиттерам во всех личиночных нейронах начинает быстро исчезать и скоро (110-120 часов с начала развития) исчезает совсем. Примечательно, что в клетках rl 1-2 и 11 1-2, которые дифференцировались самыми первыми, иммунореакция к РМЯРамиду исчезает всегда в самую последнюю очередь.

Таким образом, у трохофор хитона имеется хорошо развитая транзиторная нервная система, которая состоит из апикальных хемосенсорных нейронов и периферических сенсорных нейронов в эписфере. Никаких других нервных элеиментов у только что вылупившихся трохофор не обнаружено (по иммунореакции. с антителами против ацетилированного тубулина). Первые из появившихся нейронов посылают базальные отростки, маркируя пути, по которым впоследствии будет формироваться дефинитивная нервная система, аналогично тому, как это было показано ранее для прудовика Lymnaea stagnate (Croll, Voronezhskaya, 1996), морского блюдечка Crepidula

fornicata (Dickinson et al., 1999), морского зайца Aplysia californica (Dickinson et al:, 2000) и мидии Mytilus edulis (Флячинская, 2000).

Известно, что строение нервной системы взрослых хитонов больше напоминает таковое полихет, чем моллюсков. Тем не менее сценарий, по которому происходит развитие нервной системы хитона, полностью повторяет развитие нервной системы гастропод: первыми нервными элементами являются периферические хемосенсорные нейроны, базальные отростки которых прокладывают пути будущего развития центральной нервной системы. После ее формирования первые нейроны исчезают. Таким образом, наши данные подтверждают тот факт, что базовые механизмы, контролирующие нейрогенез, крайне консервативны.

Влияние активности хемосенсорных нейронов апикального органа на личиночное развитие моллюсков

Зародыши прудовика и катушки из одной кладки при нормальных условиях развиваются синхронно, и при средней температуре 24 ± 1°С продолжительность развития от стадии трохофоры (стадия 19) до первой ювенильной стадии (стадия 27) составляла 6.6 ± 0.9 дня для катушки (п=990) и 6.8 ± 1.1 дня для прудовика (п=1324). Проводилась инкубация зародышей в воде, кондиционированной ювенильными особями. Для кондиционирования предварительно содержащихся 24 часа без пиши особей возраста Р2 помещали в малый объем воды (200 улиток на 10 мл) и содержали так в течение 16 часов. Затем воду отбирали и пропускали через миллипоровый фильтр (0.2 мкм). Инкубация в такой воде приводила к удлинению продолжительности развития более чем в два раза (рис.18). То есть, в то время, когда контрольные животные уже завершали метаморфоз (стадия 28, 90% эмбрионального развития), инкубирующиеся в кондиционированной воде достигали только стадии велигера (стадия 23, 45% эмбрионального развития). Действие кондиционированной воды было обратимым, и темп развития восстанавливался при замене кондиционированной воды на обычную воду.

Для того, чтобы доказать, что эффект кондиционированной воды опосредуется именно ранними апикальными хемосенсорными моноаминергическими нейронами, фармакологически вызывали изменение синтезируемого ими моноамина. Для этого зародышей нкубировали в: биохимических предшественниках серотонина и дофамина (5-НТР и L-DOPA, 1 мМ); метилированных аналогах предшественников моноаминов (а-метил-триптофан и а-метил-DOPA, 1-4 мМ); блокаторах синтеза (парахлорфенилаланин и гидроксибензилгидразин, 10-50 мкМ); различных

антагонистах рецепторов серотонина и дофамина (миансерин, метисергид, ципрогептадин, сульпирид, ритансерин, кетансерин, эргометрин, 1-100 мкМ). Фармакологический анализ показал, что бихимические предшественники действовали на развитие сходным с кондиционированной водой образом - замедляли его более чем в два раза. Тормозное действие было четко видоспецифичным - развитие прудовика. удлинялось под действием предшественника дофамина, а развитие катушки - под действием предшественника серотонина. Эта специфичность строго коррелировала с химизмом хемосенсорных нейронов у соответствующего вида (рис. 18). Метилированные предшественники в диапазоне использованных концентраций не оказывали влияния на развитие.

Рис 18. Продолжительность развития прудовика, Lymnaea stagnate, и катушки, Helisoma trivolvis, от стадии трохофоры до первой ювенильной стадии. По горизонтали - продолжительность развития в % относительно контроля (100% - базовая линия). По вертикали — вещества в инкубационной среде (CW - кондиционированная < вода, 5-НТР -предшественник серотонина, L-DOPA — предшественник дофамина, 5-НТ - серотонин, DA - дофамин, ct-m-T - а-метил-триптофан; a-m-DOPA - a-метил-DOPA; NSD - блокатор синтеза моноаминов гидроксибензилгидразин, РСРА - специфический блокатор синтеза серотонина парахлорфенилаланин, ЕМ - эргометрин); * - статистически достоверное отличие от контроля, р<0.005.

Гистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание показало, что предшественники повышают, а метилированные аналоги предшественников снижают содержание соответствующего моноамина в хемосенсорных нейронах. Эффект кондиционированной воды и биохимических предшественников сильно ослаблялся, блокаторами синтеза моноаминов. Из ряда использованных антагонистов рецепторов только эргометрин значительно ослаблял как эффект кондиционированной воды, так и эффект предшественников (рис. 18).

Таким образом, было показано, что хемосенсорные нейроны апикального органа регулируют личиночное развитие. Продуцируемый при активации нейронов апикального органа транмиттерный моноамин (дофамин у Lymnaea, серотонип у Helisoma), тормозит развитие этих пресноводных моллюсков. Тормозный эффект опосредуется эргометрин-чувствительными рецепторами. Показано, что такое торможение функционально значимо при развитии в среде, неблагоприятной для метаморфоза и вылупления. В частности, хемосенсорные нейроны апикального органа «чувствуют» вещества, выделяемые в воду ювенильными особями, и при повышенной концентрации этих веществ затормаживают развитие и удлиняют время прохождения личиночных стадий. Можно полагать, что эта тормозная функция является общей для всех личинок беспозвоночных, имеющих апикальный орган.

ВЫВОДЫ

1. Основные принципы организации обонятельной системы головастика ксенопуса значительно отличаются от того, что считается обязательным для обонятельных систем. В полностью развитой и нормально функционирующей обонятельной луковице отростки сенсорных нейронов проецируются не в одну, а в несколько гломерул. Гломерулы выделяются структурно и функционально, но не отделены глиальной или клеточной стенкой от окружающей ткани.

2. Культивирование срезов обонятельной луковицы головастика при сохраненных периферических входах и центральных связях составляющих ее нейронов позволяет сохранить их специфичность и электрофизиологические характеристики, что дает возможность использовать в физиологическом эксперименте достоинства и свежего среза, и первичной клеточной культуры, но не имеет недостатков того и другого.

2. Дезингибирование митральных клеток в главной и дополнительной обонятельной луковице головастика осуществляется блокированием кальциевых токов в митральных клетках, опосредуемых а2-адрснорецепторами.

3. Сенсорная система личинки примитивного хордового асцидии не имеет обонятельных гломерул, что подтверждает независимое происхождение гломерул у позвоночных и беспозвоночных животных..

4. Сравнение строения апикального сенсорного органа у торнарий полухордовых и личинок иглокожих позволяет предположить, что господствующая в настоящее время теория происхождения хордовых. не отражает реальных филогенетических взаимоотношений между иглокожими, полухордовыми и хордовыми.

5. Система синтеза окиси азота присутствует в определенных субпопуляциях клеток в нервной системе у представители различных таксонов продвинутых беспозвоночных. N0 по-видимому участвует в хеморецепции.

6. САВАергические первичные сенсорные нейроны присутствуют в хемосенсорном органе большого прудовика.. Модуляция сенсорных входов осуществляется - путем взаимодействия медиаторов, в результате чего процессинг поступающей информации осуществляется на уровне периферического сенсорного органа. Кроме этого, периферический. хемосенсорный орган оказывает непосредственное тоническое тормозное влияние на реализацию поведенческой программы откладки яиц.

7. У представителей различных групп трохофорных животных периферические хемосенсорные нейроны являются первыми нервными элементами, дифференцирующимися в процессе нейрогенеза. Их активность оказывает тормозное влияние на развитие. При перенаселенности и недостатке пищи в популяции, ювенильные особи выделяют специфичное вещество, которое эти нейроны детектируют и тормозят личиночное развитие, давая тем самым личинкам шанс переждать неблагоприятные условия.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ

1. Малахов В.В., Незлин Л.П. 1982. О распределении катехоламинов в нервной системе свободноживущих нематод. Журн.эвол. биохим. и физиол., 18(1): 95-97.

2. Малахов В.В., Незлин Л.П., Спиридонов С.Э. 1983. О закономерностях в распределении катехоламинов и холинэстераз в нервной системе нематод. Журн. общ. биол., 44(5): 710-717.

3. Малахов В.В., Незлин Л.П. 1983. Трихоплакс - живая модель происхождения многоклеточных. "Природа", 3:32-41.

4. Незлин Л.П., Даутов С.Ш., Малахов В.В. 1984. Топография катехоламинсодержащих нейронов в личиночном развитии морских звезд. Докл.

АН СССР, 278(4): 983-985.

5. Воронов Д.А., Макаренкова Е.П., Незлин Л.П., Панчин Ю.В., Спиридонов С.Э. 1986. Изучение эмбрионального развития свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis (Enoplida) методом маркировки бластомеров. Докл. АН СССР, 286(1): 201-204.

6. Незлин Л.П. 1988. Развитие моноаминергических нейронов у актинотрохи. -планктонной личинки Phoronopsis harmeri. Журн. эвол. биохим. и физиол., 24(1): 76-80.

7. Воронцова М.Н., Незлин Л.П. 1988. Катехоламины в нервной системе личинок асцидий. Журн. общ. биол., 49(2): 227-235.

8. Незлин Л.П., Даутов С.Ш. 1988. Гистохимическое изучение нервной системы торнарии - планктонной личинки кишечнодышащих. Биология моря, 2: 70-72.

9. Незлин Л.П., Рыбаков АВ. 1988. Гистохимическое изучение нервной системы церкарий трематод. Журн. общ. биол., 49(5): 695-703.

10. Sakharov DA, Golubev A.I., Malutina L.V., Kabotyanski ЕЛ., Nezlin L.P. 1988. Serotoninergic control of ciliary locomotion in a turbellarian flatworm. In "Neurobiology ofinvertebrates". Eds. Salanki J. and S.-Roza K. Akademiai Kiado, Budapest, p.479-491.

11. Воронов ДА., Незлин Л.П., Панчин Ю.В., Спиридонов С.Э. 1989. Личинка первой стадии свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis. Гиподерма и сенсорные органы. Онтогенез, 20(4): 416-422.

12. Даутов С.Ш., Незлин Л.П. 1990. Нервная система и поведение личинок морских звезд в онтогенезе. Онтогенез, 21(2): 167-176.

13. Незлин Л.П., Воронов Д.А., Панчин Ю.В., Спиридонов С.Э. 1990. Личинка первой стадии свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis. Катехоламинергические нейроны. Онтогенез, 21(1): 69-75.

14. Рыбаков А.В., Незлин Л.П. 1990. Гистохимическое изучение нервной системы партенит трематод. Журн. общ. биол., 51(3): 419-424.

15. Юшин В.В., Незлин Л.П. 1990. Ультраструктура ресничного шнура эхиноплутеуса -планктоной личинки морского ежа Echinocardium cor datum. Цитология, 32(5): 469473.

16. Kabotyansky EA, Nezlin L.P., Sakharov DA 1991. Serotonin neurones in the planarian pharynx. Simpler nervous systems. DASakharov and W.Winlow (eds). Manchester Univ.Press,p.l38152.

17. Незлин Л.П., Прудников И.М., Давыдов П.В. 1991. Катехоламинергические нейроны ларвальной нервной системы морских звезд при метаморфозе. Журн. эвол. биохим. физиол., 27(1):19-26.

18. Незлин Л.П., Даутов С.Ш., Юшин В.В. 1991. Ультраструктура кишечного тракта торнарии - личинки кишечнодышащих. Цитология, 33(5): 3-9.

19. Незлин Л.П. 1991. Развитие нервной системы у личинок иглокожих. Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: 24с.

20. Незлин Л.П., Мороз Л Л., Элофссон Р., Сахаров ДА. 1992. Эндогенные опиоиды "модельных" гастропод: иммуноцитохимическая идентификация педатьных нервных элементов. Биологические мембраны, No 10-11:1072-1074.

21. Мороз ЛЛ., Незлин Л.П., Карлберг М., Элофссон Р., Сахаров ДА. 1992. Существуют ли NO-продуцирующие нейроны у беспозвоночных животных. Биологические мембраны, No 10-11:1119-1121.

22. Незлин Л.П., Рыбаков А.В., Контримавичюте Д.В. 1992. Гистохимическое изучение нервной системы церкарии Podocotyle atomon (Trematoda: Opecoelidae). Паразитология, 26 (2): 115-121.

23. Dautov SSh, Nezlin LP, 1992. Nervous system of the toraaria larva (Hemichordata: Enteropneusta). Histochemical and ultrastructural study. Biol. Bull., 183(3): 463-475.

24. Sakharov DA, Nezlin LP Moroz LL, Elofsson R. 1993. Patterns of enkephalin immunolabeling in the pulmonate snail Cepaea nemoralis and related mollusks. Brain Research, 620(1): 114-121.

25. Elofsson R, Carlberg M, Moroz LL, Nezlin LP, Sakharov DA. 1993. Is nitric oxide (NO) produced by invertebrate neurons? NeuroReport, 4(3): 279-282.

26. Voronov DA, Nezlin LP. 1994. Neurons containing catecholamine in juveniles of eight species of free-living marine nematodes. Russian Journal ofNematology, 2(1): 3340.

27. Dautov SSh, Nezlin LP, Yushin W. 1994. Structure of the digestive tract oftomaria larva in Enteropneusta (Hemichordata). Helgolander Meeresuntersuchungen, 48:107121.

28. Nezlin LP, Yushin W. 1994. The digestive tract of the echinopluteus ofEchinocardiwn cordatum (Echinodermata, Echinoida): its ultrastructure and innervation. Canadian J. Zool., 72(12): 2090-2099.

29. Nezlin LP, Elofsson R, Sakharov DA. 1994. Transmitter specific sensory neurons of gastropod osphradia. Biol. Bull., 187(2): 174-184

30. Nezlin LP, Cunjak RA, Zotin AA, Ziuganov W. 1994. Glochidium mK^hology of the freshwater pearl-mussel {Margaritifera margaritifera) and glochidiosis of Atlantic salmon (Salmosalar)'. A study by scanning electron microscopy. Canadian J. Zool., 72(1): 15-21.

31. Moroz LL, Nezlin LP, Elofsson R, Sakharov DA. 1994. Serotonin- and RFamide-immunoactive nerve elements in the chiton Lepidopleurus asellus (Mollusca, Polyplacophora). Cell Tissue Res., 275:277-282.

32. Nezlin LP, Moroz LL, Elofsson R, Sakharov DA. 1994. Immunolabeled neuroactive substances in the osphradium of the pond snail Lymnaea stagnate. Cell Tissue Res., 275(2): 269-272.

33. Sakharov DA, Voronezhskaya ЕЕ, Nezlin LP. 1994. Chronic haloperidol: neuronal correlates ofmotor disorders in an invertebrate animal. NeuroReport, 5(6): 667-670.

34. Dautov SSh, Nezlin LP, Yushin W. 1994. Structure ofthe digestive tract oftomaria larva in Enteropneusta (Hemichordata). Helgolander Meeresuntersuchungen, 48(1): 107-121.

35. Nezlin LP. 1995. Primary sensory neurons and their central projections in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biologica Hungarica, 46(2-4): 305-313.

36. Sakharov DA; Voronezhskaya ЕЕ; Nezlin L; Baker М^ Elekes K; Croll RP. 1996. Tyrosine hydroxylase-negative, dopaminergic neurons are targets for transmitter-depleting action ofhaloperidol in the snail brain. Cell Mol. Neurobiol., 16(4): 451-461

37. Незлин Л.П. 1996. Периферические и центральные элементы хемосенсорной системы у пресноводной легочной улитки Lymnaea stagnalis. Зоожурнал, 75(9), 1336-1341.

38. Незлин Л.П. 1997. Роль периферического сенсорного органа в контроле откладки яиц у большого прудовика Lymnaea stagnalis. Докл. АН СССР, 353(3): 415-417.

39. Nezlin LP, Voronezhskaya ЕЕ. 1997. GABA-immunoreactive neurones and interactions of GABA with serotonin and FMRFamide in a peripheral sensory ganglion of the pond snail Lymnaea stagnalis. Brain Res., 772(1-2): 217-225.

40. Vorontsova МЫ, Nezlin LP, Meinertzhagen LA. 1997. Nervous system ofthe larva ofthe ascidian Molgula citrina (Ader and Hancock, 1848). Acta Zool (Stockholm), 78(3): 177185.

41. Nezlin LP. 1997. The osphradium is involved in the control of egg-laying in the pond snail Lymnaea stagnalis. Inv. Reprodio Develop., 32(2): 163-166.

42. Nezlin LP, Schild D. 2000. Structure ofthe olfactory bulb in tadpoles ofXenopus laevis. Cell Tissue Res., 302(1): 21-29.

43. Nezlin LP. 2000. Tomaria of hemichordates and other dipleurula-type larvae: a comparison. J. Zool. Syst. Evol. Res., 38(3): 149-156.

44. Scheidweiler. U, Nezlin LP, Rabba J, М^Ъг B, Schild D. 2001. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chem. Senses, 26(4): 399-407.

45. Czesnik D, Nezlin LP, Rabba J, Muller B, Schild D. 2001. Noradrenergic modulation of calcium currents and synaptic transmission in the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Eur. J. Neurosci., 13(6): 1093-1100.

46. Voronezhskaya ЕЕ, Tyurin SA, Nezlin LP. 2002. Neuronal development in larval chiton Ischnochiton hakodadensis ^otoca: Polyplacophora). J. Сотр. Neural., 444(1): 25-38.

47. Buznikov GA, Nikitina LA, Voronezhskaya ЕЕ, Bezuglov W, Willows AOD, Nezlin LP. 2003. Localization of serotonin and its possible role in early embryos of Tritonia diomedea ^ollusca: Nudibranchia). Cell Tissue Res., 311(2): 259-266.

48. Voronezhskaya ЕЕ, Tsitrin EB, Nezlin LP. 2003. Neuronal development in the larval polychaete Phyllodoce maculata (Phyllodocidae). J. Сотр. Neurol., 455(3): 299-309.

49. Nezlin L.P., Voronezhskaya E.E. 2003. Novel, posterior sensory organ in the trochophore larvae of Phyllodoce maculata (Polychaeta) Pros. R. Soc. Lond. В (Suppl), 270, SI 59-S162.

50.Nezlin L.P., Heerman S., Schild D., R6ssler W. 2003. Organisation of glomeruli in the olfactory bulb ofXenopus laevis tadpoles. J. Сотр. Neurol., 464(3): 257-268.

51. Nezlin L.P., Yushin V.V. 2004. Structure of the nervous system in the tornaria larva of Balanoglossus proterogonius (Hemichordata: Enteropneusta) and its phylogenetic implications. Zoomorphology, 123(1): 00-00.

52. Незлин Л.П. 2003. Пачечные нейросекреторные клетки в периферическом сенсорном ганглии большого прудовика Lymnaea stagnalis. Журн.высш. нерв, деят., (в печати).

53. Voronezhskaya Е.Е., Khabarova M. Yu., Nezlin L.P. 2004. Apical sensory neurons mediate developmental retardation induced. by conspecific environmental stimuli in freshwater pulmonate snails. Development, (послано в печать).

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ

1. Незлин Л.П. 1984. Топография катехоламинсодержащих нейронов у планктонных личинок некоторых морских беспозвоночных. В кн. «Макроэволюция», М., с.135-136. (Тез. Всес. конф.).

2. Незлин Л.П. 1984. Возможная функция катехоламинсодержащих клеток у планктонных личинок немертин, форонид и иглокожих. В кн. «Физиология и биохимия медиаторных процессов», М., Часть 2, с.232. (Тез. Всес. конф.).

3. Даутов С.Ш., Незлин Л.П. 1985. Изменение поведения и строения нервной системы планктотрофных личинок морских звезд. В кн. «Простые нервные системы», Казань, Часть 1, с.55-57.

4. Незлин Л.П. 1985. Развитие катехоламинергических элементов нервной системы в онтогенезе Phoronopsis harmeri (Phoronida). В кн. «Простые. нервные системы», Казань, Часть 2, с.37-39.

5. Рыбаков А.В., Незлин Л.П. 1986. Распределение катехоламинов и ацетилхолинэстеразы в нервной системе партенити церкарий) трематод. В кн. «Биологические ресурсы шельфа, их рациональное использование и охрана», Южно-Сахалинск, с.59-60.

6. Воронов Д.А., Макаренкова Е.П., Незлин Л.П., Панчин Ю.В., Спиридонов С.Э. 1986. Исследование эмбрионального развития морской свободноживущей нематоды Enoplus brevis. Онтогенез, 17(4): 419 (Тез. Всес. научн. совещ.)

7. Незлин Л.П. , Даутов С.Ш. 1987. Нервная система планктотрофных личинок иглокожих. В кн. «Проблемы филогении и систематики иглокожих», Талинн, с.72-73.

8. Sakharov DA, Golubev A.I., Malutina L.V., Kabotyanski A.A., Nezlin L.P. 1987. Serotoninergic control of ciliary locomotion in Planaria. In: 'Neurobiology of Invertebrates. Transmitters, Modulators and Receptors", Tihany, Hungary, p.263.

9. Незлин Л.П., Семенова М.Н., Даутов С.Ш. 1988/ Медиаторные механизмы поведения планктонных личинок морских звезд. В кн. «Интегративная деятельность

нейрона: молекулярные основы», М., с.89-90 (Тез. докл. Межд. симпозиума, посвященного 90-летию со дня рождения ПХАнохина).

10. Nezlin L.P., Semenova M.N., Dautov S.Sh. 1988. Transmitter mechanisms ofbehavour of free-swimming star fish larvae..In: "Integrative action of neuron: Molecular basis. Moscow, 1988, p.89-90.

И. Незлин Л.П. , Рыбаков А.В. 1988. Особенности эволюции нервной системы на разных стадиях жизненного цикла трематод. В кн. «Проблемы макроэволюции», М., Наука, с.88-89.

12. Незлин Л.П., Семенова М.Н. 1990. Медиаторные механизмы поведения планктонных личинок морских звезд. В кн. «Х-Всес. совещание по эволюционной физиологии, поев, памяти акад. ЛАОрбели». Л., Наука, с. 116.

13. Nezlin L.P. 1991. Structure ofthe nervous system of daughter sporocyst, cercaria, and metacercaria of Podocotyle atomon (Trematoda: Opecoelidae). In: "Simpler nervous systems" (Regional Meeting ofthe ISIN). Abstracts. Minsk, 23-26 April, p.63.

14. Voronov DA, Makarenkova H.P., Nezlin L.P., Panchin Yu.V., Spiridonov S.E. 1991. The cell lineage in the marine nematode Enoplus brevis. Abstracts of Annual Conference ofBSDB, BRA and BSCB. Leeds, 8-11 April, p.153.

15. Nezlin L.P., Vorontsova M.N, Meinertzhagen LA. 1994. Nervous system of the larval ascidian Molgula citrina. Society for Neuroscience Abstracts, V 20, p 774.

16. Sakharov DA., Voronczhskaya E.E., Nezlin L.P., Elekes K., Baker M., Croll R. 1994. Haloperidol-induced monoamine depletion: tyrosine hydroxylase-negativc subsets of dopamine neurons are affected in gastropod CNS. Soc. Neurosci. Abstr., V 20, p. 1772.

17. Nezlin L.P., Sakharov DA, Elofsson R. 1994. Comparative study of gastropod osphradia: transmitter specifcy of sensory neurons. Abstracts of the Fourth Symposium on Molluscan Neurobiology, June 1 -4,1994, Amsterdam, the Nederlands, p. 141.

18. Sakharov DA., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 1994. A novel approach to examining background mechanisms of action of antipsychotics. Abstracts of the Fourth Symposium on Molluscan Neurobiology, June 1-4,1994, Amsterdam, the Nederlands, p. 146.

19. Nezlin L.P., Elofsson R., Sakharov DA. 1994. Transmitter specific sensory neurons of gastropod osphradia. In: "Simple nervous systems" (Abstracts of Regional Meeting ofthe ISIN. Puschino, May 25-27,1994), p. 29.

20. Sakharov DA., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 1994. Invertebrate models for studying mechanisms underlying effects of ana'psychotic drugs. In: "Simpler nervous systems" (Abstracts ofRegional Meeting ofthe ISIN. Puschino, May 25-27,1994), p. 40.

21. Nezlin L.P. 1995. Primary sensory neurons and their central projections in the pond snail Lymnaea stagnalis. Abstracts of the 8th Symposium on Invertebrate Neurobiology, Tihany, Hungary 27 June - 2 July 1995.

22. Nezlin L.P. 1997. Transmission mechanisms ofthe osphradial sensory system in the pond snail Lymnaea stagnalis. In; "Simpler Nervous Systems" (Abstracts of the 5th East European Conference ofISIN), Moscow, Russia, September 9-12,1997, pp 110-111.

23. Nezlin L.P., Schild D. 1998. Structure ofthe olfactory bulb in tadpoles ofXenopus laevis. In "Neuroethogy on the Move" (Proceedings of the 26th Gottingen Neurobiology Conference, Ed. N. Eisner), Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, p.420.

24. Nezlin L.P. 2000. Chemosensory organs of model animals: comparison of the osphradium ofLymnaea stagnalis with antennal lobe ofManduca sexta and olfactory bulb ofXenopus laevis. In; "Simpler Nervous Systems" (Abstracts of the VI East European. Conference oflSIN), Moscow-Puschino, Russia, September 22-25,2000, p 85.

25. Voronezhskaya E.E., Tyurin SA, Nezlin L.P. 2000. Development of serotonin and FMRFamide immunoreactivities in larval chiton (Mollusca: Polyplacophora). In; "Simpler Nervous Systems" (Abstracts of the VI East European Conference of ISIN), Moscow-Puschino, Russia, September 22-25,2000, p 132.

26. Czesnik D., Nezlin L.P., Rabba J., Miiller B., Schild D. 2001. Noradrenergic modulation of calcium currents and synaptic transmission in the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. In: "G6ttingen Neurobiology Report 2001" (Proceedings ofthe 28th G6ttingen Neurobiology Conference, Eds. N. Eisner and G.W. Kreutzberg), Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, p.459.

27. Scheidweiler U., Nezlin L.P., Muller B., Schild D. 2001. Slice culture of the olfactory bulb ofXenopus laevis tadpoles. In: "G6ttingen Neurobiology Report 2001" (Proceedings of the 28th G6ttingen Neurobiology Conference, Eds. N. Eisner and G.W. Kreutzberg), Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, p.471.

28. Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 2001. Early neurodevelopment of chiton and polychaete: Phylogenetic implications. In: "G6ttingen. Neurobiology Report 2001" (Proceedings of the 28th GCttingen Neurobiology Conference, Eds. N. Eisner and G.W. Kreutzberg), Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, p.932.

29. Nezlin L.P., Scheidweiler U., Muller B., Schild D. 2001. Comparison ofthe cell types in -acute and cultured slices of the olfactory bulb ofXenopus laevis tadpoles. Soc. Neurosci. Abstr., Vol. 27, Program No. 623.10.

30. Lauder J.M., Nikitina LA., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P., Markova LN., Luo X., Willows A.O.D., Buznikov GA 2002. Localization of serotonin and its possible role in early embryogenesis of opistobranch molluscs and sea urchins. Soc. Neurosci. Abstr., Vol. 28, Program No. 23.16.

31. Nezlin L.P., Heermann S., Schild D., R6ssler W. 2002. Organization of glomeruli in the main olfactory bulb ofXenopus laevis tadpoles. Abstracts ofThe Fifteenth Meeting ofthe European Chemoreception Research Organization (ECRO), Erlangen, Germany, July 2327. Chemical Sences, 28, p.E42.

32. Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 2002. A novel approach to the neuronal development in trochophores. Abstracts ofthe V Larval Biology Meeting. Vigo, Spain, September 15-19, 2002, p.41.

33. Nezlin L.P. Voronezhskaya E.E., Yushin V.V. 2002. Nervous system ofthe hemichordate toraaria: immunochemical and electron-microscopic study. Abstracts of the V Larval Biology Meeting. Vigo, Spain, September 15-19,2002, p. 45.

34. Nezlin L, Heermann S., Schild D., R6ssler W. 2003. Organization of glomeruli in the olfactory bulb ofXenopus laevis tadpoles. In: "The Neurosciences from Basic Research to

Therapy" (Proceedings of the 29th G6ttingen Neurobiology Conference, Eds. N. Eisner and H Zimmermann), Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, p.491:

35. Voronezhskaya E., Nezlin L. 2003. Peripheral sensory neurons lead neurogenesis in trochophore animals. In: "The Neurosciences from Basic Research to Therapy" (Proceedings of the 29th G6ttingen Neurobiology Conference, Eds. N. Eisner and H. Zimmermann), Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, p.924;

36. Nezlin L., Heermann S., Schild D., Rfissler W. 2003. Simplified organization of glomeruli in the olfactory bulb ofXenopus laevis tadpoles. In; "Sympler Nervous Systems" (Abstracts of the VII East European Conference of ISIN), Kaliningrad, Russia, September 12-16,2003, p 79.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.02.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.псчл. 4,0. Тираж 100 экз. Заказ 184. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Незлин, Леонид Павлович, Москва

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития РАН (директор - академик РАН Н. Г. Хрущов)

Официальные оппоненты:

„окгор биологических наук, чл.-корр. РАМН Скребицкий В.Г. Доктор биологических наук, профессор Шульговский В. В. Доктор биологических наук Лапшин Д. Н.

Ведущее учреждение:

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 22 марта 2004 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного сов Д 501.001.93 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологичес наук при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по ад1 119992, Москва, Воробьевы Горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факульт ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ Автореферат разослан 21 февраля 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Б. А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хеморецепция - это несомненно наиболее древнее чувство. На заре эволюции именно хеморецепция дала первым живым существам возможность искать пищу и избегать опасности. Впоследствии из этого древнего чувства родились обоняние и вкус. В настоящее время общепризнано, что сигнальная система химической рецепции у большинства животных является ведущей не только для поиска пищи и полового партнера, но и для определения опасности и социальных сигналов, а также участвует в регуляции индивидуального развития. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе восприятия и распознавания химических сигналов является принципиально важным.

Для человека, на первый взгляд, хеморецепция не так важна, особенно хеморецепция дистантная - обоняние. Большинство из нас больше полагается на зрение и слух, и мы часто не сознаем важность обоняния и вкуса до тех пор, пока их не лишимся. Предполагается, что в нашем организме около тысячи генов кодируют обонятельные рецепторы, и это составляет около одного процента от общего числа генов в нашем геноме. Такое поразительное число рецепторов свидетельствует о принципиальной важности хеморецепции.

Различают контактную, или вкусовую хеморецепцию и дистантную, или обонятельную (ольфакторную). У беспозвоночных специализированные вкусовые клетки расположены почти везде на поверхности тела, например на щупальцах (у улиток и у осьминогов) или на ногах (у членистоногих). Чаще всего они расположены вокруг рта, где пища проверяется на пригодность или токсичность. Обычно вкусовые рецепторные клетки расположены группами, причем каждая клетка имеет длинный дистальный отросток, выходящий через пору или ямку на поверхность тела. У круглых червей (нематод) так устроен орган химической чувствительности - амфида (Ward, 1977). Часто пара подобных чувствительных органов имеется и на хвостовом конце тела у червей. Дистальные отростки чувствительных клеток представляют собой видоизмененные реснички. Различные вещества проникают через поверхностную пору и стимулируют кончики ресничек. Хеморецепторы насекомых устроены подобным, но более специализированным образом. Для них характерно заключение рецепторов в структуру, называемую сенсиллой (Hansen, 1978; Kaissling and Thorson, 1979). Это образование из измененной кутикулы, которое имеет форму стерженька, ямки, пластинки или волоска. К настоящему времени самой изученной структурой являются волоски. Тела рецепторных клеток лежат у основания волоска, а их дистальные

отростки входят в волосок и тянутся до его кончика. Эти отростки можно считать дендритами, хота в действительности это реснички (как у нематод), которые содержат набор микротрубочек (9+2). На кончике находится отверстие поры, покрытое капелькой вязкой жидкости. Молекулы стимулирующего вещества диффундируют в эту жидкость через пору и соприкасаются с дендритами (Alter et al., 1977). Считается, что на дендритах расположены рецепторные белки, которые вызывают изменение проводимости мембраны. Именно в этом месте происходит сенсорное преобразование химического сигнала в электрический импульс.

Интенсивнее всего физиология вкусовых рецепторов изучалась на модели мясной мухи Phormia regina группой Детье (Dethier, 1976) в Массачусетсом университете. Так, было установлено, что каждая из четырех клеток во вкусовом волоске мухи избирательно чувствительна к определенному типу молекул. Это вкусовые клетки для воды, для сахара, два вида «солевых» клеток, чувствительных к катионам или к анионам, а также еще один тип клеток, являющихся механорецепторами. Избирательная чувствительность клетки к данному химическому соединению характеризуется тем, что она реагирует на него с самым низким порогом и самой сильной активностью по сравнению с ее реакцией на другие соединения. Обычно клетка обладает также некоторой реактивностью и к другим веществам. Кроме того, между реакциями на два вещества возможно тормозное действие. Оно может осуществлягся или на рецепторных участках мембраны, или между ресничками, или между телами клеток в волоске (Dethier, 1976). Такие свойства проявляются в ответах на чистые стимулы, такие как сахар или соль. При стимуляции естественными пищевыми веществами клетки в одном волоске вступают в более сложные комбинации реактивности. Соответственно, разные пищевые вещества дают разные комбинации ответов. Как пишет Детье: «каждое (естественное) вещество...имеет сложный химический состав, и каждая рецепторная клетка волоска обладает характерным спектром активности, а не одной единственной специфичностью. Если центральная нервная система способна анализировать эти комбинации, то это значит, что они содержат достаточно информации, чтобы характеризовать одно вещество как отличное от другого» (Dethier, 1976).

У низших позвоночных, как и у многих беспозвоночных, вкусовые рецепторы не вегда сосредоточены только во рту. Например, у некоторых придонных рыб от грудных плавников отходят пальцеобразные выросты, направленные вниз и несущие на своих кончиках хемочувствительные рецепторы.

Для высших позвоночных характерно расположение рецепторов на языке, в заднем отделе рга и в глотке. Вкусовые рецепторные клетки объединены во вкусовые почки, которые в свою очередь собраны в сосочки (Murray, 1973). Сосочки бывают нескольких типов и по-разному распределены на поверхности языка. Примечательно, что хеморецепторные клетки живут всего около 10 дней. Таким образом, и во вкусовых почках, и в обонятельных рецепторах идет непрерывное обновление сенсорных клеток (Graziadei and Monti-Graziadei, 1978). Как при такой непрерывной замене сенсорных элементов сохраняется специфичность хемосенсорной единицы, остается неясным.

Когда на рецепторы попадает натуральная пища, то вкусовые ощущения представляют собой сложные смеси вкусовых качеств. При тестировании вкуса чистыми химическими веществами, ощущения могут быть разбиты на четыре качества: сладкое, соленое, кислое и горькое. Наличие этих качеств было впервые установлено в начале прошлого века, и с тех пор это представление господствует в понимании вкусовых механизмов. Соленый вкус создается в самом чистом виде хлористым натрием. Считается, что катионы оказывают на рецепторные мембраны возбуждающее действие, а анионы - тормозное. Кислый вкус создается кислотами. Он может объясняться действием иона водорода в случае неорганических кислот, но может также определяться действием аниона органических кислот. Сладкий вкус, как полагают, зависит от стереохимической конфигурации глюкозы и близких к ней органических молекул. Для горького вкуса характерно, что он вызывается ядовитыми (токсичными) веществами, например, хинином. Механизм их действия неизвестен; возможно, он локализован на поверхностной мембране или же внутри клетки (Bartoshuk, 1978; Beidler, 1980). Тот факт, что соответствующие вкусовые ощущения вызываются преимущественно (но не исключительно) с разных участков языка, казалось бы, говорит о том, что каждый такой участок может быть основой «меченой линии», несущей в мозг информацию о своей специфической модальности. Однако записи от одиночных волокон в барабанной струне, полученные в 1941 г. Пфаффменом (Pfaffman) показали, что это не гак. Одиночное волокно может лучше всего отвечать на один стимул, но оно обычно в той или иной степени реагирует и на другие типы стимуляции. Это говорит о том, что данное волокно синаптически связано во вкусовой почке с несколькими рецепторными клетками разной специфичности. (Pfaffman et al., 1976). Пфаффман предположил, что в такой системе сенсорное качество определяется не просто активацией известной группы волокон, но и характером импульсации других активных групп. Эта теория вкусовых качеств получила название теории «распределения активности между волокнами» (across-fiber pattern).

В настоящее время представление о восприятии вкуса объединяет в себе обе теории: и «меченой линии», и «распределения активности между волокнами». Четыре основных вкусовых качества по-прежнему служат простейшей схемой дата объяснения большинства физиологических и психических данных. В пределах этой схемы представляется, чего и специфические рецепторные клетки, и вкусовые почки, и волокна барабанной струны обладают каждый своим собственным стимулом, но на каждом из этих уровней может существовать в разной степени реактивность к стимулам других типов (Shepherd, 1992).

Что касается дистантной хеморецепции, то источником запахов является практически все. Растения, хищники, добьиа, другие особи того же вида - все это испускает запахи, которые животному необходимо распознавать и классифицировать. Разумеется, в процессе эволюции оказалось возможным создать более изощренные слуховые и зрительные системы. Иногда эти новые формы коммуникации превосходят исходные химические системы, но у большинства организмов основная роль по-прежнему принадлежит дистантной хеморецепции (Wilson, 1975).

Рецепторы для дистантных стимулирующих молекул называют обонятельными (ольфакторными), а соответствующую сенсорную модальность - обонянием. Можно сказать, что обонятельными рецепторами обладают все организмы. У водных животных стимулирующие молекулы передаются через воду, а у наземных передающей средой служит воздух. Среди беспозвоночных обоняние достигает наивысшего развития у общественных насекомых. Это проявляется чисто анатомически. На передающей стороне они обладают более чем десятком различных эндокринных желез (Wilson, 1975). Принимаются исходящие сигналы рецепторами, большинство из которых обычно сосредоточено в антеннах (усиках) - парных ветвистых придатках на голове насекомого (см. например, Синицына и др., 2003). Общее число рецепторов в обоих усиках колеблется у разных насекомых от 40 ООО до 200 ООО. Как и во вкусовых рецепторах насекомого, обонятельные сенсорные клетки собраны в сенсиллы, или волоски, по строению очень похожие на вкусовые волоски. Однако волосок может содержать одну или несколько клеток, и каждая клетка обладает несколькими периферическими ресничками (дендритами). Обонятельные волоски отличаются также своими системами поверхностных пор. В некоторых случаях пор очень много (до 15 ООО на волосок). Каждая пора является наружным отверстием углубления в кутикуле волоска. На дне углубления начинаются трубочки, пронизывающие кутикулярную стенку и сообщающиеся с пространством внутри оболочки и дендритами рецепторных клеток. Считается, что пахучие молекулы

адсорбируются на наружной кутикуле и через нее диффундируют к поре, а оттуда внутрь через систему трубочек к рецепторным дендритам (Kaissling, 1974; Boeckh, 1980). При тестировании разными запахами данный обонятельный рецептор насекомого отвечает на определенное их число, составляющее его спектр реактивности. При анализе реакций на широкий круг обонятельных стимулов выделяют группы рецепторов со сходными спектрами. По мнению Бекха (Boeckh) их можно классифицировать как «специализированные к феромонам» - это клетки с узкой настройкой на молекулу данного феромона; «специализированные на запахи пищи» -это клетки, обладающие сходными спектрами реактивности к разным спиртам, эфирам и другим соединениям, создающим запахи пищевых продуктов. Считается, что конкретное пищевое вещество опознается при стимуляции рецепторов разных типов в разных сочетаниях. И третий тип рецепторов - «обобщающие». Клетки этого типа реагируют на широкий круг веществ. Из обонятельных стимулирующих молекул лучше всего изучены феромоны, а среди феромонов - половые атграктанты. Вычислено, что достаточно одной молекулы, чтобы вызвать заметный ответ рецепторной клетки, а 200 молекул достаточно, чтобы вызвать поведенческую реакцию самца (Kaissling and Thorson, 1979). Такая ситуация характерна также для слухового и зрительного восприятия, в то время как вкусовая рецепция требует гораздо больших концентраций стимулятора.

Все животные имеют характерные периферические обонятельные органы, для улавливания запахов. Это обычно носовая полость с сенсорным эпителием у позвоночных, и камеры или сенсиллы у беспозвоночных. Молекулы запахов растворяются в слизи (мукусе) и транспортируются специальными белками к расположенным на ресничках обонятельных рецепторных нейронов рецепторам. Роль мукуса и этих белков остается пока совершенно неясной, поскольку обонятельные рецепторные нейроны могут реагировать на запахи и в отсутствие мукуса (Firestein et al., 1990). Общепринято, что один рецепторный нейрон экспрессирует только один рецепторный ген (Lancet, 1986; Shepherd, 1990,1992; Shepherd and Firestein, 1991; Chess et al., 1994). Однако, прямого экспериментального доказательства этому до сих пор не получено.

У позвоночных обоняние осуществляется рецепторами, заложенными глубоко в носовой полости. У низших позвоночных, таких как рыбы или лягушки, носовая полость обычно имеет форму сравнительно простого мешочка, и струя воды или воздуха проходит непосредственно над рецепторным слоем. У млекопитающих, а особенно у животных с тонким обонянием, таких, как опоссум, кролик или собака,

носовые полости имеют сложную форму (Haberly, 1979). У этих животных воздух сначала нагревается и увлажняется, и лишь затем достигает обонятельных рецепторов. Обонятельные рецепторные клетки расположены тонким слоем. Зрелая клетка имеет длинный тонкий дендрит, который оканчивается небольшим утолщением на поверхности (см. например Williams, 1973). От этого утолщения отходят несколько ресничек, которые могут быть длиной до 200 иш, а диаметром 0.1-0.2 мкм. Реснички содержат стандартный набор микротрубочек (9 пар+2), то есть такой же, как реснички в других тканях и покрыты слизью, выделяемой опорными клетками и боуменовыми железами.

Пахучие вещества сначала поглощаются слизью, и лишь затем проникают к ресничкам и концевому утолщению дендрита, где связываются с рецепторными молекулами в мембране. Распознавание молекулы запаха начинается с взаимодействия запаха и рецептора аналогичных взаимодействию антиген - антитело в имунной системе или нейромедиатор - рецептор в нервной системе (Lancet 1986; Shepherd, 1987). Это приводит к деполяризации рецепторного нейрона и генерации потенциалов действия (обзор литературы см. в Anholt, 1993; Minor, Kaissling, 2003). Электрический импульс по аксону приходит в обонятельные клубочки (гломерулы) - специфические структуры, которые, как считается, являются неотъемлемой структурной и функциональной частью обонятельной системы (Leise, 1990). Клетки обонятельного рецептора очень малы, и только в последнее время стало возможным непосредственное отведение потенциала от тела единичной клетки. Как и вкусовые рецепторные клетки, так и обонятельные рецепторные клетки не являются статичной популяцией нейронов. Они дифференцируются из базальных клеток-предшественников, и этот процесс продолжается в течение всей жизни. Просуществовав около 60 дней, клетки дегенерируют и подвергаются фагоцитозу.

У млекопитающих в дополнение к главной обонятельной системе имеется и дополнительная обонятельная система, которая начинается вомеронасальным органом. Его функции остаются совершенно неизвестными. Ранее считалось, что он детектирует феромоны (обзор литературы см. в Beauchamp et al., 1976). Однако в дальнейшем выяснилось, что нейроны основной обонятельной системы чувствительны к феромонам, а нейроны вомеронасального органа чувствительны к веществам, не относящимся к феромонам (Dorries et al., 1996).

Бросающиеся в глаза общие черты в организации обонятельных систем насекомых и позвоночных были давно замечены биологами. В дальнейшем, когда в орбиту исследований стали вовлекаться другие группы животных, например нематоды,

моллюски и ракообразные, оказалось, что некоторые черты обонятельных систем присутствуют всегда, вне зависимости от систематического положения и сложности организации животного. Что представляют