Функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в афферентную нейропередачу во вкусовой почке

Кабанова, Наталия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в афферентную нейропередачу во вкусовой почке
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в афферентную нейропередачу во вкусовой почке"

На правах рукописи

004607778

КАБАНОВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИОННЫХ КАНАЛОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В АФФЕРЕНТНУЮ НЕЙРОПЕРЕДАЧУ ВО ВКУСОВОЙ ПОЧКЕ.

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

- 2 СЕН 2010

Пущино 2010

004607778

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной фитологии клетки Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич,

кандидат биологических наук Быстрова Марина Федоровна

доктор биологических наук, профессор Чемерис Николай Константинович,

кандидат физико-математических наук Кокоз Юрий Моисеевич

Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится « 29 » сентября 2010 г. в 15-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан_2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д-002.093.01 кандидат физико-математических наук Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Основополагающей функцией хемосенсорных клеток в составе вкусовой почки является распознавание вкусовых веществ, их трансдукция и кодирование информации об их концентрации и вкусовой модальности с целью дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга. Эти и другие функции клеток вкусовой почки реализуются при участии разветвленных межклеточных коммуникаций, обеспечивающих синхронизацию разнородных физиологических процессов, протекающих во вкусовой почке. В этой клеточной системе идентифицировано семейство метаботропных и ионотропных рецепторов к таким классическим нейротрансмитгерам, как глутамат, серотонин, ГАМК, АТР, норадреналин, холектокинин, нейропептид Y, и несколько сигнальных каскадов, сопряженных с ними. Роль этих сигнальных систем в физиологии периферического вкусового органа по большей части неизвестна. Возможность избирательно контролировать активность сигнальных процессов представляет собой инструмент, с помощью которого можно судить на физиологическом уровне о биологической функции исследуемой сигнальной системы. В настоящей работе ставились и решались задачи, как часть исследования роли серотонинергической и пуринергической систем в физиологии вкусовой почки.

Основываясь на ряде фактов, в качестве основного кандидата на роль афферентного нейротрансмиттера во вкусовой почке до недавнего времени рассматривался серотонин (5-НТ). Так, было установлено, что в окончаниях вкусового нерва, иннервирующего вкусовую почку, локализован 5-НТз-рецептор и, что вкусовые вещества стимулируют высвобождение серотошша из вкусовых клеток. Оказалось, однако, что у мышей с нокаутированным геном 5-НТ3 рецептора периферическая вкусовая система функционирует практически без нарушений. Эти результаты показывали, что серотонин не является ключевым афферентным нейротрансмиттером, непосредственно используемым для кодирования вкусовой информации.

Еще одной важной сигнальной системой вкусовой почки является пуринергическая система. Методами иммуногистохимии было показано присутствие ионотропных (Р2Х2 и Р2Х3) пуринорецепторов в окончаниях вкусового нерва. Это дало основание предположить, что АТР может выполнять функцию афферентного нейротрансмиттера, которых, вообще говоря, может использоваться несколько с целью кодирования разных вкусовых модальностей. Далее было показано, что вкусовые клетки экспрессируют несколько изоформ метаботропных (P2Y) пуринорецепторов, которые сопряжены с мобилизацией внутриклеточного Са2+. Принципиально важные данные обеспечил нокаут двух генов, кодирующих Р2Х2 и Р2Хз. Оказалось, что у мышей с данной генетической модификацией была практически полностью нивелирована способность ощущать вещества всех базовых вкусовых модальностей, а именно, горькие, сладкие, умами (вкус глютамата и некоторых других аминокислот), соленые и кислые. Кроме того, было показано, что АТР высвобождается вкусовыми клетками мыши в ответ на стимуляцию. Таким образом, АТР с одной стороны является ключевой сигнальной молекулой в афферентной передаче первичной вкусовой информации, а с другой - пуринергическая сигнальная система обеспечивает ларакршшые регуляции в периферическом вкусовом органе.

Сигнальные системы вкусовой почки физиологически исследовались преимущественно на уровне изолированных вкусовых клеток. Между тем, в таких условиях определенные физиологические функции могли быть утеряны в силу

разрушения естественных связей между клетками вкусовой почки. По-всей видимости, функциональные свойства вкусовой почки не есть аддитивная сумма свойств индивидуальных вкусовых клеток, и их следует реконструировать на более интегральном уровне, например, используя физиологически активные срезы вкусовых сосочков или регистрацию активности вкусового нерва, т.е. препараты, в которых сигнальные связи между клетками в значительной степени или полностью сохранены. Очевидная трудность физиологических исследований таких интегральных систем состоит в том, что вклад отдельной системы в физиологический ответ невозможно однозначно установить, если не использовать селективные агонисты и антагонисты соответствующих рецепторов или селективные ингибиторы сопряженных с ними эффекторкых сигнальных белков.

Одним из возможных подходов является изучение физиологических процессов на срезах вкусовых сосочков в условиях точечной интервенции в межклеточные коммуникации, протекающие при участии данной сигнальной системы. Поэтому в качестве промежуточной задачи, в настоящей работе исследовались возможные мишени для такой точечной интервенции, а именно, потенциал-зависимые Са2+-каналы вкусовых клеток типа III, ответственные за секрецию серотонина и, возможно, некоторых других нейромедиаторов, а также Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы, обеспечивающие восприятие вкусовым нервом сенсорной информации в виде квантов внеклеточного АТР. В процессе решения этих задач, нами были освоены методы молекулярного клонирования и методы реконструкции ионных каналов в экспрессионной системе.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явилось функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в межклеточные коммуникации, включая афферентную нейропередачу вкусовой информации, во вкусовой почке мыши.

В рамках сформулированной цели решались следующие задачи:

• Исследовать ПЗ Са2+-каналы, функционирующие во вкусовых клетках типа III.

• Охарактеризовать неселективные ионные каналы вкусовых клеток типа И.

• Исследовать свойства ионотрошшх пуринорецепторов, функционирующих во вкусовой почке мыши.

Научная новизна работы.

1. Методами микрофотометрии и используя Са2+ зонды, показано, что в физиологических условиях потенциал-зависимые Са2+-каналы функциональны более чем в 90% популяции клеток типа III, формирующих классический Са2+-зависимый химический синапс. Методами электрофизиологии и молекулярной биологии показано, что потенциал-зависимая Са2+ проницаемость этих клеток обеспечивается преимущественно Саг+-каналами типа Cavl.2.

2. Установлено, что во вкусовых клетках типа II функционируют неселективные ионные каналы, проницаемые для крупных органических катионов и анионов, включая АТФ. Эти каналы могут обеспечивать основной путь высвобождения афферентного нейротрансмиттера АТФ вкусовыми клетками типа II, что полностью согласуется с отсутствием Са2+-зависимого везикулярного секреторного механизма в клетках этого типа.

3. Установлено, что пептидные токсины из яда пауков потенциируют высокоаффинную десенситизацию Р2Х3 рецепторов. Благодаря этому свойству, пептидные токсины способны оказывать ингибирукмцие эффекты на Р2Х3

рецепторы на фоне 10-100 нМ внеклеточного ЛТФ in vivo, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных аналгетиков.

Научно-практическая значимость исследования.

Проведенные исследования вносят заметный вклад в существующие представления о ионных каналах, функционирующих во вкусовых клетках, и о их возможной физиологической функции. Полученные клеточные линии с функциональными К+-каналами и ионотрошшми Р2Х пуринорецепторами могут иметь практическое применение для прикладных исследований, в том числе для тестирования компонентов лекарственных препаратов.

Апробация результатов диссертации.

Научные результаты и выводы докладывались на на 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008г.), Международном научно-практическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008), 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2009), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2010г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезиса.

Структура и объем диссертации.

Диссертация включает в себя введение, литературный обзор, описание используемых методов исследования, обсуждение результатов исследований в двух главах, заключение, выводы, список цитируемой литературы и список используемых сокращений.

Работа изложена на 106 страницах машинописного текста и содержит 45 рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит 236 ссылок.

Материалы и методы.

Эксперименты проводились на одиночных вкусовых клетках, изолированных из желобоватого и листовидного сосочков языка мыши по описанной ранее методике (Baryshnikov et al., 2003). Помимо этого, изучались клетки линии СНО, трансфицированные рекомбинантными плазмидами, несущими кодирующие последовательности генов человеческих К^-каналов hERG-типа и мышиных Р2Х-пурипорецепторов. Электрическая активность исследуемых клеток регистрировалась методом patch clamp (voltagc-clamp, current-clamp) в конфигурациях "perforated patch clamp" и "whole-cell" с помощью усилителя Axopatch 200 В (Axon Instruments), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1200 и пакета лицензионных программ рС1атр8.0 (все «Axon Instruments», США). При регистрации в конфигурации "whole-cell" раствор в пипетке содержал (в мМ): 140 KCÍ/CsCl, 2 MgAT® (для вкусовых клеток) или 0.5 MgCl2 (для клеток СНО), 0.5 EGTA или 10 ВАРТА, 10 HEPES-KOH. При использовании конфигурации "perforated patch clamp" (для вкусовых клеток) регистрирующие пипетки содержали (в мМ): 140 KCI/CsCl, 1 MgC12, 0.5 EGTA Ю HEPES-KOH (CsOH), и 400 мкг/мл амфотерицина Б. Базовый внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 NaCl, 1 СаС12, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH. Все растворы имели pH 7,4.

Изменения цитозольного Са2+ во вкусовых клетках оценивали по флуоресценции Са2+-зонда Fluo-4, которую визуализировали с использованием микроскопа Axioscope-2, водноимерсионного объектива Achroplan-40, NA=0,8 ("Zeiss", Германия) и ICCD-камеры IC-200 ("Photon Technology International", США). Флуоресценцию Fluo-4 возбуждали при помощи осветителя на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах (Хохлов и соавт., 2007). Излучение возбуждения и эмиссии фильтровалось интерференционными фильтрами ("Chroma", США) в полосе длин волн 480 ± 10 и 535 ± 20 нм соответственно.

Анализ экспрессии генов a,S, a¡C, a¡D и a¡F, кодирующих al-субъединицы Са2+-каналов L-типа во вкусовых клетках типа III, проводили методом ОТ-ПЦР (обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией) с использованием набора One-Step RT-PCR kit with Platinum Taq DNA Polymerase Hi-Fi ("Invitrogen", США) и ген-специфических праймеров, сконструированных на основе последовательностей из базы данных GenBank.

Для исследования свойств пуринорецепторов, экспрессирующихся во вкусовой ткани мыши, были созданы рекомбинантные плазмиды pIRES2-EGFP/P2X2 и pIRES2-EGFP/P2X3. Комплементарные ДНК генов Р2гх2 и Р2гхЗ были клонированы из вкусовой ткани с помощью обратно-транскриптазной ПЦР и ген-специфических праймеров. Полноразмерные кДНК P2rx¡ и P2rx¡ были клонированы в вектор pGEM-T easy ("Promega", США) и затем были переклонированы в вектор pIRES2-EGFP ("Clontech", США) по сайту EcoRI.

Для получения функциональных Р2Х2 и Р2Х3 рецепторов клетки линии СНО трансфицировались плазмидами pIRES2-EGFP/P2X2 и pIRES2-EGFP/P2X3 в присутствии трансфекционного агента Lipofectamine™ (Invitrogen, США). Для получения клеточных клонов, стабильно экспрессирующих встраиваемые гены Р2Х-рецепторов, проводили рассевание клеток с последующим тестированием на наличие АТФ-зависимых токов.

Результаты и обсуждение.

1. Исследование потенциал-зависимых ионных каналов во вкусовых клетках мыши.

Популяция клеток вкусовой почки гетерогснна и включает три морфологически различных типа веретенообразных клеток - тип I, тип II, тип III. Ранее в нашей лаборатории была установлена корреляция между морфологическими и электрофизиологическими свойствами вкусовых клеток (Romanov et al., 2006, 2007). Оказалось, что каждый из трех типов клеток характеризуется своим набором потенциал-зависимых токов, наиболее характерно проявляющихся в условиях цезиевого диализа. Указанное свойство вкусовых клеток обеспечивало их однозначную идентификацию.

KClWNaClout

Cc CI WNaCl out

Рисунок 1.

Электрофизиологические характеристики разных типов вкусовых клеток (I, II, III), полученные методом patch-clamp (perforated patch-clamp) в условиях калиевого (KClin/NaCloui) и цезиевого (CsClin/NaClout) диализа. В условиях калиевого диализа клеток регистрирующая пипетка содержала 140 мМ КС1, при цезиевом диализе -140 мМ CsCl. Перфузию экспериментальной камеры

проводили раствором, содержащим 140 мМ NaCl и 1мМСаС12.

1.1. Потенциал-зависимые Саг+-каналы вкусовых клеток типа III.

Электрическая активность изолированных вкусовых клеток анализировалась методом perforated patch (Horn, Marty, 2003). Клетки детализовались раствором, содержащим 140мМ CsCl, что приводило к подавлению выходящих токов через потенциал-зависимые (ГО) К+-каналы во вкусовых клетках типа III. Это облегчало идентификацию последних и позволяло регистрировать относительно небольшие входящие ПЗ Са2+-токи (Рис. 2,1), величина которых варьировала в пределах 10-50 пА. Примерно в 50% случаев (>100 клеток типа III) они были плохо разрешимы из-за электрических шумов. В то же время, при клямпировании потенциала на мембране вкусовых клеток, нагруженных Са2+-зондом Fluo-4, и одновременной регистрации их флуоресценции, регистрировались хорошо разрешимые скачки внутриклеточного Са2+, зависящие от деполяризующего потенциала (Рис. 2, П). Это показывало, что ПЗ Са1+-каналы функциональны в большинстве (если не во всех) клеток типа Ш. Обычно Са2+-сигналы становились хорошо различимыми, начиная с -ЗОмВ, и достигали максимальной величины при -10 мВ, указывая на то, что ПЗ Са2+-токи переносятся преимущественно через высокопороговые ПЗ Са2+-каналы.

В дальнейших экспериментах эти каналы исследовались, используя внеклеточные растворы содержащие 10 мМ Ва2+. В этих условиях регистрировались хорошо разрешимые входящие ПЗ Ва-токи. Отсутствие инактивации данных токов предполагало, что они переносятся через ПЗ Са-каналы L-типа. Специфическими ингибиторами этих каналов являются дигидропиридины. В наших экспериментах Ва2+-токи практически полностью ингибировались нифедипином. Заметное ингибирование ПЗ Ва2+-тока проявлялось при концентрациях блокатора более 10 мкМ (Рис.3).

-Il.lli

4,-M

л ®

®NU

: и

-и -4(1 -21) ii 2« -и й Мешрагащв тешамВ

Рисунок 2. ПЗ Са2*-токи вкусовых клеток типа III. I - входящие Са2*-(/с тонкая линия) и пунктирная кривая) токи, регистрируемые в ответ на 100 мс деполяризацию вкусовой клетки от -70 мВ до -10 мВ в условиях диализа клетки раствором, содержащим 140 мМ СбО, и перфузии камеры раствором, содержащим 140 мМ №0 и 1 мМ СаСЬ II - Мониторинг Са2+ по флуоресценции кальциевого зонда Р1ио-4 при деполяризации мембраны вкусовой (слетки, о - Изменения флуоресценции вкусовой клетки, окрашенной Р1ио-4, вызванные входом наружного Са2+, которые стимулировались 100 мс скачками мембранного потенциала, деполяризующего клетку до указанных значений (верхняя панель). Р - интенсивность флуоресценции, измеренная перед электрической стимуляцией, Дг' - изменение интенсивности флуоресценции, 6 - Изменения флуоресценции Р1ио-4 как функция мембранного потенциала. Для сопоставления результатов различных экспериментов анализировали относительное изменение ДР/ДРтдх - максимальное изменение интенсивности флуоресценции, наблюдаемое при -10 мВ. Данные получены от семи разных клеток и представлены как среднее ± стандартная ошибка.

ю мВ

мвпрать

■40 40 -20 0 20 40 Мембранный потсшимл, мВ

Рисунок 3. Эффекты нифедипина на ПЗ Ва2+-токи. а - Семейство ПЗ Ва2+-токов в контроле и в присутствии ЮОмкМ нифедипина.,

6 - 1-У характеристика стационарного Ва2+-тока в контроле (•) и после блокирования нифеди-пином (ЮОмкМ) (о). Токи нормировали на

максимальное значение в контроле.

Эффективность блокирующего действия дигидропиридинов сильно зависит от потенциала (Bean, 1984). В наших экспериментах при поддерживаемом потенциале -70 мВ нифедипин в концентрации 100 мкМ не полностью блокировал ПЗ Ва2+-токи, которые между тем практически исчезали при поддерживаемом потенциале -50 мВ. Поэтому для увеличения эффективности блокирования ПЗ Ва2+-токов нифедипином в экспериментах, в которых снимались ингибиторные кривые, клетки поддерживали при потенциале -50 мВ (Рис. 4).

Рисунок 4. Относительная амплитуда Г13 Ва2+-тока при 0 мВ в присутствии нифедипииа (•). Ва2+-токи измеряли в 13 разных клетках в контроле и затем через 4 мин. после аппликации блокатора и нормировали на значение тока в контроле. Непрерывная кривая соответствует уравнению Хилла: У10=1/1+(В/В,^\ где 1В и 10 -стационарный Ва2т-ток в контроле и в присутствии блокатора при концентрации В\ В1/2 и л — концентрация полуэффекта и коэффициент Хилла соответственно. Для данной зависимости п - 1.6, BiQ = 45 мкМ.

Таким образом, ПЗ Са2+-токи во вкусовых клетках типа III переносятся преимущественно Ca34-каналами L-типа, для которых характерна низкая чувствительность к дигидропиридинам. Известно, что центр связывания дигидропиридинов локализован на к !-субъединице канала, которая кодируется четырьмя генами - a,S, а ¡С, 04D или a,F. Впервые Са2+-каналы L-типа с низкой чувствительностью к дигидропиридинам были функционально идентифицированы в фоторецепторных и биполярных клетках сетчатки. Оказалось, что их в]-субъединица кодируется геном a,F (Taylor, Morgans, 1998; Wilkinson, Barnes, 1996; Berntson et al., 2003; Koschak et al., 2003). Учитывая возможность альтернативного сплайсинга, для анализа экспрессии гена a,F методом ОТ-ПЦР были сконструированы три пары ген-специфических праймеров, фланкирующих различные участки этого гена. В контроле были получены фрагменты ожидаемого размера при использовании РНК, выделенной из сетчатки. Однако, соответствующих транскриптов во вкусовой ткани обнаружено не было, что говорило об отсутствии экспрессии во вкусовых клетках гена a/F. Используя метод ОТ-ПЦР и ген-специфические праймеры, мы также исследовали экспрессию генов alC, аЮ и a/S. В результате было обнаружено (Рис. 5), что во вкусовой ткани мыши экспрессированы гены alC и alD, причем ампликон гена alC (дорожка I, ожидаемый размер 485 п.н.) был гораздо интенсивнее по сравнению с ампликоном alD (дорожка 2, ожидаемый размер 332 п.н.). Транскрипта, соответствующего гену a IS, во вкусовой ткани мыши обнаружено не было (дорожка 3).

Рисунок 5. ОТ-ПЦР анализ экспрессии во вкусовой ткани генов alC (дорожка 1), аЮ (дорожка 2) и alS (дорожка 3). М- маркеры ЮОЬр DNA Ladder ("Fermentas", США).

Для количественного анализа уровня относительного содержания транскриптов генов а!С и аЮ во вкусовой ткани мыши была сконструирована клонотека комплементарных ДНК, изолированных из вкусовой ткани с использованием ОТ-ПЦР

£ 1.0

5 й.8 А

I «,б

Ъ im

i <u

f iui

i -

I 10 100

Нифедшшн, мкМ

и вырожденных праймеров, способных узнавать гены сразу нескольких нзоформ al-субъединицы, с последующей идентификацией индивидуальных клонов методом рестрикционного анализа. Первая цепь кДНК была синтезирована с помощью олиго(дТ)-праймеров. Последующая реакция ПЦР была проведена с вырожденными праймерами. Учитывая, что во вкусовой ткани экспрессированы гены двух нзоформ, полученный продукт ОТ-ПЦР теоретически должен содержать смесь ампликонов alC (927 п.н) и alD (933 п.н.). Полученный продукт ОТ-ПЦР ожидаемого размера был лигирован в плазмиду pGEM-T easy и лигазной смесью были трансформированы клетки Е. coli штамм Тор 10. Рекомбинантные плазмиды, выделенные из выросших колоний E.coli, были подвергнуты рестрикционному анализу. Для оценки величины вставки в рекомбинантных плазмидах pGEM-T easy/Cav использовали эндонуклеазу EcoRL Для идентификации соответствия вставки типу гена использовали рестриктазы BslXl и Ncol. При рестрикции BstXl должен был получиться фрагмент размером 738 п.н., соответствующий кДНК гена а/С, а при рестрикции Ncol фрагмент должен был иметь размер 304 п.н., соответствующий кДНК alD. Всего было проанализировано 50 колоний. Рекомбинантные плазмиды, выделенные из всех этих колоний несли фрагмент, соответствующий кДНК гена аIС.

После дополнительного ОТ-ПЦР-анализа с использованием ген-специфического обратного праймера для alD в реакции ОТ и последующей ПЦР с вырожденными праймерами был получен ПЦР-фрагмент ожидаемого размера, хотя и слабой интенсивности, подтверждая, что вырожденные праймеры узнают и транскрипт гена alD. Таким образом, можно сделать вывод о существенно более высоком содержании во вкусовой ткани транскриптов гена а/С по сравнению с alD.

1.2. Неселективные ионные каналы вкусовых клеток типа II.

Известно, что в большинстве клеток ПЗ выходящие токи транспортируются через К+-каналы. Однако, ряд фактов свидетельствовал о том, что в клетках типа II ПЗ К+-каналы вносят минимальный вклад в формирование выходящих токов. Например, частичная замена экстраклеточного NaCl хлоридом тетраэтиламмония (ТЕАС1) -блокатором калиевых каналов - слабо ингибировала выходящие токи (рис. 6а, правая панель и рис. 66). Характерным также являлось то, что реполяризация клеток типа II до поддерживаемого потенциала Vh = -70 мВ вызывала входящие хвостовые токи (рис. 6а), тогда как таковые должны были бы быть выходящими, если бы ионы К+ были бы носителями этих токов. В экспериментах, в которых использовались пэтч-пипетки, содержащие 140 мМ CsCl, медленно активирующиеся ПЗ выходящие токи и входящие хвостовые токи сохранялись в клетках типа II, причем их амплитуда, кинетика и потенциал реверсии были близки к таковым, наблюдаемым в условиях диализа клеток раствором с 140 мМ KCl (ср. рис. 6а,б и рис.бв, г).

В дальнейших экспериментах свойства медленно активирующихся выходящих токов (МА-токов) исследовались в условиях диализа клеток Cs+ или другими катионами, непроникающими через К+-селективные каналы, чтобы полностью исключить вклад последних в ПЗ интегральные токи.

KCIinMaClou,

-120 -60 0 60 Мембранный потенциал. мЗ

Рисунок 6. Интегральные токи во вкусовых клетках типа II. a - семейство токов, регистрируемых от вкусовой клетки в ответ на 100 мс поляризацию (верхние панели) от -100 до 50 мВ в псевдофизиологических условиях в контроле (левая нижняя панель) и в присутствии в наружном растворе 10 мМ тетраэтиламмония (TEA) (правая нижняя панель). Символы над кривыми токов указывают моменты снятия вольт-амперных (1-V)

характеристик;

6 - I-V характеристики стационарных токов,

представленных в а. в -семейство токов,

регистрируемых от вкусовой клетки в условиях диализа раствором, содержащим 140

мМ CsCl. г - I-V характеристики токов, представленных в е. Пунктирные линии в б и г соответствуют линии нулевого тока Во всех случаях использовался метод perforated patch.

-юомв

CsClin/NaClout

-э0 -60 -30 0 30 60 Мембранный потенциал, ив

Тот факт, что потенциал реверсии МА-токов был близок к 0 мВ при используемом ионном градиенте (140 мМ С$С1),./(140 мМ КаС1)ои„ свидетельствовал о том, что в случае, если ток транспортируется через ионные каналы одного типа, то эти каналы либо в равной степени проницаемы для Сб+ и Ыа+, либо селективны для ионов хлора, либо характеризуются слабой катион/анионной селективностью. Когда экстраклеточный СГ заменялся крупным анионом глюконатом, который не проникает через СГ каналы, потенциал реверсии выходящего тока смещался в сторону положительных потенциалов (рис. 7) на7.7±2.2 мВ.

Рисунок 7. Выходящий ток во вкусовых клетках типа И частично переносится СГ. а - семейство токов, генерируемых в ответ на 100 мс поляризацию (верхняя панель), в контроле (нижняя правая панель) и после замены 140 мМ ЫаС1 в наружном растворе на 140 мМ Иа-глюконат (нижняя левая панель). Символы над кривыми токов указывают моменты снятия IV характеристик. 6 - 1-У характеристики токов, представленных в а.

Это свидетельствовало о том, что выходящий ток частично переносится ионами СГ. В какой-то степени данный ток мог транспортироваться по СГ каналам, а частично - по катионным каналам. Мы проверяли такую возможность, исследуя

чувствительность выходящего тока к ряду анионных блокаторов, включая NPPB, 9-АС, нифлумовую кислоту, SITS, DIDS, которые использовались в концентрациях, при которых они обычно вызывают почти полную блокаду СГ каналов соответствующих подтипов. Оказалось, что ни один из них не оказывал существенного блокирования выходящего тока (рис. 8).

б к S>

50 мВ

100 мВ

контроль

0.5 мМ DIDS

its

• • •

1 I

А) С

5 " Врет мин

Рисунок 8. Действие анионных блокаторов СГ каналов на выходящие токи во вкусовых клетках типа II. Теки регистрировались при деполяризации клетки от -70 до 50 мВ. а -выходящие токи в контроле (правая панель) и в присутствии блокатора СГ каналов ОШБ (левая панель), б - отсутствие ингибирующего действия анионных блокаторов на амплитуду выходящего тока.

Самый эффективный из блокаторов, ЫО$, ингибировал амплитуду тока в среднем на 22.8±5.4%. Таким образом, возможный вклад БШ8-чувствительных СГ каналов в выходящий ток не мог превышать 23% и, следовательно, как минимум 77% тока должны были бы транспортироваться через катионные каналы.

Когда клетки диализовались раствором, содержащим 140 мМ ММ1)0-С1, а регистрирующая камера содержала 140 мМ №С) (п=9), амплитуда выходящих токов и потенциал реверсии (V, = -4.7 мВ) в среднем были в том же диапазоне, что и в случае диализа клеток в присутствии внутриклеточного 140 мМ СбС! (Рис. 9).

50 мВ

Е 1

I1 I

5о

1 5

0 о

-1

CsCl fJMDGCL -100 -50

Мембранный потенциал, иВ

Рисунок 9. Выходящие токи, регистрируемые от вкусовых клеток типа II в разных условиях диализа, а - выходящие токи, регистрируемые от одной и той же клетки при ионных градиентах 140мМ ММШ-С1щ/140 мМ ЫаСи (левая панель) и в 140мМ ЫЖЮ-

С1,„/140 мМ На-глюконатош (правая панель), б - средние амплитуды стационарных выходящих токов при 50 мВ в условиях 140 мМ С$С1щ/140 мМ КаС10Ш (левый столбец, 28 клеток) и 140 мМ NN11X30^/140 мМ ИаС!^ (правый столбец, 9 клеток). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка, в - 1-У характеристики выходящих токов, представленных в а.

Это означало, что выходящий ток, наблюдаемый при положительных мембранных потенциалах, мог преимущественно переноситься выходящим потоком NMDG+ и/или входящим потоком СГ. Замена экстраклеточного СГ глюконатом сопровождалась увеличением входящей компоненты интегрального тока, приводила к смещению потенциала реверсии до 14±4 мВ и значительно сильнее подавляла выходящий ток, нежели при диализе клеток CsCl (66.0± 12.5% против 26.9±5.0%). Эти факты свидетельствовали о том, что NMDG+ проникает через МА-каналы, которые также проницаемы для анионов глюконата, хотя заметно хуже чем для ионов СГ. Все эти результаты трудно объяснить в своей совокупности, если, не предположить, что ПЗ МА-входящий ток во вкусовых клетках типа II транспортируется через неселективные ионные каналы, которые проницаемы для катионов и анионов, включая Cs+, Na+, СГ, NMDG+ и глюконат.

В свете того, что клетки типа II секретируют АТФ, не используя классический Са2+-зависимый экзоцтитоз, но какие-то АТФ-проницаемые ионные каналы (Romanov et al., 2007), МА-каналы в силу своей неселективности вполне могли выполнять функцию ПЗ трансмембранной поры для секреции АТФ. Эта идея проверялась нами в ряде экспертиментов. В частности, в условиях, когда внутриклеточный и внеклеточный растворы содержали только 50 мМ MgATP + 50 мМ Mg(OH)2, наблюдались выходящие токи величиной до нескольких сотен пикоампер (рис.Юа, левая панель). Это свидетельствовало о том, что МА каналы проницаемы для Mg2+ и/или MgATP2", так как при нейтральных значениях рН другие заряженные формы АТР присутствуют лишь в следовых количествах. Так, согласно нашим расчетам, в растворе, состоящем из 50 мМ MgATP+50 мМ Mg(OH)2, при рН=7.4 и 25 °С присутствуют 21.0 мМ MgATP2", 21.1 мМ Mg2+ и 28.9 мМ Mg2ATP. Разбавление экстраклеточного раствора в 4 раза до 12.5 мМ MgATP + 12.5 мМ Mg(OH)2 (соответственно концентрации различных форм: 7.04 мМ MgATP2", 7.1 мМ Mg2+ и 5.42 мМ MgjATP) приводило к снижению амплитуды выходящего тока и смещению на графиках I-V характеристик потенциала реверсии вправо на 3.8±0.8 (п=4) (рис. 10а, правая панель и рис. 106). Это указывало на то, что медленно активирующиеся каналы примерно в равной степени проницаемы для Mg2+ и MgATP2".

50 мЗ

-г»

г 200

100

О 40 ккафзюыО тихентая, мЗ

Рисунок 10. Каналы, транспортирующие неселективные выходящие токи, проницаемы для АТФ. а - токи, регистрируемые от вкусовой клетки в условиях 50мМ Mg2ATPout/50MM Mg2ATP,„ (левая панель) и 12.5мМ Mg2ATPolI(/50MM Mg2ATPjn (правая панель). 6 - I-V характеристики токов, представленных в а, символы соответствуют моменту измерения стационарного SA-тока. Использовалась модификация whole-cell.

Таким образом, в отличие от большинства исследовавшихся клеток, включая вкусовые клетки типа I и типа III, вкусовые клетки типа II способны секретировать АТФ. Выходящие ПЗ токи в клетках типа II преимущественно транспортируются не через К'-каналы, а по неселективным каналам, скорее всего, формируемым канальными белками коннексинами (Romanov et ai., 2007). Причины использования неселективных каналов и их роль в физиологии вкусовых клеток типа II предстоит выяснить в дальнейших экспериментах.

2. Исследование рекомбинантных Р2Х пуринорецепторов.

Дальнейшей нашей задачей было изучение свойств Р2Х2 и Р2Х3 изоформ пуринорецепторов, локализованных в афферентных окончаниях вкусового нерва и являющихся непосредственными участниками проведения вкусового сигнала при участии АТФ, который выбрасывается вкусовыми клетками типа II. Трудность решения этой задачи состояла в том, что регистрировать активность этих рецепторов в составе нервного окончания практически невозможно. В связи с этим, данные рецепторы исследовались в гетерологической системе, для чего были сконструированы рекомбинантные плазмиды pIRES2-EGFP/P2X2 и pIRES2-EGFP/P2X3, несущие кодирующую последовательность генов соответствующих Р2Х рецепторов. Эти плазмиды в дальнейшем использовались для получения клеточных линий СНО, экспрессирующих рекомбинантные Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы.

Рисунок 11. Кинетика токов, регистрируемых от клеток СНО, несущих гены гомомерных Р2Х2 и Р2Х3 рецепторов, а также их гегеродимерную форму Р2Х2Л>2Х3.

P2Xj P2Xj P2Xj/P2X3

10иНАТ» МмкИАТ® IOmkN АТФ

,500 ра

<НС j tsec

1500 рА J

Клетки СНО, трансфецированные плазмидами plRES2-EGFP/P2X2 и/или pIRES2-EGFP/P2X3 приобретали способность отвечать на апликацию АТФ входящими токами (Рис. 11). Их характерная кинетика соответствовала таковой для АТФ-зависимых токов, описанных в литературе для сенсорных нейронов, экспрессирующих различные комбинации Р2Х2 и Р2Х3 рецепторов. Это свидетельствовало о том, что экзогенные Р2Х рецепторы в клетках СНО вполне функциональны, подтверждая адекватность протоколов, использованных нами.

В качестве одной их базовых характеристик Р2Х рецепторов нами исследовалась зависимость амплитуды регистрируемых токов от концентрации апплицируемой АТФ. Концентрация полунасыщения токов ЕС50 для данного исследуемого клона СНО, несущего ген Р2Х3 рецептора, составила 0,74 мкМ АТФ, пороговая концентрация соответствовала 50 нМ АТФ, а насыщение тока достигалось при 50 мкМ АТФ (Рис. 12). Полученные данные анализировались с использованием уравнения Хилла: iyia=l/l+(A/A//2)n,где 1А - ток, вызванный АТФ в концентрации А, 10

- ток, вызванный 10 мкМ АТФ, А ¡;2 и п • концентрация АТФ, вызывающая полунасыщение тока и коэффициент Хилла, соответственно. В данном случае, Л ¡/2 = 0,74 мкМ и п = 0,73. Каждая точка получена усреднением данных от 3-5 клеток.

АТР

0,05мкЧ 0,5 мкМ

0,0010,01 0,1 1 10 100 1000 |АТФ|, мкМ

Рисунок 12. АТФ-зависимые токи, регистрируемые от клетки СНО, экспресссиирующей рекомбинантные Р2Х3 рецепторы (панель а). 6 - Зависимость нормированного тока от концентрации внеклеточного АТФ. Нормирование проводили к амплитуде ответа на ЮмкМ АТФ.

Для Р2Х рецепторов характерна десенситизация, т.е. градуальное и существенное уменьшение тока в присутствии агониста во внеклеточной среде. Помимо этого, для Р2Х3 рецепторов характерен особый тип десенситизации - так называемая «высокоаффинная десенситизация». Феноменологически это явление состоит в том, что ответ на кратковременную аппликацию АТФ, которая вызывает вполне значимый входящий ток, существенно снижается, если в наружной среде постоянно присутствует агонист в подпороговых концентрациях, т.е. в концентрациях, при которых агонист сам по себе ответов не вызывает. Чувствительность рекомбинантшлх Р2Х3 рецепторов к наномолярным АТФ в наружном растворе оценивалась по изменениям амплитуды тока в ответ на аппликацию тестового стимула -5мкМАТФ(~ЕС,о).

Оказалось, что в полном соответствии с литературными данными подпороговые дозы АТФ заметно снижали ответы на тестовый стимул (Рис. 13а). По совокупности данных нами была получена концентрационная зависимость высокоафинной десенситизации, которая аппроксимировалась с использованием уравнения Хилла (/0-]ü)/l0=l/(l+(a/ai/2)") где /0 и /„ - токи, вызванные 5 мкМ АТФ в контроле и в присутствии АТФ при концентрации а. Было получено, что а1/2= 2,67 мкМ и я = 1,8.

АТР 5мкм

1нм атр

1Л

о ЁОЛ 3 а 0,6

1Д

II«

ол

o,oi

0.1 I >о (атф1,нм

100 1090

Рисунок 13.

Высокоаффинная десенситизация Р2Х3 рецепторов в присутствии 1нМ АТФ в наружном растворе, а - оригинальные токовые ответы; 6 - зависимость высокоаффинной десенситизации рекомбинангных Р2Х3 рецепторов от концентрации АТФ (нМ) в наружной среде.

Одна из задач, результаты решения которой потенциально были очень важны для дальнейшего развития данного направления, был писк модуляторов Р2Х2 и Р2Х3 рецепторов. Антагонистов Р2Х2 и Р2Хз рецепторов описано на сегодняшних день очень мало, они, как правило, дороги, и только некоторые из них находятся в свободной продаже. Известно, что пептидные токсины, выделенные из ядов, ингибируют или активируют огромное количество мишеней, в частности ионные каналы и ионотропные рецепторы. Нам предоставилась возможность использовать созданную нами клеточную линию, гетерологически экспрессирующую Р2Х2 или Р2Хз рецепторы, для изучения модулирующего действия пептидных токсинов так называемых Р315 и Р331, выделенных из яда Центрально Азиатского паука в лаборатории Е.В.Гришина (ИБХ РАН).

В случае Р2Х2 рецепторов достоверных эффектов пептидных токсинов на активность рецепторов не обнаружено, хотя использовались различные схемы опытов, учитывая, что разные вешества могут связываться с рецептором, находящимся в различных конформациях. Для Р2Хз рецепторов нами были найдены условия, в которых действие Р315 и Р331 проявлялось. Интересно, что данные пептидные токсины не оказывали статистически достоверного влияния на активность Р2Х3 рецепторов в условиях полного отмыва клеток от внеклеточного АТФ, т.е. когда рецепторы не находились в состоянии высокоаффинной десенситизации. Однако Р315 и Р331 оказались способны потенциировать высокоаффинную десснситизацию Р2Хз рецепторов. Феноменологически, действие пептидов сводилось к сдвигу концентрационной зависимости десенситизации Р2Х3 рецепторов в область более низких концентраций агониста (Рис. 14).

АТР 5мкМ

1нМ АТР+ 50нМ Р331

ода о,о1

0,1 I ю [АТФ], иМ

Рисунок 14.

Пептидный токсин Р331 повышает чувствительность Р2Х3 рецепторов к АТФ. а - пример оригинальных записей АТФ-зависимого тока через Р2Хз рецепторы в контроле и в присутствии 50нМ пептидного токсина РЗЗ1. б - зависимость степени ингибирования входящих токов, вызванных

кратковременной аппликацией 5 мкМ АТФ от концентрации АТФ (в нМ), постоянно присутствующей в наружной среде, в контроле («) и на фоне пептидного токсина (ж).

Заключение.

Достаточно давно методами иммунногистохимии и электронной микроскопии были получены свидетельства того, что во вкусовых клетках типа III (и только в них) функционируют классические химические синапсы. Последние обычно используют Са2+-зависимый экзоцитоз для выброса нейротрансмиттера, в качестве которого во вкусовых клетках предполагался серотонин, как основной компонент пресинаптические везикул. Поэтому можно было ожидать, что клетки типа III являются серотошшергическими, и что по-крайней мере в этих клетках функционируют потенциал-зависимые Са2+-каналы - неприменный атрибут химических синапсов. Нам действительно удалось показать, что из трех типов

вкусовых клеток, образующих вкусовую почку, ПЗ Са2+ -каналы функциональны во вкусовых клетках типа III и только в них. В этой связи, в качестве метода для селективной модуляции выброса серотонина и, возможно, некоторых других нейротрансмиттеров, высвобождаемых вкусовыми клетками типа III, можно было бы использовать блокаторы/активаторы ПЗ Са2+-каналов. В свете этой идеи, было целесообразно исследовать биофизические свойства ПЗ Са2+-каналов вкусовых клеток. Нами были исследованы потенциал-зависимость Са2+ токов, их кинетические характеристики, действие ряда блокаторов. Полученные данные свидетельствовали о том, что ПЗ Са2+-токи в клетках типа III транспортируются преимущественно через Са2+-каналы L-типа. Удивительной оказалась их необычно низкая чувствительность к дигидропиридинам. Таковая была описана только для Са'+-каналов биполярных и фоторецепторных клеток сетчатки, а(-субъедшшца которых кодируется геном alF. Однако, используя метод ОТ-ПЦР, мы не нашли транскрипты этого гена во вкусовой ткани. Используя метод ОТ-ПЦР и ген-специфические праймеры, мы также исследовали экспрессию трех оставшихся генов, кодирующих а 1-субъединицу Са2+-каналов L-типа: alS, alC и alD. В результате было обнаружено, что во вкусовой ткани мыши экспрессированы гены а/С и alD, причем ампликон гена alC был гораздо интенсивнее и экспрессировался во всех колониях Е. coli по сравнению с ампликоном гена alD. Продукта экспрессии гена alS во вкусовой ткани мыши обнаружено не было. Согласно литературным данным гетерологическая экспрессия известных сплайс-вариантов гена а/С индуцирует формирование Са2+-каналов с более высокой чувствительностью к дигидропиридинам, чем в нашем случае. Можно поэтому думать, что во вкусовых клетках функционирут новый сплайс вариант а/С. Насколько справедливо данное предположение покажут дальнейшие исследования.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что вкусовые клетки типа II способны секретировать АТФ в ответ на деполяризацию. В экспериментах проводилась одновременная регистрация ПЗ токов и флуоресценции Са-зонда Fluo-4, по которой определяли изменение уровня внутриклеточного Са2+ в клетках биосенсорах COS-1, вызываемое появлением АТФ во внеклеточном пространстве. Оказалось, что ответы АТФ-сенсора наблюдались только при стимуляции клеток типа II, а деполяризация клеток типа I и III ответов АТФ-сенсоров не вызывала, что свидетельствовало об отсутствие секреции АТР. Далее было показано, что высвобождение АТФ не зависит от Са2+, т.е. протекает без участия везикулярного механизма. Согласно литературным данным, выброс АТФ может протекать при участии ионных каналов. Важно отметить, что в клетках типа II выходящие ПЗ токи преимущественно переносятся через неселективные ионные каналы, проницаемые для крупных органических катионов (NMDG+, ТЕА+) и анионов (глюконат"). В силу такой неспецифичности эти каналы вполне могли бы выполнять функцию транспортной системы для АТФ в клетках типа II. Эта идея проверялась нами в прямых экспериментах, в которых оценивалась проницаемость неселективных каналов для АТФ. Нам удалось зарегистрировать потенциал-зависимые выходящие токи в условиях, когда по обе стороны мембраны вкусовой клетки присутствовали только MgATO2', Mg2* и Mg(OH)2. При уменьшении концентрации MgATP в наружном растворе в 4 раза сдвиг потенциала реверсии составлял всего около 4 мВ. Это свидетельствовало о том, что неселективные каналы, функционирующие во вкусовых клетках типа II, примерно в равной степени проницаемы для ионов Mg и АТФ.

системы в физиологии периферического вкусового органа. Было показало, в частности, что метаботропные P2Y рецепторы экспрессируются во вкусовых клетках желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков, а ионотропные Р2Х рецепторы функционируют в некоторых клетках грибовидного сосочка и в нервных окончаниях афферентного вкусового нерва.

К тому времени, когда начиналась данная работа, многое было неясным. Одна из методических задач, решить которые нам представлялось целесообразным, был поиск подходов для селективного отключения/модуляции различных ветвей пуринсргической сигнализации, в частности, афферентной нейропередачи. Поскольку механизмы высвобождения АТФ вкусовыми клетками были в тот момент неизвестны, в качестве мишени предполагались Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы вкусового нерва. Очевидная трудность решения этой задачи состояла в том, что регистрировать активность этих рецепторов в составе нервного окончания практически невозможно. В связи с этим, Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы исследовались в гетерологической системе, что потребовало от нашей лаборатории освоения целого спектра методов молекулярной и клеточной биологии. Поскольку раньше подобные методики нами не использовались, мы попытались вначале решить промежуточную, более легкую задачу, которая состояла в следующем. Используя готовые векторы, несущие гены хорошо изученных в экспрессиониых системах К+-каналов, мы осваивали методы работы с векторами, трансфекции клеток в культуре, отбора клеточных клонов, физиологического тестирования клеточных линий.

Мы использовали вирусный вектор, несущий ген {^-канала hERG-тиш, для которого били подобраны условия для эффективной гетерологической экспрессии, и были получены клеточные клоны с высоким и стабильным уровнем экспрессии, судя по характерным К+-токам большой амплитуды. Выбор именно этого типа К^-каналов был продиктован и тем, что он имеет важное физиологическое значение и используется для тестирования некоторых лекарственных средств, разрабатываемых для лечения различных патологий сердечно-сосудистой системы, в качестве аналгетических средств, антигистаминпых препаратов. Поэтому в перспективе наличие клеточных линий с функциональными К+-каналами данного типа могло оказаться полезным для прикладных исследований.

Приобретенный опыт позволил нам приступить к решению основной задачи -исследованию Р2Х рецепторов, функционирующих во вкусовой почке мыши. С этой целью гены рецепторов Р2Х2 и Р2Х3 были клонированы в плазмидный вектор pIRES2-EGFP и затем экспрессированы в клетках линии СНО, которые не обладают заметной собственной АТФ-чувствигельностью. Гетерологическая экспрессия генов Р2Х2 и Р2Х3 индуцировала появление АТФ-зависимых токов с характерными биофизическими свойствами, свидетельствуя об активности соответствующих Р2Х рецепторов.

Для Р2Х3 рецепторов свойственно явление высокоаффинной десенситизации, которое выражается в способности рецептора переходить в десенситизированное состояние в присутствии наномолярного АТФ. Отметим, что в таких концентрациях агонист сам по себе активацию АТФ-зависимых токов не вызывает, но драматически подавляет ответы клеток на микромолярный АТФ. Поскольку внеклеточная концентрация АТФ в различных тканях оценивается величиной 10-100 нМ, что достаточно для индукции высокоафшшой десенситизации Р2Х3 рецепторов, это явление можно рассматривать как естественный механизм модуляции работы данного типа ионотропных пуринорецепторов. Рекомбинантные Р2Х3 рецепторы, клонированные нами из вкусовой ткани, сохраняли свойства нативных Р2Х3

рецепторов, в частности, обладали способностью переходить в состояние высокоаффинной десенситизации при концентрации полуэффекта ~ 3 нМ АТФ.

Последнее время возрос интерес к изучению Р2Х рецепторов, поскольку таковые вовлечены в формирование хронического болевого ощущения, возникающего при повреждении тканей или их воспалении и связанного с устойчивым возбуждением сенсорных нейронов. Эти рецепторы рассматриваются в качестве одной из потенциальных мишеней при создании лекарственных препаратов, обладающих аналгезирующими свойствами. Поскольку ионные каналы являются мишенью природных токсинов, последние нередко используются для решения научных и прикладных задач.

Нам предоставилась возможность использовать созданную нами клеточную линию, гетерологическн экспрессирующую Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы, для изучения модулирующего действия пептидных токсинов из яда Центрально Азиатского паука-волка рода Geolycosa. В поведенческих экспериментах, проводимых ранее в лаборатории Гришина Е.В. с использованием цельного яда и отдельных компонентов, очищенных из этого яда, было показано, что болевые реакции мышей становились реже или пропадали совсем при введении препарата из яда в воспаленную область. Мишенью этих пептидов могли быть Р2Х рецепторы. С точки зрения задач, как физиологии боли, так и физиологии вкуса представляло интерес исследовать эффекты этих пептидов на клеточном уровне.

При исследовании модулирующего действия токсинов на активность Р2Х2 достоверных эффектов выявлено не было. В случае Р2Х3 рецепторов оказалось, что исследуемые токсины не вызывали статистически достоверных эффектов на активность Р2Х3 рецепторов в условиях полного отмыва клеток от АТФ, т.е. в условиях, при которых рецепторы не могли находиться в состоянии высокоафинной десенситизации. Оказалось, однако, что токсины способны потенциировать высокоафинную десенситизацию Р2Х3 рецепторов. Феноменологически, действие пептидов на Р2Х3 рецепторы сводилось к сдвигу концентрационной зависимости высокоафинной десенситизации в область более низких концентраций агониста. Таким образом, на фоне внеклеточного АТФ, уровень которого in vivo оценивается величиной 10-100 нМ, исследовавшиеся пептиды должны оказывать ингибирующие эффекты на Р2Х3 рецепторы, усиливая их высокоафинную десенситизацию. В силу сказанного, использовавшиеся нами пептидные токсины могут оказаться привлекательными не только как инструмент исследования Р2Х3 рецепторов, но и в качестве потенциальных аналгетиков.

Выводы.

1. Методами флуоресцентной микроскопии и фотометрии показано, что в физиологических условиях ГО Са2+-каналы активны более чем в 90% популяции вкусовых клеток типа III, формирующих классический Са2+-зависимый химический синапс.

2. Показано, что ПЗ Са2+-токи в клетках типа III переносятся преимущественно через Са2+-каналы L-типа с необычно низкой чувствительностью к дигидропиридинам.

3. Во вкусовой ткани мыши найдены транскрипты генов alC и alD, кодирующих al-субъединицы Са2+-каналов L-типа. Значительное преобладание продуктов экспрессии гена alC указывает на то, что потенциал-зависимая Са2+ проницаемость вкусовых клеток типа III обеспечивается преимущественно каналами типа Cavl.2.

4. Установлено, что неселекгивные ионные каналы, которые транспортируют выходящие токи во вкусовых клетках типа П, проницаемы для крупных органических катионов и анионов, в том числе для АТФ. Это находится в полном согласии с тем, что вкусовые клетки типа II используют невезикулярный механизм для секреции АТФ.

5. Показано, что гетерологическая экспрессия Р2Х2 и Р2Х3 рецепторов мыши в клетках СНО индуцирует АТФ-зависимые токи со свойствами, характерными для этих рецепторов. Получены линии клеток СНО, устойчиво экспрессирующие Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы.

6. Исследовано явление высокоаффинной десенситизации Р2Х3 рецепторов. Установлено, что пептидные токсины потенциируют высокоаффшшую десенситизацию Р2Х3 рецептора, сдвигая кривую ишпбирования в сторону более низких концентраций агониста.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи

1. A.A. Шутов, О.В. Лебедева, P.A. Романов, O.A. Рогачевская, Н.В. Кабанова. С.С. Колесников, Э.Р. Сафарова. "Клеточная тест-система, экспрессирующая К+-канал hERG, для исследования кардиотоксичности лекарственных препаратов. Получение и анализ". Биологические мембраны. 2008, Т. 25, № 4, С. 322-328.

2. P.A. Романов, Н.В. Кабанова, С.Л. Малкин, С.С. Колесников. "Неселективные потенциал-зависимые каналы во вкусовых клетках типа II". Биологические мембраны. 2009, Т. 26, №1, С. 48-58.

3. P.A. Романов, Ю.Е. Яценко, Н.В. Кабанова. М.Ф. Быстрова, С.С. Колесников. "Потенциал-зависимые Са2+-каналы вкусовых клеток типа Ш". Биологические мембраны. 2009, Т. 26, №4, С. 1-7.

Тезисы докладов

1. Кабанова Н.В.. Романов P.A. Рогачевская O.A., Колесников С.С., Лебедева О.В. "Исследование К^капалов в экспрессионной системе методом patch clamp". 12-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». 10-14 ноября 2008г., Пущино.

2. O.A. Рогачевская, М.Ф. Быстрова, A.A. Хохлов, С.Л. Малкин, Г.Д. Чурбанов, H.H. Осокин, Н.В. Кабанова, P.A. Романов "Использование методов флуоресцентной микроскопии для исследования мембранной проницаемости вкусовых клеток мыши". Международный научно-практический семинар «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем», 17-21 ноября 2008 г., Санкт-Петербург.

3. Кабанова Н.В.. Романов P.A., Рогачевская O.A., Шевченко A.B. "Модуляция активности Р2Х-рецепторов пептидными токсинами". 14-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». 1923 апреля 2010 г., Пущино.

Подписано в печать:

10.08.2010

Заказ № 3978 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кабанова, Наталия Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

II. 1. ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ВКУСОВОГО ОРГАНА

11.2. МЕХАНИЗМЫ ТРАНСДУКЦИИ ВКУСОВОГО СИГНАЛА 10 И.2.1. Ионные каналы как рецепторы и проводники вкусовых стимулов 10 II.2.2. Вторичные мессенджеры хеморецепторного пути передачи вкусового сигнала.

11.3. СИНАПТИЧЕСКАЯ ПЕРЕДАЧА ВКУСОВОГО СИГНАЛА

11.3.1. Потенциал-зависимые Са2+-каналы.

11.3.2. Ионотропные Р2Хпуринорецепторы: структура и свойства. 20 И.З.З. Высокоаффинная десенситизация —уникальное свойство Р2Хзрецепторов. 28 III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

111.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33 III. 1.1. Выделение изолированных вкусовых клеток. 33 III. 1.2. Регистрация ионных токов вкусовых клеток.

Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp).

III. 1.3. Метод микрофотометрии и измерение [Ca2+]in.

III. 1.4. Культура клеток.

Ш.1.5. Трансфекция клеток.

III. 1.6. ОТ-ПЦР. Клонирование. Рестрикционный анализ. 37 111.1.6.1. Идентификация а!-субъединицы, кодируюгцей Сау-каналы вкусовых клеток мыши. 37 III. 1.6.2. Создание рекомбинантных тазмид pIRES2-EGFP/P2X2 и pIRES2-EGFP/P2X3.

111.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 42 III.2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ ВО

ВКУСОВЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ

111.2.1.1. Функциональная идентификация вкусовых клеток, обладающих потенциал-зависимыми Са2+-токами.

111.2.1.2. Идентификация Сау-каналов вкусовых клеток. Эффекты блокаторов.

111.2.1.3. Анализ экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих ai-субъедииицы

Са2+-каналов L-muna.

111.2.1.4. Исследование свойств неселективных ионных каналов во вкусовых клетках типа II как возможного пути секреции А ТФ.

III.2.2. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ В

ЭКСПРЕССИОННОЙ СИСТЕМЕ.

111.2.2.1. Электрофизиологическое исследование рекомбинантных К^-каналов hERG-muna в экспрессионной системе.

111.2.2.2. Реконструкция рекомбинантных Р2Х пуринорецепторов в клеточной линии СНО.

111.2.2.3. Свойства АТФ-зависимых whole-cell токов, регистрируемых от клеток СНО, трансфицированных рекомбинантными Р2Х пуринорецепторами.

111.2.2.4. Высокоаффинная десенситизация гомомерных Р2Хз пуринорецепторов.

111.2.2.5. Модуляция активности рекомбинантных Р2Хз пуринорецепторов пептидными токсинами из яда паука.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кабанова, Наталия Владимировна

V. выводы

1. Методами флуоресцентной микроскопии и фотометрии показано, что в

24физиологических условиях ПЗ Са -каналы активны более чем в 90% популяции вкусовых клеток типа III, формирующих классический

Са -зависимыи химическии синапс.

2. Показано, что ПЗ Са -токи в клетках типа III переносятся преимущественно через Са2+-каналы Ь-типа с необычно низкой чувствительностью к дигидропиридинам.

3. Во вкусовой ткани мыши найдены транскрипты генов а1С и аШ, кодирующих а1-субъединицы Са -каналов Ь-типа. Значительное преобладание продуктов экспрессии гена а1С указывает на то, что потенциал-зависимая Са2+ проницаемость вкусовых клеток типа III обеспечивается преимущественно

Са2+

-каналами типа

Сау1.2.

4. Установлено, что неселективные ионные каналы, которые транспортируют выходящие токи во вкусовых клетках типа II, проницаемы для крупных органических катионов и анионов, в том числе для АТФ. Это находится в полном согласии с тем, что вкусовые клетки типа II используют невезикулярный механизм для секреции АТФ.

5. Показано, что гетерологическая экспрессия Р2Хг и Р2Хз рецепторов мыши в клетках СНО индуцирует АТФ-зависимые токи со свойствами, характерными для этих рецепторов. Получены линии клеток СНО, устойчиво экспрессирующие Р2Х2 и Р2Хз рецепторы, а также их гетеродимер Р2Х2/3.

6. Исследовано явление высокоаффинной десенситизации Р2Хз рецепторов. Установлено, что пептидные токсины потенциируют высокоаффинную десенситизацию Р2Хз рецептора, сдвигая кривую ингибирования в сторону более низких концентраций агониста.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основополагающей функцией хемосенсорных клеток в составе вкусовой почки является распознавание вкусовых веществ, их трансдукция и кодирование информации об их концентрации и вкусовой модальности с целью дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга. Эти и другие функции клеток вкусовой почки реализуются за счет разветвленных межклеточных коммуникаций. На сегодняшний день известно, что во вкусовой почке функционирует несколько сигнальных систем и идентифицированы рецепторы к таким классическим нейротрансмиттерам как глутамат, серотонин, ГАМК, АТР, норадреналин, холектокинин, нейропептид Y. Возможность избирательно контролировать активность той или иной сигнальной системы представляет собой инструмент, с помощью которого можно судить на физиологическом уровне о биологической функции исследуемой сигнальной системы. В настоящей работе ставились и решались задачи, как часть исследования роли серотонинергической и пуринергической систем в физиологии вкусовой почки.

Из данных иммунногистохимии и электронной микроскопии достаточно давно было известно, что во вкусовых клетках типа III (и только в них) функционируют классические химические синапсы, которые обычно используют Са2+-зависимый экзоцитоз для выброса нейротрансмиттера, и что пресинаптические везикулы содержат серотонин. Поэтому можно было ожидать, что эти клетки являются серотонинергическими, и что по-крайней мере в этих клетках функционируют потенциал-зависимые Са2+-каналы - неприменный атрибут химических синапсов. Нам действительно удалось показать, что из трех типов вкусовых клеток, образующих вкусовую почку, ПЗ Са2+-каналы функциональны во вкусовых клетках типа III и только в них. В этой связи, в качестве метода для селективного ингибирования выброса серотонина и, возможно, некоторых других нейротрансмиттеров, высвобождаемых вкусовыми клетками типа III, можно было бы использовать блокаторы ПЗ Ca -каналов. В свете этой идеи, было целесообразно исследовать биофизические свойства ПЗ Ca -каналов вкусовых клеток. Нами были исследованы потенциал-зависимость Ca токов, их кинетические характеристики, действие ряда блокаторов. Все эти данные свидетельствовали о том, что ПЗ Са2+-токи в клетках типа III транспортируются преимущественно Са2+-каналами L-типа. Удивительной оказалась их необычно низкая чувствительность к дигидропиридинам. Таковая была описана только для

-каналов биполярных и фоторецепторных клеток сетчатки, ai-субъединица которых кодируется геном Cavl.4. Однако используя метод ОТ-ПЦР, мы не нашли транскрипты этого гена во вкусовой ткани. Используя метод ОТ-ПЦР и ген-специфические праймеры, мы также исследовали экспрессию трех оставшихся генов, кодирующих а 1-субъединицу Са2+-каналов L-типа: Cavl.l, Cavl.2 и Cavl.3. В результате было обнаружено, что во вкусовой ткани мыши экспрессированы гены Cavl.2 и Cavl.3, причем ампликон гена Cavl.2 был гораздо интенсивнее и экспрессировался во всех колониях Е. coli по сравнению с ампликоном гена Cavl.3. Продукта экспрессии гена Cavl.l во вкусовой ткани мыши обнаружено не было. Поскольку согласно литературным данным гетерологическая экспрессия известных сплайс-вариантов Cavl.2 индуцирует формирование Са2+-каналов с более высокой чувствительностью к дигидропиридинам, чем в нашем случае, можно думать, что во вкусовых клетках функционирут либо новый сплайс вариант Cavl.2, либо необычные свойства регистрируемых Са2+-каналов обусловлены совместной экспрессией генов Cavl.2 и Cavl.3. Насколько справедливо данное предположение покажут дальнейшие исследования.

Ранее нами было показано, что вкусовые клетки типа II способны секретировать АТФ в ответ на деполяризацию клетки. В экспериментах проводилась одновременная регистрация ПЗ токов и измерение флуоресценции Са-зонда Fluo-4, по которой определяли изменение уровня внутриклеточного Ca в клетках биосенсорах COS-1. В итоге оказалось, что ответы АТФ-сенсора наблюдались только после деполяризации клеток типа II, а клетки типов I и III не вызывали подобные ответы. Эксперименты с АТФ-биосенсором показали, что высвобождение АТФ не зависит от Са2+, т.е протекает без участия везикулярного механизма. Согласно литературным данным, выброс АТФ может протекать при участии ионных каналов. Тот факт, что в условиях Cs-диализа выходящие токи в клетках типа II сохраняются, а присутствие TEA снаружи клетки не вызывает ингибирования выходящего тока в клетках типа II, говорит о том, что роль ПЗ К+-каналов в транспорте данных выходящих токов незначительна. Отсутствие блокирующего действия специфичных блокаторов С1-каналов показало, что данные каналы не относятся к классическим СГ-каналам. Интересным оказался тот факт, что токи, транспортируемые через эти каналы могут переноситься крупными органическими катионами (NMDG+, ТЕА+) или анионами (глюконат"). Таким образом, данные неселективные каналы могут являться путем транспорта и АТФ из вкусовых клеток типа II. В подтверждении этого предположения была получена корреляция между выходом АТФ и величиной выходящего тока, вызванного деполяризацией вкусовой клетки типа II. В экспериментах, в которых одновременно регистрировалась электрическая активность вкусовых клеток и уровень Са2+ в клетках АТФ-сенсорах, при спонтанном или индуцированном уменьшении выходящего тока, неизменно наблюдалось снижение секреции АТФ в ответ на деполяризацию вкусовой клетки. Этот результат служил сильным аргументом в пользу того, что неселективные каналы в клетках типа II, которые мы исследовали, действительно проницаемы для АТФ. И наконец, в прямых экспериментах по оценке проницаемости неселективных каналов для АТФ, нами регистрировались потенциал-зависимые выходящие токи в условиях, когда по обе стороны мембраны вкусовой клетки присутствовали только и 1^(ОН)2. При уменьшении концентрации

М^АТР в наружном растворе в 4 раза сдвиг потенциала реверсии составлял ~ 4 мВ. Это свидетельствовало о том, что неселективные каналы, функционирующие во вкусовых клетках типа II, примерно в равной степени проницаемы для ионов и АТФ.

В настоящий момент не остается сомнений, что АТФ является основным афферентным нейротрансмиттером вкусовой почки и что эта сигнальная молекула вовлечена в паракринные регуляции вкусовых клеток. Исследования последних лет убедительно продемонстрировали ключевую роль пуринергической сигнальной системы в физиологии периферического вкусового органа. Было показано, что метаботропные Р2У рецепторы экспрессируются во вкусовых клетках желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков, а ионотропные Р2Х рецепторы функционируют в некоторых клетках грибовидного сосочка и в нервных окончаниях афферентного вкусового нерва.

К тому времени, когда начиналась данная работа, многое было неясным. Одна из методических задач, решить которые нам казалось целесообразным, был поиск подходов для селективного отключения/модуляции различных ветвей пуринергической сигнализации, в частности, афферентной нейропередачи. Поскольку механизмы высвобождения АТФ вкусовыми клетками были в тот момент неясны, в качестве мишени были избраны Р2Хг и Р2Хз рецепторы вкусового нерва. Очевидная трудность решения этой задачи состояла в том, что регистрировать активность этих рецепторов в составе нервного окончания практически невозможно. В связи с этим, было решено исследовать эти рецепторы в гетерологической системе, что потребовало от нашей лаборатории освоения целого спектра методов молекулярной и клеточной биологии. Поскольку раньше подобные методики в нашей лаборатории не использовались, было решено попытаться решить промежуточную, более легкую задачу, которая состояла в следующем. Используя готовые векторы, несущие гены хорошо изученных в экспрессионных системах К+-каналов, мы учились методам работы с векторами, трансфекции клеток в культуре, отбора клеточных клонов, физиологического тестирования клеточных линий.

Мы использовали вектор К+-канала кЕЯО-типа, для которого были подобраны условия для эффективной гетерологической экспрессии и получены клеточные клоны с высоким и стабильным уровнем экспрессии, судя по характерным К+-токам большой амплитуды. Выбор именно этого типа К+-каналов был продиктован и тем, что он имеет важное физиологическое значение и используется для тестирования некоторых лекарственных средств, разрабатываемых для лечения различных паталогий сердечнососудистой системы, в качестве аналгетических средств, антигистаминных препаратов. Поэтому в перспективе наличие клеточных линий с функциональными К+-каналами данного типа могло оказаться полезным для прикладных исследований.

Данный опыт позволил нам приступить к решению основной задачи -исследованию Р2Х рецепторов, функционирующих во вкусовой почке мыши. С этой целью гены рецепторов Р2Хг и Р2Хз были клонированы в плазмидный вектор р1ЫЕ82-ЕОБР и затем экспрессированы в клетках линии СНО, которые не обладают заметной АТФ-чувствительностью. Гетерологическая экспрессия генов Р2Х2 и Р2Хз индуцировала появление АТФ-зависимых токов с характерными биофизическими свойствами, свидетельствуя об активности соответствующих Р2Х рецепторов.

Для Р2Хз рецепторов характерно явление высокоаффинной десенситизации, которая выражается в способности рецептора переходить в десенситизированное состояние в присутствии наномолярного АТФ. Отметим, что в таких концентрациях агонист сам по себе активацию АТФ-зависимых токов не вызывает, но драматически подавляет ответы клеток на микромолярный АТФ. Поскольку внеклеточная концентрация АТФ в различных тканях оценивается величиной 10-100 нМ, что достаточно для индукции высокоафинной десенситизации Р2Хз рецепторов, это явление можно рассматривать как естественный механизм модуляции работы данного типа иоиотропных пуринорецепторов. Рекомбинантные Р2Хз рецепторы, клонированные нами из вкусовой ткани, полностью сохраняли свойства нативных Р2Хз рецепторов и также обладали способностью переходить в состояние высокоаффинной десенситизации при концентрации полуэффекта ~ 3 нМ АТФ.

Нам предоставилась возможность использовать созданную нами клеточную линию, гетерологически экспрессирующую Р2Х2 и Р2Хз рецепторы, для изучения модулирующего действия пептидных токсинов из яда Центрально Азиатского паука-волка рода Оео1усо8а. В поведенческих экспериментах, проводимых ранее в лаборатории

Гришина Е.В. с использованием цельного яда и отдельных компонентов, очищенных из этого яда, было показано, что болевые реакции мышей становились реже или пропадали совсем при введении препарата из яда в воспаленную область. Мишенью этих пептидов могли быть Р2Х рецепторы. С точки зрения задач, как физиологии боли, так и физиологии вкуса представляло интерес исследовать эффекты этих пептидов на клеточном уровне.

При исследовании модулирующего действия токсинов на активность Р2Х2 достоверных эффектов выявлено не было. В случае Р2Хз рецепторов интересным оказался тот факт, что исследуемые токсины не оказывали статистически достоверного влияния на активность Р2Хз рецепторов в условиях полного отмыва клеток от АТФ, т.е. когда рецепторы не находились в состоянии высокоафинной десенситизации. Оказалось, однако, что токсины способны потенциировать высокоафинную десенситизацию Р2Хз рецепторов. Феноменологически, действие пептидов сводилось к сдвигу концентрационной зависимости десенситизации Р2Хз рецепторов в область более низких концентраций агониста. Таким образом, на фоне 10-100 нМ внеклеточного АТФ in vivo, исследовавшиеся пептиды из яда пауков должны оказывать ингибирующие эффекты на Р2Хз рецепторы, усиливая высокоафинную десенситизацию этих рецепторов. В силу сказанного, использовавшиеся нами пептидные токсины являются не только инструментом исследования Р2Хз рецепторов, но их также можно рассматривать в качестве потенциальных компонент болеутоляющих препаратов нового поколения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кабанова, Наталия Владимировна, Пущино

1. Романов Р.А., Кабанова Н.В., Малкнн C.JL, Колесников С.С. Неселективные потенциал-зависимые каналы во вкусовых клетках типа II // Биологические мембраны. 2009. Т. 26. №1. С. 64-74.

2. Хохлов А.А., Романов Р.А., Зубов Б.В., Пашинин А.Д., Колесников С.С. Осветитель на излучающих светодиодах для микрофотометрии клеток. // Приборы и техника экспериментов. 2007. Вып. 3. С. 128-131.

3. Abbaffy Т, Trubey KR, Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and modulation of cAMP in rat taste cells. // Am J Physiol Cell Physiol. 2003. 284, 1420-1428.

4. Adler E, Hoon M.A, Mueller K.L, Chandrashekar J, Ryba N.J.P, Zuker C.S. Novel Family of Mammalian Taste Receptors. // Cell. 2000. 100, 693-702.

5. Akabas M, Dodd J, Awqati Q. Identification of electrophysiological^ distinct subpopulations of rat taste cells. // J Membr Biol. 1990. 114 (1), 71-8. TP. // Pain. 2002. 95, 41-47.

6. Ascher P, Nowak L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurones in culture. // Journal of Physiology. 1988. 399, 247—266.

7. Avenet P, Lindemann B. Amiloride-blockable sodium currents in isolated taste receptor cells. // J Membrane Biol. 1988. 105, 245-255.

8. Avenet P, Lindemann B. Noninvasive recording of receptor cell action potentials and sustained currents from single taste buds maintained in the tongue: the response to mucosal NaCl and amiloride. // J Membr Biol. 1991. 124, 33-41.

9. Barrera N.P., Herbert P., Henderson R.M., Martin I.L., Edwardson J.M. Atomic force microscopy reveals the stoichiometry and subunit arrangement of 5-HT3 receptors. //Proc Natl Acad Sci USA. 2005. 102, 12595-12600.

10. Baryshnikov S.G., Rogachevskaja O.A., Kolesnikov S.S. Cacium signaling mediated by P2Y receptors in mouse taste cells. // J Neurophysiol. 2003. 90, 3283-3294.

11. Bean B.P. Nitrendipine block of cardiac calcium channels: High-affinity binding to the inactivated state //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 6388-6392.

12. Behe P., DeSimone J. A., Avenet P., Lindemann B. Membrane currents in taste cells of the rat fungiform papilla. Evidence for two types of Ca currents and inhibition of К currents by saccharin. // J Gen Physiol. 1990. 96, 1061-1084.

13. Benos DJ, Stanton В A. Functional domain within the degenerin/epithelial sodium channel (Deg/ENaC) superfamily of ion channels. // J Physiol. 1999. 520, 631-644.

14. Bernhardt S.J, Nairn M, Zehavi U, Lindemann B. Changes in IP3 and cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of sweet taste in the rat. // J Physiol. 1996. 490, 25-36.

15. Berntson A., Taylor W.R., Morgans C.W. Molecular identity, synaptic localization, and physiology of calcium channels in retinal bipolar cells // J. Neurosci. Res. 2003. V. 71. P. 146-151.

16. Bianchi L, Driscoll M. Protons at the gate: DEG/ENaC ion channels help us feel and remember. // Neuron. 2002. 34, 337-340.

17. Bigiani AR, Roper SD. Mediation of responses to calcium in taste cells by modulation of a potassium conductance. // Science. 1991. 252, 126-128.

18. Bigiani A, Delay RJ, Chaudhari N, Kinnamon SC, Roper SD. Responses to glutamate in rat taste cells. // J Neurophysiol. 1997. 77, 3048-3059.

19. Bigiani A. Amiloride-sensitive sodium currents in identified taste cells of the frog. // NeuroReport. 2001b. 12, 1315-1321.

20. Bigiani A, Ghiaroni V, Fieni F. Channels as taste receptors in vertebrates. // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2003. 83, 193-225.

21. Bo X., Alavi A., Xiang Z., Oglesby I., Ford A., Burnstock G. Localization of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds. // Neuroreport. 1999. 10, 1107-1111.

22. Boughter JD, Pumplin DW, Yu C, Christy RC, and Smith DV. Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and hamster. // J Neurosci. 1997. 17, 2852-2858.

23. Brake A. J, Wagenbach M. J, Julius D. New structural motif for ligand-gated ion channels defined by an ionotropic ATP receptor. //Nature. 1994. 371, 519-523.

24. Bretschneider F., Klapperstuck M., Lohn M., Markwardt F. Nonselective cationic currents elicited by extracellular ATP in human B-lymphocytes. // Pflugers Arch. 1995. 429, 691698.

25. Burnstock G. Purinergic nerves. // Pharmacol. Rev. 1972. 24, 509-58.

26. Burnstock G. Purine-mediated signalling in pain and visceral perception. // Trends Pharm.Sci. 2001. 22, 182-188.

27. Bystrova M.F., Yatzenko Y.E., Fedorov I.V., Rogachevskaja O.A., Kolesnikov S.S. P2Y isoforms operative in mouse taste cells. // Cell and Tissue Research. 2006. 323, 377-382.

28. Chaudhari N., Landin A.M., Roper S.D. A novel metabotropic glutamate receptor is a taste receptor for monosodium L-glutamate. // Nat Neurosci. 2000. 3, 113-119.

29. Chaudhari N., Yang H., Lamp C., Delay E., Cartford C., Than T., Roper S. The taste of monosodium glutamate, Membrane receptors in taste buds. // J Neurosci. 1996. 16, 38173826.

30. Chandrashekar J., Mueller K.L., Hoon M.A., Adler E., Feng L., Guo W., Zuker C.S., Ryba N. T2Rs Function as Bitter Taste Receptors. // Cell. 2000. 100, 703-711.

31. Chen S.R, Ebisawa K., Li X., Zhang L. Functional characterization of the recombinant type 3 Ca2+ release channel (ryanodine receptor) expressed in HEK293 cells. // J Biol Chem. 1997. 272, 24234-24246.

32. Chen Y, Herness M.S. Electrophysiological actions of quinine on voltage dependent currents in dissociated rat taste cells. // Pflugers Arch. 1997. 434, 215-26.

33. Chen Y.S, Sun X.D, Herness M.S. Characteristics of action potentials and their underlying outward currents in rat taste receptor cells. // J Neurophysiol. 1996. 75, 820-31.

34. Chen C.C, Akopian A.N., Sivilotti L, Colquhoun D, Burnstock G, Wood J.N. A P2X purinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. // Nature. 1995. 377, 428-431.

35. Chen Y.S, Sun X.D, Herness M.S. Characteristics of action potentials and their underlying outward currents in rat taste receptor cells. // J Neurophysiol. 1996. 75, 820-31.

36. Cho Y.K, Farbman A.I, Smith DV. The timing of a-gustducin expression during cell renewal in rat vallate taste buds. // Chem Sens. 1998. 23, 735-742.

37. Clapp T.R., Stone L.M., Margolskee R.F., Kinnamon S.C. Immunocytochemical evidence for co-expression of Type III receptor with signaling components of bitter taste transduction //Neuroscience. 2001. 6, 2-10.

38. Clapp T.R, Yang R., Stoick C.L., Kinnamon S.C., Kinnamon J.C. Morphological characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. // J Comp Neurol. 2004. 468, 311-321.

39. Clapp T.R., Medler K.F., Damak S., Margolskee R.F., Kinnamon S.C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. // BMC Biol. 2006. 4, 7-15.

40. Cook S.P. and McCleskey E.W. Cell damage excites nociceptors through release of cytosolic ATP. // Pain. 2002. 95(l-2):41-7.

41. Cook S.P, Rodland K.D, McCleskey E.W. A memory for extracellular Ca2+ by speeding recovery of P2X receptors from desensitization. // J Neuroscience. 1998. 18, 9238-9244.

42. Cummings T.A, Kinnamon S.C. Apical K+-channels in Necturus taste cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. // J Gen Physiol. 1992. 9, 591-613.

43. Deak F., Schoch S., Liu X., Sudhof T.C., Kavalali E.T. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. // Nat Cell Biol. 2004. 6(11), 1102-8.

44. Delay R.J., Kinnamon J.C., Roper S.D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: 2. Cell types and cell lineage. // J Comp Neurol. 1986. 253, 242-252.

45. Delay R.J., Roper S.D. Ultrastructure of taste cells and synapses in the mudpuppy Necturus maculosus. // J Comp Neurol. 1988. 277, 268-280.

46. Delay RJ, Kinnamon SC, Roper SD. Serotonin modulates voltage dependent calcium current in Necturus taste cells. // J Neurophysiol. 1997. 77, 2515-2524.

47. De Fazio R.A, Dvoryanchikov G., Maruyama Y., Kim J.W., Pereira E., Roper S.D., Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in mouse taste buds. // J Neuroscience. 2006. 26, 3971-3980.

48. DeSimone J.A, Heck G.L, DeSimone S.K. Active ion transport in dog tongue: a possible role in taste. // Science. 1981. 214, 1039-1041.

49. DeSimone J.A, Heck G.L, Mierson S, DeSimone S.K. The active ion transport properties of canine lingual epithelia in vitro implications for gustatory transduction. // J Gen Physiol. 1984. 83, 633-656.

50. Diiaz D., Bartolo R., Delgadillo D.M., Higueldo F., Gomora J.C. Contrasting effects of Cd2+ and Co2+ on the blocking/unblocking of human Cav3 channels // J. Membr. Biol. 2005. 207,91-105.

51. Dooley D.J., Taylor C.P., Donevan S., Feltner D. Ca2+ channel a25 ligands: novel modulators of neurotransmission // Trends Pharm. Sci. 2007. 28, 75-82.

52. Doolin R.E, Gilbertson T.A. Distribution and characterization of functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. // J Gen Physiol. 1996. 107, 545-554.

53. Dunn P.M, Zhong Y, Burnstock G. P2X receptors in peripheral neurons. // Prog. Neurobiol. 2001. 65, 107-134.

54. Egan T.M, Khakh B.S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. // J. Neurosci. 2004. 24, 3413—3420.

55. Egan T.M, Samways D.S.K, Li Z. Biophysics of P2X receptors. // Pflugers Arch Eur J Physiol. 2006. 452, 501-512.

56. Evans R.J, Lewis C., Virginio C., Lundstrom K., Buell G., Surprenant A., North R.A. Ionic permeability of, and divalent cation effects on, two ATP-gated cation channels (P2X receptors) expressed in mammalian cells. // J Physiol. 1996. 497, 413^422.

57. Fan Q.I., Vanderpool K.M., Chung H.S., Marsh J.D. The L-type calcium channel alpha 1C subunit gene undergoes extensive, uncoordinated alternative splicing. // Molecular and Cellular Biochemistry. 2005. 269, 153-163.

58. Finger E.T., Danilova V., Barrows J., Bartel D.L., Vigers A.J., Stone L., Hellekant G., Kinnamon S.C. ATP Signaling Is Crucial for Communication from Taste Buds to Gustatory Nerves. // Science. 2005. 310, 1495-1499.

59. Felix R. Molecular Regulation of Voltage Gated Ca Channels. // Journal of Receptors and Signal Transduction. 2005. 25, 57-71.

60. Fields R.D, Stevens B. ATP: an extracellular signaling molecule between neurons and glia. // Trends Neurosci. 2000. 12, 625-33.

61. Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Non-selective cation channel in bullfrog taste cell membrane. //NeuroReport. 1993. 5, 11-13.

62. Furue H, Yoshii K. In-situ tight-seal recordings of taste substance- elicited action currents and voltage-gated Ba currents from single taste bud cells in the peeled epithelium of mouse tongue. // Brain Res. 1997. 776, 133-139.

63. Ganchrow J.R. Taste cell function, Structural and biochemical implications. // Physiol Behav. 2000. 69, 29-40.

64. Ganchrow D, Ganchrow RJ. Renewal of taste bud cells. // Med Sci Res. 1992. 20, 653656.

65. Garcia-Palomero E, Cuchillo-Ibanez I, Garcia A.G, Renart J, Albillos A, Montiel C. Greater diversity than previously thought of chromaffin cell Ca2+ channels, derived from mRNA identification studies. // FEBS Lett. 2000. 481:235-239.

66. Garty H, Palmer L.G. Epithelial sodium channels: function, structure, and regulation. // Physiol Rev. 1997. 77, 359-396.

67. Gibb A. J, Colquhoun D. Activation of N-methyl-D-aspartate receptors by glutamate in cells dissociated from adult rat hippocampus. // Journal of Physiology. 1992. 456, 143—179.

68. Gilbertson T.A, Avenet P, Kinnamon S.C, Roper S.D. Proton currents through amiloride-sensitive Na channels in hamster taste cells role in acid transduction. // J Gen Physiol. 1992. 100, 803-824.

69. Gilbertson T.A, Roper S.D, Kinnamon S.C. Proton currents through amiloride-sensitive Na+ channels in isolated hamster taste cells: enhancement by vasopressin and cAMP. // Neuron. 1993. 10, 931-942.

70. Gilbertson T.A, Zhang H. Characterization of sodium transport in gustatory epithelia from the hamster and rat. // Chem Senses. 1998a. 23, 283-293.

71. Giniatulin R., Sokolova E, Nistri A. Modulation of P2X3 receptors by Mg2+ on rat DRG neurons in culture. //Neuropharmacology. 2003. 44, 132-140.

72. Graf E.M., Bock M., Heubach J.F., Zahanich I., Boxberger S., Richter W., Schultz J.H., Ravens U. Tissue distribution of a human Cavl .2 alphal subunit splice variant with a 75 bp insertion. // Cell Calcium. 2005. 38(1), 11-21.

73. Hajnoczky G, Csordas G, Das S, Garcia-Perez C, Saotome M, Sinha Roy S, Yi M. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+uptake in apoptosis. //Cell Calcium. 2006. 40, 553-60.

74. Harris A. Connexin channel permeability to cytoplasmic molecules // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2007. V. 94. P. 120-143.

75. He M-L., Gonzalez-Iglesias A.E., Tomic M, Stojilkovic S.S. Release and extracellular metabolism of ATP by ecto-nucleotidase eNTPDase 1-3 in hypothalamic and pituitary cells. //Purinergic Signal. 2005. 1, 135-144.

76. Heck G.L, Mierson S, DeSimone J.A. Salt taste transduction occurs through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. // Science. 1984. 223, 403-405.

77. Herness S, Zhao F, Kaya N, Lu S, Shen T, Sun X. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. // J Physiol. 2002a. 543, 601-614.

78. Hemess S., Zhao F., Lu S., Kaya N., Shen T. Expression and Physiological Actions of Cholecystokinin in Rat Taste Receptor Cells. // J Neurosci. 2002b. 22, 10018-10029.

79. Herness S., Chen Y. Serotonin inhibits calcium-activated K+-current in rat taste receptor cells. //NeuroReport. 1997. 8, 3257-3261.

80. Herness M.S, Gilbertson T.A. Cellular mechanisms of taste transduction. // Annu Rev Physiol. 1999. 61, 873-900.

81. Herness MS, Sun XD. Voltage-dependent sodium currents recorded from dissociated rat taste cells. // J Membr Biol. 1995. 146, 73-84.

82. Hille B. Ion channels of excitable membranes. Sunderland, Massachusetts, USA: Sinauer Associates, Inc. 2001. 814 p.

83. Hoon M.A., Adler E., Lindemeier J., Battey J.F., Ryba N., Zuker C.S. Putative Mammalian Taste Receptors: A Class of Taste-Specific GPCRs with Distinct Topographic Selectivity. // Cell. 1999. 96, 541-551.

84. Horn R., Marty A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method//J. Gen. Physiol. 1988. V. 92. P. 145-159.

85. Huang Y-J., Maruyama Y., Lu K-S., Pereira E., Plonsky I., Baur J.E., Wu D., Roper S.D. Mouse Taste Buds Use Serotonin as a Neurotransmitter. // J Neurosci. 2005. 25(4), 843-847.

86. Huang Y.J, Maruyama Y, Dvoryanchikov G., Pereira E., Chaudhari N., Roper S.D. The role of pannexin 1 hemichannels in ATP release and cell-cell communication in mouse taste buds. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. 104(15), 6436-41.

87. Huang A.L, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Trankner D, Ryba N.J, Zuker C.S. The cells and logic for mammalian sour taste detection. // Nature. 2006. 442(7105), 934938.

88. Jiang L.H., Kim M., Spelta V., Bo X., Surprenant A., North R.A. Subunit arrangement in P2X receptors. // J Neurosci. 2003. 23, 8903-8910.

89. Jacobson K.A., Jarvis M.F, Williams M. Purine and pyrimidine (P2) receptors as drug targets. // J Med Chem. 2002. 45, 4057-4093.

90. Karoly R., Mike A., Illes P, Gerevich Z. The Unusual State-Dependent Affinity of P2X3 Receptors Can Be Explained by an Allosteric Two-Open-State Model // Mol. Pharmacol. 2008. 173,224-234.

91. Kataoka S, Toyono T, Seta Y, Toyoshima K. Expression of ATP-gated P2X3 receptors in rat gustatory papillae and taste buds. // Arch. Histol. Cytol. 2006, 69 (4), 281-288.

92. Kawai K, Sugimoto K, Nakashima K, Miura H, Ninomiya Y. Leptin as a modulator of sweet taste sensitivities in mice. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97, 11044-11049.

93. Kaya N., Shen T., Lu S.G., Zhao F.L., Herness S. A paracrine signaling role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor subtypes. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004. 286(4), R649.

94. Kellenberger S, Schild L. Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. // Physiol Rev. 2002. 82, 735-767.

95. Kim M, Mistretta CM. 4-Aminopyridine reduces chorda tympani nerve taste responses to potassium and alkali salts in rat. // Brain Res. 1993. 612, 96-103.

96. Kim Y.V., Bobkov Y.V., Kolesnikov S.S. Adenosine triphosphate mobilizes cytosolic calcium and modulates ionic currents. // Neurosci Lett. 2000. 290, 165-168.

97. Kim D-J, Roper S.D. Localization of serotonin in taste buds: A comparative study of four vertebrates. //J Comp Neurol 1995, 353:364-370.

98. Kim M, Yoo O.J, Choe S. Molecular assembly of the extracellular domain of P2X2, an ATP-gated ion channel. // Biochem Biophys Res Commun. 1997. 240, 618-622.

99. Kim M.R., Kusakabe Y., Miura H., Shindo Y., Ninomiya Y., Hino A. Regional expression patterns of taste receptors and gustducin in the mouse tongue. // Biochem Biophys Res Commun. 2003. 312(2), 500-6.

100. Kinnamon J.C., Taylor B.G., Delay R.J., Roper S.D. Ultrastructure of mouse taste buds. Taste cells and their associated synapses. // J. Comp. Neurol. 1985. V. 235. P. 48-60.

101. Kinnamon S.C, Dionne V.E, Beam K.G. Apical localization of K+ channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85, 70237027.

102. Kinnamon S.C, Roper S.D. Evidence for a role of voltage-sensitive apical K+ channels in sour and salt taste transduction. // Chem Senses. 1988. 13, 115-121.

103. King B.F, Townsend-Nicholson A., Wildman S.S., Thomas T., Spyer K.M., Bumstock G. Coexpression of rat P2X2 and P2X6 subunits in Xenopus oocytes. // J Neurosci. 2000. 20, 4871-4877.

104. Kolesnikov S.S., Margolskee R.F. Extracellular K+ activates a K+- and H+ permeable conductance ion frog taste receptor cells. // J Physiol. 1998. 507, 415-432.

105. Kolesnikov S.S, Margolskee R.F. A cyclic-nucleotide-suppressible conductance activated by transducin in taste cells. //Nature. 1995. 376, 85-88.

106. Kollmar R., Montgomery L.G., Fak J., Henry L.J, Hudspeth A. J. Predominance of the alD subunit in L-type voltage-gated Ca channels of hair cells in the chicken's cochlea. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. 94, 14883-14888.

107. Korolkova Y.V, Tseng G-N, Grishin E.V. Unique interaction of scorpion toxins with the hERG channel. //Journal of Molecular Recognition. 2004; 17:209-217.

108. Koschak A., Reimer D., Walter D., Hoda J.-C., Heinzle T., Grabner M., Striessnig J. Cavl.4al subunits can form slowly inactivating dihydropyridine-sensitive L-type Ca2+ channels lacking Ca2+-dependent inactivation // J. Neurosci. 2003. 23, 6041-6049.

109. Kotturi M.F., Carlow D.A., Lee J.C., Ziltener H.J., Jefferies W.A. Identification and Functional Characterization of Voltage-dependent Calcium Channels in T Lymphocytes. // J Biol. Chem. 2003. 278 (47), 46949-60.

110. Kotturi M.F., Jefferies W.A. Molecular characterization of L-type calcium channel splice variants expressed in human T lymphocytes // Mol. Immunol. 2005. 42, 1461—1474.

111. Kourennyi D.E., Barnes S. Depolarization-induced calcium channel facilitation in rod photoreceptors is independent of G proteins and phosphorylation // J. Neurophysiol. 2000. V. 841. P. 133-138.

112. Kretz O, Barbry P, Bock R, Lindemann B. Differential expression of RNA and protein of the three pore-forming subunits of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel intaste buds of the rat. // J Histochem Cytochem. 1999. 47, 51-64.

113. Krimm RF, Miller KK, Kitzman PH, Davis BM, and Albers KM. Epithelial Overexpression of BDNF or NT4 Disrupts Targeting of Taste Neurons That Innervate the Anterior Tongue. // Develop Biol. 2001. 232, 508-521.

114. Kucenas S., Li Z., Cox J.A., Egan T.M., Voigt M.M. Molecular characterization of the zebrafish P2X receptor subunit gene family. // Neuroscience. 2003. 121, 935-945.

115. Kusakabe Y., Yamaguchi E., Tanemura K., Kameyama K., Chiba N., Arai S., Emori Y, Abe K. Identification of two alpha-subunit species of GTP-binding proteins, Gal 5 and Gaq, expressed in rat taste buds. // Biochim Biophys Acta. 1998. 1403, 265-272.

116. Kumazawa T, Brand JG, Teeter JH. Amino acid-activated channels in the catfish taste system. // Biophys J. 1998. 75, 2757-2766.

117. Kuzmin A.I., Lakomkin V.L., Kapelko V.I., Vassort G. Interstitial ATP level and degradation in control and postmyocardial infracted rats. // Am J Physiol. 1998. 275, C766-C771.

118. Lankipalli R.S., Zhu T., Guo D., Yan G.-X. Mechanisms underlying arrhythmogenesis in long QT syndrome//J.Electrocardiol. 2005. V. 38. P. 69-73.

119. Lazarowski E.R., Boucher R.C., Harden T.K. Mechanisms of Release of Nucleotides and Integration of Their Action as P2X- and P2Y-Receptor Activating Molecules. // Mol Pharmacol. 2003. 64, 785-795.

120. Le K.T., Babinski K., Seguela P. Central P2X4 and P2X6 channel subunits coassemble into a novel heteromeric ATP receptor. // J Neurosci 18:7152-7159.

121. Lewis C, Neidhart S, Holy C, North RA, Buell G, Surprenant A Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons. // Nature. 1995. 377, 432-435.

122. Li X-J, Blackshaw S, Snyder S.H. Expression and localization of amiloride-sensitive sodium channel indicate a role for non-taste cells in taste perception. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. 91, 1814-1818.

123. Li X-J, Xu R-H, Guggino W.B, Snyder S.H. Alternatively spliced forms of the alpha subunit of the epithelial sodium channel: distinct sites for amiloride binding and channel pore. // Mol Pharmacol. 1995. 47, 1133-1140.

124. Liang F., Hu W., Schulte B.A., Mao C., Qu C., Hazen-Martin D.J., Shen Z. Identification and characterization of an L-type Cavl.2 channel in spiral ligament fibrocytes of gerbil inner ear // Mol. Brain Res. 2004. V. 125. P. 40^16.

125. Liao P., Yu D., Lu S., Tang Z., Liang M.C., Zeng S., Lin W., Soong T.W. Smooth muscle-selective alternatively spliced exon generates functional variation in Cavl.2 calcium channels. // J Biol Chem. 2004. 279 (48), 50329-35.

126. Lin W, Finger T.E, Rossier B.C, Kinnamon S.C. Epithelial Na+ channel subunits in rat taste cells: localization and regulation by aldosterone. // J Comp Neurol. 1999. 405, 406-420.

127. Lin W, Rao S, Kinnamon SC, Gilbertson T. Evidence for expression of task-like K+ channels in rat taste cells. // Chem Senses. 2002. 27, All.

128. Lindemann B. Taste reception. // Physiol Rev. 1996. 76, 718-766.

129. Lindemann B, Barbry P, Kretz O, Bock R. Occurrence of ENaC subunit mRNA and immunoeytochemistry of the channel subunits in taste buds of the rat vallate papilla. // Ann NY Acad Sci. 1998. 855, 116-127.

130. Lindemann B. Receptors and transduction in taste. // Nature. 2001. 413, 219-225.

131. Liu D., Liman E.R. Intracellular Ca and the phospholipids PIP2 regulate the taste transduction ion channel TRPM5. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100, 15160-15165.

132. Marban E. Cardiac channelopathies // Nature. 2002. V.415. P. 213-218.

133. Margolskee R.F. Molecular Mechanisms of Bitter and Sweet Taste Transduction. // J Biol Chem. 2002. 277, 1-4.

134. Mathie A., Colquhoun D., Cull-Candy S.G. Conductance and single channel currents through nicotinic acetylcholine receptor channels in rat sympathetic ganglion neurones. // Journal of Physiology. 1991. 439, 717—750.

135. Max M, Shanker Y.G, Huang L. Taslr3, encoding a new candidate taste receptor, is allelic to the sweet responsiveness locus Sac. //Nature Genet. 2001. 28, 58-63.

136. McLaughlin S.K., McKinnon P.J., Margolskee R.F. Gustducin is a taste-cell-specific G protein closely related to the transducins. // Nature. 1992. 57, 563-569.

137. McLaughlin S.K, McKinnon P.J, Spickofsky N, Danho W, Margolskee R.F. Molecular cloning of G proteins and phosphodiesterases from rat taste cells. // Physiol Behav. 1994. 56(6), 1157-64.

138. Medler K.F., Margolskee R.F., Kinnamon S.C. Electrophysiological characterization of voltage-gated currents in defined taste cell types in mice // J. Neurosci. 2003. 23, 2608-2617.

139. Mierson S, Olson M.M, Tietz A.E. 1996. Basolateral amiloride-sensitive Na+ transport pathway in rat tongue epithelium. // J Neurophysiol. 1996. 76, 1297-1309.

140. Migita K, Haines W.R, Voigt M.M, Egan T.M Polar residues of the second transmembrane domain influence cation permeability of the ATP-gated P2X(2) receptor. // J Biol Chem. 2001. 276, 30934-30941.

141. Miller R.J. Rocking and rolling with Ca2+ channels // Trends Neurosci. 2001. 24, 445449.

142. Misaka T., Kusakabe Y., Emori Y., Gonoi T., Arai S., Abe K. Taste buds have a cyclic nucleotide-activated channel, CNGgust. // J Biol Chem. 1997. 272, 22623-22629.

143. Miyamoto T, Miyazaki T, Okada Y, Sato T. Whole-cell recording from non-dissociated taste cells in mouse taste bud. // J Neurosci Methods. 1996a. 64, 245-252.

144. Miyamoto T, Fujiyama R, Okada Y, Sato T. Properties ofNa+-dependent K+ conductance in the apical membrane of frog taste cells. // Brain Res. 1996b. 715, 79-85.

145. Miyamoto T, Miyazaki T, Fujiyama R, Okada Y, Sato T. Differential transduction mechanisms underlying NaCl- and KCl-induced responses in mouse taste cells. // Chem Senses. 2001. 26, 67-77.

146. Montmayeur J.P, Liberies S.D, Matsunami H, Buck L.B. A candidate taste receptor gene near a sweet taste locus. // Nat Neurosci. 2001. 4, 492-498

147. Murray R.G., Murray A. The anatomy and ultrastructure of taste endings // Taste and Smell in Vertebrates / Eds. Wolstenholme G.E.W., Knight J. London: J. and A. Churchill, 1970. P. 3-30

148. Murray RG, Murray A, Fujimoto A. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. // J Ultrastruct Res. 1969. 27, 444-461.

149. Nagai T, Kim D.J, Delay R.J, Roper S.D. Neuromodulation of transduction and signal processing in the end organs of taste. // Chem Senses. 1996. 21, 353-365.

150. Nagaya N, Tittle R.K, Saar N, Dellal S.S, Hume R.I. An intersubunit zinc binding site in rat P2X2 receptors. // J. Biol. Chem. 2005. 280, 25982—25993.

151. Nagato T, Matsumoto K, Tanioka H, Kodama J, Toh H. Effect of denervation on morphogenesis of the rat fungiform papilla. // Acta Anat. 1995. 153, 301-309.

152. Nakazawa K, Hess P. Block by calcium of ATP-activated channels in Pheochromocytoma cells. // Journal of General Physiology. 1993. 101, 377—392.

153. Namik K, Shen T, Lu S, Zhao F, Herness S. A paracrine signaling role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor subtypes. // Am J Physiol Regul Inter Comp Physiol. 2004, 286, R649-658.

154. Naumov AlP., Kaznacheyeva E.V., Kiselyov K.I., Mamin A.G., Kuryshev Y.A., Mozhayeva G.N. ATP-activated inward current and calcium-permeable channels in rat macrophage plasma membranes. // J Physiol. 1995. 486, 323-337.

155. Nattel S., Maguy A., Lc Bouter S., Yeh Y.-H. Arrhythmogenic ion-cannel rmodeling in the heart: Heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation // Physiol. Rev. 2007. 87, 425-456.

156. Naylor M.J, Rancourt D.E, Bech-Hansen N.T. Isolation and characterization of a calcium channel gene, Cacnalf, the murine orthologue of the gene for incomplete X-linked congenital stationary night blindness. // Genomics. 2000. 66(3), 324-7.

157. Neher E. The use of fura-2 for estimating Ca buffers and Ca fluxes. // Neuropharmacology. 1995. 34, 1423-1442.

158. Nelson G., Chandrashekar J., Hoon M.A., Feng L., Zhao G., Ryba N.J., Zuker C.S. An amino-acid taste receptor. //Nature. 2002. 416(6877), 199-202.

159. Nelson G., Hoon M.A., Chandrashekar J., Zhang Y., Ryba N.J., Zuker C.S. Mammalian sweet taste receptors. // Cell. 2001. 106, 381-390.

160. Nelson GM, Finger TE. Immunolocalization of different forms of neural cell adhesion molecule (NCAM) in rat taste buds. // J Comp Neurol. 1993. 336, 507-516.

161. Nicke A., Baumert H.G., Rettinger J., Eichele A., Lambrecht G., Mutschier E., Schmalzing G. P2X1 and P2X3 receptors form stable trimers: a novel structural motif of ligand-gated ion channels. // EMBO J. 1998. 17, 3016-3028.

162. Nicke A., Rettinger J., Schmalzing G. Monomeric and dimeric byproducts are the principal functional elements of higher order P2X1 concatamers. // Mol Pharmacol. 2003. 63, 243-252.

163. Nishiyama A., Majid D.S., Taher K.A., Miyatake A., Navar L.G. Relation between renal interstitial ATP concentrations and autoregulation-mediated changes in renal vascular resistance. // Circ Res. 2000. 86, 656-662.

164. North R.A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 2002. 82, 1013-1067.

165. Oakley B, Wu LH, Lawton A, and DeSibour C L. Neural control of ectopic filiform spines in adult tongue. // Neurosci. 1990. 36, 831-838.

166. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ in taste cells via activation of muscarinic receptors. // J Neurophysiol. 2002. 87, 2643-2649.

167. Okada Y, Fujiyama R, Miyamoto T, Sato T. Inositol 1,4,5-trisphosphate activates nonselective cation conductance via intracellular Ca2+ increase in isolated frog taste cells. // Eur J Neurosci. 1998. 10, 1376-1382.

168. Palmer LG. Ion selectivity of epithelial Na channels. // J Membr Biol. 1987. 96, 97-106.

169. Park J.Y., Ahn HJ., Gu J.G., Lee K.H., Kam J.S., Kang H.W., Lee J.H. Molecular identification of Ca2+ channels in human sperm // Exp.Mol.Med. 2003. 35, 285-292.

170. Perez C.A., Huang L., Rong M., Kozak J.A., Preuss A.K., Zhang H., Max M., Margolskee R.F. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. // Nat Neurosci. 2002. 5(11), 1169-76.

171. Platzer J, Engel J, Schrott-Fischer A, Stephan K, Bova S, Chen H, Zheng H, Striessnig J: Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell 2000; 102(l):89-97.

172. Prawitt D., Monteilh-Zoller M.K., Brixel L., Spangenberg C., Zabel B., Fleig A., Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to rapid changes in Ca2+.i. // Proc Natl Acad Sei USA. 2003. 100, 15166-15171.

173. Pratt E.B., Brink T.S., Bergson P., Voigt M.M., Cook S.P. Use-dependent inhibition of P2X3 receptors by nanomolar agonist. // J Neurosci. 2005. 25, 7359-7365.

174. Phillis J.W., O'Regan M.H. and Perkins L.M. Adenosine 5'-triphosphate release from the normoxic and hypoxic in vivo rat cerebral cortex. // Neurosci Lett. 1993. 151, 94-96.

175. Ralevic V, Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines. // Pharmacol Rev. 1998. 50, 413-492.

176. Rettinger J, Schmalzing G. Activation and desensitization of the recombinant P2X1 receptor at nanomolar ATP concentrations. // J. Gen. Physiol. 2003. 121, 451-461.

177. Roberts J. A, Evans R. J. ATP binding at human P2X1 receptors. Contribution of aromatic and basic amino acids revealed using mutagenesis and partial agonists. // J. Biol. Chem. 2004. 279, 9043-9055.

178. Romanov R.A., Kolesnikov S.S. Electrophysiologicaly identified subpopulations of taste bud cells // Neurosci. Lett. 2006. 395, 249-254.

179. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells // EMBO J. 2007. 26, 657-667.

180. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Khokhlov A.A., Kolesnikov S.S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells // J. Gen. Physiol. 2008. 132, 731744.

181. Roper S.D. The cell biology of vertebrate taste receptors. // Annu Rev Neurosci. 1989. 12, 329-53.

182. Roper SD, McBride DWJ. Distribution of ion channels on taste cells and its relationship to chemosensory transduction. // J Membr Biol. 1989. 109, 29-39.

183. Roper S.D. Cell communication in taste buds. // Cell Mol Life Sci. 2006. 63, 1494-1500.

184. Rossler P., Boekhoff I., Tareilus E., Beck S., Breer H., Freitag J. G protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter transduction. // Chem Senses. 2000. 25,413-421.

185. Ruiz-Avila L., McLaughlin S.K., Wildman D., McKinnon P.J., Robichon A., Spickofsky N., Margolskee R.F. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase through transducin in taste receptor cells. // Nature. 1995. 376 (6535), 80-5.

186. Ruiz-Avila L., Wong G.T, Damak S., Margolskee R.F. Dominant loss of responsiveness to sweet and bitter compounds caused by a single mutation in a-gustducin. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. 98, 8868-8873.

187. Saez J.C., Berthoud V.M., Branes M.C., Martinez A.D., Beyer E.C. Plasma membrane channels formed by connexins: their regulation and functions. // Physiol. Rev. 2003. 83, 1359-1400.

188. Safa P., Boulter J., Hales T.G. Functional Properties of CaV1.3 (ID) L-type Ca2 Channel Splice Variants Expressed by Rat Brain and Neuroendocrine GH3 Cells. // J. Biol. Chem.2001. 276 (42), 38727-37.

189. Sanguinetti M.C., Tristani-Firouz M. hERG potassium channels and cardiac arrhythmia // Nature. 2006. 440, 463-469.

190. Schiavo G., Benfenati F., Poulain B., Rossetto O., Polverino de Laureto P., Dasgupta B.R, Montecucco C: Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. //Nature. 1992. 359(6398), 832-5.

191. Schneggenburger R., Zhou Z., Konnerth A., Neher E. Fractional contribution of calcium to the cation currcnt through glutamate receptor channels. // Neuron. 1993. 11, 133-143.

192. Seta Y, Toyono S, Takeda S, and Toyoshima K. Expression of Mash 1 in basal cells of rat circumvallate taste buds is dependent upon gustatory innervation. // FEBS Lett. 1999. 444, 43-46.

193. Sigworth F.J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier // J. Physiol. 1980. 307, 97-129.

194. Simon S.A, Holland V.F, Benos D.J, Zampighi G.A. Transcellular and paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction. // Microsc Res Tech. 1993.26, 196-208.

195. Sokolova E., Skorinkin A., Moiseev I., Agrachev A., Nistri A., and Giniatullin R. Experimental and modeling studies of desensitization of P2X3 receptors. // Mol Pharmacol. 2006. 70, 373-382.

196. Sollars S.I, Smith P.C, Hill D.L. Time course of morphological alterations of fungiform papillae and taste buds following chorda tympani transection in neonatal rats. // J Neurobiol.2002. 51, 223-236.

197. Stevens D.R, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof W, Kaupp U.B, Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCN1 and HCN4 mediate responses to sour stimuli. // Nature. 2001. 413, 631-635.

198. Sun X-D, Herness M.S. Characterization of inwardly rectifying potassium currents from dissociated rat taste receptor cells. // Am J Physiol. 1996. 271, C1221-C1232.

199. Sudhof T.C. The synaptic vesicle cycle. // Annu Rew Neurosci. 2004. 27, 509-47.

200. Takeda M, Suzuki Y, Obara N, and Nagai Y. Apoptosis in mouse taste buds after denervation. // Cell Tissue Res. 1996. 286, 55-62.

201. Takimoto K, Li D, Nerbonne J.M, Levitan E.S. Distribution, splicing and glucocorticoid-induced expression of cardiac alpha 1C and alpha ID voltage-gated Ca2+ channel mRNAs. J Mol Cell Cardiol. 1997, 29(ll):3035-3042.

202. Taylor W.R., Morgans C. Localization and properties of voltage-gated calcium channels in cone photoreceptors of Tupaia belangeri // Vis. Neurosci. 1998. 15, 541-552.

203. Torres G.E., Egan T.M., Voigt M.M. N-Linked glycosylation is essential for the functional expression of the recombinant P2X2 receptor. // Biochemistry. 1998. 37(42), 14845-51.

204. Torres G.E., Egan T.M., Voigt M.M. Hetero-oligomeric assembly of P2X receptor subunits. Specificities exist with regard to possible partners. // J Biol Chem. 1999. 274, 6653-6659.

205. Triggle D.J. 1,4-Dihydropyridines as calcium channel ligands and privileged structures // Cell. Mol. Neurobiol. 2003. 23, 293-303.

206. Tsunenari T, Kurahashi T, Kaneko A. Activation by bitter substances of a cationic channel in membrane patches excised from the bull frog taste receptor cell. // J Physiol. 1999. 519,397-404.

207. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T, Tohyama M, Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. // Nature. 1998. 395, 555-556.

208. Ugawa S, Yamamoto T, Ueda T, Ishida Y, Inagaki A, Nishigaki M, Shimada S. Amiloride-insensitive currents of the acid-sensing ion channel-2a ASIC2a/ASIC2b heteromeric sour-taste receptor channel. // J Neurosci. 2003. 23(9), 3616-3622.

209. Valera S., Hussy N., Evans R.J., Adami N., North R.A., Surprenant A., Buell G. A new class of ligand-gated ion channel defined by P2x receptor for extracellular ATP. // Nature. 1994.371,516-519.

210. Virginio C., North R.A., Surprenant A. Calciumpermeability and block at homomeric and heteromeric P2X2 and P2X3 receptors, and P2X receptors in rat nodose neurones. // J Physiol. 1998. 510 (Pt 1), 27-35.

211. Waldmann R, Lazdunski M. H+-gated cation channels: neuronal acid sensors in the NaC/DEG family of ion channels. // Curr Opin Neurobiol. 1998. 8, 418-424.

212. Wilkinson M.F., Barnes S. The dihydropyridine-sensitive calcium channel subtype in cone photoreceptors // J. Gen. Physiol. 1996. 107, 621-630.

213. Wilkinson W.J., Jiang L.H., Surprenant A., North R.A. Role of ectodomain lysines in the subunits of the heteromeric P2X2/3 receptor. // Mol Pharmacol 70, 1159-1163.

214. Williams ME, Feldman DH, McCue AF, Brenner R, Velicelebi G, Ellis SB, Harpold MM. Structure and functional expression of 1, 2, and 15 subunits of a novel human neuronal calcium channel subtype. Neuron. 1992; 8: 71-84.

215. Wong G.T., Gannon K.S., Margolskee R.F. Transduction of bitter and sweet taste by gustducin. //Nature. 1996. 381, 796-800.

216. Wong A.Y.C., Burnstock G, Gibb A.J. Single channel properties of P2X ATP receptors in outside-out patches from rat hippocampal granule cells. // Journal of Physiology. 2000. 527, 529—547.

217. Yamamoto T, Nagei T, Shimura T, Yasoshimi Y. Roles of chemical mediators in the taste system. // Jpn J Pharmacol. 1998. 76, 325-348.

218. Yang R, Crowley H.H, Rock M.E, Kinnamon J.C. Taste bud cells with synapses express SNAP-25-like immunoreactivity. // J Comp Neurol. 2000. 424, 205-215.

219. Yang R., Stoick C.L., Kinnamon J.C. Synaptobrevin-2-like immunoreactivity is associated with vesicle at synapses in rat circumvallate taste buds. // J Comp Neurol. 2004. 471,59-71.

220. Ye Q, Heck G.L, DeSimone J. A. Voltage dependence of the rat chorda tympani response to Na+ salts: implications for the functional organization of taste receptor cells. // J Neurophysiol. 1993. 70, 167-178.

221. Ye Q, Heck G.L, DeSimone J.A. Effects of voltage perturbation of the lingual receptive field on chorda tympani responses to Na+ and K+ salts in the rat: implications for gustatory transduction. // J Gen Physiol. 1994. 104, 885-907.

222. Yoshie S., Kanazawa H., Fujita T. A possibility of efferent innervation of the gustatory cell in the rat circumvallate taste bud. // Arch Histol Cytol. 1996. 59, 479-484.

223. Zhang Y., Hoon M.A., Chandrashekar J., Mueller K.L., Cook B., Wu D., Zuker C.S., Ryba N.J.P. Coding of sweet, bitter, and umami tastes, Different receptor cells sharing similar signaling pathways. // Cell. 2003. 112, 293-301.

224. Zeng Q, Kwan A, Oakley B. Gustatory innervation and Bax-dependent Caspase-2, Participants in the life and death pathways of mouse taste receptors cells. // J Comp Neurol. 2000. 424, 640-650.

Информация о работе

Кабанова, Наталия Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в афферентную нейропередачу во вкусовой почке - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы