Физиологические процессы в периферическом вкусовом органе. Механизмы электрогенеза, возбудимости и афферентной нейропередачи

Романов, Роман Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологические процессы в периферическом вкусовом органе. Механизмы электрогенеза, возбудимости и афферентной нейропередачи
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физиологические процессы в периферическом вкусовом органе. Механизмы электрогенеза, возбудимости и афферентной нейропередачи"

На правах рукописи

Романов Роман Александрович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОМ ВКУСОВОМ ОРГАНЕ. МЕХАНИЗМЫ ЭЛЕКТРОГЕНЕЗА, ВОЗБУДИМОСТИ И афферентной нейропередачи.

Специальность 03.01.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРЕАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 б ДПР 2072

ПУЩИНО - 2012

005019693

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук.

Научный консультант: доктор биологических яаук, профессор

Колесников Станислав Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович, заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук;

доктор биологических наук, профессор Годухнн Олег Викторович, заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии яаук;

доктор биологических наук Антонов Сергей Михайлович, заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова Российской академии наук.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физиологии им. И.1Г. Павлова Российской академии наук

Защита состоится 24 мая 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт» биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г.Пущиад, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан: «_

2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Скголихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Современные представления о молекулярных механизмах вкусовой трансдукции практически полностью базируются на данных молекулярно-биологических исследований периферического вкусового органа и на системных физиологических данных, полученных с использованием генетически модифицированных животных (нокаут-ные (knock-out) и трансгенные мыши). Первые позволили идентифицировать во вкусовой ткани ряд потенциально важных сигнальных белков, а вторые (поведенческие эксперименты и регистрации электрической активности афферентных вкусовых нервов) позволили продемонстрировать ключевую роль ряда из этих белков в восприятии вкусовых стимулов той или иной модальности. В настоящий момент общепризнано, что следующие сигнальные белки играют основополагающую роль в трансдукции вкусовых стимулов - от распознавания во вкусовой поре до передачи информации на нервное окончание:

1) Два семейства гептаспиральных вкусовых рецепторов, включая примерно 30 рецепторов семейства T2R, распознающие горькие вещества, и три рецептора семейства T1R, формирующие один гетеродимерный рецептор сладкого (T1R2/T1R3) и один рецептор аминокислот (T1R1/T1R3).

2) Альфа субъединица G-белка гастдуцина (а-гастдуцин), фосфолипаза С |32, ионный канал TRPM5, knock-out каждого из которых приводит к снижению или даже полному подавлению чувствительности генетически модифицированных животных к горькому, сладкому и умами вкусам.

3) Канальные белки PKD2L1 и субъединицы эпителиального натриевого канала (ENaC). Генетический нокаут PKD2L1 приводит к снижению чувствительности животных к кислому, удаление альфа-субъединицы ENaC приводит к подавлению ами-лорид-зависимой компоненты физиологических ответов на соленые стимулы.

4) Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторы, локализованные на нервных окончаниях, инервирую-щих вкусовую почку, knock-out которых приводил к полному исчезновению вкусовой чувствительности у мышей.

С использованием иммуногистохимии и гибридизации in situ был проанализирован профиль экспрессии вышеупомянутых белков в популяции клеток вкусовой почки, что позволило сделать довольно убедительные заключения о физиологических функциях вкусовых клеток различных подтипов, идентифицированных ранее на основе ультраструктурных критериев. Выяснилось, что вкусовые клетки типа II вклю-

чают 3 субпопуляции, ответственные за рецепцию горького, сладкого и умами, соответственно; вкусовые клетки III типа отвечают за восприятие кислого, а клетки I типа выполняют функции глиальных клеток и соленого-чувствующих рецепторных. Таким образом, на сегодняшний день ясны основные функции для клеток каждого морфоти-па, однако при всей значимости данных последних лет, полученных методами молекулярной биологии, иммуногистохимии и генной инженерии, существующие представления о процессах возбуждения вкусовых клеток носят в значительной степени гипотетический характер. Характерным в этом отношении является пример а-гастдуцина и ионного канала PKD2L1.

Ген а-гастдуцина был первым геном, относящимся ко вкусовой системе, который был подвергнут генетическому нокауту (Wong et al, 1996). Оказалось, что га-стдуцин-нуль мыши в поведенческих экспериментах демонстрируют сильно подавленную чувствительность к горькому и сладкому, но не к кислому и соленому. О том, что такие аномальные поведенческие реакции нокаутных животных обязаны своим происхождением именно изменениям в периферической вкусовой системе, свидетельствуют подавленные реакции вкусового нерва на аппликацию горьких и сладких стимулов в полости рта (Wong et al, 1996). Следует отметить, что а-гастдуцин относится к Gj белкам и является близким гомологом а-трансдуцина - ключевого G-белка каскада фототрансдукции. На основании этих фактов долгое время считалось, по аналогии с фототрансдукцией, что гастдуцин сопрягает молекулярные рецепторы вкусовых веществ с каскадом циклических нуклеотидов. Однако в 2003 году (Zhang et al) было продемонстрировано, что нокаут фосфолипазы Ср2 также приводит к почти полной потере чувствительности у мышей к горькому и сладкому, что заставило пересмотреть роль а-гастдуцина. Последний в покое ассоциирован с р- и у-субъединицами в гетеротримерный G-белок, который при активации диссоциирует на гастдуцин и Ру-комплекс. Между тем, для 0,-бслков показано, что Ру-комплекс, входящий в их состав, может активировать фосфолипазу С. На основании этого было предположено, что в случае нокаута а-гастдуцина сохраняющиеся партнеры по гете-ротримеру (Ру-комплекс) могут поддерживать в покое высокую активность фосфолипазы СР2, что нарушает работу каскада вкусовой трансдукции. После того, как развитие инструментальных методов позволило начать эффективные исследования молекулярных механизмов вкуса на клеточном уровне (Clapp et al, 2008), обнаружилось, что а-гастдуцин, вероятно, представляет собой конститутивно активный G-белок, регулирующий уровень циклических нуклеотидов даже в покоящейся рецепторной

клетке, что отражается на чувствительности сенсорных клеток к вкусовой стимуляции.

В случае PKD2L было показано, что генно-модифицированные мыши, у которых удалены клетки, содержащие PKD2L1, полностью теряли чувствительность к кислому (Huang et al, 2006). Этот факт был расценен как свидетельство ключевой роли канального белка PKD2L в трансдукции кислого, поскольку PKD2L является субъединицей протон-активируемого катионного канала. Используя другие генно-инженерные подходы, позже было установлено, что PKD2L не имеет такого принципиального значения для трансдукции кислого - полученные Хуангом и соавторами результаты связаны, скорее всего, с тем, что именно РК02Ь-положительные клетки, относящиеся к типу III, являются кисло-чувствующими, и их разрушение естественно должно было подавить чувствительность животных к кислому.

Отметим также, что все больше накапливается фактов, которые свидетельствуют о том, что генетическое выключение одного гена может существенно влиять на активность экспрессии других генов. Таким образом, обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции необходимо проверять в физиологических экспериментах на уровне одиночных идентифицированных вкусовых клеток. Это целесообразно еще и потому, что именно при использовании такого подхода был достигнут заметный прогресс в области исследования сенсорных клеток других типов - фоторецеп-торных, обонятельных и механочувствительных клеток.

Совершенно неизученными остаются механизмы афферентной нейропередачи во вкусовых клетках типа II. Хотя эти клетки являются основными рецепторными для горького и сладкого вкуса, для них характерно отсутствие синаптических структур и других атрибутов классических химических синапсов, включая отсутствие пресинап-тических белков комплекса SNARE и потенциал-зависимых Са2+ каналов. Еще одна проблема заключается в том, что вкусовые клетки типа II электрически возбудимы, но в отсутствии аксонов и классических Са2+-зависимых синапсов совершенно непонятна необходимость генерации ими потенциалов действия. Надо отметить, что физиологическая роль электрической возбудимости во вкусовых клетках других типов также не ясна. Во многом остаются неизученными механизмы электрогенеза во вкусовых клетках и природа их ионной проницаемости. Крайне мало известно и о функциональных свойствах клеток типов I-III, что делает актуальным анализ физиологических особенностей каждого из них, поскольку ранее немногочисленные физиологические исследования проводились преимущественно с использованием неидентифи-цированных клеток вкусовой почки. Это делает целесообразным всеобъемлющее фи-

зиологическое исследование популяции клеток вкусовой почки млекопитающих.

Цель исследования.

Провести комплексный физиологический анализ гетерогенной популяции клеток вкусовой почки млекопитающих (на примере мыши) из желобоватого, листовидного и грибовидного вкусовых сосочков, используя современные методы клеточной и молекулярной физиологии, и тем самым решить ряд проблем физиологии периферического органа, включая выяснение механизмов афферентной нейропередачи вкусовой информации, механизмов электрогенеза вкусовых клеток и роли электрической возбудимости в их физиологии.

Основные задачи исследования.

1. С использованием методов флуоресцентной микроскопии провести анализ гетерогенной популяции одиночных вкусовых клеток и охарактеризовать

функционально клетки различных морфотипов. В частности, проанализировать

агонист-зависимую Ca сигнализацию во вкусовых клетках и исследовать механизмы Са2+ сигнализации.

2. Установить корреляции между фармакологическими, а также обнаруженными нами ранее электрофизиологическими портретами индивидуальных вкусовых клеток и профилем экспрессии генов определенных сигнальных и маркерных белков. Целесообразность выявления таких корреляций диктуется необходимостью установления функциональных критериев для идентификации и последующего исследования индивидуальных вкусовых клеток, применимых в физиологических экспериментах.

3. Провести сравнительный анализ механизмов электровозбудимости идентифицированных вкусовых клеток и, в частности, очертить спектр и охарактеризовать биофизические свойства ионных каналов, вовлеченных в генерацию потенциала действия во вкусовых клетках типа II и типа III.

4. Изучить механизмы афферентной нейропередачи во вкусовых клетках идентифицированных морфотипов.

5. Отработать методы исследования рекомбинантных канальных белков для создания биосенсоров и для сравнительного анализа ионных каналов вкусовых клеток in situ и в экспрессионной системе с целью изучения их биофизических свойств. Исследовать селективность, потенциалзависимость, термочувствительность, чувствительность к блокаторам некоторых из них.

6. Отработать методы мониторинга высвобождения сигнальных молекул из вкусовой почки и одиночной вкусовой клетки с использованием метода биосенсора -культивируемых клеток, эндогенно/экзогенно экспрессирующих молекулярные рецепторы к исследуемым агонистам.

Научная новизна работы.

На основе статистически репрезентативной серии экспериментов впервые предложены неинвазивные критерии для идентификации морфофункциональных типов вкусовых клеток. Впервые показано, что для клеток различных морфотипов, идентифицированных на основе специфических маркеров, характерен специфический спектр агонистов, способных стимулировать Са2+ сигнализацию. Ранее предложенные нами электрофизиологические критерии с учетом новых результатов по экспрессии специфических белков во вкусовых клетках, исследованных методом пэтч-кламп, позволили нам применить данные критерии для идентификации 3 известных морфофункциональных типов клеток вкусовой почки.

Впервые исследованы механизмы секреции АТФ вкусовыми клетками в ответ на вкусовую стимуляцию. Показано, что для нейропередачи используется АТФ мито-хондриального, а не гликолизного происхождения. Показано, что одиночные вкусовые клетки типа II высвобождают АТФ через потенциал-зависимые АТФ-проницаемые ионные каналы в ответ на деполяризацию плазматической мембраны -ключевого явления вкусовой трансдукции, опосредованного активацией катионного канала ТКРМ5. На основании экспериментов с животными с нокаутированным геном Рапх1, ингибиторного анализа, а также исследования свойств рекомбинантного Рапх1 впервые получены свидетельства, что канальный белок Рапх1, который рассматривался в качестве основного претендента на роль АТФ-проницаемого канала, не вовлечен в секрецию АТФ во вкусовых клетках типа II. Эти данные, а также ингибиторный анализ АТФ-проницаемых каналов вкусовых клеток свидетельствуют о том, что такие каналы формируются белками щелевых контактов - коннексинами.

Впервые исследована роль потенциалов действия (ПД) в афферентной нейропе-редаче во вкусовых клетках и, в частности, показано, что ПД обеспечивают квантовый характер высвобождения афферентного нейромедиатора АТФ из клеток типа II. Впервые разработана математическая модель потенциал-зависимой секреции АТФ при участии АТФ-проницаемых ионных каналов.

Исследована чувствительность вкусовых клеток к различным агонистам. Впер-

вые показано, что в клетках III типа функционально активен гептаспиральный рецептор внеклеточного кальция (CaSR), обеспечивающий чувствительность этих клеток к аминокислотам (глутамату, фенилаланину и аргинину) и дивалентным катионам. Показано, что клетки I типа отвечают на нейроактивные вещества (АТФ, АДФ, УТФ, ацетилхолин и карбахол, глутамат в микромолярных концентрациях) и горькое вещество денатоний мобилизацией внутриклеточного кальция и стимуляцией Са2+-активируемых СГ-каналов.

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты позволили сформировать совершенно новое представление о механизмах афферентной нейропередачи и межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Значительно расширены существующие представления о механизмах электрогенеза и возбудимости клеток вкусовой почки. В частности, впервые рассмотрена и экспериментально обоснована новая физиологическая функция потенциалов действия — регуляция и дискретизация невезикулярного высвобождения нейромедиатора. Методические разработки, использовавшиеся в работе, особенно метод биосенсора для мониторинга первичных медиаторов, включая АТФ и серотонин, могут представлять интерес для исследования других клеточных систем. Данные, полученные при исследовании рекомбинантного папнексина 1, могут быть использованы при выяснении физиологической функции этого канала в различных системах.

Личный вклад автора.

Все результаты по функциональному анализу вкусовых клеток с использованием широкого спектра методов (пэтч-кламп; флуоресцентная микроскопия, мониторинг внутриклеточного кальция, загрузка флуоресцентных зондов и красителей; математическое моделирование) были получены лично P.A. Романовым. Результаты экспериментов, выполненных при использовании сочетания биофизических методов с методами молекулярной биологии и культуры клеток, были получены совместно с O.A. Рогачевской и М.Ф. Быстровой.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на «X международном Съезде по биосенсорам» (Шанхай, Китай, 2008г.); на международном симпозиуме по TRP-каналам (Стокгольм, Швеция, 2009); на международной конференции «Новые горизонты в кальциевой сигнализации» (Пекин, Китай, 2010); на XXI съезде Европейской организации хеморецепторных исследований (Манчестер, Англия,

2011); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009, 2011гг.); на международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, Беларусь, 2008); на международной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.Петербург, 2009); на 20-том и 21-ом съездах физиологического общества им. И.ГТ. Павлова (2008, 2010); на V съезде Украинского общества нейронаук (Киев, 2011).

Публикации.

Основные результаты диссертации представлены в 42 печатных работах, в числе которых 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в книге, включенной в систему цитирования Web of Science, 5 статей в сборниках.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 214 страницах с использованием 74 рисунков, 3 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 337 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточный материал. Основные эксперименты проводились на одиночных вкусовых клетках, изолированных из желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков языка мыши дикого типа. В ряде экспериментов использовались линии генетически модифицированных мышей с нокаутированным геном гастдуцина (предоставлены Р.Ф.Маргольским), с нокаутированным геном паннексина! (предоставлены В.И.Шестопаловым).

Электрофизиология. Электрическая активность вкусовых клеток регистрировалась методом patch clamp (voltage-clamp, current clamp) в конфигурациях «whole-cell» и «perforated patch clamp», «cell-attached» и «inside out» с помощью усилителя Axopatch 200 В (Axon Instruments), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все «Axon Instruments», США). Эксперименты проводились при температуре 23-25 С. Система перфузии обеспечивала смену экстраклеточного раствора со скоростью 0,1-1 мл/с. При регистрациии в конфигурации «whole-cell» клетки диализовались раствором в составе (мМ): 140 KCl/CsCI, 2 MgATP, 0.5 EGTA или 10 ВАРТА, 10 HEPES-KOH. При использовании конфигурации «perforated patch clamp» регистрирующий электрод содержал (мМ): 140 KCl/CsCI, 1 MgCl2, 0.5 EGTA, 10 HEPES-KOH (CsOH), и 400 мкг/мл амфотерицина Б. Базовый внеклеточный раствор содержал (мМ): 140 NaCl, 1

СаС12, 1 MgCl2, Ю HEPES-NaOH. Когда было нужно, раствор модифицировался так что ионы Na+, К+ и/или СГ эквимолярно замещались на другие катионы и/или анионы. Для всех растворов pH 7,4.

Фотометрия. Для мониторинга внутриклеточного кальция в клетках использовали проникающие флуоресцентные зонды Fluo-4AM и Fura-2AM. Изменение концентрации цитозольного кальция визуализировали при помощи EMCCD-камеры Andor Ixon (Andor Technology) с использованием микроскопа Axioscope-2 (Zeiss). Флуоресценция возбуждалась при помощи программируемого осветителя на сверх-ярких излучающих полупроводниковых диодах с волоконно-оптическим выходом (Хохлов и др., 2007). Эмиссионное излучение фильтровалось интерференционными узкополосными фильтрами (Chroma) и последовательные флуоресцентные изображения регистрировались при помощи программы ImagingWorkBench 6.0 (INDEC Biosystems).

Биосеисоры. С целью создания клеточных биосенсоров было протестировано (совместно с Рогачевской O.A.) 8 эукариотических клеточных линий (COS-1, НЕК-293, СНО, нейробластома SK-N-SH, нейробластома IMR-32, глиобластома T98G, глиобластома Е PNT-5 и глиома С6), а также клетки СНО, трансфицированные одновременно Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторамми, на чувствительность к ряду нейромедиаторов, включая АТФ, серотонин, ацетилхолин, глутамат, норадреналин, ГАМК. Полученные данные показали, что клетки линии COS-1 с эндогенными Р2Y-рецепторами и СНО с экзогенными Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторамми могут выступать в качестве высокочувствительных и специфичных сенсоров для АТФ, а клетки линии глиомы С6 - для серото-нина. Поэтому клетки линии COS-1 и СНО, трансфицированные Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторамми, использовались для изучения механизма высвобождения АТФ, а клетки линии глиома С6 — для анализа высвобождения серотонина.

Фотолиз химических групп (uncaging). Осуществлялся за счет кратковременного (0.1-Зс) облучения ультрафиолетом (Х=355нм) при помощи лазера LCS-DTL-374QT ("Laser-export", РФ) клеток в исследовательской камере через объектив микроскопа. Для этого клетки предварительно загружались кальций-хелатирующим агентом NP-EGTA AM («Invitrogen», США). Для контроля изменений внутриклеточного уровня кальция клетки также загружали кальциевым зондом Fluo-4 AM; кальциевые сигналы визуализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Axioscope-2.

Гетерологическая система. При работе с рекомбинантными ионными каналами 1,6 мкг плазмиды pIRES2-EGFP с интересующим нас геном (trpmS, р2х2/р2хЗ,

panxl) и 4 мкл липофектамина («Gibco», США) добавляли к клеткам НЕК-293 и нейроблаетоме (в концентрации 3-5Х103 клеток на 35 мм чашку Петри). Для транс-фекции клеток линии СНО использовался трасфекционный агент Унифектин (Уни-фект, Россия). Регистрации проводились через 24-72 ч после трансфекции. Качество трансфекции предварительно оценивалось по интенсивности свечения GFP, либо по уровню кальциевых ответов на агонист (для Р2Х2/Р2ХЗ). Генно-инженерные конструкции были получены и предоставлены М.Ф. Быстровой. Клетки СНО, трансфи-цированные Р2Х2/Р2ХЗ рецепторами, оказались удобным клеточным АТФ-сеносором и наряду с клетками линии COS-1 применялись для исследования выброса АТФ из вкусовых клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация вкусовых клеток различных морфофуикциопальных типов с использованием электрофизиологических критериев. Ранее методом patch clamp мы проанализировали интегральные токи более чем в 1000 веретенообразных вкусовых клетках мыши и установили, что в псевдофизиологических условиях регистрации (п=564) (Рис.1), как и в условиях диализа 140 мМ CsCl (Рис.ЗА-С,с1) в ответ на импульсную стимуляцию для вкусовых клеток характерны 3 различных набора потенциал-зависимых (ПЗ) клеточных токов (Романов P.A., канд. дисс., Пущино, 2007). Кроме того, электрофизиологический анализ клеток из трансгенных мышей, у которых а-гастдуцин-положительные клетки экспрессировали зеленый флуоресцентный белок (GFP) свидетельствовал, что гастдуцин-положительные клетки являлись субпопуляцией одной из 3 обнаруженных нами групп вкусовых клеток, идентифицированных на основе электрофизиологических критериев (Романов P.A., канд. дисс., Пущино, 2007).

В рамках данной работы были выполнены эксперименты, в которых одиночные вкусовые клетки анализировались с использованием метода patch clamp, далее аккуратно засасывались в кончик регистрирующей микропипетки и предоставлялись для молеку-лярно-биологических экспериментов, в которых М.Ф. Быстровой анализировались транскрипты в полученных таким образом препаратах, содержащих мРНК одиночных вкусовых клеток (single cell ОТ-ПЦР). Совокупность полученных данных, а также некоторые специфические морфологические особенности регистрируемых клеток, позволили нам сформулировать однозначные электрофизиологические критерии для идентификации морфофункциональных типов клеток вкусовой почки (Рис.1). Так, клетки типа I, экс-прессирующие NTPD-a3y2 и характеризующиеся микровиллярным аппаратом с множе-

ством микровилл (различимого при использовании 63х объектива), демонстрировали ПЗ К+-токи и отсутствие ПЗ Na+-TOKOB. Клетки типа И, экспрессирующие а-гастдуцин, ТЖЗ-рецептор, TRPM5 и фосфолипазу С ß2, характеризовались наличием ПЗ Na -токов, относительно небольшой фракцией ПЗ К+-токов и заметных по амплитуде выходящих токов, транспортируемых неселективными ионными каналами. Для клеток типа III были характерны ПЗ Ка+-каналы, выходящие ПЗ К+-токи задержанного выпрямления, а также ПЗ Са2+-каналы и токи, активирующиеся длительной гиперполяризацией (HCN-токи). В этих клетках обнаружены транскрипты SNAP25 и PKD2L1. В множестве экспериментов хорошо определялась единственная микровилла — характерный морфологический критерий для идентификации клеток III типа.

Рисунок 1. На основании ионных токов, регистрируемых от вкусовых клеток в ответ на ряд последовательных, ступенчатых поляризаций от -100 мВ до 50 мВ, можно идентифцировать, к какому морфофункцио-нальному типу относится исследуемая клетка. В псевдофизиологических условиях регистрации для клеток типа I характерны лишь ПЗ выходящие токи К+ природы; для клеток типа II - входящий, быстро инактивирующийся ток через ПЗ Ыа+-канапы, относительно медленно активирующийся ток через неселективные каналы и значительные по амплитуде хвостовые токи, генерирующиеся при реполяризации клетки до Vi,=-70 мВ; для клеток типа III характерны ПЗ №+-каналы и К+-каналы задержанного выпрямления. Верификацией предложенной электрофизиологической идентификации служила корреляция экспрессии указанных на рисунке маркерных белков с электрофизиологическими характеристиками клеток.

Неинвазивная идентификация вкусовых клеток. Полученные выше критерии весьма удобны для идентификации вкусовых клеток 3 известных типов, однако, клетки, тестируемые методом patch clamp, оказываются менее чувствительными к агони-стам метаботропных рецепторов, чем в случае применения неинвазивного подхода, в частности, связанного с применением кальциевого имиджинга. Поэтому мы попытались найти корреляции между электрофизиологическими характеристиками и способностью клеток задействовать кальциевую сигнализацию на тот или иной химический стимул. Выяснилось, что поскольку Са2+-каналы присутствуют лишь в III типе и не функциональны в других, деполяризация вызывает хорошо-выраженные кальциевые ответы лишь в клетках III типа, тогда как наблюдаемый ПЗ кальциевый вход в клетках 1 и II типа очень мал или полностью отсутствует (Рис.2).

Тип 1 (темные) Тип II (светлые) Тип III

соленое горькое, сладкое,умами кислое

NTPD-aaa2

25 мс 13 Г" а-гастдуцин Т11ЧЗ-рецептор TRPM5 фосфолипаза С 152 1 ПЗ Са'-каналы ! SNAP-26 I PKD2L1 1 микровилла

-70 ИВ г

в -10 мВ _|_

• 10 -П.

30 1 5 мкМ иономицин П -70 мВ

25 мс 200 ра|

5 с

300 па _ ток

цитоэольный Ca -70 mb

5с

цитоэопьный Ca2*

] AF/Fo=0.5

_п_П_

цитозопьный Ca*'

Рисунок 2. Деполяризация вкусовых клеток сопряжена с повышением цитозольного кальция только в клетках III типа за счет активации ПЗ кальциевых каналов. А, В -репрезентативные одновременные записи ионных токов и флуоресценции клеток III типа, загруженных FIuo-4 (п=24). Деполяризация вкусовых клеток этого типа до -10 мВ на 100 мс вызывает активацию ПЗ Са2+-тока (А, пунктир), который приводит к генерации кальциевого пика (В); С - репрезентативная запись кальциевого сигнала в клетках I типа в ответ на деполяризацию (п=11); D и Е - репрезентативные записи ионных токов (средняя панель в D) и флуоресценции Fluo4 (D и Е) в клетках II типа (л = 21). В отличие от иономицина, 2-е деполяризация не влияла на уровень свободного внутриклеточного кальция в 17 из 21 клетки (D). В 4 случаях деполяризация вызывала небольшое увеличение во флуоресценции клеток II типа (Е).

Поэтому, клетки III типа могут быть неинвазивно идентифицированы по резкому увеличению цитозольного кальция в ответ на увеличение концентрации экстракле-

точного калия до 50 мМ, приводящего к деполяризации клеток (Phc.3C,D).

Рисунок 3. Ответы вкусовых клеток различных типов на KCl и АТФ. (А-С) - последовательные изображения 3 клеток, загруженных Fluo4, полученные: (а) в контрольных условиях (Ь) после аппликации 50 мМ KCl и (с) после аппликации 10 мкМ АТФ. A-C,d - электрофизиологические характеристики клеток из А-С в условиях С8+-диализа. D, Е -ответы вкусовых клеток идентифицированных типов на 50 мМ KCl и на 10 мкМ АТФ, соответственно; вставка на правой панели в Е - усредненные ответы на 10 мкМ АТФ только АТФ-чувствительных клеток.

С другой стороны выяснилось, что из 49 клеток, электрофизиологически идентифицированных как тип I, 40 клеток (82%) генерировали (Д/7Я)>1) кальциевые ответы на 10 мкМ АТФ (-ЕС70 для клеток I типа) со средними ответами

ДГ/Ю=1.18±0.15 (Рис. ЗА,Е). 9 клеток типа I и подавляющее большинство клеток других типов были не способны отвечать на АТФ, либо отвечали слабо (Рис.ЗЕ, правая панель). Таким образом, 50 мМ KCl и 10 мкМ АТФ позволяют идентифицровать одиночные вкусовые клетки I и III типов, а также предварительно очертить популяцию клеток II типа в препарате.

Для идентификации клеток типа II, а также субпопуляции функционально активных горько-чувствующих клеток данного типа была разработана оригинальная методика, основанная на способности данных клеток поглощать внеклеточные флуоресцентные красители при деполяризации (Рис.9). Данный подход представлен на Рис. 10 с соответствующими комментариями в тексте.

Функциональный анализ клеток I типа. Известно, что тип I наиболее представлен в составе вкусовой почки, и по данным морфологических исследований этих клеток в составе вкусовой почки более 40% (Finger, 2005). Помимо солено-рецепторной функции эти клетки наделяют глиальными функциями в связи с некоторыми особенностями: 1) наличием крыловидных отростков, изолирующих клетки других типов вместе с нервными окончаниями; 2) экто-АТФ-апиразы ЫТРО-азы2, гидролизующей экстраклеточный АТФ, высвободившийся в межклеточное пространство в акте афферентной нейропередачи; 3) специфического для глии глута-мат/аспартат транспортера (GLAST), утилизующего внеклеточный глутамат, который, по-видимому, выполняет функцию эфферентного нейромодулятора (Vandenbeuch et al, 2010). В экспериментах на одиночных клетках I типа мы показали, что АТФ и глутамат, а также ацетилхолин и ряд агонистов P2Y рецепторов вызывают мобилизацию внутриклеточного Са2+ с последующей стимуляцией Ca -активируемых СГ-каналов (Рис.4). Предполагается, что данные сигнальные пути связаны с реализацией обратных связей, в частности при афферентной нейропередаче. Учитывая, что АТФ выполняет функцию вкусового афферентного нейромедиатора, мы сосредоточили внимание на исследовании пуринергической сигнализации в клетках I типа. Выяснилось, что эффективными агонистами являлись АТФ, УТФ, АДФ, а также Bz-АТФ в субмиллимолярных концентрациях (Рис.4А-Е), тогда как агонист Р2Х-рецепторов ß,y-Methiylene-D-AT® не вызывал ответов. Анализ данных позволил заключить об участии в клеточных ответах P2Y рецепторов P2Y2, P2Y1 и, предположительно P2Y4 изоформ, действие которых опосредовано активацией фосфоино-зитидного каскада, выходом кальция из депо и его входом через SOC-каналы, что приводит к активации кальций-акгивируемого хлорного канала, чувствительного к

блокатору анионных каналов 9-АС.

-100 | -100

время, с

10 мкМ АДФ

10 мкМ АТФ

300 мкМ BZ-АТФ 1 м»М АТФ300 l"lJlf BZ-АТФ + i мкМ АТФ

10мШАТФ карбахол

ЮмкМ АТФ

50 млМ_глутамат

30 с .

«л 4BF,

Н-\

карбахол, мкМ: 10 \

\Ca¿ 100 мМ

1 1 ю ЮО 1GOO

Карбахол. мкМ

0.5 50

10 мкМ АТФ 50 мкМ глутамат

Л/""»

» 50 пА

Рисунок 4. (А-Е) - АТФ, УТФ, АДФ и BZ-АТФ индуцируют входящий анионный ток в клетках I типа, сопряженный с активацией Р2У-рецепторов и фосфоинозитидного каскада. А - токовые, ответы клетки типа 1 на аппликацию АТФ и их наложение друг на друга. В - АТФ и УТФ в насыщающих концентрациях вызывают одинаковые по амплитуде ответы; С - АДФ вызывает меньший ответ, чем АТФ, В — в некоторых клетках АТФ и АДФ активируют ток с примерно равной эффективностью; Е - Bz-АТФ активирует входящий ток в клетках I типа, хотя ответ на смесь Bz-АТФ и АТФ меньше по амплитуде, чем только на АТФ, что свидетельствует о частичном антагонизме Bz-АТФ; F - генерация входящего тока и повышение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток типа I в ответ на аппликацию карбахола; G - аппликация 50 мкМ глутамата, как и АТФ, вызывает Са2+ответы и активацию входящего тока во вкусовых клетках типа I.

Анализ вкусовых клеток на чувствительность к горькому выявил особенность,

ранее не отмеченную в литературе: горькое вещество денатоний в миллимолярных концентрациях вызывало кальциевые ответы преимущественно в клетках I типа, где стимулировало активацию фосфоинозитидного каскада, мобилизацию цитозольного кальция и активацию СГ-канала (Рис.5). Данные ответы наблюдались и в клетках I типа из животных с нокаутированным а-гастдуцином, что исключало возможность того, что данные ответы являются вторично сгенерированными, так как клетки II типа в этих животных десенситизированы и вряд ли могли вызвать последующую реакцию

у клеток типа I, например, за счет высвобождения АТФ. Роль данной чувствительности не ясна, однако сам факт говорит о невозможности использования денатония в качестве вкусового стимула для исследования трансдукционных механизмов на не-идентифицированных клетках, что является достаточно распространенной исследова-

тельской практиком.

А АТФ горькая смесь

дикий тип

АТФ горькая смесь

нокаут ((-гастдуцина

контроль__1П мкм АТФ 1 мМ денатоний

1 мМ денатоний &

1 мМ циклогексимид ° 30 с

ЛР/Ро=0.з|

0.01 0.1 ™1......"10

денатоний, мМ

10 мкМ АТФ 3 мМ денатоний сладкая смесь

5 мин с 1173122 25 с ЛК'Г =1,5 !

Рисунок 5. Ответы популяции клеток типа I на денатоний. А - репрезентативные ответы клеточной популяции на 10 мкМ АТФ и смесь горьких веществ, включающую 0,1 мМ циклогек-симида, 1 мМ денатония, 1 мМ октаацетата сахарозы. Из 44 одновременно регистрируемых клеток 12 оказались чувствительны к АТФ и 9 из них отвечали на горькую смесь веществ; В - в репрезентативной популяции из 36 клеток, выделенных из желобоватого сосочка гасту-цин-/- мышей, 7 клеток отвечали на 10 мкМ АТФ (слева). 5 из них также отвечали на смесь горьких веществ (правая панель). АТФ-нечувствительные клетки з данного препарата не реагировали на стимуляцию горькими веществами. С - последовательные ответы клеток I типа на смесь горьких веществ в контроле (слева) и после 5 минутной предъинкубации с 8 мкМ 1173122 (справа). Клетки I типа идентифицировались по значительным ответам на 10 мкМ АТФ перед стимуляцией горькими веществами; О — кадры с клеткой типа I, прокрашенной Р1ио-4, в проходящем свете (а), в контроле (Ь), после аппликации 10 мкМ АТФ (с) и 1 мМ денатония (ф; Е - последовательные кальциевые ответы клетки, изображенной в А; Р -нормированная кривая доза-ответ для денатония, аппроксимированная при помощи уравнения Хилла с Ь=1,3 и концентрацией полуэффекта 2,6 мМ. С - одновременная регистрация от 4 клеток I типа, стимулированных АТФ, денатонием и смесью сладких веществ. Клетки были частью популяции из 21 клетки, включающей 6 АТФ-отвечающих, 4 из которых, представленных на рисунке, были также чувствительны к смеси горьких веществ.

Функциональный анализ клеток II типа. Клетки II типа представляют наибольший интерес для исследователей, поскольку включают в себя 3 субпопуляции - горько-чувствующие, сладко-чувствующие и клетки, рецептирующие аминокисло-

ты (вкус «умами»). Согласно данным по генетическому нокауту TRPM5 и свойствам рекомбинантного канала гипотетическая схема трансдукции для вкусовых стимулов категорий «горькое», «сладкое» и «умами» включает в себя активацию TRPM5 и клеточную деполяризацию как абсолютно необходимый этап, однако исследование физиологической активности TRPM5 во вкусовых клетках фактически отсутствовало, поскольку долгое время не было известно ни одного специфического блокатора TRPM5. Ранее нам удалось зарегистрировать иономицин-стимулируемый катионный ток с выраженной термочувствительностью и выходящим выпрямлением в клетках, которые по электрофизиологическим характеристикам могут быть отнесены к типу II. На основании катионной селективности и высокой термочувствительности исследуемых каналов, а также факта экспрессии гена TRPM5 во вкусовых клетках (Perez et al, 2002), иономицин-стимулируемые ионные каналы вкусовых клеток были отнесены к TRPM5 (Романов P.A., канд. дисс.).

Данная работа подтверждает наличие функционально активных ионных каналов TRPM5 в клетках типа II. Так, ток, активируемый увеличением цитозольного кальция вследствие добавления иономицина, ингибировался недавно обнаруженным блокато-ром TRPMS-каналов оксидом трифенилфосфина (Рис.бА), который в наших экспериментах эффективно ингибировал рекомбинантный TRPM5, клонированный из вкусовых клеток, в аналогичных концентрациях.

Поскольку кальциевый ионофор иономицин обладает рядом артефактных свойств, связанных, например, с активацией некоторых эффекторных молекул, в наших экспериментах мы использовали альтернативный инструментарий для увеличения концентрации цитозольного кальция - фотолитическое высвобождение кальция в клетках (uncaging) (Рис.бС), которое вызывало активацию аналогичного тока, инги-бируемого оксидом трифенилфосфина. Регистрируемые каналы были неселективны по отношению к Na+ и Cs+, но непроницаемы для NMDG+ (Рис.бВ); имели вольт-амперную характеристику выходящего выпрямления и высокую термочувствительность (Q10 = 6.7 ± 0.5) (Рис.бВ). Существенно, что TRPM5 были специфичными для клеток II типа: повышение внутриклеточного уровня кальция при помощи фотолиза вызывало появление хлорного тока в клетках I типа и не оказывало влияния на базовый ток в клетках III типа (Phc.6E,F).

Трудно объяснимым фактом было отсутствие в клетках II типа классических синаптических структур, то есть не было ясно, каким образом клетки II типа передают вкусовую информацию на вкусовые нервные окончания. В связи с этим, мы исследовали секрецию АТФ вкусовыми почками и одиночными идентифицированными

вкусовыми клетками с использованием метода клеточных АТФ-биосенсоров - клеток линий COSI (Рис.7) и Р2Х2/Р2ХЗ-трансфицированных клеток линии СНО).

100 150 200

Рисунок 6. Активность ионных каналов TRPM5 во вкусовых клетках II типа. А - иономи-цин-стимулируемая активация TRPM5 и его блокирование 100 мкМ оксидом трифенилфос-фина (ТФФО) во вкусовых клетках типа П; В, слева - TRPM5-tokh в условиях 140 мМ Na+ во внеклеточном растворе и при его замене 140 мМ NMDG+, справа - температурная зависимость активности TRPM5 каналов во вкусовых клетках П типа; С - активация TRPM5 с помощью фотовысвобождения (uncaging) кальция во вкусовых клетках из кальциевого хелато-ра NP-EGTA; D - вольт-амперные характеристики интегрального тока в клетках II типа до (1) и после (2) активации в (С). E,F -отсутствие активации ионных каналов TRPM5 под действием кальция во вкусовых клетках I и П1 типов (серые линии - изменение кальция, черные — ток). Е - активация входящего анионного ТФФО-нечувствительного тока в клетках I типа с помощью фотовысвобождения кальция; F - вход кальция в клетки III типа через потенциал-зависимые кальциевые каналы в условиях деполяризации (1) и отсутствие влияния фотоли-тического высвобождения кальция (2) в клетках III типа на базовый ток в этих клетках.

Согласно ранее проведенным нами экспериментам на электрофизиологически идентифицированных клетках, когда высвобождение АТФ из вкусовых клеток электрически стимулировалось с использованием метода patch clamp, лишь клетки типа II высвобождают АТФ в ответ на деполяризацию до потенциалов 0-50 мВ. Как оказалось, выброс АТФ клетками типа II не зависел от кальция, что свидетельствовало против классического Са2+-зависимого везикулярного механизма - диализ вкусовых клеток быстрым кальциевым хелатором В APTA (ЮмМ) и снижение концентрации свободного Са2+ в экстраклеточной среде до 100 нМ не вызывало подавления кальциевых ответов COS-1 клеток в ответ на стимуляцию вкусовых клеток II типа. В то же время АТФ-высвобождение строго зависело от потенциала с порогом около -10 мВ, что служило свидетельством в пользу высвобождения АТФ через ионные каналы с

заметной нелинейной вольт-амперной характеристикой (Романов P.A., канд. дисс., Пущино, 2007).

Дополнительным подтверждением против везикулярного высвобождения АТФ вкусовыми клетками типа II является то, что деполяризация этих вкусовых клеток до потенциалов, при которых наблюдается выброс АТФ, в большинстве случаев не сопровождается повышением внутриклеточного уровня кальция (Phc.2D,E).

Высвобождение АТФ, даже более выраженное, наблюдалось нами в экспериментах, в которых мы не использовали метод patch clamp для электрической стимуляции, так что вкусовые клетки не подвергались процедуре образования гигаомного контакта, связанной с частичным разрушением цитоскелета и клеточной декомпартментали-зации. В данных опытах, где вкусовые почки (п=34), а также вкусовые клетки типа II (п=28) стимулировались деполяризующим раствором, содержащим 50-100 мМ KCl, практически во всех случаях наблюдался выброс АТФ в межклеточное пространство, детектируемый клетками АТФ-сенсорами (Рис. 7). При регистрации данного явления от вкусовых почек мы использовали также их вкусовую стимуляцию - горьким веществом (0,1 мМ циклогексимид) и смесью сладких (1 мМ аспартам, 0,1 мМ неотам, 0,3 мМ SC45647). Из 18 протестированных почек 5 ответили на вкусовые стимулы высвобождением вкусового афферентного нейромедиатора (Рис. 7). Отметим, что ни раствор с повышенной концентрацией KCl, ни вкусовые вещества не вызывали сами

Рисунок 7. Высвобождение АТФ из вкусовой почки в ответ на деполяризующий и вкусовой стимулы. Слева вверху - фотография в проходящем свете вкусовой почки и рядом расположенных 2 клеток COS-1; нижний ряд - псевдоцветные изображения, полученные при регистрации флуоресценции кальциевого зонда Fluo4 от клеток COS-1. Справа вверху - запись изменения кальция при стимуляции в верхней клетке АТФ-сенсоре, представленной на фотографиях. Цифры отражают время, когда были получены кадры нижнего ряда.

В случае если вкусовые клетки действительно используют неселективные каналы с крупной порой для высвобождения АТФ в ответ на деполяризующий и вкусовой стимулы, то такие каналы должны быть проницаемы не только для АТФ, молекулярная масса которого ~600Да, но и для других более мелких молекул. Так, например, для каналов, формируемых коннексинами, показана проницаемость для молекул ве-

по себе реакции в тестируемых клетках-сенсорах.

вкусовая

почка

COS-1

10 мкм

70 мМ KCl

0.1 мМ циклогексимид

50 с AF/F,=1

сом до 1 кДа, включая АТФ, cAMP, IP3 и ряд флуоресцентных трейсеров.

Поэтому свидетельством в пользу канальной гипотезы высвобождения АТФ из вкусовых клеток был бы вход в клетки крупных отрицательно заряженных флуоресцентных молекул, находящихся в наружном растворе. Действительно, красители Lucifer Yellow, флуоресцеин и карбоксифлуоресцеин аккумулировались во вкусовых клетках II типа при их деполяризации, что выражалось в появлении яркого свечения клеток данного типа во флуоресцентном микроскопе (Рис.8 для LY). Зависимость от потенциала выброса АТФ и входа в клетки флуоресцентных красителей, а также факт, что деполяризация необходима для адекватной вкусовой трансдукции, но сама по себе не приводит к увеличению цитозольного кальция в отличие от клеток III типа (Рис.2), подтверждают гипотезу о том, что АТФ во вкусовых клетках высвобождался через специфические ПЗ ионные каналы.

Способность клеток типа II засасывать из наружной среды отрицательно заряженные флуоресцентные красители при активации потенциал-зависимого АТФ-проницаемого ионного канала была использована при разработке неинвазивной идентификации клеток типа II. Для этого покровное стекло с иммобилизоваными клетками на 30 с помещалось в раствор с повышенной концентрацией KCl (деполяризующий раствор), содержащий карбоксифлуоресцеин, а затем после отмыва клетки исследовались во флуоресцентном микроскопе. При возбуждении синим светом (480 нм) в препарате наблюдались зеленые клетки, которые можно отнести к типу II (Phc.9B-F).

Рисунок 8. Аккумуляция Lucifer Yellow (LY) вкусовыми клетками. А -протокол загрузки LY. Вверху: потенциал вкусовой клетки во времени; после деполяризации до 50 мВ клетки реполяризовались в 2 стадии (верхняя вставка) для уменьшения выхода отрицательно заряженного LY через деактивирующиеся каналы. Внизу - концентрация LY в камере; В - Клетка типа II в проходящем свете перед инкубацией с LY (i), в эпи-флуоресцентном свете после инкубации с LY при поддерживаемом потенциале -70 мВ (ii), и после инкубации с LY при серийной деполяризации. С - интегральные токи, записанные от клетки, представленной в В до и после загрузки LY. D - вкусовые клетки типов III (i) и I (ii) не аккумулировали LY в ответ на серийную деполяризацию (темные вставки - фото во флуоресцентном свете).

Для контроля на мертвые клетки покровное стекло с данными вкусовыми клетками предварительно помещали в стандартный внеклеточный раствор, содержащий бромид этидия, так что некротические клетки идентифицировались по ярко красным ядрам, а, предположительно, апоптотические, с активизированными неселективными каналами можно идентифицировать по слабому красному свечению во всем объеме клетки. При использовании эмиссионного фильтра, пропускающего зеленый и красный цвета, неповрежденные, физиологически интактные клетки типа II идентифицировались по зеленому цвету без примеси красного. Для идентификации популяции горько-чувствующих клеток типа II раствор с карбоксифлуоресцеином содержал не повышенную концентрацию калия, а горькое вещество циклогексимид (Рис. 9Н). Идентифицированные таким образом клетки могут быть использованы в качестве мишени в дальнейшем исследовании вкусо-зависимых кальциевых сигналов при помощи кальциевого зонда Fura-2, спектрально отличающегося от карбоксифлуоресце-ина (Phc.9G). Мы обнаружили также, что помимо карбоксифлуоресцеина и Lucifer Yelow могут использоваться флуоресцентные зонды, в частности, Mag-fura-2.

Рисунок 9. Неинвазивный подход, позволяющий идентифицировать вкусовые клетки типа II. А,С - фотография в проходящем свете вкусовых клеток из грибовидных (А) и желобоватого (в) сосочков. В-Е - флуоресцентные изображения клеток из грибовидных (В), листовидных (С,О) и желобоватых (Е,Е,Н) сосочков. В (В-Е) клетки стимулировали деполяризующим раствором, содержащим кар-боксифлуоресцеин (зеленая флуоресценция без примеси красной). В качестве контроля на неспецифическое окрашивание, характерное для поврежденных и мертвых клеток использовали стандартный внеклеточный раствор, содержащий бромид этидия (красная флуоресценция). В (в-Н) для идентификации горько-чувствующих клеток типа II стандартный внеклеточный раствор с карбоксифлуоресцеином содержал 0.1 мМ циклогексимид. I - псевдоцветное изображение клеток из (С,Н) полученное при регистрации флуоресценции кальциевого зонда Рига-2 (ех=380 нМ).

Итак, вкусовые клетки типа II при деполяризации с одной стороны высвобождают АТФ в межклеточное пространство, а с другой - засасывают непроникающие флуоресцентные красители из наружного раствора. В клетках типа II функционируют относительно медленно активирующиеся ионные каналы, природа которых не была установлена. С учетом того, что для этих каналов характерна зависимость от потенциала (в-частности, порог активации), сходная с таковой для высвобождения АТФ, вполне можно предположить, что ПЗ выходящие токи в клетках II типа могут быть ответственны за транспортировку молекул АТФ в экстраклеточное пространство, как и за вход флуоресцентных трейсеров. Согласно данному предположению, регистрируемые в клетках типа II ионные каналы должны быть проницаемы для крупных молекул (включая АТФ) и характеризоваться высокой проводимостью одиночного кана-

Данные, представленные на Рис.ША и В, в которых анализировалась селективность каналов путем замены наружного аниона СГ (М\\'=35,5г/моль) на глюконат (М\¥=Т95г/моль), а также внутриклеточного Сэ+ (Муу=ТЗЗг/моль) на (Мш=195г/моль) было бы сложно объяснить, если не допустить, что ток во вкусовых клетках типа II транспортируется неселективными ионными канатами, которые проницаемы для катионов и анионов, включая Се4", Ыа+, СГ, КМБО+ и глюконат.

Нормированный ток

Ыа-д|исопа:е(Х:,'

ТОК, НА

Дисперсия тока. пА*

5000

-40 40 -100 -50 Мембранный потенциал, мВ

0 500 1000 1500 Средний ток. пА

Рисунок 10. Оценка селективности и проводимости медленно активирующихся каналов клеток типа II. А - замена наружного СГ (•) на глюконат" (о) в условиях диализа клеток СэС1 (левая панель) и ЫМПО-С1 (правая панель) не приводила к исчезновению выходящей компоненты тока. При этом средние амплитуды ПЗ выходящих токов при Ус=50 мВ сопоставимы в условиях 140 мМ СзСГ„ и 140 мМ ИМВСОш (В); С - экспериментальная зависимость дисперсии тока (•) от средней величины интегрального тока, оцененная по хвостовым токам, генерируемым в ответ на реполяризацию клеточной мембраны от 30 мВ до -70 мВ. Непрерывная кривая соответствует В = И - Í2N приЫ= 151 и I— 10.8 пА.

Используя нестационарный флуктуационный анализ (Sigworth, 1980) хвостовых

токов, регистрируемых в Сз;„/гЫаоц4 градиенте, мы оценили проводимость одиночного

канала ¡=178 ± 21 пСм (Рис.9С). Более того, мы продемонстрировали в прямом эксперименте проницаемость ПЗ каналов клеток типа II для АТФ. Так, в симметричных условиях регистрации, когда внутрипипеточный и наружный растворы включали в состав только магниевую соль АТФ, оттитрованную до нейтрального значения рН (7.2) при помощи водного раствора а затем отфильтрованную от нерастворен-

ных частичек К^О, мы наблюдали соответствующие медленно активирующиеся токи при деполяризации, а при реполяризации — хвостовые токи, характеризующиеся по сравнению с нескомпенсированными емкостными явлениями более медленной кинетикой (Рис.11А). Поскольку среди основных носителей заряда в растворе присутствовали лишь в качестве катиона и 1у^АТФ2~ в качестве аниона, очевидно, что и/или М^АТФ2 транспортируют регистрируемые токи. Когда состав наружного раствора менялся на таковой, но разбавленный водой в 4 раза, мы наблюдали снижение амплитуды и смещение потенциала реверсии в более положительную область потенциалов (Рис. 11В). Согласно известному уравнению Голдмана следовало, что данные каналы проницаемы для MgATФ2- и при этом использование разных методов

обработки результатов давало оценку Ратф/Рмщ в диапазоне от 1.8 до 5.

затем заменялся на 50 мМ MgAT®+50 мМ Mg(OH)2. В - I-V характеристики токов в (А). Из-за краткого времени жизни данного препарата, последовательное сопротивление и клеточная емкость не компенсировались.

Следующей нашей задачей было выяснить молекулярную основу АТФ-проницаемых каналов, ответственных за афферентную нейропередачу в клетках типа II. Среди данных каналов - некоторые анионные каналы, а также конпексиновые и паннексинновые полупоры. Отсутствие значительных эффектов блокаторов анионных токов исключило возможность участия анионных каналов в выбросе АТФ (Рис. I2B), делая наиболее вероятными кандидатами полупоры, сформированные множеством различных коннексинов (Сх) или паннексином! (Panxl).

Рисунок 11. ПЗ токи в клетках II типа, диализованных и перфу-зируемых MgATO+Mg(OH)2. А

- репрезентативные интегральные токи (п=4), записанные от одной клеткив растворе с 50 мМ К^АТФ+50 мМ Mg(OH)2 (вверху) и 12,5 мМ К^АТФ + 12,5 мМ Mg(OH)2 (внизу). В пипетке

- 50 мМ 1^АТФ+50 мМ Mg(OH). При образовании «whole cell» в наружном растворе было 140 мМ NaCl, который

Для того, чтобы определить наиболее вероятного претендента из оставшихся, мы охарактеризовали фармакологический профиль АТФ-проницаемых каналов вкусовых клеток, протестировав ряд веществ, ингибирующих активность различных полупор, включая лантаноиды, хинин, октанол, а также специфические пептиды 32йАР27 к коннексину 32, ОАР26 к коннексину 43, 1 ОРх 1 к паннексинуК 100 мкМ Ьа3+, Ос13+ и хинин не действовали на выходящие токи клеток типа II (Рис.12С), 1 мМ хинин оказывал слабо выраженный блокирующий эффект на ПЗ ток этих клеток. Октанол (ЗмМ), неспецифичный ингибитор коннексинов, и 43ОАР26 сильно подавляли выходящий ток (Рис. 12А,Э,Е), тогда как 500 мкМ 32ОАР27, 300 мкМ 1 ОРх 1, 20 мкМ кар-беноксолон фактически не влияли на выходящие токи во вкусовых клетках (Рис. 12А,0,Е, 13С).

100 мВ___ ili==

Г Г

| 2 нА

30 мс

500 мкМ GAP26 3 мМ октанол 300 мкМ Рх1

Нормированный ток 1

f ■"— /

контроль 0.5 мМ нифлумовая кислота 0,5 мМ NPPB 0,5 мМ SITS 1 мМ Э-АС 0,5 мМ DID!

-50 0 50

Мембранный потенциал, мВ

контроль -«>- 100 мкМ хинин -г- 100 мкМ в<13* -о- 100 мкМ 1_а3<

-•-контроль -0-0,5 мМ 43GAP26 3 мМ октанол

■ 0.5

-о- 0,5 мМ GAP27

-О- ЮмкМКБХ

0 50 .100 -50

Мембранный потенциал, мБ

■ 0.5

£ 800 I 600

ее о

1400 'I 200

* ¥

Рнсунок 12. Действие блокаторов на ПЗ выходящие токи во вкусовых клетках II типа. А -репрезентативные записи ПЗ токов в контроле (верхние панели) и после 10 мин инкубации с Сх-специфическим пептидом 43САР26 (0,5 мМ, п=21), 3 мМ октанолом (п=11), Рапх-специфическим пептидом 1 ОРх 1 (300 мкМ, п=9) и 20 мкМ карбеноксолоном. Записи зарегистрированы от 4 разных клеток. В - действие блокаторов СГ каналов на ПЗ АТФ-проницаемые токи клеток типа II. -1-У характеристики интегральных токов клеток типа II в контроле и в присутствии ингибиторов полупор на интегральные токи. Для пептида 43САР26 - инкубация 10 мин, для 10 мкМ КБХ - 30 мин. О - ПЗ токи, регистрируемые при 100 мс деполяризации до 20 мВ в контрольных клетках (п=32) и клетках, пре-инкубированых в течение 30 мин с 10Рх1 (300 мкМ, п=7) и43ОАР26 (300 мкМ, п=12).

43вАР26 подавлял выход АТФ в той же временной шкапе, что и ПЗ ток (Рис.13А,В). В то же время, присутствие 300 мкМ 10Рх1, как и 5 мкМ карбеноксолона в исследовательской камере одинаково слабо влияло и на ток, и на выброс АТФ (Рис. 13В,С). Согласно ингибирующему эффекту 43ОАР26, можно было бы предположить, что АТФ-проницаемые каналы клеток типа II являются Сх43. Однако реком-бинантные коннексоны Сх43 блокируются ЫРРВ, Ьа3+ и вс!3+ - такие данные плохо согласуются с гипотезой, что Сх43 один в виде гомогексамера ответственен за ПЗ выходящие токи и высвобождение АТФ в клетках II типа. Потенциально, Сх43 с другими коннексинами может образовывать гетеромультимерные полупоры, либо иАР26 ингибирует коннексины, содержащие аминокислотный мотив ЭНУЯ, на основе которого и был сконструирован пептид 43САР26. А

контроль 0,5 ММ 43ОАР26

1°

1 с ЮсУ

30 с 10 мин

после аппликации 43ОАР26

« 1'2 1

5 10 | °"8

1 0.6 Р 0,4

§ 0.2 5 О,

300 мкМ 10Рх1

■ АТФ-ответ Ш выходящий ток

Время, мин

контроль 20 мин

10 мин 30 мин

инкубация с 5 мкМ КБХ

Рисунок 13. Действие блокаторов полупор одновременно на интегральный ток и АТФ-высвобождение в клетках II типа. А - действие 4'САР26 на выходящий ток и ответы клеток АТФ-сенсоров, вызванные деполяризацией вкусовой клетки до 10 мВ; В - сравнение дей-

ствия 43САР26 (300 мкМ, «,о, п=14) и 10Рх1 (300 мкМ, т,Д, п=9) на ПЗ выходящие токи

(•,▼) и ответы АТФ-сенсоров (о,Д); С — выходящий ток и АТФ-высвобождение не чувствительны к 5 мкМ КБХ.

С учетом широко распространенного мнения, что именно паннексин! может

быть основным транспортером АТФ во вкусовых клетках, мы в попытке оценить от-

носительный вклад коннексиновых и паннексиновых полупор в высвобождении АТФ из вкусовых клеток типа II разработали математическую модель, чтобы описать ответы клеток АТФ-сенсоров, которые использовались для мониторинга внеклеточного

АТФ, секретируемого клетками типа II. В модели постулировалось, что АТФ может

высвобождаться через каналы двух кинетически различных типов - Сх- и Рапх1-

подобных. В соответствии со свойствами рекомбинантных каналов для коннексино-

вых полупор постулировалась медленная активация, отсутствие инактивации и отно-

сительно медленная деактивация, приводящая к генерации хвостовых токов. Для

Рапх1 -каналов предполагалась медленная инактивация и практически мгновенные активация и деактивация. Поэтому для паннексина1 и при длительной, и при кратковременной стимуляции характерна колоколо-образная зависимость количества высвободившегося АТФ от потенциала, так как, несмотря на увеличение проводимости, с усилением деполяризации падает электродвижущая сила для АТФ. В то же время для коннексиновых каналов характерно, что при длительной стимуляции (когда время стимуляции во много раз превышает время полу-деактивации каналов) эта зависимость будет иметь вид колокола, а при повторяющейся кратковременной стимуляции (когда время стимуляции сопоставимо со временем полу-деактивации каналов) - 51-образный вид, так как больший вклад в количество высвободившегося АТФ начинают вносить хвостовые токи, высвобождающие АТФ в условиях многократно возросшей электродвижущей силы (У= -70 мВ). Когда в качестве параметров в модель были введены характеристики ионных каналов во вкусовых клетках типа II, полученные нами результаты в физиологических экспериментах с повторяющейся кратковременной (100 мс) и длительной (2с) стимуляцией вкусовых клеток фактически совпали с предсказанием модели для случая, когда через данный тип ионных каналов переносится молекула с зарядом 2" (Рис.14).

Рисунок 14. Зависимость АТФ секреции от мембранного потенциала. А, В - расчетное для г = 2 (линии) и экспериментально наблюдающееся (•,▼) количество АТФ, высвободившеея при 2 с (А) и 100 мс (В) стимуляции вкусовых клеток типа II.

В предложенной выше модели были использованы кинетические характеристики паннексина 1 из литературных источников - свойства рекомбинантного Рапх1, экс-прессированного в ооцитах Хепорш ¡аех'к (Вгиггопе е! а], 2005). Данная система на наш взгляд не совсем адекватна для исследования свойств белков млекопитающих.

-80 -40 0 40 80 Мембранный потенциал, мВ

-80 -40 о 40 80 Мембранный потенциал, мВ

Поэтому чтобы ответить на вопрос, может ли Рапх1 всё-таки соответствовать по биофизическим свойствам АТФ-проницаемым каналам вкусовых клеток типа II, мы исследовали свойства рекомбинантного Рапх1, клонированного из желобоватого сосочка в нескольких эукариотических линиях (СНО, НЕК-293, нейробластома ЭК-М-БН), и сравнили их с таковыми каналов вкусовых клеток (Табл.3). Среди полученных данных следует особо отметить то, что: 1) мы не смогли зарегистрировать высвобождение АТФ на деполяризацию через рекомбинантный Рапх1 при помощи клеток АТФ-сенсоров; 2) наблюдалась принципиально различная селективность АТФ-проницаемых каналов вкусовых клеток и рекомбинантного Рапх1, а также чувствительность к блокаторам; 3) при отрицательных потенциалах рекомбинантный Рапх1 был активен, что делает его непригодным осуществлять функцию потенциал-зависимого высвобождения нейромедиатора. В целом, наши данные свидетельствовали о том, что либо Рапх1 не основной транспортер АТФ, либо АТФ-проницаемые каналы в клетках типа II образованы гетеромером Рапх1 с другимим белками.

Таблица 3. Сравнение свойств каналов клеток типа II и рекомбинантного пан-нексина! в клетках НЕК-293.__

ПЗ неселективные каналы вкусовых клеток типа II Рекомбинантный Рапх1

1. Выпрямление интегрального тока выходное, не активен при отрицательных потенциалах выходное, активен при отрицательных потенциалах

2. Выпрямление тока через одиночные каналы отсутствует выходное

3. Селективность анион-катионная анионная

4. ЭЮЗ, ЫРРВ слабо ингибирует ингибирует

5. Ьа3+, 0<13+ не ингибирует не ингибирует

6. Пептид 10Рх1, карбенок-солон, АТФ не ингибирует ингибирует

7. Пептид 43 вАР26 ингибирует частично ингибирует

8. Ш3122 ингибирует ингибирует*

9. Высвобождение АТФ есть нет

10. Флуоресцеин проникает не проникает**

* - Ma et al., 2009; ** - Huang et al, 2007

Чтобы полностью прояснить ситуацию, участвует ли Panxl в высвобождении АТФ в виде какого-то гетероолигомера, по биофизическим характеристикам не соответствующего рекомбинантному белку, мы провели серию экспериментов с исполь-

зованием генетически модифицированных животных, у которых отсутствовал Рапх1 (предоставлены проф. В.И. Шестопаловым, Университет Маями, США). Так, оказалось, что у данных мышей полностью сохраняются выходящие АТФ-проницаемые токи в клетках II типа (ср. Рис. 15А с Рис.1). Более того, вкусовые почки и одиночные вкусовые клетки типа II высвобождали АТФ и при деполяризации, и при стимуляции вкусовыми веществами. (Рис. 15В). Таким образом, можно заключить, что Рапх1 не играет существенной роли в высвобождении вкусового афферентного нейромедиато-ра, что с учетом полученных нами фармакологических данных свидетельствует в пользу коннексонов, как основного АТФ-транспортирующего механизма в клетках типа И.

А В

„ , „ 20 мВ

50 мв -70 мВ|-¡потенциал вкусовой клетки

ток вкусовой клетки

0.1 мМ циклогексимид

Рисунок 15. Функциональный анализ вкусовых клеток, выделенных из паннексин1-отрицательных мышей. А - ионные токи в клетках типа II (активны и ПЗ натриевые, и ПЗ АТФ-проницаемые каналы); В- высвобождение АТФ из клетки типа II в ответ на 5 секундную деполяризацию до 20 мВ, регистрируемое при помощи клеток COS-1; С - регистрируемое клеткой-сенсором высвобождение АТФ из вкусовой почки при деполяризующей и вкусовой стимуляции; слева - изображение вкусовой почки и клетки COS-1 в проходящем свете, справа - регистрация от клетки COS-1, подписанной на фотографии слева.

Тем не менее, оставалась неясной роль генерации ПД в афферентной нейропере-даче. Обычно вторичные сенсорные клетки, не имеющие аксонов не используют ПД для кодирования и передачи сенсорной информации и даже не способны их генерировать.

Что касается вкусовых клеток, то на сегодняшний день нет сомнений в том, что вкусовые клетки млекопитающих генерируют ПД в ответ и на электрическую, и на

вкусовую стимуляцию. Мы предполагаем, что во вкусовых клетках типа II ПД управляют афферентной нейропередачей, поскольку важным свойством секреции АТФ является ее сильная зависимость от мембранного потенциала, которая характеризовалась крутой S-образной кривой с порогом ~ -10-0мВ. При такой крутой пороговой характеристике градуальные рецепторные потенциалы, индуцируемые активацией TRPM5, не способны вызывать высвобождение афферентного нейромедиатора в широком диапазоне рецепторных потенциалов. Действительно, при характерном для клеток типа II потенциале покоя в диапазоне -55...-40мВ генерация градуальных потенциалов до 30-45мВ не способна стимулировать высвобождение АТФ. Но если стимул-зависимая деполяризация сопровождается генерацией ПД, частота или количество которых пропорциональны величине рецепторного потенциала, количество высвободившегося АТФ пропорционально интенсивности вкусового стимула, что обеспечивает адекватное кодирование сенсорной информации. Однако при сильной деполяризации, вызванной Г1Д. электродвижущая сила для выхода АТФ существенно падает. Более эффективно было бы использовать медленно деактивирующиеся АТФ-проницаемые каналы для высвобождения большой порции АТФ при реполяризации. На Рис.16 действительно видно, что через хвостовой ток, генерируемый в клетках типа II при возвращении к поддерживаемому потенциалу высвобождается количество АТФ, сопоставимое с таковым высвободившимся за предыдущие 10 с.

Рисунок 16. Деполяризация вкусовой клетки типа II приводит к высвобождению АТФ в межклеточное пространство и реакции АТФ-сенсора - клеток СНО с экзогенными Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторами. Сверху -мембранный потенциал, поддерживаемый во вкусовой клетке; деполяризация вкусовой клетки вызывает активацию выходящего тока (в середине) и высвобождение АТФ, детектируемого клетками АТФ-сенсорами (внизу). На рисунке видно, что при реполяризации вкусовой клетки генерируются большие по амплитуде хвостовые токи и хорошо заметный импульсный выброс АТФ (за счет резкого увеличения электродвижущей силы для АТФ), приводящий к удвоению амплитуды ответа клетки АТФ-сенсора.

Однако такой модели, на первый взгляд, препятствуют электровозбудимые свойства клеток II типа. В то время как клетки типа III на ступенчатую деполяризацию способны генерировать от 1 до пачки ПД, частота и количество которых пропорциональны интенсивности стимуляции (Рис. 17В,С), клетки II типа способны генерировать лишь один ПД на ступенчатую деполяризацию и всего лишь 2-4 при увеличи-

вающейся величине индуцированного тока (Рис. 17С,П). Поэтому не получается объяснить кодирование информации клетками типа II лишь электровозбудимыми свойствами.

10 _15

А 60 мВ В Ток, пД 5 0

J .1СЮ мВ LLOKVB j

50 мВ

-L Г

jJ IVWWW^w—^

20 мс 50 мВ

■Г

Рисунок 17. Электрическая возбудимость вкусовых клеток III и II типов. А - семейства ПЗ токов регистрируемых от исследуемых клеток III (вверху) II (внизу) типа. В обоих случаях использовался метод perforated patch clamp. Клетки перфузировались раствором, содержащим 140 мМ NaCl, и диализовались 140 мМ KCl. В - пачка ПД, генерируемая клеткой III типа в ответ на 500 мс импульсы деполяризующего тока различной амплитуды. С - ПД, генерируемые клеткой П типа в ответ на 800 мс градуальную стимуляцию деполяризующим током. D - одиночные ПД, генерируемые клеткой III типа (слева) и клеткой II типа (правая панель). В B-D использовался режим фиксации тока.

В то же время, анализ электрофизиологических ответов клеток типа II выявил, что аппликация смеси горьких веществ вызывает активацию с неярко, но достаточно хорошо выраженными осцилляциями, природа которых остается не ясной (Рис. 18А). При регистрации мембранного потенциала было видно, что на фоне деполяризации, индуцированной горьким веществом, осцилляционные явления приводили к генерации серии ПД (Рис. 18В). Мы предполагаем, что наличие данного стимул-индуцированного осцилляционного механизма позволяет кодировать вкусовую информацию в виде дискретных квантов АТФ пропорционально количеству сгенерированных ПД, хотя природа явления не ясна.

Возможность высвобождения АТФ во время генерации ПД была продемонстрирована нами в экспериментах, где стимулирование кратковременными деполяризаци-

онными импульсами, сопоставимыми по длительности с ПД, приводило к детектируемому высвобождению АТФ из клеток II типа (Рис.18С).

горькая смесь

500 мкМ денатоний

_f| 27 мс[~}_

10с

III ~|50мВ шь

Рисунок 18. Ответ клетки типа II на горькую стимуляцию. Градуальный ответ на горькие вещества сопровождается осцилляцией тока (А) и генерацией серии ПД в режиме регистрации «нулевой ток» (В). С - ответ АТФ-сенсора, вызванного серией 7мс деполяризаций вкусовой клетки II типа до ЮмВ (200 повторов).

Один из главных фундаментальных вопросов вкусовой афферентной нейропере-дачи - источник АТФ для высвобождения через каналы. Мы предполагали, что данный вопрос не существенен - уровень цитоплазматического АТФ достаточно высок в клетках и достигает 1-10 мМ, поскольку в клетке множество биохимических реакций используют энергию макроэргических связей молекул АТФ. В одном из наших опытов было продемонстрировано, что диализ клеток внутриклеточным раствором с 2 мМ АТФ позволяет создать внутриклеточные условия, при котором мы могли хорошо детектировать выброс АТФ из вкусовых клеток, а при диализе вкусовых клеток в режиме whole cell раствором без АТФ выброс АТФ не регистрировался. Kinnamon et al, 1988 обнаружили, что в районе нервных окончаний в клетках типа II имеются крупные митохондрии в непосредственной близости от плазматической мембраны. Однако роль данных митохондрий до сих пор оставалась не ясной, поскольку информация о АТФ как нейромедиаторе появилась лишь в 2005 году. Мы предположили, что специфические для клеток типа II митохондрии выполняют функцию создания локально высокой концентрации АТФ, аналогичную синаптическим пузырькам возле преси-наптической мембраны. Если это так, то следовало ожидать, что в результате ингиби-рования митохондриальной АТФ-азы должен нарушиться выброс АТФ из вкусовых клеток.

Действительно, блокатор митохондриальной АТФ-азы олигомицин (3 мкМ) подавлял ответы, индуцированные высвобождением АТФ из вкусовых клеток после до-

бавления в среду 100 мМ KCl, в клетках АТФ-сенсорах на основе клеток СНО со встроенными Р2Х2 и Р2ХЗ рецепторами (Рис.19А-С). При этом, когда в качестве сенсорных клеток выступала линия COS-1, чувствительная и к АТФ. и к АДФ («АТФ/АДФ»-сенсор), мы наблюдали лишь частичное снижение ответов клеток сенсоров при использовании аналогичного протокола стимуляции рядом расположенных вкусовых клеток в случае.

100 ИМ АТФ

100 мМ КС! после 5 мин С 3 мкМ олигомицином

Вкусовая клетка Тип II

аи F, 4 3 2 1 0

100 мМ KCl после 5 мин с 3 мкМ олигомицином

' "—V-..' "V <■ '---. . ...'

Ответы АТФ-сенсора (клетка СНО из А)

4F/F, 4 3 2 1 О

Ответы АТФ-сенсора (клетка COS-1 из D)

Рисунок 19. Ингибитор митохондриальной АТФ-азы подавляет выброс АТФ из вкусовых клеток П типа. А - изображение в проходящем свете клетки типа II и клетки АТФ-сенсора. Вкусовая клетка II типа подведена на микроэлектроде к прикрепленной к дну камеры клетке СНО, экспрессирующей экзогенные рецепторы Р2Х2 и Р2ХЗ и прокрашенной Fluo-4. Вкусовая клетка не подвергалась большим приложенным давлениям для получения гигаомного контакта и потому сохраняется морфология и, предположительно, клеточная компартмента-лизация. В - репрезентативный эксперимент (п=7), в котором KCl-стимуляция вкусовой клетки II типа вызывала ответ в клетке АТФ-сенсоре. Инкубация с олигомицином приводила к исчезновению ответов клеток АТФ-сенсоров при KCl-стимулируемой деполяризации вкусовых клеток; D-F - эксперимент с использованием клеток COS-1 в качестве АТФ/АДФ сенсоров; D - изображение в проходящем свете клетки типа II и клетки сенсора. Манипуляции аналогичны описанным в А;. Е - репрезентативный эксперимент (п=5), в котором KCl стимуляция вкусовой клетки II типа вызывала ответ в клетке АТФ-сенсоре в контроле и после инкубации с олигомицином. C,F - усредненные ответы клеток СНО (С) и COS-1 при KCl стимуляции вкусовых клеток типа II в контроле и после инкубации с олигомицином.

В контрольных опытах было проверено, что 100-300 нМ АТФ вызывает хорошо

воспроизводимые кальциевые ответы у клеток обоих используемых линий даже после длительной инкубации с олигомицином (п=52). Также АТФ индуцировал ответы у

Р2Х2/Р2ХЗ-положительных клеток СНО и после того, как стимуляция высокой концентрацией хлорида калия переставала индуцировать ответы в клетке-сенсоре (Рис. 20В).

Результаты опытов с олигомицином, представленных на рис. 19, с учетом данных о наличии в клетках типа II крупных митохондрий в непосредственной близости от плазматической мембраны, мы склонны рассматривать как свидетельство функционирования АТФ-обогахценного компартмента для секреции АТФ (Рис.20). Функцию поставщика АТФ и, возможно, создания определенных физических барьеров выполняет специфическая митохондрия. Вполне вероятно, что данное место обеднено другими внутриклеточными молекулами из-за физических и, возможно, химических барьеров. Это позволяет создать специфические локальные концентрации клеточных метаболитов, в частности высокую концентрацию АТФ, но пониженную концентрацию других веществ, секреция которых в межклеточное пространство физиологически нецелесообразна, несмотря на их способность проникать через ионные каналы клеток типа II.

клетках типа II можно представить в виде гипотетической схемы (Рис.21).

Функциональный анализ клеток типа III. Анализ профиля ионных токов в идентифицированных вкусовых клетках показал, что клетки III типа напоминают нейроны: для этих клеток помимо ПЗ Ыа+-каналов характерны К+-каналы задержанного выпрямления и А-токи, формирующие форму ПД и межспайковый интервал, HCN каналы, участвующие в деполяризации и пейсмейкерной активности, ПЗ Са2+-канапов L-типа, ответственные за вход в клетки кальция (Рис.2А,В), необходимого для экзоцитоза, К+-каналов входящего выпрямления. Для потенциалов действия в клетках III типа характерно перекодирование интенсивности приложенного при электростимуляции тока в частотные характеристики серии ПД, выраженная стадия

Рисунок 20. Гипотетическое устройство АТФ-обогащенного компартмента в клетках типа П. АТФ поставляется к полупорам, образованным коннексинами, из рядом расположенной митохондрии. Кальций, попадающий из внеклеточного пространства, частично связывается АТФ, концентрация которого повышена локально, а частично по электрохимическому градиенту через кальциевый унипорт заходит в митохондрии.

Цепь предполагаемых событий в

глубокой гиперполяризации (Рис. 17В), а ПД значительно быстрее, чем в клетках типа II ^1/2= 1.5-1.8 мс против 11/2=3.5-4.2 мс, соответственно).

I вкусовые молекулы

вкусовая клетка тип II

вкусовая клетка I

Рисунок 21. Гипотетическая схема событий при рецепции вкусовых веществ клетками типа II. Вкусовые молекулы связываются с вкусовыми GPCR рецепторами (T1R и T2R) , локализованными на апикальной мембране клети II типа. Стимуляция рецепторов приводит к активации G-белков, по-видимому, Gj/Go (гастдуцин, тран-сдуцин, Gji), после чего (Зу-комплекс Gi-белков активирует фосфолипазу С Р2, что приводит к мобилизации внутриклеточного кальция, скорее всего при участии 1Рз рецептора III типа на эндоплаз-матической сети. Кальций активирует кальций-зависимый ионный канал TRPM5, что приводит к ос-цилляционной деполяризации и генерации серии ПД. При насыщающих концентрациях вкусовых агонистов предполагается тотальная активация TRPM5 и длительный сдвиг мембранного потенциала к 0 мВ. Деполяризация и ПД вызывают активацию ПЗ ионных каналов, проницаемых для АТФ - коннексонов и высвобождению АТФ. Генерация серии ПД позволяет закодировать сигнал об интенсивности стимуляции. Высвободившийся АТФ активирует Р2Х2/Р2ХЗ рецепторы нервных окончаний афферентного нерва. Экто-апираза (NTDase2) рядом расположенной клетки типа I гидролизует экстраклеточный АТФ. Тем самым морфологически и биохимически клетка типа 1 выполняет глиальную функцию. Кроме того АТФ приводит к мобилизации кальция в клетках типа I при участии Р2У-рецепторов и фосфоино-зитидного каскада и активации кальций-активируемого анионного канала. Предположительно данная сигнализация играет роль в обеспечении обратной связи.

При исследовании высвобождения серотонина клетками типа III мы, как и ожидалось, зафиксировали воспроизводимую реакцию клеток глиомы С6 в ответ на длительную деполяризацию вкусовых клеток типа III (10-20 с) (Рис.22В), а также на циклическую деполяризацию (Рис.22В,С), но, несмотря на высокую чувствительность серотонинового сенсора, амплитуда ответов была крайне мала и не превышала ДР/Р0=0,15. Хотя данный тип ответов глиомы С6 блокировался ингибитором 5НТ2-рецепторов кетансерином, мы полагаем, что, такая низкая амплитуда ответов (по сравнению, например с высвобождением АТФ из клеток типа II) связана с локальностью экзоцитозного аппарата и сильным разбавлением высвободившегося серотонина

в исследовательской камере. Отметим, что в случае наблюдаемого нами произвольно-

го увеличения кальция в клетках типа III, превышающего достигаемый уровень посредством деполяризации и активации кальциевых каналов, регистрировалась хорошо детектируемая реакция клеток-сенсоров (Рис. 22, О). Поскольку клетки поддерживались при фиксированном потенциале, это свидетельствовало, что для экзоцитоза имеет значение лишь повышение кальция, а не деполяризация, которая в этих клетках, в отличие от типа II, является не следствием, а причиной высокого уровня кальция в

.1FT. С 4

-70 мВ •90 мВ

AF/F вкусовая клетка типа III

h клетка глиомы C6

100 время, с

0 1.5 3 время, с

100 200 время, с

Рисунок 22. Исследование выброса серотонина из вкусовой клетки типа III. А - изображение, в проходящем свете. В - записи флуоресцентных сигналов от вкусовой клетки (черная кривая) и глиомы С6 (серая кривая). Во вкусовой клетке повышается уровень внутриклеточного кальция в ответ на деполяризацию - циклическую (С) - первый пик, и продолжительную - второй пик, что сопровождается секрецией серотонина вкусовой клеткой. В ответ на это в клетке глиомы С6 повышается концентрация внутриклеточного кальция. Пик, достигающий максимума на 170 секунде - ответ клетки глиомы на 100 нМ серотонина. Э - самопроизвольное увеличение концентрации цитозольного кальция во вкусовой клетке типа III приводило к заметному увеличению флуоресценции в клеточных сенсорах на серотонин.

Гипотетическая схема событий представлена на рисунке 23.

В поисках агонистов рецепторов клеток типа III мы обнаружили, что эти клетки генерируют кальциевые ответы на аминокислоты и на повышение экстраклеточного кальция - результаты, свидетельствующие о вероятном функционировании в этих клетках недавно открытого кальций-чувствующего рецептора (CaSR), который был обнаружен и во вкусовых клетках.

Так клетки III типа отвечали на агонисты CaSR, NPS R-568 и неомицин, повышением цитозольного кальция, в то время как подобные ответы не наблюдались в клетках I, II типов (Рис.24).

Согласно данным экспериментам, аминокислоты (Phe~Glu>Arg) стимулировали кальциевую сигнализацию (Рис.25) при участии фосфоинозитидного каскада, выхода депонированного кальция и входа кальция через Мп2+-проницаемые каналы.

Вкусовая клетка типа III

цитозольный Ca""

Классический синапс

Рисунок 23. Гипотетическая схема событий в клетках типа III при стимуляции кислыми веществами: кислые вещества вызывают активацию ионных каналов РКХ)2Ь и других про-тон-чувствующих каналов клеток типа III. Активация входящего тока вызывает генерацию серии ПД, частота ПД зависит от величины активируемого тока, который в свою очередь пропорционален концентрации протона во вкусовой поре. Генерация ПД вызывает активацию ПЗ кальциевых каналов и вход кальция в клетку. Повышение цитозольного кальция включает кальций-зависимый экзоцитоз и высвобождение нейромедиатора на вкусовое нервное окончание.

серотонин и др.

' 4PI

6 5 8 8

1 П П П П П П 1 наружный CaJ'. мМ ff]_

NPS ft-568

неомицин NPS R-S68 KCl

\ 5°с

IAJuLJU Лы

Ь5 гп

л_П

^j-j_наружный

Ca2', мМ » ff П 3П5 1

KCl ATP NPS R 568 неомицин

200 c

j-iF/F0=O 3

Рисунок 24. Репрезентативные ответы вкусовых клеток типа III (А и В), типа I (С) и типа II (D) на агонисты кальций-чувствующего рецептора (CaSR). Клетки были загружены кальциевым красителем Fluo-4. В А и В представлены 2 различные клетки типа III.

— 200 с

NPS R-568 неомицин

И*

i \ f Клока»! \ \ , , I

VV Vy /_r

; *

A 2». ,

ri!L, ,.........., ............. Рисунок 25. Эффекты аминокислот

i«, *' ..........^ У T»'m ösi..............' " ■ :•>■■»>!.■....... (фенилаланина, аргинина и глутама-

та) в присутствии нормального , , I \ (1мМ) и повышенного (3,5 мМ) эк' " траклеточного кальция на измене-»-Ö7 (Л ' ^ ние концентрации свободного цито-f ' ' \ зольного кальция во вкусовых клет-~ ках типа III. А- записи флуоресцентных сигналов от 3 разных кле-ч , ток III типа. В - сводные результаты по чувствительности к аминокисло-g там клеток типа III при разных концентрациях наружного кальция.

1 мМ Pha

i.o 38 05 OA 0.2 аз

С«г'(нВ; ' 2.5 S.5 1 2.5 3.S 1 2 5 3.5

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, данное исследование было посвящено анализу механизмов функционирования периферического вкусового анализатора на клеточном уровне. Одна из основных трудностей такого анализа состояла в том, что популяция клеток вкусовой почки гетерогенна и включает клетки нескольких морфологически различных типов: тип I -темные, тип II - светлые, тип III — промежуточные. Морфологические подтипы клеток отражают их функциональное различие. На сегодняшний день известно, что клетки типа II являются рецепторными для вкусовых категорий горького, сладкого и умами (вкус аминокислот); вкусовые клетки III типа ответственны за восприятие кислого, а клетки I типа, помимо глиальной функции, участвуют в рецепции соленого. Поэтому нам представлялось, что адекватное исследование молекулярных механизмов вкуса на клеточном уровне возможно только с использованием идентифицированных вкусовых клеток. Поскольку в физиологических и других экспериментах с одиночными клетками морфологические критерии обычно ненадежны и поэтому практически неприменимы, нами была поставлена задача разработать функциональные критерии для идентификации клеток различных типов. Мы проанализировали методами patcli-clamp, Ca2+-imaging и флуоресцентной микроскопии более I ООО одиночных вкусовых клеток, включая клетки из генетически модифицированных животных, что позволило разработать: а) простые электрофизиологические критерии; б) неинвазивные крите-

рии для идентификации клеток типов I, II и III, включая популяцию горько-чувствующих клеток типа II. В идентифицированных вкусовых клетках были охарактеризованы ионные каналы, включая потенциал-зависимые ионные каналы и каналы, активность которых контролируется при участии внутриклеточных сигнальных каскадов. Проанализирована специфическая химическая чувствительность клеток с использованием широкого набора агонистов.

Основной упор в работе был сделан на функциональный анализ клеток II типа, которые считаются основными хемосенсорными клетками вкусовой почки, поскольку ответственны за восприятие горького, сладкого и умами. Поэтому исследование этих клеток представляло серьезный научный интерес.

В этих клетках нами впервые электрофизиологически зарегистрирован и исследован ионный канал ТКРМ5, нокаут которого приводит к потере чувствительности к горькому, сладкому и умами. Подтверждена необычная термочувствительность канала, ранее продемонстрированная лишь на рекомбинантном ТИРМ5, которая вносит существенный вклад в зависимость вкусовых ощущений от температуры.

Долгое время оставалось неясным, каким образом клетки II типа осуществляют передачу информации о вкусе на нервные окончания, ведь в этих клетках отсутствуют классические синаптические структуры, пресинаптический белок ЭМАР-25 и потенциал-зависимые кальциевые каналы. Данное исследование позволило ответить на этот вопрос. С использованием метода клеточного АТФ-биосенсора мы выяснили, что клетки типа II высвобождают афферентный нейромедиатор, АТФ, в ответ на деполяризацию. Выброс АТФ клетками типа II не зависел от кальция, что свидетельствовало против классического Са2+-зависимого везикулярного механизма. Исследования с применением методов флуоресцентных трейсеров и электрофизиологического анализа селективности каналов показали, что секреция АТФ обеспечивается АТФ-проницаемыми ионными каналами. Ингибиторный анализ, сравнение свойств натив-ных ПЗ АТФ-проницаемых каналов во вкусовых клетках с рекомбинантным паннек-сином1, эксперименты на мышах, нокаутных по паннексину1, а также математическое моделирование кинетических свойств этих каналов свидетельствовали о том, что во вкусовых клетках II типа АТФ-проницаемый канал формируется канальными белками из семейства коннексинов.

Важным свойством клеток II типа является их способность генерировать потен-

циалы действия (ПД). В то же время другие вторичные сенсорные клетки, не имеющих аксонов, например фоторецепторы позвоночных и волосковые клетки органа Корти не используют ПД для кодирования и передачи сенсорной информации и не способны их генерировать. Поэтому целесообразность генерации ПД для вкусовой трансдукции была не вполне ясна. При исследовании потенциал-зависимости выброса АТФ из вкусовых клеток типа II с применением метода клеточного АТФ-биосенсора мы обнаружили, что зависимость АТФ-секреции от мембранного потенциала характеризуется крутой S-образной кривой с порогом —Ю-ОмВ. При такой крутой пороговой характеристике, градуальные рецепторные потенциалы не способны вызывать высвобождение афферентного нейромедиатора в широком диапазоне рецепторных потенциалов. Однако, если стимул-зависимая деполяризация сопровождается генерацией Г1Д, частота или количество которых пропорциональны величине рецепторного потенциала, то тогда количество высвободившегося АТФ будет пропорционально интенсивности вкусового стимула. Это обеспечивает адекватное кодирование сенсорной информации, а за счет высокой крутизны зависимости высвобождения ЛТФ от потенциала фактически происходит квантовый (т.е. унифицированный по кинетике и величине) выброс АТФ в ответ на каждый ПД через неселективные ионные каналы.

С использованием 2 типов АТФ-сенсоров (АТФ- и АТФ/АДФ- специфичного) мы показали, что при потенциал-зависимой нейротрансмиссии основной пул АТФ для высвобождения имеет митохондриальное а не гликолизное происхождение. С учетом литературных данных, полученных с помощью электронной микроскопии, о локализации в непосредственной близости к плазматической мембране специфической митохондрии во вкусовых клетках типа II, а также наших косвенных свидетельств о падении интенсивности выброса АТФ и индукции входа кальция при деполяризации клеток II типа с деградировавшей ультраструктурой, мы предполагаем, что в клетках типа II функционирует специальный компартмент, включающий коннексоны плазматической мембраны и локализованную рядом митохондрию, служащий для высвобождения АТФ в акте вкусовой нейропередачи.

кальция за счет активации ПЗ Са2+-каналов, что стимулировало высвобождение серо-тонина. Такие свойства клеток III типа позволяют хорошо объяснить то, как эти клетки кодируют и передают сенсорную информацию о кислом.

Удивительно было обнаружить, что клетки типа III также чувствительны к наружному кальцию и широкому спектру аминокислот: фенилаланин, аргинин и глу-тамат, а также высокий экстраклеточный кальций вызывали в клетках данного типа кальциевые ответы, опосредованные выходом в клетку депонированного кальция и входом через кальций-проницаемые ионные каналы. Анализ при помощи специфических агонистов (NPS R-568, неомицин) позволил нам утверждать, что данная чувствительность обеспечивается функциональной активностью в этих клетках кальций-чувствующего рецептора (CaSR). Возможно, данное свойство вкусовых клеток типа III связано напрямую с вкусовой чувствительностью, поскольку глутамат вызывает негативную реакцию у мышей с нокаутом Т1 КЗ-рецептора (Yasumatsu et al, 2011), а повышение кальция характеризуется горьким ощущением. Хотя также остается вероятным, что данный рецептор опосредует модуляцию клеток типа III эфферентными нервными окончаниями, так как недавно были получены свидетельства в пользу участия глутамата в эфферентной нейромодуляции клеток вкусовой почки.

Исследование функциональных свойств популяции клеток типа I показало, что эти клетки обладают уникальными для вкусовой почки рецепторными свойствами — именно среди клеток данного типа оказались клетки, чувствительные к ряду агонистов: АТФ и УТФ, АДФ, ацетилхолин и глутамат в микромолярных концентрациях стимулировали мобилизацию кальция и активацию кальций-активируемого хлорного канала в клетках этого типа. Как известно, клетки I типа несут на плазматической мембране экто-АТФ-азу NTI'Dase2, гидролизующую экстраклеточный АТФ до АМФ, и глиа-специфичный глутамат/аспартат транспортер (GLAST), закачивающий экстраклеточный глутамат в клетки. Кроме того, эти клетки имеют крыловидные отростки, которые создают физический барьер между клетками вкусовой почки и, по-видимому, ограничивают межклеточное пространство с нервными окончаниями от растекания нейромедиатора. В апикальной части этих клеток имеются электрон-плотные гранулы, которые, возможно, секретируются во вкусовую пору. Мы полагаем, что уникальная для вкусовой почки чувствительность клеток типа I к различным нейроактивным веществам позволяет им регулировать выполнение глиальных функ-

ций и запускать различные адаптационные механизмы при наличии нейромедиаторов в межклеточном пространстве, например, модулируя активность NTDa3bi2 и GLAST, а также индуцируя секрецию во вкусовую пору.

Интересно, что клетки типа I оказались хорошо отвечающими на денатоний повышением уровня цитозолыюго кальция. Роль данной сигнализации остается не ясной, однако сам факт говорит о том, что денатоний не следует использовать в качестве вкусового стимула для исследования трансдукционных механизмов на неиден-тифицированных клетках, что пока является достаточно распространенной исследовательской практикой.

ВЫВОДЫ.

1. Проведен функциональный анализ гетерогенной популяции вкусовых клеток в препаратах диссоциированных желобоватых, листовидных и грибовидных вкусовых сосочков с использованием методов электрофизиологии и флуоресцентной микроскопии. Показано, что вне зависимости от типа исследуемого вкусового сосочка для популяции вкусовых клеток характерны три функциональных инварианта. Установлено, что каждый функциональный клеточный инвариант соответствует определенному морфологическому подтипу (тип I - тип III), идентифицируемому по профилю маркерных белков. Полученные корреляции позволили сформулировать функциональные критерии для идентификации индивидуальных вкусовых клеток при их исследовании физиологическими методами.

2. Изучены механизмы электрогенеза и электрической возбудимости в идентифицированных вкусовых клетках. В частности, показано, что по своим электрическим характеристикам вкусовые клетки типа III сходны с нейроналыгыми клетками и способны генерировать пачки потенциалов действия в ответ на деполяризацию. Показано, что в клетках типа III функционируют Са2+ каналы L-типа, которые обеспечивают вход наружного Са2+ и выброс серотонина в ответ на деполяризацию.

3. Установлено, что клетки типа II имеют недостаточный набор ПЗ каналов и поэтому генерируют лишь одиночные потенциалы действия в ответ на электрическую стимуляцию. Между тем, вкусовые стимулы вызывают генерацию пачки потенциалов действия, за счет осциляторного характера генераторного тока.

4. Клетки типа I по своим электрорфизиологическим свойствам сходны с глиальными клетками. Показано, что в клетках типа I функционируют метаботропные

рецепторы к таким нейроактивным веществам, как АТФ, АДФ, УТФ. ацетилхолин и карбахол, глутамат, которые сопряжены с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией внутриклеточного Са2+. Са2+-мобилизация сопровождается стимуляцией входящего тока через Са2+-активируемые СГ-каналы. Субпопуляция клеток типа I оказалась способной детектировать горькое вещество денатоний, которое вызывало мобилизацию цитозольного кальция при участии фосфоинозитидного каскада и активацию Са2+-активируемых СГ-каналов.

5. Отработана оригинальная методика мониторинга секреции нейроактивных веществ (АТФ, серотонина) из одиночных клеток с использованием клеточных биосепсоров на основе экзогенных/эндогенных рецепторов, сопряженных с Са2+ мобилизацией.

6. С использованием метода биосенсора впервые показано, что в желобоватых листовидных и грибовидных сосочках клетки вкусовой почки высвобождают афферентный нейромедиатор, АТФ, в ответ на вкусовую и электрическую стимуляцию. Исследованы клеточные источники и механизмы секреции АТФ вкусовыми клетками типа II. Установлено, что в секрецию вовлечен АТФ митохондриалыюго, а не гликолизного происхождения, и что АТФ высвобождается через потенциал-зависимые АТФ-проницаемые ионные каналы без участия экзоцитоза. Впервые проанализирована роль потенциалов действия в афферентной нейропередаче во вкусовой почке и показано, что спайки обеспечивают квантовый характер высвобождении афферентного нейромедиатора АТФ из клеток типа II. Впервые разработана математическая модель потенциал-зависимой секреции АТФ при участии АТФ-проницаемых ионных каналов.

7. Проанализирована возможная роль в секреции АТФ вкусовыми клетками типа II канального белка Panxl, рассматриваемого в качестве основного претендента на роль АТФ-проницаемого канала. С использованием совокупности методов, включая животных с нокаутированным геном Panxl, ингибиторный анализ, сравнительный биофизический анализ рекомбинантного Panxl и АТФ-проницаемых ионных каналов вкусовых клеток, впервые получены свидетельства, что канальный белок Panxl не вовлечен в секрецию АТФ во вкусовых клетках типа II. Это, в сочетании с другими данными, указывает на то, что АТФ-проницаемые каналы во вкусовых клетках типа II формируются не Panxl, а белками щелевых контактов -коннексинами.

8. Исследованы биофизические характеристики ионного канала TRPM5 in situ и в экспрессионной системе, являющегося ключевым элементом в каскаде

вкусовой трансдукции в клетках типа II. Показано, что в условиях in situ повышение уровня цитозолыюго кальция ведет к активации TRPM5, блокируемого оксидом трифенилфосфина (ТФО), эффективно ингибирующего токи через рекомбинантный TRPM5, клонированный из вкусовых клеток. Подтверждена высокая термочувствительность TRPM5 in situ (Qiu>6).

9. Впервые показано, что в клетках типа III функционально активен гептаспиральный рецептор внеклеточного кальция (CaSR), который сопряжен с фосфоинозитидным каскадом. Используя ингибиторнвый анализ, установлено, что полимодальный рецептор CaSR обеспечивает чувствительность клеток типа III к ряду аминокислот (глутамат, фенилаланин и аргинин), которые стимулируют мобилизацию депонированного Са2+ и вход наружного Са2+ через Са2+/Мп2+-проницаемые каналы. Высказано предположение, что остаточная чувствительность к аминокислотам, наблюдаемая у животных с генетически инактивированным умами рецептором T1R1/T1R3, может быть обусловлена присутствием рецептора CaSR в субпопуляци клеток типа III.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Romanov R.A., Rogachevskaja O A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. // EMBOJ. 2007. 26(3), 657-67.

2. Романов P.A., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Яценко Ю.Е., Колесников С.С. Мониторинг выброса АТР из одиночных клеток методом биосенсора. // Биологические мембраны. 2007. Т. 24(4). С. 309-315.

3. Romanov R.A., Rogachevskaja О.А., Khokhlov A.A., Kolesnikov S.S. Voltage-Dependence of ATP Secretion in Mammalian Taste Cells II J. Gen. Physiol. 2008. V. 132. P. 731744.

4. Шутов А.А., Лебедева O.B., Романов P.A., Рогачевская O.A., Кабанова Н.В., Колесников С.С., Сафарова Э Р. Клеточная тест-система, экспрессирующая К+-канал hERG, для исследования кардиотоксичности лекарственных препаратов. Получение и анализ // Биологические мембраны. 2008. Т. 25(4). С. 322-328.

5. Романов Р.А., Кабанова Н.В., Малкин С.Л., Колесников С.С. Неселективные потенциал-зависимые каналы во вкусовых клетках типа II // Биологические мембраны. 2009. Т.26(1), с.64-74.

6. Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Кабанова Н.В., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Потенциал зависимые Са2+ каналы вкусовых клеток типа III // Биологические мембраны. 2009. Т.26(4), с.258-264.

7. Хохлов А.А., Романов Р.А., Рогачевская О.А., Садовников В.Б , Колесников С.С. Возможная роль гастдуцин-положительных сенсорных клеток обонятельного эпителия в восприятии 2-гептанона// Сенсорные системы. 2009. Т.23.№2, С. 164-171.

8. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Яцепко Ю.Е., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке мыши. Ацетилхолпн как возможный посредник. // Биологические мембраны. 2010. Т.27(1), С. 114-120.

9. Bystrova M.F., Romanov R.A., Rogachevskaya O.K., Churbanov G.D., Kolesnikov S.S. Functional expression of the extracellular calcium-sensing receptor in mouse taste cells. II J. Cell Sci. 2010. V. !23(Pt 6). P. 972-982.

10. Романов P.A., Колесников С.С. Первичные медиаторы. Методы и подходы для исследования секреции // Биологические мембраны. 2011. Т.28(1). С.3-13.

11. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Ротачевская О.А., Колесников С.С. Канальная активность рекомбинантного паннексина1. // Биологические мембраны. 2011. Т.28. №5 С.374-381.

12. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Ротачевская О.А., Колесников С.С. Идентификация ионных каналов TRPM5 во вкусовых клетках II типа. // Нейрофизиология/Newophysiology. 2011. Т.43(3). С.201-210.

13. Rogachevskaya О.A., Churbanov G.D., Bystrova M.F., Romanov R.A., Kolesnikov S.S.Stimulation of the extracellular Ca2+-sensing receptor by denatonium. // Biochem. Biophys. Res. Commun.. 2011. V. 416 (3-4), 433-436.

14. Ротачевская O A., Романов P.A., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке: АТФ и ацетилхолин как первичные медиаторы. //Нейрофизиология/Neurophysiology. 2011. Т.43(6). С.543-553

15. Komanov R.A., Rogachevskaja О.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Electrical excitability of taste cells. Mechanisms and possible physiological significance. // Биологические мембраны. 2012. T.29. №1-2. C.85-101.

Статьи в книгах:

1. Ronninov R.A., Rogachevskaja О.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Afferent Output in Mammalian Taste Cells: A Role of Electrical Excitability in Mediating Transmitter Release. // pp. 133-157 in "Action Potential Biophysical and Cellular Context. Initiation, Phases and Propagation". Ed. M.L. DuBois. 2010. Nova Science Publishers, New York, 207 p.

Статьи в сборниках:

1. Романов Р.А., Рогачевская O A., Быстрова М.Ф., Хохлов А.А., Колесников С.С. Механизм афферентной трансмиссии во вкусовых рецегггорных клетках II типа/ / Сборник статей по материалам Международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (25-27 июня 2008 г.Минск, Беларусь), часть I, С.260-261.

2. Хохлов А.А., Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Осветитель на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах для флуоресцентной микроскопии одиночных клеток/ / Сборник статей по материалам Международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (25-27 июня 2008 г.Минск, Беларусь), часть II, С.336-338.

3. Рогачевская О.А., Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке мыши. Ацетилхолин как возможный посредник. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2009. Сборник статен, Том 1, С.262-264.

4. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Афферентная нейропередача во вкусовых клетках. Роль электрической возбудимости клеток II типа. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2011. Сборник статей. Том 1,С.251-257.

5. Рогачевская О.А., Кабанова М.Ф., Быстрова М.Ф., Романов Р.А., Королькова Ю.В., Гришин Е.В., Колесников С.С. Исследование Р2Х2 и Р2ХЗецепторов в гетерологической системе. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2011. Сборник статей. Том 1, С.246-251.

Тезисы:

1. Романов P.A., Рогачевская O.A., Быстрова М.Ф., Маргольский Р.Ф., Колесников С.С. Хеморецепторные клетки вкусовой почки млекопитающих. // Цитология. 2007. 49 (9). Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института Цитологии РАН. С. 789.

2. Романов P.A., Рогачевская O.A., Быстрова М.Ф., Маргольский Р.Ф., Колесников С.С. Механизм афферентной сигнализации во вкусовой почке. // 20-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2007. Материалы съезда. С. 79.

3. Романов P.A., Рогачевская O.A., Колесников С.С. Роль потенциалов действия в кодировании вкусовой информации. // 20-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2007. Материалы съезда. С. 393.

4. Романов P.A., Рогачевская O.A., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Функциональный анализ вкусовых рецепторных клеток типа II. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2007. Материалы конференции. С. 160.

5. Романов P.A., Хохлов A.A., Быстрова М.Ф., Рогачевская O.A., Колесников С.С. Исследование секреции АТР методом биосепсора. // Международная научно-практическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине». Ростов-на-Дону. 2007. Материалы конференции. С. 36.

6. Романов P.A., Рогачевская O.A., Яцснко Ю.Е., Хохлов A.A., Колесников С.С. «Межклеточные коммуникации во вкусовой почке млекопитающих». // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008 г. Материалы съезда, с. 185.

7. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. ATP release from taste cells/ Monitoring with ATP biosensor. // The tenth world congress on biosensors, Shanghai, China, May 14-16, 2008, Delegate manual, P3, 102.

8. Рогачевская O.A., Быстрова М.Ф., Хохлов A.A., Мапкин C.JI., Чурбанов Г.Д., Осокин H.H., Кабанова Н.В., Романов P.A. Использование методов флуоресцентной микроскопии для исследования мембранной проницаемости вкусовых клеток мыши. // Материалы Международного семинара «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем». 17-21 ноября 2008, С.-Петербург. С.29.

9. Рогачевская O.A., Романов P.A., Хохлов A.A., Колесников С.С. Механизмы межклеточных коммуникаций во вкусовой почке при участии внеклеточного АТФ. // Все-украинская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии». 30-31 октября 2008 г. Днепропетровск, Украина. Сборник трудов, С.34.

10. Кабанова Н.В., Романов P.A., Рогачевская O.A., Колесников С.С., Лебедева О.В. Исследование К+каналов в экспрессиошюй системе методом patch-clamp // 11-ая Пу-щинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2008. Материалы конференции, С.174.

11. Романов P.A., Кабанова Н.В., Малкнн С.Л., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Исследование активности ионного канала TRPM5 в идентифицированных клетках вкусовой почки. // Биологические мембраны. 2009. Т. 26(4). Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции». 17-18 марта 2009г. С.-Петербурге. 326-327.

12. Романов P.A., Рогачевская O.A., Хохлов A.A., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. АТР-проницаемые ионные каналы вкусовых клеток. // Биологические мембраны. 2009. Т. 26(4). Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции». 17-18 марта 2009г. С.-Петербург. С. 327-328.

13. Romanov R.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Identification of taste cells functionally expressing TRPM5. //Abstracts of TRP-meeting, Sep 26-27, 2009. Stockholm. P. 12.

14. Романов P.A., Рогачевская O.A., Быстрова М.Ф., Хохлов A.A., Колесников С.С. Электрическая возбудимость вкусовых клеток и афферентная нейропередача. // 21-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2010. Тезисы докладов. С. 520.

15. Романов Р.А., Рогачевская O A., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Роль гептаспиральных рецепоров семейства С в физиологии вкусовых клеток. // 21-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 2010. Тезисы докладов. С. 521.

16. Рогачевская О.А., Кабанова Н.В., Шевченко А.В., Малкин С.Л., Чурбанов Г.Д., Кабанова Н.В., Романов Р.А. Клеточная тест система, экспрессирующая гомомерные Р2Х2, Р2ХЗ и гетеромерные Р2Х2/Р2хЗ рецепторы. Получение и анализ. // Психоф1зюлопчш та вюцеральш функцн в норм! i патологи.УкраШа, КиКв. 2010. Тези доповщей. С. 170.

17. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Механизмы афферентной нейропередачи во вкусовой почке. Роль потенциалов действия. // Психоф1зюлопчш та вгсце-ралып функцн в норм) i патологи.Украша, Кш'в. 2010. Тези доповщей. С. 173.

18. Romanov R.A.. Rogachevskaya О.A., Bystrova M.F., Churbanov G.D., Kolesnikov S.S. Functional Activity of the Extracellular Calcium-Sensing Receptor in Mouse Taste Cells of the Type III. //New Horizons in Calcium Signaling. Meeting program, poster abstract. Beijing, China, October 10-13, 2010, p.59.

19. Рогачевская O A., Романов P.A., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке: АТФ и ацетилхолин как первичные медиаторы. // V Congress of the Ukranian Society for Neuoscience, Kyiv, June 6-10, 2011. C.58.

20. Романов P.A., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Идентификация TRPM5 во вкусовых клетках II типа. // V Congress of the Ukranian Society for Neuoscience, Kyiv, June 6-10, 2011. С. 103.

21. Romanov R., Bystrova M., Rogachevskaya O., Kolesnikov S. Afferent output in type II cells. // ECRO XXI Congress. Manchester, 2011. Abstracts. P.83-84.

Подписано в печать:

02.04.2012

Заказ № 6892 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Романов, Роман Александрович

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

II. 1. Организация периферического вкусового анализатора.

II. 1.1. Устройство периферического вкусового рецепторного органа.

II. 1.2. Морфологический и функциональный анализ клеток вкусовой почки.

II. 1.3. Электрофизиологический анализ клеток вкусовой почки. Поиск критериев для идентификации вкусовых клеток.

II.2. Рецепторы вкусовых клеток. Трансдукция вкусовых стимулов, опосредованная системой вторичных мессенджеров.

II.2.1. Трансдукция горьких и сладких стимулов. Вкусовые рецепторы T1R и T2R.

II. 2.2. Роль фосфоинозитидного каскада в трансдукции горького, сладкого и умами. Внутриклеточные каскады в микровиллярных и цилиарных хемосенсорных клетках. 18 П.2.3.Роль IP3-зависимого выхода кальция из внутриклеточных депо в трансдукции вкусовых стимулов.

II.2.4. Роль гастдуцина во вкусовой трансдукции.

II.3. Ионные каналы вкусовых клеток.

11.3.1. Ионные каналы как детекторы вкусовых стимулов.

11.3.2. Потенциал-зависимые ионные каналы вкусовых клеток.

НА. Первичные медиаторы. Методы и подходы для исследования секреции.

11.4.1. Иммуноцитохимические методы и биохимические методы анализа клеточного содержимого.

11.4.2. Жидкостная хроматография на микроколонках, капиллярный электрофорез.

II. 4.3. Микродиализ и медленно текущая двухтактная перфузия.

II.4.4. Микроэлектродная вольтамперометрия.

П.4.5.Энзиматические биосенсоры.

II.4.6. Клеточные биосенсоры.

II.5. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке.

11.5.1. Первичные мессенджеры во вкусовой почке.

11.5.2. АТФ как афферентный вкусовой нейромедиатор.

11.5.3. Выброс АТФ.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III. 1. Выделение вкусовых клеток.

111.2. Культура клеток и трансфекция.

111.3. Электрофизиологические эксперименты.

111.4. Мониторинг внутриклеточного кальция (Ca-imaging).

111.5. Клеточные биосенсоры для АТФ и серотонина. Поиск и получение.

III. 5.1. Клеточные сенсоры на основе эндогенных рецепторов.

III.5.2. Клеточный сенсор к АТФ на основе экзогенных рецепторов.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

IV.1. Идентификация вкусовых клеток.

IV. 1.1. Идентификация вкусовых клеток на основе электрофизиологических критериев.

IV. 1.2. Определение морфофункциональных клеточных типов, соответствующих электрофизиологически идентифицированным.

IV. 1.3. Неинвазивная идентификация вкусовых клеток.

IV.2. Функциональный анализ клеток типа 1.

IV.2.1. Ионные каналы клеток Iтипа.

IV.2.2. Чувствительность клеток I типа кАТФ, глутамату и ацетилхолипу.

Предполагаемая роль АТФ в паракринной регуляции.

IV. 2.3. Чувствительность клеток I типа к горькому.

IV.3. Функциональный анализ клеток типа II.

1V.3.1. Электрофизиологическая активность ионного канала TRPM5 в клетках II типа.

IV.3.2. Клетки типа II высвобождают АТФ при стимуляции.

IV.3.3. Клеточные механизмы афферентной нейропередачи. Роль потенциалов действия.

IV.3.4. Молекулярная природа АТФ-проницаемого канала клеток типа II.

Ингибиторы. Коннексины versus паннексин 1.

IV. 3.5. Роль митохондрий в афферентной нейропередаче.

IV.4. Функциональный анализ клеток типа III.

1V.4.1. Ионные каналы вкусовых клеток типа III.

IV.4.2. Роль потенциалов действия в кодировании информации. Афферентная нейропередача.

IV. 4.3. Чувствительность клеток типа III к аминокислотам и кальцию. Функциональная экспрессия кальций-чувствующего рецептора.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Романов, Роман Александрович

VI. ВЫВОДЫ.

1. Проведен функциональный анализ гетерогенной популяции вкусовых клеток в препаратах диссоциированных желобоватых, листовидных и грибовидных вкусовых сосочков с использованием электрофизиологических и фотометрических методов. Показано, что вне зависимости от типа исследуемого вкусового сосочка для популяции вкусовых клеток характерны три функциональных инварианта. Установлено, что каждый функциональный клеточный инвариант соответствует определенному морфологическому подтипу (тип I - тип III), идентифицируемому по профилю маркерных белков. Полученные корреляции позволили сформулировать функциональные критерии для идентификации индивидуальных вкусовых клеток при их исследовании физиологическими методами.

2. Изучены механизмы электрогенеза и электрической возбудимости в идентифицированных вкусовых клетках. В частности, показано, что по своим электрическим характеристикам вкусовые клетки типа III сходны с нейрональными клетками и способны генерировать пачки потенциалов действия в ответ на деполяризацию. Показано, что в клетках типа III функционируют Са2+ каналы Ь- типа, которые обеспечивают вход наружного Са2+ и выброс серотонина в ответ на деполяризацию.

4. Клетки типа I по своим электрорфизиологическим свойствам сходны с глиальными клетками. Показано, что в клетках типа I функционируют метаботропные рецепторы к таким нейроактивным веществам, как АТФ, АДФ, УТФ, ацетилхолин и карбахол, глутамат, которые сопряжены с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией I I внутриклеточного Са . Са -мобилизация сопровождается стимуляцией

4 . входящего тока через Са -активируемые СГ-каналы. Субпопуляция клеток типа I оказалась способной детектировать горькое вещество денатоний, которое вызывало мобилизацию цитозольного кальция при участии фосфоинозитидного каскада и активацию Са -активируемых СГ-каналов.

5. Отработана оригинальная методика мониторинга секреции нейроактивных веществ (АТФ," серотонина) из одиночных клеток с использованием клеточных биосенсоров на основе экзогенных/эндогенных рецепторов, сопряженных с Са2+ мобилизацией.

6. С использованием метода биосенсора впервые показано, что в желобоватых листовидных и грибовидных сосочках клетки вкусовой почки высвобождают афферентный нейромедиатор, АТФ, в ответ на вкусовую и электрическую стимуляцию. Исследованы клеточные источники и механизмы секреции АТФ вкусовыми клетками типа II. Установлено, что в секрецию вовлечен АТФ митохондриального, а не гликолизного происхождения, и что АТФ высвобождается через потенциал-зависимые АТФ-проницаемые ионные каналы без участия экзоцитоза. Впервые проанализирована роль потенциалов действия в афферентной нейропередаче во вкусовой почке и показано, что спайки обеспечивают квантовый характер высвобождении афферентного нейромедиатора АТФ из клеток типа II. Впервые разработана математическая модель потенциал-зависимой секреции АТФ при участии АТФ-проницаемых ионных каналов.

7. Проанализирована возможная роль в секреции АТФ вкусовыми клетками типа II канального белка Panxl, рассматривавшегося в качестве основного претендента на роль АТФ-проницаемого канала. С использованием совокупности методов, включая животных с нокаутированным геном Panxl, ингибиторный анализ, сравнительный биофизический анализ рекомбинантного Panxl и АТФ-проницаемых ионных каналов вкусовых клеток, впервые получены свидетельства, что канальный белок Panxl не вовлечен в секрецию АТФ во вкусовых клетках типа II. Это, в сочетании с другими данными, указывает на то, что АТФ-проницаемые каналы во вкусовых клетках типа II формируются не Panxl, а белками щелевых контактов - коннексинами.

8. Исследованы биофизические характеристики ионного канала TRPM5 in situ и в экспрессионной системе, являющегося ключевым элементом в каскаде вкусовой трансдукции в клетках типа II. Показано, что в условиях in situ повышение уровня цитозольного кальция ведет к активации TRPM5, блокируемого оксидом трифенилфосфина (ТФО), эффективно ингибирующего токи через рекомбинантный TRPM5, клонированный из вкусовых клеток. Подтверждена высокая термочувствительность TRPM5 in situ (QI0>6).

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Итак, данное исследование было посвящено анализу механизмов функционирования периферического вкусового анализатора на клеточном уровне. Одна из основных трудностей такого анализа состояла в том, что популяция клеток вкусовой почки гетерогенна и включает клетки нескольких морфологически различных типов: тип I - темные, тип II - светлые, тип III -промежуточные. Морфологические подтипы клеток отражают их функциональное различие. На сегодняшний день известно, что клетки типа II являются рецепторными для вкусовых категорий горького, сладкого и умами (вкус аминокислот); вкусовые клетки III типа ответственны за восприятие кислого, а клетки I типа, помимо глиальной функции, участвуют в рецепции соленого. Поэтому нам представлялось, что адекватное исследование молекулярных механизмов вкуса на клеточном уровне возможно только с использованием идентифицированных вкусовых клеток. Поскольку в физиологических и других экспериментах с одиночными клетками морфологические критерии обычно ненадежны и поэтому практически неприменимы, нами была поставлена задача разработать функциональные критерии для идентификации клеток различных типов. Мы

Л 1 проанализировали методами patch-clamp, Са -imaging и флуоресцентной микроскопии более 1000 одиночных вкусовых клеток, включая клетки из генетически модифицированных животных, что позволило разработать: а) простые электрофизиологические критерии; б) неинвазивные критерии для идентификации клеток типов I, II и III, включая популяцию горько-чувствующих клеток типа И. В идентифицированных вкусовых клетках были охарактеризованы ионные каналы, включая потенциал-зависимые ионные каналы и каналы, активность которых контролируется при участии внутриклеточных сигнальных каскадов. Проанализирована специфическая химическая чувствительность клеток с использованием широкого набора агонистов.

В этих клетках нами впервые электрофизиологически зарегистрирован и исследован ионный канал ТЯРМ5, нокаут которого приводит к потере чувствительности к горькому, сладкому и умами. Подтверждена необычная термочувствительность канала, ранее продемонстрированная лишь на рекомбинантном Т11РМ5, которая вносит существенный вклад в зависимость вкусовых ощущений от температуры.

Долгое время оставалось неясным, каким образом клетки II типа осуществляют передачу информации о вкусе на нервные окончания, ведь в этих клетках отсутствуют классические синаптические структуры, пресинаптический белок 8ЫАР-25 и потенциал-зависимые кальциевые каналы. Данное исследование позволило ответить на этот вопрос. С использованием метода клеточного АТФ-биосенсора мы выяснили, что клетки типа II высвобождают афферентный нейромедиатор, АТФ, в ответ на деполяризацию. Выброс АТФ клетками типа II не зависел от кальция, что свидетельствовало против классического Са2+-зависимого везикулярного механизма. Исследования с применением методов флуоресцентных трейсеров и электрофизиологического анализа селективности каналов показали, что секреция АТФ обеспечивается АТФ-проницаемыми ионными каналами. Ингибиторный анализ, сравнение свойств нативных ПЗ АТФ-проницаемых каналов во вкусовых клетках с рекомбинантным паннексином1, эксперименты на мышах, нокаутных по паннексину1, а также математическое моделирование кинетических свойств этих каналов свидетельствовали о том, что во вкусовых клетках II типа АТФ-проницаемый канал формируется канальными белками из семейства коннексинов.

Важным свойством клеток II типа является их способность генерировать потенциалы действия (ПД). В то же время другие вторичные сенсорные клетки, не имеющих аксонов, например фоторецепторы позвоночных и волосковые клетки органа Корти не используют ПД для кодирования и передачи сенсорной информации и не способны их генерировать. Поэтому целесообразность генерации ПД для вкусовой трансдукции была не вполне ясна. При исследовании потенциал-зависимости выброса АТФ из вкусовых клеток типа II с применением метода клеточного АТФ-биосенсора мы обнаружили, что зависимость АТФ-секреции от мембранного потенциала характеризуется крутой S-образной кривой с порогом —10-0мВ. При такой крутой пороговой характеристике, градуальные рецепторные потенциалы не способны вызывать высвобождение афферентного нейромедиатора в широком диапазоне рецепторных потенциалов. Однако, если стимул-зависимая деполяризация сопровождается генерацией ПД, частота или количество которых пропорциональны величине рецепторного потенциала, то тогда количество высвободившегося АТФ будет пропорционально интенсивности вкусового стимула. Это обеспечивает адекватное кодирование сенсорной информации, а за счет высокой крутизны зависимости высвобождения АТФ от потенциала фактически происходит квантовый (т.е. унифицированный по кинетике и величине) выброс АТФ в ответ на каждый ПД через неселективные ионные каналы.

С использованием 2 типов АТФ-сенсоров (АТФ- и АТФ/АДФ-специфичного) мы показали, что при потенциал-зависимой нейротрансмиссии основной пул АТФ для высвобождения имеет митохондриальное а не гликолизное происхождение. С учетом литературных данных, полученных с помощью электронной микроскопии, о локализации в непосредственной близости к плазматической мембране специфической митохондрии во вкусовых клетках типа II, а также наших косвенных свидетельств о падении интенсивности выброса АТФ и индукции входа кальция при деполяризации клеток II типа с деградировавшей ультраструктурой, мы предполагаем, что в клетках типа II функционирует специальный компартмент, включающий коннексоны плазматической мембраны и локализованную рядом митохондрию, служащий для высвобождения АТФ в акте вкусовой нейропередачи.

Мы также показали, что приложенный ток при электростимуляции вкусовых клеток типа III перекодировался ими в частотные характеристики серии потенциалов действия пропорционально интенсивности стимула. Сопровождающая данное явление деполяризация клеток типа III приводила к резкому подъему уровня цитозольного кальция за счет активации ПЗ Са2+-каналов, что стимулировало высвобождение серотонина. Такие свойства клеток III типа позволяют хорошо объяснить то, как эти клетки кодируют и передают сенсорную информацию о кислом.

Удивительно было обнаружить, что клетки типа III также чувствительны к наружному кальцию и широкому спектру аминокислот: фенилаланин, аргинин и глутамат, а также высокий экстраклеточный кальций вызывали в клетках данного типа кальциевые ответы, опосредованные выходом в клетку депонированного кальция и входом через кальций-проницаемые ионные каналы. Анализ при помощи специфических агонистов (ЫРБ 11-568, неомицин) позволил нам утверждать, что данная чувствительность обеспечивается функциональной активностью в этих клетках кальций-чувствующего рецептора (СаБЯ). Возможно, данное свойство вкусовых клеток типа III связано напрямую с вкусовой чувствительностью, поскольку глутамат вызывает негативную реакцию у мышей с нокаутом ТШЗ-рецептора (УазиггШБи е1 а1, 2012), а повышение кальция характеризуется горьким ощущением. Хотя также остается вероятным, что данный рецептор опосредует модуляцию клеток типа III эфферентными нервными окончаниями, так как недавно были получены свидетельства в пользу участия глутамата в эфферентной нейромодуляции клеток вкусовой почки.

Исследование функциональных свойств популяции клеток типа I показало, что эти клетки обладают уникальными для вкусовой почки рецепторными свойствами - именно среди клеток данного типа оказались клетки, чувствительные к ряду агонистов: АТФ и УТФ, АДФ, ацетилхолин и глутамат в микромолярных концентрациях стимулировали мобилизацию кальция и активацию кальций-активируемого хлорного канала в клетках этого типа. Как известно, клетки I типа несут на плазматической мембране экто-АТФ-азу NTPDase2, гидролизующую экстраклеточный АТФ до АМФ, и глиа-специфичный глутамат/аспартат транспортер (GLAST), закачивающий экстраклеточный глутамат в клетки. Кроме того, эти клетки имеют крыловидные отростки, которые создают физический барьер между клетками вкусовой почки и, по-видимому, ограничивают межклеточное пространство с нервными окончаниями от растекания нейромедиатора. В апикальной части этих клеток имеются электроноплотные гранулы, которые, возможно, секретируются во вкусовую пору. Мы полагаем, что уникальная для вкусовой почки чувствительность клеток типа I к различным нейроактивным веществам позволяет им регулировать выполнение глиальных функций и запускать различные адаптационные механизмы при наличии нейромедиаторов в межклеточном пространстве, например, модулируя активность ШТ)азы2 и GLAST, а также индуцируя секрецию во вкусовую пору.

Интересно, что клетки типа I оказались хорошо отвечающими на денатоний повышением уровня цитозольного кальция. Роль данной сигнализации остается не ясной, однако сам факт говорит о том, что денатоний не следует использовать в качестве вкусового стимула для исследования трансдукционных механизмов на неидентифицированных I клетках, что пока является достаточно распространенной исследовательской практикой.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Романов, Роман Александрович, Пущино

1. Abbaffy Т, Trubey KR, Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and modulation of cAMP in rat taste cells. II Am J Physiol Cell Physiol. 2003.284, 1420-1428.

2. Abraham EH, Prat AG, Gerweck L, Seneveratne T, Arceci RJ, Kramer R, Guidotti G, Cantiello HF. The multidrug resistance (mdrl) gene product functions as an ATP channel. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. 90, 312-316.

3. Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, Zuker CS. Novel Family of Mammalian Taste Receptors. // Cell. 2000. 100, 693-702.

4. Akabas M, Dodd J, Awqati Q. Identification of electrophysiological^ distinct subpopulations of rat taste cells. // JMembr Biol. 1990. 114 (1), 71-8.

5. Avenet P, Lindemann B. Amiloride-blockable sodium currents in isolated taste receptor cells. IIJ Membrane Biol 1988. 105,245-255.

6. Avenet P, Lindemann B. Noninvasive recording of receptor cell action potentials and sustained currents from single taste buds maintained in the tongue: the response to mucosal NaCl and amiloride. IIJ Membr Biol. 1991. 124, 33-41.

7. Bao L, Locovei S, Dahl G. Pannexin membrane channels are mechanosensitive conduits for ATP. // FEBSLett. 2004. 572, 65-68.

8. Bartel DL, Sullivan SL, Lavoie EG, Sevigny J, Finger ТЕ. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the Ecto-ATPase of type I cells in taste buds. // J Comp Neurol. 2006. 497: 1-12.

9. Baryshnikov SG, Rogachevskaja OA, Kolesnikov SS. Cacium signaling mediated by P2Y receptors in mouse taste cells. // JNeurophysiol. 2003. 90,3283-3294.

10. Behe P, DeSimone JA, Avenet P, Lindemann B. Membrane currents in taste cells of the rat fungiform papilla. Evidence for two types of Ca currents and inhibition of К currents by saccharin. IIJ Gen Physiol. 1990. 96,1061-1084.

11. Beidler LM, Smallman RL. Renewal of cells within taste buds. // J Cell Biol. 1965. 27(2), 263-72.

12. Beis I, Newsholme EA. The contents of adenine nucleotides, phosphagens and some glycolytic intermediates in resting muscles from vertebrates and invertebrates. // Biochem J. 1975.152,23-32.

13. Bell PD, Lapointe J-Y, Sabirov R, Hayashi S, Peti-Peterdi J, Manabe К, Ко vacs G, Okada Y. Macula densa cell signaling involves ATP release through a maxi anion channel. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003.100,4322-4327.

14. Benos DJ, Stanton BA. Functional domain within the degenerin/epithelial sodium channel (Deg/ENaC) superfamily of ion channels. IIJ Physiol. 1999. 520,631-644.

15. Bernhardt SJ, Nairn M, Zehavi U, Lindemann B. Changes in IP3 and cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of sweet taste in the rat. // J Physiol. 1996. 490,25-36.

16. Bianchi L, Driscoll M. Protons at the gate: DEG/ENaC ion channels help us feel and remember. II Neuron. 2002. 34,337-340.

17. Bigiani A, Delay RJ, Chaudhari N, Kinnamon SC, Roper SD. Responses to glutamate in rat taste cells. IIJ Neurophysiol. 1997. 77, 3048-3059.

18. Bigiani A, Ghiaroni V, Fieni F. Channels as taste receptors in vertebrates. // Progress in Biophysics & Molecular Biology. 2003. 83,193-225.

19. Bigiani A. Mouse taste cells with glia-like membrane properties. // JNeurophysiol. 2001a. 85,1552-1560.

20. Bigiani A. Amiloride-sensitive sodium currents in identified taste cells of the frog. // NeuroReport. 2001b. 12,1315-1321.

21. Bigiani AR, Roper SD. Mediation of responses to calcium in taste cells by modulation of a potassium conductance. // Science. 1991.252,126-128.

22. Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, Burnstock G. Localization of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds. // Neuroreport. 1999. 10, 1107-1111.

23. Bodin P, Burnstock G. Purinergic signalling: ATP Release. // Neurochem Res. 2001. 26, 959-969.

24. Boughter JD, Pumplin DW, Yu C, Christy RC, Smith DV. Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and hamster. // J Neurosci. 1997. 17, 28522858.

25. Breitwieser GE, Miedlich SU, Zhang M. Calcium sensing receptors as integrators of multiple metabolic signals. // Cell Calcium. 2004. 35,209-216.

26. Bruzzone R, Barbe MT, Jakob NJ, Monyer H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. // J Neurochem. 2005. 92,1033-1043.

27. Bruzzone R, Hormuzdi SG, Barbe MT, Herb A, Monyer H. Pannexins, a family of gap junction proteins expressed in brain. // Proc Natl Acad Sei USA. 2003. 100,13644-13649.

28. Bungay PM, Newton-Vinson P, Isele W, Garris PA, Justice JB. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. // J Neurochem. 2003. 86,932-946.

29. Burger PM, Mehl E, Cameron PL, Maycox PR, Baumert M, Lottspeich F, De Camilli P, Jahn R. Synaptic vesicles immunoisolated from rat cerebral cortex contain high levels of glutamate. II Neuron. 1989. 3, 715-720.

30. Burnstock G. The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. // Neuropharmacology. 1997. 36,1127-1139.

31. Bystrova MF, Yatzenko YE, Fedorov IV, Rogachevskaja OA, Kolesnikov SS. P2Y isoforms operative in mouse taste cells. // Cell and Tissue Research. 2006. 323, 377-382.

32. Caicedo A, Jafri MS, Roper SD. In Situ Ca2+ Imaging Reveals Neurotransmitter Receptors for Glutamate in Taste Receptor Cells. II J Neurosci. 2000.20,7978-7985.

33. Caicedo A, Kim KN, Roper SD. Glutamate-induced cobalt uptake reveals non-NMDA receptors in rat taste cells. // J Comp Neurol. 2000b. 417, 315-24.

34. Caicedo A, Pereira E, Margolskee RF, Roper SD. Role of the G-protein subunit alpha-gustducin in taste cell responses to bitter stimuli. // JNeurosci. 2003.23, 9947-9952.

35. Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W, Zuker CS, Ryba N. T2Rs Function as Bitter Taste Receptors. // Cell. 2000.100,703-711.

36. Chang HT, Yeung ES. Determination of catecholamines in single adrenal medullary cells by capillary electrophoresis and laser-induced native fluorescence. // Anal. Chem. 1995. 67, 1079-1083.

37. Chan-Palay V, Jonsson G, Palay SL. Serotonin and substance P coexist in neurons of the rat's central nervous system. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978. 75, 1582-1586.

38. Chaudhari N, Landin AM, Roper SD. A novel metabotropic glutamate receptor is a taste receptor for monosodium L-glutamate. // Nat Neurosci. 2000. 3, 113-119.

39. Chaudhari N, Pereira E, Roper SD. Taste receptors for umami: the case for multiple receptors. //Am J Clin Nutr. 2009. 90, 738S-742S.

40. Chaudhari N, Yang H, Lamp C, Delay E, Cartford C, Than T, Roper S. The taste of monosodium glutamate, Membrane receptors in taste buds. // JNeurosci. 1996. 16,3817-3826.

41. Chaytor AT, Evans WH, Griffith TM. Peptides homologous to extracellular loop motifs of connexin 43 reversibly abolish rhythmic contractile activity in rabbit arteries. IIJ Physiol. 1997. 503,99-110.

42. Chaytor AT, Martin PE, Edwards DH, Griffith TM. Gap junctional communication underpins EDHF-type relaxations evoked by ACh in the rat hepatic artery. II Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001.280, H2441-H2450.

43. Chen G, Ewing AG. Chemical analysis of single cells and exocytosis. // Crit, Rev. Neurobiol. 1997. 11,59-90.

44. Chen G, Gavin PF, Luo G, Ewing AG. Observation and quantitation of exocytosis from the cell body of a fully developed neuron in planorbis corneus. II J Neurosci. 1995. 15, 77477755.

45. Chen KC, Budygin EA. Extracting the basal extracellular dopamine concentrations from the evoked responses: re-analysis of the dopamine kinetics. IIJ Neurosci Methods. 2007. 164, 27-42.

46. Chen Y, Herness MS. Electrophysiological actions of quinine on voltagedependent currents in dissociated rat taste cells. // PJlugers Arch. 1997. 434,215-26.

47. Chen YS, Sun XD, Herness MS. Characteristics of action potentials and their underlying outward currents in rat taste receptor cells. // JNeurophysiol. 1996. 75, 820-31.

48. Clapp TR, Medler KF, Damak S, Margolskee RF, Kinnamon SC. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. // BMC Biol. 2006. 4, 7.

49. Clapp TR, Stone LM, Margolskee RF, Kinnamon SC. Immunocytochemical evidence for co-expression of Type III receptor with signaling components of bitter taste transduction. // Neuroscience. 2001. 6,2-10.

50. Clapp TR, Trubey KR, Vandenbeuch A, Stone LM, Margolskee RF, Chaudhari N, Kinnamon SC. Tonic activity of Galpha-gustducin regulates taste cell responsivity. // FEBS Lett. 2008. 582,3783-3787.

51. Clapp TR, Yang R, Stoick CL, Kinnamon SC, Kinnamon JC. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. // J Comp Neurol. 2004. 468, 311-321.

52. Consolazione A, Milstein C, Wright B, Cuello AC. Immunocytochemical detection of serotonin with monoclonal antibodies. // JHistochem Cytochem. 1981. 29,1425-1430.

53. Cotrina ML, Lin JH, Alves-Rodrigues A, Liu S, Li J, Azmi-Ghadimi H, Kang J, Naus CC, Nedergaard M. Connexins regulate calcium signaling by controlling ATP release. // Proc Natl AcadSci USA. 1998. 95, 15735-15740.

54. Crank J. The Mathematics of Diffusion. 1st ed. Oxford University Press, Oxford, UK. 1985.432 pp.

55. Cruciani V, Mikalsen SO. The vertebrate connexin family. // Cell Mol Life Sci. 2006. 63, 1125-1140.

56. Cummings TA, Kinnamon SC. Apical K+-channels in Necturus taste cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. // J Gen Physiol. 1992. 99, 591-613.

57. Dale N. Dynamic ATP signalling and neural development. IIJ Physiol. 2008. 586, 24292436.

58. Damak S, Rong M, Yasumatsu K, Kokrashvili Z, Pérez CA, Shigemura N, Yoshida R, Mosinger B Jr, Glendinning JI, Ninomiya Y, Margolskee RF. Trpm5 null mice respond to bitter, sweet, and umami compounds. // Chem Senses. 2006. 31,253-64.

59. De Fazio RA, Dvoryanchikov G, Maruyama Y, Kim JW, Pereira E, Roper SD, Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in mouse taste buds. // JNeurosci. 2006.26, 3971-3980.

60. De Vuyst E, Decrock E, Cabooter L, Dubyak GR, Naus CC, Evans WH, Leybaert L. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. // EMBO J. 2006. 25, 34-44.

61. Delay RJ, Kinnamon JC, Roper SD. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: 2. Cell types and cell lineage. // JComp Neurol. 1986. 253,242-252.

62. Delay RJ, Kinnamon SC, Roper SD. Serotonin modulates voltage dependent calcium current in Necturus taste cells. // JNeurophysiol. 1997. 77,2515-2524.

63. Delay RJ, Roper SD. Ultrastructure of taste cells and synapses in the mudpuppy Necturus maculosus. II JComp Neurol. 1988.277,268-280.

64. Delay RJ, Taylor R, Roper SD. Merkel-like basal cells in Necturus taste buds contain serotonin. 11J Comp Neurol. 1993. 335, 606-613.

65. DeSimone JA, Callaham EM, Heck GL. Chorda tympani taste response of rat to hydrochloric acid subject to voltage-clamped lingual receptive field. II Am J Physiol. 1995. 268, 1295-1300.

66. DeSimone JA, Heck GL, DeSimone SK. Active ion transport in dog tongue: a possible role in taste. // Science. 1981.214,1039-1041.

67. DeSimone JA, Heck GL, Mierson S, DeSimone SK. The active ion transport properties of canine lingual epithelia in vitro—implications for gustatory transduction. IIJ Gen Physiol. 1984. 83, 633-656.

68. Díaz D, Bartolo R, Delgadillo DM, Higueldo F, Gomora JC. Contrasting effects of Cd2+ and Co2+ on the blocking/unblocking of human Cav3 channels. // J Membr Biol. 2005. 207, 91105.

69. Donaldson SH, Lazarowski ER, Picher M, Knowles MR, Stutts MJ, Boucher RC. Basal nucleotide levels, release and metabolism in normal and cystic fibrosis airways. // Mol Med. 2000. 6, 969-982.

70. Donaldson SH, Picher M, Boucher RC. Secreted and cell-associated adenylate kinase and nucleoside diphosphokinase contribute to extracellular nucleotide metabolism on human airway surfaces. II Am JRespir Cell Mol Biol. 2002. 26,209-215.

71. Doolin RE, Gilbertson TA. Distribution and characterization of functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. IIJ Gen Physiol. 1996. 107, 545-554.

72. Elliott EJ, Simon SA. The anion in salt taste: a possible role for paracellular pathways. // Brain Res. 1990. 535,9-17.

73. Eskandari S, Zampighi GA, Leung DW, Wright EM, Loo DD. Inhibition of gap junction hemichannels by chloride channel blockers. // J Membr Biol. 2002.185, 93-102.

74. Evans R.M., Zamponi G.W. 2006. Presynaptic Ca channels—integration centers for neuronal signaling pathways. Trends Neurosci. 29,617-624.

75. Evans RJ, Derkach V, Surprenant A. ATP mediates fast synaptic transmission in mammalian neurons. // Nature. 1992. 357,503-505.

76. Farbman AI. Renewal of taste bud cells in rat circumvallate papillae. // Cell Tissue Kinet. 1980.13, 349-357.

77. Fedorov IV, Rogachevskaja OA, Kolesnikov SS. Modeling P2Y receptor-Ca2+ response coupling in taste cells. // Biochim Biophys Acta. 2007. 1768,1727-1740.

78. Finger ET, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L, Hellekant G, Kinnamon SC. ATP Signaling Is Crucial for Communication from Taste Buds to Gustatory Nerves. // Science. 2005. 310, 1495-1499.

79. FischerW, Franke H, Groger-Arndt H, liles P. Evidence for the existence of P2Y(1,2,4) receptor subtypes in HEK-293 cells: reactivation of P2Y(1) receptors after repetitive agonist application // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2005. 371,466-472.

80. Fossier P, Tauc L, Baux G. Calcium transients and neurotransmitter release at an identified synapse. // Trends Neurosci. 1999. 22,161-166.

81. Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Differential distribution of two Ca+-dependent and -independent K+ channels throughout receptive and basolateral membranes of bullfrog taste cells. II Arch Eur J Physiol. 1994.429,285-290.

82. Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Non-selective cation channel in bullfrog taste cell membrane. //NeuroReport. 1993. 5,11-13.

83. Furue H, Yoshii K. In-situ tight-seal recordings of taste substance- elicited action currents and voltage-gated Ba currents from single taste bud cells in the peeled epithelium of mouse tongue. II Brain Res. 1997. 776,133-139.

84. Ganchrow JR. Taste cell function, Structural and biochemical implications. // Physiol Behav. 2000. 69,29-40.

85. Garty H, Palmer LG. Epithelial sodium channels: function, structure, and regulation. // Physiol Rev. 1997. 77,359-396.

86. Gilbertson TA, Avenet P, Kinnamon SC, Roper SD. Proton currents through amiloride-sensitive Na channels in hamster taste cells role in acid transduction. // J Gen Physiol. 1992. 100, 803-824.

87. Gilbertson TA, Damak S, Margolskee RF. The molecular physiology of taste transduction. // Curr Opin Neurobiol. 2000. 10, 519-527.

88. Gilbertson TA, Roper SD. Kinnamon SC. Proton currents through amiloride-sensitive Na+ channels in isolated hamster taste cells: enhancement by vasopressin and cAMP. // Neuron. 1993.10,931-942.

89. Gilbertson TA, Zhang H. Characterization of sodium transport in gustatory epithelia from the hamster and rat. // Chem Senses. 1998a 23,283-293.

90. Gilbertson TA, Zhang H. Self-inhibition in amiloride-sensitive sodium channels in taste receptor cells. IIJ Gen Physiol. 1998b. Ill, 667-677.

91. González D, Gómez-Hernández JM, Barrio LC. Molecular basis of voltage dependence of connexin channels: an integrative appraisal. // Prog Biophys Mol Biol. 2007. 94,66-106.

92. Hacker K, Laskowski A, Feng L, Restrepo D, Medler K. Evidence for two populations of bitter responsive taste cells in mice. IIJNeurophysiol. 2008. 99,1503-1514.

93. Hacker K, Medler KF. Mitochondrial calcium buffering contributes to the maintenance of Basal calcium levels in mouse taste cells. IIJ Neurophysiol. 2008. 100,2177-2191.

94. Hapuarachchi S, Janaway GA, Aspinwall CA. Capillary electrophoresis with a UV light-emitting diode source for chemical monitoring of native and derivatized fluorescent compounds. II Electrophoresis. 2006.27,4052-4059.

95. Harris AL. Connexin channel permeability to cytoplasmic molecules. // Prog Biophys Mol Biol. 2007. 94,120-143.

96. Hayashi S, Hazama A, Dutta AK, Sabirov RZ, Okada Y. Detecting ATP release by a biosensor method. // Sci STKE. 2004. 258, pi 14.

97. Hayashi S, Hazama A, Dutta AK, Sabirov RZ, Okada Y. Detecting ATP release by a biosensor method. // Sci STKE. 2004.258, pll4.

98. Hazama A, Fan HT, Abdullaev I, Maeno E, Tanaka S, Ando-Akatsuka Y, Okada Y. Swelling-activated, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-augmented ATP release and CI" conductances in murine CI 27 cells. // J Physiol. 2000. 523,1-11.

99. Hazama A, Hayashi S, Okada Y. Cell surface measurements of ATP release from single pancreatic beta cells using a novel biosensor technique. // Pfliigers Arch. 1998. 437,31-35.

100. Heck GL, Mierson S, DeSimone JA. Salt taste transduction occurs through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. // Science. 1984.223,403-405.

101. Herness MS, Gilbertson TA. Cellular mechanisms of taste transduction. I I Annu Rev Physiol. 1999. 61, 873-900.

102. Herness MS, Sun XD. Characterization of chloride currents and their noradrenergic modulation in rat taste receptor cells. // JNeurophysiol. 1999. 82,260-271.

103. Herness MS, Sun XD. Voltage-dependent sodium currents recorded from dissociated rat taste cells. // JMembr Biol. 1995. 146,73-84.

104. Herness S, Chen Y. Serotonergic agonists inhibit calcium-activated potassium and voltage-dependent sodium currents in rat taste receptor cells. IIJ Membr Biol. 2000.173(2), 127-38.

105. Herness S, Chen Y. Serotonin inhibits calcium-activated K+ current in rat taste receptor cells. II NeuroReport. 1997. 8, 3257-3261.

106. Herness S, Zhao F, Kaya N, Lu S, Shen T, Sun X. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. IIJ Physiol. 2002a. 543, 601-614.

107. Herness S, Zhao F, Lu S, Kaya N, Shen T. Expression and Physiological Actions of Cholecystokinin in Rat Taste Receptor Cells. IIJNeurosci. 2002b. 22,10018-10029.

108. Herness S. Coding in taste receptor cells: the early years of intracellular recordings. // Physiol Behav. 2000. 69,17-27.

109. Hisatsune C, Yasumatsu K, Takahashi-Iwanaga H, Ogawa N, Kuroda Y, Yoshida R, Ninomiya Y, Mikoshiba K. Abnormal taste perception in mice lacking the type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. IIJ Biol Chem. 2007. 282,37225-37231.

110. Hofer AM, Brown EM. Extracellular calcium sensing and signaling. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2003.4,530-538.

111. Hofstadler SA, Swanek FD, Gale DC, Ewing AG, Smith RD. Capillary electrophoresis electrospray-ionization fourier-transform ion-cyclotron resonance mass-spectrometry for direct analysis of cellular proteins. // Anal Chem. 1995. 67,1477-1480.

112. Holland VF, Zampighi GA, Simon SA. Tight junctions in taste buds: possible role in perception of intravascular gustatory stimuli. // Chem Senses. 1991. 16, 69-79.

113. Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba N, Zuker CS. Putative Mammalian Taste Receptors: A Class of Taste-Specific GPCRs with Distinct Topographic Selectivity. // Cell. 1999. 96, 541-551.

114. Huang AL, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Trankner D, Ryba NJ, Zuker CS. The cells and logic for mammalian sour taste detection. // Nature. 2006.442(7105), 934-8.

115. Huang L, Shanker YG, Dubauskaite J, Zheng JZ, Yan W, Rosenzweig S, Spielman AI, Max M, Margolskee RF. Ggammal3 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. // Nat Neurosci. 1999. 2, 1055-1062.

116. Huang Y-J, Lu K-S. Immunohistochemical studies on protein gene product 9.5, serotonin and neuropeptides in vallate taste buds and related nerves of the guinea pig. // Arch Histol Cytol. 1996. 59,433-441.

117. Huang YJ, Maruyama Y, Dvoryanchikov G, Pereira E, Chaudhari N, Roper SD. The role of pannexin 1 hemichannels in ATP release and cell-cell communication in mouse taste buds. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007.104,6436-6441.

118. Huang Y-J, Maruyama Y, Lu K-S, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D, Roper SD. Mouse Taste Buds Use Serotonin as a Neurotransmitter. IIJ Neurosci. 2005. 25(4), 843-847.

119. Hume JR, Duan D, Collier ML, Yamazaki J, and Horowitz B. Anion transport in heart. // Physiol Rev. 2000. 80,31-81.

120. Hume RI, Role LW, Fischbach GD. Acetylcholine release from growth cones detected with patches of acetylcholine receptor-rich membranes. // Nature. 1983. 305,632-634.

121. Iglesias R, Dahl G, Qiu F, Spray DC, Scemes E. Pannexin 1: the molecular substrate of astrocyte "hemichannels". // JNeurosci. 2009.29,7092-7097.

122. Jankowski JA, Tracht S, Sweedler JV. Assaying single cells with capillary electrophoresis.// Trends Anal. Chem. 1995.14,170-176.

123. Jiang P, Cui M, Zhao B, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Osman R, Margolskee RF, Max M. Lactisole interacts with the transmembrane domains of human T1R3 to inhibit sweet taste. // J Biol Chem. 2005. 280,15238-46.

124. Jiang P, Ji Q, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Margolskee RF, Max M. The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet proteins. // J Biol Chem. 2004. 279, 45068-45075.

125. Jones SR, Gainetdinov RR, Caron MG. Application of microdialysis and voltammetry to assess dopamine functions in genetically altered mice: correlation with locomotor activity. // Psychopharmacology. 1999.147,30-32.

126. Juusola M., French A.S., Uusitalo R.O., Weckstrom M. 1996. Information processing by graded-potential transmission through tonically active synapses. Trends Neurosci. 19,292-297.

127. Kanazawa H, Yoshie S. The taste bud and its innervation in the rat as studied by immunohistochemistry for PGP 9.5. II Arch Histol Cytol. 1996. 59,357-367.

128. Kang J, Kang N, Lovatt D, Torres A, Zhao Z, Lin J, Nedergaard M. Connexin 43 hemichannels are permeable to ATP. II J Neurosci. 2008. 28,4702-4711.

129. Karoly R, Mike A, Illes P, Gerevich Z. The unusual state-dependent affinity of P2X3 receptors can be explained by an allosteric two-open-state model. // Mol Pharmacol. 2008. 73, 224-234.

130. Kaske S, Krasteva G, König P, Kummer W, Hofmann T, Gudermann T, Chubanov V. TRPM5, a taste-signaling transient receptor potential ion-channel, is a ubiquitous signaling component in chemosensory cells. // BMC Neurosci. 2007. 8,49

131. Kataoka S, Yang R, Ishimaru Y, Matsunami H, Sevigny J, Kinnamon JC, Finger TE. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. // Chem Senses. 2008. 33,243-254.

132. Kataoka Y, Ohmori H. Activation of glutamate receptors in response to membrane depolarization of hair cells isolated from chick cochlea. //J. Physiol. 1994.477,403-414.

133. Kawagoe KT, Zimmerman JB, Wightman RM. Principles of voltammetry and microelectrode surface states. // J. Neurosci Meth. 1993.48,225-240.

134. Kawai K, Sugimoto K, Nakashima K, Miura H, Ninomiya Y. Leptin as a modulator of sweet taste sensitivities in mice. // Proc Natl Acad Sei USA. 2000. 97, 11044-11049.

135. Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, Herness S. A paracrine signaling role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor subtypes. II Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004.286(4), R649-58.

136. Kellenberger S, Schild L. Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. // Physiol Rev. 2002. 82, 735-767.

137. Kelliher KR, Spehr M, Li XH, Zufall F, Leinders-Zufall T. Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing. // Eur J Neurosci. 2006. 23, 3385-3390.

138. Kienitz MC, Bender K, Dermietzel R, Pott L, Zoidl G. Pannexin 1 constitutes the large conductance cation channel of cardiac myocytes. //J Biol Chem. 2011.286,290-298.

139. Kim DJ, Roper SD. Localization of serotonin in taste buds: a comparative study in four vertebrates. // J Comp Neurol. 1995. 353,364-70.

140. Kim M, Mistretta CM. 4-Aminopyridine reduces chorda tympani nerve taste responses to potassium and alkali salts in rat. // Brain Res. 1993. 612,96-103.

141. Kim MR, Kusakabe Y, Miura H, Shindo Y, Ninomiya Y, Hino A. Regional expression patterns of taste receptors and gustducin in the mouse tongue. // Biochem Biophys Res Commun. 2003.312(2), 500-6.

142. Kim YV, Bobkov YV, Kolesnikov SS. Adenosine triphosphate mobilizes cytosolic calcium and modulates ionic currents. // Neurosci Lett. 2000.290,165-168.

143. Kinnamon JC, Sherman TA, Roper SD Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. IIJ Comp Neurol. 1988. 270,1-10, 56-57.

144. Kinnamon JC, Taylor BG, Delay RJ, Roper SD. Ultrastructure of mouse taste buds. Taste cells and their associated synapses. // J Comp Neurol. 1985. 235,48-60.

145. Kinnamon SC, Dionne VE, Beam KG. Apical localization of K+ channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85, 7023-7027.

146. Kinnamon SC, Roper SD. Evidence for a role of voltage-sensitive apical K+ channels in sour and salt taste transduction. // Chem Senses. 1988.13,115-121.

147. Koch U, Magnusson AK. Unconventional GAB A release: mechanisms and function. // Curr. Opin. Neurobiol. 2009. 19,305-310.

148. Kolesnikov SS, Margolskee RF. A cyclic-nucleotide-suppressible conductance activated by transducin in taste cells. // Nature. 1995. 376, 85-88.

149. Kolesnikov SS, Margolskee RF. Extracellular K+ activates a K+ and FT1" - permeable conductance ion frog taste receptor cells. IIJ Physiol. 1998.507,415-432.

150. Kossel AH, McPheeters M, Lin W, Kinnamon SC. Development of membrane properties in taste cells of fungiform papillae: functional evidence for early presence of amiloride-sensitive sodium channels. // J Neurosci. 1997. 17, 9634-9641.

151. Kourennyi DE, Barnes S. Depolarization-induced calcium channel facilitation in rod photoreceptors is independent of G proteins and phosphorylation. // J Neurophysiol. 2000. 84, 133-138.

152. Kretz O, Barbry P, Bock R, Lindemann B. Differential expression of RNA and protein of the three pore-forming subunits of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel intaste buds of the rat. IIJHistochem Cytochem. 1999.47, 51-64.

153. Kumazawa T, Brand JG, Teeter JH. Amino acid-activated channels in the catfish taste system. // Biophys J. 1998. 75,2757-2766.

154. Kusakabe Y, Yamaguchi E, Tanemura K, Kameyama K, Chiba N, Arai S, Emori Y, Abe K. Identification of two alpha-subunit species of GTP-binding proteins, Gal5 and Gaq, expressed in rat taste buds. // Biochim Biophys Acta. 1998. 1403,265-272.

155. Lawton DM, Furness DN, Lindemann B, Hackney CM. Localization of the glutamate-aspartate transporter, GLAST, in rat taste buds. // Eur J Neurosci. 2000.12, 3163-3671.

156. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Constitutive release of ATP and evidence for major contribution of ecto-nucleotide pyrophosphatase and nucleoside diphosphokinase to extracellular nucleotide concentrations. // J Biol Chem. 2000. 275, 31061-31068.

157. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Interplay of constitutively released nucleotides, nucleotide metabolism and activity of P2Y receptors. // Drug Dev Res. 2001. 53, 66-71.

158. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. // Mol Pharmacol. 2003. 64, 785-795.

159. Lee SB, Lee CH, Kim SN, Chung KM, Cho YK, Kim KN. Type II and III Taste Bud Cells Preferentially Expressed Kainate Glutamate Receptors in Rats. // Korean J Physiol Pharmacol. 2009.13,455-460.

160. Leybaert L, Braet K, Vandamme W, Cabooter L, Martin PE, Evans WH. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. // Cell Commun Adhes. 2003. 10, 251257.

161. Li JH-Y, Lindemann B. Multi-photon imaging of extracellular tracers in taste disk and fungiform papilla of the frog. // Cell Tiss Res. 2003. 313,11-27.

162. Li X-J, Blackshaw S, Snyder SH. Expression and localization of amiloride-sensitive sodium channel indicate a role for non-taste cells in taste perception. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994.91, 1814-1818.

163. Li X-J, Xu R-H, Guggino WB, Snyder SH. Alternatively spliced forms of the alpha subunit of theepithelial sodium channel: distinct sites for amiloride binding and channel pore. // Mol Pharmacol. 1995.47,1133-1140.

164. Lin W, Finger TE, Rossier BC, Kinnamon SC. Epithelial Na+ channel subunits in rat taste cells: localization and regulation by aldosterone. // J Comp Neurol. 1999. 405,406-420.

165. Lin W, Kinnamon SC. Physiological evidence for ionotropic and metabotropic glutamate receptors in rat taste cells. // JNeurophysiol. 1999. 82,2061-2069.

166. Lin W, Rao S, Kinnamon SC, Gilbertson T. Evidence for expression of task-like K+ channels in rat taste cells. // Chem Senses. 2002. 27, All.

167. Lindemann B, Barbry P, Kretz O, Bock R. Occurrence of ENaC subunit mRNA and immunocytochemistry of the channel subunits in taste buds of the rat vallate papilla. // Ann NY Acad Sci. 1998.855,116-127.

168. Lindemann B. Receptors and transduction in taste.// Nature. 2001. 413,219-225.

169. Lindemann B. Taste reception. //Physiol Rev. 1996. 76, 718-766.

170. Lisman JE, Raghavachari S, Tsien RW. The sequence of events that underlie quantal transmission at central glutamatergic synapses. II Nat Rev Neurosci. 2007. 8, 597-609.

171. Liu D, Liman ER. Intracellular Ca2+ and the phospholipids PIP2 regulate the taste transduction ion channel TRPM5.1 I Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100,15160-15165.

172. Locovei S, Bao L, Dahl G. Pannexin 1 in erythrocytes: function without a gap. // Proc Natl Acad Sci USA. 2006a. 103,7655-7659.

173. Locovei S, Wang J, Dahl G. Activation of pannexin 1 channels by ATP through P2Y receptors and by cytoplasmic calcium. // FEBSLett. 2006b. 580,239-244.

174. LopezJimenez ND, Cavenagh MM, Sainz E, Cruz-Ithier MA, Battey JF, Sullivan SL. Two members of the TRPP family of ion channels, Pkdll3 and Pkd211, are co-expressed in a subset of taste receptor cells. // JNeurochem. 2006. 98,68-77.

175. Lucas P, Ukhanov K, Leinders-Zufall T, Zufall F. A diacylglycerol-gated cation channel in vomeronasal neuron dendrites is impaired in TRPC2 mutant mice: mechanism of pheromone transduction. //Neuron. 2003.40, 551-561.

176. Ma W, Compan V, Zheng W, Martin E, North RA, Verkhratsky A, Surprenant A. Pannexin 1 forms an anion-selective channel. // Pflugers Arch. 2012. Epub Feb 7.

177. Ma W, Hui H, Pelegrin P, Surprenant A. Pharmacological characterization of pannexin-1 currents expressed in mammalian cells. //JPharmacol Exp Ther. 2009. 328,409-418.

178. Margolskee RF. Molecular Mechanisms of Bitter and Sweet Taste Transduction. // J Biol Chem. 2002.277, 1-4.

179. Max M, Shanker Y.G, Huang L. TaslrS, encoding a new candidate taste receptor, is allelic to the sweet responsiveness locus Sac. II Nature Genet. 2001. 28, 58-63.

180. McLarnon SJ, Riccardi D. Physiological and pharmacological agonists of the extracellular Ca2+-sensing receptor. II Eur J Pharmacol. 2002. 447,271-278.

181. McLaughlin SK, McKinnon PJ, Margolskee RF. Gustducin is a taste-cell-specific G protein closely related to the transducins. I I Nature. 1992. 57, 563-569.

182. McLaughlin SK, McKinnon PJ, Spickofsky N, Danho W, Margolskee RF. Molecular cloning of G proteins and phosphodiesterases from rat taste cells. // Physiol Behav. 1994. 56(6), 1157-64.

183. Medler KF, Margolslee RF, Kinnamon SC. Electrophysiological characterization of voltage-gated currents in defined taste cell types in mice. // JNeurosci. 2003. 23,2608-2617.

184. Michael D.J., Wightman R.M. 1999. Electrochemical monitoring of biogenic amine neurotransmission in real time. JPharm BiomedAnal. 19, 33-46.

185. Mierson S, Olson MM, Tietz AE. 1996. Basolateral amiloride-sensitive Na+ transport pathway in rat tongue epithelium. // JNeurophysiol. 1996. 76,1297-1309.

186. Misaka T, Kusakabe Y, Emori Y, Gonoi T, Arai S, Abe K. Taste buds have a cyclic nucleotide-activated channel, CNGgust. IIJ Biol Chem. 1997. 272,22623-22629.

187. Miyamoto T, Fujiyama R, Okada Y, Sato T. Properties of Na+-dependent K+ conductance in the apical membrane of frog taste cells. // Brain Res. 1996b. 715, 79-85.

188. Miyamoto T, Miyazaki T, Fujiyama R, Okada Y, Sato T. Differential transduction mechanisms underlying NaCl- and KCl-induced responses in mouse taste cells. // Chem Senses. 2001.26,67-77.

189. Miyamoto T, Miyazaki T, Okada Y, Sato T. Whole-cell recording from non-dissociated taste cells in mouse taste bud. II JNeurosci Methods. 1996a. 64,245-252.

190. Montmayeur JP, Liberies SD, Matsunami H, Buck LB. A candidate taste receptor gene near a sweet taste locus. // Nat Neurosci. 2001 4,492-498.

191. Morimoto T, Popov S, Buckley KM, Poo MM. Calcium-dependent transmitter secretion from fibroblasts: modulation by synaptotagmin I. // Neuron. 1995. 15, 689-696.

192. Mueller KL, Hoon MA, Erlenbach I, Chandrashekar J, Zuker CS, Ryba NJ. The receptors and coding logic for bitter taste. // Nature. 2005.434,225-229.

193. Murata Y, Yasuo T, Yoshida R, Obata K, Yanagawa Y, Margolskee RF, Ninomiya Y. Action potential-enhanced ATP release from taste cells through hemichannels. IIJ Neurophysiol. 2010.104,896-901.

194. Murray RG, Murray A, Fujimoto A. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. // J Ultrastruct Res. 1969. 27,444-461.

195. Murray RG, Murray A. The anatomy and ultrastructure of taste endings. In Taste and Smell in Vertebrates, ed. GEW Wolstenholme, J Knight. 1970. pp. 3-30. London: Churchill.

196. Murray RG. The mammalian taste bud type III cell: a critical analysis. // J Ultrastruct Mol Struct Res. 1986. 95,175-188.

197. Nagai T, Kim DJ, Delay RJ, Roper SD. Neuromodulation of transduction and signal processing in the end organs of taste. // Chem Senses. 1996. 21, 353-365.

198. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJ, Zuker CS. An amino-acid taste receptor. //Nature. 2002.416(6877), 199-202.

199. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJ, Zuker CS. Mammalian sweet taste receptors. // Cell. 2001.106,381-390.

200. Nelson GM, Finger TE. Immunolocalization of different forms of neural cell adhesion molecule (NCAM) in rat taste buds. H JComp Neurol. 1993. 336, 507-516.

201. Nemeth EF, Steffey ME, Fox J. The parathyroid calcium receptor: a novel therapeutic target for treating hyperparathyroidism. // Pediatr Nephrol. 1996. 10,275-279.

202. Nirenberg MJ, Vaughan RA, Uhl GR, Kuhar MJ, Pickel VM. The dopamine transporter is localized to dendritic and axonal plasma membranes of nigrostriatal dopaminergic neurons. // JNeurosci. 1996. 16,436-447.

203. Noguchi T, Ikeda Y, Miyajima M, Yoshii K. Voltage-gated channels involved in taste responses and characterizing taste bud cells in mouse soft palates. // Brain Res. 2003. 982, 241— 259.

204. Obata H, Shimada K, Sakai N, Saito N. GABAergic neurotransmission in rat taste buds: immunocytochemical study for GAB A and GAB A transporter subtypes. // Mol Brain Res. 1991. 49,29-36.

205. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ in taste cells via activation of muscarinic receptors. // JNeurophysiol. 2002. 87,2643-2649.

206. Okada Y, Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Inositol 1,4,5-trisphosphate activates nonselective cation conductance via intracellular Ca2+ increase in isolated frog taste cells. // Eur J Neurosci. 1998. 10, 1376-1382.

207. Okutucu B, Telefoncu A. Optimization of serotonin imprinted polymers and recognition study from platelet rich plasma. // Talanta. 2008. 76, 1153-1158.

208. Oleson EB, Salek J, Bonin KD, Jones SR, Budygin EA. Real-time voltammetric detection of cocaine-induced dopamine changes in the striatum of freely moving mice. // Neurosci Lett. 2009.467,144-146.

209. Oleson EB, Talluri S, Childers SR, Smith JE, Roberts DC, Bonin KD., Budygin EA. Dopamine uptake changes associated with cocaine self-administration. // Neuropsychopharmacology. 2009. 34,1174-1184.

210. Ostrom RS, Gregorian C, Insel PA. Cellular release of and response to ATP as key determinants of the set-point of signal transduction pathways. // J Biol Chem. 2000. 275, 1173511739.

211. Palmer LG. Ion selectivity of epithelial Na channels. // J Membr Biol. 1987. 96, 97-106.

212. Panchin Y, Kelmanson I, Matz M, Lukyanov K, Usman N, Lukyanov S. A ubiquitous family of putative gap junction molecules. // Curr Biol. 2000. 10, R473-474.

213. Paton DM. Letter: Effect of substituted tryptamines on the efflux of noradrenaline from adrenergic nerves in rabbit atria. // Br J Pharmacol. 1973. 49, 614-627.

214. Pearson JD, Gordon JL. Vascular endothelial and smooth muscle cells in culture selectively release adenine nucleotides. II Nature. 1979.281,384-386.

215. Pelegrin P, Surprenant A. Pannexin-1 couples to maitotoxin- and nigericin-induced interleukin-lbeta release through a dye uptake-independent pathway. // J Biol Chem. 2007. 282, 2386-2394.

216. Pelegrin P, Surprenant A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-lbeta release by the ATP-gated P2X7 receptor. II EMBO J. 2006. 25,5071-5082.

217. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, Max M, Margolskee RF. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. // Nat Neurosci. 2002. 5(11), 1169-76.

218. Perry M, Li Q, Kennedy RTReview of recent advances in analytical techniques for the determination of neurotransmitters. // Analytica Chimica Acta. 2009. 653,1-22.

219. Pi M, Faber P, Ekema G, Jackson PD, Ting A, Wang N, Fontilla-Poole M, Mays RW, Brunden KR, Harrington JJ, Quarles LD. Identification of a novel extracellular cation-sensing G-protein-coupled receptor. IIJ Biol Chem. 2005.280,40201-40209.

220. Picher M, Boucher RC. Human airway ecto-adenylate kinase. A mechanism to propagate ATP signaling on airway surfaces. II J Biol Chem. 2003. 278,11256-11264.

221. Pivato LS, Constantin RP, Ishii-Iwamoto EL, Kelmer-Bracht AM, Yamamoto NS, Constantin J, Bracht A. Metabolic effects of carbenoxolone in rat liver. // J Biochem Mol Toxicol. 2006.20,230-240.

222. Pratt EB, Brink TS, Bergson P, Voigt MM, Cook SP. Use-dependent inhibition of P2X3 receptors by nanomolar agonist. // JNeurosci. 2005.25, 7359-7365.

223. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel В, Fleig A, Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to rapid changes in Ca2+.,. // Proc Natl Acad Sei USA. 2003.100,15166-15171.

224. Revay R, Vaughaa R, Grant S, Kuhar MJ. Dopamine transporter immunohistochemistry in median eminence, amygdala, and other areas of the rat brain. II Synapse. 1996. 22,93-99.

225. Roberts CD, Dvoryanchikov G, Roper SD, Chaudhari N. Interaction between the second messengers cAMP and Ca2+ in mouse presynaptic taste cells. // J Physiol. 2009. 587(Pt 8), 1657-1668.

226. Robinson DL, Venton BJ, Heien ML, Wightman RM. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. // Clin Chem. 49. 2003.1763-1773.

227. Romanov RA, Kolesnikov SS. Electrophysiological identified subpopulations of taste bud cells. II Neurosci Lett. 2006. 395,249-254.

228. Romanov RA, Rogachevskaja OA, Bystrova MF, Jiang P, Margolskee RF, Kolesnikov SS. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. // EMBO J. 2007.26, 657-667.

229. Romanov RA, Rogachevskaja OA, Khokhlov AA, Kolesnikov SS. Voltage-dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. II J Gen Physiol. 2008.132, 731-744.

230. Roper SD, McBride DWJ. Distribution of ion channels on taste cells and its relationship to chemosensory transduction. II JMembr Biol. 1989.109,29-39.

231. Roper SD. Cell communication in taste buds. // Cell Mol Life Sei. 2006. 63,1494-1500.

232. Roper SD. Signal transduction and information processing in mammalian taste buds. // Pflugers Arch. 2007.454,759-776.

233. Rossler P, Boekhoff I, Tareilus E, Beck S, Breer H, Freitag J. G protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter transduction. // Chem Senses. 2000. 25, 413-421.

234. Ruiz-Avila L, McLaughlin SK, Wildman D, McKinnon PJ, Robichon A, Spickofsky N, Margolskee RF. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase through transducin in taste receptor cells. II Nature. 1995. 376 (6535). 80-5.

235. Ruiz-Avila L, Wong GT, Damak S, Margolskee RF. Dominant loss of responsiveness to sweet and bitter compounds caused by a single mutation in a-gustducin. // Proc Natl Acad Sei USA. 2001. 98, 8868-8873.

236. Sabirov RZ, Dutta AK, Okada Y. Volume-dependent ATPconductive large-conductance anion channel as a pathway for swelling-induced ATP release. И J Gen Physiol. 2001. 118, 251— 266.

237. Salvi M, Fiore C, Battaglia V, Palermo M, Armanini D, Toninello A. Carbenoxolone induces oxidative stress in liver mitochondria, which is responsible for transition pore opening. // Endocrinology. 2005.146,2306-2312.

238. San Gabriel A, Nakamura E, Uneyama H, Torii K. The calcium-sensing receptor in taste tissue. // Biochem Biophys Res Commun. 2009. 378,414-418.

239. Sandilos JK, Chiu YH, Chekeni FB, Armstrong AJ, Walk SF, Ravichandran KS, Bayliss DA. Pannexin 1, an ATP release channel, is activated by caspase cleavage of its pore-associated С terminal autoinhibitory region. //JBiol Chem. 2012. Feb 6.

240. Schwartz EA. Depolarization without calcium can release gamma-aminobutyric acid from a retinal neuron. II Science. 1987. 238,350-355.

241. Schwiebert EM, Zsembery A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. H Biochim Biophys Acta. 2003. 1615, 7-32.

242. Schwiebert LM, Rice WC, Kudlow BA, Taylor AL, Schwiebert EM. Extracellular ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayers of primary human vascular endothelial cells. II Am J Physiol. 2002. 282, C289-C301.

243. Simon SA, Holland VF, Benos DJ, Zampighi GA. Transcellular and paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction. // Microsc Res Tech. 1993. 26, 196— 208.

244. Smith CUM. Biology of sensory systems // John Wiley & Songs, Ltd. Chichester, 2000, 445 p.

245. Smith DV, Klevitsky R, Akeson RA, Shipley MT. Taste bud expression of human blood group antigens. II J Comp Neurol. 1994. 343,130-142.

246. Sokolova E, Skorinkin A, Moiseev I, Agrachev A, Nistri A, Giniatullin R. Experimental and modeling studies of desensitization of P2X3 receptors. // Mol Pharmacol. 2006. 70, 373382.

247. Sombers LA, Hanchar HJ, Colliver TL, Wittenberg N, Cans A, Arbault S, Amatore C, Ewing AG. The effects of vesicular volume on secretion through the fusion pore in exocytotic release from PC12 cells. IIJNeurosci. 2004.24, 303-309.

248. Sorensen CE, Novak I. Visualization of ATP release in pancreatic acini in response to cholinergic stimulus. Use of fluorescent probes and confocal microscopy. // J Biol Chem. 2001. 276,32925-32932.

249. Srinivas M, Hopperstad MG, Spray DC. Quinine blocks specific gap junction channel subtypes. // Proc Natl Acad Sei USA. 2001. 98,10942-10947.

250. Starostik MR, Rebello MR, Cotter KA, Kulik A, Medler KF. Expression of GABAergic receptors in mouse taste receptor cells. // PLoS One. 2010. 5, el3639.

251. Sterling P, Matthews G. Structure and function of ribbon synapses. // Trends Neurosci. 2005. 28,20-29.

252. Stevens DR, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof W, Kaupp UB, Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCN1 and HCN4 mediate responses to sour stimuli. II Nature. 2001.413, 631-635.

253. Stewart RE, Lyall V, Feldman GM, Heck GL, DeSimone JA. Acid-induced responses in hamster chorda tympani and intracellular pH tracking by taste receptor cells. // Am J Physiol. 1998.275, C227-C238.

254. Stone LM, Tan S-S, Tam PPL, Finger TE. Analysis of Cell Lineage Relationships in Taste Buds. IIJNeurosci. 2002. 22(11), 4522-4529.

255. Stout CE, Costantin JL, Naus CC, Charles AC. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. II J Biol Chem. 2002. 277,10482-10488.

256. Sudhof TC, Rothman JE. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. // Science. 2009. 323,474-477.

257. Sudhof TC. The synaptic vesicle cycle. // Annu Rev Neurosci 2004.27,509-547.

258. Sun X-D, Herness MS. Characterization of inwardly rectifying potassium currents from dissociated rat taste receptor cells. II Am J Physiol. 1996.271, C1221-C1232.

259. Swamy BE, Venton BJ. Subsecond detection of physiological adenosine concentrations using fast-scan cyclic voltammetry. // Anal Chem. 2007. 79, 744-750.

260. Tachibana M, Okada T. Release of endogenous excitatory amino acids from ON-type bipolar cells isolated from the goldfish retina. IIJNeurosci. 1991. 11,2199-2208.

261. Takeda M, Suzuki Y, Obara N, Nagai Y. Apoptosis in mouse taste buds after denervation. // Cell Tissue Res. 1996. 286, 55-62.

262. Takeda M, Suzuki Y, Obara N, Nagai Y. Induction of apoptosis by colchicine in taste bud and epithelial cells of the mouse circumvallate papillae. // Cell Tissue Res. 2000. 302,391-395.

263. Talavera K, Yasumatsu K, Voets T, Droogmans G, Shigemura N, Ninomiya Y, Margolskee RF, Nilius B. Heat activation of TRPM5 underlies thermal sensitivity of sweet taste. IINature. 2005.438,1022-1025.

264. Taylor J, Gordon-Weeks PR. Calcium-independent gamma-aminobutyric acid release from growth cones: role of gamma-aminobutyric acid transport. // J Neurochem. 1991. 56, 273280.

265. Toyono T, Kataoka S, Seta Y, Shigemoto R, Toyoshima K. Expression of group II metabotropic glutamate receptors in rat gustatory papillae. // Cell Tissue Res. 2007.328, 57-63.

266. Toyono T, Seta Y, Kataoka S, Harada H, Morotomi T, Kawano S, Shigemoto R, Toyoshima K. Expression of the metabotropic glutamate receptor, mGluR4a, in the taste hairs of taste buds in rat gustatory papillae. I I Arch Histol Cytol. 2002. 65, 91-96.

267. Toyono T, Seta Y, Kataoka S, Kawano S, Shigemoto R, Toyoshima K. Expression of metabotropic glutamate receptor group I in rat gustatory papillae. // Cell Tissue Res. 2003. 313, 29-35.

268. Tracht SE, Toma V, Sweedler JV. Postcolumn radionuclide detection of low-energy betaemitters in capillary electrophoresis. // Anal Chem. 1994.66,2382-2389.

269. Tran Van Nhieu G, Clair C, Bruzzone R, Mesnil M, Sansonetti P, Combettes L. Connexin-dependent inter-cellular communication increases invasion and dissemination of Shigella in epithelial cells. // Nat Cell Biol. 2003. 5, 720-726.

270. Triggle DJ. 1,4-Dihydropyridines as calcium channel ligands and privileged structures. // Cell Mol Neurobiol. 2003. 23, 293-303.

271. Tsunenari T, Kurahashi T, Kaneko A. Activation by bitter substances of a cationic channel in membrane patches excised from the bull frog taste receptor cell. // J Physiol. 1999. 519, 397404.

272. Tsunoda S, Sierralta J, Sun Y, Bodner R, Suzuki E, Becker A, Socolich M, Zuker CS. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. II Nature. 1997. 388, 243-249.

273. Ueda K, Ichimori Y, Maruyama H, Murakami Y, Fujii M, Honma S, Wakisaka S. Celltype specific occurrence of apoptosis in taste buds of the rat circumvallate papilla. // Arch Histol Cytol. 2008. 71, 59-67.

274. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T, Tohyama M, Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. // Nature. 1998. 395, 555-556.

275. Ugawa S, Yamamoto T, Ueda T, Ishida Y, Inagaki A, Nishigaki M, Shimada S. Amiloride-insensitive currents of the acid-sensing ion channel-2a ASIC2a)/ASIC2b heteromeric sour-taste receptor channel. Il JNeurosci. 2003. 23(9), 3616-3622.

276. Ullrich ND, Voetsa T, Prenena J, Vennekensa R, Talavera K, Droogmansa G, Nilius B. Comparison of functional properties of the Ca2+-activated cation channels TRPM4 and TRPM5 from mice. // Cell Calcium. 2005. 37,267-278.

277. Vandenbeuch A, Clapp TR, Kinnamon SC. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. I I BMC Neurosci. 2008. 9, 1.

278. Vandenbeuch A, Tizzano M, Anderson CB, Stone LM, Goldberg D, Kinnamon SC. Evidence for a role of glutamate as an efferent transmitter in taste buds. // BMC Neurosci. 2010. 11,77.

279. Vigne P, Hechler B, Gachet C, Breittmayer JP, Frelin C. Benzoyl ATP is an antagonist of rat and human P2Y1 receptors and of platelet aggregation. // Biochem Biophys Res Commun. 1999. 256, 94-97.

280. Wakisaka S, Miyawaki Y, Youn SH, Kato J, Kurisu K. Protein gene product 9.5 in developing mouse circumvallate papilla: comparison with neuron-specific enolase and calcitonin gene-related peptide. II Anat Embryol. 1996. 194,365-372.

281. Wakisaka S, Miyawaki Y, Youn SH, Kato J, Kurisu K. Protein gene-product 9.5 in developing mouse circumvallate papilla: comparison with neuron-specific enolase and calcitonin gene-related peptide. II Anat Embryol (Berl). 1996. 194, 365-372.

282. Waldmann R, Lazdunski M. H+-gated cation channels: neuronal acid sensors in the NaC/DEG family of ion channels. // Curr Opin Neurobiol. 1998. 8,418-424.

283. Wang W, Zhang SH, Li LM, Wang ZL, Cheng JK, Huang WH. Monitoring of vesicular exocytosis from single cells using micrometer and nanometer-sized electrochemical sensors. // Anal Bioanal Chem. 2009. 394,17-32.

284. Warner A, Clements DK, Parikh S, Evans WH, DeHaan RL. Specific motifs in the external loops of connexin proteins can determine gap junction formation between chick heart myocytes. // J Physiol. 1995. 488, 721-728.

285. Warr O, Takahashi M, Attwell D. Modulation of extracellular glutamate concentration in rat brain slices by cystine-glutamate exchange. // J Physiol. 1999. 514, 783-793.

286. Wassum KM, Tolosa VM, Wang J, Walker E, Monbouquette HG, Maidment NT. Silicon wafer-based platinum microelectrode array biosensor for near real-time measurement of glutamate in vivo. // Sensors Basel Sensors. 2008. 8,5023-5036.

287. Wellendorph P, Brauner-Osborne H. Molecular pharmacology of promiscuous seven transmembrane receptors sensing organic nutrients. // Mol Pharmacol. 2009. 76,453-465.

288. Wellendorph P, Burhenne N, Christiansen B, Walter B, Schmale H, Brauner-Osborne H. The rat GPRC6A: cloning and characterization. // Gene. 2007. 396,257-267.

289. Welsh MJ, Proce MP, Xie J. Biochemical basis of touch perception: mechanosensory function of degenerin/epithelial Na+ channels. IIJ Biol Chem. 2002.277,2369-2372.

290. Wildman SS, Unwin RJ, King BF. Extended pharmacological profiles of rat P2Y2 and rat P2Y4 receptors and their sensitivity to extracellular H+ and Zn2+ ions. // Br J Pharmacol. 2003. 140, 1177-86.

291. Wilkinson WJ, Jiang LH, Surprenant A, North RA. Role of ectodomain lysines in the subunits of the heteromeric P2X2/3 receptor. U Mol Pharmacol. 2006. 70,1159-1163.

292. Wong GT, Gannon KS, Margolskee RF Transduction of bitter and sweet taste by gustducin. //Nature. 1996. 381, 796-800.

293. Woods LA, Powell PR, Paxon TL, Ewing AG. Analysis of mammalian cell cytoplasm with electrophoresis in nanometer inner diameter capillaries. // Electroanalysis. 2005. 17, 1192— 1197.

294. Yamamoto T, Nagei T, Shimura T, Yasoshimi Y. Roles of chemical mediators in the taste system. II Jpn J Pharmacol. 1998. 76, 325-348.

295. Yang R, Crowley HH, Rock ME, Kinnamon JC. Taste bud cells with synapses express SNAP-25-like immunoreactivity. // JComp Neurol 2000a. 424,205-215.

296. Yang R, Tabata S, Crowley HH, Margolskee RF, Kinnamon JC. Ultrastructural localization of gustducin immunoreactivity in microvilli of type II taste cells in the rat. // J Comp Neurol. 2000b. 425,139-151.

297. Yang S, Cheek DJ, Westfall DP, Buxton IL. Purinergic axis in cardiac blood vessels. Agonist-mediated release of ATP from cardiac endothelial cells. // Circ Res. 1994. 74,401-407.

298. Yasumatsu K, Horio N, Murata Y, Shirosaki S, Ohkuri T, Yoshida R, Ninomiya Y. Multiple receptors underlie glutamate taste responses in mice. // Am J Clin Nutr. 2009. 90, 747S-752S.

299. Yasumatsu K, Ogiwara Y, Takai S, Yoshida R, Iwatsuki K, Torii K, Margolskee RF, Ninomiya Y. Umami taste in mice uses multiple receptors and transduction pathways. // J Physiol. 2012. 590(Pt 5), 1155-1170.

300. Ye Q, Heck GL, DeSimone JA. Effects of voltage perturbation of the lingual receptive field on chorda tympani responses to Na+ and K+ salts in the rat: implications for gustatory transduction. // J Gen Physiol. 1994. 104,885-907.

301. Ye Q, Heck GL, DeSimone JA. The anion paradox in sodium taste reception: resolution by voltage-clamp studies. II Science. 1991. 254, 724-726.

302. Ye Q, Heck GL, DeSimone JA. Voltage dependence of the rat chorda tympani response to Na+ salts: implications for the functional organization of taste receptor cells. // J Neurophysiol. 1993. 70,167-178.

303. Yee CL, Yang R, Bottger B, Finger TE, Kinnamon JC. "Type III" cells of rat taste buds: immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. II J. Comp. Neurol. 2001.440, 97-108.

304. Yegutkin GG, Henttinen T, Jalkanen S. Extracellular ATP formation on vascular endothelial cells is mediated by ecto-nucleotide kinase activities via phosphotransfer reactions. // FASEB. 2001. 15,251-260.

305. Yegutkin GG, Henttinen T, Samburski SS, Spychala J, Jalkanen S. The evidence for two opposite, ATP-generating and ATP-consuming, extracellular pathways on endothelial and lymphoid cells. // Biochem J. 2002. 367, 121-128.

306. Yellen G. The voltage-gated potassium channels and their relatives. // Nature. 2002. 419, 35-42.

307. Yeung ES. Study of single cells by using capillary electrophoresis and native fluorescence detection. IIJ Chromatogr A. 1999. 830,243-262.

308. Yoshida R, Shigemura N, Sanematsu K, Yasumatsu K, Ishizuka S, Ninomiya Y. Taste responsiveness of fungiform taste cells with action potentials. // JNeurophysiol. 2006. 96, 30883095.

309. Yoshii K. Gap Junctions among Taste Bud Cells in Mouse Fungiform Papillae. // Chem Senses. 2005. Suppl 1, i35-i36.

310. Young SH, Poo M. Spontaneous release of transmitter from growth cones of embryonic neurones. И Nature. 1983. 305,634-637.

311. Zeng Q, Kwan A, Oakley B. Gustatory innervation and bax-dependent caspase-2: participants in the life and death pathways of mouse taste receptor cells. // J Comp Neurol. 2000. 424,640-650.

312. Zeng Q, Oakley B. p53 and Bax: putative death factors in taste cell turnover. // J Comp Neurol 1999.413, 168-180.

313. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D, Zuker CS, Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes, Different receptor cells sharing similar signaling pathways. // Cell. 2003. 112,293-301.

314. Zhang Z, Jiang Y, Quinn SJ, Krapcho K, Nemeth EF, Bai M. L-phenylalanine and NPS R-467 synergistically potentiate the function of the extracellular calcium-sensing receptor through distinct sites. IIJ Biol Chem. 2002. 277,33736-33741.

315. Zhao GQ, Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Erlenbach I, Ryba NJ, Zuker CS. The receptors for mammalian sweet and umami taste. // Cell. 2003. 115,255-266.

316. Zimmermann H. Extracellular metabolism of ATP and other nucleotides. // Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 2000. 362,299-309.

317. Гистология (введение в патологию) // Под ред. Э.Г. Улумбекова, Ю.А. Челышева. -М.: ГЭОТАР, 1997. 960 с.

318. Николе ДГ, Мартин АР, Валлас БГ, Фукс ПА 2003. От нейрона к мозгу. М.: Едиториал УРСС. 672 с.

319. Романов Р.А. Физиологический анализ популяции клеток вкусовой почки. Идентификация хемосенсорных клеток млекопитающих. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Пущино, 2007.

320. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Канальная активность рекомбинантного паннексина 1. // Биологические мембраны. 2011.28,374-381.

321. Романов РА, Хохлов АА, Быстрова МФ, Рогачевская OA, Яценко ЮЕ, Колесников СС. Мониторинг выброса АТР из одиночных клеток методом биосенсора. // Биологические мембраны. 2007.24 (4), 309-315.

322. Романов РА, Хохлов АА, Колесников СС. Входящий ток, активируемый АТР во вкусовых клетках мыши. // Биологические мембраны. 2005. 22 (5), 390-395.

323. Хохлов АА, Романов РА, Зубов БВ, Пашинин АД, Колесников СС. Осветитель на излучающих диодах для микрофотометрических исследований клеток. // Приборы и техника эксперимента. 2007. №3, 128-131.

Информация о работе

Романов, Роман Александрович
доктора биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Физиологические процессы в периферическом вкусовом органе. Механизмы электрогенеза, возбудимости и афферентной нейропередачи - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Физиологические процессы в периферическом вкусовом органе. Механизмы электрогенеза, возбудимости и афферентной нейропередачи - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы